Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР"

На правах рукописи

Бнбишев Владимир Александрович

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ

КУЛЬТУР

Специальность (№.01. 05 - Селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2007

Работа выполнена в Краснодарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства им. П.П. Лукъяненко в период с 1986 по 2007 год

Научный руководитель: доктор биологических наук

Давоян Румик Оганесович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Туманян Наталья Георгиевна

кандидат биологических наук Мирошниченко Марина Валерьевна

Ведущая организация: Кубанский государственный аграрный университет

Защита состоится 16 октября 2007 в 10 часов на заседании диссертационного совета при Всероссийском научно-исследовательском институте риса по адресу: 350921. г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан 12. 09. 2007.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Гончарова Ю.К.

имени К.А. Тимирязева ОБЩАЯЖелезное» Фонд научный литеру '

Актуальность проблемы. Одной из главных гф^ршн снижения урожае. ......... . г

является влияние неблагоприятных погодньис ' " условий в период вегетации растений. Стрессоустойчивость, или способность растений адаптироваться к неблагоприятным воздействиям, представляет собой сложный комплекс функционально связанных биохимических, физиологических и морфологических признаков, определяющих устойчивость, соответственно, на молекулярном, клеточном, организменном и ценотическом уровнях (Удовенко, Гончарова, 1982; Федулов, 1994]. Селекционеры в своей работе по созданию стрессоустойчивых сортов вынуждены ориентироваться, как правило, только на конечный результат множества адаптивных реакций, используя в качестве критерия оценки генотипов количество выживших при стрессе растений и степень повреждения клеток и тканей [Пучков, Набоков, 2001]. При этом вне их поля зрения остается генетически детерминированный вклад отдельных процессов и механизмов в формирование адаптивного ответа, что не позволяет выявить этапы, лимитирующие стрессоустойчивость конкретного генотипа.

Известно, что более устойчивые формы часто обладают пониженной продуктивностью. Найдена обратная зависимость между степенью устойчивости организма и интенсивностью обмена веществ, что объясняется уходом растений в вынужденный покой (наиболее распространенный механизм, обеспечивающий неспецифическую устойчивость) [Удовенко, Гончарова, 1982]. Для Краснодарского края в зимний период характерны резкие колебания температуры, частые оттепели, вызывающие уменьшения глубины вынужденного локоя и, соответственно, снижение неспецифической устойчивости озимых культур, а в весенний период нередки заморозки в первой половине и засуха во второй, В таких условиях необходимы сорта, обладающие повышенной способностью адаптироваться к резким изменениям погодных условий • так называемой "функциональной устойчивостью" [Нечипорович, 1988].

Для эффективного отбора генотипов с повышенной "функциональной устойчивостью" нужно оценивать, по крайней мере, две основных составляющих - скорость формирования адаптивного ответа растений при воздействии стрессового фактора (временная составляющая) и способность перестраивать клеточные процессы и морфологию адекватно изменившимся условиям (качественная составляющая). Нами были разработаны методические подходы, позволяющие дифференцировать эти составляющие и рассматривать их как два самостоятельных признака, В основу методов была положена оценка некоторых аспектов процесса изменения интенсивности белкового синтеза и функционального состояния и стабильности мРНК растений при стрессовом воздействии.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение молекулярных механизмов, принимающих участие в формировании адаптивного ответа у сортов озимой пшеницы и ячменя, поиск молекулярных маркеров и создание на их основе методов, позволяющих диагностировать физиологическое состояние и определять степень устойчивости растений к различным стрессам. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- изучить влияние различных абиотических стрессов на изменение трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом из проростков озимой пшеницы и ячменя;

- выявить зависимость между рангом сгрессоустойчивости сорта и изменением трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом;

- исследовать вопрос о роли поли(А) последовательностей мРНК в определении стабильности и функциональной активности информационных молекул;

- показать взаимосвязь стабильности мРНК с физиологическим состоянием растений;

- разработать диагностический метод оценки сгрессоустойчивости сортов зерновых культур.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- обнаружен эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полисом.

Установлено, что эффект обусловлен изменением доли полисом в препаратах мРНП растений. Предполагается, что эффект отражает реакцию замедления интенсивности белкового синтеза, универсальную для начальной стадии воздействия различных видов абиотических стрессов;

- выявлен эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro. Показано, что эффект связан с наличием ассоциированной с поли(А) мРНК РНКазы, очевидно, входящей в состав регуляторного нукпеопротеидного комплекса локализованного в 3' декодирующей зоне макромолекулы (З'РНПК);

- установлено, что дифференциальный распад мРНК количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчнвости сортов;

- разработан метод аффинно-адсорбци он ной хроматографии на поли(У)-сефарозе препаратов РЫК, позволяющий специфически фракционировать пул цитоплазматических поли(А) мРНК, количественно разделять лолн(А) мРНК свободных (неактивных) и лолисомных мРНП, выявлять популяции мРНК в составе фракций, изучать, присутствующую в клетках апикальной меристемы листа, группу поли(А) мРНК не сорбирующихся на поли(У)-сефарозе без предварительной специфической инкубации;

- предложена модель механизма "оперативного" изменения функционального состояния и стабильности мРНК при стрессе.

Научно - практически ценность па боты.

- разработан метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов озимого ячменя и озимой пшеницы, пригодный для массового скрининга;

• создан метод диагностики физиологического состояния сельскохозяйственных растений на основе выхода гтоли(А)мРНК во втором цикле хроматографии на поли(У)-сефароэе;

• разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии РНК, перспективный для создания на его основе новых способов оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур;

- созданы предпосылки для разработки технологии комплексной оценки стрессоустойчивости сортов озимого ячменя и озимой пшеницы.

Основные положения, выносимые на защиту.

- изменение трансляционной активности полисом является универсальной адаптивной реакцией растений, характерной для начального периода многих видов абиотических стрессов;

• наличие ассоциированных с мРНК регуляторных нуклеопротеидных комплексов (З'РНПК), влияющих на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, специфически отражается на характере фракционирования информационных молекул в процессе аффинной хроматографии;

- регул яторные нуклеопротеидные комплексы определяют "запрограммированность" пула цитоплазматических мРНП растений на обеспечение перехода клетки в различные стационарные режимы функционирования;

- диагностические методы, созданные на основе предложенных молекулярно-биологических маркеров, могут значительно облегчить селекционерам работу по подбору родительских пар и, в дальнейшем, выявлению нужных генотипов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1990; II симпозиуме "Новые направления биотехнологии растений", Пущино, \993; 16th International Congress of Biochemistry and Mol. Biology, New Delhi, India 1994; 3 международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, J995; II съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997; региональной конференции "Перспективы внедрения современных бистехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства", Ставрополь, 2003.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 153 страницах, содержит 13 таблиц и 27 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на четырехсуточных проростках озимой пшеницы (ТгШсит aeslivum L) и озимого ячменя (Hordeum vutgare L.) сортов селекции КНИИСХ им. П.П. Л у кья ненко, а также на созревающем зерне кукурузы (Zea mays L) линии Wisconsin 64А. Сорта были ранжированы по стрессоу стойчивостя на основе оценок общепринятыми полевыми и лабораторными методами. Семена пшеницы и ячменя проращивались при 20°С между двумя слоями влажной фильтровальной бумаги. Кукурузу выращивали в полевых условиях. Початки срезали на 20-й день после искусственного опыления.

Четырехсуточные проростки озимого ячменя и озимой пшеницы подвергали действию температурного (2°; 4°С или 42°С на свету), водного (12% ПЭГ-8000) и солевого (2% NaCl) стрессов. В разные интервалы времени проростки срезали. Образцы хранили в жидком азоте.

Выделение полирибосом проводили методом Дэвиса с coaBT.[Dav¡es et al, 1972], используя экстрагирующий стандартный буфер Лароча [Larosche & Horkins, 1987]. Трансляцию полисом и РНК in vitro проводили в лизате из ретикулоцитов кролика [Хеймс и Хиггенс, 1987],

Визуализировали зоны интенсивного деления клеток проростков методом Фёльгена ¡Паушева, 1974]. Растительный материал, в котором преобладают меристематические клетки, получали из апикальной зоны листьев проростков. Срезали кончик листа размером менее Змм.

РНК метили [3Н]-уридином с УА 30 Ки/ммоль ("Изотоп", Россия). Срезанные проростки выдерживали в растворе IS мКи/мл в течение 60 минут. Кинетин и АБК вносили под корни проростков в концентрациях SxlO^M и 5х10"7М, соответственно.

Выделение суммарной РНК проводили в присутствии ионов Mg*\ РНК экстрагировали буфером, содержащим 200 шМ Трис-HCl рН 8,0; 30 mM MgCl2; 250 тМ сахарозы, в соотношении 1:5 (г/мл). После осветления в раствор добавляли DDS-Na до 1%. Депротеннизацию РНК осуществляли смесью фенол/хлороформ (1:1) и осаждением с помощью LiCI с мочевиной в конечной концентрации 4М каждой. Осадки растворяли в буфере, содержащем 20тМ Трис-HCl рН 7,6. Суммарную РНК для хроматографии использовали сразу после выделения либо хранили в присутствии 70% этанола при -20°С или в сухом виде. Растворы РНК не замораживали, т.к. это изменяет профиль фракционирования.

Нуклеопротеид-целитную хроматографию проводили методом [Лихтенштейн и др., 1976]. Элюцию РНК с колонки осуществляли последовательно растворами: - 1М LiCI; 2М мочевины при 20°С (Г фракция) и 2М LiCI; 4М мочевины при 65°С (II фракция).

Изменения профиля фракционирования индуцировали либо предварительным прогревом растворов РНК 65 С 10 мин., либо их инкубацией 100 часов при 20°С, либо смещением рН растворов в щелочную сторону. Сдвиг рН в инкубационном растворе достигался как добавлением NH,OH до 40шМ с последующей нейтрализацией эквимолярным количеством НС1, так и добавлением буфера, содержащего Трис-HCl рН 8,6 и 9,6 до 40шМ, с последующим снижением рН раствора до 7,6, внесением соответствующей концентрации буфера - Трис-НС1 рН 6,8. В стандартных экспериментах время инкубация не превышало 60 минут при 20 С.

Аффинную хроматографию на поли(У)-сефарозе осуществляли по методике, описанной [Остерман, 1985]. Аффинно-адсорбционная хроматография является модификацией метода аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе, На колонку с поли(У)-сефарозой, уравновешенную буфером, содержащим 0,05М трис-HCl рН 7,6; 0,5М LiCI; 0,4шМ Na-ЭДТА; 0,02% DDS-Na, в том же буфере наносилась суммарная РНК в концентрации 0,2 мг/мл, со скоростью 30 мл/час. Нанесение препарата на колонку повторяли дважды. Таким же буфером промывали колонку до нулевой оптической плотности. Фракции пол и (А) мРНК элюировались последовательно пятикратными по отношению к объему колонки растворами: фракция 1 -0,01М трис-HCl рН 7,6; 0,1М LiCI; 0,08mM Na-ЭДТА; 0,004% DDS-Na при 20°С; фракция 2 -бидистиллированной водой при 65°С; фракция 3 - 0,05М трис-HCl рН 7,6; 0,1% DDS-Na при 65°С. Количество поли(А) мРНК во фракциях определяли спектрофотометрически из расчета 1 ОЕ;.{,о™40мкг/мл. Поли(У)-сефарозу использовали многократно. По неустановленным

причинам аффинно-адсорбционное фракционирование на новой поли(У)-сефарозе затруднено. Воспроизводимые результаты получали только после длительного (8-10 часов) промывания колонки буфером, содержащим 0.05М трис-HCl рН 7,6; 0,5% DDS-Na при 65°С или после трех - пяти циклов хроматографии. Емкость колонки не меньше, чем в два раза превышала количество наносимых поли(А) мРНК из расчета их 5% содержания в препаратах суммарной РНК. Периодически проверяли емкость колонки нанесением избыточного количества синтетической поли(А). Использовали свободно-проточные колонки, скорость жидкости в которых (ЗОмл/час) подбирали соотношением диаметра выходного канала и плотностью фильтра. Колонки были объединены в кассету с общей термостатируемой рубашкой. Хроматографию на МАК осуществляли по методике, описанной [Mandell & Hershey, I960].

Эксперименты проводили не менее, чем в четырех биологических повторностях. В таблицах и на рисунках представлены характерные опыты в серии. Данные в таблицах являются средними значениями 3-6 аналитических повторов. Статистическую оценку достоверности полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента. Представленные результаты имели достоверные различия с уровнем значимости 0,5.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка мапекулярно-кинети ческого маркера оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур при стрессовом воздействии

При воздействии различных стрессовых факторов растение отвечает комплексом реакций, направленных на поддержание гомеостаза и переживания неблагоприятного периода. Очевидно, что высокая скорость формирования растением адаптивного ответа на стрессовое воздействие позволяет минимизировать негативные последствия. При стрессе наряду со специфическими реакциями в растительной клетке развивается комплекс однотипных, не зависящих от конкретного вида воздействия, процессов, получивший название "неспецифический адаптивный синдром" [Браун, Моженок, 1987; Пахомова, 1995].

Вероятно, на основе любой реакции этого комплекса можно разработать молекулярно-ки нети чески й маркер, позволяющий оценить такой признак, как скорость формирования адаптивного ответа. Но нам представлялось целесообразным сосредоточить свое внимание на процессе изменения интенсивности белкового синтеза в условиях стресса на том основании, что этот процесс является центральным в клетке и адаптивные изменения на уровне трансляции предшествуют и обусловливают изменения биохимических и физиологических процессов, т.е. являются "первичными" по отношению к ним. Особый интерес в этом плане представляла работа с препаратами полирибосом. Предполагалось, что трансляция in vitro препаратов полирибосом из подвергнутых стрессу проростков позволит в какой-то мере охарактеризовать изменения функционального состояния белоксинтезирующего аппарата клеток стрессированных растений.

Эффект стоессиндуиированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАПк Нами было показано, что под воздействием пониженной температуры (рис. 1 а), солевого (рис.1 б.) и водного (рис.1 в.) стрессов, а также при тепловом шоке (рис.) г.; д.) in vivo с пол и рибосомам и происходят определенные изменения, проявляющиеся in vitro в изменении их трансляционной активности (ТАП). Во всех случаях увеличение ТАП in vitro наблюдалось на начальном этапе стрессового воздействия с последующим ее снижением. Можно предположить, что исследуемая реакция, кинетическим маркером которой служит изменение ТАП, имеет универсальный для любого неблагоприятного абиотического воздействия характер, являясь составляющей процесса адаптации.

Обнаруженный эффект оказался сортоспецифичным. У контрастных по стрессоустойчнвости сортов озимой пшеницы Краснодарская 39 и Безостая 1 скорость реакции коррелировала с рангом устойчивости (рис. 1 г.;д.), что проявлялось в разном времени, необходимом для достижения максимума ТАП in vitro.

Тепловой шок является одним из наиболее "жестких" абиотических стрессов. Через 15 минут после начала стрессового воздействия сортом Краснодарская 39 максимум ТАП был уже пройден, а Безостая I достигает его только через 45 минут.

и

»

Радикал ♦(дзнмый ячмень)

О 1 4 i 111

(чаем) Гипот»р мическнй стресс (2*Q

Кркн одарен ая Йрасаодзрскдя 39 Э» (озимая пшениц»)

5 Э 4(1 • Й М « (О (часы) : (минуты}

Водный стресс Гикртермический Й стресс у (2% МаСО (13*/. ПЭГ-3030) стресс (42 С)

Рис.1 - Динамика изменения трансляционной активности ¡п четырех суточ ных проростков озимой пшеницы и озимого ячменя, подвергнутых гипотермическому (а.), солевому (б,), водному (в.) стрессам и тепловому шоку или * гипертермическому стрессу (г.; д.) ■ контроль, ——— стресс.

(чаем) Солевой стресс (2% NaCD

U м « и

(чциути)

Ггавртер ынчесюй стресс (42 С) vitro ПОЛИСОМ ИЗ

В таблице 1 приведены данные об изменении ТАП in vitro из проростков, ранжированных по устойчивости сортов озимой пшеницы в ответ на температурный, солевой и водный стрессы.

Таблица 1 - Изменение трансляционной активности in vitro (стресс/контроль* lOOÍi) препаратов полисом in проростков оэлмоЛ пшенгшы (сорта ранжированы по холодоустойчив ости), индушфованное вочдеЛствлеы различных стрессовых факторов

Сорта 2*С 5 часов 4*С 5чассв NaCl (2%) 60 ммнуг ПЭГ-8000 (12%) бОмннут ПЭГ-8000 (12%) ISO минут Ранг устойчивости

Краснодарская 39 :об±и 189 ±7,2 138+12,2 189+8.1 54±7 1

Краснодарская 57 144±5,2 146+5,7 — 153+6,2 74±5.4 2

0 лимита 2 127±3,8 131+6,4 150±б.З 117+9.0 88 ±6,1 3

Безостая 1 — 134+2.7 120+5,4 72 ±10,6 21б±19,8 4

Колос 75+6.3 128 ±3.4 57±9,1 — — 5

На начальном этапе водного стресса (12% ПЭГ-8000,60 минут) количественное увеличение ТАП прямо коррелировало с рангом устойчивости сортов, а на более позднем этапе (180 минут) корреляция была обратной (табл.1).

Для объяснения таких закономерностей была предложена схема развития реакции у различающихся по стрессоустойчивости гипотетических сортов зерновых культур (рис.2). Эта схема позволяет показать как возможность создания диагностического метода на базе данного молекулярно-кинетического маркера, так и сложности, связанные с необходимостью точной калибровки этого метода.

г

J;

Рис.2 - Схема описывающая динамику изменения трансляционной активности полисом из ранжире ванных по стрессоустойчив ости сортов зерновых культур, в

процессе стрессового воздействия

С 1 по 5•обозначение ранга стрессоустойчив ости.

• гипотетические сорте

Уменьшение концентраций ПЭГ-8000 н ЫаС1 в десять и в сто раз от применяемых для моделирования водного и солевого стрессов [Киль, Бибишев, Плотников, 1991] позволило установить, что скорость изучаемой реакции коррелирует с напряженностью неблагоприятного воздействия и что стрессоустойчивый сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 реагирует на более слабое воздействие, чем Безостая 1 (рис.3).

Краснодарская 39

1.21» пэг-вооо

1 1 3 4 i i 7 I 9 Продолжительность эксперимента (условные единицы)

J часа 6 часов 8,25* W«CI

300 270 24 Q 210 180 ISO 120 90 ~3

300 270 240 210 160 150 120 SO

Безостая 1 0.124 пэг-воао vnv пэг-еооо

ica 6 часов ВЛ2М N»C1

__I

вв * *

f

3 часа 6 часов

I.

\

t - I

3 час» 6 часов Э ч»с» Контроль; —---Стресс

6 часов

3 часа 6 часе» Э часа 6 часов Продолжительность эксперимента (часов)

Рис.3 - Динамика изменения трансляционной активности in vitro - полисом из проростков озимой пшеницы, контрастных по стрессоустойчи&ости сортов Краснодарская 39 и Безостая 1, подвергнутых воздействию в 100 и в 10 раз меньших концентраций ПЭГ-8000 и NaCI, от используемых для моделирования водного и солевого стрессов (12*/о ПЭГ-8000 и 2% NaCI)

Такие выводы можно сделать на основании того, что трансляционная активность in vitro препаратов полирибосом из проростков сорта Безостая 1, инкубированных три часа в присутствии 0,12% ПЭГ-8000 и 0,02% NaCI (рис.3), не отличалась от контроля, и ее увеличение регистрировалось только при трансляции препаратов из проростков, инкубированных в этих условиях в течение шести часов.

Динамика изменения ТАП менялась в случае увеличения в инкубационном растворе концентрации ПЭГ-SOOO до 1,2% и NaCI до 0,2%. Максимум ТАП in vitro при этом был достигнут в препаратах из проростков сорта Безостая 1, инкубировавшихся три часа, и далее происходило ее снижение. В случае сорта Краснодарская 39 максимум трансляционной активности достигался в препаратах полирибосом из проростков, инкубировавшихся при минимальной концентрации ПЭГ-8000 и NaCI всего три часа.

При разделении препаратов полисом ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы (рис.4) выяснилось, что эффект увеличения ТЛП in vitro обусловлен повышением в них доли тяжелых полисом и, соответственно, уменьшением количества моносом.

Рис.4 - Распределение полисом из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39, подвергнутых воздействию теплового шока (ТШ(42°С)) во фракциях прн ультрацекгрифугировании в градиенте концентрации сахарозы М+С — моносомы и субъеднницы рибосом.

а. Контроль (20°С) — значение ТАП принимается за 100%;

б. ТШ (42°С) 15 мин -133*/.;

в. ТШ (4ГС) 45 мин -114%;

г. ТШ (42°С) 60 мин - 79%. % Полисом — процент полисом от суммарного препарата (М+С+Полисомы)

1 Пишсиш , Ш ЕопрмьРОО

шс;

TfflW'QIiinBjf

Ж

ТШ (<12'С)45 юту?

М+С ТЩ4/С) 60>okjt

НирОЛЯШ! «ДШтЩГШ

Объяснить это можно как усилением процесса трансляции in vivo в результате интенсивной инициации рибосом, так и, напротив, замедлением белкового синтеза. Блокирование или замедление белкового синтеза, сопровождаемое увеличением доли тяжелых полисом за счет пула моносом, ранее наблюдалось в результате действия таких ингибиторов трансляции, как циююгексимид, а-амонитин и др. JYamamoto & Pellegrim, 1990], Молекулярный механизм ингибирования обусловлен затрудненной диссоциацией рибосом.

Можно предположить, что описанный выше молекулярный механизм замедления трансляции имеет место и в качестве естественной, т.е. физиологической реакции клетки на стресс. Очевидно, он мог бы позволить плавно н обратимо, в случае непродолжительного воздействия, замедлить процесс трансляции, что является обязательной стадией подготовки белоксинтезируюшего аппарата клетки к функционированию в новых условиях.

Нами был модифицирован хроматографический метод выделения и фракционирования полирибосом [Calzone et at., 1982]. Это позволило создать метод оценки, присущей сорту, скорости формирования адаптивного ответа по изменению соотношения количества полисом/моносом в препаратах из контрольных и стрессированных растений.

Таблица 2 - Оценка скорости формирования адаптивного ответа на воздействие пониженной температуры у линии озимого ячменя

Скорость фор миров ания адаптивного ответ«

высокая средняя нижаи нестандартная

Бает он Скороход Вавилон 23

Радикал 23 Циклон 17

9 I 9 22 27

t1 за 24 16

12 8 29 19

26 5 25 1

13 21 7

IS 10 1-4

4 20 18

в 2

Цифрами обозначены порядковые номера линий озимого ячменя.

Новым методом был осуществлен скрининг 30 линий озимого ячменя, полученных от селекционеров закрытым списком. Анализ результатов (Табл.2) на 80% совпал с данными о С1ре «»устойчивости линий в целом, полученными селекционерами в полевых условиях.

Разработка молекулярно-кинетических маркеров оценки стрессоустой чивости зерновых культур на основе механизма регулирующего изменение функционального состояния и

стабильности мРНК

На начальном этапе стрессового воздействия растения получают наибольшие повреждения. Не вызывает сомнений, что те сорта зерновых культур, которые способны именно на этом этапе наиболее эффективным образом перестроить обмен вешеств и структуру своих клеток соответственно создавшимся условиям, оказываются более жизнеспособными. Известно, что при стрессе в клетках растений дифференциально меняются функциональное состояние и стабильность цитоплазматнческих мРНК [Gutierrez et al., 1999]. Это приводит к каскаду адаптивных преобразований: к изменению в составе транслирующихся матриц, к соответствующему изменению в спектре синтезирующихся белков и, как следствие, к изменению биохимических, физиологических процессов и структуры клеток. Очевидно, механизм, регулирующий изменение функционального состояния и стабильности цитоплазматнческих мРНК, играет ключевую роль в системе оперативной регуляции белкового синтеза. Есть основание предполагать, что особенности функционирования этого механизма обусловливают различия в уровне стрессоустой чивости сортов зерновых культур и могут быть использованы в качестве критериев оценки данного признака.

ЭМект дифференциального распада паяй fA i мРНК in vitro. Сложнлгти, возникающие при работе с мРНК, связаны, как с низким ее содержанием в препаратах суммарной РНК, так и с тем, что мРНК в большей степени, чем другие молекулы, подвержены разрушению различными факторами. Считается, в частности, что Mg**, присутствующий в растворах суммарной РНК, способствует деградации РНК, катализируя реакцию разрушения, протекающую через образование 2',3- циклического фосфата [Баршевская и др., 1987]. Многие исследователи избавляются от этого катиона еще на стадии экстракции РНК из биологического материала и последующих стадиях ее очистки.

Выделение полнаденилированной мРНК из препаратов суммарной РНК, как правило, осуществляется методами аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе и олиго(дТ)-целлюлозе [Остерман, 1985]. Этот процесс может затрудняться тем, что в результате потери Mg++, поддерживающего третичную структуру рибосом ных частиц, цепи рРНК разворачиваются и приобретают способность неспецифически адсорбироваться на колонке с аффинным носителем, Количество неспсцифически сорбировавшихся молекул, многократно превышает количество поли(А) мРНК. Чтобы уменьшить долю неспецифической адсорбции при хроматографии таких препаратов колонки перед элюцией поли(А) мРНК промывают пятикратно разбавленным буфером для нанесения и/или после элюции проводят еще один или несколько циклов хроматографии [Aviv&Leder, 1972; Попов н др., 1975].

Б.

1

орбировзвшайся РНК

-JV

НОА&Р франции Номер фракции

Рис.5 — Схема двуиикличной аффинной хроматографии РНК из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 на поли(У)-ссфарозе. А — проростки росли при 20°С; Б — при 4°С 5 часов. 1 — поли (А) мРНК элюированная в первом цикле хроматографии б «дистиллированной водой при 65°С; не сорбировавшаяся РНК при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу; 2 • РНК элюированная во втором цикле хроматографии.

В своей работе мы осуществляли экстракцию суммарной РНК в присутствии ионов Мв^ буфером, применяемым при выделении полирибосом [ЬатоБсЬе & Ногк1п5, 1987], после чего

препараты депротеинизировали смесью фенол/хлороформ. В препаратах суммарной РНК, выделенных таким образом, рибосом ные РНК сохраняют "компактную" структуру препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе, что позволило упростить процесс хроматотрафической очистки и, более того, количественно оценивать содержание поли(А) мРНК, т.е. использовать метод аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе не только в препаративных, но и в аналитических целях. Благодаря этому, при двуцикличной аффинной хроматографии препаратов суммарной РНК из проростков озимой пшеницы, удалось обнаружить эффект уменьшения выхода мРНК во втором цикле (рис.5). Эффект количественно коррелировал с изменением физиологического состояния растений (Табл.З) и рангом стрессоустойчивости сортов (Табл. 4).

Таблица 3 - Влияние освещения на выход во втором цикле хроматографии поли(А)мРНК (поли(А) -Н- мРНК) сортов озимой и яровой пшеницы

Сорт» Поли(А)" мРНК в%

бел о сведения 18 часов контрольОО освещение в часах опыт СО") "СГ - -к* 3 часа

3 12 30

Краснодарская 39 75±2 25±0,й 17*0.4 16*0.5 -50

(озимая)

Безостая 1 41 ± 1,1 33*0,8 29 ±0.8 30*0,9 •3

(снимая)

Друкина Б 37±0,9 47 ±1,0 - - 10

(яровая)

Спектр 36±0,9 3(5 ¿0.3 0

(яровая"»

Фитофизиологи, основываясь на многолетних эмпирических наблюдениях, отмечают противоположную реакцию на свет у озимой и яровой пшениц [Шайн, 1960]. В наших экспериментах озимая и яровая пшеницы также имели противоположную реакцию на свет, У озимой пшеницы освещение приводило к снижению, а у яровой к увеличению выхода мРНК во втором цикле хроматографии (Табл. 3).

Таблица 4 - Влияние пониженной температуры <4*С 5 часов) на выход во втором цикле хроматографии пол и (А) мРНК (пит(Д)+мРНК) сортов озимого ячменя

Сорта Поли(А)" мРНК (V») "О" - "К" Ранг устойчивости

контроль "К" (20 -С) опыт "О" (4-С)

Радикал 40 ± 0.5 зз* о,з -7 1

Секрет 40 ± 0,4 35 ± 0.4 -5 2

Кордон 42 & 0,4 39 ± 0.2 -3 3

Янус 36 ± 0,5 36 ± 0.4 0 4

Вавилон за * о.з 42 ± 0.5 6 5

Машик 30 ± 0.7 44 ± 0.6 14 б

Наиболее холодоустойчивый сорт озимого ячменя Радикал в наших экспериментах имел отрицательную разницу между опытом и контролем, по выходу поли(А) мРНК во втором цикле хроматографии. Однако эта отрицательная величина убывает по мере снижения холодостойкости сортов, становится нейтральной для двуручки (Янус). Только затем сорта ячменя имеют положительное изменение доли прироста поли(А) мРНК под действием холода. Наиболее высокое значение по нашим данным имеет сорт ярового ячменя (Мамлюк), обладающий наименьшей холодоустойчивостью (Табл. 4)

Эффект был использован в качестве молекул ярно-кинетического маркера и, соответственно, разработан диагностический метод оценки стрессоустойчивости сортов озимой пшеницы и озимого ячменя [Плотников, Бакалдина, Бибишев, Патент РФ, 1997].

Однако для применения метода в селекционной практике необходимо его техническое упрощение и увеличение информативности, что требовало глубокого фундаментального исследования обнаруженного эффекта.

В процессе работы было показано, что уменьшение выхода мРНК во втором цикле связано с разрушением молекул. О ферментативном характере деградации мРНК, не сорбировавшихся на полн(У)-сефарозе во втором цикле (рис.4) свидетельствовало невысокое связывание этих молекул с МАК: - 3,5-10% и количество, осаждающееся раствором Рассела [Кагге!, 1963] -6,114,5%, переводящего в нерастворимую форму все олигонуклеотиды размером более шести звеньев. Однако, кратность и продолжительность депротеинизацни, обработка ироназой и протеиназоЙ К, а также разбавление препаратов суммарной РНК с целью изменить соотношение фермент / субстрат, не влияли на величину распада в процессе хроматографии. При смешивании в соотношении 1:1 двух препаратов суммарной РНК, контрастно различающихся по выходу поли(А) мРНК во втором цикле, в результате хроматографии, получали близкое к рассчитанному среднее количество молекул (Табл. 5).

Таблица 5 - Выход во втором цмкле поли(А) мРНК исходных (А и Б) и смешанных в соотношении 1:1 (0,5А и 0,5Б) контрастно различающихся по стабильности препаратов РНК из четырехсуточных проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (% от количества наносимой РНК)

Вид Образец А Образец Б 0,5А + 0,5Б 0.5А + 0,5Б

стресса теоретически фактически

1 34,2*2.7 72,9*1,8 53.6 56.1*2.4

2 28,9*3.4 54,8*1,7 41,9 39.7*3.1

Примечание: l.A-конгроль, Б-3 часа 2% ЫаС1;2.А-кштроль(20 С), Б-5 часов 2*С.

Это противоречит версии об РНКазном загрязнении препаратов суммарной РНК, но хорошо согласуется с данными о том, что деградация матриц у эукариот осуществляется ассоциированными с мРНК нуклеазами [Bandyopadhyay et al.,1990].

В качестве рабочей гипотезы было высказано предположение о наличии на мРНК растений в 3 некодирующей зоне проксимально от поли(А)-хвоста, устойчивой к обработке традиционными депротеи н изи рующим и агентами структуры - регуляторного нуклеопротеидного комплекса (ЗРНПК), в состав которого входит рибонуклеаза и обусловливающий дифференциальный характер распада фактор, вероятно, снимающий ее ингибирование в ответ на определенный цитоплазматический сигнал in vivo, либо сходное с ним воздействие irt vttro.

Метод аААинмо-адсорбционного (А А) фракционирования пула , поли fА) мРНК растений. Наличие прочно ассоциированных нуклеопротеидных комплексов, очевидно, оказывает влияние на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, включая поли(А)-последовательносгь, а некоторые особенности комплексов специфически отражаются на характере элюции информационных молекул с колонки поли(У)-сефарозы в процессе хроматографии. Об этом свидетельствует тот факт, что, несмотря на отсутствие неспецифической адсорбции рРНК (рис.6), в процессе двуцикличной хроматографии систематически наблюдали в первом цикле появление двух дополнительных пиков: при промывании колонки пятикратно разбавленным буфером для нанесения • до термической элюции поли(А) мРНК бидистиллированной водой и после - при уравновешивании колонки буфером для нанесения (рис.7). Последний пик можно получить, используя также элюирующий буфер. В этих ликах элюиро вались молекулы, имеющие максимум поглощения 260 нм присущий нуклеиновым кислотам [Маннатис и др., 1984].

Суммарная

РНК

^лЛ/v

1 2 3

Номер фракции

Рис,б -Электрофорез РНК иэ проростков озимой шдеяицы сорт» Краснодарская 39

Суммарная 12 3

^НК Номер фракции

Рис.7 - Схема »фф и ино-адсорбционного фракционирования мРШС растений на поли (У)-се фароэе

Фракция 1 »люируется пятикратно разбавленным буфером для нанесения при 20 С

фракция 2 - б иди стнлл ирован ной водой при 65"С.

фракция 3 - буфером для нанесения (злюирующиы буфером) при б5*С,

Кроме того, при непродолжительной (60 минут) инкубации срезанных проростков озимой пшеницы в растворе [ Н]-уридина (уридин присутствует только в составе РНК, меченый нуклеотид включался в состав вновь синтезированных молекул, впоследствии элюировавшихся, как во фракции полученной после термической элюшш б (инсталлирован ной водой (фракция 2), так и в исследуемых фракциях (фракции 1 и 3). Причем, содержание включившегося in vivo [3Н]-уридина в молекулы всех фракций в десятки раз превышало его количество в суммарной РНК (Табл. 6), что характерно именно для матричных РНК [Остерман, 1983].

Таблица 6 -Аффикно-адсорбционное фракционирование меченых [3Н]-урндиноы РНК четырехсут очных проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (нмп./мин. в 5 мкг РНК)

Подготовка образца Суммарная РНК Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

РНК без прогрева 4,3± 0.7 20*12.2 207*31 79*9¿

РНК после прогрева (65* С 10 мин) 3,9*1,6 50±7,1 104*18 113*11,7

Информационная природа молекул РНК этих фракций подтверждается и их достаточно высокой трансляционной активностью в системе из ретикулоцитов кролика (Табл. 7).

Таблица7 —Включение[353]-метионинав белок (имп./мнн, в 5 ыкя. трансляционной смеси), при тр ен еяяцни уИго фракций поли(А) мРНК полученных методой аф финн о-адсорбционной хроматографии наполн(У)-еефарозе

Культура Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

Озимая mu ен иц а 44250*4140 83500±5030 55255±2310

Созревающее зерно кукурузы 19550±2470 51875±4712 42310±1872

Примечание: поли (А) мРНК иэ озимой тюенкцы сорта Краснодарская 39 и поли(А) ыРНКт созревающего зерна кукурузы линии Wi sconsin Í4A.

О неслучайном характере распределения поли(А) мРНК при фракционировании позволяет судить, как гетерогенность фракций по стабильности, выявленная благодаря инкубации препаратов перед хроматографией в условиях, очевидно, способствующих серьезным конформационным изменениям молекул (рис.8а.; 9; 13; 14), так и изменение профиля фракционирования пула поли(А) мРНК индуцированное in vivo воздействием на проростки повышенной (рис.9) и пониженной (рис.13; 14) температуры, экзогенных фитогормонов и в процессе 30-часового роста проростков (рис. 10).

Рнс, 8 — Гетерогенность по стабильности поли(А) мРВК фракций полученных методом АА хроматографии препаратов суммарной РНК Hi созревающего jepHa Wíscokíbi

WA. а. Влияние способа предварительной ннкуСацнн препаратов суммарной РОК на шменшне профиля фракционирования поШ!(А) мРНК. в. Выявленные группы пош|(А> мРШС в составе фракщА. o«h»»»B i,

4S é

Примечательно, что определенные условия предварительной инкубации индуцируют сходные изменения 1 и 3 фракций и контрастные с ними изменения фракции 2. К примеру, в результате инкубации при повышенном значении рН (с NHiOH) препаратов суммарной РНК из созревающего зерна кукурузы (рис.Ва.) и из проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (рис.9) происходит, преимущественно уменьшение фракций 1 и 3.

Прмреа ÍS'C 10 на пут

Шшубиом Иакгбати (100 ч*сев е Ш.ОН 100 «с» 20Q

2СГС «'С 10 тая.

о.б,

E^j Никубацвя инкубация ин'он К«нт^«л» <10* С)

Инкубация ннкубацня NHjOH

Стресс (JOC мин.)

Рис.9— Изменение профиля АЛ фракционирования norat(A) мРНК m проростков о^имоп пшеницы, сорта Краснодарская 39, ннпуи^оаяннй* воздействием на растения кр атковремемното теплового шока (40*С 60 юш) и в результат« никубацмн препаратов РНК » Присутствии 40 uiM NH,OH

Количество молекул фракции 2 убывает в меньшей степени (рис.8а.) и, даже увеличивается (рис.9), вероятно, в результате их перераспределения. Подтверждением этой закономерности может служить перераспределение молекул поли(А) мРНК проростков озимого ячменя фракций I и 3 во фракцию 2 (рис. 15), а исключением-случаи присутствия "скрытой" группы поли(А) мРНК (рис.13; 14). Напротив, предварительный прогрев суммарной РНК 65°С 10 минут, зачастую, в большей степени приводит к распаду молекул фракции 2. Это показано в таблице 5 и на рисунке 8а. Интересные результаты получаются и при длительной инкубации препаратов суммарной РНК (100 часов при 20°С. РНК растворена в буфере 20 тМ Тп5-НС1 рН 7,6). На рисунке 8 а. можно видеть, что при этом фракция 1 в четверо уменьшилась по сравнению с не инкубированным образцом; фракция 2 снизилась более, чем на половину, а . фракция 3 не изменилась. Препарат суммарной РНК после длительной инкубации прогревали

при 65°С. Это не вызвало изменений фракции 1 и 2, а фракция 3 уменьшилась так же, как и при прогреве не инкубированного препарата (рис.8а.). Очевидно, что характер изменения профиля фракционирования, в рассмотренных случаях, не соответствует представлениям о существовании "изначально" стабильных или нестабильных транскриптов и, вероятно, связан с особенностями регуляторных комплексов индивидуальных мРНК. В ряде экспериментов (рис. 8а.; 13; 15) можно наблюдать количественную детерминированность распада или перераспределения молекул в другие фракции. Выявленные группы молекул в составе фракций поли(А) мРНК из созревающего зерна кукурузы (рис. 8а.) дифференцированные по реакции на различные способы предварительной инкубации суммарной РНК, обозначены разной штриховкой на рисунке 86. Возможно, таким образом удалось выявить некоторые популяции в пуле мРНК, наличие которых отмечалось ранее другими исследователями (Кеепе, 2001; Каиа! ега!, 2004]

Ппиниипы АЛ Фракционирования попинукдеотидов. Метод АА хроматографии основан на аффинном отделении мРНК от рибосомной РНК, с последующим фракционированием матриц по уровню их конформационной сложности. Аффинное связывание поли(А) мРНК с поли(У) осуществляется в процессе нанесения препаратов суммарной РНК на колонку Поли(У>-сефарозы. После промывания колонхи однократным буфером для нанесения, пятикратно разбавленным буфером элюируются, очевидно, наиболее слабо связанные с поли(У) молекулы (фракция 1), Предположение о наличии у мРНК этой фракции коротких поли(А) "хвостов" не подтвердилось, т.к. при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу эти молекулы элюируют, преимущественно, в длиннохвостов ых" фракциях. Так молекулы поли(А) мРНК фракции 1, полученные методом АА хроматографии препаратов суммарной РНК из проростков озимого ячменя сорта Радикал, при повторном нанесении на поли(У)-сефарозу распределились следующим образом: - фракция 1 — 11,3*1,8% от нанесенной РНК; фракция 2 - 30,5±2,2%; фракция 3 - 39,2*4,1%. Такое распределение молекул, вероятно, указывает на высокую начальную структурированность поли(А)-сегментов этой группы мРНК. Термическая элюция мРНК бидистиллированной водой (65°С) снимает с колонки только часть молекул (фракция 2), остальные же прочно удерживаются и при повышении температуры элкшии до 80°С и выше. Буфером оставшиеся РНК (фракция 3) количественно снимаются даже при комнатной температуре, что указывает на не аффинную природу их задержания на колонке.

Известно, что при понижении ионной силы раствора ниже 20тМ сефароза обнаруживает "склонность" и к гидрофобной сорбции полинуклеотидов на поверхности гранул, за счет взаимодействия материала матрицы с гетероциклическими нуклеотидами, и к ионной, за счет присутствующих на ссфарозе ионогенных групп (карбоксилы и остатки сульфокислоты) [Остерман, 1985].

Таблица 8 - Аффинно-адсорбционное фракционирование синтетической

поли(А) (% от суммарного количества наносимого на поли(У) - с е ф ароэу)

Образец Фраищя 1 Фракция 2 Фракция 3

Полис A) bes предварительного прогрева 0 46.2 ± 2,6 48,5 ±4,7

Полн(А) после предварительного прогрева. 0 24,2 ± 7Л 63 ± 4Д

Многоточечный характер адсорбции обусловливает более прочное взаимодействие с поверхностью гранул — молекул, не обладающих сложной структурированностью. Это иллюстрируется уменьшением второй фракции и увеличением третьей при АА фракционировании, предварительно прогретого в буфере (20 mM Tris-MCI, рН 7,6), образца синтетической поли(А) (Табл.8),

Эффект фракционирования поли(А) мРНК растений, согласно основной версии, обусловлен наличием контрастно, различающихся по прочности ассоциации с мРНК ре гуля торных комплексов. Вероятно, конформационные изменения которые претерпевает 3' некодирующий регион молекулы в процессе хроматографии или специфической инкубации, приводят либо к отделению компонентов комплекса вместе с рибонуклеазой, либо к деингибированию рибонуклеазы и после высвобождения поли(А)-хвоста при элюции с колонки — распаду молекул, либо мРНК сохраняет свой комплекс неизменным. При термической элюцин мРНК с колонки б иди отняли рованной водой происходит отделение поли(А)-хвосга мРНК от поли(У) и одновременно адсорбция молекул на поверхности гранул сефарозы. В этих условиях, с колонки сходят молекулы (фракция 2), сохранившие регуляторный нуклеопротеидный комплекс в 3 'декодирующей зоне мРНК (З'РНПК), т.е. имеющие структурированный участок, ослабляющий эту связь, а также, продукты деградации мРНК, количество которых и определяется при рециклике. Буфером элюируются мРНК, очевидно, утратившие комплекс, что позволило им адсорбироваться на гранулах по всей длине молекул (фракция 3).

Таблица 9 - Задержание на колонках МАК и поли(У)-сефарозы поли(А) мРНК 2 и 3 фракций, полученных в процессе аффинно-алсорбционной хроматографии препаратов суммарной РНК из созревающего зерна кукурузы линии Висконсин 64А (% от количества наносимой РНК)

Образец МАК П оли(У>се фар аза

Фракция 2 Фракция 3 74,9 ± 0.5 98.7 ± 0,7 722 =ь 1,3 44,3 ± 5.1

Подтверждением этой гипотезы служит практически стопроцентная сорбция на МАК мРНК третьей фракции (Табл.9), что свидетельствует об отсутствии распада, а их небольшое количество связавшееся с лоли(У)-сефарозон при повторном нанесении, вероятно, объясняется тем, что утратившие ЗРНПК молекулы в растворе образуют динамический клубок, в котором поли(А)-хвост мРНК может оказаться недоступным для аффинного взаимодействия. Напротив, наличие З'РНПК у мРНК второй фракции, определенным образом, организует 3' некодирующий регион, включая поли(А)-"хвост", что обеспечивает задержание всех не деградировавших молекул на поли(У)-сефароэе.

Функциональные особенности поли(А) мРНК Фракций, получаемых в процессе АА хооматогваФии. Отмеченное в предыдущих разделах сходство популяционного состава фракции 1 и 3 (рис.8; 9; 13), а также синхронность и направленность в динамике количественных изменений этих фракций (рис. 10; 14), указывают на их принадлежность к одной группе мРНК функционально отличающейся от группы, к которой принадлежит фракция 2. Логично предположить, что происходит разделение мРНК свободных и полисомных мРНП. Косвенным подтверждением гипотезы о природе фракций может служить показанное на рис.10 уменьшение 1-ой и 3-ей и увеличение 2-ой фракции в процессе 30 часового роста как в препаратах из клеток листа, так и колеоптиля.

В цитоплазме молодой клетки в основном присутствуют свободные мРНП, часть из которых переходит в полисомы по мере ее созревания [Weber & Schweiger, 1985]. В этой связи представляется закономерным увеличение 2-ой фракции, предположительно полисомной мРНК, индуцированное экзогенным кинетином и, напротив, блокирование этого процесса АБК, наблюдаемое в препаратах из клеток колеоптиля. Сложнее объяснить эффект стимуляции увеличения 2-ой фракции абсцизовой кислотой и некомпетентность к действию кинетика, проявившийся в препаратах из клеток листа. В этой ткани у 4-х суточных проростков ячменя, очевидно, преобладают меристематические клетки и клетки, только приступившие к растяжению.

Действие экзогенной АБК может способствовать форсированию реализации генетической программы, в данном случае - процесса созревания клеток.

I ш 55 V] о ю ю « а ю Ю »

П)>Я№и»ап«и||Ц № ««п^мнат« <*««)

Рис. 10 — Пшенеши профиля АА фряадюшрояяша препаратов поли(А) мРНК 1Г» ткднсй шютл н КАлеотиля лророспсов ои-пиого пмсш сорта Нясптом: ицауцирявмно« » процессе ¿0 часового роста II под плинием 5К«г«нныХ кинетика н АВК

■ контроль, —«— ыиспт,--*— АЕК

Предположение о принадлежности мРНК фракций 1 и 3 к группе свободных, а фракции 2 -к полисомным частицам согласуется с данными о том, что мРНП, изолированные из постлалисомного супернатанта ультрацентрифугированием и при этом седиментирующие одним пиком, разделяются на две очень контрастных по прочности ассоциации с сорбентом фракции в процессе аффинной хроматографии на олиго(4Т)-целлюлозе [Уас^ й а!., 1990].

Чтобы подтвердить изложенную выше гипотезу, использовали традиционный метод разделения свободных н полисомных мРНП—дифференциальное ультрацентрифугирование и, менее широко используемый метод - нуклеопротеид-иелитную (НПЦ) хроматографию {Лихтенштейн и др., 1976].

яУЬыпрацемтрпфупцхжанне

А НЛЦ'Хр&пмиофяфял

« Р 3

г -1

<Л Я

3

ггт:

РНК из супершшш

РНК из осадка

Рис. 11-АЛ фржциомуовашк гвш^А) мРНК т п^партов ыРНП, получешых методом днфферениилного упыре Ц(шрнфуп|> овям и т проростков огыого нтга сорта Бастион и методом нуклеопротещ-це л пной (НПЦ) хроматографии -го

РНК ¡фракции РНОфрагаш проростков о*мой пшешцм скапонкиНЩ Краснодарская 39

В силу технических, причин (угловой ротор при ультрацентрифугировании и ступенчатая элюция мРНК при НПЦ хроматографии) в наших экспериментах происходило частичное

перекрывание фракций свободных и полисомных мРНП. Тем не менее, на рисунке II показано, что поли(А) мРНК из обогащенных препаратов свободных мРНП, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и НПЦ хроматографии (рис. 11 а. -РНК из сулернатанта и б. - РНК 1-й фракции с колонки НПЦ), в процессе АА фракционирования предпочтительно распределились в 1-й и 3-Й фракциях, в то время как мРНК из препаратов полисом (рис.11а. - РНК из осадка и б. — РНК П-й фракции с колонки НПЦ) в большей степени элюировались во 2-й фракции.

"Скрытая" группа поли fА) мРНК. Окраска проростков методом Фёльгена (дифференцированно окрашивается только ДНК) [Паушева, 1974) позволяет визуализировать зоны интенсивного деления клеток (рис. 12). Известно, что на протяжении всего периода вегетации функционирует, так называемая, "основная" или первичная меристема [Clowes, 1961] у основания листа (рис. 12в.) и на кончике корня (рис. 12г.). Кроме "основной", есть еще и "временные" - вторичная и третичная меристемы, расположенные, в частности, на кончике и по краю листовой пластинки и существующие до тех пор, пока продолжается рост листа {Гиляров и др., 1986]. Пример вторичной меристемы, локализованной на кончике листа, представлен на рис.12 6.

У двух и трехсуточных проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 стебель окрашен в темный цвет (рис. 12а.), что указывает на преобладание "молодых" клеток, а светлая окраска средней части стебля четырехсуточных проростков свидетельствует о "зрелости"

прохождение стадии

Рис.П- Проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 окрашенные по методу Фельгена

A. • 1; 2; и 3 • двух, трех и четырехсуточные проростки, соответственно. Выделенные и обозначенные буквами зоны, в увеличенном виде, представлены на рисунке: Б.-кончик листа.

B.-основакие стебля. Г.-кончик корня.

1зона интенсивного деления клеток

2.- зона растяжения

Значительный интерес представляло исследование пула цитоплазматических мРНК из клеток, находящихся на разных стадиях зрелости, с помощью метода АА хроматографии на поли(У)-сефарозе. Технически более просто использовать среднюю часть колеоптиля ("зрелые" клетки) и кончик (1-3 мм) листовой пластинки. В последнем случае можно утверждать, что в срезанной ткани преобладают меристематические клетки.

На рисунке 13 показано, что профили фракционирования поли(А) мРНК методом АА хроматографии различаются: для клеток колеоптиля и апикальной меристемы листа (рис. 13а. и б.); для контрольных и стрессированных проростков (рис. 1 За.); для инкубированных

клеток этой зоны, т. е. о том, что они закончили или растяжения.

различными способами препаратов суммарной РНК (рис, 13а., б., в.).

Краснодарская 3 9

Я.

I1 1

5 '1,6- I Й

§ 1.2-

S1 -

¡0.6-Э 0.4-S 0,2-1

I

а-*

1 2 3 4 5 6

Клетки колеоптиля

s П ■ щ п 2. ■ » з 2

ÉLtkblM

12 3 4 5

Апикальная меристема листа

Безостая 1

I -

О

а б.

§

1

а

5 «

Lili

i

2 -131.6-U-IX-1 -030,60,4-

од-

Краснодэрская 39 'i

J

Э

I

1

12 3 12 3

Кяеш) кап«огття Ara вольная меристема лисп

рН7,<5 рШ,б рДО.б Лгошальная меристема лисп

Рис. 13 • Изменение профиля АД фракционирования поли(А) мРНК проростков озимой пшеницы сортов Краснодарская 39 и Безостая 1, обусловленное реакцией на стрессовое воздействие, атак же, предварительной инкубацией соответствующих препаратов суммарной PJIK 1-3 - РНК проростков не подвергнутых стрессовому воздействию; 4-6 - РНК проростков, подвергнутых воздействию пониженной температуры (4°С 5 часов). 1 и 4-препараты РНК без предварительной инкубации (контроль); 2 и 5-препараты РНК предварительно прогревались 65"С 10 мин; 3 и 6 препараты РНК предварительно инкубировались 100 часов при 20"С; в. - Препараты суммарной РНК предварительно ннкуб1(ровалнсь 60 мни при 20°С в 40 мМ буфере Трис-HCI рН 7,6; 8,6; 9,6.

Очевидно, что стрессовое воздействие сильно изменило популяционный состав фракций поли(А) мРНК из клеток колеолтиля. Об этом можно судии, не только по изменению профиля фракционирования контрольных образцов (рис. 13а. Клетки колеоптиля 1 и 4), но и по изменению во всех фракциях доли стабильных молекул в условиях прогрева при 65°С 10 минут (рис. 13а. Клетки колеоптиля 2 и 5) и инкубации при 20°С 100 часов (рис. 13а. Клетей колеоптиля 3 и 6). Влияние воздействия пониженной температуры (4°С 5 часов) на меристематических клетках отражается в меньшей степени (рис. 13а. Апикальная меристема листа 1 и 4). Об этом свидетельствует отсутствие количественных изменений фракции 2 и 3.

Изменения затрагивают только первую фракцию.

Общий выход пол и (А) мРНК из апикальной меристемы листа (рис. 13а, Апикальная меристема листа 1 и 4; б, 1) существенно ниже (контрольные образцы - 2,31% от суммарной РНК, а стрессированные - 2,05% (сорт Краснодарская 39», чем соответствующие образцы из клеток колеоптиля (контрольные образцы - 4,78% и стрессированные - 4,14%). Однако инкубация препаратов РНК из клеток меристемы 100 часов при 20°С и при прогреве 65°С - в случае с подвергнутыми стрессовому воздействию проростками, приводит к увеличению общего выхода поли(А) мРНК до 3,5±0,07% от суммарной РНК, т.е. в среднем на 34 и 58% для Краснодарской 39 (рис. 13а. Апикальная меристема листа 3 и 5) и на 60% для Безостой 1 (рис. 136. Апикальная меристема листа 3). Таким образом выявлено наличие в препаратах РНК из меристематнческих клеток особой "скрытой" группы мРНК, возможно предзапасенной для более поздних этапов их развития. В случае инкубации РНК апикальной меристемы листа при рН близкой к нейтральной (рН 7,6) эта группа распределилась исключительно в 1 и 3 фракциях (рис.13 Апикальная меристема листа - а., б), а по мере увеличения рН в инкубационном растворе всё больше молекул переходит во 2-к> фракцию (рис.13в).

In vivo определенные изменения, очевидно, в структуре регуляторных комплексов мРНК "скрытой" группы происходят не только в процессе роста клеток, но и при стрессовом воздействии. Это можно заключить по индукции появления "скрытой" группы - прогревом 65®С 10 минут препаратов суммарной РНК стрессированных растений (рис.13. Апикальная меристема листа а. 5), что не отмечалось в аналогичных условиях на препаратах из нестрессированных растений (рис.13 Апикальная меристема листа - а. 2; б. 2).

Фракция 1 Фракция 1 Фрлкшм 3 Eafni ядам

--'tí

, JEtít-cmnart

О 1,5 5 О 2,5 5 О 2,5 5

Продскпжтспьносгъ эксперимент« (часов). Контрольны* ркнши ——

Стрк«ф№М||Ш«p»itmu gg] ; В г—□-фрШФМ 1-Q"Франция 2:

[ОКТр ОЛЬНЫ» ClfWtHp«íii»«í стшл»(ЮС) (4 с 5 часов)

| -фракция А

Рис.14 - АА фракционирование пол и (А) мРНК из проростков холодоустойчивых сортов озимого ячменя Бастион, Радикал и слабоустойчивого Циклона - а. Растения контрольные и подвергнутые воздействию пониженной температуры; 6. 1, - РНК без инкубации; 2. - РНК предварительно инкубированная в присутствии с 40 шМ ЫН,ОН 60 минут; е. и г. препараты РНК инкубированные 60 мин. в буфере содержащем 40 тМ Трис-НС! (рН 8,6 и 9,6).

Воздействие пониженной температуры на четырехсуточные проростки озимого ячменя сортов контрастных по стрессоустойчивости, вызывает 1п v^vo количественные изменения

фракций поли(А) мРНК, полученных методом АА хроматографии (рис. 14а.). Аналогичные или очень схожие изменения профиля фракционирования можно нкзуиировать in vitro, если перед хроматографией различными способами (NH«OH (рис.146.) и буфер (рис. 14в.)) на непродолжительное время сдвинуть в основную сторону рН инкубационных растворов препаратов суммарной РНК из проростков, не подвергнутых стрессу.

Таким образом, выявлено наличие у этих проростков "скрытой" группы мРНК, не сорбирующейся на поли(У)-сефароэе без предварительной инкубации. Доля "скрытой" группы в общем пуле мРНК составила у холодоустойчивых сортов Бастион и Радикал 42 и 50% соответственно, а у слабоустойчивого Циклона — 26%. Причём преимущественное распределение этой труппы РНК во фракции 2 у Бастиона и во фракциях 1 и 3 у Радикала, индуцируемое как in vivo, так и in vitro (рис.14а.; б.; в.), вероятно, отражает индивидуальные особенности этих сортов. Инкубация в тех же условиях препаратов РНК, выделенных из проростков подвергнутых холодовому стрессу (среди еустойчивый сорт Скороход), вызывает распад большей части поли (А) мРНК (рис.14г.).

Можно заключить, что неспособность мРНК "скрытой" группы без предварительной инкубации связываться с поли(У)-сефарозой, очевидно, объясняется высокой структурированностью и закрытостью их пол и (А)-хвостов

Модель механизма регуляции белкового синтеза растений при стрессе. Ранее рассматривались случаи количественного увеличения фракции 2 в результате перераспределения молекул из других фракций, индуцированного предварительной инкубацией (рис, 9; 13в.). Такое же перераспределение показано и на рисунке 156., но здесь привлекает внимание сходство реакции in vitro - изменения профиля фракционирования индуцируемого инкубацией при повышенных значениях рН препаратов суммарной РНК из контрольных растений, с тем, что происходит in vivo в процессе 30-ти часов роста проростков озимого ячменя (рис.15а.).

а. . i

|| U

и.

г

Л Л

ь gg

йа

\1»

г-.

ч

о

П о

¡1 I

Ц | ||

РНК шпршодв рзекий

РШСрктапй нош 30i

роен

м

м

И

г* О <¡3.

1 t

"i

о

£ ЧШ S

lis.

К0Ш]Н№ йкубщю (ía ннкубадй претдиш РЕК протоков РНК)

ÍNH4OH

Рис. i 5 - Изменение профиля АА фракционирования препаратов поли(А) мРНК проростков озимого ячменя сорта Бастион: in vivo индуцированное в процессе 30 часового роста и in vitro — в результате инкубации препаратов суммарной РНК в присутствии 40шМ NH4OH 60 минут.

Индукция in vitro аналогичного происходящему в процессе 30-ти часового роста проростков перераспределению поли(А) мРНК между фракциями (рис.15а.; б.) позволяет предположить, что регуляторный комплекс в 3* некодируюшей зоне (З'РНПК), кроме определения стабильности мРНК, обеспечивает и изменение их функционального состояния. In vitro переход во вторую фракцию, очевидно, связан с тем, что регуляторные комплексы, компоненты которых ранее отделялись вместе с рибонуклеазой, становятся более прочно связанными с мРНК. Объяснить такие изменения можно исчезновением некоего фактора "разрыхляющего" З'РНПК. Если представить, что этот фактор, предположительно ингибитор трансляции (блокирование процесса инициации может осуществляется при взаимодействии с КЭП-структурой), входит в состав регуляторных комплексов свободных мРНП и закрывает при этом часть поли(А)-последовательности, то индуцированное in vivo его отделение освобождает место для растительного РАВР (poly(A)-binding protein), присоединение которого, в свою очередь, может вызывать конформационные изменения этой зоны молекулы,

позволяя вытеснить альтернативный мажорный белок с поли(А) и уменьшить его количество в других частях матрицы, т.е. активировать мРНП аналогично показанному для клеток животных [Овчинников и др., 2001]. Простейший вариант гипотетической модели, описывающей работу З'РНПК, представлен на рисунке 16, хотя, очевидно, что функцию ингибитора иуклеазы более эффективно могут выполнять микроРНК (miRNA), обнаруженные в составе многих мРНП [Hieronymus & Silver, 2004].

АКТИВАЦИЯ мРНП

7toG *

7roG«

Регуияториый нуклеопротя}дный комплекс в 3 «^кодирующей гоне мРНК СЗ'РНШС).

Нуклсаэа З'РНПК.

Деадгвил ирующая нуклеазл

Индуктор З'РНПК Неактивная и актив провал идя форма

Ингибитор

■трансляции

CTr.Ing.).

Растите ль ныв РАБР

Рис. 16. — Схема функционирования гипотетического регуляторного нуклеопротеилного комплекса в 3' некодирующей зоне мРНК (З'РНПК).

При укорочении лоли(А)-хвоста мРНК эукариот деаденилируюшей нуклеазой до 20 нуклеогидов и ниже, деградация молекулы происходит скачкообразно [Айтхожин, Искаков, 1982], очевидно, в результате активации другой ассоциированной иуклеазы [Плотников, Бакалдииа, Бибишев, 1993]. При стрессе возникает необходимость быстрой деградации определенных видов мРНК [Каша) е1 а!, 2004], что может индуцироваться прямым воздействием цито плазматического эффектора на З РНПК этих матриц (рис.16).

Соответствие изменений профиля фракционирования, вызванных in vivo: действием пониженной температуры (рис.! 4а.) и в процессе роста проростков (рис.15 а.), и in vitro -сдвигом pH в основную сторону в инкубационном растворе контрольных препаратов суммарной РНК (рис.146.; в.; г. и рис.156.; в.), - выявляет сходство этого воздействия с цито плазматическим сигналом, на который настроены регуляторные комплексы мРНК. На начальном этапе холодового воздействия в ряде случаев происходит сдвиг цитоплазматической pH в основную сторону у растений [Пятыгин и др., 2005]. Постепенный сдвиг цитоплазматической pH в основную сторону происходит и в растущих клетках лсд влиянием ауксина, вызывающего перекачку протонов (Н4) из цитоплазмы к клеточной стенке [Медведев и др., 1999]. Есть основания предполагать, что именно изменение цитоплазматической pH, в первую очередь, является тем сигналом (универсальным эффектором), на который специфически настроены 3 регуляторные комплексы мРНП.

Смена наборов синтезирующихся белков является обязательной составляющем адаптивного синдрома [Пахомова, 1995], однако белковый состав, например, при гипер и гипотермии качественно различается. Тем не менее, определенная неспецифичность в трансляционном ответе на стресс сохраняется, т.к. синтез белков теплового шока могут индуцировать: ионы тяжёлых металлов, ультрафиолетовое излучение, поранение, действие определённых фитогормонов и еще длинный ряд других факторов [Кулаева, 1997], а в ответ на воздействие пониженной температуры синтезируются стрессовые белки, которые индуцируются также: осмотическим шоком, неорганическими солями, патогенами вирусного и бактериального происхождения н т.д., но не тепловым шоком [Едрева, 1991]. Группирующим эти факторы может оказаться характер вызываемых ими изменений состояния (текучести) билипкдного слоя клеточных мембран [Пятыгин и др., 2005], Следует добавить, что синтезу белков теплового шока, независимо от индуцирующей причины, предшествует и качественно с ним коррелирует сдвиг цитоплазматической pH в кислую сторону [Weitzel et al,, 1987].

Дифференциальный распад или изменение функционального состояния (перераспределение в другие фракции) мРНК, индуцированное действием различных факторов как in vivo, так и in vitro, позволяет представить модель молекулярного механизма регуляции белкового синтсза на начальном этапе стрессового воздействия. Известно, что группы свободных и полисом я ых мРНП состоят из популяций [Кеепе, 2001; Kawai et al,, 2004] предположительно, являющихся элементами (подпрограммами) общей физиологической программы клетки [Кеепе, 2001], т.е. кодирующих наборы белков, необходимых для поддержания жизнедеятельности растений, в том числе и в определенных интервалах напряженности стрессового воздействия. Молекулы в популяциях обладают способностью идентично реагировать на воздействие [Kawai et al., 2004], что, возможно, объясняется наличием у них одинаковых З'РНПК. В свою очередь, регуляторные комплексы, очевидно, различаются между собой по диапазону воспринимаемого ими цитоплазматического сигнала, коррелирующего с уровнем напряженности стресса, обеспечивая адекватность изменений в составе транслирующихся мРНК, а, следовательно, и в спектре вновь синтезированных белков - изменившимся условиям. Представляется, что важной составляющей адаптации является "запрограммированость" пула цитоплазматических мРНП зрелой клетки на обеспечение ее перехода в различные стационарные режимы функционирования.

Уход растений в вынужденный покой (механизм приобретения неспецифической устойчивости к внешним условиям), являющийся одним из таких стационарных режимов функционирования, обусловлен снижением интенсивности клеточных процессов в результате изменения композиции экспрессирующихся генов. Сорта зерновых культур, обладающие высокой скоростью формирования адаптивного ответа, а также способные осуществлять более "глубокие" адаптивные преобразования клеточных процессов, благодаря наличию соответствующего набора предзапасенных в цитоплазме частиц мРНП, т.е. - высокой

"функциональной устойчивостью", очевидно, нуждаются в меньшем времени необходимом для погружения в состояние "вынужденного покоя" или выхода из него. Об этом свидетельствуют, присущие им, высокие ранги морозоустойчивости [Маймистов, 2001]. Кроме того, эти сорта обладают большим потенциалом неспецифической адаптации к воздействию различных, по своей природе, неблагоприятных абиотических факторов.

Однако, слишком быстрое формирование адаптивного ответа и "глубина" адаптивных преобразований клеточных процессов не всегда являются ценными качествами возделываемой культуры. Так, небольшое изменение внешних условий может быть началом стрессового воздействия, а может — непродолжительным отклонением от средних значений. Если растение на это реагирует кардинальным изменением физиологических процессов, клеточного метаболизма, то в первом случае оно успешно адаптируется к стрессу и избежит серьезных повреждений клеток и тканей, а во втором — напрасно потратит энергию и "пластические вещества'', что отразится на главном критерии оценки того или иного сорта - урожае. Одной из основных проблем современной селекции является создание сортов оптимально адаптированных к местным условиям, т.е. сочетающих, наилучшим образом, соответствующие этим условиям показатели "функциональной устойчивости".

В настоящее время уже созданы или находятся в стадии разработки диагностические методы тонкой количественной оценки главных составляющих "функциональной устойчивости", основанные на предложенных нами молекулярно-кинетических маркерах. Так, скорость формирования адаптивного ответа определяется по динамике изменения доли тяжелых полисом в препаратах мРНП из стрессированных растений или, в каких-то случаях, по величине пороговых значений напряженности неблагоприятного воздействия, "запускающих" адаптивные процессы, А "глубина" адаптивных преобразований клеточных процессов растения - по величине нестабильной популяции поли(А) мРНК (с использованием двуци клич ной аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе) и количественного изменения фракций поли(А) мРНК (с использованием АА хроматографии на поли(У)-сефарозе). Представляется перспективной разработка маркера основанного и на выявлении популяционного состава этих фракций.

Скрининг и оценка селекционного материала новыми методами позволит подробно изучить особенности сортов, хорошо адаптированных в тех или иных климатических условиях, создать коллекции, в которых будут дискретно представлены признаки, составляющие "функциональную устойчивость" во всем спектре своих проявлений. Это значительно облегчит селекционерам работу по подбору родительских пар и в дальнейшем выявление генотипов сочетающих нужные комбинации данных признаков.

ВЫВОДЫ

]. Эффект изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП) in vitro отражает универсальную для многих абиотических стрессов адаптивную реакцию проростков озимой пшеницы и ячменя,

2, На начальных этапах стрессового воздействия степень изменения ТАП in vitro коррелирует с рангом устойчивости сортов зерновых культур, что является молекулярно-кинетическим маркером для создания диагностического метода, применимого в селекционной практике.

3, Изменение ТАП in vitro обусловлено варьированием в препаратах из стрессированных проростков озимой пшеницы и ячменя доли "тяжелых" полисом по отношению к моносомам.

4, В препаратах суммарной РНК, выделенных в присутствии ионов Mg**, частицы рибосомной РНК сохраняют "компактную" структуру, препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе, что позволяет использовать метод аффинной хроматографии в аналитических целях.

5. Выход поли(А) мРНК из суммарной РНК проростков озимой пшеницы и озимого ячменя во втором цикле количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов, что было использовано в качестве молекулярно-кинетического маркера для создания диагностического метода.

6. Распад мРНК in vitro осуществляется ассоциированной с транскриптом РНКазой, очевидно входящей в состав устойчивого к традиционным депротеивизирующим агентам регуляторного нуклеопротеидного комплекса в 3' некоднруюшей зоне мРНК (3' РНПК).

7. Наличие 3' РНПК в составе мРНП обусловливает эффект аффинно-адсорбционного фракционирования пула мРНК в процессе хроматографии на поли(У)-сефарозе.

8. Метод аффннно-адсорбционной (АА) хроматографии позволяет дифференцировать и количественно оценивать свободные и полисом вые мРНК в пуле информационных РНК.

9. Инкубация препаратов суммарной РНК перед АА хроматографией позволяет дифференцировать популяции мРНК в составе фракций и, кроме того, выявлять присутствующую в некоторых тканях так называемую "скрытую" группу молекул, не сорбировавшихся на поли(У)-сефарозе в обычных условиях.

10. Наличие 3' РНПК в составе мРНП программирует не только дифференциальный распад информационной молекулы, ко и изменение ее функционального состояния ¡ft vivo.

11. Динамика количественного изменения фракций свободных и полисомных мРНП коррелирует с рангом стрессоустойчивости сортов, что может быть использовано в качестве молекулярно-кинепического маркера для создания диагностического метода.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

Метод оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур, основанный на определении динамики количественного изменения доли тяжелых полисом в процессе стрессового воздействия, рекомендуется для применения в селекционной практике.

Метод аффинно-адсорбционной хроматографии является перспективным для разработки на его основе лабораторных молекулярных методов оценки стрессоустойчивости и фотопериодической реакции злаков.

В области фундаментальных исследований рекомендуется сочетание возможностей метода АА хроматографии с традиционными моле куля pi ю-биологическими методами, что позволит исследователям получать ранее недоступную информацию.

Рекомендуется, на основе предложенных методов разработать технологию комплексной оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плотников BJC, Влияние теплового шока на белоксинтезирующий аппарат зерна обычной и опак-2 кукурузы/ В.К. Плотников, В.И. Киль, В.А. Бибишев, Б.Н. Новиков//Физи<хлогия растений -1990. -Т.37,- № 2, -С.302-307.

2. Киль В.И. Неслецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом ячменя и пшеницы/ В.И. Киль, В.А. Бнбишев, В.К. Плотников //Физиология растений, >1991. -Т.38. -№4. -С.730-735

3. Плотников В.К. Дифференциальная стабильность мРНК in vitro, как показатель физиологического состояния растений / В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, В.А.Бибишев //Материалы 2-го Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", -Пушино,-1993,-0.88.

4. Plotnikov V.K.. Decay of mRNA by affinity chromatography as reflect of plant physiology state./ V.K Plotnikov., N.B. Bakaldina, V.A.Blbishev//16-th International Congress of Biochemistry and Mot. Biology, -New Delphi, India, -1994, -P. 115.

5. Плотников B.K., Бакалдина Н.Б., Бибншсв ВА "Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур" Патент РФ (по заявке Х»93-03 2022/13 от 17.06.93) №2084133 от 20.07.1997.

6. Плотников В.К.. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: влияние стрессов на стабильность мРНК in vitrof B.K. Плотников, Н.Б. Бакалдина, Б.Н. Новиков, Ж.В. Алекссенко, В.А.Бибишев, СЛ. Полежаев, В.Г Рядчиков // Генетика, -1998, -№9, -С Л 2051211.

7. Бнбишев В .Л. Хромато графическое разделение мРНК свободных и полисомных информосом, как метод изучения реакции злаковых на стрессовое воздействие/ В.А. Бнбишев //Сборник научных трудов посвященный 100-летию В.А.Невинных. -Краснодар, -2000, -С.208-214.

8. Бнбншсн В.А. Распад рРНК in vitro, как индикатор интенсивности синтеза белка в клетке/ В.А. Бнбишев, Б.Н. Новиков, Ж.В.Алексеенко//Материалы научно-практической конференции "Зеленая революция П.ПЛукьяненко". -Краснодар. -2001. -С. 527-533.

9. Бнбишев В.А Фракционирование пула мРНК свободных и полисомных информосом, как метод оценки хозяйственно полезных признаков зерновых./ В.А. Бнбишев //Материалы Всероссийской конференции Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека, -Ставрополь, -2001. -C.18-I9.

10. Бнбишев В.А Изучение молекулярного механизма устойчивости злаковых к неблагоприятным абиотическим воздействиям/ В.А. Бибишев //Материалы Всероссийской конференции Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека. -Ставрополь, -2001. -С.20.

11. Давоян P.O. Цитологическая и биохимическая характеристика новых интрогрессивных линий озимой мягкой пшеницы/ Р.А.Давоян, И.В.Бебякина, Э.Р.Давоян, В.А.Бнбншев//Наука Кубани, 2007. № 1. С.40-43.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота.

Поли(А) мРНК - полиаденил ированная матричная кислота.

ПЭГ-8000 - полиэтилен гликол ь-8000.

МАК — метилированный альбумин кизельгур.

ТАЛ in vitro — трансляционная активность полирибосом in vitro.

РАВР - poly(A)-binding protein.

мРНП - матричные рнбонукл eon роте иды

АА хроматография - аффинно-адсорбционная хроматография на поли(У>сефарозе ЗРНПК — регуляторный нуклеолротеидный комплекс в 3' некодируюшей зоне поли(А)мРНК НПЦ-хроматография - нуклеопротеид целитная хроматография

Отпечатано в типографии «Кортика» 350000 гКрасиоаар ул. Коммунаров 73/1 Тираж 100. заказ 5119.