Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитокинин-зависимая экспрессия ARR5::GUS конструкции в ходе роста трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на нитратном и аммонийном источниках азота

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Цитокинин-зависимая экспрессия ARR5::GUS конструкции в ходе роста трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на нитратном и аммонийном источниках азота"

На правах рукописи

ШТРАТНИКОВА Виктория Юрьевна

0034Б75Э7

Цитокинин-зависимая экспрессия А1Ш5::Си$ конструкции в ходе роста трансгенных растений АгаЬШорБгй ШаИапа (Ь.) НеупЬ. на нитратном и аммонийном источниках азота

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г '

Москва - 2009

003467597

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Кулаева Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Клячко Нелла Леопольдовна Бровко Фёдор Александрович

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет -Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, г. Москва

Защита состоится «19» мая 2009 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, электронная почта: .m-azarkovich@ippras.rtL; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «ДО» апреля 2009 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ВВЕДЕНИЕ

Цитокинины принимают участие в регуляции жизни растения на всех этапах онтогенеза от оплодотворения яйцеклетки до старения и смерти. Они участвуют в регуляции деления клеток, индуцируют стеблевой морфогенез, активируют дифференцировку хлоропластов и задерживают старение листьев, участвуют в регуляции транспорта метаболитов в растении; с их помощью корневая система регулирует функциональную активность в надземных органах, в частности, в листьях (Skoog and Miller, 1957; Кулаева, 1973, 1987; Мок and Мок, 2001).

Цитокинины также играют крайне важную роль в качестве медиаторов, обеспечивающих регуляцию роста надземных органов в ответ на нитратное питание растений. Влияние нитратов на реакцию растений на цитокинин было показано ещё в 1962 г. (Кулаева, 1962). С тех пор выяснено, что нитраты индуцируют экспрессию генов ключевых ферментов биосинтеза цитокининов — изопентенилтрансфераз (AtIPT3) (Takei et al., 2004). Нитраты активируют биосинтез цитокининов в корнях и усиливают их транспорт в надземные органы, вызывая стимуляцию ростовых процессов (Walch-Liu et al., 2000; Takei et al., 2001; Sakakibara et al., 2003). Цитокинины выполняют роль сигнала дальнего действия, с помощью которого поступающий в корни нитрат активирует рост листьев (Rahayu et al., 2005).

Маркёром действия цитокининов на листья может служить индукция генов-регуляторов ответа типа A (ARR-гены А типа), которые включаются цитокинином через мембранные рецепторные гистидинкиназы и индуцируемый ими фосфатный каскад (Taniguchi et al., 1998; Kiba et al., 1999). Гены ARR типа А являются генами прямого ответа на цитокинин, который специфично и быстро индуцирует их экспрессию. Для её изучения в лаборатории Kieber была создана генетическая конструкция, содержащая маркерный ген бактериальной глюкуронидазы (GUS) под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5-гена и были получены трансгенные растения Arabidopsis thaliana с этой конструкцией (D'Agoustino et al., 2000), которые широко используются в научных исследованиях (Romanov et al., 2002; Werner et al., 2003; Aloni et al., 2005). Было показано, что экспрессия конструкции ARR5::GUS повышалась при обработке Arabidopsis thaliana возрастающими концентрациями бензиладенина (БА) (D'Agoustino et al., 2000; Romanov et al., 2002; Lopez-Bucio et al., 2007), и уменьшалась при снижении концентрации эндогенных

цитокининов в результате трансформации растений геном оксидазы цитокинина (Werner et al., 2003).

Анализ активности GUS в таких трансформантах, проведённый параллельно с иммуногистохимическим изучением цитокининов, показал, что активность GUS отражает уровень активных форм цитокининов в тканях и может использоваться для оценки их распределения в растениях (Aloni et al., 2005). Это дало возможность изучения изменений уровня цитокининов в ходе развития отдельных органов и всего растения, а также в ответе растений на различные внешние воздействия.

К числу важных проблем жизни растений относится их реакция на снабжение азотом и участие в этом цитокининов. Известно, что аммоний в качестве единственного источника азота угнетает рост многих растений (Cao et al., 1993; Полесская и др., 2000; Walch-Liu et al., 2000), который восстанавливается под действием нитратов (Rahayu et al., 2005). Предполагается, что цитокинины вносят свой вклад в это восстановление (Walch-Liu et al., 2000; Rahayu et al., 2005).

Однако до сих пор не проводилось исследований, позволяющих установить изменение распределения цитокининов по растению в ходе его развития. Также не было данных, характеризующих это распределение при выращивании растений на различных источниках азотного питания в течение длительного срока развития. Анализ экспрессии GUS-тет под цитокинин-зависимым промотором ARR5-гена в трансформированных растениях A. thaliana дал хорошую методическую возможность для выяснения этих вопросов.

Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучить, как уровень активных форм цитокининов, о котором судили по активности GUS в растениях A. thaliana, трансформированных б'Ш'-гсном под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5-гена, коррелирует с ростовыми процессами в трансформантах и как эти процессы зависят от нитратного и аммонийного питания растений.

В задачи работы входило

1. Проверка реакции промотора ARR5-гена на изменение уровня цитокинина в листьях трансгенных растений Arabidopsis.

2. Сравнение роста листьев растений и цитокинин-зависимой экспрессии в них GUS-гена в качестве критерия уровня в них активных форм цитокининов.

3. Изучение изменений в локализации активных форм цитокининов в ходе роста растений.

4. Сравнение особенностей распределения активных форм цитокининов в листьях и корнях растений, выращенных на нитратном и аммонийном источниках азота.

5. Изучение влияния экзогенного цитокинина на морфогенез и экспрессию ЛЛ/?5;;С(У5'-конструкции в трансгенных растениях Arabidopsis в условиях аммонийного питания.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые охарактеризована динамика уровня активных форм цитокининов в ходе онтогенеза листа и установлено, что рост листа коррелирует с накоплением активных форм цитокининов, а прекращение роста — с резким падением их уровня. Установлено перемещение центров локализации цитокининов из нижних, закончивших рост листьев, в растущие листья верхних ярусов в ходе роста растений. Впервые установлены особенности активности GUS и, следовательно, распределения активных форм цитокининов в растениях, растущих на аммонийном азоте при полном отсутствии нитратов в питательной среде. В таких условиях угнеталось развитие надземной части и корневой системы растений, снижалась активность GUS в корнях, а также в гидатодах листьев. Это даёт основания предполагать подавление синтеза цитокининов в кончиках корней и их транспорта в надземные органы, что может быть причиной угнетения развития надземных органов. Добавление 10~9 мМ зеатина в питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота 2 мМ хлорида аммония, заметно исправляло нарушения морфогенеза в надземных органах, подтверждая роль недостатка цитокининов в угнетении роста растений на аммонийном источнике азота.

Проделанная работа вносит ощутимый вклад в понимание взаимодействия минерального питания и гормональной регуляции роста растения, что представляет интерес не только с точки зрения фундаментальной науки, но и при решении задач оптимизации роста растений. Полученные результаты могут быть использованы для

разработки теоретических основ управления продуктивностью растений. Проведенное нами детальное изучение в ходе развития A. thaliana экспрессии конструкции ARR5::GUS, широко используемой в научных работах во всём мире, является важным источником информации для дальнейших исследований с применением данной конструкции.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на всероссийских конференциях: в Сыктывкаре, 2007; Москве, 2007, 2008; Новосибирске, 2008; Екатеринбурге, 2008 и на XVI Конгрессе FESPB, Tampere, Финляндия, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 2 — в журналах, рекомендованных ВАК; 1 в центральном российском журнале по физиологии растений и 1 в зарубежном журнале.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 68 рисунков, 5 приложений. Список цитированной литературы составляет 147 наименований, из них 140 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (экотипа Wassilewskija), трансформированные конструкцией, содержащей бактериальный ген ß-глюкуронидазы (GUS) под контролем цитокинин-зависимого промотора ЛЛЙ5-гсна (D'Agoustino, 2000). Семена трансгенных растений были любезно предоставлены профессором Kieber J.J. (Университет Северной Каролины, США).

Семена стерилизовали и затем инкубировали при 4°С в чашках Петри на агаризованной (0,7% агара) питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей (MC 1/2) или её модификациях в течение трёх дней для синхронизации прорастания. Модификации состояли в добавлении в среду МС1/2 в качестве единственного источника азота KN03, 20 или 2 мМ, или (NH4)2S04 10 или 1 мМ (в среду с аммонийной солью добавляли KCl, соответственно, 10 или 2 мМ). Содержание сахарозы составляло 1%. Во все среды добавлялся MES-буфер для

стабилизации pH на уровне 5,7—6,0. Затем растения выращивали на указанной среде в климатической камере при освещении 120 цмоль фотонов/(м2-с), температуре 23°С, продолжительности светового периода 16 ч. Пробы для анализа отбирали 2 раза в неделю.

В ряде опытов семена проращивали на чашках Петри со средой MC в течение 10 дней, проростки переносили в почву и продолжали выращивать в тех же температурных и световых условиях. Розеточные листья 2 и 3 ярусов срезали с 3—7-недельных растений и использовали для определения хлорофилла, содержания белка и измерений активности GUS флуоресцентным методом.

В экспериментах с добавлением цитокининов в среду MC 1/2, содержащую в качестве единственного источника азота 2 мМ NH4C1, добавляли раствор транс-зеатина в концентрациях КГ10—10"6 М.

Активность GUS определяли двумя методами:

1) Флуорометрический анализ активности GUS проводился согласно (Jefferson, 1987).

2) Выявление активности GUS с использованием X-Gluc (5-бромо-4-хлоро-З-индолил-р-О-глюкуронид) проводили согласно (Vitha, 1995). Затем растения фотографировали, фотографии растений, окрашенных в результате GUS-реакции в синий цвет, переводили в чёрно-белое изображение (8-битная цветопередача), и интенсивность окраски количественно оценивали с помощью программы ImageJ. Результаты приведены в условных единицах (0—255) по системе HSV компьютерной графики, представляющих собой среднюю интенсивность окраски на единицу проанализированной площади. Площадь листьев и семядолей, длину черешков и корней измеряли на фотографиях растений с использованием программы ImageJ.

Растворимый белок определяли по методу (Bradford, 1976). Содержание хлорофилла измеряли согласно (Arnon, 1949).

Определение нитратов в растениях проводили ионометрическим методом.

Обработку полученных данных проводили в программе Excel. Опыты проводили минимум в трёх биологических повторностях и повторяли 2—3 раза, на графиках приведены данные характерного опыта. Бары представляют собой стандартную ошибку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ применимости метола оценки уровня цитокининов по активности GUS в тканях растений Arabidopsis thaliana, трансформированных маркерным геном GUS под контролем цитокинин-зависимого промотора Л/?У?5-гена Для проверки правомерности изучения уровня активных форм цитокининов в трансформантах по активности GUS листья 1 яруса, срезанные с 3-недельных растений, инкубировали на растворах БА (10~8 М—10"6 М) в течение 24 ч в темноте. Активность GUS определяли по анализу окраски листьев с помощью X-Gluc в качестве субстрата. Приведённые на рис. 1 данные показали зависимость активности GUS от логарифма концентрации БА в растворе. Результаты подтвердили правомерность суждения в наших опытах об уровне активных форм цитокининов в тканях растений по интенсивности активности GUS.

tf»

I

80 70 60 -50 -40 30 20 -10 О

п

Рисунок 1. Зависимость активности GUS в срезанных листьях от логарифма концентрации БА в растворе инкубации листьев. После инкубации с цитокинином активность GUS определяли с использованием X-Gluc.

контроль, вода

-7

Ig [БА]

-6

Этот вывод был подтверждён в опытах по определению активности GUS флуоресцентным методом в листьях 2-3 яруса, срезанных с 5-недельных растений А. thaliana, выращенных в почве, после инкубации листьев в течение 72 ч в темноте на растворе БА в концентрациях 10~8 М—10"5 М. Было показано, что индукцию активности GUS в листьях вызывали также такие природные цитокинины (в концентрации 5 • 10"6М), как транс-зеетш и изопентениладенин, тогда как аденин, производным которого являются природные цитокинины, но который лишён цитокининовой активности, не вызывал индукцию активности GUS в листьях. Её не индуцировали также другие регуляторы роста: абсцизовая кислота (5-Ю"5 М),

индолил-3-уксусная кислота (10"6 М), метилжасмонат (5 -1СГ6 М), салициловая кислота (5 • 10"5 М) и спермин (СП, 5 • 10"5 М).

Всё это говорит о высокой специфичности ответа промотора гена ARR5 на цитокинины и подтверждает возможность оценки присутствия активных форм цитокининов в тканях по активности GUS в растениях А. thaliana, трансформированных GUS-геном под промотором ААЙ5-гена.

Сравнительное изучеиие роста листьев и активности в них GUS В ходе работы была выявлена неоднородность имеющейся популяции трансгенных растений Arabidopsis по проявлению активности GUS и были получены чистые линии растений (растений, происходящих от одного предка), характеризующихся высокой («В») и низкой («Н») активностью GUS. В дальнейшем работа велась параллельно на обеих линиях. Основные полученные на них закономерности в общих чертах совпадали. Поэтому результаты представлены для одной из линий, с указанием, на какой линии они получены.

В качестве среды, служащей эталоном для сравнения и обеспечивающей нормальное развитие растений, была выбрана среда, содержащая 20 мМ нитрата в качестве единственного источника азота. На этой среде у растений формировалась полная розетка листьев с хорошо развитыми черешками. Растение переходило к цветению на третьей-четвёртой неделе жизни. Площадь листа могла достигать 8 мм2, длина черешков — 4—8 мм. В наших условиях растения экотипа Wassilewskija закладывали 6-7 листьев розетки (считая семядольные) (рис. 5А).

В молодом листе активность GUS не обнаруживалась или была низкой (рис. 2.Г1). По мере роста листа она появлялась в сосудистой системе черешка и в области апикальной гидатоды (рис. 2.А1, В1, Г1). Наиболее высокая активность GUS наблюдалась в областях сосудистой системы (рис. 2.В1). Как показывает рис. 2, рост листа совпадал с периодом увеличения активности GUS, что указывало на увеличение уровня активных форм цитокининов в листе. Почти сразу после достижения листом максимального размера происходило значительное снижение активности GUS в пластинке (рис. 2.В1, Г1). Это доказывает, что прекращение роста листа происходит в условиях снижения содержания в них активных форм цитокининов, что связано, возможно, с оттоком или с перераспределением цитокининов, поступающих из корней, от закончившего рост листа в растущие листья. Дольше всего активность GUS сохранялась в базальных областях листа, в сосудистой системе черешка и в гидатодах (рис. 2.В1, Г1).

AI

A2

2

Л 2

о I

с 11

= I

0>

10

15

Ъ S

■■*-■ сосудистая система черешка

_ 'I.

главная жилка \

-*—жилки 2 порядка / \ ■■"■•■жилки 3 порядка,/

- центральная часть

- области гидатод ,L

/ 1\

/ \ I \ / I

5 10 15 20

Возраст, сутки

В2

«1 5140 i S ¿120

i I 'поо

S 5= 80 j >.сэ

60

S » g 40 с К

Е 20

- к m

Е 5 S 0

« Ьй

о га 0

Г2

1 S120 п

—черешок —»—главная жи

10 15

- центральная часть

- область апикальной гидатоды

Возраст, сутки

Рисунок 2. Характеристика роста и активности GUS в листе первого яруса и семядолях Arabidopsis thaliana, выращенных на среде, содержащей 20 мМ нитрат калия в качестве единственного источника азота. Линия Н. 1. Лист 1-го яруса. 2. Семядоли. Площадь листа (AI) и семядоли (А2), длина черешка листа (Б1), активность GUS в сосудистой системе листа (В1) и семядоли (В2), активность GUS в пластинке листа (Г1) и семядоли (Г2).

Линия В отличалась высокой активностью GUS в мезофилле листьев, поэтому изменение активности GUS в мезофилле на ней прослеживалось более отчётливо. На растениях линии Н сильнее проявлялось преобладание активности GUS в сосудистой системе и приуроченность её к областям гидатод, что указывало на поступление цитокининов в листья по сосудистой системе с пасокой.

Сходные закономерности были получены на семядолях (рис. 2.2) (данные приведены для линии Н). Менее резко была выражена стадия усиления активности GUS на ранних этапах роста семядолей. Поскольку семядоли являются запасающим органом растения, то высокая активность GUS на начальных стадиях роста семядолей могла быть связана с присутствием в них запасных цитокининов, которые переходят в активную форму.

В целом данные, полученные на двух линиях, указывали на одинаковые закономерности: 1) увеличение активности GUS в ходе роста листа, 2) её снижение после прекращения роста листа, 3) преобладание активности GUS в проводящей системе.

Дополнительные эксперименты, проведённые на растениях, выращенных в почве, показали, что в ходе роста листьев активность GUS снижалась с возрастом значительно быстрее, чем проявлялось падение содержания хлорофилла. Таким образом, цнтокинин-зависимая активность GUS в трансгенных растениях А. thaliana лучше характеризовала возрастные изменения листа, чем содержание хлорофилла.

О 5 10 15 20 25 30

Возраст, сутки

Рисунок 3. Развитие активности GUS в семядолях и розеточных листьях первого и второго ярусов растений, выращенных на среде, содержащей в качестве единственного источника азота 20 мМ нитрат калия. Линия Н.

Динамика активности GUS в семядольных листьях (рис. 2.2) и листьях первого

и второго ярусов совпадала с данными для листьев первого яруса. Рис. 3 позволяет

11

увидеть, что снижение активности GUS, а, следовательно, и содержания активных форм цитокининов в нижерасположенных органах соответствовало по времени росту активности GUS в вышерасположенных развивающихся листьях. Это указывает на перераспределение цитокининов в растениях в пользу более молодых, растущих органов.

Период активного роста семядолей и листьев у А. thaliana совпадает с высоким уровнем в них физиологически активных форм цитокининов, а прекращение роста происходит на фоне резкой убыли этих фитогормонов и нарастания их содержания в вышерасположенных, активно растущих листьях. Такая динамика эндогенного содержания активных форм цитокининов в ходе роста листа показана впервые. Перераспределение накопления активных форм цитокинина в растениях от прекративших рост органов в более молодые происходит задолго до появления внешних признаков старения листа. Высокая активность GUS в проводящей системе черешка и листьев и в областях гидатод является ещё одним свидетельством в пользу поступления цитокининов в листья из корней в составе пасоки.

Влияние нитратного и аммонийного азота в питательной среде па рост и цитокинин-зависимую активность GUS в растениях Arabidopsis

Для того чтобы проверить, будут ли наблюдаться изменения по активности GUS в растениях в зависимости от их снабжения нитратом, растения подвергали азотному голоданию в течение недели, а затем переносили на соли азота.

Трансформанты Arabidopsis выращивали на среде Хогланда. Затем растения переносили на среду Хогланда без азотсодержащих солей. Для этого Ca(N03)2 замещали на 3 мМ К.С1+1 мМ СаС12 на 8 дней и измеряли в них содержание нитрата и активность GUS. Затем целые растения или срезанные с них полностью развитые листья 2—3 ярусов переносили на растворы солей 5 мМ нитрата или 5 мМ аммония. Через 3 суток в листьях интактных растений и в срезанных листьях измеряли активность GUS флуоресцентным методом.

Снижение содержания нитратов в растениях сопровождалось резким падением активности GUS в листьях (рис. 4А). При переносе голодающих интактных растений на нитрат активность GUS в листьях усиливалась в течение трёх суток (рис. 4Б). Этого не происходило в срезанных листьях, что указывает на индукцию нитратом синтеза цитокининов в корнях с их последующим транспортом в листья. Аммонийная

соль практически не увеличивала активность GUS после голодания. Это говорит о

том, что аммонии не индуцировал синтез цитокининов в растениях.

. 5 СО "

О s

Ii

6000

4000 -

2000

- Среда Хогланда без N03 .-.- □--- Среда Хогланда с N03

Период голодания, сутки

Рисунок 4А. Активность GUS при голодании по азоту растений А. thaliana.

Рисунок 4Б. Активность GUS при переносе голодающих по азоту растений А. thaliana на азотсодержащие растворы на три дня. (I) Контрольные растения (8 суток па обычной среде Хогланда и затем 3 дня на 5 мМ

нитрата). (II) Растения после 8-дневного голодания на среде Хогланда без нитрата. Обозначения растворов: N0, — 3 мМ К1МО, + 1 мМ Са(1\03)2, N114 — 5мМ ГЧН4С1.

1п D О

Л

р 4000

о

Ц 3000

S ГГ

1 3 2000

о

ц с 1000

(I)

Варианты

N03 ! NH4 Срезанные листья

-L

X

N03 NH4

Ингактные растения

Чтобы проверить, как полное отсутствие нитрата влияет на содержание .активных форм цитокининов в растении, мы исследовали в растениях, выращенных на аммонии, цитокинин-зависимую активность GUS.

Рисунок 5. Растения, выращенные на МС1/2, содержащей в качестве единственного источника азота А) 20 мМ нитрата калия, Б) 20 мМ сульфата аммония. Бар — 1 мм. Линия В. Возраст растения: А) 20 дней, Б) 23 дня.

В наших опытах в питательную среду добавляли MES-буфер, который обеспечивал pH 5,7—6,0, наиболее часто использующийся в литературе при выращивании Arabidopsis. Такое значение pH не оптимально для аммонийного питания, которое нуждается в подщелачивании среды. Однако оно позволяло проводить опыты с нитратным и аммонийным питанием в одинаковых условиях.

Отсутствие нитрата и наличие аммония в питательной среде приводили к серьёзным морфологическим изменениям надземной части у обеих изученных линий: скученной розетке листьев, снижению общей площади листьев примерно в 6 раз, отсутствию выраженных черешков, нарушениям формирования сосудистой системы, преждевременной гибели растения (рис. 5Б). Однако следует помнить, что условия аммонийного питания в наших опытах могли быть не оптимальными при выбранном pH. Отличия в морфологии семядолей были менее выражены.

Активность GUS в листе первого яруса у растений, получавших аммонийный источник азота, различалась для двух исследуемых линий. В мезофилле листьев первого яруса растений линии Н активность GUS не обнаруживалась (рис. 6.1). Активность GUS наблюдалась только в черешке, центральной жилке, жилках второго порядка и её значения были ниже, чем для нитратных растений (рис. 6.Б1, В1).

В мезофилле и сосудистой системе листьев 1 яруса растений линии В, получавших аммонийный азот, наблюдалась довольно высокая активность GUS. Это указывает на высокий уровень в них активных форм цитокининов, который может быть результатом задержки транспорта цитокининов ввиду подавления роста листьев следующих порядков. При этом была слабее выражена разница окраски сосудистой системы и мезофилла. У листьев 2 яруса растений линии В падение активности GUS наблюдалось ещё в процессе роста листа, что связано, видимо, с серьёзными нарушениями процессов роста уже на ранних этапах развития листа. В трёхнедельном возрасте растения этой линии были значительно обеднены цитокининами по сравнению с нитратными растениями того же возраста (рис. 5Б).

В семядолях растений обеих линий, выращенных на аммонийном азоте, активность GUS была довольно высока (6.Б2). Её значения могли превышать активность GUS в семядолях растений, получавших нитратный азот.

Характерной особенностью листьев и семядолей аммонийных растений было отсутствие выраженной активности GUS в областях гидатод по сравнению с другими

участками листа (рис. 6.Б2), что чётко прослеживалось у растений, получавших нитраты (рис. 6.В2). Возможно, это отражает сниженное поступление цитокининов из корней с пасокой в пластинку листа растений на аммонийном азоте.

AI

А2

г г

S

3 i о

Ц

с

■■■□■■■ нитрат —*—аммоний

5 10

B1,(NH4)2S04, 20 мМ

5

~s 4

i 3

| 2

I :

0 5

Б2, (NH4)2S04, 20 мМ

10

15

20

5140 л а 15120

V О)

о S „-100 j ш —

с О

ю J

о н „ и

га о

I- х

S с ь

черешок 1— главная жилка ¡--жилки 2 порадка

>з

s S

* 5

О X

га о)

а. с;

* m

. 140 Ч

120

ц

äl00

5 10 15 20

B1,KN03) 20 мМ

--х--жилки 2 порядка /

-SM ¡2 и э

О ® а X О 2

Сй - J и с §

Mi

t- ¿г Ш

s S

<ü X

о га

80 60 1 40 20 -0

■ область апикальной гидатоды - центральная часть

10

15

20

В2, KN03, 20 мМ

область апикальной гидатоды центральная часть

15

Возраст, сутки

10 15 Возраст, сутки

Рисунок 6. Рост и активность GUS в листьях 1 яруса (1) и семядолях (2) растения, выращенного на среде МС1/2, содержащей в качестве источника азота 20 мМ сульфата аммония. Для сравнения приведены данные для растений, выращенных на среде, содержащей в качестве источника азота 20 мМ нитрата калия. Линия Н. Площадь листьев (AI) и семядолей (А2). Активность GUS в листе 1 яруса (Б1) и семядоле (Б2) у растений, получавших 20 мМ сульфат аммония. Активность GUS в листе 1 яруса растения, выращенного на 20 мМ нитрате калия (В1) и в семядолях этих растений (В2).

В листьях аммонийных растений наблюдались частые аномалии в развитии сосудистой системы: слабое развитие жилок 3 порядка, раздвоение главной жилки, отсутствие апикальной петли, отсутствие выраженной иерархии в системе жилок.

Таким образом, уровень активных форм цитокининов, показателем которого является активность GUS, был значительно снижен в растениях, выросших на среде, содержащей аммоний в качестве единственного источника азота. Это согласуется с литературными данными о снижении содержания цитокининов в пасоке растений при недостатке нитрата (Walch-Lju et al., 2000).

Изучение роста растений и активности GUS в тканях надземных органов при снижении концентрации солей аммония в питательной среде с 20 мМ до 2 мМ, так же, как и сравнение влияния хлоридной и сульфатной солей аммония, значительных отличий в динамике роста и активности GUS не обнаружило.

Следовательно, обнаруженное в опытах угнетение роста надземных органов зависело не столько от выбранной концентрации аммония, сколько от замены им нитрата в питательной среде.

Таким образом, при элиминации солей нитрата из питательной среды, в растениях на аммонийном азоте снижается не только рост, но и экспрессия GUS-гена. под контролем цитокинин-зависимого промотора, что говорит о снижении в них уровня активных форм цитокининов. Отсутствие активности GUS в областях гидатод указывало на снижение поступления активных форм цитокининов в листья из корней, что подтверждалось отсутствием активных форм цитокининов в мезофилле листьев линии Н. Обнаруженное на растениях линии В повышение активности GUS в мезофилле ещё ждёт своего объяснения, наиболее вероятно, что оно связано с ослаблением оттока цитокининов.

Морфологические параметры и активность GUS в корнях растений Arabidopsis thaliana, выращенных на средах с различными источниками азота

Были изучены активность GUS в корнях растений и их морфологические характеристики на разных источниках азотного питания. Данные приведены для растений линии В, выращенных на средах, содержащих в качестве единственного источника азота 2 мМ нитрата калия или 2 мМ сульфата (или хлорида) аммония или 20 мМ сульфата аммония.

КИОз, 2 мМ

ЫН4(804)2, 2 мМ

ЫН4(804)2, 20 мМ

240 . 200

—о— Обиря длина

корневой системы ------ Боковые корни 1

порядка —*— Боковые корни 2

порядка —х— Главный корень ■

Боковые корни 1 порядка - Боковые корни 2 порядка

240 -

200

2

2 160

га

| 120 -

с „„

-5 а 80 -

—X 40 -

3 6 9 12 15 18 Возраст, сутки

-о— Общая длина корневой системы -■•-• Боковые корни 1 порядка -*— Боковые корни 2 порядка -х— Главный корень

3 6 9 12 15 1Е Возраст, сутки

Д

"5 зо

о. 25

о

* 20 о

О 15 " 10

Боковые корни

1 порядка

-л— Боковые корни

2 порядка ¿г'

0 3 6 9 12 15 18 21 Возраст, сутки

'§ 30

а 25 о * 20 о ш

••-□•■- Боковые корни 1 порядка —^— Боковые корни 2 порядка

_. - -о......

3 6 9 12 15 18 Возраст, сутки

30

а 25 о * 20 о

ё 15 ? Ю

з § 5

* О

Боковые корни 1 порядка -л— Боковые корни 2 порядка

-т— о— 5—

3 6 9 12 15 18 21 Возраст, сутки

Рисунок 7. Параметры роста корневой системы растений, выращенных на среде МС1/2, содержащей в качестве единственного источника азота 2 мМ нитрата калия (А, Г), 2 мМ сульфат аммония (Б, Д), или 20 мМ сульфат аммония (В, Е). Линия В.

Рисунок 8. Активность GUS в корнях. Возраст растения: А, Б, В —трое суток; Д — 17 суток; Г, Е — три недели; Ж — 24 дня. Растения росли на среде МС1/2, содержащей в качестве единственного источника азота: А, Г — 2 мМ нитрата калия; Б, Д, Е, Ж — 2 мМ аммония (сульфат или хлорид), В — 20 иМ сульфата аммония. Бар: 0.1 мм. Чёрные стрелки — главный корень, чёрные наконечники стрелок — гипокотиль, белые стрелки — боковой корень, белые наконечники стрелок — очаги закладки боковых корней.

Как показывает рисунок 7, замена в

питательнои среде нитратного азота на

аммонийный существенно снижала рост корневой системы. При этом наблюдалось

значительное снижение длины корневой системы у растении, выросших на аммонии

(рис. 7Б). Ингибирование роста корней по основным изученным параметрам было особенно ярким при использовании аммония в концентрации 20 мМ (рис. 7В).

Определение активности GUS в корнях растений на нитратном и аммонийном источниках азота обнаружило серьёзные различия по её проявлению. В корне проростков на питательной среде с нитратом активность GUS была высокой. Уже через три дня от начала прорастания семян на аммонийном азоте происходило существенное снижение активности GUS в кончике корня и по длине сосудистой системы корня (рис. 8А, Б, В), особенно резко это проявлялось в присутствии 20 мМ аммония (рис. 8В). У растений на среде с нитратами высокая активность GUS сохранялась в кончике корня и боковых корней в течение всего изученного срока (3 недели) (рис. 8Г). В растениях на питательной среде с аммонием активность GUS исчезала из обычных участков её местонахождения: из меристем, корневого чехлика, общая её интенсивность в сосудистой системе снижалась и постепенно исчезала (рис. 8Д, Е, Ж). В присутствии 20 мМ аммония в питательной среде снижение активности GUS в кончике корней и по всей длине корня происходило быстрее. Это показывало, что корневая система не выполняла функции снабжения побегов цитокининами. Возможно, это являлось одной из причин ингибирования роста надземных органов растений на аммонийном источнике азота.

Влияние экзогенных иитокининов

Для проверки вопроса о том, насколько опосредуют цитокинины влияние нитрата на морфологию растения и наоборот, насколько дефицит цитокининов определяет нарушение морфологии растений на аммонийном азоте, были поставлены эксперименты, в которых в питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота хлорид аммония, добавляли транс-зеатин в концентрациях от Ю"10 до 10"6 М. Основные данные были получены на растениях линии Н.

Высокие концентрации цитокининов (10"6М) оказывали негативное влияние на морфологию растения. Полностью отсутствовал корень, нарушалась форма семядолей, настоящие листья у растения практически не развивались. Активность GUS была высокой в семядолях, в основании гипокотиля и полностью отсутствовала в семядольном узле. Растения, выросшие на среде, содержащей транс-зеатин в

концентрации 10" М, практически не отличались от контрольных растений, выросших на среде без цитокининов.

На среде, содержащей цитокинины в концентрациях 10"8 и 10"9М, у большинства растений развитие надземной части было более близким к развитию растений, выращенных на нитрате: увеличивалась площадь листьев, приближаясь по размеру к листьям растений, выращенных на нитрате (рис. 9А). Листья имели отчётливые черешки, однако длина черешков при этом была промежуточной — выше, чем у аммонийных растений, однако ниже, чем у растений, выращенных на нитрате (рис. 9Б).

5 4 3

2 Н 1 О

—■—Аммоний и цитокинин ------- Аммоний

—Нитрат

О

2 2

га

Э

а

<а т га х 5

1—Аммоний и цитокинин -•■Аммоний - Нитрат

18

12 15 18

1—Аммоний и цитокинин -••Аммоний

- - Нитрат ,1 /'

3 6 9 12 15 18 21 Возраст, сутки

—■—Аммоний и цитокинин ■•-♦--- Аммоний - -о- - Нитрат

8

6 9 12 15 18 21 Возраст, сутки

Рисунок 9. Морфологические параметры растений, выращенных на МС1/2, содержащей в качестве источника азота 2 мМ хлорида аммония с добавлением трвнс-зеатипа. Линия Н. Для сравнения приведены данные для растений, выращенных на среде, содержащей в качестве единственного источника азота 2 мМ нитрата калия или 2 мМ хлорида аммония. А. Площадь листа 1 яруса. Б. Длина листа 1 яруса. В, Г. Общая длина корневой системы. Концентрации /иранс-зеатина: А, Б, В —10"9 М, Г — 10~8 М.

Торможение роста корневой системы и ингибирование закладки боковых

корней характерно для действия экзогенного цитокинина (1л е1 а1., 2006; ОеЫ й а1.,

2005), ярче оно проявлялось при концентрации цитокинина 10"8 М (рис. 9Г). При этом

20

корни растений, выращенные на среде, содержащей 10"4 M транс-зеатина, не

показали значительных отклонений по длине от корней растений, выращенных на 2 мМ аммонии (рис. 9В).

Активность GUS в листьях растений линии Н, выращенных на 10"s и Ю'ЧМ цитокинина, проявлялась так же, как и в растениях, выращенных на нитрате: была высокой в черешках и наблюдалась в областях гидатод (рис. 10).

Таким образом, экзогенные цитокинины в концентрации 10~8—10"ЧМ стимулировали развитие побега и до некоторой степени могли заменить недостаток нитрата в среде. ВЫВОДЫ

На растениях Arabidopsis thaliana, трансформированных маркерным GUS-геном под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5-гена, проведено сравнительное изучение роста и активности GUS, отражающей уровень активных форм цитокининов в тканях, и получены следующие закономерности.

1. С помощью анализа экспрессии GLß-reHa впервые установлена динамика уровня активных форм цитокининов в онтогенезе листа Arabidopsis thaliana, показано их накопление в ходе роста листа и падение после его остановки.

2. Показана локализация активных форм цитокининов в тканях листа с преобладанием в проводящей системе и гидатодах, что указывает на поступление цитокининов в листья из корневой системы.

3. Анализ активности GUS в ходе развития растений Arabidopsis thaliana показал смешение накопления активных форм цитокининов из нижних, закончивших рост листьев в верхние растущие листья, что указывает на их перераспределение в онтогенезе растений.

Рисунок 10. Растение, выращенное на MCI/2, содержащей в качестве источника азота 2 мМ хлорида аммония с добавлением 10"'M транс-зеатина. Бар — 1 мм. Линия Н. Возраст растения: 16 дней.

4. Анализ активности GUS в трансформантах, выращенных на нитратном или аммонийном источниках азота, выявил следующие закономерности их влияния на уровень цитокининов в растении:

а) Уровень активных форм цитокининов был выше у растений на нитратном азоте, что соответствовало более активному их росту и развитию по сравнению с растениями на аммонийном азоте.

б) Голодание растений по нитратам вызывало резкое снижение уровня активных форм цитокининов в листьях, который восстанавливался после предоставления растениям нитратного, но не аммонийного азота.

в) Аммонийное питание в отсутствие нитратов угнетало в наших условиях рост растений, приводило к нарушениям развития в листьях сосудистой системы, снижало уровень активных форм цитокининов в растении и изменяло их локализацию в тканях листа.

г) В ходе роста растений на аммонийной среде происходило снижение уровня цитокинина в корнях: исчезновение активности GUS в меристемах, корневом чехлике и сосудистой системе, что свидетельствует о подавлении в корнях метаболических процессов, связанных с синтезом цитокининов.

5. Добавление транс-зеатина в питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота соли аммония, в значительной степени исправляло вызванные им нарушения роста в надземных органах растений.

Список работ по материалам диссертации

1. Штратникова В.Ю., Кулаева О.Н. (2007) Влияние форм азотного питания на GUS-реакцию растений Arabidopsis thaliana, трансформированных GUS-геном под контролем цитокинин-зависимого промотора гена ARR5. В сб. тезисов: Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Часть 1. Сыктывкар, с. 397—398.

2. Кудрякова Н.В., Кузнецов В.В., Штратникова В.Ю., Кулаева О.Н. (2007) Факторы индукции старения в регуляции экспрессии PArr5-GUS гена у Arabidopsis thaliana. В сб. тезисов: Современная физиология растений: от молекул до экосистем. Часть 1. Сыктывкар, с. 192—193.

3. Штратникова В.Ю., Кулаева О.Н. (2007) Влияние форм азотного питания на GUS-реакцию Arabidopsis thaliana, трансгенного по гену ARR5::GUS. В сб.

тезисов: Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности. М., с. 89—90.

4. Штратникова В.Ю. (2008) Влияние форм азотного питания на рост и GUS-активность растений Arabidopsis thaliana, трансформированных конструкцией pARR5::GUS. В сб. тезисов: Ломоносов-2008. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология». М., МАКС Пресс, с. 200—201.

5. Штратникова В.Ю. (2008) Цитокинин-зависимая экспрессия гена pARR5::GUS при развитии растений Arabidopsis thaliana в зависимости от форм азотного питания. В сб. тезисов: Студент и научно-технический прогресс. Новосибирск, с. 43—44.

6. Shtratnikova V.Y., Kulaeva O.N. (2008) Effects of types of nitrogen nutrition on growth and GUS-activity in Arabidopsis thaliana plants transformed with pARR5::GUS construct. In: Abstracts of XVI Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB), Tampere, Finland. Physiologia Plantarum, 133, P01-67.

7. Kudryakova N.V., Kusnetsov V.V., Shtratnikova V.Y., Kulaeva O.N. (2008) Effects of cytokinin and senescence-inducing factors on expression of Pams-GUS gene construct during leaf senescence in transgenic Arabidopsis thaliana plants. Plant Growth Regul., 56, 21—30.

8. Штратникова В. Ю., Кулаева О. Н. (2008) Цитокинин-зависимая экспрессия ARR5::GUS-конструкции в ходе роста трансгенных растений Arabidopsis thaliana. Физиология растений, 55, 842—850.

9. Кудрякова Н.В., Штратникова В.Ю., Кулаева О.Н. (2008) Экспрессия pARR5::GUS в срезанных листьях растений Arabidopsis thaliana и её индукция нитратами. В сб. тезисов Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений. Екатеринбург, с. 231—232.

Заказ № 71/04/09 Подписано в печать 14.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

"д ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 Х^Д/ www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Штратникова, Виктория Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Цели и задачи исследования.

Раздел 1. Обзор литературы.

Глава 1.1. Цитокинины и их роль в росте растения.

1.1.1. Физиологическая роль цитокининов.

1.1.2. Многообразие цитокининов.

1.1.3. Модификации цитокининов.

1.1.4. Синтез цитокининов.

1.1.5. Деградация цитокининов.

Глава 1.2. Система рецепции и передачи цитокининового сигнала.

Глава 1.3. Роль цитокининов в процессах старения.

Глава 1.4. Взаимосвязь цитокининового и нитратного метаболизма.

1.4.1. Влияние форм азота в питательной среде на развитие растений.

1.4.2. Влияние азотного питания на метаболизм цитокининов

1.4.3. Влияние неорганического азота на гены синтеза цитокининов.

1.4.4. Влияние неорганического азота на уровень цитокининов

1.4.5. Влияние неорганического азота и цитокининов на регуляторы ответа.

Глава 1.5. Ген ARR5 и его использование для определения цитокининового статуса растения.

Раздел 2.

Глава 2.6. Материалы и методы.

Раздел 3. Результаты и их обсуждение.

Глава 3.7. Анализ применимости метода оценки уровня цитокининов по активности GUS в тканях растений Arabidopsis thaliana, трансформированных маркёрным геном GUS под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5-TQua.

Глава 3.8. Сравнительное изучение роста листьев и активности GUS

Глава 3.9. Влияние нитратного и аммонийного азота в питательной среде на рост и цитокинин-зависимую активность GUS в растениях Arabidopsis.

3.9.1. Изменение активности GUS в растениях, голодающих по нитрату.

3.9.2. Характеристика роста и активности GUS в листьях растений, выращенных на питательной среде, содержащей аммонийный или нитратный азот.

3.9.3. Сравнительное изучение влияния на рост и активность GUS в растениях Arabidopsis thaliana солей аммония в концентрациях 20 и 2 мМ.

Глава 3.10. Морфологические параметры и активность GUS в корнях растений Arabidopsis thaliana, выращенных на средах с различными источниками азота.

Глава 3.11. Влияние экзогенных цитокининов на растения Arabidopsis thaliana, выращенные на среде с 2 мМ аммония в качестве единственного источника азота.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитокинин-зависимая экспрессия ARR5::GUS конструкции в ходе роста трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на нитратном и аммонийном источниках азота"

Цитокинины принимают участие в регуляции жизни растения на всех этапах онтогенеза от оплодотворения яйцеклетки до старения и смерти. Они участвуют в регуляции деления клеток (Skoog and Miller, 1957), дифференцировке хлоропластов, индуцируют стеблевой морфогенез, задерживают старение листьев (Кулаева, 1962), участвуют в регуляции транспорта метаболитов в растении; с их помощью корневая система -регулирует функциональную активность в надземных органах, в частности, в листьях (Кулаева, 1973, 1987; Мок and Мок, 2001).

О связи цитокининового метаболизма с нитратным питанием известно ещё с 1962 г. (Кулаева, 1962), когда было обнаружено, что нитрат, подаваемый через корни, изменяет реакцию растений на их обработку кинетином. В последнее десятилетие были локализованы гены синтеза цитокининов (AtlPTl—9), и показано, что ген AtIPT3 играет основную роль в синтезе цитокининов в растении в ответ на нитратное питание при азотном голодании, а ген AtIPT5 — в условиях достаточности источников азотного питания (Miyawaki et al., 2004; Takei et al., 2004a). Показно, что при добавлении нитрата к голодающим растениям накапливаются транспортные формы цитокинина в корнях, увеличивается их содержание в пасоке и активных форм цитокининов в листьях, где они вызывают накопление транскриптов регуляторов ответа (Takei et al., 2001b; Sakakibara et al., 1998).

Нитратная и аммонийная форма азота оказывают серьёзное влияние на морфологию растения. На многие растения, в том числе Arabidopsis thaliana, аммонийная форма азота в качестве единственного источника азота, действует негативным образом: угнетается рост побегов (Walch-Liu et al., 2000) и корней (Cao et al., 1993). Ингибирование роста в присутствии аммония приписывают нескольким причинам, одну из которых видят в недостатке нитрата как молекулы, связанной с метаболизмом цитокининов (Walch-Liu et al., 2000). Угнетению роста растений табака на аммонийном азоте соответствовало снижение содержания в пасоке зеатина и его рибозида (Walch-Liu et al., 2000). Перенос растений томатов с раствора аммония на раствор с нитратом вызывал синхронную активацию роста листьев и содержания в листьях и пасоке зеатина и его рибозида (Rahayu et al., 2005). Это подчёркивает сигнальную роль цитокининов в активации роста листьев нитратным азотом.

Гены ARR являются генами-регуляторами ответа в гистидин-киназном цитокининовом сигналинге Arabidopsis. Ген ARR5 относится к ARR-генам группы А, которые характеризуются быстрым и специфическим ответом на активные формы цитокининов, среди которых гены ARR4, 5 и 6 являются наиболее чувствительными и информативными репортёрами цитокининового действия (Brenner et al., 2005). В 2000 году (D'Agoustino et al., 2000) было получено трансгенное растение с конструкцией ARR5::GUS, где репортёрный ген (3-глюкуронидазы находился под контролем промотора гена ARR5. При обработке цитокининами активировалась экспрессия ARR5 во всех тканях растения. Было показно, что экспрессия конструкции ARR5::GUS повышалась при обработке Arabidopsis thaliana возрастающими концентрациями бензиладенина (D'Agoustino et al., 2000; Romanov et al., 2002; Lopez-Bucio et al., 2007), а при снижении концентрации эндогенных цитокининов в результате трансформации растений геном оксидазы цитокинина уровень ^.Я^.-.-Сгб^-активности снижался (Werner et al., 2003). Aloni с соавторами (Aloni et al., 2005) с помощью иммунолокализации показали, что участки высокой GUS-активности совпадают с участками высоких концентраций цитокининов. Таким образом, было доказано, что GUS-активность конструкции ARR5::GUS действительно отражает уровень активных цитокининов в растениях.

Однако до сих пор не проводилось систематических исследований, позволяющих установить изменение распределения цитокининов по растению в ходе его развития. Также не было данных, характеризующих это 7 распределение при выращивании растений на различных источниках азотного питания в течение длительного срока развития. Использование экспрессии ARR5::GUS конструкции, в которой ген репортёрного белка GUS находился под контролем цитокинин-зависимого промотора, предоставила хорошие методические возможности для выяснения этих вопросов.

Цели и задачи исследования

Цель работы состояла в том, чтобы изучить, как уровень активных цитокининов, о котором судили по активности GUS в растениях A. thaliana, трансформированных GUS-теном под контролем цитокинин-зависимого промотора у4&К5-гена, коррелирует с ростовыми процессами в трансформантах и как эти процессы зависят от нитратного и аммонийного питания растений.

В задачи работы входили

1. Проверка реакции промотора ^4&Я5-гена на изменение уровня цитокинина в листьях трансгенных растений Arabidopsis.

2. Сравнение роста листьев растений и цитокинин-зависимой экспрессии в них GUS-TQua в качестве критерия уровня в них активных форм цитокининов.

3. Изучение изменений в локализации активных форм цитокининов в ходе роста растений.

4. Сравнение особенностей распределения активных форм цитокининов в листьях и корнях растений, выращенных на нитратном и аммонийном источниках азота.

5. Изучение влияния экзогенного цитокинина на морфогенез и экспрессию ARR5::GUS-KOHcipyKWiH в трансгенных растениях Arabidopsis в условиях аммонийного питания.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Штратникова, Виктория Юрьевна

Выводы

На растениях Arabidopsis thaliana, трансформированных маркерным GUS-tghom под контролем цитокинин-зависимого промотора -проведено сравнительное изучение роста и активности GUS, отражающей уровень активных форм цитокининов в тканях, и получены следующие закономерности.

1. С помощью анализа экспрессии GUS-reua впервые установлена динамика уровня активных форм цитокининов в онтогенезе листа Arabidopsis thaliana, показано их накопление в ходе роста листа и падение после его остановки.

2. Показана локализация активных форм цитокининов в тканях листа с преобладанием в проводящей системе и гидатодах, что указывает на поступление цитокининов в листья из корневой системы.

3. Анализ активности GUS в ходе развития растений Arabidopsis thaliana показал смещение накопления активных форм цитокининов из нижних, закончивших рост листьев в верхние растущие листья, что указывает на их перераспределение в онтогенезе растений.

4. Анализ активности GUS в трансформантах, выращенных на нитратном или аммонийном источниках азота, выявил следующие закономерности их влияния на уровень цитокининов в растении: а) Уровень активных форм цитокининов был выше у растений на нитратном азоте, что соответствовало более активному их росту и развитию по сравнению с растениями на аммонийном азоте. б) Голодание растений по нитратам вызывало резкое снижение уровня активных форм цитокининов в листьях, который восстанавливался после предоставления растениям нитратного, но не аммонийного азота. в) Аммонийное питание в отсутствие нитратов угнетало в наших условиях рост растений, приводило к нарушениям развития в листьях сосудистой системы, снижало уровень активных форм цитокининов в растении и изменяло их локализацию в тканях листа, г) В ходе роста растений на аммонийной среде происходило снижение уровня цитокинина в корнях: исчезновение активности GUS в меристемах, корневом чехлике и сосудистой системе, что свидетельствует о подавлении в корнях метаболических процессов, связанных с синтезом цитокининов.

5. Добавление /прянс-зеатина в питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота соли аммония, в значительной степени исправляло вызванные им нарушения роста в надземных органах растений.

Благодарности

За работу над своей диссертацией мне бы хотелось поблагодарить в первую очередь своего научного руководителя Кулаеву Ольгу Николаевну.

Не меньшую признательность я выражаю коллективу лаборатории экспрессии генома растений ИФР РАН, особенно Кудряковой Наталье Васильевне за плодотворное сотрудничество, Каравайко Наталье Николаевне за технические консультации, всем сотрудникам за важные критические замечания и моральную поддержку, заведующему лабораторией Кузнецову Виктору Васильевичу за организацию всей работы, а также директору ИФР РАН Кузнецову Владимиру Васильевичу за предоставленную возможность для работы над диссертацией.

Я приношу глубокую благодарность сотрудникам кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ: Харитонашвили Елене Владимировне, Полесской Ольге Генриховне, Алёхиной Наталье Дмитриевне, Чубу Владимиру Викторовичу — за ценные теоретические консультации и практическую помощь; Лазаревой Екатерине Алексеевне, Кочетовой Галине Владимировне, Аверчевой Ольге Владимировне и Лабунской Елене Алексеевне за моральную поддержку; и в особенности, .заведующему кафедрой Ермакову Игорю Павловичу.

За методические идеи, советы, консультации и рекомендации мне хотелось бы поблагодарить сотрудника НИИ им. Белозерского Дмитрия Кнорре и сотрудника каф. физиологии и биохимии растений СПбГУ Григория Пожванова.

Я также очень признательна за неоценимую помощь в организации основной части работы — бинокулярных фотосъёмок — сотруднику кафедры генетики биологического факультета МГУ Ленину Алексею и сотруднице НИИ им. Белозёрского Логачёвой Марии.

Заключение

Работа, проделанная нами, выявила некоторые закономерности распределения цитокининов в различных органах растения в ходе его роста и развития. Мы установили, что цитокинины накапливаются в листе только в период активного его роста, после прекращения которого уровень цитокининов в них быстро снижается, происходит перераспределение цитокининов в пользу более молодых, растущих органов.

Были получены данные, являющиеся очередным свидетельством в -пользу гипотезы, утверждающей, что нарушения развития растения под действием аммония в качестве единственного источника азота, вызваны отсутствием нитрата как сигнальной молекулы. Один из механизмов этих нарушений связан, по-видимому, с ингибированием синтеза цитокининов в корнях. Добавление экзогенных цитокининов в небольших количествах может частично исправить нарушения морфологии и способствовать развитию надземной части растения, при этом происходит сдвиг отношения побеги/корни в пользу надземной части.

Данные по сравнению экспрессии GUS-гена под контролем цитокинин-- зависимого промотора ARR5-гена на средах, содержащих нитрат или аммоний в качестве единственного источника азота, являются приоритетными и способствуют нашему пониманию процессов взаимодействия элементов минерального питания и регуляторной фитогормональной системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Штратникова, Виктория Юрьевна, Москва

1. Кулаева О.Н. (1962) Влияние корней на обмен веществ листьев в связи с проблемой действия кинетина на лист. Физиология растений, 9, 229—239.

2. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука, 263 с.

3. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2002) Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. Физиология растений, 49, 626—640.

4. Пожванов Г.А., Медведев С.С. (2008) Метод количественной оценки содержания ауксина по гистохимическому окрашиванию на GUS-активность. Физиология растений, 55, 786—792.

5. Полесская О.Г., Каширина Е.И., Андреева С.Е., Горяева О.В., Глазунова М.А., Алёхина Н.Д. (2001) Морфофизиологические параметры донорного листа при акклимации пшеницы к условиям азотного питания. Физиология растений, 48, 829—835.

6. Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Люкевич Т.В., Кузнецов В.В., Лось Д.А., Кулаева О.Н. (2006) Реакция на цитокинин у цианобактерий. Физиология растений, 53, 851-956.

7. Aloni R., Aloni Е., Langhans М., Ullrich C.I. (2006) Role of cytokinin and auxin in shaping root architecture: regulating vascular differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Ann. ofBot., 97, 883—893.

8. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Dreieicher E., Ullrich C.I. (2005) Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream. J. Exp. Bot., 56, 1535—1544.

9. Aloni R., Langhans M., Aloni E., Ullrich C.I. (2004) Role of cytokinin in the regulation of root gravitropism. Planta, 220, 177—182.

10. Arnon D.I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol, 24, 1—15.

11. Battraw M.J., Hall T.C. (1990) Histochemical analysis of CaMV 35S promoter-P-glucuronidase gene expression in transgenic rice plants. Plant Mol. Biol, 15, 527—538.

12. Bedell J. P., Chalot M., Gamier A., Botton B. (1999) Effects of nitrogen source on growth and activity of nitrogen-assimilating enzymes in Douglas-fir seedlings. Tree Physiology, 19, 205—210.

13. Beemster G.T.S., Baskin T.I. (2000) STUNTED PLANT 1 mediates effects of cytokinin, but not of auxin, on cell division and expansion in the root of Arabidopsis. Plant Physiol, 124, 1718—1727.

14. Benkova E., Michniewicz M., Sauer M., Teichmann Т., Selfertova D., Jurgens G., Friml J. (2003) Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell, 115, 591—602.

15. Block De M., Debrouwer D. (1992) In-situ enzyme histochemistry on plastic-embedded plant material. The development of an artefact-free (3-glucuronidase assay. Plant J., 2, 261—266.

16. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein. Anal Biochem., 72, 248—254.

17. Brandstatter I., Kieber J.J. (1998) Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 1009—1019.

18. Buchanan-Wollaston V., Ainsworth C. (1997) Leaf senescence in Brassica napus: cloning of senescence related genes by subtractive hybridization. PlantMol. Biol., 33, 821—834.

19. Buchanan-Wollaston V., Earl S., Harrison E., Mathas E., Navabpour S., Page Т., Pink D. (2003) The molecular analysis of leaf senescence — a genomics approach. PlantBiotechnol. J.,1, 3—22.

20. Candela H., Martinez-Laborda A., Micol J. L. (1999) Venation pattern formation in Arabidopsis thaliana vegetative leaves. Dev. Biol., 205, 205— 216.

21. Cao Y., Glass A.D.M., Crawford N.M. (1993) Ammonium inhibition of Arabidopsis root growth can be reversed by potassium and auxin resistance mutations aux 1, axrl and axrl. Plant Physiol., 102, 983—-989.

22. Casimiro I., Marchant A., Bhalerao R.P., Beeckman Т., Dhooge S., Swarup R., Graham N., Inze D., Sandberg G., Casero P.J., Bennett M. (2001) Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell, 13, 843—852.

23. Chaillou S., Vessey J.K., Morot-Gaudry J.F., Raper C.D., JR., Henry L.T., Boutin J.P. (1991) Expression of characteristics of ammonium nutrition as affected by pH of the root medium. J. Exp. Bot., 42, 189—196.

24. Che P., Lall S., Howell S.H. (2007) Developmental steps in acquiring competence for shoot development in Arabidopsis tissue culture. Planta, 226,1183—1194.

25. Chen C.M. (1981) Biosynthesis and enzymic regulation of the interconversion of cytokinin. In: Metabolism and molecular activities of cytokinins, Guern J., Peaud-Lenoel C. (eds.) Heidelberg: Springer-Verlag, pp. 34—43.

26. Cramer M.D., Lewis O.A.M. (1993) The influence of N03 and NHt nutrition on the carbon and nitrogen partitioning characteristics of wheat (Triticum aestivum L.) and maize (Zea mays L.) plants. Plant and Soil, 154, 289—300.

27. D'Agostino I.B., Deruere J., Kieber J.J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol., 124, 1706—1717.

28. Debi R. В., Taketa S., Ichii M. (2005) Cytokinin inhibits lateral root initiation but stimulates lateral root elongation in rice (Oiyza sativa). J. Plant Physiol. 162, 507—15.

29. Drew M.C. (1975) Comparison of the effects of a localized supply of phosphate, nitrate, ammonium and potassium on the growth of the seminal root system, and the shoot, in barley. New Phytol., 75, 479—490.

30. Ferreira F.J., Kieber J.J. (2005) Cytokinin signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 518—525.

31. Gan S., Amasino R.M. (1997) Making sense of senescence: molecular genetic regulation and manipulation of leaf senescence. Plant Physiol., 113, 313—319.

32. Gepstein S., Sabehi G., Carp M.J., Hajouj Т., Falah M., Nesher O., Yariv I., Dor C., Bassani M. (2003) Large-scale identification of leaf senescence-associated genes. Plant J., 36, 629—642.

33. Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. (2002) Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol 49, 161—169.

34. Gregersen P.L., Holm P.B. (2007) Transcriptome analysis of senescence in the flag leaf of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Biotechnol J., 5, 192—206.

35. Guo Y., Cai Z., Gan S. (2004) Transcriptome of Arabidopsis leaf ' senescence. Plant Cell Environ., 27, 521—549.

36. Hensel L.L., Grbic V., Baumgarten D.A., Bleecker A.B. (1993) Developmental and age related processes that influence the longetivity and senescence of photosynthetic tissues in Arabidopsis plants. Plant Cell, 5, 553—564.

37. Himanen I.K., Boucheron E., Vanneste S., de Almeida E.J., Inze D., Beeckman T. (2002) Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell, 14, 2339—2351.

38. Hirose N., Makita N., Kojima M., Kamada-Nobusada Т., Sakakibara

39. H. (2007) Overexpression of a type-A response regulator alters rice morphology and cytokinin metabolism. Plant Cell Physiol., 48, 523—539.

40. Hirose N., Takei K., Kuroha Т., Kamada-Nobusada Т., Hayashi H., Sakakibara H. (2008) Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation. J. Exp. Bot., 59, 75—83.

41. Hodal L., Bochardt A., Nielsen J.E., Mattsson O., Okkels F.T. (1992) Detection, expression and specific elimination of endogenous glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants. Plant Sci., 87, 115—122.

42. Hwang C.F., Lin Y., D'Souza Т., Cheng C.L. (1997) Sequences necessary for nitrate-dependent transcription of Arabidopsis nitrate reductase genes. Plant Physiol., 113, 853-—62.

43. Hwang I., Chen H.-C., Sheen J. (2002) Two-component signal transduction pathways in Arabidopsis. Plant Physiology, 129, 500—515.

44. Hwang I., Sheen J. (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis signal transduction. Nature, 413, 383—389.

45. Imamura A., Hanaki N., Umeda H., Nakamura A., Suzuki Т., Ueguchi C., Mizuno T. (1998) Response regulators implicated in His-to-Asp phosphotransfer signaling in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2691—2696.

46. Inoue Т., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato Т., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. (2001) Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature, 409, 1060—1063.

47. Jefferson R.A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. PlantMol. Biol. Rep., 5, 385—405.

48. Jefferson R.A. (1989) The GUS reporter gene system. Nature, 342, 837— 838.

49. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. (1986) P-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447—8451.

50. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. (1987) GUS-Fusion: glucuronidase as a sensitive and versatile gene-fusion marker in higher plants. EMBOJ., 6, 3901—3907.

51. Jung J.H., Yun J., Seo Y.H., Park C.M. (2005) Characterization of an Arabidopsis gene that mediates cytokinin signaling in shoot apical meristem development. Mol Cells, 19, 342—349.

52. Kakimoto T. (2001) Plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyl-transferases. Plant Cell Physiol., 42, 677—685.

53. Kamfnek M., Motyka V., Vankova R. (1997) Regulation of cytokinin content in plant cells. Phys. Plant., 101, 689—700.

54. Kende H. (1964) Preservation of chlorophyll in leaf sections by substances obtained from root exudate. Science, 145, 1066—1067.

55. Kiba Т., Taniguchi M., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. (1999) Differential expression of genes for response regulators in response to cytokinins and nitrate in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 40, 767—771.

56. Kiba Т., Yamada H., Sato S., Kato Т., Tabata S., Yamashino Т., Mizuno Т. (2003) The Type-A response regulator, ARR15, acts as a135negative regulator in the cytokinin-mediated signal transduction in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 44, 868—874.

57. Kim H.J., Ryu H., Hong S.H., Woo H.R., Lim P.O., Lee I.C., Sheen J., Nam H.G., Hwang I. (2006) Cytokinin-mediated control of leaf longevity by AHK3 through phosphorylation of ARR2 in Arabidopsis. Proc Natl Acad SciUSA, 103,814—819.

58. Kuderova A., Urbankova I., Valkova M., Malbeck J, Brzobohaty В., Nemethova D., Hejatko J. (2008) Effects of conditional IPT-dependent cytokinin overproduction on root architecture of Arabidopsis seedlings. Plant Cell Physiol., 49, 570—582.

59. Kuiper D. (1988) Growth responses of Plantago major L. ssp. pleiosperma (Pilger) to changes in mineral supply. Evidence for reulation by cytokinins. -Plant Physiol, 87, 555—557.

60. Kuiper D., StaaL M. (1987) The effects of exogenously applied plant growth substances on the physiological plasticity in Plantago major ssp. pleiosperma: Responses of growth, shoot to root ratio and respiration. Physiol Plant., 69, 651—658.

61. Kulaeva O.N., Prokoptseva O.S. (2004) Recent advances in the study of mechanisms of action of phytohormones. Biochemistfy (Mosc), 69, 233— 247.

62. Kulaeva O.N., Zagranichnaya Т.К., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Y., Zemlyachenko Y.V., Hall M., Lipkin V.M., Boziev

63. K.M. (1998) A new family of cytokinin receptors from Cereales. FEBS Lett., 423, 239—242.

64. Kurakawa Т., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M., Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007) Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature, 445, 652—655.

65. Laskowski M.J., Williams M.E., Nusbaum H.C., Sussex I.M. (1995) Formation of lateral root meristems is a two stage process. Dev., 121, 3303—3310.

66. Lee D.J., Kim S., Ha Y.M., Kim J. (2008) Phosphoiylation of Arabidopsis response regulator 7 (ARR7) at the putative phospho-accepting site is required for ARR7 to act as a negative regulator of cytokinin signaling. Planta, 227, 577—587.

67. Leibfried A., To J.P.C., Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J.J., Lohmann J.U. (2005) WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators. Nature, 438, 1172—1175.

68. Letham D.S., Shannon I.S., McDonald R. (1964) The structure o^-zeatin, a factor inducing cell division. Proc. Chem. Soc., 7, 230.

69. Li X., Mo X., Shou H., Wu P. (2006) Cytokinin-mediated cell cycling arrest of pericycle founder cells in lateral root initiation of Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 47, 1112—1123.

70. Lim P.O., Woo H.R., Nam H.G. (2003) Molecular genetics of leaf senescence in Arabidopsis. Trends Plant Sci., 8, 272—278.

71. Little Y.D., Rao H., Oliva S., Daniel-Vedel F., Krapp A., Malamy J.E. (2005) The putative high-affinity nitrate transporter NRT2.1 represses lateral root initiation in response to nutritional cues. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 102, 13693—13698.

72. Lohar D.P., Schaff J.E., Laskey J.G., Kieber J.J., Bilyeu K.D., Bird D.M. (2004) Cytokinins play opposite roles in lateral root formation, and nematode and Rhizobial symbioses. Plant J., 38, 203—214.

73. Malamy J. E. (2005) Intrinsic and environmental response pathways that regulate root system architecture. Plant, Cell Env., 28, 67—77.

74. Malamy J., Benfey P. (1997) Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana. Dev., 124, 333—344.

75. Malamy J., Ryan K. (2001) Environmental regulation of lateral root initiation in Arabidopsis. Plant Physiol., 127, 899—909.

76. Martin Т., Schmidt R., Altmann Т., Frommer W.B. (1992) Nondestructive assay systems for detection of ^-glucuronidase activity in higher plants. Plant Mol. Biol. Rep., 10, 37—46.

77. Miller C.O. (1961) Kinetin and related compounds in plant growth. Annu.Rev. Plant. Physiol., 12, 395—408.

78. Miyata S.-i., Urao Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1998) Characterization of genes for two-component phosphorelay mediators with a single HPt domain in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 437, 11—14.

79. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenytransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J., 37, 128—138.

80. Мок D.W., Мок M.C. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol, 52, 89—118.

81. Мок D.W.S., Мок M.C. (1994) Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Boca Raton, FL

82. Mothes K., Engelbrecht L., Kulajewa O. (1959) Uber die Wirkung des Kinetins auf Stickstoffverteilung und EiweiBsynthese in isolierten Blattern. Flora 147, 445—464.

83. Motyka V., Vankova R., Capkova V., Petrasek J., Kammek M., Schmiilling T. (2003) Cytokinin-induced upregulation of cytokinin oxidase activity in tobacco includes changes in enzyme glycosylation and secretion. Physiol Plant., 117, 11—21.

84. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato Т., Tabata S., Ueguchi C. (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell, 16, 1365—1377.

85. Novel G., Novel M. (1973) Mutants of E. coli К 12 unable to grow on methyl-beta-D-glucuronide: map location of uidA locus of the structural gene of beta-D-glucuronidase. Mol Gen. Genet., 120, 319—335.

86. Peuke A.D., Jeschke W.D., Hartung W. (1998) Foliar application of nitrate or ammonium as sole nitrogen supply in Ricimis communis. II. The flows of cations, chloride and abscisic acid. New Phytol. 140, 625—636.

87. Raab Т.К., Terry N. (1994) Nitrogen source regulation of growth and photosynthesis in Beta vulgaris L. Plant Physiol., 105, 1159—1166.

88. Rahayu Y.S., Walch-Liu P., Neumann G., Romheld V., Wiren N., Bangerth F. (2005) Root-derived cytokinins as long-distance signals for N03-induced stimulation of leaf growth. J. Exp. Bot., 56, 1143—1152.

89. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol., 132, 1998— 2011.

90. Rauh B.L., Basten C., Buckler IV E. S. (2002) Quantitative trait loci analysis of growth response to varying nitrogen sources in Arabidopsis thaliana. Theor. Appl. Genet., 104, 743—750.

91. Richmond A.E., Lang A. (1957) Effect of kinetin on protein content and survival of detached Xanthium leaves. Science, 125, 650—651.

92. Romanov G.A., Kieber J.J., Schmulling T. (2002) A rapid cytokinin response assay in Arabidopsis indicates a role for phospholipase D in cytokinin signalling. FEBSLett., 515, 39—43.

93. Romanov G.A., Lomin S.N., Schmulling T. (2006) Biochemical characteristics and ligand-binding properties of Arabidopsis cytokininreceptor АНКЗ compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay. J. Exp. Bot., 57, 4051-4058.

94. Sabatini S., Beis D., Wolkenfelt H., Murfett J., Guilfoyle Т., Malamy J., Benfey P., Leyser O., Bechtold N., Weisbeek P., Scheres B. (1999) An auxin-dependent distal organizer of pattern and polartity in the Arabidopsis root. Cell, 99, 463—472.

95. Sakai H., Aoyama Т., Bono H., Oka A. (1998) Two-component response regulators from Arabidopsis thaliana contain a putative DNA-binding motif. Plant Cell Physiol., 39, 1232—1239.

96. Sakai H., Aoyama Т., Oka A. (2000) Arabidopsis ARR1 and ARR2 response regulators operate as transcriptional activators. Plant J., 24, 703— 711.

97. Sakai H., Honma Т., Aoyama Т., Sato S., Kato Т., Tabata S., Oka A.2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science, 294, 1519—1521.

98. Sakakibara H. (2006) Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Annu. Rev. Plant Biol., 57, 431—449.

99. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. (1998) A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize. Plant J., 14, 337—344.

100. Scheres В., Benfey P., Dolan L. (2002) Root development. In: The Arabidopsis Book. Somerville C. R., Meyerowitz E. M. (eds.) American Society of Plant Biologists, Rockville, MD. http://www.aspb.org/downloads/arabidopsis.

101. Signora L., De Smet I., Foyer C.H., Zhang H. (2001) ABA plays a central role in mediating the regulatory effects of nitrate on root branching in Arabidopsis. Plant J., 28, 655—662.

102. Singh S., Letham D.S., Zhang X., Palni L.M.S. (1992) Cytokinin biochemistry in relation to leaf senescence. Part IV. Effect of nitrogenous141nutrients on cytokinin levels and senescence of tobacco leaves. Physiol. Plant., 84, 262—268.

103. Skoog F., Miller C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol, 54, 118— 130.

104. Smet De I., Signora L., Beeckman Т., Foyer C.H., Zhang H. (2003) An abscisic acid-sensitive checkpoint in lateral root development of Arabidopsis. Plant J., 33, 543—555.

105. Sporlein В., Mayer A., Dahlfeld G., Koop H.U. (1991) A microassay for quantitative determination of P-glucuronidase reporter gene activities in individually selected single higher plant cells. Plant Sci., 78, 73—80.

106. Stitt M. (1999) Nitrate regulation of metabolism and growth. Curr. Opin. Plant Biol, 2, 178—186.

107. Strnad M., Hanus J., Vanek Т., Kamrnek M., Ballantine J.A., Fussell В., Hanke D.E. (1997) Meta-topolin, a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus x canadensis Moench., cv. Robusta). Phytochemistty, 45, 213—218

108. Suzuki Т., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno T. (1998) Histidine-containing phosphotransfer (HPt) signal transducers implicated in His-to-Asp phosphorelay in Arabidopsis. Plant Cell Physiol., 39, 1258—1268.

109. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. (2001a) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol Chem., 276, 26405—26410.

110. Takei K., Ueda N., Aoki K., Kuromori Т., Hirayama Т., Kazuo S., Yamaya Т., Sakakibara H. (2004a) AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiology, 45, 1053—1062.

111. Takei K., Yamaya Т., Sakakibara H. (2004b). Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J. Biol Chem., 279, 41866—41872.

112. Taniguchi M., Kiba Т., Sakakibara H., Ueguchi C., Mizuno Т., Sugiyama T. (1998) Expression of Arabidopsis response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. FEBSLett., 429, 259—262.

113. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki Т., Mizuno T. (2001) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Nature, 42, 231—235.

114. Urao Т., Miyata S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2000) Possible His to Asp phosphorelay signaling in an Arabidopsis two-component system. FEBS Lett., 478, 227—232.

115. Urao Т., Yakubov В., Yamaguchi-Shinozaki К., Shinozaki К. (1998) Stress-responsive expression of genes for two-component response regulator-like proteins in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 427, 175—178.

116. Vitha S., Benes K., Michalova M., Ondrej M. (1993) Quantitative |3-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151—155.

117. Vitha S., Benes K., Phillips J.P., Gartland K.M.A. (1995) Histochemical GUS analysis. Methods Mol. Biol, 44, 185—193.

118. Walch-Liu P., Ivanov I.I., Filleur S., Gan Y., Remans Т., Forde B.G. (2006) Nitrogen regulation of root branching. Ann. Bot., 97, 875—881.

119. Walch-Liu P., Neumann G., Bangerth F., Engels C. (2000) Rapid effects of nitrogen form on leaf morphogenesisin tobacco. J. Exp. Bot., 51, 227—237.

120. Wang R., Tischner R., Gutierrez R.A., Hoffman M., Xing X., Chen M., Coruzzi G., Crawford N.M. (2004) Genomic analysis of the nitrate response using a nitrate reductase-null mutant of Arabidopsis. Plant Physiol, 136, 2512—2522.

121. Wiren von N., Gazzarrini S., Gojon A., Frommer W. B. (2000) The molecular physiology of ammonium uptake and retrieval. Curr. Opin. Plant Biol, 3, 254—261.

122. Yanai O., Shani E., Dolezal K., Tarkowski P., Sablowski R., Sandberg G., Samach A., Ori N. (2005) Arabidopsis KNOXI proteins activate cytokinin biosynthesis. Curr. Biol, 15, 1566—1571.

123. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya Т., Sakakibara H.2004) Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinasesin maize. Differential ligand preferences and response to m-zeatin. Plant Physiol 134, 1654—1661.

124. Zhang H., Forde B. (1998) An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Sci., 279, 407—409.

125. Zhang H., Jennings A., Barlow P.W., Forde B.G. (1999) Dual pathways for regulation of root branching by nitrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6529—6534.

126. Zhang H., Rong H., Pilbeam D. (2007) Signalling mechanisms underlying the morphological responses of the root system to nitrogen in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot., 58, 2329—2338.