Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Поиск источников устойчивости к пирикуляриозу риса с помощью молекулярных маркеров с целью использования их в селекции риса

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Поиск источников устойчивости к пирикуляриозу риса с помощью молекулярных маркеров с целью использования их в селекции риса"

□ОЗОВОО15

На правах рукописи

ВОЛКОВА СВЕТЛАНА АНДРЕЕВНА

ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К [ИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ [АРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ

РИСА

Специальность 06 01 05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2007 2 4 ^ДЙ 2007

003060015

На правах рукописи

ВОЛКОВА СВЕТЛАНА АНДРЕЕВНА

ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ

РИСА

Специальность 06 01 05 - селекция ц семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2007

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте риса в 2003-2007 гг

Научный руководитель кандидат биологических наук

Мухина Жанна Михайловна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Костылев Павел Иванович

кандидат биологических наук, доцент Тюрин Владислав Викторович

Ведущая организация Всероссийский научно-

исследовательский институт биологической защиты растений

Защта соыотся «29» мая 2007 года в 10 часов на заседани диссертационного совет Д 006 026 01 при Всероссийском научнс исследовательском институте риса по адресу 350921 г Краснодар п/ Белозерное

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан 25. 2007 г

Ученый секретарь диссертационно^е^ойета

кандидат биологических наук ___Гончарова Ю К

Актуальность проблемы Рис одна из важнейших зерновых культур Его зерном питается почти половина человечества Среди факторов, лимитирующих урожаи риса, ведущее место занимают болезни и вредители Пирикуляриоз - одно из наиболее вредоносных заболеваний риса, вызываемое возбудителем Magnaporthe grísea (Herbert) Действенная и экологически безопасная стратегия борьбы с этим заболеванием - выведение устойчивых сортов, что является одним из важных направлений в селекции риса

В селекции устойчивых к пирикуляриозу сортов риса перед селекционером становятся две проблемы выбор подходящих генов устойчивости и прогноз стабильности устойчивости сорта с этой комбинацией генов Во г почему необходим простой, но эффективный метод анализа устойчивости к этому заболеванию, учитывая, что многие сорта, вовлекаемые в скрещивания, содержат несколько генов устойчивости и многие селекционные линии поддерживаются долгое время Гены вертикальной устойчивости могут быть выявлены из .анализа реакции сорта на инокуляцию моноизолятамн Magnoporthe grísea (Herbert) Barr с известными генами авирулентности Но такой классический фи-топатологический тест требует затраты времени и значительных материальных средств Также важным лимитирующим фактором является нестабильность генов авирулентности возбудителя пирикуляриоза риса и перекрывание спектра расоспецифической устойчивости

Маркирование генов устойчивости к патогену позволяет быстро и эффективно проводить пирамидирование генов в генотипе сорта

Необходимо также помнить, что неотъемлемой составляющей управления комплексом защитным мер против грибковых заболеваний растений является изучение самого патогена В свете современного развития молекулярно-биологических подходов, появилась возможность исследования генетического разнообразия молекулярно-генетическими методами

Цель и задач» исследовании. Целью работы являлась разработка систем идентификации генов устойчивости риса к биотическим стрессам (пирикуляриозу), основанных на полиморфизме ДНК-маркеров, а также изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза риса (Magnoporthe grísea (Herbert) Barr) молекулярно-генетическими методами В связи с этим в ходе исследований бьпи поставлены следующие задачи

1 Разработать ДНК-маркерную систему для выявления гена устойчивости к пирикулярио?у риса Pi-ta

2 Осуществить поиск доноров устойчивости к гену AVRPi-ta коллекции ВНИИ риса с использованием сконструированного молекулярного маркера ARRRIpi-taR/pi-taL

3 Провести «ДНК-паспортизацию» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров

4 На основании данных микросателлитиого анализа сгруппировать изоляты в соответствии со степенью генетического родства

Научная новизна исследований В настоящей работе впервые

1 Создан ДНК-маркер ARRRlpi-taR/pi-taL на основе полимераз-ной цепной реакции, позволяющий идентифицировать ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta

2 Осуществлен скрининг коллекции образцов исходного материала ВНИИ риса на наличие расоспецифического гена устойчивое i и к пирикуляриозу Pi-ta, на основе его ДНК-полиморфизма

3 Проведена «ДНК-паспортицазция» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров

4 Отобраны наиболее полиморфные маркеры, необходимые для оценки генетического родства штаммов возбудителя пирикуляриоза риса

Научно-практнчсская ценность работы.

Создан внутригенный ДНК-маркер для обнаружения гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta и создания сортов риса несущих ген Pi-ta

Показана возможность использования полиморфизма микросателлитных локусов для ранжировки изолятов Pyriculana grísea Sacc согласно генетическому родству и их географическому происхождению

Уникальность, полученных «ДНК-паспортов» позволила создать базу Степень полиморфизма между изученными изолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr, выявленная по данным микросателлитиого анализа, говорит о возможности их использования для создания ДНК-лот печатков»

Основные положения, выносимые па защиту:

1 Создание внутригенного доминантною ДНК-маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta

2 Скрининг образцов коллекции исходного материала ВНИИ риса на наличие гена Pi-ta

3 «ДНК-паспоргизация» образцов Российской коллекции возбудителя лирикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатоло-I ии

Результаты исследовании были доложены на V регионально!! научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» 18-19 декабря 2003г, г Краснодар (ул Калинина, 13), Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэко-слстем» Краснодар, 29сецгября-1 октября 2004г. Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы, научное обеспечение и перспективы развития рисоводства в XXI веке», Краснодар, 26-27 августа, 2003

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы н приложения Работа изложена на 130 страницах, содержит 13 таблиц и 19 рисунков

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2003г по 2007г в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института риса, в лаборатории микологии и иммунитета в ВНИИ фитопатологии и в лаб генной инженерии растений (кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета)

2.1 Создание виутригенного маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.

Для разработки дизайна праймеров при создании внутригенного ДНК-маркера использовали аминокислотные и нуклеотидные последовательности доминантной (источник - сорт Yashiro-mochi) и рецессивной (источник - сор г Tsuyake) аллелей гена Pi-ta Их номера в базе данных www nebí nih gov соответственно AAK00132 и АА045178 для аминокислотных последовательностей, AF207842 и AY196754 - дпя нуклеотидных последовательностей

Из литературных данный известно, что устойчивый и чувствительный аллели гена Pi-ta отличаются заменой 918 аминокислотного остатка серина на аланин Для определения данной точки полиморфизма на кодирующей этот белок нуклеотидной последовательности, аминокис-

лотная последовательность была превращена в нуклеотидную с помощью программы «Конверсия ДНК/белок», предоставленной для свободного доступа на сайте "Практическая Молекулярная Биология" http //molbioI.edu ru Затем было проведено сравнение полученных нуклеотидных последовательностей доминантных и рецессивных аллелей гена Pi-ta, с использованием алгоритма «multiple alignment» в программе CLUSTALW После определения точки полиморфизма были сконструированы два аллельспецифичных праймера На основе разработанного дизайна праймеров был сформирован заказ и праймерные пары, были синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Россия

Созданный аллельспецифичный маркер для идентификации доминантной аллели целевого iena был назван нами ARRRIpi-taR/pi-taL.

Был выполнен подбор условий ДНК амплификации Следует отметить, что праймерная пара ARRRIpi-taR/pi-taL очень чувствительна к чисготе используемой в реакции ДНК и качеству Taq-полимеразы

Для поиска источников гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta с использованием созданной маркерной системы ARRRIpi-taR/pi-taL были взяты в коллекции исходного материала ВНИИ риса следующие сорта и сортообразцы Кулон, Лидер, Кулон (Краснодар), Спаль-чик, Фонтан, Нарцисс, Кубань 3, Снежинка, Дубовский, Курчанка, Краснодарский 3352, Снежинка, Лакуна. Спринт, Краснодарский 424, Водолей, Серпантин, Изумруд, КПК 17, Стрелец, Талисман, Аметист. ВНИИР 7887, Кубань 3, Виола, ВНИИР 8847, Раздольный. Рапан. Кендзо 3782. КП-27-02, КП-9-01. КП 37-01. КП 40-02 КП 27-02, К-0632, К-0636, К-0681, К-01939, К-02129, К-2131, К-02135, К-22258, К-02385, К-02397, К-02497, К-02503, К-2332, К-2742, К-2728, К-2744, К-0681, Баллила, К-02980, К-03097, К-03524, К-03389, К-03695, К-03781, К-03782, К-02979, Азуцена, 1R 36. К-3980, Рапан (Калиниский район), Лиман (Абинский район), К1

В качестве положительного контроля для анализа полиморфизма гена устойчивости Pita использован сорт К1, несущий доминантную аллель гена, а з качестве отрицательного Nipponbare и С101А51, несущие рецессивную аллель гена Pi-ta

Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод (Murray М G , Thompson W F. 1980)

Амплификация с целью выявления полиморфизма гена устойчивости риса Pi-ta проводилась наборами для проведения ПЦР (комп Си-лекс-М, г Москва, Россия) ПЦР смесь включала Юнг ДНК, 2,5тМ MgCI2, 0,2тМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTPs) , 50mM KCl,

lOmM Tris-HCI, pH 9,0, 0,1% Тритон X-100, 0,23цМ каждого праймера, 0,25 единицы 5u Тац-полимеразы, в общем объеме 25мкл

Электрофорез проводили в 3% агарозном геле, на основе 0,5><Трис-боратного буфера (0,045 М Трис, 0,045 М Борной кислоты, 1мМ ЭДТ А, рН=8,2) при напряжении 120V в течение 1ч часа, в камерах для горизонтального электрофореза Gel Electrophoresis Apparatus GNA-100 фирмы Pharmacia

2.2 Изучение биоразнообразня нзонятов Magnoporthe grisea (Herbert) Barr Государственной российской коллекции патогена на основе полиморфизма микросателлитных локусов.

В рамках сотрудничества с ВНИИ фитопатологии было начато исследование образцов из Государственной российской коллекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr молекулярно-гснетическими методами Изучаемая коллекция охарактеризована по культурально-морфологическим признакам, количественный и качественный состав генов (а)вирулентности в грибных штаммах коллекции выявлен на основе фитопатологических тестов с использованием сортов-дифференциаторов риса

Происхождение изолятов

- Япония F-67-57n 95-85 III 117. Set-1, 138 AR1119, Ken 82-9. Ken 8211, Ken 83-16. Ken 83-21. Г-67-57, Ken 60-19, Nada 66-16, P-2b. 138A. Ken 53-83, TH-68-126, Jna 168, Ken 54-20,

- Краснодарский край, Россия P-40, KK-97-8, KK-97-10, КК-97-4 3, КК-97-18sem, KK-96usl2, KK-96usl 3, КК-97-24, КК-97-8ст, KK-97-9zer

- Славянский р-н, Краснодарский край, Россия Кр-03-01*, Кр-03-02*,

- Херсонб,Украина ХС-21 RI122 84, ХС-40, XC-3R8ctR8R4 ХС-3 R8ct R8, ХС-45мет, ХК-40 R335n42-90R1119, ХС-85 87, XK-40R6R684 ХС-78сем 86

- Крымская область, Украина КП-57мет85 KI1-7I S5 КП-32, КП-57мет R1114, КП-57мет R1114, КП-58узл. КП-68узл 86 КП-70, КП-68мет 85, KH-74usl 85, КН-18, КП-63, КП-10 83, КП-8 83

- Одесская область, Украина ОК-17узл, OK-23met, КП-16 ReReas ОК-19 R7 86, OK-28sem, ОК-26 R1122-1122-1118,

- Франция. РН-31 Rl 112. CJ-125.

- Средняя Азия СА

■"Примечание Моноизоляты Кр-03-02 и Кр-03-01 были выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии согласно методическим указаниям, разработанным в ВНИИ фитопатологии

Для генотипирования изолятов и моноизолятов фитопатогепа ис пользованы 23 «нейтральных» микросателлитных маркеров, характе ризующиеся высоким полиморфизмом, ко-доминантным характерог наследования

Для выделения грибной ДНК также использовали СТАБ-метод Амплификация микросателлитных последовательностей для выяв лении полиморфизма микросателлитных локусов Magnoporthe grise (Herbert) Barr проводилась наборами для проведения ПЦР (комп Си бэнзим, г Москва, Россия) в реакционном объеме 25мкл Параметр! ПЦР смеси в 25мкл смеси содержится 10 hi геномной ДНК, IX ПЦ! буфер (20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КС1), 0,1 шМ каждою dNTP i 1ед Taq-полимеразы

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использова ли 8% акриламидныи гель на основе '1ЬЕ Электрофорез проводил! при напряжении 250V в течение 3 часов Визуализацию проводили ультрафиолете после окрашивания 1елей бромистым этидием

Статистическая обработка данных была выполняли методами кла стерного, дисперсионно!о и дискриминатного анализа согласно мето диками описанными Г Ф Лакиным и Б А Доспеховым

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3 1. Создание внутригенного ДНК маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta

Наиболее удобными и эффективными являются внутригенные ДНК маркеры Для их разработки необходимо знание нуклеотиднон после довательности гена и его положение на хромосоме

Доминантный ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta секвенирова и имеются предположения о его роли в формировании иммушпета ри са Он расположен в области центромеры 12-той хромосомы В это: локусе располагается кластер R генов, включающий тесно сцепленны Pi-ta и Pi-ta2 гены, идентифицированные Kiyosawa с коллегами Доми нантная и рецессивная аллели этого гена отличаются одной аминокислот ной заменой в положение 918 серина на аланин Это об>словливае наличие двух аллелей данного гена Pi-ta" и Pi-ta" Нуклеотидная пс следовательность полученной праймерной пары, используемая для вы явления данного полиморфизма, представлена в таблице 3 1

Таблица 3.1 - Нуклеотидная последовательность праймеров для идентификации доминантной аллели входящей в состав доминантной маркерной системы гена Р(-1а

Назва- I

ние Последовательность мононуклео-j прайме- гидов |

_|эа _ ___I

ÁRRRIp R:CAAGTCAGGTTGAAGATGC | i-taR/pi- ATAGC(24n.o) i tal.*: L:GCTGCTTGTTCGAACAGCGC¡ __СIGC(24 и.o)......' ___|

Для проверки эффективности созданной маркерной системы была поставлена пробная ПЦР с сортами К1 (положительный контроль) и Nipponbare (отрицательный контроль)см. рис. 3.1.

"¿»W.K1 Nb fp.ww и» ■

Рисунок 3.1 Генетическое разнообразие, выявляемое с помощью доминантного маркера ЛККР1рМаК/ркаЬ Примечание: ш»,- маркер молекулярного веса ДНК. Соре К1 (положительный контроль), МрропЬагс {отрицательный контроль).

Из рисунка 3.! видно, что аллельная миграция наблюдалась только в случае использования сорта, несущего доминантную аллель гена Рь!а (положительный контроль); и отсутствовала у сорта с рецессивной аллелью гена {отрицательный контроль).

Таким образом, анализ резульчатов предварительною апробирования созданной аллельспецифнчной ДНК-маркерной системы показал ее эффективность при идентификации доминантной аллели гена устойчивости к иирикуляриозу И-1а, что свидетельствует о перспективности ее использования в программах маркерной селекции на устойчивость риса к иирикуляриозу.

3.2 Поиск источников гена устойчивости РМа среди сортов и соргообразион коллекции исходного материала ВНИИ риса при помощи маркерной системы А1ШШрМаКУрИаЬ

С использованием созданного доминантного маркера устойчивости проверено наличие гена Р|4а в 66 сортах и сортообразцах из коллекции исходного материала ВНИИ риса (см. рис 3.2).

Рисунок 3.2- Электрофоре! и чес кое разделение продуктов амплификации праймеров АЯЯЕ^рМаЯ/р^аЬ

Примечания: сорт: К1 (положительный контроль), МЬ МрропЪаге (отринагельный контроль), 1-65 номера сортов, представленных на сгр.6

Данные эксперимента показали, что ген РИа выявлен в сортах 1К 36 (ШЯ1) и К1 (Франция).

3.3 Изучение биоразнообразин изолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr Г осударственной российской коллекции патогена на основе молекул я рно-ге нет и чес кого подхода

В виду сопряженной эволюции возбудителя Magnoporthe grísea (Herbert) Barr и поражаемого им растения Oryza sativa, изучение фито-патогена - важная составляющая часть селекционных программ, нацеленных на создание уст ойчивых к пирикуляриозу сортов риса. Генет ическая паспортизация патогена в различных зонах рисосеяния, кроме того, имеет большое значение для изучения его мирового генетического многообразия, что является одной из ключевых задач совместных усилий ученых из международных исследовательских центров (CIRAD, IRRI. CDC). Мониторинг расового состава паразита в разных рисосеющих регионах мира необходим для разработки правильной селекционной стратегии в создании устойчивых сортов риса.

Стреми i ельное развитие биотехнологии привело к появлению современных молекулярно-генетических методов исследования расового состава данного (как и многих других) патогспа В первую очередь -это возможность установления генетического родства между выделенными изолятами патогена на основе применения молекулярных маркеров, в том числе - и с изолятами с известными генами (а)вирулентности Кроме того, генетическая паспортизация изолятов патогена, необходима при защите авторских прав держателей коллекций последнего

В рамках данного исследования проведена генетическая паспортизация единственной в России коллекции патогена, держателем которой является Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии ДНК 59 изолятов коллекции с известными генами (а)вирулентности, охарактеризованных, кроме того, по комплексу культурально-морфологических свойств ,была любезно предоставлена нам для проведения молекулярного (микросателлитного) анализа сотрудниками лаборатории микологии и иммунитета ВНИИФ Моно-изоляты Кр-03-02 и Кр-03-01 выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии из Краснодарской популяции патогена

Высокий полиморфизм, выявляемый SSR-маркерами, ко-доминантный тип их наследования, аллельспецифичность определяют ценность этой маркерной системы позволяет говорить о возможности ее использования для оценки генетической изменчивости между изолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr

Идентификация и паспортизация изолятов может выполняться на основании данных о аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого изолята В связи с этим для оценки степени генетического сходства среди избранных нами изолятов коллекции ВНИИ фитопатологии, и составления их ДНК-фингерпринта, было использовано 23 нейтральных, т е не сцепленных с каким либо геном, микросателлитных маркеров, отобранных исходя из принципа максимального полиморфизма, основанного на литературных данных От анализа двух маркеров отказались, в связи с тем что они не показали полиморфизма на изучаемых изолятах Как видно из табл 3 2, маркеры проявили различный уровень полиморфизма от двух до двенадцати аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом но маркерам Pyrms 43 - 44, Pyrms 59 - 60, Pyrms 99 - 100 и Pyrms 125-126

Таблица 3 2 Полиморфизм микросателлитных локусов изолятов Государственной российской коллекции Magnoporlhe grísea (Herbert) Barr,

№ пп Прай-мер Размер ам-плифициро-ванных аллелей, п о Число выявленных аллелей

1 2 j 4

1 Pyrms 7 - 8 99-159 7

2 Pyrms 15 -16 133-177 6

3 Pyrms 37 -38 190-205 4

4 Pyrms 39 -40 430-510 7

5 Pyrms 43 -44 166-344 9

6 Pyrms 45 -46 200-257 175-185 7 4

7 Pyrms 47 -48

8 Pyrms 59 -1 168 367 ¡bu 9 4

9 Pyrms 61 -62 220-285

10 Pyrms 63 -64 176-187 5

И Pyrms 67- 194_775 6

12 Pf™77" 106-208 to 7

13 Pyrms 81 - 184 232 o¿ 7

14 Pyrms 83 84 8

15 Pyrms 87- 174_250 öo 7 6 1

16 Pyrms 93-! 94 i

№ пп I Размер ам-Прай- 1 плифициро-мер ванных аллелей, и о Число выявленных аллелей

1 2 3 4

17 Ругтз 99 -100 173-255 10

18 Ругтз101 - 102 454 2

19 Ругтз107 - 108 290-350 5

20 РУ™8115; 369-453 - 116 5

21 РУ™ 125: 120-364 -126 12

Примечание п о пар нуклеотидных оснований

На рисунках 3 4-3 5 представлено аллелъное разнообразие в микро-сателлитных локусах патогена, выявленное изученными маркерами Наибольшее аллельное разнообразие (9-12 аллелей) показали маркерь Ругтз 43 - 44, Ругтз 59 - 60, Ругтз 99 - 100 и Рунш 125 - 126 Осталь ные маркеры можно условно разделить на две группы исходя из выяв ленного ими полиморфизма К первой - относятся следующие Руплэ - 8, Ругтэ 15-16, Ругтз 39-40, Ругтз 45-46, Ругтз 67-68, Ругтз 77-78 Ругтз 81-82, Рунт 83-84, Ругтз 87-88, Ругтз 93-94 с количеством ал лелей от 6 до 8 на один микросателлитный локус К группе маркеров выявивших проявивших еще более низкий полиморфизм, принадле жат Ругшь 37 - 38, Рупш 37-38. Ругтз 47-48. Ругтз 61-62, Ругтз 63-64 Руппэ 107-108 Число аллелей на один локус здесь было равным 5-4 г даже 2 - по маркеру Ругтз 101-102

После идентификации аллелей и определения их размеров в соот ветствин с маркером молекулярного веса ДНК, был проведен учет час тоты встречаемости аллелей по каждому маркеру у нсследованны> изолятов На приведенных ниже диаграмме (рис 3 3) показаны часто ты встречаемости аллелей микросателлитных маркеров, выявленные г ходе исследования

Рисунок 3,3 Частота аллелей, выя вели ная у изучаемых изолятов патогена в ми крое ател л и т но м локусе Ругт 125-126 Примечание: и.о. - пар нуклеотилных оснований

У большинства маркеров выявляются аллели, которые наиболее распространены у исследованных изолятов. 1ак, к примеру, у II из 23 использованных маркеров более 50 % изолятов совпадали по одному из аллелей. Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества изолятов свидетельствует об относительной генетической их близости. Это вполне может являться следствием того, что различные группы изолятов, сформировались на основе небольшого числа исходных популяций. Наряду с этим можно предположить, что аллели наиболее распространенные у исследованных и юля гон, могут характеризовать некий общий тип возбудителя пирикуляриоза, который образовался путем естественного отбора.

Рисунок 3,4 Генетическое разнообразие, выявленное и локусе Pyrms 125-126

Примечание: mw.- маркер молекулярного веса ДНК. И золят ы: 1 -Nada 66-16, 2-Кеп 54-20, 3-TH-68-I26, 4-Кеп 60-19, 5-F-67-57, 6-Jna 168, 7-Кеп 53-83, 8-P-2b, 9-138Д, Ш-ХС-40, 11-ХС-З R8cr R8, 12-OK-266usl, I3-KP-16 R6R6.82, 14-КР-32. 15-КН-18.

ы

Рисунок 3.5 Генетическое разнообразие, выявленное в локусе

Pyrms 7 8

Примечание: invv.- маркер молекулярного веса ДПК.Мюляты I-Nada 66-16, 2-К.еп 54-20, З-ТН-68-126, 4-Кеп 60-19, 5-Р-67-57, 6-Jna 168, 7-Кеп 53-83, 8-P-2b, 9-138А, 10-ХС-40, 11-ХС-З R8cr RS, i2-OK-266usl. 13-КР-16 R6R6.82, 14-КР-32, 15-КН-18, 16-ХС-85.86.

По результатам анализа о наличии аллелей у изолятов, использованных в работе, была составлена матрица. Среди всех изученных изолятов не было обнаружено двух с идентичным набором аллелей.

Таким образом. Результат эксперимента показал эффективность использования полиморфизма микросатсллитных локусов для изучения генетического разнообразия возбудителя лирикуляриоза.

Возможность различать изоляты на основе полиморфизма микроса-теллитных маркеров подтверждает перспективность их использования в идентификации изолятов.

На основании комплекса исследования полиморфизма микросатсллитных локусов была выполнена классификация изолятов возбудителя пирикуляриоза по величине их генетического сходства. Для этой цели использовали кластерный анализ Уорда {Ward's method). Результаты кластеризации представлены на рисунке 3.6.

Tree Diagram W Variables Ward s method Percent d saqreement

1 2 « 1 0

J 08

I 04 02 00

Рисунок 3 6 Дендрограмма изученных изолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr, по данным микросателлитного анализа

Примечание На данном рисунке по оси абцисс указаны названия изолятов в порядке их генетического сходства, по оси ординат - «расстояние» между изолятами или их группами, выраженное в условных еденицах.

В результате разрезания иерархического кластерного дендрита по расстоянию 0,6 уел ед были выделены четыре кластера, численность и качественный состав которых охарактеризована в таблице 3 5 К кластеру номер один отнесены изоляты KK-97-8CT, Set-1, Ken 82-11, Ken 82-9, Ken 83-16, Ken 83-21, XC-40, Г-67-57, КП-57мет R1114, Ken 60-19, КП-63, Nada 66-16, P-2b КП-32, Ken 53-83, P-40, CJ-125, PH-31 RH 12, TH-68-126; Ken 54-20 В состав второго кластера вошли изоляты КК-97-24, 138 AR,, ,9, КК-97-10, КК-96узд КК-96узл Кр-03-01 КК-97-4з, 138А; ОК-23мет, КК-97-9зер, Jna 168, CA Третий кластер представлен следующими изолятами ХК-40 R3W1142-90R1119, КН-18, ХС-3R8ctR8R4, КП-8 83, ХС-45мет, КП-lOsj, КП-57мет ю> КП-71 и, КП-58узл, ХС-85 86, ОК-17узл, ХС-3 R8ct R8, XK-40R6R6 83, КП-68узл 85, ХС-78сем 85; КП-69 Четвертый кластер включает F-67-57n 95-85 R, 1 )7, ОК-26 R,,22-1122-iiis, КП-74узли, КК-97-13зер, OK-19 R7 86, Кр-03-02, КП-68мет 85т ХС-21 R1122 84, ОК-28сем, КК-97-8, КП-16 R6R682

Численность кластеров быта различной и варьировала от 10 до 20 изолятов. В первом кластере очевидно преобладают изоляты японского происхождения Туда же относятся оба французских изолята во втором — изоляты, собранные на территории Краснодарского края Третий кластер целиком состоит из изолятов Украинского происхождения К

tl^í^TTnr^rT^ J- llrf= s-rbL. л

четвертому - также огносяюя украинские и российские изоляты (см табл 3 3)

Таблица 3 3- Численность и доля изолятов (в %) в различных класте-

Кла стер Число изолятов Происхождение

Ук-раи на Краснодарский край Фра нция Япо ния Сре дняя азия

1 20 4(2 ' 0%) 2(10%) * 2(10 %) 12(6 0%) 0

2 12 1 (8% ) 7 (58%) 0 3(2 5%) 1 (8%)

3 17 17 (10 0%) * 0 0 0 0

4 10 6 (60 %) 3 (30%) 0 1 (10 %) 0

Ито го 59 28 1 '16 (47 и 1- ' (?7 %) (20%> |(3%>!%) 1 (2%)

*Примечание в скобках после абсолютного значении частот изолятов одного происхождения приведена их доля от числа изолятов в кластере

Для проверки кластерного решения были использованы дисперсионный и дискриминантный анализы, которые показали статистическую достоверность разделения изолятов и различия долей изолятов разного происхождения в каждом кластере Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества изолятов свидетельствует об относительной генетической их близости Проведенное в рамках данной работы исследование по анализу генетического родства между изолятами возбудителя пирикуляриоза коллекции ВНИИ фитопатологии позволило создать генетические «отпечатки» каждого изолята этих изолятов

Выявлена корреляция между географическим происхождением штаммов и их генетическим полиморфизмом, определенным с помощью микросателлитных маркерных систем

выводы

1 На основе молекулярного полиморфизма создан внутригенныи доминантный маркер к гену расоспецифнческой устойчивости к пири-куляриозу Pi-ta - ARRRIpi-taR/pi-taL Основанный на ПЦР методах маркер гена Pi-ta удобен для маркерной селекции, прост в применении, дает быстрый резупьтат, и относительно недорог, а, следовательно, может быть использован для анализа большого количества образцов

2 С использованием созданного доминантного маркера устойчивости ARRRIpi-taR/pi-taL проведен поиск гена Pi-ta в 66 сортах и сорто-образцах из коллекции исходного материала ВНИИ риса

3 Впервые проведена ДНК-паспортизация образцов Государственной Российской коллекции возбудителя пирикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатологии, с целью изучения биоразно-образпя патогена

4 На основании данных об аллельном полиморфизме микросател-литных локусов, выявленных при помощп ДНК-маркеров, было показано, что каждый из исследованных моноизолятов Magnaporthe grysea обладает уникальным свойственным лишь ему «ДНК-паспортом»

5 Показана возможность идентификации изолятов возбудителя Pyricularia oryzae Cavara на основе высокого микросателлитного полиморфизма

6 Проведенная кластеризация образцов из Государственной Российской коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза на основе молекулярно-генетического анализа позволила установить велечины их генетического родства

7 Выявлена статистически достоверная корреляция между географическим происхождением штаммов и их генетическим полиморфизмом, определенным с помощью микросателлитных маркерных систем

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

1 В селекции на устойчивость к пирикуляриозу рекомендуем использовать маркерную систему ARRRIp)-taR/pi-taL, что позволит сэкономить время и избежать фитопатологического теста, требующего использования климатических камер и совместимых рас фитопатогена

2 Проводить анализ поступающих образцов в коллекцию исходного материала ВНИИ риса на наличие гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta

В селекционных программах на создание сортов риса, устойчивых к пирикуляриозу, использовать полученные в рамках данного исследования ДНК-паспорта изолягов патогена при проведении геноти-

пирования местных популяций паразита

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Волкова С А , Мухина Ж М Изучение биоразнообразия возбудителя пирикулярноза риса фитопатологическими и молекулярными методами // Рисоводство - 2004 - № 4 - С 101 -104

2 Волкова С А, Мухина Ж.М Биотехнологические подходы к изучению пирикулярноза риса // Рисоводство - 2004 - № 4 - С 44-46

3 Волкова С А , Мухина Ж М Фило-географическое изучение Magnaporthe grísea (Herbert) Barr фитопатологическими и молекулярными методами // Материалы докладов международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем - Краснодар - 2004 - №3- С 47-48

4 Волкова С А , Мухина Ж М Фило-географическое изучение популяций Magnaporthe grísea (Herbert) Barr // Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных исследований в регионах - Краснодар - 2004 - С 52-53

5 Волкова С А , Мухина Ж М Филогеографическое изучение популяции возбудителя пирикулярноза // Материалы всероссийской научно-практической конференции Развитие инновационных процессов в рисоводстве - базовый принцип стабилизации отрасли Краснодар - 2005 - С 51 -52

6 Волкова С А , Ковалев В С , Мухина Ж М . Ильницкая Е Т , Супрун И И Комплексных подход к селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением молекулярных маркеров // Доклады российской академии сельскохозяйственных наук - 2006 - №4. - С 10-12

7 Волкова С А , Мухина Ж М Использование метода молекулярного маркирования для решения проблемы пирикулярноза // Материалы международной научной конференции Устойчивое производство риса настоящее и перспективы -Краснодар -2006 - С 199-201

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волкова, Светлана Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1. Маркеры в генетике и селекции растений

1.1.1. Молекулярно-генетические маркеры

1.1.2. Понятие полимеразной цепной реакции

1.1.3. Типы ДНК-маркеров

1.2. Иммунитет растений

1.3. Изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза (Magnoporthe grísea)

1.4. Молекулярный полиморфизм Pi-ta гена устойчивости к пирикуляриозу

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Создание внутригенного маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.

2.2. Изучение биоразнообразия изолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr государственной российской коллекции патогена на основе полиморфизма микросателлитных локусов.

2.3. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Создание внутригенного ДНК маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta

3.2. Поиск источников гена устойчивости Pi-ta среди сортов и сортообразцов коллекции исходного материала ВНИИ риса при помощи маркерной системы ARRRIpi-taR/pi-taL

3.3. Изучение биоразнообразия изолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr государственной российской коллекции патогена на основе молекулярно-генетического подхода

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Поиск источников устойчивости к пирикуляриозу риса с помощью молекулярных маркеров с целью использования их в селекции риса"

Рис - одна из важнейших зерновых культур. Его зерном питается почти половина человечества. Среди факторов, лимитирующих урожай риса, ведущее место занимают болезни и вредители. Несмотря на мощное развитие в настоящее время агрохимической индустрии, возможности ее далеко не беспредельны. Причем использование химических средств защиты растений приводит к химическому загрязнению окружающей среды (в частности загрязнению фунгицидами). Скученность и однотипность возделываемых растений агробиоценоза привело к возникновению новых и весьма благоприятных условий для питания, размножения и специализации в процессе филогенеза видов фитопатогенов и, в конечном счете к значительным изменениям в составе вредоносных грибковых болезней сельскохозяйственных культур [1; 9]

Грибы - неотъемлемая часть биосферы нашей планеты и важный объект народно-хозяйственного значения. С одной стороны грибы используются в пищу человеком и для изготовления лекарственных препаратов, а с другой стороны являются возбудителями заболеваний человека, причиной аллергических реакций, потенциальными биологическими ядами. Но наиболее значимы грибы как фитопатогены. Грибы вызывают более десяти тысяч различных заболеваний растений, что приводит большим потерям, около 20-30%, урожая сельскохозяйственных культур [116, 7]

Настоящее требует более тонкого и бережного подхода к использованию природных ресурсов, в том числе и в земледелии. В данных условиях в соответствии с закономерностями развития агроэкосистем должны измениться стратегия и тактика не только защиты растений, но и всей растениеводческой практики.

Применение устойчивых сортов - наиболее надёжный метод борьбы с большинством болезней растений, в том числе и с пирикуляриозом риса По словам одного из создателей отечественной фитоиммунологии Шапиро И.Д., «потребность в сортах, иммунных к фитопатогенам, на протяжении научно-технического прогресса в сельском хозяйстве будет увеличиваться. Причем в особенности возрастет значение таких сортов при переходе от интегрированной защиты растений к управлению агробиоценозами» [48,49]

Генетическое разнообразие, природное или созданное человеком, является основой для выведения новых сортов сельскохозяйственных культур, в том числе и риса. Маркеры - распознаваемые фенотипические проявления генов - удобно использовать для отбора растений, несущих гены устойчивости к интересующему селекционера заболеванию, и отслеживания этих признаков в процессе селекции и в семеноводстве. Первоначально в этих целях применялись морфологические маркерные признаки (особенности формы, окраски). Количество их ограничено, к тому же полигенная структура многих агнономически ценных признаков растений значительно усложняет генетическое картирование агрономически важных генов и контроля над переносом этих генов в новые формы растений развитие методов молекулярной биологии привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров — фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям и входящих непосредственно в структуру целевого гена или сцепленными с этим геном [44]. Маркерная селекция значительно упрощает процесс отбора растений с интересующим селекционера геном [25; 26].

Исходя из вышесказанного, использование ДНК-маркеров коренным образом изменило методы оценки генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов растений и штаммов грибов, картирования и определения, физической природы генов, интрогрессии новых генов и генетического мониторинга в селекции и генетике риса и его патогенов.

Актуальность проблемы. Пирикуляриоз - одно из наиболее вредоносных заболеваний риса, вызываемое возбудителем Ма%парог1Ъе grísea (Herbert). Действенная и экологически безопасная стратегия борьбы с этим заболеванием - выведение устойчивых сортов, что является одним из важных направлений в селекции риса [12].

В селекции устойчивых к пирикуляриозу сортов риса перед селекционером становятся две проблемы: выбор подходящих генов устойчивости и прогноз стабильности устойчивости сорта с этой комбинацией генов. Вот почему необходим простой, но эффективный метод анализа генов устойчивости к этому заболеванию, учитывая, что многие сорта, вовлекаемые в скрещивания, содержат несколько генов устойчивости и многие селекционные линии поддерживаются долгое время. Гены вертикальной устойчивости могут быть выявлены из анализа реакции сорта на инокуляцию моноизолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr с известными генами авирулентности. Но такой классический фитопатологический тест требует затраты времени и значительных материальных средств. Также важным лимитирующим фактором является нестабильность генов авирулентности возбудителя пирикуляриоза риса и перекрывание спектра расоспецифической устойчивости [24].

Маркирование генов устойчивости к патогену позволяет быстро и эффективно проводить пирамидирование генов в генотипе сорта.

Необходимо также помнить, что неотъемлемой составляющей управления комплексом защитных мер против грибковых заболеваний растений является изучение самого патогена. В свете современного развития молекулярно-биологических подходов, появилась возможность исследования генетического разнообразия молекулярно-генетическими методами.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка эффективного метода идентификации генов устойчивости риса к биотическим стрессам (пирикуляриозу) в селекционных программах, ориентированных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов, основанных на полиморфизме ДНК-маркеров, а также изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза риса (Magnoporthe grísea

Herbert) Barr) молекулярно-генетическими методами. В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

1. Разработать ДНК-маркерную систему для выявления гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.

2. Провести поиск доноров устойчивости к гену AVRPi-ta коллекции ВНИИ риса с использованием сконструированного молекулярного маркера ARRRIpi-taR/pi-taL.

3. Провести «ДНК-паспортизацию» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров.

4. На основании данных микросателлитного анализа сгруппировать изоляты в соответствии со степенью генетического родства.

Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые:

- создан ДНК-маркер ARRRIpi-taR/pi-taL на основе полимеразной цепной реакции, позволяющий идентифицировать ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta

- проведен скрининг коллекции образцов исходного материала ВНИИ риса на наличие расоспецифического гена устойчивости к пирикуляриозу Pita, на основе его ДНК-полиморфизм. проведена «ДНК-паспортицазция» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров.

- отобраны наиболее полиморфные маркеры, необходимые для оценки генетического родства штаммов возбудителя пирикуляриоза риса.

Научно-практическая ценность работы.

Создан внутригенный ДНК-маркер, необходимый для обнаружения гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta, и ведения маркерной селекции на устойчивость к пирикуляриозу.

Показана возможность использования полиморфизма микросателлитных локусов для ранжировки изолятов Pyricularia grísea Sacc. согласно генетическому родству и их географическому происхождению.

Степень генетического полиморфизма между изученными изолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr, выявленная по данным микросателлитного анализа, говорит о возможности их использования для создания генетических «отпечатков».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Создание внутригенного доминантного ДНК-маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.

2. Скрининг образцов коллекции исходного материала ВНИИ риса на наличие гена Pi-ta.

3. «ДНК-паспортизация» образцов Российской коллекции возбудителя пирикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатологии.

Апробация работы. V региональная научно-практическая конференция молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» 1819 декабря 2003г., г. Краснодар (ул. Калинина, 13)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 115 страницах, содержит 12 таблиц и 23 рисунков.