Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений"

На правах рукописи

005008437

ГЕРАСИМОВА СОФЬЯ ВИКТОРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ГЕНА ОРНИТИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В РАЗВИТИИ И СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 Я Н В 2012

Новосибирск 2011

005008437

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук в лаборатории генной инженерии Института Цитологии и Генетики СО РАН, г. Новосибирска

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А.В. Кочетов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Першина Л. А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Чумаков М.И.

Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт

Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток

Защита диссертации состоится «Ну> 2012 г. на утреннем

заседании диссертационного совета Д 003.C/ll.0'l в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан 2011

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т. М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адаптация растений к неблагоприятным условиям окружающей среды требует реализации сложных генетических программ, в которых задействована скоординированная экспрессия больших генных ансамблей, исследование которых необходимо для понимания молекулярных механизмов стрессоустойчивости. В частности, в ответ на стресс изменяется уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм некоторых аминокислот (Martinelli et al., 2007). К их числу относится ген дельта-орнитинаминотрансферазы (О AT, ЕС 2.6.1.13), кодирующий фермент, катализирующий перенос дельта-аминогруппы орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием пирролин-5-карбоксилата (П5К) и глутамата (Stranska et al., 2008). Эта реакция является частью системы взаимопревращений таких аминокислот, как аргинин, орнитин, глутамат и пролин. Метаболизм этих аминокислот связан с фиксацией, запасанием и ремобилизацией азота, формированием и прорастанием семян, устойчивостью к различным абиотическим стрессам, регуляцией процессов развития (Funck et al., 2008; Canas et al., 2008; Mattioli et al., 2009). Согласно литературным данным, ген OAT принимает участие в ответе на стресс, однако его конкретная биологическая роль остается неясной и является предметом обсуждения (Stranska et al., 2008). Долгое время считалось, что О AT участвует в синтезе пролина при стрессе (Roosens et al., 1998, 2002), однако ряд исследователей опровергают это утверждение и постулируют, что ген ОАТ регулирует деградацию орнитина и связан с системой рециркуляции азота (Funck et al, 2008). Отдельные данные указывают на участие гена ОАТ в ряде других жизненно-важных клеточных процессов (Boon et al., 1999; Slocum, 2005; Page et al., 2010). Потенциально, OAT может являться важным регулятором клеточного метаболизма, поскольку реакция, катализируемая этим ферментом, связывает несколько биохимических систем: цикл мочевины, цикл накопления и деградации пролина и путь биосинтеза полиаминов. Транскрипционная регуляция этого гена не изучена, а его роль в процессах развития и ответе на стресс не определена. Изучение транскрипционной регуляции гена ОАТ и его роли в развитии и стрессоустойчивости необходимо для расширения современных представлений о регуляции клеточного метаболизма, а также для разработки новых способов получения устойчивых форм растений.

Цель н задачи исследования. Целью данной работы является исследование роли гена дельта-орнитинаминотрансферазы (ОАТ) в развитии и стрессоустойчивости растений.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и создание генетических конструкций для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях и получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих эти конструкции.

2. Оценка содержания свободного пролина в тканях трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ в нормальных условиях и в. условиях солевого стресса

3. Анализ солеустойчивости трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ.

4. Разработка и создание репортерной генетической конструкции для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Получение трансгенных растений табака, несущих эту конструкцию. Анализ экспрессии репортерной конструкции в трансгенных растениях Nicotiana tabacum на разных стадиях развития.

5. Оценка уровня экспрессии гена ОАТ Nicotiana tabacum в разных тканях и органах на разных стадиях развития растений.

Научная новизна. Создана новая генетическая модель для изучения функций и транскрипционной регуляции гена ОАТ, которая включает в себя генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, а также репортерную конструкцию для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Впервые показано, что растения с увеличенным уровнем экспрессии гена ОАТ обладают в нормальных условиях большей корневой массой, чем контрольные растения. Впервые показано, что введение антисмыслового супрессора гена ОАТ не влияет на рост растений в нормальных условиях, но существенно снижает формирование корней в условиях солевого стресса. Показано, что изменение уровня экспрессии гена ОАТ не влияет на содержание свободного пролина ни в норме, ни при солевом стрессе. Впервые показано, что активность промотора гена ОАТ и повышенный уровень мРНК ОАТ в норме ассоциированы с зонами инициации роста.

Полученные результаты не подтверждают существующую гипотезу об участии ОАТ в накоплении пролина при стрессе, однако позволяют выдвинуть альтернативную гипотезу о его участии в поддержании ростовых процессов в норме и при стрессе.

Практическая ценность. Показано, что искусственное повышение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях усиливает их ростовые характеристики и повышает солеустойчивость. Создана генетическая конструкция, эффективно повышающая экспрессию гена ОАТ в трансгенных растениях, которая может быть использована для трансформации разных видов растений. Создана репортерная генетическая конструкция, которая может быть использована для анализа транскрипционной активности гена ОАТ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Индуцированное трансгенезом увеличение экспрессии гена OÁT в растениях табака приводит к повышенному формированию корней в норме и позволяет преодолеть ингибирующее действие солевого стресса на рост побегов.

2. Повышенная транскрипционная активность гена ОАТ характерна для зон роста растений.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г.); на отчетной конференции программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (Москва, 2008 г.), на 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009 г.), на Германо - Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.), на международной конференции «Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology» (Новосибирск, 2010 г.), на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 135 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В качестве источника для получения кДНК использовались проростки Medicago truncatula, Lycopersicon esculentum. Для выделения последовательности промотора использовались молодые растения Arabidopsis thaliana (сорт Columbia). Для получения трансгенных растений использовались растения Nicotiana tabacum сорта SRI.

Бактериальные штаммы. Для генно-инженерных работ использовали штамм Escherichia coli XL-1 Blue. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0.

Плазмиды. При создании генетических конструкций использовались плазмиды pBluescript II SK (Fermentas) и pRT104 (Topfer et al., 1987), а также бинарные векторы для трансформации растений pBilOl и pBil21 (Jefferson, 1989).

Информационные ресурсы. В работе использовались материалы с публичных информационных ресурсов GenBank (Benson et al., 2011), TAIR (Swarbreck et al., 2008), PLACE (Higo et al., 1999).

Получение генетических конструкций. Для получения генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования (Маниатис и др., 1984).

Получение трансгенных растений табака. Трансформацию растений табака проводили путем культивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS (Murashige and Scoog, 1962) с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина). Для проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования. Семена трансгенных растений поколения Т, получали путем самоопыления трансформантов.

Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из листьев контрольных и трансгенных растений с использованием набора Genomic DNA purification kit (Fermentas). 15 мкг выделенной геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, фракционировали в 0.75% агарозном геле и переносили на заряженную нейлоновую мембрану капиллярным способом. В качестве зонда использовался фрагмент Т-ДНК конструкции, использованной для трансформации.

Анализ экспрессии гена ОАТ методом полуколичественной ПЦР. Тотальная РНК выделялась из растительного материала с помощью реактива TRIreagent («Ambion»). 1 мкг РНК использовался в реакции обратной транскрипции с oligoT праймером. ПЦР проводили со специфическими праймерами, в качестве матрицы использовался 1 мкл смеси кДНК. Для стандартизации количества кДНК матрицы осуществлялась количественная ПЦР с праймерами к гену бета-актина. Количество продукта определяли по свечению соответствующего фрагмента в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Оценка солеустойчивости трансформантов. Для эксперимента было отобрано по 15-20 трансгенных растений поколения ТО для каждой генетической конструкции. Верхушки побегов массой около 1 грамма, срезали с растений, выращенных в условиях культуры тканей на среде MS в стандартных условиях (22°С, длина светового дня 16 часов), и помещали на среду MS содержащую 300 мМ NaCl и MS без добавления соли. Выращивали в стандартных условиях в течение 5 недель. У полученных растений отдельно измеряли сырую массу корней и побегов. Зеленые листья отбирали для оценки содержания пролина (по 2-3 образца с каждого растения). В качестве контроля использовались нетрансгенные растения сорта SR1.

Содержание свободного пролина в тканях растений оценивалось по методу Бэйтса (Bates et al., 1973).

Гистохимическое окрашивание. Определение экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы проводилось при использовании модифициронного субстрата X-Gluc (Fermentas). Раствором, содержащий X-Gluc, инфильтрировали ткани растений, инкубировали растение в растворе в течение двух дней, потом отмывали хлорофилл из тканей 70% этиловым спиртом. Для анализа было отобрано 5 трансформантов. Каждый трансформант был микроклонирован. Было проанализировано не менее четырех растений из каждой популяции клонов.

Статистическая обработка данных. Для оценки влияния различных факторов на проявление признаков использовался одно- и двухфакторный дисперсионный анализ. Достоверность различий между анализируемыми группами проверялась по апостериорному критерию Дункана.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и анализ трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ. Целью этой части работы было получение и анализ трансгенных растений с повышенной и сниженной экспрессией гена ОАТ. Были разработаны и созданы две генетические конструкции на базе бинарного вектора pBi для трансформации растений (рис. 1). Конструкция для повышения экспрессии целевого гена (pBi-OAT) содержит полноразмерную белок-кодирующую последовательность гена ОАТ М. truncatula под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Супрессорная конструкция pBi-OATas содержит фрагмент белок-кодирующей последовательности гена ОАТ L. esculentum, помещенный в обратной ориентации под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. С помощью агробактериальной трансформации эти конструкции были введены в геном N. tabacum и получены канамицин-устойчивые трансформанты. Наличие встройки генетической конструкции в геномной ДНК независимых трансформантов было подтверждено с помощью ПЦР и Саузерн-блот гибридизациеи (рис. 2). Методом полуколичественной ПЦР было показано, что растения поколения ТО и Т1, несущие конструкцию pBi-OAT, обладают повышенным в 4-5 раз уровнем мРНК ОАТ по сравнению с нетрансгенным контролем.

Чтобы проверить гипотезу об участии ОАТ в ответе на стресс и в накоплении пролина, была проведена оценка стрессоустойчивости трансформантов с измененной экспрессией гена ОАТ и измерено содержание пролина в контрольных и трансгенных растениях в норме и при стрессе.

Д pNOS^ J; NPTII terNOS —| CalVIVp35S^>j MtrOAT СамV ter

RB Lf

Б pNOs)j NPTII terNOS -1 CaMVp35S^(' LesOAT^ CaMVter

RB

LB

Рисунок 1. Схемы генетических конструкций A. pBi-OAT; Б. pBi-OATas. MtrOAT - кДНК гена OAT люцерны M. truncatula; LesOAT - фрагмент кДНК гена OAT томата L. esculentum; CaMV p35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, NPTII - ген неомицинфосфотрансферазы II Е. coli, CaMV ter, NOS Ter - сигналы полиаденилирования; pNOS - промотор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, RB и LB - повторы, ограничивающие область Т-ДНК

2 3 5 7 9 10 SRI

6 7 8 11 16 SR1

10 8

6

5

4

Рисунок 2. Саузерн-блот гибридизация А: Гибридизация с геномной Д1 трансформантов, иесущих конструкцию pBI-ОАТ, гидролиз Xbal. Б: Гибридизация геномной ДНК трансформантов, несущих конструкцию pBI-OATas, гидролиз Eco] Цифрами обозначены номера трансформантов, SRI - нетрансгенный контроль.

Было решено использовать солевой стресс как классическую моде _ стрессового фона, при котором быстро возрастает концентрация пролина тканях растений. Показано, что в нормальных условиях у трансгеннк растений с повышенной экспрессией гена ОАТ сырая масса побегов отличается от контроля, а сырая масса корней достоверно выше, чем контрольных растений (рис. ЗА). При солевом стрессе рост побег _ контрольных растений был подавлен: масса побегов контрольных растет была достоверно снижена на среде с высоким содержанием соли. Растения повышенной экспрессией гена ОАТ в условиях солевого стрес демонстрировали выраженную способность к росту по сравнению контрольными растениями (рис. ЗА): сырая масса побегов этих растен] при солевом стрессе и в норме достоверно не различались. Масса побег

трансгенных растений, несущих супрессор ОАТ, не отличалась от контроля ни в норме, ни при стрессе (рис. ЗБ). Формирование корней в засоленной среде было подавлено и у контрольных и у трансгенных растений, однако растения с повышенной экспрессией гена ОАТ формировали в среднем больше корней, чем контроль (рис. ЗА), а растения, несущие супрессорную конструкцию, были практически неспособны формировать корни (рис. ЗБ). По результатам этого эксперимента можно заключить, что повышение

Сырая масса побегов

□ MS

IMS+NaCI

Сырая масса корней

MS

0,09

0,08

0,07

0,06

г 0,05 г

2. 0,04 0,03 0,02 0,01 0

MS+NaCI

SR ОАТ о/е

SR ОАТо/е

ОАТ о/е

Рисунок 3. Оценка солеустойчивости растений с измененной экспрессией гена ОАТ. А: растения, несущие сверхпродуцирующую конструкцию (ОАТо/е), Б: растения, несущие супрессорную конструкцию (OATas). MS -стандартная культуральная среда, MS+NaCI - культуральная среда с добавлением ЗООмМ хлорида натрия. SRI - нетрансгенный контроль. Приведено стандартное отклонение. *, — : р<0,05.

экспрессии OAT усиливает ростовые характеристики растений и позволяет преодолеть ингибирующее действие солевого стресса на рост побегов. Введение антисмыслового супрессора гена ОАТ приводит к утрате способности к укоренению в условиях засоления.

Чтобы понять, связаны ли ростовые характеристики полученных растений с накоплением пролина, было измерено содержание свободного пролина в листьях контрольных и трансгенных растений в норме и при солевом стрессе. Было показано, что ни в норме, ни при стрессе уровень пролина в листьях трансформантов не отличается от контроля (рис. 4). Таким образом, изменение ростовых характеристик у трансформантов не связано с изменением уровня пролина. Этот результат позволяет предположить, что ОАТ не принимает существенного участия в синтезе пролина ни в норме, ни при солевом стрессе. Однако, этот ген может быть связан с механизмами стрессоустойчивости, поскольку изменение его экспрессии наиболее значимо влияет на рост растений именно в условиях стресса.

Содержание свободного пролина

5000 т

* j. т «00 ; * * * *

га

и

gaga о зооо -j

I Г Н I I

И 1000 I

Ш, гМ „ \пЛ, гш.....

SR OATo/e SR OATas

Рисунок 4. Содержание пролина в листьях трансформантов, несущих конструкцию pBI-ОАТ (ОАТо/е) и pBI-OATas (OATas), росших пять недель на среде MS (светлые столбцы) и на среде MS, содержащей 300 мМ NaCl (темные столбцы).Приведено стандартное отклонение. * : р<0,05.

Признаком, который изменяется при изменении экспрессии гена ОАТ, является способность к росту и формированию корней в условиях стресса. Это позволяет выдвинуть предположение об участии гена ОАТ в процессах роста растений, в частности, в процессах развития корней. Поскольку в норме рост побегов контрольных и трансгенных растений не различается, возможно, роль гена ОАТ становится решающей именно в условиях стресса.

Рост растений осуществляется благодаря делению и растяжению клеток. Можно предположить, что ген ОАТ принимает участие в поддержании какого-то из этих процессов. Поскольку четких данных о пространственном

4000

га

а 3000 а

и ms £

О

и NaCl з 2000 о "с

2 1000

d

распределении экспрессии гена ОАТв тканях и органах растений не было, была поставлена задача изучить, в каких тканях экспрессируется этот ген, и связана ли его экспрессия с зонами, в которых происходит деление или растяжение клеток.

Изучение транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Целью этой части работы было выявить особенности пространственного и временного распределения транскрипционной активности гена ОАТ. С помощью ПЦР со специфическими праймерами был выделен участок геномной ДНК A. thaliana, с координатами от -1744 до +100 относительно старта транскрипции гена ОАТ. Предположительно, этот участок соответствует промоторной области гена ОАТ. На основе бинарного вектора для трансформации растений pBil21 была создана репортерная генетическая конструкция, в которой репортерный ген бета-глюкуронидазы Е. coli помещен под контроль выделеленного промотора гена ОАТ (рис. 5).

pNOS/f" NPT1I ) ^terNOS-| promOAT^>j GUS У tertJOS

RB LB

Рисунок 5. Схема репортерной генетической конструкции. promOAT - промоторный учаток гена ОАТ A. thaliana; NPTII — ген неомицинфосфотрансферазы II Е. coli, GUS -репортерный ген бета-глюкуронидазы Е. coli ; NOS Ter - сигнал полиаденилирования; pNOS - промотор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens\ RB и LB - повторы, ограничивающие область Т-ДНК.

Бета-глюкуронидаза (GUS, ЕС, 3.2,1,31) представляет собой гидролазу, которая катализирует расщепление бета-глюкуронидов. Принцип выявления активности репортерного гена заключается в том, что глюкуронидаза гидролизует определенные субстраты, в результате расщепления которых образуются окрашенные или флуоресцирующие продукты. Были получены независимые растения-трансформанты N. tabacum, несущие эту конструкцию, и проведен их первичный анализ на наличие трансгена методом ПЦР. Пять трансформантов, несущих встройку Т-ДНК, были отобраны для дальнейшего анализа. Был проведен гистохимический анализ растений-трансформантов на разных стдиях развития: растения-регенеранты ТО, выращенные в условиях кулыуры тканей, взрослые растения ТО в период цветения и проростки Т1 на разных стадиях развития. Все исследованные трансформанты обладали единообразным паттерном экспрессии репортерной конструкции (рис. 6). Транскрипционная активность промотора гена ОАТ была обнаружена в следующих зонах:

1. Пазушные почки

2. Верхушечная почка

3. Апикальная часть стебля

4. Молодые раскрывающиеся листья

5. Зона инициации придаточных корней

6. Отдельные места инициации боковых корней

7. Отдельные кончики молодых корней

8. Элементы цветка на стадии формирования бутонов

9. Элементы околоцветника на стадии раскрытия цветка

10. Проростки первой недели прорастания.

I

Рисунок 6. Экспрессия гена-репортера в трансгенных растениях, несущих конструкцию Р1844. Синий цвет отражает активность бета-глюкуронидазы. Интенсивность окрашивания соответствует уровню активности. А: общий вид побега. 1 - верхушечная почка, 2 - молодые листья, 3 - пазушные почки, 4 - верхняя часть стебля. Б: срез стебля на уровне пазушной почки. 1 - меристема пазушной почки, 2 - дифференцирующиеся клетки ксилемы. В: молодые корни. 1 - инициация роста бокового корня, 2 - кончики молодых боковых корней. Г: Проростки разного возраста. Цифрами обозначено количество дней, прошедших с момента посадки семян.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что места локализации транскрипции гена ОАТ совпадают с зонами инициации роста. Этот результат позволяет предположить, что ген ОАТ у растений принимает участие в ростовых процессах. Это заключение согласуется с предположением об участии гена ОАТ в поддержании ростовых процессов, которое было сделано в первой части работы, на основании анализа стресс-обусловленнового фенотипа растений с измененной экспрессией гена ОАТ.

Анализ экспреснн гена ОАТ в различных тканях и органах.

Чтобы подтвердить пространственное распределение транскрипционной активности гена ОАТ, была проведена оценка экспрессии собственного гена ОАТ табака в разных тканях N. tabacum в нормальных условиях методом полуколичественной ПЦР (рис. 7). Было показано, что транскрипционная активность ОАТ наиболее высока в каллусной ткани и в проростках ранних стадий прорастания.

о.з -

е£и

J

Рисунок 7. Относительный уровень транскрипции гена ОАТ табака в различных тканях и органах Данные представлены в условных единицах, отражающих отношение уровня транскрипции ОАТ к уровню транскрипции гена бета-актина Приведено стандартное отклонение.

Анализ экспрессии гена ОАТ в разных частях побега показал, что повышенный уровень мРНК ОАТ наблюдается в верхушечной почке, первом листе и в узлах побега. Во втором листе и в междоузлиях наблюдается самый низкий уровень транскрипции. Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными в результате анализа транскрипционной активности промотора гена ОАТ A. thaliana и подтверждают экспрессию гена ОАТ в митотически-активных тканях (каллус, меристемы).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной диссертационной работе была создана новая генетическая модель для исследования функций гена орнитинаминотрансферазы растений. Он включает в себя генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в растениях, а также репортерную конструкцию, позволяющую анализировать транскрипционную активность гена ОАТ. С использованием данной модели впервые был получен ряд результатов, существенно расширяющих современные представления о функциях гена ОАТ у растений. Было показано, что индуцированное трансгенезом изменени экспрессии гена ОАТ приводит к изменению параметров роста растений в норме и при стрессе. Увеличение экспрессии гена ОАТ приводит к достоверному увеличению корневой массы растений и повышению и солеустойчивости за счет преодоления ингибирующего влияния солевого стресса на рост побегов. Введение антисмыслового супрессора гена OA' почти полностью ингибирует укоренение в условиях солевого стресса. В то же время, изменение экспрессии гена ОАТ не влияет на уровень пролина. Эти результаты не подтверждают гипотезу об участии гена ОАТ в синтезе пролина, однако позволяют выдвинуть предположение об участии этого гена в ростовы процессах. С использованием репортерной генетической конструкции было обнаружено, что транскрипционная активность промотора гена ОАТ ассоциирована с зонами инициации роста и с процессами прорастания семени. Эти результаты также указывают на связь гена ОАТ с ростовыми процессами. Для того, чтобы проверить адекватность созданной генетической модели, был проведена оценка уровня мРНК ОАТ в разных тканях и органах. Было показано, что экспрессия этого гена повышена в митотически-активных тканях и в проростках на ранних стадиях прорастания, что согласуется предыдущими результатами и подтверждает адекватность созданной генетической модели.

На основании полученных результатов в данной диссертационной работ была сформулирована новая гипотеза о роли гена ОАТ: функции гена OA связаны с поддержанием процессов роста, в частности, укоренения в норме и в условиях солевого стресса.

Созданная генетическая модель может быть использована для дальнейши исследований. Перспективным представляется изучение параметров рост растений с измененной экспрессией гена ОАТ в разнообразных условия: поскольку этот ген может влиять на устойчивость к многим видам стресса, также на общую жизнеспособность растений. Репортерная конструкция може быть использована для изучения индукции промотора гена ОАТ различным химическими агентами и факторами внешней среды, а различные делеционнь: варианты промотора гена ОАТ на основе полученной репортерной конструкции могут быть использованы для исследования структур промотора и поиска специфических регуляторных сайтов.

выводы

1. Показано, что изменение экспрессии гена ОАТ не оказывает влияния на уровень пролина: трансгенные растения, несущие созданные генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, не отличаются от контрольных растений по содержанию пролина ни в норме, ни при солевом стрессе.

2. Обнаружено, что изменение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях влияет на ростовые характеристики побегов и корней в норме и при солевом стрессе:

• введение в геном растений генетической конструкции, усиливающей экспрессию гена ОАТ, приводит к повышенному формированию корней в норме и повышенной устойчивости к солевому стрессу;

• введение в геном растений антисмыслового супрессора ОАТ приводит к пониженному формированию корней при солевом стрессе.

3. Проведена оценка активности промотора гена ОАТ A.thaliana, с использованием гена-репортера. Показано, что активность промотора наблюдается в меристематических зонах (апикальной и пазушных почках, первом листе, зоне укоренения, кончиках корней). В онтогенезе промотор гена ОАТ индуцируется при прорастании семени во всех тканях проростка с наибольшим уровнем активности в семядолях.

4. Показано, что уровень экспрессии гена ОАТ N. tabacum различен в разных тканях и органах:

• наибольший уровень мРНК ОАТ наблюдается в зонах активного роста (каллус, проростки, апикальная меристема, первый лист);

• минимальный уровень мРНК ОАТ наблюдается в дифференцированных тканях (стебель, лист).

5. Сформулирована новая гипотеза о роли гена ОАТ у растений: изменение ростовых характеристик в ответ на изменение экспрессии гена ОАТ, а также локализация экспрессии этого гена в зонах роста позволяет предположить, что ген ОАТ принимает участие в процессах роста растений и возможно, участвует в защите зон роста в условиях стресса.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. 1. Герасимова С. В.. Колодяжная Я.С., Титов С.Е. и др. Трансформанты табака, экспрессирующие кДНК гена орнитинаминотрансферазы Medicago truncatulall Генетика. 2010. Т. 46. № 7. С. 1000-1003.

2- Герасимова С. В Горелова В. В., Дорогина О. В. и др. Анализ транскрипционной активности промотора гена дельта-орнитинаминотрансферазы Arabidopsis thaliana //Генетика. 2011 Т 47 № 5 С. 707-710.

3. Ибрагимова С.С., Колодяжная Я.С., Герасимова СВ.. Кочетов А.В. Роль гена пролиндегидрогеназы в поддержании стрессоустойчивости у растений // Физиология растений. 2012. Т. 59. №1. С. 99-107.

4. Герасимова С.В.. Ибрагимова С.С., Кочетов А. В., Шумный В. К. Функции дельта-орнитинаминотрансферазы у растений // Успехи современной биологии. 2011. Т. 131. №6. С. 531-542.

5. Кочетов А.В., Герасимова СВ.. Сангаев С.С. и др. Исследование механизмов устойчивости растений к абиотическим стрессам на модели трансгенных растений // Материалы отчетной конференции программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов», Москва, 2008, С. 230-232.

6. Герасимова СВ., Титов С.Е., Романова А.В. и др. Трансгенные растения с повышенной экспрессией орнитинаминотрансферазы - новая модель для изучения устойчивости к абиотическим стрессам // Тезисы Международной научной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Звенигород, 2008. С. 16.

7. Герасимова С.В., Горелова В.В., Романова А.В. и др. Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы (ОАТ) в развитии и стрессоустойчивости растений // тезисы 13-й международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, 2009. С. 12.

8. Gerasimova S.V._, Gorelova V.V., Romanova A.V. et al. The Role of delta-OAT Gene in Proline Accumulation and Stress Response in Plants // Abstracts of the German-Russian Forum Biotechnology GRFB'09, Novosibirsk, 2009. P. 21.

9. Горелова B.B., Герасимова С.В.. Коваль B.C. и др. Функциональная активность промотора гена орнитинаминотрансферазы Arabidopsis thaliana в развитии и в ответе на стрессовые воздействия // тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс», Москва, 2010. С.113-114

10. Gerasimova S. V., Gorelova V.V., Romanova A.V. et al. The Physiological Role Of AOAT Gene In Plant Development And Stress Response // Abstracts of the International Conference «Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology» PlantGen, Novosibirsk, 2010. P. 19.

Патент: Титов С.Е., Герасимова С.В.. Кочетов А.В. и др. Колодяжная 1С., Комарова М.Л., Романова А.В., Шумный В.К. Способ получения рансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина. Патент на изобретение №2324737, зарегистрирован 20 мая 2008 года.

Подписано к печати 22.12.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. 0,7 Тираж 110 Заказ № 84

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Герасимова, Софья Викторовна, Новосибирск

61 12-3/517

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

Герасимова Софья Викторовна

Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

генетика - 05.02.0?

Научный руководитель: к.б.н., доцент Кочетов А.В.

г. Новосибирск, 2011 г.

Содержание

Список сокращений..................................................................................................................5

Введение....................................................................................................................................7

Г. Обзор литературы...............................................................................................................Ю

1.1. Введение в обзор литературы..................................................................................10

1.2 Организация и эволюция генов, кодирующих ОАТ.............................................12

1.3. Функции ОАТ у млекопитающих...........................................................................13

1.4. Функции ОАТ у растений........................................................................................16

1.4.1 Биохимические свойства орнтинаминотрансферазы.........................................16

1.4.2. Роль ОАТ в системе взаимопревращений аминокислот...................................17

1.4.2.1 Роль ОАТ в метаболизме пролина............................................................18

1.4.2.2. Участие ОАТ в метаболизме орнитина и аргинина..............................23

1.4.2.3. Участие ОАТ в биосинтезе полиаминов.................................................27

1.4.3. Роль ОАТ в онтогенезе........................................................................................30

1.4.4. Структура и транскрипционная регуляция гена ОАТ у Arabidopsis thaliana. 32

1.5 Подходы к исследованию функций генов у растений на примере гена ОАТ. 34

1.5.1. «Прямая» и «обратная» генетика........................................................................34

1.5.2. Выделение растительных генов..........................................................................34

1.5.3. Исследование структуры и биохимических свойств белка..............................35

1.5.4. Создание растений с модифицированной экспрессией исследуемого гена. ..35

1.5.5. Изучение транскрипционной регуляции гена...................................................38

1.6. Заключение по обзору литературы............................................................................40

2. Материалы и методы..........................................................................................................42

2.1. Материалы....................................................................................................................42

2.1.1. Растительный материал.......................................................................................42

2.1.2.Реактив ы.................................................................................................................42

2.1.3. Ферменты..............................................................................................................42

2.1.4. Бактериальные штаммы.......................................................................................42

2.1.5. Плазмиды...............................................................................................................42

2.1.6. Праймеры..............................................................................................................43

2.1.7. Данные публичных информационных ресурсов...............................................43

2.1.8. Среды и буферные растворы...............................................................................45

2.2. Методы.........................................................................................................................45

2.2.1. Получение проростков из семян.........................................................................45

2.2.2. Трансформация и выращивание трансформантов............................................46

2.2.3. Культивирование каллусной ткани.....................................................................46

2.2.4. Оценка солеустойчивости....................................................................................46

2.2.5. Получение семян трансформантов от самоопыления.......................................46

2.2.6. Сегрегационный анализ.......................................................................................46

2.2.7. Приготовление компетентных клеток................................................................47

2.2.8. Выделение геномной ДНК растений..................................................................47

2.2.9. Выделение суммарной РНК................................................................................47

2.2.10. Обратная транскрипция.....................................................................................48

2.2.11.ПЦ Р......................................................................................................................48

2.2.12. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.............................49

2.2.13. Электрофорез в агарозном геле.........................................................................49

2.2.14. Выделение фрагментов из агарозного геля......................................................49

2.2.15. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции...................................................49

2.2.16. Лигирование........................................................................................................49

2.2.17. Трансформация клеток плазмидной ДНК........................................................49

2.2.18. Селекция клонов на среде, содержащей X-Gal................................................50

2.2.19. Определение первичной последовательности ДНК (секвенирование).........50

2.2.20. Компьютерная обработка данных.....................................................................51

2.2.21. Анализ геномной ДНК растений методом ПЦР..............................................51

2.2.22. Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот-гибридизации......51

2.2.23. Приготовление радиоактивномеченых зондов................................................51

2.2.24. Оценка экспрессии ОАТ в тканях трансгенных растений с помощью полуколичественной ПЦР..............................................................................................51

2.2.25. Определение содержания свободного пролина в тканях растений...............53

2.2.26. Гистохимическое окрашивание........................................................................53

2.2.27. Статистическая обработка данных...................................................................54

3. Результаты...........................................................................................................................55

3.1. Исследование фенотипического проявления повышенной и пониженной экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях.............................................................55

3.1.1. Создание генетической конструкции для повышения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях (pBi-OAT)...............................................................................55

3.1.2. Создание генетической конструкции для снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях (pBi-OATas)............................................................................58

3.1.3. Получение трансгенных растений N. tabacum...................................................61

3.1.4. ПЦР-анализ геномной ДНК растений-трансформантов...................................61

3.1.5. Саузерн-блот анализ геномной ДНК растений-трансформантов....................62

3.1.6. Оценка уровня транскрипции гена ОАТ в трансгенных растениях................64

3.1.7. Сегрегационный анализ трансгенных растений в поколении Т1....................65

3.1.8. Оценка числа функционально активных инсерций..........................................66

3.1.9. Анализ солеустойчивости трансгенных растений............................................67

3.1.10. Оценка содержания пролина в листьях трансгенных растений.....................71

3.2. Изучение транскрипционной активности промотора гена ОАТ Arabidopsis thaliana.................................................................................................................................72

3.2.1. Выделение промоторной области гена ОАТ Arabidopsis thaliana...................72

3.2.2. Создание репортерной генетической конструкции PI844...............................72

3.2.3. Получение и первичный генетический анализ трансгенных растений, несущих репортерную конструкцию............................................................................74

3.2.4. Гистохимический анализ трансформантов. Выявление экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы (GUS)..........................................................74

3.2.4.1. Гистохимичекий анализ растений (ТО) выращенных в условиях культуры тканей...........................................................................................................................74

3.2.4.2. Гистохимический анализ цветущих взрослых растений ТО из теплицы. 77

3.2.4.3. Гистохимический анализ проростков Т1....................................................78

3.2.5. Компьютерный анализ последовательности промотора гена ОАТ на наличие цис-регуляторных элементов........................................................................................78

3.3. Анализ транскрипции гена ОАТ в различных тканях и органах............................81

4. Обсуждение результатов

Заключение..........................

Выводы................................

Список литературы.............

Список сокращений

2-ОГ - альфакетоглутарат,

CaMV - вирус мозаики цветной капусты,

GUS - ß-глюкуронидаза,

NPTII - неомицинфосфотрансфераза II,

N-ацГК - N-ацетилглутаматкиназа,

N-ацГС - N-ацетилглутаматсинтаза,

N-ацГФР - Ы-ацетилглутамат-5-фосфатредуктаза,

N-ацОАТ - N-ацетиламинотрансфераза,

N-ацОГАТ - N-ацетилорнитин.тлутамат ацетилтрансфераза,

N-КПИГ - N-карбомоилпутресциниминогидролаза,

SDS - лаурилсульфат натрия.

S-АМД - S-аденозшшетиониндекарбоксилаза,

АДК - аргининдекарбоксилаза,

АИГ - агматиниминогидролаза,

ACJI - аргиносукцинатлиаза

АСС - аргиносукцинатсинтаза,

БАП - бензиламинопурин,

ГДГ - глутаматдегидрогеназа,

ГОГАТ - глутаматоксоглутаратаминотрансфераза,

ГС - глутаминсинтаза,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК,

МАТ - метионинаденозилтрансфераза

мРНК - матричная РНК,

НУК - нафтилуксусная кислота,

ОАТ - орнитинаминотрансфераза

ОДК - орнитиндекарбоксилаза,

ОТ - обратная транскрипция,

ОТК - орнитинтранскарбомоилаза,

п.н. - пары нуклеотидов,

П5К - пирролин-5-карбоксилат

П5КДГ - пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназа,

П5КР - пирролин-5-карбоксилатредуктаза,

П5КС - пирролин-5-карбоксилатсинтаза

ПДГ - пролиндегидрогеназа

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

РНК - рибонуклеиновая кислота,

РНКаза - рибонуклеаза,

СпдС - спермидинсинтаза,

СпмС - сперминсинтза,

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота,

Введение

Актуальность проблемы. Адаптация растений к неблагоприятным условиям окружающей среды требует реализации сложных генетических программ, в которых задействована скоординированная экспрессия больших генных ансамблей, исследование которых необходимо для понимания молекулярных механизмов стрессоустойчивости. В частности, в ответ на стресс изменяется уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм некоторых аминокислот (Martinelli et al., 2007). К их числу относится ген дельта-орнитинаминотрансферазы (OAT, ЕС 2.6.1.13), кодирующий фермент, катализирующий перенос дельта-аминогруппы орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием пирролин-5-карбоксилата (П5К) и глутамата (Stranska et al., 2008). Эта реакция является частью системы взаимопревращений таких аминокислот, как аргинин, орнитин, глутамат и пролин. Метаболизм этих аминокислот связан с фиксацией, запасанием и ремобилизацией азота, формированием и прорастанием семян, устойчивостью к различным абиотическим стрессам, регуляцией процессов развития (Funck et al, 2008; Canas et al, 2008; Mattioli et al., 2009). Согласно литературным данным, ген OAT принимает участие в ответе на стресс, однако его конкретная биологическая роль остается неясной и является предметом обсуждения (Stranska et al., 2008). Долгое время считалось, что ОАТ участвует в синтезе пролина при стрессе (Roosens et al, 1998, 2002), однако ряд исследователей опровергают это утверждение и постулируют, что ген ОАТ регулирует деградацию орнитина и связан с системой рециркуляции азота (Funck et al, 2008). Отдельные данные указывают на участие гена ОАТ в ряде других жизненно-важных клеточных процессов (Boon et al., 1999; Slocum, 2005; Page et al, 2010). Потенциально, OAT может являться важным регулятором клеточного метаболизма, поскольку реакция, катализируемая этим ферментом, связывает несколько биохимических систем: цикл мочевины, цикл накопления и деградации пролина и путь биосинтеза полиаминов. Транскрипционная регуляция этого гена не изучена, а его роль в процессах развития и ответе на стресс не определена. Изучение транскрипционной регуляции гена ОАТ и его роли в развитии и стрессоустойчивости необходимо для расширения современных представлений о регуляции клеточного метаболизма, а также для разработки новых способов получения устойчивых форм растений.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование роли гена дельта-орнитинаминотрансферазы (ОАТ) в развитии и стрессоустойчивости растений.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и создание генетических конструкций для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях и получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих эти конструкции.

2. Оценка содержания свободного пролина в тканях трансгенных растений с измененной экспрессией гена ОАТ в нормальных условиях и в условиях солевого стресса

3. Анализ солеустойчивости трансгенных растений с измененной экспрессией . гена ОАТ.

4. Разработка и создание репортерной генетической конструкции для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Получение Трансгенных растений табака, несущих эту конструкцию. Анализ экспрессии репортерной конструкции в трансгенных растениях Nicotiana tabacum на разных стадиях развития.

5. Оценка уровня экспрессии гена ОАТ Nicotiana tabacum в разных тканях и органах на разных стадиях развития растений.

Научная новизна. Создана новая генетическая модель для изучения функций и транскрипционной регуляции гена ОАТ, которая включает в себя генетические конструкции для повышения и снижения экспрессии гена ОАТ, а также репортерную конструкцию для изучения транскрипционной активности промотора гена ОАТ. Впервые показано, что растения с увеличенным уровнем экспрессии гена ОАТ обладают в нормальных условиях большей корневой массой, чем контрольные растения. Впервые показано, что введение антисмыслового супрессора гена ОАТ не влияет на рост растений в нормальных условиях, но существенно снижает формирование корней в условиях солевого стресса. Показано, что изменение уровня экспрессии гена ОАТ не влияет на содержание свободного пролина ни в норме, ни при солевом стрессе. Впервые показано, что активность промотора гена ОАТ и повышенный уровень мРНК ОАТ в норме ассоциированы с зонами инициации роста.

Полученные результаты не подтверждают существующую гипотезу об участии ОАТ в накоплении пролина при стрессе, однако позволяют выдвинуть альтернативную гипотезу о его участии в поддержании ростовых процессов в норме и при стрессе.

Практическая ценность. Показано, что искусственное повышение экспрессии гена ОАТ в трансгенных растениях усиливает их ростовые характеристики и повышает солеустойчивость. Создана генетическая конструкция, эффективно повышающая

экспрессию гена OAT в трансгенных растениях, которая может быть использована для трансформации разных видов растений. Создана репортерная генетическая конструкция, которая может быть использована для анализа транскрипционной активности гена ОАТ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Индуцированное трансгенезом увеличение экспрессии гена ОАТ в растениях табака приводит к повышенному формированию корней в норме и позволяет преодолеть ингибирующее действие солевого стресса на рост побегов.

2. Повышенная транскрипционная активность гена ОАТ характерна для зон роста растений.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г.); на отчетной конференции программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (Москва, 2008 г.), на 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2009 г.), на Германо -Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.), на международной конференции «Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology» (Новосибирск, 2010 г.), на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 135 источников..

1. Обзор литературы

1.1. Введение в обзор литературы

Дельта-орнитинаминотрансфераза (ОAT, ЕС 2.6.1.13) катализирует реакцию переноса дельта-аминогруппы с орнитина на альфа-кетоглутарат с образованием полуальдегида глутаминовой кислоты (ПГК) и глутамата (рис. 1). Полуальдегид глутаминовой кислоты находится в равновесии со своей более стабильной циклической формой - пирролин-5-карбоксилатом (П5К). Кофактором в реакции выступает пиридоксаль-фосфат (Stranska et al, 2008). Гены с функцией ОАТ были обнаружены у представителей всех царств живой природы: микроорганизмов, грибов, насекомых, млекопитающих и растений (рис. 2). Несмотря на то, что гены, кодирующие орнитинаминотрансферазу, имеют древнейшее происхождение, их функции и регуляция у высших организмов до сих пор остаются не до конца изученными. Чем выше организация, тем более тонкий и разнообразный паттерн регуляции имеет этот ген. Еще у бактерий было показано, что экспрессия гена ОАТ в значительной мере зависит от различных стимулов (Takechi et al., 1994; Gardan et al, 1995). В регуляции экспрессии ОАТ у дрожжей принимает участие сложный комплекс генов (Messenguy et al., 2000). У млекопитающих экспрессия гена ОАТ регулируется по-разному в зависимости от пола, органа, типа ткани и стадии развития организма (Ventura et al., 2009). Биологическая роль и регуляция этого гена у растений до сих пор остается неясной и в последнее время является предметом активных дискуссий (Stranska et al., 2008).

Ген ОАТ является одним из элементов системы метаболизма аминокислот. Аминокислоты необходимы для синтеза белков, но некоторые из них т