Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур

Бибишев, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур"

На правах рукописи

Бибишев Владимир Александрович

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ

КУЛЬТУР

Специальность 06.01. 05 - Селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

оозшоиь»

Краснодар - 2007

003160869

Работа выполнена в Краснодарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства им П П Лукьяненко в период с 1986 по 2007 год

Научный руководитель доктор биологических наук

Давоян Румик Оганесович

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Туманян Наталья Георгиевна

кандидат биологических наук Мирошниченко Марина Валерьевна

Ведущая организация Кубанский государственный аграрный университет

Защита состоится 16 октября 2007 в 10 часов на заседани диссертационного совета при Всероссийском научно-исследовательско институте риса по адресу 350921 г Краснодар, п/о Белозерное

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан 12 09 2007

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Гончарова Ю К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одной из главных причин снижения урожаев зерновых культур является влияние неблагоприятных погодных условий в период вегетации растений Стрессоустойчивость, или способность растений адаптироваться к неблагоприятным воздействиям, представляет собой сложный комплекс функционально связанных биохимических, физиологических и морфологических признаков, определяющих устойчивость, соответственно, на молекулярном, клеточном, организменном и ценотическом уровнях [Удовенко, Гончарова, 1982, Федулов, 1994] Селекционеры в своей работе по созданию стрессоустойчивых сортов вынуждены ориентироваться, как правило, только на конечный результат множества адаптивных реакций, используя в качестве критерия оценки генотипов количество выживших при стрессе растений и степень повреждения клеток и тканей [Пучков, Набоков, 2001] При этом вне их поля зрения остается генетически детерминированный вклад отдельных процессов и механизмов в формирование адаптивного ответа, что не позволяет выявить этапы, лимитирующие стрессоустойчивость конкретного генотипа

Известно, что более устойчивые формы часто обладают пониженной продуктивностью Найдена обратная зависимость между степенью устойчивости организма и интенсивностью обмена веществ, что объясняется уходом растений в вынужденный покой (наиболее распространенный механизм, обеспечивающий неспецифическую устойчивость) [Удовенко, Гончарова, 1982] Для Краснодарского края в зимний период характерны резкие колебания температуры, частые оттепели, вызывающие уменьшения глубины вынужденного покоя и, соответственно, снижение неспецифической устойчивости озимых культур, а в весенний период нередки заморозки в первой половине и засуха во второй В таких условиях необходимы сорта, обладающие повышенной способностью адаптироваться к резким изменениям погодных условий - так называемой "функциональной устойчивостью" [Нечипорович, 1988]

Для эффективного отбора генотипов с повышенной "функциональной устойчивостью" нужно оценивать, по крайней мере, две основных составляющих - скорость формирования адаптивного ответа растений при воздействии стрессового фактора (временная составляющая) и способность перестраивать клеточные процессы и морфологию адекватно изменившимся условиям (качественная составляющая) Нами были разработаны методические подходы, позволяющие дифференцировать эти составляющие и рассматривать их как два самостоятельных признака В основу методов была положена оценка некоторых аспектов процесса изменения интенсивности белкового синтеза и функционального состояния и стабильности мРНК растений при стрессовом воздействии

Пель и задачи исследования Целью работы являлось изучение молекулярных механизмов, принимающих участие в формировании адаптивного ответа у сортов озимой пшеницы и ячменя, поиск молекулярных маркеров и создание на их основе методов, позволяющих диагностировать физиологическое состояние и определять степень устойчивости растений к различным стрессам В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи

- изучить влияние различных абиотических стрессов на изменение трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом из проростков озимой пшеницы и ячменя,

- выявить зависимость между рангом стрессоустойчивости сорта и изменением трансляционной активности т vitro препаратов полирибосом,

- исследовать вопрос о роли поли(А) последовательностей мРНК в определении стабильности и функциональной активности информационных молекул,

- показать взаимосвязь стабильности мРНК с физиологическим состоянием растений,

- разработать диагностический метод оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур

Научная новизна. В настоящей работе впервые

- обнаружен эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полисом

Установлено, что эффект обусловлен изменением доли полисом в препаратах мРНП растений Предполагается, что эффект отражает реакцию замедления интенсивности белкового синтеза, универсальную для начальной стадии воздействия различных видов абиотических стрессов,

- выявлен эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro Показано, что эффект связан с наличием ассоциированной с поли(А) мРНК РНКазы, очевидно, входящей в состав регуляторного нуклеопротеидного комплекса локализованного в 3' некодируимцей зоне макромолекулы (3 РНПК),

- установлено, что дифференциальный распад мРНК количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов,

- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии на поли(У)-сефарозе препаратов РНК, позволяющий специфически фракционировать пул цитоплазматических поли(А) мРНК, количественно разделять поли(А) мРНК свободных (неактивных) и полисомных мРНП, выявлять популяции мРНК в составе фракций, изучать, присутствующую в клетках апикальной меристемы листа, группу поли(А) мРНК не сорбирующихся на поли(У)-сефарозе без предварительной специфической инкубации,

- предложена модель механизма "оперативного" изменения функционального состояния и стабильности мРНК при стрессе

Научно — практическая ценность работы.

- разработан метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов озимого ячменя и озимой пшеницы, пригодный для массового «фининга,

- создан метод диагностики физиологического состояния сельскохозяйственных растений на основе выхода поли(А)мРНК во втором цикле хроматографии на поли(У)-сефарозе,

- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии РНК, перспективный для создания на его основе новых способов оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур,

- созданы предпосылки для разработки технологии комплексной оценки стрессоустойчивости сортов озимого ячменя и озимой пшеницы

Основные положения, выносимые на защиту

- изменение трансляционной активности полисом является универсальной адаптивной реакцией растений, характерной для начального периода многих видов абиотических стрессов,

- наличие ассоциированных с мРНК регуляторных нуклеопротеидных комплексов (3 РНПК), влияющих на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, специфически отражается на характере фракционирования информационных молекул в процессе аффинной хроматографии,

- регуляторные нуклеопротеидные комплексы определяют "запрограммированность" пула цитоплазматических мРНП растений на обеспечение перехода клетки в различные стационарные режимы функционирования,

- диагностические методы, созданные на основе предложенных молекулярно-биологических маркеров, могут значительно облегчить селекционерам работу по подбору родительских пар и, в дальнейшем, выявлению нужных генотипов

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" Москва, 1990, II симпозиуме "Новые направления биотехнологии растений", Пущино, 1993, 16th International Congress of Biochemistry and Mol Biology, New Delhi, India 1994, 3 международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1995, II съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997, региональной конференции "Перспективы внедрения современных биотехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства", Ставрополь, 2003

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 153 страницах, содержит 13 таблиц и 27 рисунков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на четырехсуточных проростках озимой пшеницы (Triticum aestmtm L) и озимого ячменя (Hordeum vulgare L) сортов селекции КНИИСХ им П П Лукьяненко, а также на созревающем зерне кукурузы (Zea mays L) линии Wisconsin 64А Сорта были ранжированы по стрессоустойчивости на основе оценок общепринятыми полевыми и лабораторными методами Семена пшеницы и ячменя проращивались при 20°С между двумя слоями влажной фильтровальной бумаги Кукурузу выращивали в полевых условиях Початки срезали на 20-й день после искусственного опыления

Четырехсуточные проростки озимого ячменя и озимой пшеницы подвергали действию температурного (2°, 4°С или 42°С на свету), водного (12% ПЭГ-8000) и солевого (2% NaCl) стрессов В разные интервалы времени проростки срезали Образцы хранили в жидком азоте

Выделение полирибосом проводили методом Дэвиса с соавт [Davies et al, 1972], используя экстрагирующий стандартный буфер Лароча [Larosche & Horkins, 1987] Трансляцию полисом и РНК in vitro проводили в лизате из ретикулоцитов кролика [Хеймс и Хиггенс, 1987]

Визуализировали зоны интенсивного деления клеток проростков методом Фельгена [Паушева, 1974] Растительный материал, в котором преобладают меристематические клетки, получали из апикальной зоны листьев проростков Срезали кончик листа размером менее Змм

РНК метили [3Н]-уридином с УА 30 Ки/ммоль ("Изотоп", Россия) Срезанные проростки выдерживали в растворе 15 мКи/мл в течение 60 минут Кинетин и АБК вносили под корни проростков в концентрациях 5x1 О^М и 5х10"7М, соответственно

Выделение суммарной РНК проводили в присутствии ионов Mg4"1" РНК экстрагировали буфером, содержащим 200 шМ Трис-HCl рН 8,0, 30 mM MgCl2, 250 тМ сахарозы, в соотношении 1 5 (г/мл) После осветления в раствор добавляли DDS-Na до 1% Депротеинизацию РНК осуществляли смесью фенол/хлороформ (1 1) и осаждением с помощью LiCl с мочевиной в конечной концентрации 4М каждой Осадки растворяли в буфере, содержащем 20шМ Трис-HCl рН 7,6 Суммарную РНК для хроматографии использовали сразу после выделения либо хранили в присутствии 70% этанола при -20°С или в сухом виде Растворы РНК не замораживали, т к это изменяет профиль фракционирования

Нуклеопротеид-целитную хроматографию проводили методом [Лихтенштейн и др, 1976] Элюцию РНК с колонки осуществляли последовательно растворами - 1М LiCl, 2М мочевины при 20°С (I фракция) и 2М LiCl, 4М мочевины при 65°С (II фракция)

Изменения профиля фракционирования индуцировали либо предварительным прогревом растворов РНК 65°С 10 мин, либо их инкубацией 100 часов при 20°С, либо смещением рН растворов в щелочную сторону Сдвиг рН в инкубационном растворе достигался как добавлением NH4OH до 40тМ с последующей нейтрализацией эквимолярным количеством НС1, так и добавлением буфера, содержащего Трис-HCl рН 8,6 и 9,6 до 40тМ, с последующим снижением рН раствора до 7,6, внесением соответствующей концентрации буфера - Трис-НС1 рН 6,8 В стандартных экспериментах время инкубации не превышало 60 минут при 20 С

Аффинную хроматографию на поли(У)-сефарозе осуществляли по методике, описанной [Осгерман, 1985] Аффинно-адсорбционная хроматография является модификацией метода аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе На колонку с поли(У)-сефарозой, уравновешенную буфером, содержащим 0,05М трис-HCl рН 7,6, 0,5М LiCl, 0,4mM Na-ЭДТА, 0,02% DDS-Na, в том же буфере наносилась суммарная РНК в концентрации 0,2 мг/мл, со скоростью 30 мл/час Нанесение препарата на колонку повторяли дважды Таким же буфером промывали колонку до нулевой оптической плотности Фракции поли(А) мРНК элюировались последовательно пятикратными по отношению к объему колонки растворами фракция 1 -0,01М трис-HCl рН 7,6, 0,1M LiCl, 0,08mM Na-ЭДТА, 0,004% DDS-Na при 20°С, фракция 2 -бидистиллированной водой при 65°С, фракция 3 - 0,05М трис-HCl рН 7,6, 0,1% DDS-Na при 65°С Количество поли(А) мРНК во фракциях определяли спектрофотометрически из расчета 10Е2бо=40мкг/мл Поли(У)-сефарозу использовали многократно По неустановленным

причинам аффинно-адсорбционное фракционирование на новой поли(У)-сефарозе затруднено Воспроизводимые результаты получали только после длительного (8-10 часов) промывания колонки буфером, содержащим 0,05М трис-HCl рН 7,6, 0,5% DDS-Na при 65°С или после трех - пяти циклов хроматографии Емкость колонки не меньше, чем в два раза превышала количество наносимых поли(А) мРНК из расчета их 5% содержания в препаратах суммарной РЖ Периодически проверяли емкость колонки нанесением избыточного количества синтетической поли(А) Использовали свободно-проточные колонки, скорость жидкости в которых (ЗОмл/час) подбирали соотношением диаметра выходного канала и плотностью фильтра Колонки были объединены в кассету с общей термостатируемой рубашкой Хроматографию на МАК осуществляли по методике, описанной [Mandell & Hershey, 1960]

Эксперименты проводили не менее, чем в четырех биологических повторностях В таблицах и на рисунках представлены характерные опыты в серии Данные в таблицах являются средними значениями 3-6 аналитических повторов Статистическую оценку достоверности полученных данных проводили с использованием критерия Стыодента Представленные результаты имели достоверные различия с уровнем значимости 0,5

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка молекулярно-кинетического маркера оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур при стрессовом воздействии

При воздействии различных стрессовых факторов растение отвечает комплексом реакций, направленных на поддержание гомеостаза и переживания неблагоприятного периода Очевидно, что высокая скорость формирования растением адаптивного ответа на стрессовое воздействие позволяет минимизировать негативные последствия При стрессе наряду со специфическими реакциями в растительной клетке развивается комплекс однотипных, не зависящих от конкретного вида воздействия, процессов, получивший название "неспецифический адаптивный синдром" [Браун, Моженок, 1987, Пахомова, 1995]

Вероятно, на основе любой реакции этого комплекса можно разработать молекулярно-кинетический маркер, позволяющий оценить такой признак, как скорость формирования адаптивного ответа Но нам представлялось целесообразным сосредоточить свое внимание на процессе изменения интенсивности белкового синтеза в условиях стресса на том основании, что этот процесс является центральным в клетке и адаптивные изменения на уровне трансляции предшествуют и обусловливают изменения биохимических и физиологических процессов, т е являются "первичными" по отношению к ним Особый интерес в этом плане представляла работа с препаратами полирибосом Предполагалось, что трансляция in vitro препаратов полирибосом из подвергнутых стрессу проростков позволит в какой-то мере охарактеризовать изменения функционального состояния белоксинтезирующего аппарата клеток стрессированных растений

Эффект стрессиндуиированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП) Нами было показано, что под воздействием пониженной температуры (рис 1 а), солевого (рис 1 б) и водного (рис 1 в) стрессов, а также при тепловом шоке (рис 1 г , д ) in vivo с полирибосомами происходят определенные изменения, проявляющиеся in vitro в изменении их трансляционной активности (ТАП) Во всех случаях увеличение ТАП т vitro наблюдалось на начальном этапе стрессового воздействия с последующим ее снижением Можно предположить, что исследуемая реакция, кинетическим маркером которой служит изменение ТАП, имеет универсальный для любого неблагоприятного абиотического воздействия характер, являясь составляющей процесса адаптации

Обнаруженный эффект оказался сортоспецифичным У контрастных по стрессоустойчивости сортов озимой пшеницы Краснодарская 39 и Безостая 1 скорость реакции коррелировала с рангом устойчивости (рис 1 г ,д), что проявлялось в разном времени, необходимом для достижения максимума ТАП in vitro

Тепловой шок является одним из наиболее "жестких" абиотических стрессов Через 15 минут после начала стрессового воздействия сортом Краснодарская 39 максимум ТАП был уже пройден, а Безостая 1 достигает его только через 45 минут

70 70

60 60

50 50

15 Краснодарская 39 40 Краснодарская 39 40 Безостая 1

¡5 11 (озимыйячмень) ® (озимаяпшеница) 40 Краснодарская33 30 (озимаяпшеница) 30 (озимаяпшеница)

® 0 а 4 6 8 10 0 12 1 4 Г> о 12 3 4 5 6 "5 5 30 « (0 ~0 И М 45 ¡Г | (часы) (чае») (часы) (минуты) (минуты)

с Гипотермический Солевой стресс Водный стресс Гипертермичесюай Гипертермический

3 ^е00 С2°с) (2% ИаСП (12% ПЗГ 8000) стресс (42 С) стресс (42 С)

Рис 1 - Динамика изменения трансляционной активности т vitro полисом из четырехсуточных проростков озимой пшеницы и озимого ячменя, подвергнутых гипотермическому (а), солевому (б), водному (в) стрессам и тепловому шоку или -гипертермическому стрессу (г , д) - контроль,-----стресс

В таблице1 приведены данные об изменении ТАП in vitro из проростков, ранжированных по устойчивости сортов озимой пшеницы в ответ на температурный, солевой и водный стрессы

Таблица 1 - Изменение трансляционной активности т \itro (стресс/коктролъ 100%) препаратов полисом ж проростков озимой пшеницы (сорта ранжированы по холодоустойчивости), индуцированное воздействием различных стрессовых факторов

Сорта 2°С 5часов 4°С 5часов NaCl (2%) 60 минут ПЭГ-8000 (12%) 60 минут ПЭГ-8000 (12%) 180 минут Ранг устойчивости

Краснодарская 39 206+11 189+7 2 158+12,2 189+8,1 54±7 1

Краснодарская 57 144±5,2 146+5,7 — 155+бД 74±5,4 2

Олимпия 2 127±5,8 131±6 4 150+6,3 117±9,0 88±6.1 3

Безостая 1 — 13412,? 120+5,4 72 ±10,6 21б±19,8 4

Колос 75 ±6,8 128+3,4 57±9Д — — 5

На начальном этапе водного стресса (12% ПЭГ-8000, 60 минут) количественное увеличение ТАП прямо коррелировало с рангом устойчивости сортов, а на более позднем этапе (180 минут) корреляция была обратной (табл 1)

Для объяснения таких закономерностей была предложена схема развития реакции у различающихся по стрессоустойчивости гипотетических сортов зерновых культур (рис 2) Эта схема позволяет показать как возможность создания диагностического метода на базе данного молекулярно-кинетического маркера, так и сложности, связанные с необходимостью точной калибровки этого метода

Рис.2-Схема описывающая динамику изменения трансляционной активности полисом из ранжированных п стрессоустойчивости сортов зерновых культур, в процессе стрессового воздействия

С 1 по 5-обозначение ранга стрессоустойчивости.

1 , 2, 4.——-*-, "»гипотетическиесорта

Уменьшение концентраций ПЭГ-8000 и NaCl в десять и в сто раз от применяемых для моделирования водного и солевого стрессов [Киль, Бибишев, Плотников, 1991] позволило установить, что скорость изучаемой реакции коррелирует с напряженностью неблагоприятного воздействия и что стрессоустойчивый сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 реагирует на более слабое воздействие, чем Безостая1 (рис 3)

Краснодарская 39 Безостая 1

1,2» ПЭГ-8000 Js

3 часа Б часов 0,2« NaCl £s

■ч.

-i-¡—

_I_'

3 часа В часов 3 часа 6 часов 3 часа 6 часов 3 часа 6 часов

Контроль,-----Стресс Продолжительность эксперимента (часов)

Рис 3 - Динамика изменения трансляционной активности т vitro - полисом из проростков озимой пшеницы, контрастных по стрессоустойчивости сортов Краснодарская 39 и Безостая 1, подвергнутых воздействию в 100 и в 10 раз меньших концентраций ПЭГ-8000 и NaCl, от используемых для моделирования водного и солевого стрессов (12% ПЭГ-8000 и 2% NaCl)

Такие выводы можно сделать на основании того, что трансляционная активность in vitro препаратов полирибосом из проростков сорта Безостая 1, инкубированных три часа в присутствии 0,12% ПЭГ-8000 и 0,02% NaCl (рис 3), не отличалась от контроля, и ее увеличение регистрировалось только при трансляции препаратов из проростков, инкубированных в этих условиях в течение шести часов

Динамика изменения ТАП менялась в случае увеличения в инкубационном растворе концентрации ПЭГ-8000 до 1,2% и NaCl до 0,2% Максимум ТАП т vitro при этом был достигнут в препаратах из проростков сорта Безостая 1, инкубировавшихся три часа, и далее происходило ее снижение В случае сорта Краснодарская 39 максимум трансляционной активности достигался в препаратах полирибосом из проростков, инкубировавшихся при минимальной концентрации ПЭГ-8000 и NaCl всего три часа

Продолжительность эксперимента (условные единицы)

I В

8 Л

300 0,12% ПЭГ-8000 270 s 240 "ч 210 180 150 120 ЭО

3 часа

6 часов

300 270 240 210 180 150 120 до

0,02% NaCl

1,2% ПЭГ-3000 300 0,12« ПЭГ-8000 270 240 210 180 150

120 -*-i-

3 часа 6 часов

3 часа

6 часов

0,2% NaCl

300 0,02% NaCl

270 240 210 180 150

120 !■---""-i-

При разделении препаратов полисом ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы (рис 4) выяснилось, что эффект увеличения ТАП от vitro обусловлен повышением в них доли тяжелых полисом и, соответственно, уменьшением количества моносом

Рис 4 - Распределение полисом из б проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39, подвергнутых воздействию теплового шока (ТШ(42°С)) во фракциях при ультрацентрифугировании в градиенте концентрации сахарозы М+С - моносомы и субъединицы рибосом

а Контроль (20°С) - значение ТАП принимается за 100%, б ТШ (42°С) 15 мин -133%, в ТШ (42°С) 45 мин -114%, г ТШ (42°С) 60 мин - 79% % Полисом - процент полисом от суммарного препарата (М+С+Полисомы)

< Полисоиы

. W«

Контроль (20 С)

ИП(42СН5штут

Ш(42С)15иауг

Ш (42 С) 60 минут

Объяснить это можно как усилением процесса трансляции от vivo в результате интенсивной инициации рибосом, так и, напротив, замедлением белкового синтеза Блокирование или замедление белкового синтеза, сопровождаемое увеличением доли тяжелых полисом за счет пула моносом, ранее наблюдалось в результате действия таких ингибиторов трансляции, как циклогексимид, а-амонитин и др [Yamamoto & Pellegrim, 1990] Молекулярный механизм ингибирования обусловлен затрудненной диссоциацией рибосом

Можно предположить, что описанный выше молекулярный механизм замедления трансляции имеет место и в качестве естественной, т е физиологической реакции клетки на стресс Очевидно, он мог бы позволить плавно и обратимо, в случае непродолжительного воздействия, замедлить процесс трансляции, что является обязательной стадией подготовки белоксинтезирующего аппарата клетки к функционированию в новых условиях

Нами был модифицирован хроматографический метод выделения и фракционирования полирибосом [Calzone et al, 1982] Это позволило создать метод оценки, присущей сорту, скорости формирования адаптивного ответа по изменению соотношения количества полисом/моносом в препаратах из контрольных и стрессированных растений

Таблица 2 - Оценка скорости формирования адаптивного ответа на воздействие пониженной температуры у линий озимого ячменя

Скорость формирования адаптивного ответа

высокая средняя низкая нестандартная

Бас-т он Скороход Вавилон 28

Радикал 23 Циклон 17

9 19 22 27

1 1 30 24 16

12 8 29 19

26 5 25 1

13 21 7

15 10 14

4 20 18

6 2

Цифрами обозначены порядковые номера линий озимого ячменя

Новым методом был осуществлен скрининг 30 линий озимого ячменя, полученных от селекционеров закрытым списком Анализ результатов (Табл 2) на 80% совпал с данными о стрессоустойчивости линий в целом, полученными селекционерами в полевых условиях

Разработка молекулярно-кипетических маркеров оценки стрессоустойчивости зерновых культур на основе механизма регулирующего изменение функционального состояния и

стабильности мРНК

На начальном этапе стрессового воздействия растения получают наибольшие повреждения Не вызывает сомнений, что те сорта зерновых культур, которые способны именно на этом этапе наиболее эффективным образом перестроить обмен веществ и структуру своих клеток соответственно создавшимся условиям, оказываются более жизнеспособными Известно, что при стрессе в клетках растений дифференциально меняются функциональное состояние и стабильность цитоплазматических мРНК [Gutierrez et ai, 1999] Это приводит к каскаду адаптивных преобразований к изменению в составе транслирующихся матриц, к соответствующему изменению в спектре синтезирующихся белков и, как следствие, к изменению биохимических, физиологических процессов и структуры клеток Очевидно, механизм, регулирующий изменение функционального состояния и стабильности цитоплазматических мРНК, играет ключевую роль в системе оперативной регуляции белкового синтеза Есть основание предполагать, что особенности функционирования этого механизма обусловливают различия в уровне стрессоустойчивости сортов зерновых культур и могут быть использованы в качестве критериев оценки данного признака

Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК т vitro Сложности, возникающие при работе с мРНК, связаны, как с низким ее содержанием в препаратах суммарной РНК, так и с тем, что мРНК в большей степени, чем другие молекулы, подвержены разрушению различными факторами Считается, в частности, что Mg'"', присутствующий в растворах суммарной РНК, способствует деградации РНК, катализируя реакцию разрушения, протекающую через образование 2,3- циклического фосфата [Баршевская и др, 1987] Многие исследователи избавляются от этого катиона еще на стадии экстракции РНК из биологического материала и последующих стадиях ее очистки

Выделение полиаденилированной мРНК из препаратов суммарной РНК, как правило, осуществляется методами аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе и олиго(дТ)-целлюлозе [Остерман, 1985] Этот процесс может затрудняться тем, что в результате потери Mg++, поддерживающего третичную структуру рибосомных частиц, цепи рРНК разворачиваются и приобретают способность неспецифически адсорбироваться на колонке с аффинным носителем Количество неспецифически сорбировавшихся молекул, многократно превышает количество поли(А) мРНК Чтобы уменьшить долю неспецифической адсорбции при хроматографии таких препаратов колонки перед элюцией поли(А) мРНК промывают пятикратно разбавленным буфером для нанесения и/или после элюции проводят еще один или несколько циклов хроматографии [Aviv & Leder, 1972, Попов и др , 1975]

sä-

Рис 5 - Схема двуцикличной аффинной хроматографии РЖ из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 на поли(У)-сефарозе А - проростки росли при 20°С, Б - при 4°С 5 часов 1 - поли(А) мРНК элюированная в первом цикле хроматографии бидистиллированной водой при 65°С, не сорбировавшаяся РНК при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу, 2 -РНК элюированная во втором цикле хроматографии

В своей работе мы осуществляли экстракцию суммарной РНК в присутствии ионов Mg++ буфером, применяемым при выделении полирибосом [ЬэтовсЬе & Ногкшв, 1987], после чего

препараты депротеинизировали смесью фенол/хлороформ В препаратах суммарной РЖ, выделенных таким образом, рибосомные РНК сохраняют "компактную" структуру препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе, что позволило упростить процесс хроматографической очистки и, более того, количественно оценивать содержание поли(А) мРНК, т е использовать метод аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе не только в препаративных, но и в аналитических целях Благодаря этому, при двуцикличной аффинной хроматографии препаратов суммарной РНК из проростков озимой пшеницы, удалось обнаружить эффект уменьшения выхода мРНК во втором цикле (рис 5) Эффект количественно коррелировал с изменением физиологического состояния растений (Табл 3) и рангом стрессоустойчивости сортов (Табл 4)

Таблица 3 - Влияние освещения на выкод во втором цикле хроматографии поли (А) ыРХГК (поли(А) -М- мРНК) сортов озимой и яровой пшеницы

Сорта Поли(А)" мРНК в %

вез освещения 18 часов контр оль ('ГД освещение в часах опыт ("О") «о» - "К" 3 часа

3 12 за

Краснодарская 39 75±2 25±0,б 17 ±0,4 16 ±0,5 -50

(озимая)

Безостая 1 41±1 1 33±0 8 29 ±0 8 30 ±0,9 -8

(озимая)

Дружина Б 37±0,9 47 ±1 0 - - 10

(яровая)

Спектр 36±0,9 36 ±0,8 - 0

(яровая)

Фитофизиологи, основываясь на многолетних эмпирических наблюдениях, отмечают противоположную реакцию на свет у озимой и яровой пшениц [Шайн, 1960] В наших экспериментах озимая и яровая пшеницы также имели противоположную реакцию на свет У озимой пшеницы освещение приводило к снижению, а у яровой к увеличению выхода мРНК во втором цикле хроматографии (Табл 3)

Таблица 4 - Влияние пониженной температуры (4"С 5 часов) на выход во втором цикле хроматографии поли(А) мРНЗС (п ол и (А) гдРНК) сортов озимого ячменя

Сорта Поли(А)*"* мРНК ("/<.) "О" - "К" Ранг устойчив о с-ш

контроль "К" (2 0 °С) опыт " О" (4°С)

Ряди кал 40 ± 0 5 33 ± 0 3 -1 1

Секрет 40 ± 0,4 35 ± 0 4 -5 2

Кордон 42 ± 0 4 39 ± 0 2 -3 3

Янус 36 ± 0,5 36 ± 0 4 0 4

Вавилон 36 ± 0,3 42 ± 0,5 6 5

Мамлюк 30 ± 0,7 44 ± 0 6 14 6

Наиболее холодоустойчивый сорт озимого ячменя Радикал в наших экспериментах имел отрицательную разницу между опытом и контролем, по выходу поли(А) мРНК во втором цикле хроматографии Однако эта отрицательная величина убывает по мере снижения холодостойкости сортов, становится нейтральной для двуручки (Янус) Только затем сорта ячменя имеют положительное изменение доли прироста поли(А) мРНК под действием холода Наиболее высокое значение по нашим данным имеет сорт ярового ячменя (Мамлюк), обладающий наименьшей холодоустойчивостью (Табл 4)

Эффект был использован в качестве молекулярно-кинетического маркера и, соответственно, разработан диагностический метод оценки стрессоустойчивости сортов озимой пшеницы и озимого ячменя [Плотников, Бакалдина, Бибишев, Патент РФ, 1997]

Однако для применения метода в селекционной практике необходимо его техническое упрощение и увеличение информативности, что требовало глубокого фундаментального исследования обнаруженного эффекта

В процессе работы было показано, что уменьшение выхода мРНК во втором цикле связано с разрушением молекул О ферментативном характере деградации мРНК, не сорбировавшихся на поли(У)-сефарозе во втором цикле (рис 4) свидетельствовало невысокое связывание этих молекул с МАК - 3,5-10% и количество, осаждающееся раствором Рассела [Яагге1, 1963] - 6,114,5%, переводящего в нерастворимую форму все олигонуклеотиды размером более шести звеньев Однако, кратность и продолжительность депротеинизации, обработка проназой и протеиназой К, а также разбавление препаратов суммарной РНК с целью изменить соотношение фермент / субстрат, не влияли на величину распада в процессе хроматографии При смешивании в соотношении 1 1 двух препаратов суммарной РНК, контрастно различающихся по выходу поли(А) мРНК во втором цикле, в результате хроматографии, получали близкое к рассчитанному среднее количество молекул (Табл 5).

Таблица 5 - Выход во втором цмкле поли(А) мРНК исходных (А и Б) и смешанных в соотношении 1 1 (0,5А и 0,5Б) контрастно различающихся по стабильности препаратов РНК из четырехсуточных проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (% от количества наносимой РНК)

Вид Образец А Образец Б 0,5А + 0,5Б 0,5А + 0.5Б

стресса теоретически фактически

1 34,2*2,7 72,9±1,3 53,6 5б,1±2,4

2 28,9±3,4 54,8±1,7 41,9 39,7±3,1

Примечание 1 А-контроль, Б-3 часа 2% NaCl, 2 А-контроль (20 С), Б-5 часов 2°С

Это противоречит версии об РНКазном загрязнении препаратов суммарной РНК, но хорошо согласуется с данными о том, что деградация матриц у эукариот осуществляется ассоциированными с мРНК нуклеазами [Bandyopadhyay et al ,1990]

В качестве рабочей гипотезы было высказано предположение о наличии на мРНК растений в 3 некодирующей зоне проксимально от поли(А)-хвоста, устойчивой к обработке традиционными депротеинизирующими агентами структуры - регуляторного нуклеопротеидного комплекса (3 РНПК), в состав которого входит рибонуклеаза и обусловливающий дифференциальный характер распада фактор, вероятно, снимающий ее ингибирование в ответ на определенный цитоплазматический сигнал in vivo, либо сходное с ним воздействие in vitro

Метод аффинно-адсорбиионного (АА) фракционирования пула поли(А) мРНК растений Наличие прочно ассоциированных нуклеопротеидных комплексов, очевидно, оказывает влияние на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, включая поли(А)-последовательность, а некоторые особенности комплексов специфически отражаются на характере элюции информационных молекул с колонки поли(У)-сефарозы в процессе хроматографии Об этом свидетельствует тот факт, что, несмотря на отсутствие неспецифической адсорбции рРНК (рис 6), в процессе двуцикличной хроматографии систематически наблюдали в первом цикле появление двух дополнительных пиков при промывании колонки пятикратно разбавленным буфером для нанесения - до термической элюции поли(А) мРНК бидистиллированной водой и после - при уравновешивании колонки буфером для нанесения (рис 7) Последний пик можно получить, используя также элюирукмций буфер В этих пиках элюировались молекулы, имеющие максимум поглощения 260 нм присущий нуклеиновым кислотам [Маниатис и др , 1984]

ЩЫЯ - V ft NvJ: "

• I*-

t)r f • .

. - ■ ■

fc --.■3^ L

Суммарная 12 3

РНК Номер фракции

Рис. б - Эле>?грофорез РНК приростков Рис. 7 - Схема аффинно-адсорбцяонного

озимой пшениц к сорта Краснодарская 39 фракционирования мРНК растений

на поли(У)-сефар£зс

Фракция 1 элк>ируется ш^гиьфатно разбавленным буферов для нанесенил при 20+С.

Фракция 2 - бидистиллнрованной водой при 65"С

Фракция 3 - буфером для нанесения (элюирующим буфером) при (>'''''

Кроме того, при непродолжительной (60 минут) инкубации срезанных проростков озимой пшеницы б растворе [Н]-урндина (уридив присутствует только в составе РНК, меченый нуклеотид включался в состав вновь синтезированных молекул, впоследствии элюировавшихся, как во фракции полученной после термической элю ни и бидистиллнрованной водой ((фракция 2), так и в исследуемых фракциях (фракции 1 и 3). Причем, содержание включившегося т \>п>о [11]-ури;шна н молекулы всех фракций в десятки раз превышало его количество в суммарной РНК (Табл. 6), что .характерно именно для матричных РНК [Остермал, 1983].

Таблица Ь -Аффинно-адсорбционное фрэд^ио1шрование меченых [3Н]-уридином РНК четырежсуточных прорсегхов озимой пшеницы сорта краснодарская 39 (нмп./мин. в 5 мкт РНК)

Подготовка образца Суммарная РНК Фракция I фракция 2 Фракция 3

РНК без прогрева 4,3±0,7 89± 12,2 2D7±31 79±9,2

РНК после прогрева (.65" С 10 мин) 3.9*1.6 50±7,1 104 ± 1S 113 ± 11,7

Информационная природа молекул РНК этих фракций подтверждается и их достаточно высокой трансляционной активностью в системе из ретикудоцитов кролика (Табл. 7)

Таблица? — Включение [5iS]- мети о ни на в белок (и мл./мин в 5 мкл. трансляционной смеси), при трансляции in vitro фракций гтоли(А) мРПК полученных меч-од ом аффинно-адсорбционной кроматографик на полн(У)-сефарозе

Культура Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

С'зимай пшеница 44250±4140 83500±5030 55 2 5 5± 231 0

Созр ев ающее зерно кукурузы 1 9550±2470 51875±47I2 423LD±1872

Примечание: поли(А) мРНК из озимой пшеницы сорта Краснодарская и по ли (А) м РНК из созревающего зерв а кукурузы линии твотадщ 64А.

О неслучайном характере распределения поли(А) мРНК при фракционировании позволяет судить, как гетерогенность фракций по стабильности, выявленная благодаря инкубации препаратов перед хроматографией в условиях, очевидно, способствующих серьезным конформационным изменениям молекул (рис 8а, 9, 13, 14), так и изменение профиля фракционирования пула поли(А) мРНК индуцированное т упо воздействием на проростки повышенной (рис 9) и пониженной (рис 13, 14) температуры, экзогенных фитогормонов и в процессе 30-часового роста проростков (рис 10)

Рис 8 — Гетерогенность по стабильности полн(А) мРНК фракций полученных методом АА хроматографии препаратов суммарной РНК го созревающего •зерна кукурузы линии \"йзсо1ияп 64А. а Влияние способа предварительной инкубации препаратов суммарной РНК на изменение профиля фракционирования поли(А) МРНК б. Выявленные группы поли(А) мРНК в составе фракций.

Щ! -<1>1>;н.х.и»* 1„ Офр;ж*ИШ X

т Эк

Примечательно, что определенные условия предварительной инкубации индуцируют сходные изменения 1 и 3 фракций и контрастные с ними изменения фракции 2 К примеру, в результате инкубации при повышенном значении рН (с НН4ОН) препаратов суммарной РНК из созревающего зерна кукурузы (рис 8а) и из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (рис 9) происходит, преимущественно уменьшение фракций 1 и 3

Без Инкубация инкубации >щСОН

Контроль (20* С)

Без Инкубация инкубации >Щ4ОН

Стресс (40 С 60 мин )

Рис 9 — Изменение профршя

фракционирования полн(А) мРНК из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39, индуцированное воздействием на растения кратковременного теплового шока (40° С 60 мин ) и в результате пнъубпцшт препаратов РНК в присутствии 40 шМ ИН^ОН

Количество молекул фракции 2 убывает в меньшей степени (рис 8а) и, даже увеличивается (рис 9), вероятно, в результате их перераспределения Подтверждением этой закономерности может служить перераспределение молекул поли(А) мРНК проростков озимого ячменя фракций 1 и 3 во фракцию 2 (рис 15), а исключением - случаи присутствия "скрытой" группы поли(А) мРНК (рис 13, 14) Напротив, предварительный прогрев суммарной РНК 65°С 10 минут, зачастую, в большей степени приводит к распаду молекул фракции 2 Это показано в таблице 5 и на рисунке 8а Интересные результаты получаются и при длительной инкубации препаратов суммарной РНК (100 часов при 20°С РЖ растворена в буфере 20 тМ Тт-НО рН 7,6) На рисунке 8 а можно видеть, что при этом фракция 1 в четверо уменьшилась по сравнению с не инкубированным образцом, фракция 2 снизилась более, чем на половину, а фракция 3 не изменилась Препарат суммарной РНК после длительной инкубации прогревали

при 65°С Это не вызвало изменений фракции 1 и 2, а фракция 3 уменьшилась так же, как и при прогреве не инкубированного препарата (рис 8а) Очевидно, что характер изменения профиля фракционирования, в рассмотренных случаях, не соответствует представлениям о существовании "изначально" стабильных или нестабильных транскрипгов и, вероятно, связан с особенностями регуляторных комплексов индивидуальных мРНК В ряде экспериментов (рис 8а, 13, 15) можно наблюдать количественную детерминированность распада или перераспределения молекул в другие фракции Выявленные группы молекул в составе фракций поли(А) мРНК из созревающего зерна кукурузы (рис 8а) дифференцированные по реакции на различные способы предварительной инкубации суммарной РНК, обозначены разной штриховкой на рисунке 86 Возможно, таким образом удалось выявить некоторые популяции в пуле мРНК, наличие которых отмечалось ранее другими исследователями [Кеепе, 2001, Ка\уа1 е1 а1, 2004]

Принципы АЛ фракционирования полинуклеотидов Метод АА хроматографии основан на аффинном отделении мРНК от рибосомной РНК, с последующим фракционированием матриц по уровню их конформационной сложности Аффинное связывание поли(А) мРНК с поли(У) осуществляется в процессе нанесения препаратов суммарной РНК на колонку поли(У)-сефарозы После промывания колонки однократным буфером для нанесения, пятикратно разбавленным буфером элюируются, очевидно, наиболее слабо связанные с поли(У) молекулы (фракция 1) Предположение о наличии у мРНК этой фракции коротких поли(А) "хвостов" не подтвердилось, т к при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу эти молекулы элюируют, преимущественно, в длиннохвостовых фракциях Так молекулы поли(А) мРНК фракции 1, полученные методом АА хроматографии препаратов суммарной РНК из проростков озимого ячменя сорта Радикал, при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу распределились следующим образом - фракция 1 - 11,3±1,8% от нанесенной РНК, фракция 2 - 30,5±2,2%, фракция 3 - 39,2±4,1% Такое распределение молекул, вероятно, указывает на высокую начальную структурированность поли(А)-сегментов этой группы мРНК Термическая элюция мРНК бидистиллированной водой (65°С) снимает с колонки только часть молекул (фракция 2), остальные же прочно удерживаются и при повышении температуры элюции до 80°С и выше Буфером оставшиеся РНК (фракция 3) количественно снимаются даже при комнатной температуре, что указывает на не аффинную природу их задержания на колонке

Известно, что при понижении ионной силы раствора ниже 20тМ сефароза обнаруживает "склонность" и к гидрофобной сорбции полинуклеотидов на поверхности гранул, за счет взаимодействия материала матрицы с гетероциклическими нуклеотидами, и к ионной, за счет присутствующих на сефарозе ионогенных групп (карбоксилы и остатки сульфокислоты) [Остерман, 1985]

Таблица 8 - Аффинно-адсорбционное фракционирование синтетической

поли(А) (% от суммарного количества наносимого на поли(У)-сефарозу)

Образец Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

Поли(А) б ез предварительного прогрева 0 46,2 ± 2,6 48,5 ±4,7

Поли(А) после предварительного прогрева 0 24,2 ± 2,2 63 ±4,1

р Многоточечный характер адсорбции обусловливает более прочное взаимодействие с поверхностью гранул - молекул, не обладающих сложной структурированностью Это иллюстрируется уменьшением второй фракции и увеличением третьей при АА фракционировании, предварительно прогретого в буфере (20 тМ Тт-НО, рН 7,6), образца синтетической поли(А) (Табл 8)

Эффект фракционирования поли(А) мРНК растений, согласно основной версии, обусловлен наличием контрастно, различающихся по прочности ассоциации с мРНК регуляторных комплексов Вероятно, конформационные изменения которые претерпевает 3' некодирующий регион молекулы в процессе хроматографии или специфической инкубации, приводят либо к отделению компонентов комплекса вместе с рибонуклеазой, либо к деингибированию рибонуклеазы и после высвобождения поли(А)-хвоста при элюции с колонки - распаду молекул, либо мРНК сохраняет свой комплекс неизменным При термической элюции мРНК с колонки бидисгиллированной водой происходит отделение поли(А)-хвоста мРНК от поли(У) и одновременно адсорбция молекул на поверхности гранул сефарозы В этих условиях, с колонки сходят молекулы (фракция 2), сохранившие регуляторный нуклеопротеидный комплекс в 3 некодирующей зоне мРНК (З'РНПК), т е имеющие структурированный участок, ослабляющий эту связь, а также, продукты деградации мРНК, количество которых и определяется при рециклике Буфером элюируются мРНК, очевидно, утратившие комплекс, что позволило им адсорбироваться на гранулах по всей длине молекул (фракция 3)

Таблица 9 - Задержание на колонках МАК и поли(У)-сефарозы поли(А) мРНК 2 и 3 фракций, полученных в процессе аффинно-адсорбционной хроматографии препаратов суммарной РНК из созревающего зерна кукурузы линии Висконсин 64А (% от количества наносимой РНК)

Образец МАК Поли(У>сефароза

Фракция 1 Фракция 3 74,9 ± 0,5 98,7± 0,7 72.2 ± 1,3 44.3 ±5,1

Подтверждением этой гипотезы служит практически стопроцентная сорбция на МАК мРНК третьей фракции (Табл 9), что свидетельствует об отсутствии распада, а их небольшое количество связавшееся с поли(У)-сефарозой при повторном нанесении, вероятно, объясняется тем, что утратившие ЗРНПК молекулы в растворе образуют динамический клубок, в котором поли(А)-хвост мРНК может оказаться недоступным для аффинного взаимодействия Напротив, наличие З'РНПК у мРНК второй фракции, определенным образом, организует 3 некодирующий регион, включая поли(А)-"хвост", что обеспечивает задержание всех не деградировавших молекул на поли(У)-сефарозе

Функциональные особенности поли(А) мРНК фракций, получаемых в процессе АА хроматографии Отмеченное в предыдущих разделах сходство популяционного состава фракции 1 и 3 (рис 8, 9, 13), а также синхронность и направленность в динамике количественных изменений этих фракций (рис 10, 14), указывают на их принадлежность к одной группе мРНК функционально отличающейся от группы, к которой принадлежит фракция 2 Логично предположить, что происходит разделение мРНК свободных и полисомных мРНП Косвенным подтверждением гипотезы о природе фракций может служить показанное на рис 10 уменьшение 1-ой и 3-ей и увеличение 2-ой фракции в процессе 30 часового роста как в препаратах из клеток листа, так и колеоптиля

В цитоплазме молодой клетки в основном присутствуют свободные мРНП, часть из которых переходит в полисомы по мере ее созревания [Weber & Schweiger, 1985] В этой связи представляется закономерным увеличение 2-ой фракции, предположительно полисомной мРНК, индуцированное экзогенным кинетином и, напротив, блокирование этого процесса АБК, наблюдаемое в препаратах из клеток колеоптиля Сложнее объяснить эффект стимуляции увеличения 2-ой фракции абсцизовой кислотой и некомпетентность к действию кинетина, проявившийся в препаратах из клеток листа В этой ткани у 4-х суточных проростков ячменя, очевидно, преобладают меристематические клетки и клетки, только приступившие к растяжению

Действие экзогенной АБК может способствовать форсированию реализации генетической программы, в данном случае - процесса созревания клеток.

Фракш 1я

фра*адзи 2 Л п с гн

'1'[>;|К Щ1Г1 3

Рпс.Ю — Изменение Профиля АА фрЯКЦ] ю я:ми .и П14 препаратов пипп(А) мРНК ш тканей листа и 1.0 1С 1М11:[;1Ч проростков очимого ярчм о 1Л сорта Бастион: индущтровлннос б процессе зо часового роста п под в ;и 'чнисм огенных клнетина II ЛБК

ЛБК

кон I ро П.. -- 4

к19и 1111£ ----

11редположение о принадлежности мРНК фракций 1 и 3 к группе свободных, а фракции 2 -к полнеомиым частицам согласуется с данными о том, что мРНП, изолированные из постноли со много супер наг анта ультрацентрифугированием >1 при этом седимснтирующис одним пиком, разделяются на две очень контрастны* по прочности ассоциации с сорбентом фракции в процессе аффинной хроматографии на олиго(сГГ)-целлюлозе |Уас1;о' е( а! , 1990],

Чтобы подтвердить изложенную выше гипотезу, использовали традиционный метод разделения свободных 1! полисом ных мРНП - дифференциальное ультрацент р и фуг яров анис и, менее широко используемый метод - нуклеопротеид-целитную (НПЦ) хроматографию [Лихтенштейн и др., 19761.

1й 3 -¡1 I I

о. 5 л ьтраиуншрпфу.-нроепн не

в. шщ-хромояюграфия

РНК гп супернятянта

РНК ш осадкя

РЖ I фракции РНК" Пфржщи

с колони! НЩ

Вгс. II-АЛ фракшонцюванис по щ^Л) мРНК ! г? препаратов мРНП. подуннныт методом днф фер« кш 1апьного удыра центр»|фуп фонами тпроростков ЧЧМСК/

сорта Бастион н методом н; кле опро I «я -цс ш [гнон (НЩ) хроматограф]«-» проростков оятмой гппснпцы сорта Краснодарская 39

13 силу технических причин (угловой ротор при ультрацептрнфугиронании и ступенчатая элюция мРНК при НПЦ хроматографии) в наших экспериментах происходило частичное

перекрывание фракций свободных и полисомных мРНП. Тем не менее, на рисунке II показано, что поли(А) мРНК из обогащенных препаратов свободных мРНП, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и НПЦ хроматографии (рис.1) а, -РНК из супернатанта и б - РНК 1-й фракции с колонки НПЦ), в процессе АА фракционирования предпочтительно распределились в 1-й и 3-й фракциях, в то время как мР1 1К из препаратов полисом (рис. И а. - РНК из осадка и б — РНК 11-й фракции с колонки НПЦ) в большей степени элюировалнсь во 2-й фракции.

"Скрытия" группа поли (А) мРНК. Окраска проростков методом Ф ель гена (дифференцированно окрашивается только ДНК) [Паушева, 1974] позволяет визуализировать зоны интенсивного деления клеток (рис. 12), Известно, что на протяжении всего периода вегетации функционирует, так называемая, "основная" иди первичная меристема [Clowes, 1961] у основания листа (рис. 12в.) и на кончике корпя (рис, 12г.). Кроме "основной", есть еще и "временные" - вторичная и третичная меристемы, расположенные, в частности, на копчике и по краю листовой пластинки и существующие до тех пор, пока продолжается рост листа J Гил яров и др., 1986] Пример вторичной меристемы, локализованной па кончике листа, представлен на рис. 12 б.

У двух и трехсуточных проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 стебель окрашен в темный цвет (рис. 12а.), что указывает на преобладание "м-олодьгх" клеток, а светлая окраска средней части стебля четыре,чеу точных проростков свидетельствует о "зрелости" клеток этой зоегы, т. с. о том, что они закончили или заканчивают прохождение стадии растяжения.

Значительный интерес представляло исследование пула цитоплазматических мРНК из клеток, находящихся на разных стадиях зрелости, с помощью метода АА хроматографии па поли(У)-сефарозе. Технически более просто использовать среднюю часть колеоптиля ("зрелые" клетки) и копчик (1-3 мм) листовой пластинки. В последнем случае можно утверждать, что в срезанной ткани преобладают м ер nei ем этические слетки.

На рисунке 13 показано, что профили фракционирования поли(А) мРНК методом АА Хроматографии различаются: для клеток колеоптиля и апикальной меристемы листа (рис 13а. и б.); для контрольных и езрессированных проростков (рис. 13 а.), для инкубированных

А.

Б.

Г.

Рис.11 - Проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 окрашенные по методу Фельгена

A. -1; 2; и 3 - двух, трех и четырехсотом ные проростки, соответственно Выделенные и обозначенные буквами зоны, 8 увеличенном виде представлены на рисунке: Б.-кончик листа.

B.-основание стебля. Г.-кончик корня.

1.- зона интенсивного деления клеток

2.- зона растяжения

различными способами препаратов суммарной РЫК (рис. 13а., б., в.). Й

™ Краснодарская 39

0 ь-

Ь н ■ £.1.8-

| и-

1 0.81 0.6-§ 0.4-

I 02-

1 2 3 4 3 6

Клетки колеопгиля

1 2 3 4 5

Апикальная меристема листа

1 I 3 Клетки колеоптиля

1 1 3 Апикальная меристема листа

1.81,61,41.2 I -0.80.60.40,2 О

Краснодарская 39

в.

во

рН7,6 рнз.б рНУ.б .Апикальная меристема

листа

Рис 13 - Изменение профиля А А фракционирования поли(А) мРНК проростков озимой пшеницы сортов Краснодарская 39 и Безостая I, обусловленное реакцией на стрессовое воздействие, а так же, предварительной инкубацией соответствующих препаратов суммарной РНК 1-3 - РНК проростков не подвергнутых стрессовому воздействию, 4-6- РНК проростков, подвергнутых воздействию пониженной температуры (4гС 5 часов) 1 и 4 - препараты РНК без предварительной инкубации (контроль), 2 и 5 - препараты РНК предварительно прогревались 65°С 10 мин; 3 и 6 препараты РНК предварительно инкубировались 100 часов при 20"С: в - Прел араты суммарной РНК предварительно инкубировались 60 мин при 20°С в 40 мМ буфере ( рис-НС! рН 7,6; 8,6; 9,6.

Очевидно, что стрессовое воздействие сильно изменило популяционный состав фракций поли(А) мРНК из клеток колеоптиля. Об этом можно судить не только по изменению профиля фракционирования контрольных образцов (рис. 13а. Клетки колеоптиля 1 и 4), но и по изменению во всех фракциях доли стабильных молекул в условиях прогрева при 65°С 10 минут {рис 13а. Клетки колеоптиля 2 и 5) и инкубации при 20°С 100 часов (рис. 13а Клетки колеоптиля 3 и 6). Влияние воздействия пониженной температуры (4"С 5 часов) на меристем этических клетках отражается в меньшей степени (рис 13а Апикальная меристема листа I и 4). Об этом свидетельствует отсутствие количественных изменений фракции 2 и 3.

Изменения затрагивают только первую фракцию.

Общий выход поли(А) мРНК из апикальной меристемы листа (рис. 13а. Апикальная меристема листа 1 и 4; б. 1) существенно ниже (контрольные образцы - 2,31% от суммарной РНК, а стресснрованные - 2,05% (сорт Краснодарская 39)), чем соответствующие образцы из клеток колеоптиля (контрольные образцы - 4,78% и стрес сиров айны е - 4,14%). Однако инкубация препаратов РНК из клеток меристемы 100 часов при 20°С и при прогреве 65°С - в случае с подвергнутыми стрессовому воздействию проростками, приводит к увеличению общего выхода поли(А) мРНК до 3,5±0,07% от суммарной РНК, т.е в среднем на 34 и 58% для Краснодарской 39 (рис, 13а. Апикальная меристема листа 3 и 5) и на 60% для Безостой 1 (рис. 136 Апикальная меристема листа 3). Таким образом выявлено наличие в препаратах РНК из меристематических клеток особой "скрытой" группы мРНК, возможно предзапасснной для более поздних этапов их развития. В случае инкубации РНК апикальной меристемы листа при рН близкой к нейтральной (рН 7,6) эта группа распределилась исключительно в 1 и 3 фракциях (рис.13 Апикальная меристема листа - а., б), а по мере увеличения рН в И1 всубационном растворе всё больше молекул переходит во 2-ю фракцию (рис. I Зв).

1>1 чгго определенные изменения, очевидно, в структуре регуляторных комплексов мРНК "скрытой" группы происходят не только в процессе роста клеток, но и при стрессовом воздействии. Это можно заключить по индукции появления "скрытой" группы - прогревом 65°С 10 минут препаратов суммарной РНК стрессирОванных растений (рис. 13. Апикальная меристема листа а 5), что не отмечалось в аналогичных условиях на препаратах из йестрессироваиных растений (рис 13 Апикальная меристема листа - а. 2, б. 2).

■Т'Р ЛКЩ1Я 1

Фрлкцня 2 Еппчпон

Фр якцня 3

о 2,5 5 Ридпшиг

ЪЛ

1,0 о? о

пг» т ГУН

17ггг- тп

1 2

о 5

Циклон

гЛдЛ Ш

Продоижгггетьносгь ' К''] и - : с 11 т.1 (ч я с о в)

Контрольные рлстрнля □ : I

Стр?с<щ>о&акные раетення

1>Н7.(> ИЛ 9,6 1>Н7.б 8,6 0,6 К 11.:; >■:, : • - С т]1 * 1 гроте лнны е рлиргаш I]О С.')

(4 С 5 члсоб)

¡5: ЕЗ: ■_______ □ -<)>(> пил га 1;0-фрлкция 2; Я -фракция 3.

Рис.14 - АА фракционирование ноли(А) мРНК из проростков холодоустойчивых сортов озимого ячменя Бастион, Радикал и слабоустойчивого Циклона - а. Растения контрольные И подвергнутые воздействию пониженной температуры: б. I - РНК без инкубации; 2. - РНК предварительно инкубированная в присутствии с 40 шМ КН<ОН 60 минут; в и г. препараты РНК инкубированные 60 мин в буфере содержащем 40 тМ Трис-НС1 (рН 8,6 и 9,6).

Воздействие пониженной температуры на четырехсуточные проростки озимого ячменя сортов контрастных по стреееоустойчивости, вызывает т уЫо количественные изменения

фракций поли(А) мРНК, полученных методом АА хроматографии (рис. 14а ). Аналогичные или очень схожие изменения профиля фракционирования можно индуцировать in vitro, если перед хроматографией различными способами (NH4OH (рис.146.) и буфер (рис.14в.)) на непродолжительное время сдвинуть r основную сторону рП инкубационных растворов препаратов суммарной РНК из проростков, не подвергнутых стрессу

Таким образом, выявлено наличие у этих проростков "скрытой" группы мРНК, не сорбирующейся на поли(У)-сефарозе без предварительной инкубации. Доля "скрытой" группы в общем пуле мР1 !К составила у холодоустойчивых сортов Бастион и Радикал 42 и 50% соответственно, а у слабоустойчивого Циклона - 26%. Причем преимущественное распределение этой группы PI 1К во фракции 2 у Бастиона и во фракциях I и 3 у Радикала, индуцируемое как in vivo, так и in vitro (рис.14а ; б.; в.), вероятно, отражает индивидуальные особенности этих сортов Инкубация в тех же условиях препаратов РНК, выделенных из проростков подвергнутых холодовому стрессу (среднеустойчивый сорт Скороход), вызывает распад большей части поли (А) мРНК (рис. 14г.).

Можно заключить, что неспособность мРНК "скрытой" группы без предварительной инкубации связываться с поли(У)-сефарозой, очевидно, объясняется высокой структурированностью и закрытостью их поли(А)-хвостов

Модель механизма ВШМШШ белкового синтеза растений при стрессе. Ранее рассматривались случаи количественного увеличения фракции 2 в результате перераспределения молекул из других фракций, индуцированного предварительной инкубацией (рис. 9; 13в.). Такое же перераспределение показано и на рисунке 156., но здесь привлекает внимание сходство реакции in vitro ■ изменения профиля фракционирования индуцируемого инкубацией при повышенных значениях рН препаратов суммарной РНК из контрольных растений, с тем, что происходит in vivo в процессе 30-зи часов роста проростков озимого ячменя (рис.15а ).

ЗЙм

h м О

с S 0.4

¡W

ЕЙ И

111

0,6

U.J

6 N

Vi У| 6 7 6 8 О

■ Я

. If, О,

1 i

шгршшк p j с тел ¡/i

РНК' pac rea íi nt|! pDCîa

i'íHipom Инкубация (без инкубщнв сравргга РЖ препаратов РНК) сЩОН

Рис.15 - Изменение профиля А А фракционирования

препаратов поли(А) мРНК проростков озимого ячменя сорта Бастион: in vivo индуцированное в процессе 30 часового роста и in vitro -в результате инкубации препаратов суммарной РНК в присутствии 40тМ NH4OH 60 минут.

Индукция in vitro аналогичною происходящему в процессе 30-ти часового роста проростков перераспределению поли(А) мРНК между фракциями (рис,15а., б.) позволяет предположить, что регуляторный комплекс н 3' некодирующей зоне (З'РППК), кроме определения стабильности мРНК, обеспечивает и изменение их функционального состояния In vitro переход во вторую фракцию, очевидно, связан с тем, что регуляторные комплексы, компоненты которых ранее отделялись вместе с рибонуклеазой, становятся более прочно связанными с мРНК. Объясшпъ такие изменения можно исчезновением некоего фактора "разрыхляющего" З'РППК. Вели представить, что этот фактор, предположительно ингибитор трансляции (блокирование процесса инициации может осуществляется при взаимодействии с КЭП-структурой), входит в состав регуля горных комплексов свободных мРНП и закрывает при этом часть поли(А)—последовательности, то индуцированное in vivo ею отделение освобождает место для растительного РАВР (poly(A)-binding protein), присоединение которого, в свою очередь, может вызывать конформационные изменения этой зоны молекулы,

позволяя вытеснить альтернативный мажорный белок с поли(А) и уменьшить его количество t других частях матрицы, т.е. активировать мРНП аналогично показанному для клето животных [Овчинников и др., 200)]. Простейший вариант гипотетической модели описывающей работу З'РНЛК, представлен на рисунке 16, хотя, очевидно, что функщи ингибитора иуклеазы более эффективно могут выполнять микроРНК (tiliRNA), обнаружении и составе многих мРНП [Hieronymus & Silver, 2004].

АКТИВАЦИЯ иРНП

7шС<

7тС i

Р егу ляторны й нукл ео пр оте ц д н ы й комплекс в 3 v некодирующей зоне мРНК (З'РНШС).

Нукл е аз а З'РШШ.

Де ад е н и л ирующая нукл саз а.

Индуктор З'РНПК Неактивная и активирован н ая форма

Ингибитор трансляции

Civ bg).

Растительный РАБР

ДЕГРАДАЦИЯ «РНК

Рис 16. — Схема функционирования гипотетического регуляторного нуклеопротеидпог комплекса в 3' некодирующей зоне мРНК (З'РНПК)

При укорочении поли(А)-хвоста мРНК эукариот деаденилирующей нуклеазой до 2 нуклеотидов и ниже, деградация молекулы происходит скачкообразно [Айтхожин, Искако! 1982], очевидно, в результате активации другой ассоциированной иуклеазы [Ллотниког Бакалдина, Бибишев, 1993]. При стрессе возникает необходимость быстрой деградацт определенных видов мРНК [Ка\Уа1 е! а1., 2004], что может индуцироваться прямы воздействием цитопл аз магического эффектора на 3 РНПК этих матриц (рис. 16).

Соответствие изменений профиля фракционирования, вызванных in vivo действием пониженной температуры (рис 14а) ив процессе роста проростков (рис 15 а), и т vitro -сдвигом pH в основную сторону в инкубационном растворе контрольных препаратов суммарной РНК (рис 146, в , г и рис 156, в ), - выявляет сходство этого воздействия с цитоплазматическим сигналом, на который настроены регуляторные комплексы мРНК На начальном этапе холодового воздействия в ряде случаев происходит сдвиг цитоплазматической pH в основную сторону у растений [Пятыгин и др, 2005] Постепенный сдвиг цитоплазматической pH в основную сторону происходит и в растущих клетках под влиянием ауксина, вызывающего перекачку протонов (Н1} из цитоплазмы к клеточной стенке [Медведев и др, 1999] Есть основания предполагать, что именно изменение цитоплазматической pH, в первую очередь, является тем сигналом (универсальным эффектором), на который специфически настроены 3 регуляторные комплексы мРНП

Смена наборов синтезирующихся белков является обязательной составляющей адаптивного синдрома [Пахомова, 1995], однако белковый состав, например, при гипер и гипотермии качественно различается Тем не менее, определенная неспецифичность в трансляционном ответе на стресс сохраняется, т к синтез белков теплового шока могут индуцировать ионы тяжелых металлов, ультрафиолетовое излучение, поранение, действие определённых фитогормонов и еще длинный ряд других факторов [Кулаева, 1997], а в ответ на воздействие пониженной температуры синтезируются стрессовые белки, которые индуцируются также осмотическим шоком, неорганическими солями, патогенами вирусного и бактериального происхождения и т д, но не тепловым шоком [Едрева, 1991] Группирующим эти факторы может оказаться характер вызываемых ими изменений состояния (текучести) билипидного слоя клеточных мембран [Пятыгин и др, 2005] Следует добавить, что синтезу белков теплового шока, независимо от индуцирующей причины, предшествует и качественно с ним коррелирует сдвиг цитоплазматической pH в кислую сторону [Weitzel et al, 1987]

Дифференциальный распад или изменение функционального состояния (перераспределение в другие фракции) мРНК, индуцированное действием различных факторов как in vivo, так и т vitro, позволяет представить модель молекулярного механизма регуляции белкового синтеза на начальном этапе стрессового воздействия Известно, что группы свободных и полисомных мРНП состоят из популяций [Кеепе, 2001, Kawai et al, 2004] предположительно, являющихся элементами (подпрограммами) общей физиологической программы клетки [Кеепе, 2001], те кодирующих наборы белков, необходимых для поддержания жизнедеятельности растений, в том числе и в определенных интервалах напряженности стрессового воздействия Молекулы в популяциях обладают способностью идентично реагировать на воздействие [Kawai et al, 2004], что, возможно, объясняется наличием у них одинаковых З'РНПК В свою очередь, регуляторные комплексы, очевидно, различаются между собой по диапазону воспринимаемого ими цитоплазматического сигнала, коррелирующего с уровнем напряженности стресса, обеспечивая адекватность изменений в составе транслирующихся мРНК, а, следовательно, и в спектре вновь синтезированных белков - изменившимся условиям Представляется, что важной составляющей адаптации является "запрограммированость" пула цитоплазматических мРНП зрелой клетки на обеспечение ее перехода в различные стационарные режимы функционирования

Уход растений в вынужденный покой (механизм приобретения неспецифической устойчивости к внешним условиям), являющийся одним из таких стационарных режимов функционирования, обусловлен снижением интенсивности клеточных процессов в результате изменения композиции экспрессирующихся генов Сорта зерновых культур, обладающие высокой скоростью формирования адаптивного ответа, а также способные осуществлять более "глубокие" адаптивные преобразования клеточных процессов, благодаря наличию соответствующего набора предзапасенных в цитоплазме частиц мРНП, те- высокой

"функциональной устойчивостью", очевидно, нуждаются в меньшем времени необходимо для погружения в состояние "вынужденного покоя" или выхода из него Об это свидетельствуют, присущие им, высокие ранги морозоустойчивости [Маймистов, 2001] Кроме того, эти сорта обладают большим потенциалом неспецифической адаптации воздействию различных, по своей природе, неблагоприятных абиотических факторов

Однако, слишком быстрое формирование адаптивного ответа и "глубина" адаптивны преобразований клеточных процессов не всегда являются ценными качествами возделываемо культуры Так, небольшое изменение внешних условий может быть началом стрессовог воздействия, а может — непродолжительным отклонением от средних значений Если растени на это реагирует кардинальным изменением физиологических процессов, клеточног метаболизма, то в первом случае оно успешно адаптируется к стрессу и избежит серьезны повреждений клеток и тканей, а во втором - напрасно потратит энергию и "пластически вещества", что отразится на главном критерии оценки того или иного сорта - урожае Одно" из основных проблем современной селекции является создание сортов оптимальн адаптированных к местным условиям, т е сочетающих, наилучшим образом, соответствующие этим условиям показатели "функциональной устойчивости"

В настоящее время уже созданы или находятся в стадии разработки диагностически методы тонкой количественной оценки главных составляющих "функциональной устойчивости", основанные на предложенных нами молекулярно-кинетических маркерах Так, скорость формирования адаптивного ответа определяется по динамике изменения доли тяжелых полисом в препаратах мРНП из стрессированных растений или, в каких-то случаях, по величине пороговых значений напряженности неблагоприятного воздействия, "запускающих" адаптивные процессы А "глубина" адаптивных преобразований клеточных процессов растения - по величине нестабильной популяции поли(А) мРНК (с использованием двуцикличной аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе) и количественного изменения фракций поли(А) мРНК (с использованием АА хроматографии на поли(У)-сефарозе) Представляется перспективной разработка маркера основанного и на выявлении популяционного состава этих фракций

Скрининг и оценка селекционного материала новыми методами позволит подробно изучить особенности сортов, хорошо адаптированных в тех или иных климатических условиях, создать коллекции, в которых будут дискретно представлены признаки, составляющие "функциональную устойчивость" во всем спектре своих проявлений Это значительно облегчит селекционерам работу по подбору родительских пар и в дальнейшем выявление генотипов сочетающих нужные комбинации данных признаков

ВЫВОДЫ

1 Эффект изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП) т vitro отражает универсальную для многих абиотических стрессов адаптивную реакцию проростков озимой пшеницы и ячменя

2 На начальных этапах стрессового воздействия степень изменения ТАП т vitro коррелирует с рангом устойчивости сортов зерновых культур, что является молекулярно-кинетическим маркером для создания диагностического метода, применимого в селекционной практике

3 Изменение ТАП т vitro обусловлено варьированием в препаратах из стрессированных проростков озимой пшеницы и ячменя доли "тяжелых" полисом по отношению к моносомам

4 В препаратах суммарной РНК, выделенных в присутствии ионов Mg", частицы рибосомной РНК сохраняют "компактную" структуру, препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе, что позволяет использовать метод аффинной хроматографии в аналитических целях

5 Выход поли(А) мРНК из суммарной РНК проростков озимой пшеницы и озимого ячменя во втором цикле количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов, что было использовано в качестве молекулярно-кинетического маркера для создания диагностического метода

6 Распад мРНК т vitro осуществляется ассоциированной с транскриггтом РНКазой, очевидно входящей в состав устойчивого к традиционным депротеинизирующим агентам регулягорного нуклеопротеидного комплекса в 3' некодирующей зоне мРНК (3' РНПК)

7 Наличие 3' РНПК в составе мРНП обусловливает эффект аффинно-адсорбционного фракционирования пула мРНК в процессе хроматографии на поли(У)-сефарозе

8 Метод аффинно-адсорбционной (АА) хроматографии позволяет дифференцировать и количественно оценивать свободные и полисомные мРНК в пуле информационных РНК

9 Инкубация препаратов суммарной РНК перед АА хроматографией позволяет дифференцировать популяции мРНК в составе фракций и, кроме того, выявлять присутствующую в некоторых тканях так называемую "скрытую" группу молекул, не сорбировавшихся на поли(У)-сефарозе в обычных условиях

10 Наличие 3' РНПК в составе мРНП программирует не только дифференциальный распад информационной молекулы, но и изменение ее функционального состояния in vivo

11 Динамика количественного изменения фракций свободных и полисомных мРНП коррелирует с рангом стрессоустойчивости сортов, что может быть использовано в качестве молекулярно-кинетического маркера для создания диагностического метода

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

Метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур, основанный на определении динамики количественного изменения доли тяжелых полисом в процессе стрессового воздействия, рекомендуется для применения в селекционной практике

Метод аффинно-адсорбционной хроматографии является перспективным для разработки на его основе лабораторных молекулярных методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодической реакции злаков

В области фундаментальных исследований рекомендуется сочетание возможностей метода АА хроматографии с традиционными молекулярно-биологическими методами, что позволит исследователям получать ранее недоступную информацию

Рекомендуется, на основе предложенных методов разработать технологию комплексной оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Плотников В К Влияние теплового шока на белоксингезирующий аппарат зерна обычной и опак-2 кукурузы/ В К Плотников, В И Киль, В А Бибишев, Б Н Новиков//Физиология растений -1990 -Т 37,- № 2, -С 302-307

2 Киль В И Неспецифический прирост трансляционной активности т vitro полисом ячменя и пшеницы/ В И Киль, В.А. Бибишев, В К Плотников //Физиология растений, -1991 -Т 38 -№4 -С 730-735

3 Плотников В К Дифференциальная стабильность мРНК m vitro, как показатель физиологического состояния растений / В К Плотников, Н Б Бакалдина, В.А Бибишев //Материалы 2-го Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", -Пущино, -1993, -С 88

4 Plotnikov V К Decay of mRNA by affinity chromatography as reflect of plant physiology state / V К Plotnikov, N В Bakaldina, V A Bibishev //16-th International Congress of Biochemistry and Mol Biology, -New Delphi, India, -1994, -P 115

5 Плотников В К, Бакалдина Н Б, Бибишсв В.А. "Способ диагностики физиологическог состояния зерновых культур" Патент РФ (по заявке №93-03 2022/13 от 17 06 93) №2084133 о 20 07 1997

6 Плотников В К Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов растений влияни стрессов на стабильность мРНК т vitro/ В К Плотников, Н Б Бакалдина, Б Н Новиков, Ж В Алексеенко, В.А.Бибишев, С JI Полежаев, В Г Рядчиков // Генетика, -1998, -№9, -С 1205 1211

7. Бибишев В.А. Хроматографическое разделение мРНК свободных и полисомны информосом, как метод изучения реакции злаковых на стрессовое воздействие/ В.А Бибише //Сборник научных трудов посвященный 100-летию В А Невинных -Краснодар, -2000, -С 208 214

8 Бибишев В.А. Распад рРНК in vitro, как индикатор интенсивности синтеза белка клетке/ В.А. Бибишев, Б Н Новиков, Ж В Алексеенко//Материалы научно-практическо" конференции "Зеленая революция П П Лукьяненко" -Краснодар -2001 -С 527-533

9 Бибишев В.А Фракционирование пула мРНК свободных и полисомных информосом, к;, метод оценки хозяйственно полезных признаков зерновых / В А. Бибишев //Материалы Всероссийской конференции Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания здоровья человека -Ставрополь,-2001 -С 18-19

10. Бибишев В А Изучение молекулярного механизма устойчивости злаковых к неблагоприятным абиотическим воздействиям/ В.А. Бибишев //Материалы Всероссийской конференции Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека -Ставрополь, -2001 -С 20

11 Давоян Р О Цитологическая и биохимическая характеристика новых интрогрессивных линий озимой мягкой пшеницы/ Р А Давоян, И В Бебякина, Э Р Давоян, В.А Бибишев//Наука Кубани, 2007 №1 С 40-43

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

Поли(А) мРНК - толиаденилированная матричная кислота

ПЭГ-8000 - полиэтиленгликоль-8000

МАК - метилированный альбумин кизельгур

ТАП in vitro - трансляционная активность полирибосом in vitro

РАВР - poly(A)-binding protein

мРНП - матричные рибонуклеопротеиды

АА хроматография - аффинно-адсорбционная хроматография на поли(У)-сефарозе ЗТНПК - регуляторный нуклеопротеидный комплекс в 3' некодирующей зоне поли(А)мРНК НПЦ-хромаггография - нуклеопротеид целитная хроматография

Отпечатано в типографии «Картика» 350000 г Краснодар ул Коммунаров 73/1 Тираж 100 заказ5119

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бибишев, Владимир Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Клеточное ядро: - уровни регуляции экспрессии генома.

1.1.1 Регуляция экспрессии генома на эпигенетическом уровне.

1.1.2. Регуляция экспрессии генома на уровне транскрипции.

1.1.3.Регуляция экспрессии генома на уровне процессинга пре-мРНК.

1.1.4. Дифференцированный транспорт мРНК в цитоплазму.

1.2 Цитоплазма: - уровни регуляции экспрессии генома.

1.2.1.Поступление мРНК в цитоплазму.

1.2.2. Цитоплазматические мРНП.

1.2.3. Компартментализация мРНК в клетке.

1.2.4. Регуляция экспрессии генома на уровне трансляции.

1.2.5. Сигнальные системы клеток растений.

1.3. Смена наборов синтезирующихся белков в ответ на воздействие экзо и эндогенных факторов.

1.4. Методические подходы к изучению белоксинтезирующего аппарата эукариотических клеток и стабильности мРНК.

1.5. Методы оценки стрессоустойчивости растений в селекционной практике.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Подготовка растительного материала.

2.2. Визуализация зоны интенсивного деления клеток проростков.

2.3. Трансляция in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

2.4. Трансляция in vitro в лизате из ретикулоцитов кролика.

2.5. Выделение полирибосом.

2.6. Введение in vivo радиоактивной метки в мРНК проростков.

2.7. Воздействие экзогенных фитогормонов.

2.8.Выделение суммарной РНК.

2.9. Нуклеопротеид - целитная хроматография.

2.10.Аффинная хроматография на поли(У)-сефарозе.

2.11. Аффинно-адсорбционная хроматография на поли(У)-сефарозе.

2.12.Электрофоретический анализ РНК.

3. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКОГО МАРКЕРА ОЦЕНКИ СКОРОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА СОРТОВ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР ПРИ СТРЕССОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ.

3.1. Эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП).

3.2. Эффект распада рибосомной РНК in vitro.

4. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ОЦЕНКИ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА ОСНОВЕ МЕХАНИЗМА, РЕГУЛИРУЮЩЕГО ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И СТАБИЛЬНОСТИ мРНК.

4.1. Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro.

4.2. Метод аффинно - адсорбционного (АА) фракционирования пула поли(А) мРНК растений.

4.3. Принципы АА фракционирования полинуклеотидов.

4.4. Функциональные особенности поли(А) мРНК фракций, получаемых в процессе А А хроматографии.

4.5. "Скрытая" группа поли(А) мРНК.

4.6. Модель механизма регуляции белкового синтеза у растений при стрессе.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур"

Влияние неблагоприятных погодных условий в период вегетации растений является одной из главных причин снижения урожаев зерновых культур. Актуальная задача современной селекции - создание стрессоустойчивых и высокоурожайных сортов. Однако селекционная работа, ведущаяся на этом направлении, сопряжена с определенными сложностями, связанными с тем, что более устойчивые формы чаще всего обладают пониженной продуктивностью. Найдена обратная зависимость между степенью устойчивости организма и интенсивностью обмена веществ, что объясняется уходом растений в вынужденный покой (наиболее распространенный механизм, обеспечивающий неспецифическую устойчивость) [Удовенко и Гончарова, 1982 с.144]. Кроме того, для Краснодарского края в зимний период характерны резкие колебания температуры, частые оттепели, вызывающие уменьшения глубины вынужденного покоя, и соответственно, снижение уровня неспецифической устойчивости озимых культур, а в весенний период не редки заморозки в первой половине и засуха во второй.

Для таких условий возделывания необходимы сорта, обладающие повышенной способностью к адаптации, т.е. приспособительными реакциями, связанными с оперативной регуляцией интенсивности физиологических процессов в ответ на изменение внешнего воздействия - так называемой "функциональной устойчивостью" [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995; Маймистов, 2001]. Причем, у сортов зерновых культур повышенная "функциональная устойчивость" может сочетаться с хорошей урожайностью, т.к. высокая интенсивность физиологических процессов является так же основой продуктивности [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995].

Селекционеры в своей работе по созданию стрессоустойчивых сортов вынуждены ориентироваться, как правило, только на конечный результат множества адаптивных реакций, используя в качестве критерия оценки генотипов - количество выживших при стрессе растений и степень повреждения клеток и тканей [Пучков, Набоков, 2001]. При этом вне их поля зрения остается генетически детерминированный вклад отдельных процессов и механизмов в формирование адаптивного ответа, что не позволяет выявить лимитирующие стрессоустойчивость конкретного генотипа этапы.

Стрессоустойчивость или способность растений адаптироваться к неблагоприятным условиям представляет собой сложный комплекс функционально связанных биохимических, физиологических и морфологических признаков определяющих устойчивость соответственно - на молекулярном, клеточном, организменном и ценотическом уровнях [Удовенко, Гончарова, 1982; Федулов, 1994].

Безусловно, есть необходимость создания методов подробной диагностики всех элементов стрессоустойчивости. Созданы диагностические методы, которые, кроме морфологической оценки, позволяют судить об уровне стрессоустойчивости растений по изменению физиологических и биохимических процессов [Сергеева, 1971; Федулов, 1994; Павлов, Стрельцов, 1997]. Эти методы расширяют возможности исследователя в получении информации о своем селекционном материале.

Использование молекулярно-биологических подходов позволяет изучать более высокий уровень регуляции экспрессии генома на пути передачи информации от ДНК к признаку, что открывает возможности разработки принципиально новых критериев оценки генотипов и, вероятно, позволит непосредственно выявлять причины тех или иных фенотипических проявлений.

При отборе генотипов с повышенной "функциональной устойчивостью" необходимо оценивать две основных составляющих этой устойчивости -способность растения своевременно реагировать на воздействие стрессового фактора и осуществлять адаптационные изменения адекватно этому воздействию, перестраивая клеточные обмен веществ и структуру.

Очевидно, что чем раньше произойдет распознавание растениями неблагоприятного воздействия, тем быстрее будет запущен комплекс реакций, направленный на минимизацию негативных последствий от стресса. Этот комплекс однотипных реакций, развивающийся в растительной клетке независимо от конкретного вида стресса, получил название неспецифический адаптивный синдром [Браун, Моженок, 1987; Пахомова, 1995]. Среди основных составляющих этого комплекса, таких как - накопление свободных аминокислот, увеличение активности окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, важнейшими являются замедление белкового синтеза и следующее за этим изменение спектра синтезируемых белков.

Создание диагностического метода предназначенного оценить какой-нибудь процесс в динамике, предполагает разработку соответственного маркера, так же являющегося процессом, функцией. Этот тип маркеров получил название молекулярно-кинетических [Плотников, 2001].

Уверенно маркировать на уровне рецепции такой признак, как способность растения своевременно реагировать на воздействие стрессового фактора, представляется достаточно сложным, т.к. информация о нем интегрально воспринимается сразу несколькими сигнальными системами клетки [Тарчевский, 2002. Стр.153.]. Легче это сделать, определяя присущий конкретному генотипу временной интервал от начала стрессового воздействия до появления первых адаптивных реакций, проявляющихся в соответствующих изменениях интенсивности процесса трансляции. Очевидно, что это, в первую очередь, отразится на полирибосомах. Поэтому, изучение изменений, происходящих в препаратах мРНП из стрессированных растений, предшествовало разработке соответствующего маркера и далее -диагностического метода.

Другой признак - способность адекватно стрессовому воздействию осуществлять адаптивные изменения связан, в широком смысле, с перепрограммированием экспрессии генома на всех уровнях от транскрипции до трансляции и даже посттрансляционной модификации белков [Дубинин, 1989]. Однако особое значение имеет коррекция процесса трансляции осуществляемая на самой начальной стадии стрессового воздействия. Такая коррекция во многом определяет эффективность всего адаптивного ответа, т.к. обычно именно на этом этапе растения получают наибольшие повреждения.

Адаптивные процессы в клетке в диапазоне от тонкой настойки до кардинальных изменений метаболизма модулируются изменениями в спектре синтезирующихся белков. В свою очередь, качественный состав белков меняется в результате удаления из процесса трансляции одних видов мРНК при деградации [Клячко, 1991; Плотников, 1992; Gutierrez et al., 1999] или потере активности [Stuger et al., 1999] и напротив, вовлечения в трансляцию других - при их активации [Овчинников и др., 2001].

Очевидно, что существует молекулярный механизм, обеспечивающий изменения в составе транслирующихся мРНК адекватные изменению внешних условий. С определенной долей уверенности можно охарактеризовать некоторые особенности этого механизма. Во-первых - его очень древнее происхождение. Самой возможностью существования и развития эукариотическая клетка обязана способности оперативно реагировать на изменение внешних условий. Во-вторых, управление механизмом осуществляется не ядром, а цитоплазмой, о чем можно заключить по скорости появления стрессовых белков [Войников, 1989; Кулаева, 1997]. В третьих -функционирование механизма должно быть основано на очень простых принципах, т.к. только это может объяснить его высокую надежность при управлении, столь сложной системой, как эукариотическая клетка.

Тем не менее, в настоящее время в мире не существует общепризнанной или хотя бы просто убедительной гипотезы описывающей функционирование такого механизма, поэтому для поиска и разработки молекулярных маркеров, позволяющих выявлять генотипы, обладающие интересующими нас качествами, были проведены глубокие фундаментальные исследования в этой области.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов, принимающих участие в формировании адаптивного ответа у сортов озимой пшеницы и ячменя, поиск молекулярных маркеров и создание на их основе методов, позволяющих диагностировать физиологическое состояние и определять уровень устойчивости растений к различным стрессам. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучить влияние различных абиотических стрессов на изменение трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом из проростков озимого ячменя и озимой пшеницы;

- выявить зависимость между рангом стрессоустойчивости сорта и изменением трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом;

-. исследовать вопрос о роли поли(А) последовательностей мРНК в определении стабильности и функциональной активности информационных молекул;

- изучить взаимосвязь между изменением физиологического состояния растений и стабильностью мРНК.

- разработать диагностический метод оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- обнаружен эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полисом in vitro. Установлено, что эффект обусловливается изменением доли "тяжелых" полисом в препаратах мРНП растений. Предполагается, что эффект отражает реакцию замедления интенсивности белкового синтеза, универсальную для начальной стадии воздействия различных видов абиотических стрессов;

- обнаружен эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro. Показано, что эффект связан с наличием ассоциированной с поли(А) мРНК нуклеазы, очевидно, входящей в состав регуляторного нуклеопротеидного комплекса локализованного в 3' некодирующей зоне макромолекулы (З'РНПК);

- установлено, что дифференциальный распад мРНК количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов;

- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии на поли(У)-сефарозе препаратов РНК, позволяющий: специфически фракционировать пул цитоплазматических поли(А) мРНК; количественно разделять поли(А) мРНК свободных (неактивных) и полисомных мРНП; выявлять популяции мРНК в составе фракций; изучать, присутствующую в клетках апикальной меристемы листа, группу поли(А) мРНК не сорбирующихся на поли(У)-сефарозе без предварительной специфической инкубации; предложена модель механизма "оперативного" изменения функционального состояния и стабильности мРНК при стрессе. Научно - практическая ценность работы.

- разработан метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов озимого ячменя и озимой пшеницы, пригодный для массового скрининга; создан метод диагностики физиологического состояния сельскохозяйственных растений, на основе выхода поли(А)мРНК во втором цикле хроматографии;

- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии РНК на поли(У)-сефарозе, перспективный для создания на его основе новых способов оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур;

- созданы предпосылки для разработки технологии комплексной оценки стрессоустойчивости сортов озимого ячменя и озимой пшеницы.

Основные положения, выносимые на защиту.

- изменение трансляционной активности полисом является универсальной адаптивной реакцией растений, характерной для начального периода большинства видов абиотических стрессов;

- наличие ассоциированных с мРНК регуляторных нуклеопротеидных комплексов (3 'РНПК), влияющих на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, специфически отражается на характере фракционирования информационных молекул в процессе аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе;

- регуляторные нуклеопротеидные комплексы (З'РНПК) определяют "запрограммированность" пула цитоплазматических мРНП растений на обеспечение перехода клетки в различные стационарные режимы функционирования;

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1990; II симпозиуме "Новые направления биотехнологии растений", Пущино, 1993; 16th International Congress of Biochemistry and Mol. Biology, New Delhi, India 1994; 3 международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1995; II съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997; региональной конференции "Перспективы внедрения современных биотехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства", Ставрополь, 2003.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 153 страницах, содержит 13 таблиц и 27 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Бибишев, Владимир Александрович

ВЫВОДЫ

1. Эффект изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП) in vitro отражает универсальную для многих абиотических стрессов адаптивную реакцию проростков озимой пшеницы и ячменя.

2. На начальных этапах стрессового воздействия степень изменения ТАП in I vitro коррелирует с рангом устойчивости сортов зерновых культур, что является молекулярно-кинетическим маркером для создания диагностического метода, применимого в селекционной практике.

3. Изменение ТАП in vitro обусловлено изменением в препаратах из стрессированных проростков озимой пшеницы и ячменя доли "тяжелых" полисом по отношению к моносомам.

4. В препаратах суммарной РНК, выделенных в присутствии ионов Mg"^, частицы рибосомной РНК сохраняют "компактную" структуру, препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе,! что позволяет использовать метод аффинной хроматографии в аналитических целях.

5. Выход поли(А) мРНК из суммарной РНК проростков озимой пшеницы и озимого ячменя во втором цикле количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов, что было использовано в качестве молекулярно-кинетического маркера для создания диагностического метода.

6. Распад мРНК in vitro осуществляется ассоциированной с транскриптом РНКазой, очевидно входящей в состав устойчивого к традиционным депротеинизирующим агентам регуляторного нуклеопротеидного комплекса в 3' некодирующей зоне мРНК (3' РНПК).

7. Наличие У РНПК в составе мРНП обусловливает эффект аффинно-адсорбционного фракционирования пула мРНК в процессе хроматографии на поли(У)-сефарозе.

8. Метод аффинно-адсорбционной (АА) хроматографии позволяет дифференцировать и количественно оценивать свободные и полисомные мРНК в пуле информационных транскриптов.

9. Инкубация препаратов суммарной РНК перед АА хроматографией позволяет дифференцировать популяции мРНК в составе фракций и, кроме того, выявлять присутствующую в некоторых тканях так называемую "скрытую" группу молекул, не сорбировавшихся на поли(У)-сефарозе в обычных условиях.

10. Наличие У РНПК в составе мРНП программирует не только дифференциальный распад информационной молекулы, но и изменение ее функционального состояния in vivo.

11. Динамика количественного изменения фракций свободных и полисомных мРНП коррелирует с рангом стрессоустойчивости сортов, что может быть использовано в качестве молекулярно-кинетического маркера для создания диагностического метода.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур, основанный на определении динамики количественного изменения доли тяжелых полисом в процессе стрессового воздействия, рекомендуется для применения в селекционной практике.

2. Метод аффинно-адсорбционной хроматографии является перспективным для разработки на его основе лабораторных молекулярных методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодической реакции злаков.

3. В области фундаментальных исследований рекомендуется сочетание возможностей метода АА хроматографии с традиционными молекулярно-биологическими методами, что позволит исследователям получать ранее недоступную информацию.

4. Рекомендуется, на основе предложенных методов, разработать технологию комплексной оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плотников В.К. Влияние теплового шока на белоксинтезирующий аппарат зерна обычной и опак-2 кукурузы/ В.К. Плотников, В.И. Киль,

B.А. Бибишев, Б.Н. Новиков//Физиология растений -1990. -Т.37,- № 2,

C.302-307. !

2. Киль В.И. Повышение трансляционной активности полисом как неспецифическая реакция растений на стрессы: генотипический полиморфизм./ В.И. Киль, В.А. Бибишев, В.К. Плотников // Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", -Москва, -1990, -С.82.

3. Плотников В.К. Молекулярно-генетические аспекты термоадаптации созревающего зерна кукурузы./ В.К. Плотников, В.И. Киль, В.А. Бибишев, Б.Н. Новиков, Ж.Р. Парадес //Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов"^ -Москва,-1990, -С. 167.

4. Плутахин Г.А. К вопросу о роли рибонуклеаз в регуляции активности генов/ Г.А. Плутахин, Б.Н. Новиков, В.А. Бибишев, В.К Плотников // Материалы 2-го Всесоюзного совещания "Генетика развития".- Ташкент, -1990, -С.138.

5. Киль В.И. Влияние стрессов на трансляционную активность полисом ячменя и пшеницы/ В.И. Киль, В.А. Бибишев, В.К. Плотников //Материалы 2-го Всесоюзного общества физиологов растений.// -Минск, -1990, -С.97.

6. Киль В.И. Неспецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом ячменя и пшеницы/ В.И. Киль, В.А. Бибишев, В.К. Плотников //Физиология растений, -1991. -Т.38. -№4. -С.730-735

7. Плотников В.К. Дифференциальная стабильность мРНК in vitro, как показатель физиологического состояния растений / В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, В.А.Бибишев //Материалы 2-го Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", -Пущино, -1993, -С.88.

8. Plotnikov ,V.K. In vitro messenger RNA differential stability as show of plant physiological state/ V.K Plotnikov., N.B. Bakaldina, V.A.Bibishev //Second symposium "Trends in plant biotechnology". -Pushchino, Russia, -1993,-P.326.

9. Plotnikov V.K. Decay of mRNA by affinity chromatography as reflect of plant physiology state./ V.K Plotnikov., N.B. Bakaldina, V.A.Bibishev //16-th International Congress of Biochemistry and Mol. Biology, -New Delphi, India,-1994,-P. 115.

Ю.Плотников B.K. Некоторые аспекты молекулярного действия препарата фуролан и янтарной кислоты на рост яровой пшеницы/ В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, Ж.В. Алексеенко, В.А.Бибишев, Б.Н. Новиков, Н.И. Ненько //МатериалыЗ-й международной конференции "Регуляторы роста и развития растений". -М.-1995. -С. 101-102. П.Плотников В.К. Дифференциальная стабильность мРНК как молекулярно-генетический маркер интенсивности роста пшеницы/В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, В.А.Бибишев, Ж.В. Алексеенко//Сборник научных трудов КНИИСХ, посвященный 95-летию акад. П.П.Лукьяненко. -Краснодар, -1996. -С. 253-260. 12.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Бибишев В.А. "Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур" Патент РФ (по заявке №93-03 2022/13 от 17.06.93) №2084133 от 20.07.1997. В.Плотников В.К. Дифференциальная стабильность мРНК эукариот в ommp-системе: основа новых методов в биотехнологии / В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, Б.Н. Новиков, Ж.В. Алексеенко, В.А.Бибишев, C.JI. Полежаев, В.Г Рядчиков // Материалы 2-го съезда биохимического общества РАН, -1997, -ч.2, -С. 525. Н.Плотников В.К. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: влияние стрессов на стабильность мРНК in vitro/ В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, Б.Н. Новиков, Ж.В. Алексеенко,

B.А.Бибишев, C.JI. Полежаев, В.Г Рядчиков // Генетика, -1998, -№9,

C.1205-1211.

15.Полежаев С. Jl. Влияние качества аминокислотного питания на стабильность мРНК животных/С.Л. Полежаев, М.О.Омаров, В.Г.Рядчиков, В.К.Плотников, Н.Б.Бакалдина, В.А.Бибишев, Б.Н.Новиков, Ж.В.Алексеенко// Сборник научных трудов РАСХН. -М. -1998. -С.248-255.

16.Плотников В.К. Влияние качества аминокислотного питания на стабильность мРНК животных/ В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, Б.Н. Новиков, Ж.В. Алексеенко, В.А.Бибишев, М.О. Омаров, С.Л. Полежаев, В.Г Рядчиков //Сборник научных трудов РАСХН, -М: -1998, -С.248-258.

17. Бибишев В.А. Хроматографическое разделение мРНК свободных и полисомных информосом, как метод изучения реакции злаковых на стрессовое воздействие/ В.А. Бибишев //Сборник научных трудов посвященный 100-летию В.А.Невинных. -Краснодар, -2000, -С.208-214.

18.Бибишев В.А. Распад рРНК in vitro, как индикатор интенсивности синтеза белка в клетке/ В.А. Бибишев, Б.Н. Новиков, Ж.В.Алексеенко//Материалы научно-практической конференции "Зеленая революция П.П.Лукьяненко". -Краснодар. -2001. -С. 527-533.

19.Бибишев В.А Фракционирование пула мРНК свободных и полисомных информосом, как метод оценки хозяйственно полезных признаков зерновых./ В.А. Бибишев //Материалы Всероссийской конференции "Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека". -Ставрополь, -2001. -С.18-19.

20.Бибишев В.А Изучение молекулярного механизма устойчивости злаковых к неблагоприятным абиотическим воздействиям/ В.А. Бибишев //Материалы Всероссийской конференции "Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека". -Ставрополь, -2001. -С.20.

21.Давоян P.A. Цитологическая и биохимическая характеристика новых интрогрессивных линий озимой мягкой пшеницы/ Р.А.Давоян, И.В.Бебякина, Э.Р.Давоян, В.А.Бибишев//Наука Кубани, 2007. №1. С.40-43.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Бибишев, Владимир Александрович, Краснодар

1. Авдонин П.В. Рецепторы и внутриклеточный кальций/П.В.Авдонин, В.А.Ткачук//М.: Наука, -1994. -288с.

2. Айтхожин М.А., Искаков Б.К. Информосомы растений. Алма-Ата: Наука, -1982.-181с.

3. Аравин A.A. Роль двухцепочечных РНК в сайленсинге генов у эукариот./А.А. Аравин, М.С.Кленов, В.В.Вагин, Я.М.Розовский, В.А.Гвоздев.//Мол. Биол. -2002, -Т.36, -С. 240-251.

4. Ашмарин И.П. Молекулярная биология./И.П.Ашмарин//Л. -1977. -159с.

5. Баршевская Т.Н. Неспецифическая деградация РНК в присутствии ионов магния./Т.Н.Баршевская, Л.Е.Горюнова, Р.Ш.Бибилашвили//Мол. Биол. -1987. -Т.21. -№5. -С.1235-1241.

6. Бекман Э.М. Автокаталитическая деградация РНК: влияние различных факторов на динамику процесса/Э.М. Бекман, М.Ф.Денисенко, М.Ю.Григорьев, В.Я.Арион//Мол. Биол. -1986,- Т.20, -С.527-535.

7. Белицина Н.В. Информационные рибонуклеиновые кислоты дифференцирующихся животных клеток./Н.В.Белицина, М.А.Айтхожин, Л.П.Гаврилова, А.С.Спирин//Биохимия, -1964. -Т.29. -С.363-374.

8. Браун А.Д. Неспецифический адаптивный синдром клеточной системы./ А.Д. Браун, Т.П. Моженок Л.; Наука, -1987. -232с.

9. Войников В.К. Температурный стресс и митохондрии растений.// Новосибирск: "Наука". Сиб. Отд. -1987. -207с.

10. Войников В.К. Стрессовые белки растений при действии высокой и низкой температуры./В.К. Войников//Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, -1989, -С.5-19.

11. Гвоздев, В.А. Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции/ В.А. Гвоздев// Соросовский образов, журн. -1996. -№2. -С. 2231.

12. Гвоздев, В.А. Регуляция активности генов при созревании мРНК./В.А. Гвоздев// Соросовский образов, журн. -1996. -№12. -С. 11-18.

13. Генкель П.А. Диагностика морозоустойчивости растений по глубине покоя их тканей и клеток/П.А.Генкель, Е.З.Окнина// Методы. -М.: Изд-во АН СССР,-1954. С.36.

14. Генкель П.А. Состояние покоя и и морозоустойчивость плодовых растений/П.А.Генкель, Е.З.Окнина// Методы. -М.: Наука, -1964. 241 с.

15. Гиляров М.С. (Главный редактор) Биологический энциклопедический словарь. М.: "Советская энциклопедия". -1986. -831с.

16. Гречкин А.Н. Сигнальные системы клеток и геном./ А.Н. Гречкин, И.А.j

17. Тарчевский// Биоорган, химия. -2000. -Т.26, -№10. -С.779-781.

18. Дубинин Н.П. Вечное движение/Н.П. Дубинин//М.: Политиздат, -1989, -448с.

19. Едрева A.M. Стрессовые белки растений./А.М.Едрева//Физиол. Раст. -1991. -Т.38. -С.788-800.

20. Ельская A.B. Регуляция биосинтеза белка у эукариот/А.В. Ельская, Н.Ф. Стародуб, Ф.П. Потапов, М.И. Коваленко, Г.В. Овчаренко, М.Ю. Оболенская, JI.JI. Иванов//Киев: Наукова думка, -1990, -280 с.

21. Ельская A.B. Регуляция белкового синтеза у высших организмов: факты игапотезы/А.В. Ельская//Мол. Биол. -1999. -Т. 33, -№6. -С. 1043-1053

22. Зак Е.А. Полисомы растений, связанные с актиновым цитоскелетом/ Е.А. Зак, О.И. Соколов, Н.Л. Клячко// Докл. РАН. -1996. -Т. 343. -С. 37-39.

23. Иванов П.А. Стрессовые гранулы: РНП-содержащие цитоплазматические тельца, возникающие в ответ на стресс. Состав и механизмы формирования./П.А. Иванов, Е.С.Нежина//Мол. Биол. -2006, -Т.40, -№6, -С.937-944.

24. Карпов B.JI. ДНК, хроматин, гистоновый код./ B.JI. Карпов// Вестник Рос. Акад. наук.- 2003. -Т. 73. -№6. -С. 506-513.

25. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны/В.И.Кефели//-М: Наука. -1974. -252 с.

26. Киль В.И. Неспецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом из проростков ячменя и пшеницы под действием стрессов/В.И.Киль, В.А.Бибишев, В.К.Плотников//Физ. Раст. -1991, -Т. 38, -№4. -С. 730-735.

27. Клячко, H.JI. Матричные РНК и трансляционный контроль у растений / H.JI. Клячко//Физиол. и биохим. культурных растений. -1991. -Т.23. -С. 419426.

28. Клячко, H.JI. Белоксинтезирующий аппарат и цитоскелет./ H.JI. Клячко//Физиол. раст. -1998. -Т.45. -№2. -С. 208-217.

29. Клячко, H.JI. Фитогормоны и цитоскелет./ H.JI. Клячко//Физиол. раст. -2003. -Т.50. -№3. -С. 475-480.

30. Костомарова, A.A. Ядерно-цитоплазматические взаимодействия при трансплонтации ядер у зародышей амфибий и рыб./ A.A. Костомарова//Биология развития и управление наследственностью. М.: Наука, -1986. -С. 180-192.

31. Кравцов A.B. Способ определения морозостойкости растений/А.В.Кравцов//Авт. св. СССР, кп А0д7/00 А01Н/04 №897162 от 9 апреля 1988.

32. КубаренкоА.В. GTFa3bi аппарата трансляции./А.В. Кубаренко, П.В.Сергеев, М.В.Роднина//Мол. Биол. -2005, -Т.39, -С.746-761.

33. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу.// Соросовский образовательный журнал, -1997, -№2, -С.5-13.

34. Кумаков P.A. Физиология формирования урожая яровой пшеницы и проблемы селекции./ P.A. Кумаков // С.-х. биол. -1995. -№5. -С. 3-19.

35. Лихтенштейн A.B. Исследование рибонуклеопротеидных частиц методом хроматографии РНК на колонке нуклеотид-целита./ A.B. Лихтенштейн; Р.П. Алехина, B.C. Шапот//Мол. Биол. -1976, -№1. -TIO. -С.55-62. ;

36. Лихтенштейн A.B. Ядерно-цитоплазматические отношения и транспорт РНК./ A.B. Лихтенштейн; B.C. Шапот// Усп. Совр. Биол. -1982, -Т.94. -№1. -С. 3-20.

37. Льюин Б. Гены./ Б. Льюин; М. "Мир"-1987. -544 с.

38. Маймистов В.В. Физиологические основы засухоустойчивости пшеницы. (Обзор)/ В.В.Маймистов // Материалы научно-практической конференции «Зеленая революция П.П. Лукьяненко». -Краснодар, -2001, -С.495.

39. Маниатис Т. Молекулярное клонирование/Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук//М.: "Мир". -1984, -480с.

40. Ничипорович A.A. Фотосинтетическая деятельность растений как основа их продуктивности в биосфере и земледелии./ А.А.Ничипорович //Фотосинтез и продуктивный процесс. -М. -1988. -САН

41. Новиков Б.Н. Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов в селекционном процессе/Б.Н.Новиков//Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. -Краснодар. -2000.

42. Овчинников М.А. Что и как закодировано в мРНК/М.А. Овчинников// Соросовский Образов. Журнал. -1998. -№4. -С. 10-18.

43. Овчинников Л. П. Мажорные белки мРНП в структурной организации и функционировании мРНК в клетках эукариот./Л.П.Овчинников; М.А.Скабкин; П.В.Рузанов; В.М.Евдокимова//Мол. Биол.- 2001. -Т.35. -№4. -С.548-558.

44. Овчинников Ю.А. Био-органическая химия/ Ю.А. Овчинников: М. «Просвещение» -1987, -815 с.

45. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. /Л.А. Остерман//М.: Наука, -1983. -303с

46. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот /Л.А. Остерман//М.: Наука,-1985. -536с. ;

47. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений/З.П.Паушева//М: "Колос",-1974, -С.111-113.

48. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса иIнеспецифический адаптивный синдром у растений./ В.М Пахомова// Цитология. -1995. -Т.37.-С.66-91.

49. Питерман М. Физические и химические свойства рибосом/М. Питерман// М. Мир.-1967. -288с.

50. Плотников, В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот./ В.К. Плотников// Успехи современной биологии. -1992.-Т. 123.-С.98-108.

51. Плотников В.К. Сорт озимой пшеницы "Краснодарская 39" источник открытий в молекулярной биологии растений./ В.К. Плотников// Материалы научно-практической конференции «Зеленая революция П.П. Лукьяненко». -Краснодар, -2001,-С. 611-621.

52. Попов А.К. Использование хроматографии на колонке с поли(У)-целлюлозой для выделения эукариотической матричной РНК./А.К. Попов,

53. A.Р.Федотов, Г.А.Дворкин//Биохимия. -1975. -Т.40. -С.45-47.

54. Пучков, Ю.М. Прогресс в селекции зимостойких сортов озимой пшеницы на Кубани./Ю.М. Пучков; Г.Д. Набоков// Материалы научно-практической конференции «Зеленая революция П.П. Лукьяненко». -Краснодар, -2001, -С.43-59.

55. Пятыгин С.С. Сопряжение генерации потенциала действия в клетках растений с метаболизмом: современное понимание проблемы/С.С. Пятыгин,

56. B.А.Воденеев, В.А.Опритов//Усп. Совр. Биол. 2005, Т. 125, №5, С.520-528.

57. Самарина О.П. Выделение ядерных рибонуклеопротеидов, содержащих информационную РНК/ О.П. Самарина; И.С.Асриян; Г.П. Георгиев//Докл. Акад. Наук. СССР, -1965. -Т. 163, -С. 1510-1513.

58. Сергеева К.А. Физиологические и биохимические основы зимостойкости древесных растений./К.А. Сергеева// М.: "Наука" -1971, -169с.

59. Сингер, М. Гены и геномы/ М. Сингер, П. Берг; М. «МИР» -1998. -Т.2, -391с. !135 ;

60. Соколова В.А. Новый лабораторно-полевой способ оценки зимнихповреждений малины/В.А.Соколова//Проблемы и пути адаптации растений к болезням и экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции. -Ленинград.-1981.-С.41-42.

61. Спирин А.С Биосинтез белка: Инициация трансляции./ A.C. Спирин// Соросовский Образов. Журн. -1999, -№5, -С. 2-7.

62. Спирин A.C. Биосинтез белка: регуляция на уровне трансляции./ A.C. Спирин// Соросовский Образов. Журн. -2000, -№5, -С. 2-7.

63. Спирин A.C. Рибонуклеиновые кислоты как центральное звено живой материи./А.С.Спирин// Вестник РАН. -2003, -Т.73, -№2, -С. 117-127.

64. Табатадзе Н.Г. О связи морозостойкости некоторых цитрусовых с РНКазной активностью клеточных органелл./Н.Г. Табатадзе, Д.И.Джохадзе//Физиол. Раст. -1982, -Т.29, -№6, -С. 1062-1066.

65. Тарчевский И.А Метаболизм растений при стрессе/ И.А. ТарчевскийЖазань, -"Фен" -2001, -447с.

66. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений./ И.А. Тарчевский.// М. "Наука" -2002. -294с.

67. Удовенко Г.В. Влияние экстремальных условий среды на структуру урожая с. -х. растений./ Г.В.Удовенко, Э.А.Гончарова // Л.: Гидрометеоиздат, -1982. -144с.

68. Федулов, Ю.П. Системный анализ морозоустойчивости озимых культур./ Ю.П. Федулов: автореф. дис. докт. биол. наук. Санкт-Петербург, -1994. -45с.

69. Хасигов П.З. Обнаружение дискретного распада поли(А)-сегментов мРНК/П.З.Хасигов, Б.А.Кузнецов, В.Ф.Глазков, А.Я.Николаев//Биохимия, -1979, -Т.44, -С.2245-2252.

70. Хеймс Б. Транскрипция и трансляция"/ Б. Хеймс и С. Хиггенс// М.: Мир, -1987.-399 с.

71. Хосино С. Новая функция эукариотического фактора терминации трансляции eRF3/GSPT: участие в процессе деградации мРНК/С. Хосино, Я. Араки, Т. Кобаси, Н. Учида, Т. Катада// Биохимия -1999 -Т. 64, -вып. 12, -с. 1621-1627.

72. Ченцов Ю.С. Ультраструктура клеточного ядраю/ Ю.С. Ченцов; В.Ю. Поляков: М. Наука, -1974, -246с.

73. Шайн С.С. Свет и развитие растений/ С.С. Шайн, //М. 1963, с. 126

74. Биологический энциклопедический словарь / Яблоков, А.В.и др.; гл. ред. М.С. Гиляров; М. "Советская энциклопедия ". -1986. -831с.I

75. Aaronson R.P. Isolation of nuclear pore complexes in association with a lamina./ R.P. Aaronson & G. Blobel//Proc. Nat. Acad. Sci. USA, -1975, -V. 72, -P. 1007-1011.

76. Abel S. Localization of RNA-degrading activity within vacuoles of cultured tomato cells/S. Abel, K. Glund//Physiol. Plant. -1986, -V.66, -P. 1163-1186.

77. Ainger K. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into Oligodendrocytes / K. Ainger, F. Avossa, F. Morgan, S. J. Hill, C. Barry, E. Barbarese, J. H. Carson//J. Cell. Biol. -1993. -V. 123. -P. 431-441.

78. Ajtkhozhin M.A. Informosomes of germinating wheat embryo./M.A. Ajtkhozhin, A.U.Akhanov, K.I.Doshanov//FEBS Left. -1973. -V.31, -P. 104-106.;

79. Ajtkhozhin M.A. Informosomes as a stored form of mRNA in wheat embryos./M.A. Ajtkhozhin, A.U.Akhanov, K.I.Doshanov/ FEBS Left. -1976, -V.66, -P. 124-126.

80. Acton G.J. Phytochrome controlled acid RNAse: an "attached" protein of ribosomes/G.J. Acton//Phytochemistry.- 1974, -V.13, -P.1303-1310.

81. Aviv H. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose/ H. Aviv, P. Leder//Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, -1972. -V.69. -P.1408-1412.

82. Bandyopadhyay R. Nuclease activity associated with mammalian in it's native state: possible basis for selectivity in mRNA decay/ R.Bandyopadhyay, M.Coutts, A.Krowczynska, G.Brawerman//Mol.and Cell. Biol. -1900. -N5. -P.2060-2069.

83. Barna B. Extracellular RNAse activity in healthy and rust infected wheat leaves/B. Barna, W.D.Ibental, R.Heitefuss//Phys. Mol. Plant Pathol. -1989, -V.35, -P. 151.

84. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function./D.P. Bartel//Cell, -2004, -V.l 16, -P.281-297.

85. Bassel G. J. Single mRNAs visualized by ultrastructural in situ hybridization are principally localized at actin filament intersections in fibroblasts./GJ. Bassel, C.M. Powers, K.L. Taneja, R.H. Singer//! Cell Biol. -1994. -V.126. -P. 863-876.

86. Benedetti A. Overexpression of eukaryotic protein synthesis initiation factor 4E in HeLa cells results in aberrant growth and morphology/A. Benedetti & R.E. Rhoads//Proc. Natl. Acad. Sci. -1990, -V.87, -№21, -P.8212-8216.

87. Berger S.L. Chromatin goes global/ S.L. Berger; G. Fersenfeld// Molecular Cell.-2001.-V.8.-P. 263-268.

88. Bernstein P. The poly(A)-binding protein complex is major determinant of mRNA stability in vitro./P Bernstein, S.W.Pelts, J.Ross//Mol. Cell Biol. -1989, -V.9, -P.659-670.

89. Black D.L. Pre-mRNA splicing in vitro requires intact U4/U6 small nuclear ribonucleoprptein/D.L. Black; J.A. Steitz//Cell. -1986. -V.46. -P. 697-704.

90. Bouget F. Localization of actin mRNA during the establishment of cell polarity and early cell divisions in Fucus tmbryos/F. Bouget, S. Gerttula, S.L. Shaw, R.S. quatrano//Plant Cell. -1996. -V.8. -P. 189-201.

91. Brawerman G. Characteristics and significance of the polyadenylate sequence in mammalian messenger RNA./ G. Brawerman // In: Progress in Nucl. Acid Res. And Mol. Biol. -1976,-V. 17,-P. 117-148.

92. Brown D.D. Gene expression in eukaryotes./D.D. Brown//Science. -V. 211. -P. 667-674.

93. Browing K.S. Determination of the amount of the protein synthesis initiation and elongation factors in wheat germ./ K.S. Browing, J. Humphreys, W. Hobbs // J. Biol. Chem. -1990, -V. 265, -№ 29, -P. 17967-17973.

94. Butzou J.J. Interaction of metal ions with nucleic acids and related compounds. XVII. On mechanism of degradation of polyribonucleotides andoligoribonucleotides by zinc (II) ions/JJ. Butzou, G.L. Eichhon//Biochemistry. -1971,-V.10, -P.2019-2027.

95. Byrne D. Half-lives of oat mRNA in vivo and in polysome-based in vitro system/D. Byrne, K.A.Seeley, J.T.Colbert/ZPlanta, -1993, -V.189, -P.249-256.

96. Calzone F.J. Regulation of protein synthesis in Tetrahymena: isolation and characterization of polysomes by gel filtration and precipitation at pH 5,3./ F.J. Calzone; R.C.Angerer; M.A.Gorovsky//Nucl. Acids Res. -1982. -V.10. -N6. -P.2145-2161.

97. Carol J. The cap-to-tail guide to mRNA turnover/J.Carol, M.Wilusz, M. Wormington, S.W.Pelts//Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2001, -V.2 -P.237-246.

98. Caruccio N. Purification of human polyribosome-associated 3' to 5' exoribonuclease/N. Caruccio, J. Ross//J. Biol. Chem. -1994, -V.269,- P.31814-31821.

99. Choi Y.D. Isolation of the heterogeneous nuclear RNA-ribonucleoprotein complex (hnRNP): A unique supramolecular assembly./ Y.D.Choi; G. Dreyfuss// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1984. -V. 81, -P. 7471-7475/

100. Clowes F.A. Apical meristems./F.A. Clowes//Blackwell Scientific Publications, Oxford. -1961. -P.249-256

101. Colbert R.A. Detection of mRNA coding for translational regulated heat-shock proteins in non-heat-shocked thymic lymphocytes/R.A. Colbert; D.A.Young//J. Biol. Chem. -1987, -V. 262, -N21, -P. 9939-9941.

102. Czaplinski K. The surveillance complex interacts with the translation release factors to enhance termination and degrade aberrant mRNAs/K. Czaplinski, M.J. Ruiz-Echevarria, S.V. Paushkin, X. Han, S.W. Peltz// Genes Dev. -1998, -V. 12, -P. 1665-1677.

103. Dalmay T. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by transgene but not by avirus/T. Dalmay, A.Hamilton, S.Rudd, S.Angell, D.C.Baulcombe//Cell. -2000, -V.101, -P.543-553.

104. Davidson E.H. Regulation of gene expression: Possible role of repetitive sequences./E.H. Davidson; R.J. Britten// Science.- 1979. -V. 204, -P. 1052-1059.

105. Davies E. Polyribosomes from peas. An improved method for their isolation in the absence of ribonuclease inhibitors/E. Davies, B.A. Larkins, R.H. Knight//Plant Physiol. -1972. -V.50. -N2. -P. 581.

106. Deutscher M.P The metabolic role of RNAses/ M.P. Deutscher//TIBS. -1988, -V.13, -P. 136-139.

107. Deutscher M.P. Ribonuclease multiplicity, diversity, and complexity/M.P. Deutscher//J. Biol. Chem. -1993, -V.268, -P.13011-13014.

108. Duncan R. Regulated phosphorylation and low abundance of HeLa cell initiation factor elF-4F suggest a role in translational control. Heat shock effects on elF-4F./R. Duncan, S.C. Milburn, J.W. Hershey// J.Biol.Chem. -1987, -№1. -P. 380388

109. Dworkin M.B. Cytoplasmic nonpolysomal ribonucleoproteins particles in sea urchin embryos and their relationship to protein synthesis/M.B. Dworkin, L.M.Rudensey, A.A.Infante//Proc. Nat. Acad. Sci. USA, -1977, -V.74, -P.2231-2235.

110. Elbashir S.M. RNA interference is mediated by 21 and 22-nucleotide RNAs/S.M. Elbashir, W.Lendeckel, T.Tuschi//Genes Dev. -2001, -V.15, -P. 188-200.

111. English J.J. Supression of virus accumulation in transgenic plants exhibition silencing of nuclear genes/J.J English, E.Mueller, D.C.Baulcombe//Plant Cell. -1996, -V.8, -P. 179-188.

112. Fahrenkrog B. Molecular architecture of the Yeast Nuclear Pore complex: Localization of Nsplp subcomplexes/ B. Fahrenkrog; E.C.Hurt; U. Aebi; N. Pante// J. Cell Biol. -1998 -V. 143, -P. 577-588.

113. Fan J. Global analysis of stress-regulated mRNA turnover by using cDNA arrays/J. Fan, X. Yang, W. Wang, I. Wood, W.H. Becker, M. Gorospe//Proc. Natl. Acad. Sci. -V. 99. -P. 10611-10616.

114. Fedoulov Y.P. System analysis of frost resistance in winter wheat and it s use in dreeding/Y.P.Fedoulov//Euphytica.-1998, -V.100.- P. 101-108.

115. Fire A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans/A. Fire, M.K.Montgomery, S.A.Kostas, S.E.Driver, S.S.Mello//Nature. -1998, -V.391, -P.806-811.

116. Franke, W.W. The nuclear envelope and the architecture of the nuclear periphery/W.W. Franke; U.Scheer; G.Krohne; E. Jarasch//J. Cell Biol. -1981. -V. 91. -P. 39-50.

117. Gallie D.R. Heat shock disrupts cup and poly(A+) tail function during translation and increases mRNA stability of introduced reporter mRNA ./ Gallie D.R., Caldwell C., Pitto L // Plant.Physiol. -1995, -V.108, -P. 1703-1713.

118. Godefroy-Colburn T. The role of mRNA competition in regulating translation. IV. Kinetic model/T Godefroy-Colburn & R.E. Thach// G. Biol.Chem. -V. 256, -P. 11762-11773

119. Gorlich D. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm./ D. Gorlich; U. Kutay// Annu.Rev. Cell Dev. Biol. -V.15, -P. 607-660.

120. Gott J.M. Function and mechanisms of RNA edition./J.M. Gott & R.B. Emeson// Annu. Rev. Genet. -V.34. -P. 499-531. j

121. Green P.J. Control of mRNA stability in higher plants/P.J. Green//Plant Physiol. -1993, -V.102,- P.1065-1070.

122. Gutierrez R.A. Current perspectives on mRNA stability in plants: multiple levels and mechanisms of control/R.A. Gutierrez , G.C.Macintosh, P.J.Green// Trends in Plant Sciences. -1999. -V.4. -P. 429-438/

123. Hardie D.G. Plant protein serine/threonine kinases: Classification and function/D.G. Hardie//Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. -1999. -V.50, -P.97-131.

124. Hannon G.J. RNA interference./G.J. Hannon//Nature, 2002, V.418, P.244-251.

125. Hieronymus H. A system view of mRNP biology/H. Hieronymus; P.A. Silver// Genes & Development -2004, -V. 18, -P. 2845-2860.

126. Hiriuchi T. Translational regulation of complement protein C 2 expression by differential utilization of the 5' untranslated region of mRNA/T. Hiriuchi, K.J. Macon, V.J. Kidd, J.E. Volanakis// J. Biol. Chem. -1990, -V. 265, -№ 2, -P. 65216524

127. Jenuwein T. Translating the histon code/ T. Jenuwein; C.D. Allis //Science. -2001V.293 .-P. 1074-1080.

128. Jia Y. Rapid transcript accumulation of pathogenesis-related genes during an incompatible interaction in bacterial speck disease-resistant tomato plants/Y. Jia; G.B. Martin// Plant Mol. Biol. -1999. -V. 40, -N3. -P. 455-465.

129. Johnson D.S. The intracellular localization of messenger RNAs/D.S. Johnson//Cell. -1995. -V. 81. -P 161-170.

130. Johnson R.R. Degradation of mRNAs during seed development/R.R. Johnson, M.E. Chaverra, H.J.Cranston, T.Pleban, W.E.Dyer//Plant Mol. Biol. -1999, -V.39, -P.823-833.

131. Kawai T. Global mRNA stabilization preferentially linked to translational repression during the endoplasmic reticulum stress response./T. Kawai; J.Fan; K. Mazan-Mamczarz; M. Gorospe//Mol. & Cell. Biol. -2004. -V. 24, -N 15. -P. 67736787.

132. Kedersha N. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability/N. Kedersha & P.Anderson//Biochem. Soc. Trans. -2002, -V.30, -P.963-969.

133. Keen J.D. Ribonucleoprotein infrastructure regulating the flow of genetic information between the genome and the proteom/J.D. Keen// Proc. Natl. Acad. Sci. -2001, -V. 98, -N 13. -P. 7018-7024.

134. Kislauskis E. Determinants of mRNA localization/E. Kislauskis, R.H. Singer//Curr. Opin. Cell. Biol. -1992. -V. 4. -P. 975-978.

135. MO.Kleene K.C. Transcription of similar sets of rare maternal RNAs and rare nuclear RNAa in sea urchin blastulae and adult coelomocytes/ K.C. Kleene; T. Humphreys//.!. Embryol. Exp. Morphol. -1985. -V. 85, -P. 131-149.

136. Korner C.G., Wormington M., Muckenthaler M., Schneider S., Dehlin E., Wahle E. The deadenilation nuclease (DAN) is involved in poly(A) tail removal during the meiotic maturation of Xenopus oocytes.//The EMBO J.-1998. -V.17. -P.5427-5437.

137. Kozak M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNA/M. Kozak // Nucl.Acids Res. -1987, -V. 15,- № 20, -P. 8125-8132

138. Kornberg R.D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA/ R.D. Kornberg// Science. -1974. -V. 184. -P. 868-871.

139. Lager K. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2,8A resolution/K. Lager; A.W. Mader; R.K. Richmond; D.F. Sargent; T. Richmond// Nature. -1997. -V.389.-P.251-260.

140. Latchman D.S. Transcription factors: An overview/ D.S. Latchman// Intern. J. Biochem. Cell Biol. -1997. -V. 29, -N12. -P. 1305-1312.

141. Lawrence J.B. Intracellular localization of mRNAs for cytoskeletal proteins/J.B. Lawrence & R.H. Singer//Cell. -1986. -V. 45. -P. 407-415.

142. Leguang H. Isolation of hamster brain polyribosomes-cytoskeleton complexes/H. Leguang & D. Gauthier//Neurochem. Res. -1989. -V, 14. -P. 239-243.

143. Lehninger A.L. Principles of biochemistry/A.L. Lehninger, D.l. Nelson, M.M. Cox//N.Y.: Worth Publ. -1993. -1013 p.

144. Larosche A. Isolation and in vitro translation of polysomes from mature rye leaves/A. Larosch, W.G. Horkins//Plant Physiol. -1987 -V.83. -N3. -P. 581.

145. Lewin B. Gene expression 2/B. Lewin//2nd Ed. Wiley-Interscience, New York, -1980. -P. 694-760.

146. Lim L. Adenine-rich polymer associated with rabbit reticulocyte messenger RNA/L. Lim & E.D. Canellakis// Nature, -V. 270, -P. 710-712

147. Lodish H.F. Translational control of protein synthesis.// Annu.Rev.Biochem. -1976,-V. 45, -P. 39-72

148. Loomis W.F. Histidine kinases in signal transduction pathways of eukaryotes/W.F. Loomis, G. Shaulsky, N. Wang//J. Cell. Sci. -1997. -V. 110. -P. 1141-1145.

149. Luo M. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans./M. Luo; R. Reed//J. Cell Biol. -V. 96, -N26. -P. 14937-14942.

150. Macdonald P.M. RNA regulatory element BLEI directs the early steps of bicoid mRNA localization/P.M. Macdonald. K. Kerr, J.l. Smeth, A. Leask//Development. -1993.-V. 118.-P. 1233-1243.

151. Maki R. The role of DNA rearrangement and alternate mRNA processing in the expression of immunoglobulin delta genes/R. Maki; W. Roeder; A. Traunecker; C. Sidman; M. Wabl; W. Rasjhke; S. Tonegawa// Cell. -!981, -V.24, -P. 353-365.

152. Mandell J.D. A fractionating column for the analysis of nucleic acids./J.D. Mandell & A.D.Hershey//Analyt. Biochem.- 1960. -V.l, -P.66-77.

153. Maniatis T. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing/T. Maniatis; R. Reed//Nature -1987. -V. 325. -P. 673-678.

154. Marato F.G. Translational control in heat-shocked Drosophila embryos/F.G. Marato & J.M. Sierra//J.Biol.Chem. -1988, -V. 263, -№ 30, -P. 15720-15725

155. Mariman E.C. Adenoviral heterogeneous nuclear RNA is associated with the host nuclear matrix during splicing/ E.C. Mariman; C.A. van Eekelen; R.J. Reinders; A.J. Berns; W.J. van Venrooij//J. Mol. Biol. -1982. -V. 154, -P. 103-119.

156. Meister G. Mechanism of gene silencing by double-stranded RNA./G. Meister & T.Tuschl//Nature. -V.431, -P.343-349.

157. MetzlafFM. RNA-mediated RNA degradation and halcone synthase a silecing in petunia/M. Metzlaff, M.O'Dell. P.D.Cluster, R.B.Flavekk//Cell. -1997, -V.88, -P.845-854.

158. Moazed D. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA/D. Moazed, J.M.Robertson, H.F.Noller//Nature, -1987, -V.334, -P.362-364.

159. Montgomery M.K. RNA as target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans/M.K. Montgomery, S.Xu, A.Fire//Proc. Natl. Acad. Sci. USA,-1998.-V.95,-P. 15592-15507.

160. Moss E.G. RNA interference: is a small RNA world/E.G. Moss,//Curr. Biol. -2001,-V.ll -V.112-115.

161. Napoli C. Introduction of a chimeric chalcon synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans/C. Napoli, C.Lemieux, R.Jorgensen//Plant Cell. -1990, -V.2, -P.279-289.

162. Nelson W.G. The role of the nuclear matrix in the organization and function of DNA./ W.G. Nelson; K.J. Pienta; E.R. Barrack; D.S. Coffey// Annu. Rev. Bioph. Chem. -1982. -V. 15, -R 457-475. I

163. Newman T.C. DST sequences, highly conserved among plant SAUR genes, target reporter transcripts for rapid decay in tobacco/T.C. Newman, M.OhmeTakagi, C.B.Green//Plant Cell. -1993. -V.5, -P.701-714.

164. Niu X. Bipartite determinants of DNA-binding specificity of plant basic leucine zipper proteins/ X. Niu; L. Renshaw-Gegg; L. Miller; M.J. Guiltinan // Plant Mol. Biol.-1999. -V.41.-N1.-P. 1-13.

165. Pawson T. Signaling throught scaffold, anchoring, and adaptor proteins/T. Pawson, J.D.Scott//Science. -1997, -V.278, -N5346. -P.2075-2080.

166. Peumans W.J. Some aspects of the synthesis of long-lived messenger ribonucleoproteins in developing rye embryos/W.J. Peumans, L.I.Caers, A.R.Carlier//Planta, -1979, -V.144, -P.485-490.

167. Plasterk R.H. RNA silencing: the genome's immune system./R.H. Plasterki

168. Science.-2002, -V.296, -P. 1263-1265. !

169. Preobrazhensky A.A. Informosomes and their protein components: the present state of knowledge./A.A. Preobrazhensky, A.S. Spirin//In: Progress Nucl. Acid Res. And Mol. Biol. N.Y., -1978, -V.21, -P. 1-37.

170. Razzel W.E. The precipitation of polyribonucleotides with magnesium salt and ethanol/W.E. Razzel//J.Biol.Chem. -1963. -V.238.- P.3053.

171. Reich C. The RNA component of the Bacillus subtilis RNAase P. Sequence, activity, and partial secondary structure/C.Reich, K.J.Gardiner, G.J.Olsen, B.pace, T.L.Marsh, N.R.Pace//J. Biol. Chem. -1986, -V.261, -P.7888-7893.i

172. Rodnina M.V. GTPases mechanism and function factors on the ribosome/M.V. Rodnina, H.Stark, A.Savelsbergh, H.J.Wieden, D.Mohr//Biol. Chem. -2000. -V.381. -P.377-387.

173. Rogier S., Sigrid R., Tilo M., Christoph F. Messanger RNA-binding properties of nonpolysomal ribonucleoproteins from heat-stressed tomato cells.// Plant.Physiol. -1999, -V. 120, -P. 23-31. I

174. Ross J. mRNA stability in mammalian cells/J.Ross//Microbiol. Rev. -1995, -V.59, -P.423-450.

175. Sachs A. The role of poly(A) in the translation and stability of mRNA.// Curr. Opin. Cell Biol., -1990, -V. 2,- P. 1092-1098.i

176. Sachs A. Messanger RNA degradation in eukaryotes.// Cell, -1993, -V. 74, -P. 413-421.

177. Sauvage F. Alternative polyadenylation of the amyloid protein precursor mRNA regulated translation/ F. Sauvage; V. Kruys; O. Marinx; G. Hues; J.N. Octave// EMBO J. -1992, -V.il,- N8. -P. 3099-3103

178. Schenk P.W. Signal perception and transduction: The role of protein kinases/P.W. Schenk, B.E. Snaar-Jagalska//Biochem. et biophys. acta. -1999, -V.1449, -Nl, -P. 1-24.

179. Schiebel W. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. Purification and physical properties/W. Schiebel, B.Haas, S.Marincovic, A.Klanner, H.L.Sanger//J. Biol. Chem. -1993, -V.268, -P. 11851-11857.

180. Sharp P.A. Splicing of messenger RNA precursors/P.A. Sharp//Science -1987. -V. 235, -P.766-771.

181. Sharpless K. p-Actin mRNA-binding proteins associated with the cytoskeletal framework/K. Sharpless, D. Biegel, T. Yang, J.S. Pachter//Ear. J. Biochem. -1993. -V. 212. -P. 217-225.

182. Shatkin A.J. Capping of eukaryotic mRNAs/A.J. Shatkin // Cell. -V. 9, -P. 645653. ;

183. Shaw-Lee R. Alternative splicing of fructose 1,6-bisphosphate aldolase transcripts in Drosophila melanogaster predicts three isozym/ R. Shaw-Lee; J.L. Lissemore; D.T. Sullivan; D.R. Iolan// J. Biol. Chem. -!992. -V. 267, -N6. -P. 39593967.

184. Sheth U. Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies/U. Sheth & R.Parker//Science. -V.300 -P.753-755.

185. Shirley B.W. A potential role for mRNA turnover in the light regulation of plant gene expression: ribulose-l,5-biphosphate carboxylase small subunit in soybean/B.W. Shirley, R.B.Meagher//Nucleic Acids Res. -1990, -V.18, -P.3377-3385.

186. Siwecka M.A. Purification and characterization of nuclease I associated with rye germ ribosomes/M.A. Siwecka, M.Rytel, J.W.Szarkowski//Acta Biochem. -1989, -V.36, -P.45-62.

187. Skoczek H. Electrophoretic studies of different parts of barley embryo roots/H. Skoczek//Acta Physiol. Plant. -1980, -V.80, -P.243-246.

188. Smith C.J. Expression of truncated tomato polygalacturonase gene in transgenic plants/C.J.Smith, C.F.Watson, C.R.Bird, J.Ray, W.Schuch//Mol. Gen. Genet. -1990, -V.224, -P.477481. j

189. Soreg H. In vitro translation of polyadenylic acid-free rabbit globin messenger RNA./H. Soreg, U.Nudel, R.Salomon, M.Revel, U.L.Littauer//J. Mol. Biol. -1974, -V.88, -P.233-245.

190. Sonenberg N. Cap-binding proteins of eucariotic messenger RNA functions in initiation and control of translation/N. Sonenberg // Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology. New York: Acad. Press, -1988, -V. 35, -P. 173-207.

191. Spirin A.S. On "masked" forms of messenger RNA in early embryogenesis and in other differentiating systems/A.S. Spirin//In current topics in Devel. Biol. -1966, -V.l,- P. 1-38.

192. Spirin A.S. Masked and translatable messenger ribonucleoproteins in higher eukaryotes./A.S. Spirin// JWB Hershey, MB Mathews, N Sonenberg, eds, Translational Control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,-1996. -P. 319-334.

193. Spohr C. Polyribosome-bound and free cytoplasmic haemoglobin messenger RNA in a differentiating avian erythroblasts/C. Spohr, B.Kayibanda, K. Scherrer.//Eur. J. Biochem. -1970, -V.31, -P. 194-208.

194. Stevens A. Eukaiyotic nucleases and mRNA turnover. In: Control of mRNA stability/A. Stevens//Acad. Press, New-York -1993, -P.429-486.

195. Stuger R. Messenger RNA-binding properties of nonpolysomal ribonucleoproteins from heat-stress tomato cells/R. Stuger; S.Ranostaj; T. Materna & C. Forreiter.//Plant Physiol. -1999. -V. 129. -P. 23-31/

196. Sunitha I., Slobin L.I. An in vitro system derived from Friend erythroleukemia cells to study messenger RNA stability // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1987. -V.144. -P. 560-567

197. Sullivan M.L. Post-transcriptional regulation of nuclear-encoded genes in higher plants: the role of mRNA stability and translation/M.L. Sullivan,; P.J. Green//Plant Mol. Biol. -1993, -V.23, -P. 1091-1104.

198. Sussman M. General bacterial genetics/M. Sussman// Ann. Rev. Gen. -1970, -N4, -P.135.

199. Tarun S.Z. Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF4G/S.Z. Tarun S.Z. & A.B. Sachs // Genes Dev. -V. 9, -P. 29973007.

200. Terras F.R. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid/F.R. Terras, I.A.Penninckx, I.J.Goberis, W.E.Broecaert//Planta. -1998, -V.206. -Nl, -P.l 17-124.

201. Thara V.K. Pseudomonas syringae pv tomato induces the expression of tomato EREBP-like genes Pti4 and Pti5 independent of ethylene, salicylate and jasmonate// Plent J. -1999. -V. 20. -N4. -P. 475-483.

202. Thompson D.M. Degradation products of the mRNA encoding the small subunit of ribulose-l,5-biphosphate carboxylase in soybean and transgenic petunia//D.M. Thompson, M.M.Target, R.B.Meagher//Plant Cell. -1992, -V.4, -P.47-58.

203. Uchida N. Identification of a Human cytoplasmic poly(A) nuclease complex stimulated by poly(A)-binding protein/N Uchida, S.Hoshino, T. Katada//J. Biol. Chem. -2004, -V.279, -P. 1383-1391.

204. Uchida N., Hoshino S., Katada T. Identification of a Human Cytoplasmic Poly(A) Nuclease Complex Stimulated by Poly(A)-binding Protein // J. Biol. Chem. -2004 -V. 279. -№.2, -P. 1383-1391.

205. Vincent A. The yeast translational allosuppressor, SAL6: A new member of the PPl-like phosphatase family with a long serin-rich N-terminal extension/A. Vincent , G. Newnam, S.W. Liebman// Genetics -1994, -V. 138, -P. 597-608.

206. Wang X. The role of phospholipase D in signaling cascade/X. Wang// Plant Physiol. -1999. -V.120, N2. -P.645-651.

207. Weber M. Evidence for and mechanism of control during cell differential in Acetobularia/M. Weber, H.G.Schweiger// Eur. J. Cell Biol. -1985. -V38. -1^1. -P.73-78. !

208. Weeks D.P. Preformed messenger of quiescent wheat embryo/D.P.Weeks, A.Marcus//Biochim. Biophys. Acta, -1971, -V.232, -P.671-684.

209. Weitzel G. The cytoplasmic pH , ATP content and total protein synthesis rate during heat shock protein inducing treatments in yeast/G. Weitzel ; Pilatus U.; Rensing L.// Exp. Cell Res. -1987. -V.170. -Nl. -P. 64-79.

210. Wilhelm J.E. RNA on the move: the mRNA localization pathway/J.E. Wilhelm & R.D.Vale//J. Cell. Biol. -1993. -V. 123. -P. 269-274.

211. Wilson K.F. The nuclear cap-binding complexes is a novel target of growthifactor receptor coupled signal transduction/K.F. Wilson; P. Fortes; U.S. Singh; M. Ohno; I.W. Mattaj; R.A. Cerione//J. Biol. Chem. -1999. -V. 274, -P. 4166-4173.

212. Wingender E. TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation/ E. Wingender; X. Chen; R. Hehl; H. Karas; I. LiebichII Nucl. Acids. Res. -2000. -V. 28. -N.l.-P. 316-319.

213. Yadav V.K. Characterization of free cytoplasmic poly(A) ribonucleoprotein complexes from barley embryos/V.K. Yadav; I.M.Satha; S.L.Mehta//Indian J.Ezp.Biol. -1990. -V.28. -N3. -P268-272. j

214. Yamamoto Karen K. Ribosom subunit to polysome ratios affect the synthesis of rRNA in Drosophila cells/ Karen K. Yamamoto, Pellegrini M.//Biochemistry. -1990. -V.29. -N50. -P. 11029-11032.

215. Zahringer J. Novel mechanism for translational control in regulation of ferritin synthesis by iron./J. Zahringer, B.Baliga, H.Munro//Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, -V.73, -P.857-861.

216. Zamecnik P.C. An historical account of protein synthesis with current overtones a personalized view/P.C. Zamecnik//Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. -1969, -V.34, -P.l-16. |

217. Zamore P.D. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleatide intervals/P.D. Zamore, T.Tuschl, P.A.Sharp, D.P.Bartel//Cell, -2000, -V.101, -P.25-33.

Информация о работе

Бибишев, Владимир Александрович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2007
ВАК 06.01.05

Диссертация

Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы