Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Биохимические признаки стабильности мРНК в связи с регуляцией синтеза белка в клетках злаков с их устойчивостью к стрессам с целью создания новых методов селекции
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство
Автореферат диссертации по теме "Биохимические признаки стабильности мРНК в связи с регуляцией синтеза белка в клетках злаков с их устойчивостью к стрессам с целью создания новых методов селекции"
КРАСНОДАРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ О /[СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА им. П.П.ЛУКЬЯНЕНКО
На правах рукописи
ПЛОТНИКОВ Владимир Константинович
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ СТАБИЛЬНОСТИ мРНК В СВЯЗИ С РЕГУЛЯЦИЕЙ СИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКАХ ЗЛАКОВ И ИХ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СТРЕССАМ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИИ
Специальность: 06.01.05. - селекция и семеноводство
ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Краснодар -1997
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Э.Р. Авакян
доктор сельскохозяйственных наук Ф.А. Колесников
доктор биологических наук, профессор ТЛ. Михайлова
Ведущее учреждение Кубанский Государственный Университет
Защита диссертации состоится " й Ъ " года в 10 часов на
заседании диссертационного совета Д020.66.01 ВНИИ риса по адресу: 350083, Краснодар, п/о Белозерное
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса
Диссертация в виде научного доклада разослана " 1997г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук " Е.М. Сорочинская
1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы. Синтез белка - основной процесс, обеспечивающий реализацию генетической информации в морфологические и физиологические особенности организмов. Относительно большой объем клеток эукариот и появление у них ядра, в котором осуществляется транскрипция генов, снижают оперативность регуляции синтеза белка этих организмов на уровне транскрипции. Постгранскрипционный уровень регуляции синтеза белка является более оперативным и реализуется через целый ряд молекулярных механизмов: процессинг ядерной РНК, транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, выбор мРНК для трансляции, регуляцию скоростей инициации, элонгации и терминации синтеза белка и другие механизмы.
В последние десятилетия стало очевидным, что наиболее лабильным звеном постгранскрипционной регуляции синтеза белка является модуляция стабильности цитоплазмашческих мРНК. Индивидуальные мРНК значительно различаются по периоду полураспада, который варьирует в клетках эукариот от минут до недель. В настоящее время интенсивно изучаются факторы, определяющие стабильность мРНК, к которым в первую очередь относится структура самих мРНК и активность РНКаз. Методы генной инженерии позволили эффективно показать участие тех или иных структур в определении времени жизни молекул мРНК [28]. Эти исследования необходимы для понимания глубинных механизмов регуляции экспрессии генов в ходе онтогенеза, при стрессовых условиях среды, а также для оптимизации экспрессии трансгенов. Однако поспранскрипционная регуляция синтеза белка у растений на уровне дифференциальной стабильности мРНК изучена крайне слабо.
Созревающее зерно кукурузы представляет собой хорошую модель для изучения тканеспецифической регуляции синтеза белка, поскольку здесь синтезируется в большом количестве ограниченный набор запасных белков - зеи-нов, биохимия и генетика которых хорошо изучены. Этому в значительной степени способствуют широкомасштабные исследования биохимического и молекулярно-биологического действия мутации гена opaque-2> определяющей глобальное перераспределение синтеза белковых фракций в зерне кукурузы. Фундаментальные исследования, конечной целью которых является создание высоколизиновой кукурузы, уже к концу 80-ых годов привели к тому, что были клонированы и секвенированы как структурные гены зеинов, так и регуля-торный ген opaque-2, осуществляющий транскрипционную регуляцию синтеза
зеинов.__;_-_
* Научный консультант по диссертации - д.с.-х.н., профессор, почетный доктор университета Феррары, заслуженный деятель науки Кубани, академик Алешин Николай Евгеньевич.
Одновременно накапливались факты, свидетельствующие о том, что большое значение в регуляции синтеза этих белков играет постгранскрипци-онный уровень. Но оставались не ясными конкретные механизмы поспранс-крипционной регуляции (Shmidt,1993).
Значение исследований этих механизмов выходит за рамки регуляции синтеза только запасных белков, так как многие молекулярные процессы, связанные с формированием хозяйственно-ценных признаков растений, таких как стрессоустойчивость и фотопериодизм, регулируются на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях.
1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было изучение роли дифференциальной стабильности мРНК в постгранскрипцион-ной регуляции синтеза белка у растений и создание на основе этого новых методов, повышающих эффективность селекционного процесса. В задачи исследования входило изучить:
- закономерности формирования белкового комплекса созревающего зерна кукурузы при разных уровнях активности РНКаз в тканях и в условиях блокады транскрипции актиномицином Д.
- трансляционную активность полирибосом in vitro созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя в оптимальных и стрессовых условиях роста растений.
- стабильность мРНК зеинов 19 кД и 22 кД при блокаде транскрипции генома созревающего зерна кукурузы актиномицином Д (in vivo) и в бесклеточной системе синтеза белка.
- влияние мутации гена opaque-2 на стабильность мРНК созревающего зерна кукурузы.
- влияние условий окружающей среды на стабильность мРНК проростков пшеницы и ячменя.
- создать на основе экспериментальных и литературных данных гипотетическую модель молекулярного механизма действия мутации гена opaque-2 по изменению белкового и аминокислотного состава зерна кукурузы. Экспериментально показать сходство молекулярных механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в растительной клетке.
- создать новый охраноспособный метод оценки исходного материала пшеницы и ячменя по ряду генетико-физиологических признаков на основании сортоспецифических особенностей функционирования компонентов бе-локсинтезирующего аппарата растений.
1.3. Научная новизна работы. Роспатент выдал патент на изобретение [38]:"Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур". В основе способа лежат оригинальные исследования реакции компонентов бе-
локсинтезирующей системы растений на различные эндогенные и экзогенные факторы.
Впервые проведено комплексное исследование феномена дифференциальной стабильности мРНК и его роли в регуляции синтеза белка в клетках злаковых растений. В работе впервые доказана дифференциальная стабильность мРНК запасных белков зерна кукурузы - зеинов 19 кД и 22 кД. Установлено, что мутация гена opaque-2 изменяет стабильность мРНК зерна кукурузы. Впервые экспериментально доказано, что основным фактором, формирующим как высоколизиновый, так и адаптационный синдромы в созревающем зерне кукурузы, является высокая лабильность мРНК зеинов.
Впервые обнаружено, что в ходе двуциклической аффинной хроматографии РНК созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя па поли(У)-сефарозе, а также при инкубации водных препаратов суммарной РНК (in vitro) происходит дифференциальный распад мРНК по тем же закономерностям, что и в живой клетке (in vivo). Показано, что распад мРНК детерминирован структурой мРНК, белками, ассоциированными с мРНК, и не зависит от основного клеточного метаболизма, но определяется генотипом и условиями роста растения.
При исследовании трансляционной активности белоксинтезирующего аппарата растений in vitro впервые обнаружено, что под влиянием стрессовых условий среды (обезвожившгае, засоление, низкие положительные температуры) происходит неспецифический прирост трансляционной активности полисом проростков пшеницы и ячменя. Это явление имеет генотипический характер. Блокада транскрипции актиномицином Д генома кукурузы предотвращает в зерне распад полирибосом и мРНК под действием теплового шока, что доказывает активное участие генома в ответе на тепловой шок.
Полученные в работе данные вносят существенный вклад в изучение молекулярных процессов формирования зерна и адаптации растений к неблагоприятным факторам среды, расширяют и углубляют теоретические основы селекции.
1.4.Практическая ценность работы. Предложен молекулярный метод оценки физиологического состояния зерновых культур, защищенный патентом [38]. Предложен новый метод оценки стабильности мРНК, полностью независимый от основного клеточного метаболизма и уменьшающий объем экспериментальных работ. Это метод открывает новый класс молекулярных маркеров хозяйственно-ценных признаков злаковых растений. Обнаруженная сортоспецифичность реакции белоксинтезирующего аппарата на изменение внешних условий создает принципиально новую основу для разработки методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодизма зерновых культур для це-
лей селекции. Предложен метод стабилизации мРНК in vitro (обработка цели-том).
Материалы работы используются в курсах лекций и в качестве задачи большого практикума по молекулярной биологии на биологических факультетах Кубанского государственного университета и Кубанского государственного аграрного университета.
1.5.Основные положения, вынесенные на защиту. Дифференциальная стабильность мРНК является важнейшим звеном посттранскрипционной регуляции экспрессии генов злаковых растений. Стабильность мРНК определяется кодирующим его геном и условиями роста растений.
Регуляция синтеза запасных белков - зеинов осуществляется в значительной степени на уровне стабильности мРНК, что является основным компонентом сходства молекулярно-биологических механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в созревающем зерне кукурузы.
На примере созревающих зерновок кукурузы и проростков пшеницы и ячменя показано, что изменение условий произрастания растений (температуры, освещения) приводят к генотипическому ответу на уровне стабильности мРНК in vitro. Распад мРНК при инкубации водных препаратов РНК происходит аналогично распаду в живой клетке.
Установлена взаимосвязь между степенью полиаденилирования мРНК, ее вторичной структурой и стабильностью. Обработка высокоочищенных препаратов суммарной РНК целитом, специфически связывающим белки, приводит к остановке деаденилирования и стабилизации мРНК, что свидетельствует о наличии ассоциированных с мРНК РНКаз белковой природы, устойчивых к действию традиционных депротеинизирующих агентов.
Явление дифференциальной стабильности мРНК in vitro открывает принципиально новые возможности для оценки селекционного материала по ряду хозяйственно ценных свойств.
1.6.Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждены на четвертой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алма-Ата,1980), на 3 Всесоюзной научно-технической конференции по проблемам кукурузы (Днепропетровск, 1981), на Всесоюзном совещании "Производство и использование растительного белка" (Краснодар, 1981), на 6 и 7 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987, 1990), на 5 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), на Всесоюзной конференции по биотехнологии зерновых культур (Алма-Ата, 1988), на Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), на 2 съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990),
на Международном симпозиуме "Проблемы синтеза и практического применения олигонуклеотидов" ( Москва, 1991 ), на 1, 2 и 3 симпозиумах "Новые направления биотехнологии растений" (Пущино, 1991, 1993, 1995), на 1 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), на 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 3 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на 2 съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997).
2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Условия проведения исследований. Автор проводил свои исследования в Краснодарском научно-исследовательском институте им. П.П. Лукья-ненко.
2.2. Материалы исследований. Исследования проводили на созревающем зерне кукурузы (Zea mays L.) линии Висконсин 64 А обычной (W64A+/+) и ее высоколизиновом спонтанном мутанте opaque-2 (W64Ao2/o2), а также на зеленых и этиолированных проростках озимых и яровых сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) и ячменя (Hordeum vulgare L.) селекции КНИИСХ им. П.П.Лукьянепко:
2.2.1.Растения кукурузы выращивали в поле или в фитотроне. Радиоактивно меченные нуклеотиды или аминокислоты, а также ингибиторы транскрипции или трансляции вводили в ножку и основание початка. В определенные сроки после ручного самоопыления початки снимали с растения, зерно фиксировали жидким азотом.
2.2.2. Семена пшеницы и ячменя проращивали на фильтровальной бумаге при 20°С. Через трое суток для части проростков включали освещение. Еще через сутки зеленые и этиолированные проростки срезали и немедленно замораживали в жидком азоте. Эксперименты по влиянию стрессов проводили только на зелеш.тх проростках, в экспериментах по ингибированию синтеза РНК или белка раствор ингибиторов вносили под корни проростков.
2.3.Методы исследования. Экстракцию белковых фракций, изоэлек-трическое фокусирование белков в ПААГ, определение количества белка и изучение аминокислотного состава на автоматическом аминокислотном анализаторе KLA-3B фирмы Hitachi (Япония) проводили по (Рядчиков В.Г. "Улучшение зерновых белков и их оценка", М. :Колос, 1978);
Определение активности РНКаз проводили по (Татарская Р.И. и др. ДАН СССР, 1964, т.157, N 3) с использованием коммерческого препарата дрожжевой РНК;
Выделение свободных и мембраносвязанных полирибосом ультрацентрифугированием и Mg4"1" - преципитацией, выделение РНК и очистку по-ли(А)-содержащей мРНК аффинной хроматографией на поли(У)-сефарозе, соотношение молекул с длинными и короткими поли(А)-последовательностями (А)п65°/(А)п35° термальной ступенчатой элюцией по-ли(А)+мРНК с колонки поли(У)-сефарозы при температурах 35° и 65°, синтез белка в бесклеточной системе из зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика, электронную микроскопию по (под редакцией Б.Хеймса, С.Хиггинса "Транскрипция и трансляция", М.: Мир, 1987; под редакцией Дж. Дрейпера и др. "Генная инженерия растений», М.: Мир, 1991);
В работе использовали синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, комплиментарные участку специфической мРНК: зеина 22 кД и зеина 19 кД (Marks е.а.,1985), мРНК waxy (УДФ-глюкозилтрансфераза, Wessler, Marquerite,1985), белка opaque-2 (о2-белок, Hartings е.а.,1989), мРНК фактора элонгации трансляции la (eEF-la, Pokalsky e.a., 1989); мРНК ß-кеторедукгазы и эноилредуктазы ( Slabas, Evans, 1990), а также мРНК акгана (Slabas, Evans, 1990). Зонды метили концевым включением радиоактивной метки [у33?] АТФ с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4; гибридизацию радиоактивно меченых зондов с мРНК проводили по (Т. Маниатис и др. "Методы генетической инженерии", М.: Мир,1984); для количественной оценки содержания мРНК использовали прямое измерение радиоактивности связавшегося с мРНК зонда на сцинтилляционном счетчике радиоактивности Rack Beta Spectral 1219, ЬКВ,(Швеция-Фшшяндия);
Использованы модификации методов исследования, разработанные автором [1,3,7,8,31,34,37]. Обработка РНК целитом: в водный раствор суммарной РНК (1 мг/мл), выделенной из тканей растений в присутствии ионов Mg^, добавляли прокаленный целит в соотношении 1 г целита на 4 мг РНК. Часть образцов прогревали в присутствии целита и охлаждали до комнатной температуры. Все образцы перемешивали с целитом в течение 5 минут при комнатной температуре, раствор декантировали с целита [34,37].
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Биосинтез белка в созревающем зерне обычной и opaque-2 кукурузы. Вторая половина семидесятых годов нашего столетия была ознаменована тем, что в это время произошел значительный прогресс в знаниях о синтезе запасных белков в семенах, обусловленный установлением места локализации синтеза этих белков, которым являются мембраносвязанные полирибосомы зерна злаков и семядолей бобовых растений. Это стало возможным благодаря применению комплекса методов современной молекулярной биологии: диф-
ференциалыюго ультрацентрифугирования, бесклеточного сш(теза белка, электронной микроскопии, ингибиторного анализа и др. Аналогичные работы были проведены автором на созревающем зерне кукурузы [1-17].
3.1.1. Биосинтез белков в онтогенезе. Активность РНКаз возрастает в процессе созревания эндосперма злаков, в том числе кукурузы; мутация гена opaque-2 значительно увеличивает активность РНКаз на всем протяжении развития эндосперма кукурузы (Dalby, Davies, 1967; Wilson, Alexander, 1967) [6,8,10-17]. Исследования закономерностей синтеза белка и нуклеиновых кислот привели к предположению, что изменение в соотношении синтеза и деградации мРНК является важным фактором, определяющим формирование белкового комплекса эндосперма кукурузы (Johari е.а.,1977; Tsai е.а.,1978) [8]. В связи с этим автором были предприняты исследования взаимосвязи уровня активности РНКаз в клетках эндосперма кукурузы с динамикой синтеза ос-борновских белковых фракций и компонентным составом зеинов[10-16].
Под действием мутантного гена opaque-2 все группы белков претерпевают изменения [8,10-16]. Плейотроиность действия мутации на биохимическом уровне выражается в том, что в эндосперме изменена активность ферментов не только азотного, но и углеводного, липидного и энергетического обменов (Mertz, 1986).
У злаков, в частности у пшеницы и кукурузы, периферическая часть эндосперма, особенно клетки, прилегающие к алейроновому слою, значительно отличаются от центральной части по соотношению белковых и углеводных отложений (Яковлев,1950). С точки зрения цитоморфологии, в эндосперме о2-кукурузы нет четкой дифференциации между центральной (мучнистой) частью и субалейроновым слоем (роговидной частью), как у обычного аналога. Субалейроновый слой в мутанте заменен рыхлой крупноклеточной тканью, по морфологии сходной с тканью центральной зоны обычного эндосперма. В мучнистой ткани обычной кукурузы в 5 раз выше активность РНКазы, чем в роговидной, и по абсолютному значению она близка к активности в мутантом эндосперме. При этом мучнистая часть содержит в 2 раза больше лизина в белке, что обусловлено перераспределением белковых фракций. Как и о2-эндосперм, мучнистая ткань содержит значительно меньше зеина и больше других белковых фракций по сравнению с роговидной тканью. Снижение содержания зеина в мучнистой ткани зерна обычной кукурузы сопровождается характерными для о2-эндосперма изменениями в спектре зеина при его изоэлектрофокусировке в ПААГ: отсутствует фракция 1 + 2 и значительно снижено содержание фракции 7 [10].
В спектре зеиновых белков обычного эндосперма на разных стадиях развития имеются количественные различия: в ходе созревания снижается содержание 1-го, 2-го и 16-го компонентов. По данным денситометрии, на долю
1-го и 2-го пиков от всей суммы зеина в обычном эндосперме приходится на 20-й день от опыления 7,6 %, на 40-й день - 6,1 %, на 60-й - 4,0 %. В зеине о2-эндосперма отсутствуют именно 1-й и 2-й компоненты, 16-й присутствует на 20-день, но затем содержание его резко падает [6,11,13]. По-видимому, синтез упомянутых компонентов у обычной кукурузы происходит только на ранних этапах созревания. В дальнейшем возросшая активность РНКаз уничтожает их короткоживущие мРНК, тем самым прекращая синтез, а последующее накопление других зеиновых белков разбавляет их концентрацию в ходе развития эндосперма. В мутантном эндосперме синтез этих компонентов сведен до минимума вследствие более высокой активности РНКаз. Следовательно, изменение спектра зеиновых белков в созревающем эндосперме может являться результатом модуляции экспрессии генов зеинов на постгранскрипционном уровне.
3.1.2. Влияние блокады транскрипции на соотношение синтеза белковых фракций. Развитие идеи о перераспределении белковых фракций (в широком смысле слова) в результате дифференциального распада мРНК во многом связано с попыткой теоретического объяснения супериндукции синтеза ряда белков в клетке под влиянием актиномицина Д - ингибитора ДНК-зависимого синтеза РНК. Было замечено, что при использовании актиномицина Д, когда мРНК постепенно разрушается, а новая не синтезируется и ожидается угнетение синтеза белка, синтез тем не менее усиливается. Для объяснения этого феномена Г. Томкинс (Тоткшз,1969) предложил гипотетическую схему регуляции синтеза ферментов, согласно которой в процессе участвуют как структурный, так и регуляторный гены. При этом мРНК регу-ляторных генов менее стабильна, чем мРНК структурных. Структурный ген продуцирует мРНК, на которой при трансляции образуется фермент, а регуляторный ген - мРНК, на которой образуется белок-репрессор. Этот белок, как полагал Г.Томкинс, специфично блокирует определенные последовательности мРНК, что нарушает инициацию синтеза белка и в то же время стимулирует распад молекул мРНК. Распад короткоживущей мРНК репрессора в условиях блокады транскрипции приводит к стабилизации мРНК ряда структурных генов и стимуляции синтеза соответствующих им белков (рис. 1).
Судя но многочисленным сообщениям о парадоксальном действии актиномицина Д по индукции синтеза белков в животных и растительных клетках, описанная система регуляции имеет, видимо, широкое распространение (ТоткшБ е.а.Д972,Ке5з1ег-1сек50п е.а.,1978). Представляло принципиальный интерес выяснить, как повлияет блокада транскрипции актиномицином Д на соотношение белковых фракций в эндосперме обычной и 02-кукурузы и таким образом оценить возможность трактовки причин формирования высоколизи-нового синдрома с позиций гипотезы Г. Томкинса.
1 I I □ 1 1
Структурные гены ген-регулятор
Т
мРНК
* 1
энзимы белок-репрессор
Рие.1. Гипотетическая схема участия РНКазы в регуляции синтеза белка на посттранскрипционном уровне
Введение актиномицина Д в початки обычной кукурузы (500 мкг/початок) приводило к перераспределению включения меченых аминокислот в растворимые белковые фракции: возрастала доля альбуминов и снижалась доля глобулинов, глютелинов и проламинов (табл.1).
Таблица 1
.Влияние актиномицина Д на распределение 14С-аминокислот (лизин, лейцин) среди белков различных фракций эндосперма обычной и орадие-2 кукурузы (20-й день после опыления),
Биохими- \У64+/+ W64o2/o2
ческий актиномицин Д актиномицин Д
показатель контроль 26 ч 90 ч контроль 26 ч 90 ч
Альбумины 42,т,А 48,5±2,3 56,4±2,0 67,0±3,3 67,1+2,0 65,3±0,2
Глобулины 9,7±0,8 7,9+0,8 5,7±0,5 8,3±0,2 6,№Л 7,4±1,0
Проламины 23,2+0,9 19,5±0,4 8,3±0,8 10,3+1,0 12,9+1,0
Ппотелины 25,1±1,9 21,4±1,5 18,4±1,0 16,1±0,9 16,6±0,9 14,4+1 =0
Аминокислоты, % от общего азота
Лизин 4,0±0,1 5,0+0,1 5,7+0,3 5,7+0,5 5,4±0,1 5,3±0,1
Лейцин 11,7+0,4 10,1+0,5 9,1+0,1 6,2+0,2 6,8+0,2 7,5+0,1
мРНК
короткоживущие мРНК" - ? РНК-аза-
Экспозиции в течение 26 и 90 часов давали однонаправленные, но разной степени изменения в перераспределении радиоактивности. Соответственно изменению белкового комплекса изменялся и аминокислотный состав эндосперма: увеличивалась доля лизина и снижалась - лейцина.
В мутантном эндосперме изменения были незначительными. Однако вполне очевидно, что и здесь более всего снизилась доля глобулинов; практически не изменилась пропорция синтеза альбуминов и глютелинов, но достоверно возросла пропорция синтеза проламинов. Соответственно несколько снизилась доля лизина и увеличилась доля лейцина, которым богата зеиновая фракция [10,14,15,16].
Поскольку при актиномициновой блокаде экспрессия генов исключена, усиление синтеза зеина может быть только следствием относительной стабильности мРНК зеинов в ог-эндосперме. Относительно низкая доля глобулинов в зерне 02-кукурузы и неизменность ее под влиянием ингибиторов, а также снижение синтеза глобулинов в зерне обычной кукурузы, обусловленное действием ингибиторов, говорят о том, что субпопуляция мРНК глобулинов относительно богата коропсоживущими мРНК, быстро распадающимися как в условиях ингибирования синтеза белка, так и в условиях повышенной активности РНКазы. Сходные результаты о времени жизни мРНК глобулинов были получены на вегетативных органах яровой пшеницы (Белова, 1980,1982).
В целом, полученные экспериментальные данные и сопоставление их с литературными позволяют предположить, что повышенная активность РНКаз может быть фактором, определяющим перераспределение белковых фракций по гипотетической схеме Г. Томкинса: усиленный распад короткоживущих мРНК снижает концентрацию белков-репрессоров, в результате повышается стабильность мРНК ряда струюурных генов (см. рис.1), что, в свою очередь, может быть причиной заторможешюсти развития мутаптного эндосперма, выражающейся в сохранении в мутанте белковых картин ранних стадий созревания эндосперма [2]. В дальнейшем этот вывод, основанный на косвенных данных, был под твержден в экспериментах по прямому сравнению стабильности in vitro ряда специфических мРНК из зерна обычной и opaque-2 кукурузы (рис. 4) [40].
3.2.3. Влияние теплового шока на белоксинтезирующий аппарат. Известно, что тепловой шок, разрушая мембраны, тем самым способствует деполимеризации мРНК РНКазами (Belanger е.а.,1986). В связи с этим представляло интерес выяснить, как влияет исходный уровень РНКаз в клетке на степень деструктивных изменений белоксинтезирующего аппарата при тепловом шоке. Для изучения влияния теплового шока на синтез белка в созревающем
зерне кукурузы початки снимали с растения и инкубировали при 25°С (контроль) или при 40°С (опыт) [17,19,27].
На двадцатый день после опыления тепловой шок увеличивал активность РНКаз в зерне обычной кукурузы до уровня мутанта, в тех же условиях в зерне 02-кукурузы не наблюдалось возрастания активности РНКаз. Относительный уровень активности РНКаз выглядел следующим образом: зерно обычной кукурузы - 100 %, зерно обычной кукурузы при тепловом шоке -160 %, зерно о2-кукурузы - 165 % и зерно о2-кукурузы при тепловом шоке -155 %. На ЗО-й день активность РНКаз в зерне обеих форм кукурузы была соответственно выше по сравнению с двадцатым днем и тепловой шок не изменял их активности.
Таблица 2.
Выход рибосомального материала (мкг/г свежих зерен)
Дни Линия Класс полирибосом
после кукурузы свободные мембраносвязанные
опыления 25°С 40°С 25°С 40°С
20 W6A о2/о2 310+15 272+8 152±8 53+10
20 W64A +/+ 223+5 224+6 124+20 81±6
30 W64A о2/о2 196±9 91±4 63±9 18±3
30 W64A+/+ 130+5 96+5 32+1 20+2
30 W64A +/+, актиномицин Д 154+8 127±3 34+2 31+2
На 20-ый день тепловой шок не изменял выход свободных полисом из зерна обычной кукурузы, но выход мембраносвязанных полисом снизился на 35% (табл.2). В то же время тепловой шок снижал выход свободных и мем-браносвязашшх полисом из 02-зерна соответственно на 12 и 65 %. На 30-ый день для обычной и о2-кукурузы выход свободных полисом снизился соответ-ствешш на 26 и 54 %, а мембраносвязанных - на 38 и 71 %. Более высокую чувствительность к тепловому шоку мембраносвязанных полисом можно объяснить распадом мембран ГЭР (Вс1ап£сг е.а.,1986). Однако практически не изменился выход мембраносвязанных полисом при воздействии тепловым шоком на зерно кукурузы, обработанное актиномицином Д. Это позволяет предполагать, что процесс распада (мембран или полирибосом) определяется не прямым действием высокой температуры, а обусловлен изменениями в экспрессии генома.
Под влиянием теплового шока снижается трансляционная активность обоих классов полисом как обычной, так и о2-кукурузы на 20-ый день (табл.3). Вероятно, это объясняется изменением соотношения полисом и мо-носом. К ЗО-ому дню картина была более сложной: трансляциоштя активность свободных полисом обычной кукурузы не изменялась при тепловом шоке, в то время как во всех других вариантах наблюдалось снижение трансляционной активности.
Таблица 3.
Включение 358-метионина в белок (имп/мин х 103/А2бо) при трансляции полирибосом в бесклеточной системе _синтеза белка из зародышей пшеницы_
Дни Линия Класс полирибосом
после кукурузы свободные мембраносвязанные
опыления 25°С 40°С 25°С 40°С
20 \V64A Ог/О! 11,5±0,60 6,6±0,60 47,0±0,5 24,1+0,2
20 \V64A +/+ 16,2±0,80 10,9±0,60 72,0±0,6 36,5±0,8
30 \У64 Ао2/о2 2,9±0,05 1,8±0,07 27,3+0,2 14,8±0,4
30 \V64A +/+ 3,3+0,08 3,0+0,09 20,8+0,5 12,3+0,3
30 \V64A +/+, актиномицин Д 12,5±0,5 11,9±0,20 22,2±0,5 31,0±0,7
Введете актиномицина Д в початок кукурузы приводит к стимуляции активности свободных полисом и снимает действие теплового шока на мем-браносвязанные полисомы. Последнее выражается в том, что активность мембраносвязанных полисом не только не снижается, но даже повышается.
По-видимому, при обработке актиномицином Д РНКазы деполимери-зуют в первую очередь короткоживугцие мРНК гипотетических репрессоров, существование которых постулировал Г. Теркине (Тотктэ е.а.,1969), снижающие стабильность и трансляционную активность белокешггезирующего аппарата ( см. рис. 1). Этим, вероятно, можно объяснить усиление трансляционной активности свободных полисом.
Повыше1шая температура усиливает активность рибосом растений в бесклеточной системе синтеза белка на экзогенной матрице (РеЫцщ, \^(3пег,1985). Возможно, этим эффектом объясняется стимулирование тепловым шоком активности мембраносвязанных полирибосом из зерна, обрабо-
танного актиномицином Д, тогда как свободные полирибосомы уже работали на полную мощность. В норме же распад мембраносвязанных полисом при тепловом шоке не позволяет наблюдать этот эффект.
Поскольку у ряда организмов под влиянием теплового шока происходит дезагрегация полирибосом без уничтожения соответствующих мРНК, представлялось принципиально важным выяснить, сопровождается ли снижение количества мембраносвязанных полисом в зерне кукурузы деполимеризацией мРНК и какое влияние оказывает на этот процесс ингибирование транскрипции. Для этого использовали дот-блот-гибридизацшо радиоактивно меченного олигонуклеотидного зонда к мРНК зеинов 22 кД с суммарной РНК из созревающего зерна кукурузы на капроновых фильтрах.
При изучении влияния теплового шока початки кукурузы срезали с растения и выдерживали при соответствующей температуре в лабораторных условиях [27]. Снятие початка с растения является само по себе стрессирую-щим фактором, связанным с потерей влаги. Этим можно объяснить то, что зерно контрольных початков в экспериментах по тепловому шоку содержало лишь одну треть мРНК зеинов 22 кД по сравнению с зерном контрольных початков, подвергнутых немедленной фиксации жидким азотом. Тем не менее, в первые часы теплового шока распаду подвергалось до 90% мРНК зеинов 22 кД, т.е. время полураспада составляло только 1,5 часа (в норме - 5-50 часов). Следовательно, снижение количества мембраносвязашшх полирибосом в созревающем зерне кукурузы под действием теплового шока сопровождается распадом, по крайней мере, части мРНК мембраносвязанных полисом. Это обусловлено синтезом неизвестного фактора, индуцированного тепловым шоком, так как предварительное введите в початок актиномицина Д сохраняет мРНК на исходном уровне (табл.4).
Таблица 4.
Влияние температуры на относительное содержание мРНК зеинов 22 кД в созревающем зерне кукурузы _(имп./мин/50 мкг РНК)_
Линия кукурузы Время обработки, час Температура
25°С 40°С
контроль актиномицин д контроль актиномицин д
\V64A +/+ 3 33000±500 33000±600 3500+40 33000±400
\V64A +/+ 10 31000+400 29000±600 30600+600 28000+600
\V64A 02/02 3 3000±30 2900±40 2950±60 2900+80
Однако к 10-ому часу в условиях теплового шока происходит восстановление исходного уровня мРНК зеина 22 кД. Возможно, это связано с тем, что неизвестный фактор РНК-овой или белковой природы синтезируется в клетках лишь в первые минуты перехода от условий оптимальной температуры к тепловому шоку. Затем этот фактор распадается и в дальнейшем не синтезируется.
3.3. Стабильность мРНК зеинов. Транскрипционная регуляция синтеза зеина в значительной степени связана с наличием в клетках эндосперма белка opaque-2, который специфически связывается с промоторами генов зеинов 22 кД и является их транскрипционным активатором. Отсутствие этого белка в эндосперме о2-кукурузы приводит к глобальному снижению (более чем на 90%) синтеза зеинов 22 кД (Schmidt,1993). Таким образом, зерно Ог-кукурузы содержит, в основном, только зеины 19 кД. Распад мРНК в зерне, обработанном актиномицином Д, приводит к относительному увеличению доли синтеза зеина в мутанте, но не в обычной кукурузе (см. табл.1), что позволяет предполагать разницу в стабильности мРНК зеинов 19 кД и 22 кД. Вместе с тем известно, что в зерне обычной кукурузы количество транскриптов зеинов 22 кД в ядре значительно превосходит содержание этих мРНК в цитоплазме, в то время как для транскриптов зеинов 19 кД наблюдаются обратные соотношения. Одним из объяснений этому может быть разная стабильность мРНК зеинов 19 кД и 22 кД (Kodrzycky е.а.,1989).
С целью проверки этого предположения была предпринята работа по изучению гетерогенности мРНК зеинов 19 кД и 22 кД по времени жизни как in vivo, так и in vitro с использованием метода дот-блот-гибридизации суммарной и поли(А)+мРНК с соответствующими олигонуклеотидными зондами.
3 .3.1 Дифференциальная стабильность мРНК зеинов in vivo. О времени полураспада мР1Ж зеинов судили по уровню содержания мРНК в зерне (20-й день после опыления) в различные временные интервалы после инъекции ак-тиномицина Д в початок (500 мкг/початок) [20,22,25,26,27,34,37,40].
Под влиянием мутации гена opaque-2 содержание мРНК зеинов 19 кД снизилось до 40 %, а мРНК зеинов 22 кД до 4 % от уровня их содержания в зерне обычной кукурузы [34].
К 10-ому часу блокады транскрипции в зерне обычной кукурузы оста-. валось 55 % мРНК зеинов 19 кД и только 40 % мРНК зеинов 22 кД. В зерне мутанта в этих условиях оставалось 80 % мРНК зеина 19 кД (рис.2). Об изменении содержания мРНК зеинов 22 кДа судить трудно по причине очень низкого их содержания в зерне о2-кукурузы.
Таким образом, мРНК зеинов по мере убывания стабильности выстраиваются в следующий ряд: мРНК зеинов 19 кД зерна 02-кукрузы > мРНК
Время, ч
Рис.2. Динамика распада мРНК зеииов 19 кД (а) и 22 кД (б) в созревающем зерне (20 день после опыления) кукурузы W64A+/+ (1) и W64A о2/о2 (2) при обработке акгиномицином Д
зеинов 19 кД зерна обычной кукурузы > мРНК зеинов 22 кДа зерна обычной кукурузы.
Относительная стабильность мРНК зеинов в зерне о2-кукурузы позволяет понять эффект усиления синтеза зеина в мутанте при блокаде транскрипции актиномицшюм Д (см. табл.1): вероятно, в о2-зерне распад мРНК незеи-новых белков более интенсивен по сравнению с распадом мРНК зеинов, тогда как в аналогичных условиях в зерне нормальной кукурузы происходит сравнительно равномерный распад мРНК как незеиновых, так и зеиновых мРНК. Этот вывод, сделанный на основании изучения стабильности мРНК зеинов in vivo, согласуется с результатами, получешшми в дальнейшем при изучении стабильности ряда специфических мРНК in vitro (рис.4).
3.3.2. Дифференциальная стабильность п о лиГАУсодержащей мРНК зеинов в бесклеточпой системе синтез белка. Бесклеточная система синтеза белка широко применяется для изучения цис- и транс- факторов, определяющих распад мРНК, а также для оценки относительной стабильности мРНК. Время полужизни мРНЕС в бесклеточпой системе коррелирует с таковым в ин-тактных клетках (Ross, Kobs,1986; Sunita, Slobin, 1987; Byrne e.a.,1993). Вместе с тем этот метод оценки стабильности мРНК не имеет тех недостатков, с которыми сопряжено применение актиномицина Д.
В работе использовали поли(А)+мРНК из созревающего зерна обычной и opaque-2 кукурузы и две бесклеточные системы - из зародышей пшеницы и
ретикулоцитов кролика [25,26,34]. Первая система обладает низкой эндогенной активностью и высокой стимуляцией меченых аминокислот при добавлении экзогенной матрицы. Ее главный недостаток - РНКазная активность. Для повышения эффективности синтеза была проведена оптимизация бесклеточной системы по всем ее компонентам. Бесклеточная система из ретикулоцитов кролика более стабильна и обладает низкой нуклеазной активностью. В обоих случаях были получены одинаковые результаты: за 30 минут инкубации мРНК из зерна обычной кукурузы в любой из систем поли(А)-содержащая мРНК зеинов 19 кД распадалась только на 40 %, а поли(А)-содержащая мРНК зеинов 22 кД - на 60 % (рис.3). В то же время мРНК зеинов 19 кД из зерна 02-кукурузы по динамике и степени распада не отличалась от таковой мРНК из зерна обычной кукурузы. Аналогичным образом происходил распад мРНК зеинов 19 кД из зерна обычной кукурузы, обработанной актиномицином Д в течение 10 часов, т.е. не имеющей короткоживущей субпопуляции (рис.3).
Время, мин
Рис.3. Распад мРНК зеинов в бесклеточной системе синтеза белка. А -поли(А)+мРНК обычной кукурузы; Б - поли(А)+мРНК обычной кукурузы, обработанной актиномицином Д, 10 ч; В - поли(А)+мРНК ораяие-2 кукурузы; 1- зеин 19 кД, 2- зеин 22 кД.
Таким образом, распад мРНК зеинов обычной кукурузы в бесклеточной системе синтеза белка, как и распад in vivo, происходит дифференциально. Матричные РНК зеинов 19 кД оказались более стабильными по сравнению с мРНК зеинов 22 кД в обоих случаях. Отсутствие разницы в динамике и степени распада мРНК зеинов 19 кД, взятой из разных объектов, а также об-работашсых актиномицином Д, указывает на то, что в бесклеточную систему вносили только мРНК относительно стабильной субпопуляции - полиадени-лированная короткоживущая фракция мРНК зеинов утрачивается в ходе выделения мРНК аффинной хроматографией в силу своей нестабильности. Это предположение представляется вероятным, исходя из того, что остановка трансляции в живой клетке циклогексимидом приводила к стабилизации ко-роткоживущих мРНК и увеличивала их выход при аффинной хроматографии (Wreshner,Rechavi,l 988).
3.4. Дифференциальная стабильность специфических мРНК в ходе аффинной хроматографии на полиГУ)-сефарозе.
3.4.1.Стабильность мРНК зеинов 19 кД обычной и орадие-2-кукурузы. Для проверки предположения о распаде части мРНК в ходе деуциклической аффинной хроматографии использовали препараты суммарной РНК из зерна обычной и ог-кукурузы. При повторном нанесении на колонке сорбировалось только 45 % поли(А)+мРНК из обычной кукурузы и 56 % из 02-кукурузы. Разница в 11 % была достоверной. По всей видимости, доля молекул мРНК, подвергающихся деградации при аффинной хроматографии, генетически детерминирована [34,37].
Естественно было предполагать, что распад мРНК осуществляют следовые примеси свободных РНКаз в препаратах PITK, по чистоте соответствующих стандартным требованиям. Для проверки этого предположения смешивали в соотношении 1 : 1 два препарата суммарной РНК, контрастно различающихся по выходу поли(А)+'мРНК, с последующим выделением из смеси пол^Ау^мРНК. Ожидалось, что в случае наличия примесей свободных РНКаз выход поли(А)4 'мРНК должен быть ниже среднего значения для смешанного образца. Каждый раз подобный эксперимент давал рассчитанный средний выход ± 1,5 %. Кроме того, суммарный препарат поли(А)+мРНК, сорбированный на поли(У)-сефарозе, подвергали обработке проназой и про-теиназой К, но это не отражалось на выходе поли(А)++мРНК. Эти факты доказывают отсутствие свободных РНКаз и позволяют предположить, что разрушение мРНК производится ассоциированными РНКазами.
В наших экспериментах предполагаемые ассоциированные РНКазы выдерживали обработку смесью фенола и хлороформа, этанола, высокими концентрациями додецилсульфата натрия, хлористого лития и мочевины. РНКазы с подобными свойствами известны у животных (Арион и др., 1982).
Известно, что гомонуклеотидная последовательность поли(А) участвует в определении стабильности мРНК: деаденилирование является первым этапом распада мРНК, второй этап - расщепление мРНК на олигонуклеотиды (Green,1993; Beelman,Parker, 1995). Исходя из результатов наших исследований и литературных данных, мы предполагаем, что мРНК растений содержит комплексы ассоциированных РНКаз, осуществляющих деаденилирование и распад мРНК в ходе аффинной хроматографии.
Для изучения судьбы мРНК в ходе аффинной хроматографии была использована молекулярная гибридизация радиоактивно меченных олигонукле-отидных зондов к мРНК зеинов 19 кД с поли(А)-содержащей мРНК непосредственно на колонке поли(У)-сефарозы. Гибридизацию поли(А)-содержащей мРНК проводили одновременно для первого и второго циклов хроматографии (т.е. для поли(А)+мРНК и поли(А)++мРНК) на параллельных колонках при температуре 36°С в присутствии 50 % формамида.
Для гибридизации использовали матричные РНК, отличающиеся друг от друга по длине поли(А)-последовательностей на З'-конце молекул. Препараты РНК непосредственно после выделения имели преимущественно длин-нохвостовые поли(А)+мРНК с соотношением (А)п65°/(А)п 35°= 2,4 для обычной кукурузы и 2,2 для о2-кукурузы (мРНК тип 1). Хранение препаратов суммарной РНК в жидком азоте в течение 4-6 недель приводило к укорачиванию поли(А)-последовательностей мРНК и соотношение менялось в сторону ко-роткохвостовых молекул: для нормальной кукурузы оно составляло 0,33, а для о2-кукурузы - 0,24 (мРНК тип 2). Соответственно изменялся и выход по-ли(А)чмРНК: он снижался с 1,6 % до 0,8 %. Вероятно, при этих условиях хранения (-195,8°С) не прекращается деятельность ассоциированных с мРНК РНКаз, определяющих деаденилирование и распад, так как один и тот же препарат, разлитый на аликвоты, менялся с течением времени хранения. Механизм этого процесса, скорее всего, связан с элекгронно-конформационными взаимодействиями, активирующими действие ферментов в условиях низких температур (Рубин, 1987).
Результаты экспериментов по гибридизации мРНК с олигонуклеотид-ным зондом 33Р-зеин (19 кД) различаются для разных типов мРНК. При этом для мРНК типа 1 общая радиоактивность поли(А)++мРНК составляла в среднем 90 % от общей радиоактивности поли(А)+мРНК для обычной кукурузы и около 100 % для о2-кукурузы. В случае же мРНК типа 2 общая радиоактивность поли(А)++мРНК от поли(А)+мРНК составляла 63 % для обычной кукурузы и 109 % для о2-кукурузы (табл.5). Чтобы устранить влияние вторичной структуры мРНК на результаты гибридизации, суммарную РНК типа 1 прогревали в воде при 65°С 5 минут, а затем проводили одновременно гибридизацию зонда с поли(А)+мРНК и поли(А)++мРНК. При этом прогрев приводил к
потере до 35 % поли(А)+мРНК, а общая радиоактивность поли(А)+,мРНК от поли(А)+мРНК составляла 67 % для обычной кукурузы и 97 % для о2-кукурузы. Вероятно, часть сайтов гибридизации мРНК типа 1 бьша закрыта вторичной структурой молекулы и это снижало общую радиоактивность по-ли(А)+мРНК. Укорочение поли(А)-хвостов у мРНК типа 2 приводило к плавлению вторичной структуры мРНК и деэкранированию дополнительных сайтов гибридизации. На примере Р-акгина клеток животных показано, что по-ли(А)-последователыюсть в значительной мере определяет вторичную структуру мРНК (Bandyopadhyay,Brawerman,1992).
Таблица 5
Гибридизация зонда 33Р-зеин (19 кД) с поли(А)-содержащей мРНК из зерна обычной и opaque-2-кyкypyзы в ходе аффинной хроматографии
на поли(У)-сефарозе
Линия кукурузы Характеристика поли-А+ мРНК1 Обработка РНК2 Характеристика поли-А-содержащих мРНК зеинов3
0,33 - 64±2
\У64А+/+ 2,40 + 67+1
2,40 - 90+2
0,24 _ 109±3
\¥64Ао2/о2 2,20 + 97±2
2,20 — 103+2
Пр1мечшше. 1) (А)п65°С/(А)п35°С
2) (-) Отсутствие обработки, (+) прогрев суммарной РНК при 65°С, 5 минут
3) % суммарной радиоактивности поли(А)++мРНК от суммарной радиоактивности поли(А)+мРНК
Известно, что деаденилирование приводит к дестабилизации мРНК; при этом стабильность определяется не только величиной поли(А)-последовательности на 3'-конце молекулы, но скоростью деаденилирования (Уап Но1Т,СгсспД997). Если исходить из того, что количество поли(А)++мРНК отражает долю стабильных молекул в данном пуле мРНК, то деаденилирование должно снижать это количество соответственно скорости деаденилирования, т.е. стабильности мРНК. После деаденилирования при хранении образ-
цов суммарной РНК в жидком азоте удельная радиоактивность по-ли(А)++мРНК для РНК типа 2 из обычной кукурузы снижалась на 55 %, а для 02-кукурузы - только на 30%, если удельную радиоактивность поли(А)++мРНК тала 1 обеих форм кукурузы принимать за 100%. Следовательно, динамика распада мРНК зеинов 19 кД in vitro (при аффинной хроматографии) и in vivo вполне аналогична [34,37].
3.4.2.Влияние циклогексимида и пелита на стабильность мРНК. Инги-бирование синтеза белка циклогексимидом (4 мг/початок) в зерне ог-кукурузы в течение 5 часов приводило к увеличению выхода поли(А)++мРНК с 55% до 80%, а в четырехдневных зеленых проростках озимой пшеницы Краснодарская 39 цшслогексимид, внесенный под корни (20 мкг/мл), в течение 6 часов увеличивал выход с 20% до 80%. Это свидетельствует о том, что процесс дифференциального распада мРНК в ходе аффинной хроматографии определяется короткоживущей РНКазой белковой природы, ассоциированной с мРНК. Для доказательства этого положения использовали обработку суммарного препарата РНК типа 1 взвесью целита (SÍO2), специфически адсорбирующего на себе белки. Обработка целитом приводила к увеличению выхода поли(А)++мРНК только у прогретого препарата суммарной РНК [34,37]. Вероятно, ассоциированные с мРНК РНК азы экранированы вторичной структурой мРНК и это является одной из причин устойчивости ферментов к обработке самыми различными агентами.
Детальное изучение влияния целита на изменение стабильности мРНК было проведено на РЖ из проростков яровой пшеницы [37]. В процессе хранения препаратов суммарной РНК из проростков пшеницы в течение шести недель в жидком азоте выход поли(А)+мРНК снизился с 2,10 % до 1,10 % у зеленых и с 2,14 % до 0,90 % у этиолированных проростков. При этом уменьшалось соотношение молекул с длинными и короткими поли(А)-последователыюстями. Обработка целитом прогретых и непрогретых препаратов суммарной РНК из зеленых и этиолированных проростков пшеницы с исходным соотношением (А)п65°/(А)п35° практически не вносила изменений в выход иоли(А)++мРНК. Однако, по мере укорочения поли(А)-последователыюстей происходило увеличение выхода поли(А)++мРНК после обработки целитом на 24 % и 29 % соответственно. Одновременный прогрев и обработка целитом таких препаратов РНК увеличивали выход по-ли(А)++мРНК до 45 % (табл.6). Очевидно, по мере укорочения поли(А)-последовательностей происходит изменение пространственной структуры мРНК, делая ассоциированные с ней белки доступными для адсорбции целитом. Прогревание, усиливая уже начавшийся процесс расплавления вторичной структуры, способствует повышению эффективности стабилизации мРНК целитом.
Таблица 6.
Влияние целита на выход поли(А)++мРНК из зеленых и этиолированных проростков пшеницы при аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе в зависимости от соотношения мРНК с длинными и короткими поли(А)-последовательностями на З'-конце молекул, % от контроля
Вид обработки суммарного препарата РНК (А)п 65°С/(А)п 35°С
зеленые этиолированные
2,08 1,70 1,18 0,56 2,00 1,84 1,67 0,52
контроль 100 100 100 100 100 100 100 100
65°С,5мин 96 93 70 58 96 93 75 38
целит 106 124 102 120 105 129 110 104
целит, 65°С,5мин 100 145 127 96 98 144 117 79
Дальнейшее изменение соотношения полиаденилированных молекул РНК в сторону короткохвостовых приводит к тому, что прогрев значительно снижает выход поли(А)++мРНК. Однако, целит и в этом случае эффективно "спасает" мРНК от деградирующего влияния повышенной температуры. Вместе с тем, эффективность стабилизации целитом таких мРНК в отсутствии прогрева значительно ниже по сравнению с длшгаохвостовыми молекулами, возможно, из-за того, что распад большей части мРНК, зависящий от деаде-нилирования, уже произошел в ходе хранения препаратов суммарной РНК.
Таким образом, влияние щшюгексимида и целита на стабильность мРНК, свидетельствуют о взаимосвязи степени полиаденилирования, пространственной структуры и участии белка в распаде мРНК.
3.4.3.Ряды индексов стабильности специфических мРНК in vivo и in vitro. Факты деаденилирования и дифференциального распада мРНК в жидком азоте позволили предположить, что инкубация водного препарата РНК при положительной температуре может оказаться эффективным приемом изучения этих процессов. Для проверки этого предположения ингибирование транскрипции генома осуществляли путем инкубации сегментов снятого с растения початка кукурузы на растворе актиномицина Д (100 мкг/мл). Контрольные сегменты инкубировали на дистиллированной воде [35,39,40].
Инкубация водного раствора суммарной РНК при 36°С в течение 1,5 часов приводила к заметному деаденилированию и распаду мРНК зерна кукурузы и проростков пшеницы (рис.4,5). Об этом свидетельствуют эксперименты с РНК зерна сегментированного початка кукурузы, в которых была прове-
дена сравнительная гибридизация поли(А)++мРЫК на поли(У)-сефарозе и дот-гибридизация суммарной РНК на капроновых фильтрах с молекулярным зондом к мРНК зеина 19 кД: блокада транскрипции с помощью актиномицина Д (in vivo) и инкубация препарата суммарной РНК (in vitro) приводили к деградации 30 % мРНК зеина по показаниям обоих методов. При этом следует отметить, что после инкубации абсолютные значения результатов молекулярной гибридизации на колонке поли(У)-сефарозы (суммарная радиоактивность) для части специфических мРНК были выше контрольных, т.е. превышали 100 %. Вероятно, это связано с тем, что деаденилирование приводит к плавлению вторичной структуры и деэкранированию дополнительных сайтов гибридизации. Аналогичное явление было уже описано для мРНК зеина 19 кД при изучении поли(А)+мРНК и поли(А)++мРНК зерна 02-кукурузы (табл.5).
Поскольку такие же закономерности наблюдались и при распаде соответствующих специфических мРНК in vivo в случае блокады транскрипции актиномицином Д (рис.4,5), можно предположить, что превышение 100 % суммарной радиоакгавносга в опытном варианте тем больше, чем более стабильна изучаемая мРНК. По-видимому, для каждой специфической мРНК значение суммарной радиоактивности поли(А)++мРНК зависит от двух процессов - плавления вторичной структуры, связанного с деаденилированием, и распада мРНК, оказывающих противоположное влияние на результаты молекулярной гибридизации. У стабильных мРНК эффект плавления вторичной структуры превышает эффект распада мРНК, в то время как у нестабильных -эффект плавления практически не заметен на фоне распада мРНК.
Сравнение in vivo и in vitro рядов индексов стабильности мРНК зерна обычной кукурузы (рис.4 а, б) показало, что самыми стабильными являлись мРНК эноилредуктазы и актина, самой нестабильной - мРНК eEF-Ia. В середине ряда индексы стабильности мРНК менялись местами при исследовании in vivo и in vitro. Вероятно, это связано с тем, что стрессовые условия проведения экспериментов in vivo оказали дестабилизирующее влияние на мРНК зеина 19 кД и мРНК о2-белка.
Как это ранее было показано для мРНК зеинов 22 кД [27], инкубация сегментов контрольных початков приводила и к обвальному распаду мРНК зеинов 19 кД (на 70%). На фоне этого распада резко увеличивалась доля мРНК незеиновых белков. Вместе с тем отмечено, что отношение включения радиоактивно меченых аминокислот in vivo в зеиновые и незеиновые белки зерна кукурузы на растении в десятки раз выше, чем таковое для зерна сегментов початков, инкубированных вне растения. Следовательно, стрессовые условия приводят к резкому ингибированию синтеза зеинов вследствие распада их мРНК. Тем не менее, блокада транскрипции приводила к углублению
Рис.4. Ряды индексов стабильности мРНК зерна обычной (1) и opaque-2(2) кукурузы in vivo и in vitro. In vivo - распад мРНК при блокаде транскрипции актиномицином Д. По оси абсцисс - время обработки актиномицином Д. (часы); по оси ординат - % поли (А)++мРНК. In vitro - распад мРНК в ходе инкубирования водных препаратов суммарной РНК в течение 1,5 часов при 36°С. По оси абсцисс степень полиаденилирования мРНК, (А)п657(А)п35°; по оси ординат - % поли(А)++мРНК. мРНК генов: а - эноил-редукгазы; б - актина; в - waxy; г - Р-кето-редуктазы; д - зеина 19 кД; е - 02-белка; ж -eEF-la
Рис.5. Ряды индексов стабильности мРНК этиолированных (1) и зеленых (2) проростков озимой пшеницы Краснодарская 39 in vivo и in vitro. In vivo - распад мРНК при блокаде транскрипции актиноми-цином Д. По оси абсцисс время обработки актшюмицином Д (часы); по оси ординат - % поли(А)++мРН1С. In vitro - распад мРНК в ходе инкубирования водных препаратов суммарной РНК в течение 1,5 часов при 36°С. По оси абсцисс - время инкубирования (часы); по оси ординат - % иоли(А)++мРНК. мРНК генов: а - eEF-1а; б - актина; в - waxy
распада мРНК зеииов 19 кД и к изменению положения мРНК зеина и о2-белка в ряду индексов стабильности по сравнению с таковыми из зерна контрольного початка, зафиксированного жидким азотом сразу после снятия с растения. Под влиянием мутации гена opaque-2 снижалось отношение зеиновых мРНК к незеиновым аналогично тому, как это имело место для обычной кукурузы, подвергавшейся стрессу. Сравнение in vitro рядов индексов стабильности специфических мРНК зерна обычной и о2-кукурузы (рис.4 а, в) показало, что в мутанте все исследуемые мРНК, за исключением мРНК актина и eEF-Ia , стабильнее соответствующих мРНК из зерна обычной кукурузы. Это согласуется с данными о более высокой стабильности мРНК зеина 19 кД в зерне о2-кукурузы и подтверждает вывод о том, что чем стабильнее мРНК, тем больше превышение над контролем результатов суммарной радиоактивносга. Вместе с тем, это объясняет различие в индексах стабильности суммарной мРНК зерна обычной и о2-кукурузы, которое является результатом более высокого содержания стабильных специфических мРНК в популяции мРНК зерна мутанта. Индекс стабильности мРНК составлял 45 % для обычной кукурузы и 56 % для 02-кукурузы в 1994 году и соответственно 40 % и 50 % в 1995 году. Следовательно, условия налива зерна в поле отражались на абсолютном значении индекса стабильности мРНК, но сохранялась разница между сравниваемыми формами кукурузы.
Аналогичное исследование трех специфических мРНК этиолированных проростков пшеницы показало полную идентичность рядов индексов стабильности этих мРНК in vivo и in vitro (рис.5). Вместе с тем, у зеленых проростков озимой пшеницы в экспериментах in vitro они были стабильнее соответствующих мРНК из этиолированных проростков, что, по-видимому, свидетельствует о более эффективной экспрессии этих генов в зеленых проростках. Наиболее стабильной в проростках пшеницы была мРНК eEF-Ia в отличие от таковой зерна кукурузы, а относительно стабильная в зерне кукурузы мРНК waxy в проростках- самая нестабильная. По-видимому, в этом находят свое отражение особенности ростового метаболизма сравниваемых растительных тканей, так как литературные данные свидетельствуют, что содержание мРНК или белка eEF-Ia является хорошим критерием интенсивности метаболических процессов в тех или иных растительных клетках. Важно отметить, что имеются высокие уровни гомологии нуклеотидного состава генов eEF-Ia разного происхождения до 70 % - 80 % (Pokalsky е.а., 1989).
Следовательно, распад мРНК в ходе двуцнклической аффинной хроматографии позволяет оценить индекс стабильности мРНК, отражающий относительную долю стабильных молекул в популяции суммарной мРНК клетки или в субпопуляции специфической мРНК. Этот показатель характеризует по-
тенциальную эффективность экспрессии того или иного гена в зависимости от генотипа и условий роста растений.
Представленные факты свидетельствуют о перспективности использования метода аффинной хроматографии для изучения влияния эндогенных и экзогенных факторов на стабильность мРНК растений. В целом, феномен дифференциального распада мРНК in vitro представляется принципиально важным для изучения реализации генетической информации в физиологические особенности организма.
Необходимо отметить, что дифференциальный распад мРНК in vitro наблюдался только в том случае, если суммарную РНК выделяли в присутствии ионов MgH. Замена ионов магния в экстрагирующем буфере на ионы лития приводила к стабилизации всех РНК [35,39].
3.4.4. Вариабельность выхода полиГАТмРНК.[29.30.31. 33,35,38]. Исследования трех сортов яровой пшеницы, различающихся генетически детерминированной интенсивностью роста (высокорослый сорт Опал, среднерос-лый Саратовская 29 и низкорослый Хупатека), показали, что наблюдается прямо пропорциональная зависимость между интенсивностью роста и выходом поли(А)^+мРН.К. Проростки выращивали на свету при температуре 20°С. Различия в росте разных сортов были хорошо видны визуально на четырехсу-точных проростках. Как видно из таблицы 7, сорт Опал имел самый высокий выход поли(А)"ь+мРНК, минимальный выход - сорт Хупатека (сорт мексиканского происхождения). Сорт Саратовская 29 имел промежуточное значение выхода поли(А)++мРНК.
Таблица 7.
Соотношение выхода поли(А)++мРНК и интенсивности роста для четырехсуточных проростков яровой пшеницы
Сорт Выход поли А** мРНК
(по мере снижения интенсивности в % от поли А+ мРНК
роста)
Опал 49±2
Саратовская 29 39+1
Хупатека 32+1
В таблице 8 представлены результата исследования выхода по-ли(А)++мРНК из проростков озимых пшениц, которые росли при разных температурных режимах. Минимальный выход у всех сортов наблюдался при 20°С. Отклонение от этой температуры приводило к увеличению выхода по-
ли(А)++мРНК. Здесь, как и в предыдущем эксперименте, было визуально видно, что проростки росли интенсивнее при температуре 23°С и еще более интенсивно при температуре 26°С по сравнению с температурой 20°С. Следовательно, и в этом случае увеличение выхода поли(А)++мРНК положительно коррелировало с ростом растений.
Таблица 8.
Выход поли(А)++мРНК из четырехдневных проростков озимых пшениц, находившихся в разных температурных условиях, в % от поли(А)+мРНК
Сорт Температура в последние 8 часов вегетации проростков, °С
4 20 23 26
Краснодарская 39 60±3 14+1 36+2 75±2
Олимпия 55+3 18±2 33±2 73±2
Безостая 1 44+1 25+1 31+2 49+1
Исключением из этой закономерности является увеличение выхода по-ли(А)++мРНК при 4°С, когда проростки росли менее интенсивно, чем при 20°С. Вероятно, это связано с хорошо известным фактом, что в период закаливания зимующих растений при околонулевых температурах, наряду с торможением роста, необходимо поддержание относительно высокого уровня биосинтеза метаболитов для структурной перестройки клеток, обеспечивающей им устойчивость к холоду (Трунова и др., 1988).
Такая же закономерность наблюдалась и у некоторых сортов ячменя, однако для большинства сортов озимого ячменя было характерно снижение выхода поли(А)++мРНК при 4°С.
В ходе этих исследований был отмечен важный факт: ранжировка селекционерами озимых сортов пшеницы и ячменя по холодоустойчивости в полевых условиях совпадает с нашей оценкой, основанной на изменении выхода поли(А)++мРНК из проростков под влиянием холода. Вместе с тем реакция на холод у озимой пшеницы и озимого ячменя была противоположной. Наиболее холодоустойчивый сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 отличался значительным увеличением доли поли(А)++мРНК при 4°С, в то время как наиболее холодоустойчивый сорт озимого ячменя Радикал имел отрицательную разницу между опытом (4°С) и контролем (20°С). Эта отрицательная величина убывает по мере снижения холодоустойчивости сортов, равняется нулю для сорта двуручки (Янус) и только затем сорта ячменя имеют положительное значение изменения доли поли(А)++мРНК под влиянием холода. Наи-
более высокое значение имел сорт ярового ячменя Мамлюк, обладающий наименьшей холодоустойчивостью (табл.9).
Таблица 9.
Влияние холода на выход поли(А)++мРНК из четырехдневных проростков озимого ячменя*
Сорт Поли (А)** мРНК в % от поли (А)+ мРНК Ранг холодоустойчивости сортов по полевым многолетним оценкам селекцио-неров( по мере убывания холодоустойчивости)
«К», 20°С «О», 4°С «0»-«К»
Радикал 40±0,5 33+0,3 -7 1
Секрет 40+0,4 35+0,4 -5 2
Кордон 42+0,4 39+0,2 -3 3
Янус 36+0,5 36±0,4 0 4
(двуручка)
Вавилон 36±0,3 42±0,5 6 5
Мамлюк 30±0,7 44±0,6 14 6
(яловой)
*Проростки были выращены при температуре 20°С. Перед закладкой опытов растения выдерживали не менее 12 часов на свету. Последние 8 часов опытные растения вегетировали на свету при 4°С.
Перед постановкой опытов растения выдерживали на свету не менее 12 часов и опыт проводили при освещении, так как наличие шш отсутствие, а также длительность освещения сильно влияли на выход поли(А)++мРНК. На рис.6 показана динамика изменений выхода поли(А)++мРНК из этиолированных и зеленых проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39. Освещение этиолированных проростков приводило к снижению, а затемнение зеленых проростков приводило к увеличению выхода поли(А)++мРЖ.
В темноте проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 росли намного интенсивнее, чем на свету. Следовательно, и в этом случае наблюдается прямо пропорциональная зависимость между интенсивностью роста и выходом поли(А)++мРНК.
Время, ч
Рис.6. Динамика выхода поли(А)++мРНК из четырехдневных проростков озимой пшеницы Краснодарская 39 при изменении условий освещения, % от поли(А)++мРНК. 1 - переход "свет - темнота" (зеленые проростки);2 - переход "темнота - свет" (этиолированные проростки)
У взятых для исследования двух сортов озимой пшеницы освещение приводило к снижению, а у яровой пшеницы сорта Дружина Б - к увеличению выхода поли(А)' 'мРНК в сравнении с контролем. При этом выявлены количественные различия в реакции на свет разных сортов озимой и яровой форм пшеницы, соответствующие реальным различиям этих сортов по фотопериоду (табл.10).
Таблица 10.
Влияние света на выход поли(А)++мРНК из четырехдневных зеленых проростков озимой и яровой пшениц при 20°С
Сорт
Поли (А)++ мРНК в % от поли (А)+ мРНК
без освещения 12 ч освещение Зч
Краснодарская 39 (озимая) 75±2,0 25±0,6,0
Безостая (озимая) 41±1,1 33±0,8
Дружина Б (яровая) 37±0,9 47±1,0
Спектр (яровая) 36±0,9 36+0,8
Известно, что свет регулирует темп онтогенеза. Для озимой пшеницы характерна задержка роста под влиянием света, в то время как для яровой пшеницы это проявляется лишь в слабой степени. Важно подчеркнуть, что генетически детерминированный тип развития и продолжительность вегетационного периода неяровизированных растений определяется их реакцией на свет именно в начальный период жизни, т.е. на стадии проростков (Федоров, Чельцова, 1990).
Взаимосвязь доли поли(А)++мРНК с биологическими особенностями растений свидетельствует о том, что процессы, происходящие при аффинной хроматографии, отражают конкретные процессы, происходящие in vivo, а следовательно, отражают молекулярные события реализации генетической информации в особенности физиологии растений.
3.5.Неспецифический ответ белоксинтезирующего аппарата растений на стрессовые условия внешней среды. Известно, что адаптация растений к стрессам непосредственно связана с работой белоксинтезирующего аппарата. При этом факторами, определяющими течение молекулярных процессов, является напряженность стресса: в закаливающей зоне его действия происходит активация как транскрипции, так и трансляции; в повреждающей - преобладающими становятся процессы распада, резко увеличивается активность гидролитических ферментов.
По нашим данным в закаливающей зоне стресса в 1,5 - 2 раза увеличивается активность РНКаз в проростках пшеницы и ячменя и изменяется индекс стабильности мРНК независимо от вида стресса (холод, засуха, засоление, действие экзогенных фитогормонов), т.е. происходит неспецифическая реакция белоксинтезирующего аппарата на стрессы [21,33,38].
Исследования действия солевого (2 % хлористого натрия), водного (12 % ПЭГ-8000) и холодового (2°С) стрессов на активность полисом шестидневных зеленых проростков пшеницы и ячменя в бесклеточной системе синтеза белка из зародышей пшеницы показало, что под влиянием всех трех видов стресса в первые часы воздействия наблюдается подъем трансляционной активности полисом, выделенных методом ультрацентрифугирования [18,23,24].
Эффект усиления активности полисом найден также при поранении растения, поражении патогенами, гипоксии (Бехоев и др., 1984, Ishizuka, Imaseki, 1989, Morelli е.а.,1994). Таким образом, усиление трансляционной активности полисом, наблюдаемое in vitro, является неспецифической ответной реакцией растений на действующий стресс.
Вместе с тем, усиление активности полисом in vitro наблюдается в первые часы блокады транскрипции актиномицином Д , а также при инкубации проростков пшеницы и ячменя на растворе панкреатической РНКазы [17,19,20,21,32]. В последнем случае наблюдалось также увеличение поступ-
леыия в растение радиоактивно меченых аминокислот [21,32]. Эти факты позволяют предполагать, что причиной усиления трансляционной активности полисом может быть дифференциальный распад мРНК в условиях повышенной РНКазной активности на основании гипотезы, представленной на рис. 1.
Анализ действия холодового стресса на трансляционную активность полисом in vitro ряда сортов пшеницы и ячменя с известной холодоустойчивостью показал прямо пропорциональную зависимость между долей прироста активности и холодоустойчивостью сорта. Это позволяет предполагать важную адаптивную роль мощности белоксинтезирующего аппарата в неспецифической устойчивости растений к стрессам (табл. 11).
Таблица 11.
Прирост трансляционной активности in vitro полисом проростков под действием холодового стресса у разных сортов злаковых культур
Сорт
Ранг холодоустойчивости (по данным селекционеров)
Активность полисом, % к контролю
Ячмень Радикал Скороход Метеор Вавилон Циклон Иверия
1 2
3
4
5
6
224+5 170±5 154±3 143±3 137±4 121±3
Пшеница Краснодарская 39 Краснодарская 57 Олимпия Безостая 1 Краснодарская 70 Колос
1
2
3
4
5
6
206±4
144±4
127±5
124±4
98±3
75+3
Трудно на сегодняшний день объяснить тот факт, что реакция у проростков пшеницы и ячменя на холод по приросту трансляционной активности
полисом была однонаправленной - увеличение активности, а по изменению выхода полЦАу^мРНК (индекс стабильности мРНК) реакция на холод этих двух культур была разнонаправленной: увеличение индекса у самого холодоустойчивого сорта пшеницы (Краснодарская 39) и снижение у самого холодоустойчивого сорта ячменя (Радикал). Так же противоположно реагировали эти сорта и на свет: прирост индекса у Краснодарской 39 и снижете у Радикала. Эти факты соответствуют многолетним эмпирическим наблюдениям фитофи-зиологов и селекционеров, отмечающих противоположные реакции озимой пшеницы и озимого ячменя на холод. Для объяснения несоответствия в изменении индекса стабильности и изменения трансляционной активности полисом in vitro у ячменя требуются дополнительные фундаментальные исследования этих двух феноменов. Тем не менее, очевидно, что реакция на стрессы белоксинтезирующего аппарата пшеницы и ячменя как на уровне стабильности мРНК, так и на уровне трансляционной активности полисом in vitro является генотипической (сортоспецифической).
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Судя по многочисленным сообщениям о парадоксальном действии ак-тиномицина Д по индукции синтеза белков в животных и растительных клетках, предложенная Г.Томкинсом схема регуляции имеет, по-видимому, широкое распространение (Tomkins, 1972). С позиции современной молекулярной биологии фактором, связующим интенсивность трансляции и время жизни мРНК, является степень полиаденилирования З'-конца мРНК. Известно, что чем протяженнее поли(А)-сегмент мРНК, тем выше ее трансляционная активность и стабильность (Jackson, Standart,1990; Munroc, Jacobson,1990; Кляч-ко,1991). Деаденилирование мРНК определяется РНКазой, ассоциированной с поли(А)-сегментом, активность которой, по данным настоящей работы, снимается обработкой РНК целитом [34,37]. Возможно, эта РНКаза является тем гипотетическим репрессором, дестабилизирующим мРНК, существование которого постулировал Г.Томкинс.
Коррелятивная связь между изменением суммарной активности РНКаз и синтезом белка в клетках растений позволяет предположить, что повышение активности РНКаз может быть фактором, определяющим перераспределение белковых фракций по гипотетической схеме: усиление распада короткоживу-щих мРНК снижает концентрацию белков-репрессоров, в результате повышается стабильность остальных мРНК растительной клетки (рис.1). Короткожи-вущие мРНК могут принадлежать репрессорам транскрипции и трансляции. Изменение их концентраций приведет к значительной перестройке метаболизма растения.
Вместе с тем, роль суммарной активности РНКаз в клетке остается не ясной, так как она складывается из активности РНКаз, участвующих в разных сторонах метаболизма РНК (процессинг, распад) и РНКаз, депонированных в вакуолях клетки. Возможно, изменение суммарной активности РНКаз в клетках растений под влиянием эндогенных и экзогенных факторов лишь коррелятивно связано с изменением активности РНКаз, ответственных за распад
Анализ многочисленных литературных данных показывает, что "высоколизиновый" синдром в клетках растений биохимически весьма схож с "адаптационным" синдромом - неспецифической реакцией на различные виды стресса. Главные черты обоих синдромов: 1) снижение синтеза запасных белков, 2) увеличение синтеза ряда других белков и мРНК (в первую очередь РНКаз, каталаз, ингибиторов трипсина, фактора элонгации еЕР-1а и др.), 3) снижение содержания крахмала и, следовательно, урожая (НаЬЬеп е.а.,1993; МогеШ е.а.,1994).
В наших исследованиях первые два положения подтверждались тем, что отношение количества мРНК зешюв к сумме мРНК незеиновых белков для зерна обычной кукурузы было равно 15, а для о2-кукурузы или для зерна обычной кукурузы в стрессовых условиях это соотношение снижалось до 6.
Меньшее накопление крахмала в зерне ог-кукурузы связано с нарушениями в ферментативной системе его синтеза (.1озЫ, 1980). Между синтезом запасных белков и синтезом крахмала имеется тесная взаимосвязь: максимум синтеза крахмала возможен лишь при максимуме синтеза запасных белков и наоборот (Сиоихе.а., 1994).
мРНК.
Повышенная активность РНК-азы
нарушение превращения
^перераспределение бел-
лизина в другие аминокислоты
ковых функций
нарушения в синтезе и накоплении крахмала
увеличение содержания лизина
ухудшение физических свойств эндосперма, снижение урожая
Рис.7. Гипотетическая причинно-следственная связь, обуславливающая высоколизиновый синдром в эндосперме кукурузы opaque-2
Вероятно, в синтезе крахмала, как и в синтезе запасных белков, принимают участие короткоживущие мРНК, нестабильные в условиях повышенной активности РНКаз. В свою очередь, повышение концентрации сахарозы в цитоплазме приводит к дестабилизации мРНК мембраносвязанных полисом (Turner е.а.,1990). Так может быть объяснена плейотропность действия гена opaque-2 (рис.7).
Вместе с тем, в экстремальных условиях в растениях также наблюдаются множественные изменения в ферментных системах. Следуя логике предложенной схемы, это можно объяснить дерепрессией широкого круга мРНК, которые направлены на создание нового профиля синтеза ферментов, необходимого для метаболических перестроек в адаптационном плане.
5.ВЫВОДЫ
5.1. Проведены сравнительные исследования синтеза белка в созревающем зерне обычной кукурузы и высоколизинового мутанта opaque-2, отличающегося повышенным уровнем активности РНКаз в эндосперме. Получены новые данные о динамике синтеза белковых фракций, свидетельствующие о значительной роли дифференциальной стабильности мРНК в формировании белкового комплекса зерна кукурузы:
а) найдена коррелятивная связь уровня активности РНКаз в клетках эндосперма с динамикой синтеза осборновских белковых фракций, компонентным составом зеинов и распадом полирибосом при тепловом шоке;
б) установлено, что в условиях блокады транскрипции актипомицином Д в зерне обычной кукурузы распад мРНК приводит к перераспределению синтеза белковых фракций подобно мутации гена opaque-2. В аналогичных условиях в зерне о2-кукурузы увеличивается доля синтеза зеинов, что предполагает относительно высокую стабильность мРНК этих белков в зерне мутанта.
5.2. Выявлены различия в стабильности мРНК зеинов в зерне обычной и opaque-2 кукурузы:
а) показано, что in vivo (при блокаде транскрипции актиномицином Д) и in vitro (в бесклеточной системе синтеза белка) мРНК зеинов 19 кД зерна обычной кукурузы более стабильна, чем мРНК зеинов 22 кД;
б) найдено, что в зерне о^-кукурузы имеется только 35 % мРНК зеинов 19 кД и 4 % мРНК зеинов 22 кД от уровня их содержания в зерне обычной кукурузы на 20-й день после опыления. При этом in vivo и in vitro мРНК зеинов 19 кД стабильнее аналогичной мРНК обычной кукурузы.
5.3. Воздействие стрессов (обезвоживание, поранение, тепловой шок) вызывает обвальный распад мРНК зеинов в зерне обычной кукурузы (на 70 -
90 % в зависимости от напряженности стресса). Предварительное ингибиро-вание транскрипции актиномицином Д предотвращает распад мРНК зеинов под влиянием теплового шока, что доказывает связь активности генома с деструктивными процессами при стрессе.
5 4. Обнаружен дифференциальный распад мРНК в ходе аффинной хроматографии, инкубации водных растворов РНК при положительных температурах и хранении в жидком азоте (in vitro). Распад специфических мРНК не зависит от трансляции и происходит аналогично тому, как это наблюдается in vivo в условиях блокады актиномицином Д транскрипции генома созревающего зерна кукурузы и проростков пшеницы. Установлена взаимосвязь между степепыо полиаденилирования мРНК, ее вторичной структурой и стабильностью в ходе аффинной хроматографии.
5.5. Остановка синтеза белка в растениях циклогексимидом или обработка высокоочищенных суммарных препаратов РБК растений целитом (Si02) приводит к остановке деаденилирования и стабилизации мРНК, что свидетельствует о наличии ассоциированных с мРНК РНКазах белковой природы, устойчивых к действию традиционных депротеинизирующих агентов.
5.6. Изменение условий внешней среды (температуры, освещения, стрессовые воздействия) приводят к генотипическому ответу белоксинтези-рующего аппарата растений (повышение трансляционной активности полисом in vitro, дифференциальный распад мРНК in vitro), что предоставтает принципиально новые возможности для разработки методов оценки стрессоустойчи-вости и фотопериодизма селекционного материала.
5.7. Дифференциальная стабильность мРНК наряду с транскрипцией формирует в клетках растений "высоколизиновый" и "адаптационный" синдромы. Подобный неспецифический комплекс регуляции синтеза белка на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях определяет быстрый ответ живой клетки на изменение условий окружающей среды и восстановление метаболизма после возвращения в нормальные условия.
6.РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ
Сложность биологических явлений, с которыми имеют дело селекционеры, требует интегрального подхода для оценки генетико-физиологического потенциала исходного материала и новых сортов сельскохозяйственных растений. Жесткая детерминированность стабильности мРНК, выражающаяся в сходстве распада мРНК in vivo и in vitro, открывает перспективы использования дифференциального распада мРНК in vitro как принципиально нового класса молекулярных маркеров для оценки стрессоустойчивости и фотопериодизма зерновых культур. Приоритет этого открытия закреплен патентом
[38]. Анализ судьбы специфических мРНК, основанный на методологии и последних достижениях генной инженерии, превосходит анализ белка по точности и предпочтительнее анализа ДНК, когда параметры экспрессии генов важнее параметров их структуры. В то же время этот метод, как и большинство молекулярных методов, легко поддается автоматизации, что позволит получать большой объем информации по мониторингу экспрессии генов в сравнительно простых экспериментах [33,35,36,38,39].
7. НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Плотников В.К. Выделение мРНК из эндосперма обьгчной и высоколизино-вой кукурузы. Сб. науч. тр. КНИИСХ, "Биохимическая и биологическая оценка белков зерновых культур при селекции на качество зерна", Краснодар, 1979, N 19, с. 44-51.
2. Рядчиков В.Г., Лебедев A.B., Филипас Т.Е., Неудачин В.П., Ермакова П.К. ,Плотников В.К. ,Букреева Г.И. ,3има К.И. Дариченко А.П. Белки и структура зерна кукурузы опак-2. Сб. науч. тр. КНИИСХ к 80-летию академика ВАСХНИЛ М.И.Хаджинова "Генетика и селекция кукурузы", 1979, Краснодар, с.236-258.
3. Плотников В.К. Два метода выделения матричной РНК из эндосперма кукурузы. Сб. пауч. тр. КНИИСХ, "Физиология зерновых культур в связи с задачами селекции", Краснодар, 1980, N 23, с. 106-112.
4. Плотников В.К. ,Лебедев A.B. ,Рядчиков В.Г. Действие гена опак-2 на содержание поли-А-содержащей РНК в развивающемся эндосперме кукурузы. Материалы 4-ой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур", Алма-Ата, 1980, с. 101102.
5. Плотников В.К. Влияние гена опак-2 на содержание матричной PIIK в развивающемся эндосперме кукурузы. Материалы 3-ей Всесоюзной научно-технической конференции по проблемам кукурузы. Днепропетровск, 1981, с.52-53.
6. Плотников В.К., Букреева Г.И., Лебедев A.B., Рядчиков В.Г. Рибонуклеаз-ная активность, матричные РНК и белки созревающего эндосперма обычной и опак-2 кукурузы. Материалы Всесоюзного совещания "Производство и использование растительного белка", Краснодар, 1981, с. 86-87.
7. Плотников В.К., Рядчиков В.Г. Влияние гена опак-2 на содержание нуклеиновых кислот в эндосперме кукурузы. Рукопись депонирована в справочно-информационном фонде ВНИИТЭИСХ, N 133-82. Реферат опубликован в реферативном журнале "Зерновые, зернобобовые культуры", N 8, 1982, с. 40.
8. Плотников В.К., Рядчиков В.Г., Букреева Г.И., Лебедев A.B. Некоторые особенности популяции мРНК созревающего эндосперма кукурузы опак-2. Физиология растений, 1983, т. 30, вып. 1, с. 63-72.
9. Плотников В.К., Филичкин С.А., Рядчиков В.Г., Неудачин В.П., Долгих Ю.Р. Распределение поли-А-содержащей РНК мембраносвязанных полирибосом в субклеточных препаратах созревающего эндосперма кукурузы. Сельскохозяйственная биология, 1983, т.16, с. 120-125,
10. Плотников В.К., Рядчиков В.Г., Филичкин С.А., Неудачин В.П., Филипас Т.Б., Долгих Ю.Р. К выяснению причин перераспределения белковых фракций в эндосперме кукурузы опак-2. Физиология и биохимия культурных растений, 1984, т. 16, с. 59-66.
11. Плотников В.К., Букреева Г.И. Некоторые закономерности синтеза зеина в созревающем эндосперме кукурузы. Сб. науч. тр. КНИИСХ "Биохимическая оценка белков зерновых культур в связи с задачами селекции на качество", Краснодар, 1985, с. 59-65.
12. Плотников В.К. Закономерности формирования белкового комплекса созревающего эндосперма кукурузы. Сб. науч. тр. КНИИСХ " Биохимическая оценка белков зерновых культур в связи с задачами селекции на качество", Краснодар, 1985, с. 66-73.
13. Плотников В.К., Неудачин В.П., Букреева Г.И. Соотношение активности РНКазы и синтеза зеина в созревающем эндосперме кукурузы. 6-ой Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1987, с. 136-137.
14. Плотников В.К., Рядчиков В.Г., Филичкин СЛ., Неудачин В.П., Букреева Г.И. Возможный молекулярный механизм перераспределения белковых фракций в созревающем эндосперме кукурузы опак-2. Материалы 5-го съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, Москва, 1987, т.4, ч.4, с. 135-136.
15. Плотников В.К., Киль В.И., Рахман Мд. Масудур. Влияние актиномицина, гепарина и канаванина на синтез запасных белков в зерне кукурузы. Материалы Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, Алма-Ата, 1988, с. 47-48.
16 . Плотников В.К., Киль В.И. Динамика синтеза зеина и зеина-2 в созревающем зерне обычной и опак-2 кукурузы под влиянием актиномицина и канаванина. Доклада ВАСХНИЛ, 1989, вып. 10, с. 8-10.
17. Плотников В.К., Киль В.И., Бибишев В.А., Новиков Б.Н. Влияние теплового шока на белоксинтезирующий аппарат зерна обычной и опак-2 кукурузы. Физиология растений, 1990, т. 37, вып. 2, с. 302-307.
18. Киль В.И., Бибишев В.А., Плотников В.К. Повышение трансляционной активности полисом как неспецифическая реакция растений на стрессы: гено-типический полиморфизм. Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990, с. 82.
19. Плотников В.К., Киль В.И., Бибишев В.А., Новиков Б.Н., Парадес Ж.Р. Молекулярно-генетические аспекты термоадаптации созревающего зерна кукурузы. Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990, с. 167.
20. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б. Особенности регуляции экспрессии генов зеинов в развивающемся зерне кукурузы опак-2. Материалы 2-го Всесоюзного совещания "Генетика развития", Ташкент, 1990, с. 133-134.
21. Плутахин Г.А., Новиков Б.Н., Бибишев В.А., Плотников В.К. К вопросу о роли рибонуклеаз в регуляции активности генов. Материалы 2-го Всесоюзного совещания "Генетика развития", Ташкент, 1990, с. 138.
22. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов зеинов 22 кД зерна кукурузы. Материалы 2-го съезда Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990, с. 63.
23. Киль В.И., Бибишев В.А., Плотников В.К. Влияние стрессов на трансляционную активность полисом ячменя и пшеницы. Материалы 2-го съезда Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990, с. 97.
24. Киль В.И., Бибишев В.А., Плотников В.К. Неспецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом из проростков пшеницы и ячменя. Физиология растений, 1991, т. 38, вып. 4, с. 730-735.
25. Plotnikov V.K., Bakaldina N.B., Efimov V.A. Stability of mRNA as regulation tool of zein genes expression in maize. International symposium "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application", Moscow, USSR, 1991, p. 166.
26. Плотников B.K., Бакалдина Н.Б., Ефимов B.A. Посттранскршционная регуляция экспрессии генов зеинов в созревающем зерне кукурузы. Материалы 1-го Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1991, с. 95-96.
Plotnikov V.K., Bakaldina N.B., Efimov V.A. Posttranscriptional regulation of zein genes expression in developing maize endosperm. First symposium "Trends in plant biotechnology", Pushchino, USSR, 1991, p. 189.
27. Плотников B.K., Бакалдина Н.Б., Ефимов B.A. Стабильность мРНК зеина кукурузы в условиях нормальной и высокой температур. Физиология растений, 1991, т. 38, вып. 5, с. 981-990.
28. Плотников В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот. Успехи современной биологии, 1992, т. 112, вып. 2, с. 186-199.
29. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Бибишев В.А. Дифференциальная стабильность мРНК in vitro как показатель физиологического состояния растений. Материалы 2-го симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, с. 88.
Plotnikov V.K., Bakaldina N.B., Bibishev V.A. In vitro messenger RNA differential stability as show of plant physiological state. Second symposium "Trends in plant biotechnology", Pushchino, Russia, 1993, p. 326.
30. Plotnikov V.k., Bakaldina N.B., Bibishev V.A. Decay of mRNA by affinity chromatography as reflect of plant physiology state. 16th International Congress of Biochemistiy and Molecular Biology, New Delhi, India, 1994, p.115.
31. Плотников В .К., Бакадцина Н.Б., Алексеенко Ж.В., Бибишев В.А., Новиков Б.Н., Ненько Н.И. Некоторые аспекты молекулярного действия препарата фуролан и янтарной кислоты на рост яровой пшеницы- Материалы 3-ей международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 1995, с. 101-102.
32. Новиков Б.Н., Плутахин Г.А., Бибишев В.А., Бакалдина Б.Н., Плотников В.К. Влияние панкреатической рибонуклеазы на экспрессию генов проростков озимого ячменя и пшеницы. Материалы 3-ей международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 1995, с. 214-215.
33. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Бибишев В.А., Алексеенко Ж.В. Дифференциальная стабильность мРНК как молекулярно-генетический маркер интенсивности роста пшеницы. Сб. науч. тр. КНЙИСХ к 95-летию академика ВАСХНИЛ П.П. Лукьяненко, 1996, с.253-260.
34. Plotnikov V.K., Bakaldina N.B. Differential stability of zein mRNA in developing corn kernel. Plant Molecular Biology,1996, v.31, p.507-515.
35. Плотиков B.K., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В.Дифференциальная стабильность мРНК in vitro: новый класс молеку-лярно-генетических маркеров сельскохозяйственных растений. Материалы научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 1996, с.65.
36. Плотников В.К. Молекулярная биология - основа новых методов биотехнологии растений. В кн.: Пути совершенствования систем земледелия Краснодарского края, Краснодар, 1996, с.137-139.
37. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б. Постгранскрипционная регуляция экспрессии генов: изучение дифференциального распада мРНК растений in vivo и in vitro. Генетика, 1997, N 3, с.343-349.
38.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Бибишев В.А. Российский патент N 2084133 на изобретение "Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур" от 20 июля 1997.
39.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В., Бибишев В.А., Полежаев С.Л., Рядчиков В.Г. Дифференциальная стабильность мРНК эукариот в ommp системе: основа новых методов биотехнологии. Материалы 2 съезда биохимического общества РАН, 1997, ч.2, с.525.
40. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. Постгранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: ряды индексов стабильности специфических мРНК in vivo и in vitro. Генетика, 1998, N 3 (4), (в печати).
Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Плотников, Владимир Константинович, Краснодар
КРАСНОДАРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА им. П.П.ЛУКБЯНЕНКО
л На правах рукописи
Г^У
ПЛОТНИКОВ Владимир Константинович
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ СТАБИЛЬНОСТИ мРНК В СВЯЗИ С РЕГУЛЯЦИЕЙ СИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКАХ ЗЛАКОВ И ИХ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СТРЕССАМ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИИ
Специальность: 06.01.05. - селекция и семеноводство
■ ' С с? V /")/..„
ДИССЕРТАЦИЙ [ ^ Ч г- ^ Д, ^
в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
.... .. ;)и,ОЛ
Краснодар -1997
М: 99-3 /
/
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Э.Р. Авакян
доктор сельскохозяйственных наук Ф.А. Колесников
доктор биологических наук, профессорТ.П. Михайлова
Ведущее учреждение
Кубанский Государственный Университет
- о/
Защита диссертации состоится "-¿-^ " \991 года в ДО часов на
заседании диссертационного совета Д020.66.01'ВНИИ риса по адресу. 350083, Краснодар, п/о Белозерное
С диссертацией можно ознакомиться .¿российского научно-
исследовательского института риса
Диссертация в виде научного доклада р^ __ ¿др 1997г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук """ Е.М. Сорочинская
м,
••» г у 1 _ О О
ээ
1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы. Синтез белка - основной процесс, обеспечивающий реализацию генетической информации в морфологические и физиологические особенности организмов. Относительно большой объем клеток эукариот и появление у них ядра, в котором осуществляется транскрипция генов, снижают оперативность регуляции синтеза белка этих организмов на уровне транскрипции. Постгранскрипционный уровень регуляции синтеза белка является более оперативным и реализуется через целый ряд молекулярных механизмов: процессинг ядерной РЖ, транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, выбор мРНК для трансляции, регуляцию скоростей инициации, элонгации и терминации синтеза белка и другие механизмы.
В последние десятилетия стало очевидным, что наиболее лабильным звеном постгранскрипционной регуляции синтеза белка является модуляция стабильности цитоплазматических мРНК. Индивидуальные мРНК значительно различаются по периоду полураспада, который варьирует в клетках эукариот от минут до недель. В настоящее время интенсивно изучаются факторы, определяющие стабильность мРНК, к которым в первую очередь относится структура самих мРНК и активность РНКаз. Методы генной инженерии позволили эффективно показать участие тех или иных структур в определении времени жизни молекул мРНК [28]. Эти исследования необходимы для понимания глубинных механизмов регуляции экспрессии генов в ходе онтогенеза, при стрессовых условиях среды, а также для оптимизации экспрессии трансгенов. Однако послранскрипционная регуляция синтеза белка у растений на уровне дифференциальной стабильности мРНК изучена крайне слабо.
Созревающее зерно кукурузы представляет собой хорошую модель для изучения тканеспецифической регуляции синтеза белка, поскольку здесь синтезируется в большом количестве ограниченный набор запасных белков - зеи-нов, биохимия и генетика которых хорошо изучены. Этому в значительной степени способствуют широкомасштабные исследования биохимического и ;кулярно-биологического действия мутации гена opaque-2, определяющей оиальное перераспределение синтеза белковых фракций в зерне кукурузы, даментальные исследования, конечной целью которых является создание "ысоколизиновой кукурузы, уже к концу 80-ых годов привели к тому, что были клонированы и секвенированы как структурные гены зеинов, так и регуля-
Ь -."Горный ген орадие-2, осуществляющий транскрипционную регуляцию синтеза
^ тшв.__________
~ Научный консультант по диссертации - д.с.-х.н., профессор, почетный доктор университета Феррары, заслуженный деятель науки Кубани, академик Алешин Николай Евгеньевич.
Одновременно накапливались факты, свидетельствующие о том, что большое значение в регуляции синтеза этих белков играет посттранскршщи-онный уровень. Но оставались не ясными конкретные механизмы посттранскрипционной регуляции (Shmidt, 1993).
Значение исследований этих механизмов выходит за рамки регуляции синтеза только запасных белков, так как многие молекулярные процессы, связанные с формированием хозяйственно-ценных признаков растений, таких как стрессоустойчивость и фотопериодизм, регулируются на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях.
1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью исследования было изучение роли дифференциальной стабильности мРНК в постхранскрипцион-ной регуляции синтеза белка у растений и создание на основе этого новых методов, повышающих эффективность селекционного процесса. В задачи исследования входило изучить:
- закономерности формирования белкового комплекса созревающего зерна кукурузы при разных уровнях активности РНКаз в тканях и в условиях блокады транскрипции актиномицином Д.
- трансляционную активность полирибосом in vitro созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя в оптимальных и стрессовых условиях роста растений.
- стабильность мРНК зеинов 19 кД и 22 кД при блокаде транскрипции генома созревающего зерна кукурузы актиномицином Д (in vivo) и в бесклеточной системе синтеза белка.
- влияние мутации гена opaque-2 на стабильность мРНК созревающего зерна кукурузы.
- влияние условий окружающей среды на стабильность мРНК проростков пшеницы и ячменя.
- создать на основе экспериментальных и литературных данных гипотетическую модель молекулярного механизма действия мутации гена opaque-2 по изменению белкового и аминокислотного состава зерна кукурузы. Экспериментально показать сходство молекулярных механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в растительной клетке.
- создать новый охраноспособный метод оценки исходного материала пшеницы и ячменя по ряду генетико-физиологических признаков на основании сортоспецифических особенностей функционирования компонентов бе-локсинтезирующего аппарата растений.
1.3. Научная новизна работы. Роспатент выдал патент на изобретение [38]:"Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур". В основе способа лежат оригинальные исследования реакции компонентов бе-
локсинтезирукяцей системы растений на различные эндогенные и экзогенные факторы.
Впервые проведено комплексное исследование феномена дифференциальной стабильности мРБК и его роли в регуляции синтеза белка в клетках злаковых растений. В работе впервые доказана дифференциальная стабильность мРНК запасных белков зерна кукурузы - зеинов 19 кД и 22 кД. Установлено, что мутация гена opaque-2 изменяет стабильность мРНК зерна кукурузы. Впервые экспериментально доказано, что основным фактором, формирующим как высоколизиновый, так и адаптационный синдромы в созревающем зерне кукурузы, является высокая лабильность мРНК зеинов.
Впервые обнаружено, что в ходе двуциклической аффинной хроматографии РНК созревающего зерна кукурузы, проростков пшеницы и ячменя на поли(У)-сефарозе, а также при инкубации водных препаратов суммарной РНК (in vitro) происходит дифференциальный распад мРНК по тем же закономерностям, что и в живой клетке (in vivo). Показано, что распад мРНК детерминирован структурой мРНК, белками, ассоциированными с мРНК, и не зависит от основного клеточного метаболизма, но определяется генотипом и условиями роста растения.
При исследовании трансляционной активности белоксинтезирующего аппарата растений in vitro впервые обнаружено, что под влиянием стрессовых условий среды (обезвоживание, засоление, низкие положительные температуры) происходит неспецифический прирост трансляционной активности полисом проростков пшеницы и ячменя. Это явление имеет генотипический характер. Блокада транскрипции актиномицином Д генома кукурузы предотвращает в зерне распад полирибосом и мРНК под действием теплового шока, что доказывает активное участие генома в ответе на тепловой шок.
Полученные в работе данные вносят существенный вклад в изучение молекулярных процессов формирования зерна и адаптации растений к неблагоприятным факторам среды, расширяют и углубляют теоретические основы селекции.
1.4.Практическая ценность работы. Предложен молекулярный метод оценки физиологического состояния зерновых культур, защищенный патентом [38]. Предложен новый метод оценки стабильности мРНК, полностью независимый от основного клеточного метаболизма и уменьшающий объем экспериментальных работ. Это метод открывает новый класс молекулярных маркеров хозяйственно-ценных признаков злаковых растений. Обнаруженная сортоспецифичность реакции белоксинтезирующего аппарата на изменение внешних условий создает принципиально новую основу для разработки методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодизма зерновых культур для це-
лей селекции. Предложен метод стабилизации мРНК in vitro (обработка цели-том).
Материалы работы используются в курсах лекций и в качестве задачи большого практикума по молекулярной биологии на биологических факультетах Кубанского государственного университета и Кубанского государственного аграрного университета.
1.5.Основные положения, вынесенные на защиту. Дифференциальная стабильность мРНК является важнейшим звеном посттранскрипционной регуляции экспрессии генов злаковых растений. Стабильность мРНК определяется кодирующим его геном и условиями роста растений.
Регуляция синтеза запасных белков - зеинов осуществляется в значительной степени на уровне стабильности мРНК, что является основным компонентом сходства молекулярно-биологических механизмов формирования высоколизинового и адаптационного синдромов в созревающем зерне кукурузы.
На примере созревающих зерновок кукурузы и проростков пшеницы и ячменя показано, что изменение условий произрастания растений (температуры, освещения) приводят к генотипическому ответу на уровне стабильности мРНК in vitro. Распад мРНК при инкубации водных препаратов РНК происходит аналогично распаду в живой клетке.
Установлена взаимосвязь между степенью полиаденилирования мРНК, ее вторичной структурой и стабильностью. Обработка высокоочищенных препаратов суммарной РНК целитом, специфически связывающим белки, приводит к остановке деаденилирования и стабилизации мРНК, что свидетельствует о наличии ассоциированных с мРНК РНКаз белковой природы, устойчивых к действию традиционных депротеинизирующих агентов.
Явление дифференциальной стабильности мРНК in vitro открывает принципиально новые возможности для оценки селекционного материала по ряду хозяйственно ценных свойств.
1.б.Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждены на четвертой конференции "Физиологические основы повышения продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алма-Ата,1980), на 3 Всесоюзной научно-технической конференции по проблемам кукурузы (Днепропетровск, 1981), на Всесоюзном совещании "Производство и использование растительного белка" (Краснодар, 1981), на 6 и 7 Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987, 1990), на 5 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), на Всесоюзной конференции по биотехнологии зерновых культур (Алма-Ата, 1988), на Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 1990), на 2 съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990),
на Международном симпозиуме "Проблемы синтеза и практического применения олигонуклеотвдов" ( Москва, 1991 ), на 1, 2 и 3 симпозиумах "Новые направления биотехнологии растений" (Пущино, 1991, 1993, 1995), на 1 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), на 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Быо-Дели, Индия, 1994), на 3 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на 2 съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997).
2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Условия проведения исследований. Автор проводил свои исследования в Краснодарском научно-исследовательском институте им. П.П. Лукья-ненко.
2.2. Материалы исследований. Исследования проводили на созревающем зерне кукурузы (Zea mays L.) линии Висконсин 64 А обычной (W64A+/+) и ее высоколизиновом спонтанном мутанте opaque-2 (W64A02/02), а также на зеленых и этиолированных проростках озимых и яровых сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) и ячменя (Hordeum vulgare L.) селекции КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко:
2.2.1.Растения кукурузы выращивали в поле или в фитотроне. Радиоактивно меченные нуклеотиды или аминокислоты, а также ингибиторы транскрипции или трансляции вводили в ножку и основание початка. В определенные сроки после ручного самоопыления початки снимали с растения, зерно фиксировали жидким азотом.
2.2.2. Семена пшеницы и ячменя проращивали на фильтровальной бумаге при 20°С. Через трое суток для части проростков включали освещение. Еще через сутки зеленые и этиолированные проростки срезали и немедленно замораживали в жидком азоте. Эксперименты по влиянию стрессов проводили только на зеленых проростках, в экспериментах по ингибированию синтеза РНК или белка раствор ингибиторов вносили под корни проростков.
2.3.Методы исследования. Экстракцию белковых фракций, изоэлек-трическое фокусирование белков в ПААГ, определение количества белка и изучение аминокислотного состава на автоматическом аминокислотном анализаторе KLA-3B фирмы Hitachi (Япония) проводили по (Рядчиков В.Г. "Улучшение зерновых белков и их оценка", М. Колос, 1978);
Определение активности РНКаз проводили по (Татарская Р.И. и др. ДАН СССР, 1964, т. 157, N 3) с использованием коммерческого препарата дрожжевой РНК;
Выделение свободных и мембраносвязанных полирибосом ультрацентрифугированием и Mg"14" - преципитацией, выделение РНК и очистку по-ли(А)-содержащей мРНК аффинной хроматографией на поли(У)-сефарозе, соотношение молекул с длинными и короткими поли(А)-последовательностями (А)п65°/(А)п35° термальной ступенчатой элюцией по-ли(А)+мРНК с колонки поли(У)-сефарозы при температурах 35° и 65°, синтез белка в бесклеточной системе из зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика, электронную микроскопию по (под редакцией Б.Хеймса, С.Хиггинса "Транскрипция и трансляция", М.: Мир, 1987; под редакцией Дж. Дрейпера и др. "Генная инженерия растений», М.: Мир, 1991);
В работе использовали синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, комплиментарные участку специфической мРНК: зеина 22 кД и зеина 19 кД (Marks е.а.,1985), мРНК waxy (УДФ-глюкозилтрансфераза, Wessler, Marquerite,1985), белка opaque-2 (о2-белок, Hartings е.а.,1989), мРНК фактора элонгации трансляции la (eEF-la, Pokalsky e.a., 1989); мРНК ß-кеторедукгазы и эноилредуктазы ( Slabas, Evans, 1990), а также мРНК актина (Slabas, Evans, 1990). Зонды метили концевым включением радиоактивной метки [у33Р] АТФ с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4; гибридизацию радиоактивно меченых зондов с мРНК проводили по (Т. Маниатис и др. "Методы генетической инженерии", М.: Мир,1984); для количественной оценки содержания мРНК использовали прямое измерение радиоактивности связавшегося с мРНК зонда на сцинтилляциошюм счетчике радиоактивности Rack Beta Spectral 1219, LKB,(Швеция-Финляндия);
Использованы модификации методов исследования, разработанные автором [1,3,7,8,31,34,37]. Обработка РНК целитом: в водный раствор суммарной РНК (1 мг/мл), выделенной из тканей растений в присутствии ионов Mg4-1", добавляли прокаленный целит в соотношении 1 г целита на 4 мг РНК. Часть образцов прогревали в присутствии целита и охлаждали до комнатной температуры. Все образцы перемешивали с целитом в течение 5 минут при комнатной температуре, раствор декантировали с целита [34,37].
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Биосинтез белка в созревающем зерне обычной и opaque-2 кукурузы. Вторая половина семидесятых годов нашего столетия была ознаменована тем, что в это время произошел значительный прогресс в знаниях о синтезе запасных белков в семенах, обусловленный установлением места локализации синтеза этих белков, которым являются мембраносвязанные полирибосомы зерна злаков и семядолей бобовых растений. Это стало возможным благодаря применению комплекса методов современной молекулярной биологии: диф-
ференциального ультрацентрифугирования, бесклеточного синтеза белка, электронной микроскопии, ингибиторного анализа и др. Аналогичные работы были проведены автором на созревающем зерне кукурузы [1-17].
3.1.1. Биосинтез белков в онтогенезе. Активность РНКаз возрастает в процессе созревания эндосперма злаков, в том числе кукурузы; мутация гена opaque-2 значительно увеличивает активность РНКаз на всем протяжении развития эндосперма кукурузы (Dalby, Davies, 1967; Wilson, Alexander, 1967) [6,8,10-17]. Исследования закономерностей синтеза белка и нуклеиновых кислот привели к предположению, что изменение в
-
Плотников, Владимир Константинович
-
доктора биологических наук
-
Краснодар, 1997
-
ВАК 06.01.05
- Дифференциальный распад мРНК злаков in vitro как молекулярно-кинетический маркер эффекта взаимодействия генотип-среда
- РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
- Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур
- Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур
- Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов отбора в селекционном процессе
