Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ РИСА

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ РИСА"

ВОЛКОВА СВЕТЛАНА АНДРЕЕВНА

ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ к ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ

РИСА

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОЛКОВА СВЕТЛАНА АНДРЕЕВНА

ПОИСК ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ к ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИХ В СЕЛЕКЦИИ

РИСА

Специальность 06.0) .05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I РГАУМСХА

1 имени К А. Тимирязева

| ЦНБ имени н и. Железное*

I Фонд на^ы|

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте риса в 2003-2007 гг.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Мухина Жапиа Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Костыле в Павел Иванович

кандидат биологических наук, доцент Тюрин Владислав Викторович

Ведущая организаиия: Всероссийский научно-

исследовательскнй институт биологической защиты растений

Защит соетится «29» мая 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.026.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте риса по адресу: 350921. г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан 25. ОЬ. 2007 г.

Ученый секретарь диссертапион кандидат биологических нау

вета

Гончарова Ю.К.

Актуальность проблемы. Рис олиа из важнейших зерновых культур. Его зерном питается почти половина человечества. Среди факторов, лимитирующих урожай риса, ведущее место занимают болезни и вредители. Пнрнкуляриоз - одно из наиболее вредоносных заболевании риса, вызываемое возбудителем Magnaporthe grísea (Herbert). Действенная и экологически безопасная стратегия борьбы с этим заболеванием — выведение устойчивых сортов, что является одним из важных направлений в селекции риса.

В селекции устойчивых к пирикуляриозу сортов риса перед селекционером становятся лве проблемы: выбор подходящих генов устойчивости и прогноз стабильности устойчивости сорта с этой комбинацией генов. Вот почему необходим простой, но эффективный метод анализа устойчивости к этому заболеванию, учитывая, что многие сорта, вовлекаемые в скрещивания, содержат несколько генов устойчивости и многие селекционные линии поддерживаются долгое время. Гены вертикальной устойчивости могут быть выявлены из анализа реакции сорта на инокуляцию моноизолятами Magnoporlhe grísea (Herben) Barr с известными генами авирулентности. Но такой классический фи-топатологический тест требует затраты времени и значительных материальных средств. Также важным лимитирующим фактором является нестабильность генов авирулентности возбудителя пирикуляриоза риса и перекрывание спектра расоспсцифической устойчивости.

Маркирование генов устойчивости к патогену позволяет быстро и эффективно проводить пирамидирование генов в генотипе сорта.

Необходимо также помнить, что неотъемлемой составляющей управления комплексом защитным мер против грибковых заболеваний растений является изучение самого патогена. В свете современного развития молекулярно-биологических подходов, появилась возможность исследования генетического разнообразия молекулярно-генетическими методами.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка систем идентификаций генов устойчивости риса к биотическим стрессам (пирикуляриозу), основанных на полиморфизме ДНК-маркеров, а таюке изучение биоразнообразия возбудителя пирикуляриоза риса (Magnoporlhe grísea (Herbert) Barr) молскулярно-гснстическими методами. В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

1. Разработать ДНК-маркерную систему для выявления гена устойчивости к пирикуляриозу риса l'i-ta.

2. Осуществить поиск доноров устойчивости к i-ену AVRPi-ta коллекции ВНИИ риса с использованием сконструированного молекулярного маркера ARRRlpi-taR/pi-taL.

3. Провести «ДНК-паспортизацию» образное Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя нирикуляриоза риса с помощью микросателлн гных маркеров.

4. На основании данных микросателлитпого анализа сгруппировать изоляты в соответствии со степенью генетического родства.

Научная новизна исследований. В настоящей работе впервые:

1. Создан ДНК-маркер ARRRIpi-taR/pi-taL на основе полимераз-Hoii цепной реакции, позволяющий идентифицировать ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta.

2. Осуществлен скрининг коллекции образцов исходного материала ВНИИ риса на наличие расос п ецн ф и чес ко го гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta, на основе его ДНК-полиморфизма.

3. Проведена «ДНК-паспоргицазция» образцов Российской Государственной коллекции изолятов возбудителя нирикуляриоза риса с помощью микросателлитных маркеров.

4. Отобраны наиболее полиморфные маркеры, необходимые для оценки генетического родства штаммов возбудителя нирикуляриоза риса.

Научно-практическая ценность работы.

Создан внутригенный ДНК-маркер для обнаружения гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta и создания сортов риса несущих ген Pi-ta.

Показана возможность использования полиморфизма .микросателлигных локусов для ранжировки изолятов Pyricularia grísea Sacc. согласно генетическому родству и их географическому происхождению.

Уникальность, полученных «Д1 IK-паспортов» позволила создать базу. Степень полиморфизма между изученными изолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr, выявленная по данным микросателлитного анализа, говорит о возможности их использования лля создания ДНК-«отпечатков».

Основные положения, вьншснмыс на защиту:

1, Создание внутригенного доминантного ДНК-маркера к гену устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta.

2. Скрининг образцов коллекции исходного материала ВНИИ риса на наличие гена Pi-ta.

3. «ДНК-паспортизация» образцов Российской коллекции возбудителя лирикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатологии.

Результаты исследований были лоложеиы на: V региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» 18-19 декабря 2003г., г. Краснодар (ул. Калинина, 13); Международной научно-практической конференции «Биологическая зашита растений - основа стабилизации агроэко-снстем» Краснодар, 29сентября-1 октября 2004г; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы, научное обеспечение и перспективы развития рисоводства в XXI веке», Краснодар, 26-27 августа, 2003

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 130 страницах, содержит 13 таблиц и 19 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2003г. по 2007г. в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института риса, в лаборатории микологии и иммунитета в ВНИИ фитопатологии и в лаб. генной инженерии растений (кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета).

2.1 Создание внутрнгенного маркера к гену устойчивости к ппрнкуляриозу риса РНа.

Для разработки дизайна праймеров при создании внутри генного ДНК-маркера использовали аминокислотные и нуклеотидные последовательности доминантной (источник - сорт УазЫго-тосЫ) и рецессивной (источник - сорт Твиуаке) аллелей гена РМа. Их номера в базе данных \v\vw.ricbi.nili,еоу соответственно ЛЛК00132 и ЛА045178 для аминокислотных последовательностей; ЛР207842 и АУ196754 - для нуклеотидных последовательностей.

Из литературных данный известно, что устойчивый и чувствительный аллели гена Р1-1а отличаются заменой 918 аминокислотного остатка серина на аланнн. Для определения данной точки полиморфизма на кодирующей этот белок нуклеотидной последовательности, аминокис-

лотная последовательность была превращена в пуклеотндную с помощью программы «Конверсия ДНК/белок», предоставлен!ioíí для свободного доступа на сайте "Практическая Молекулярная Биология" htip://molbiol. edu.ru. Затем было проведено сравнение полученных нуклеотидных последовательностей доминантных н рецессивных аллелей гена P¡-ta, с использованием алгоритма «multiple alignment» в программе CLUSTALW. После определения точки полиморфизма были сконсгруированы два аллельспецифичных праймера. На основе разработанного дизайна праймеров был сформирован заказ и нраймерные пары, были синтезированы фирмой ЗАО «Сннтол», Россия.

Созданный аллельспецифнчный маркер для идентификации доминантной аллели целевого гена был назван нами ARRRIpi-taR/pí-taL.

Был выполнен подбор условий ДНК амплифнкапни. Следует отметить, что п рай мерная napa ARRIllpi-talVpi-taL очень чувствительна к чистоте используемой в реакции ДНК и качеству Taq-полимеразы.

Для поиска источников гена устойчивости к нирикуляриозу риса Pi-ta с использованием созданной маркерной системы ARRRlpi-taR/pi-taL были взяты в коллекции исходного материала ВНИИ риса следующие сорта и сортообразцы: Кулон, Лидер, Кулон (Краснодар). Спаль-чпк, Фонтан, Нарцисс, Кубань 3, Снежинка. Дубово кии, Курчанка, Краснодарский 3352, Снежинка, Лакуна. Снринг, Краснодарский 424, Водолей, Серпантин, Изумруд, КГ1К 17, Стрелец, Талисман, Аметист, ВНИИР 7887, Кубань 3, Виола, ВНИИР 8847, Раздольный, Рапан. Кендзо 3782, К П-27-02, КП-9-01. KÍ1 37-01, KJ1 40-02. КП 27-02, К-0632, К-0636, К-0681, К-01939, К-02129, К-2131, K-02Í35, К-22258, К-02385, К-02397, К-02497, К-02503, К-2332, К-2742, К-2728, К-2744, К-0681, Баллила, К-02980, К-03097, К-03 524, К-03389, К-03695. К-03781. К-03782, К-02979, Азуцсна, 1R 36, K-39S0, Рапан (Калнниский район), Лиман (Абинский район), К1.

В качестве положительного контроля для анализа полиморфизма гена устойчивости Pita использован сорт К1, несущий доминантную аллель гена, а в качестве отрицательного Nipponbare н СШ1Л51, несу-шпе рецессивную аллель гена Pi-ta.

Экстракцию ДНК проводили, используя СТА В-метод (Murray M.G., 'lTiompson W.F. 1980).

Амплификация с целью выявления полиморфизма гена устойчивости риса Pi-ta проводилась наборами для проведения ПЦР (комп, Си-лекс-М, г.Москва. Россия). ПЦР смесь включала Юнг ДНК, 2.5тМ MgCI2, 0,2шМ дезоксинуклеотидтр![фосфатов (dNTPs) , 50шМ КС1.

[ОшМ Tris-НС I, рН 9,0,0,1% Тритон Х-100, 0,23цМ каждого и рай мера, 0,25 единицы 5и Taq-полимеразы, в общем объеме 25мкл.

Электрофорез проводили в 3% агарозном геле, на основе 0,5*Трис-боратного буфера (0,045 М Трнс, 0,045 М Борной кислоты, 1мМ ЭДТА, рН=8,2) при напряжении I20V в течение 1ч часа, в камерах для горизонтального электрофореза Gel Electrophoresis Apparatus GNA-100 фирмы Pharmacia.

2.2 Изучение бноразнообразня нзилятов Magnoporthc grísea (Herbert) Barr Государственной российской коллекции патогена на основе полиморфизма микроса геллнтных локусов.

В рамках сотрудничества с ВНИИ фитопатологии было начато исследование образцов из Государственной российской коллекции Magnoporthc grísea (Herbert) Barr молекулярно-гснетическимн методами. Изучаемая коллекция охарактеризована по культураиьио-морфологическим признакам, количественный и качественный состав генов (а)вирулентности в грибных штаммах коллекции выявлен на основе фитопатологических тестов с использованием сортов-дифференциаторов риса.:

Происхождение изолятов:

- Япония: F-67-5 7п.95-8 5 Rt 117. Set-1, 138 ARM 19. Ken 82-9. Ken 82-II, Ken 83-16, Ken 83-21. F-67-57, Ken 60-19, Nada 66-16, P-2b. 138A. Ken 53-83, TH-68-126, Jna 168, Ken 54-20;

- Краснодарский край, Россия: P-40, KK-97-8, KK-97-10, КК-97-4 3, КК-97-18sem, KK-96usl2, KK-96usl.3, КК-97-24, КК-97-8ст, KK-97-9zcr;

- Славянский р-н, Краснодарский край, Россия: Кр-03-01*, Кр-03-02*;

- Херсонб,Украина: XC-2I R1122.84, ХС-40, XC-3RíctRsR4. ХС-3 R8ct R8, ХС-45мет, ХК-40 R335n42-90RM19, ХС-85.87, XK-40R*R684. ХС-78ссм.Я6:

- Крымская область, Украина: КП-57мет.и. КП-71.8^ КП-32, КП-57мет R1114, КП-57мст R1114, КП-58уэл. КП-68узл.86, КП-70, КП-68мет.85, КП-74ш1.85, КН-18, КП-63, КП-10.83, КП-8.*3;

- Одесская область, Украина: ОК-17узл, OK-23met, КП-16 ReRísí. ОК-19 R7.86, OK-28sem, ОК-26 R1122-1122-1118;

- Франция: РН-31 RII12.CM25:

- Средняя Азия: СА

♦Примечание: Моноизоляты Кр-03-02 и Кр-03-01 были выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии согласно методическим указаниям, разработанным в ВНИИ фитопатологии.

Для генотипирования нзолятов и мои он зол я то в фитопатогепа использованы 23 «нейтральных» микросагеллитных маркеров, характеризующиеся высоким полиморфизмом, ко-доминантным характером наследования.

Для выделения грибной ДНК также использовали СТА В-метод.

Амплификация микросателлитных последовательностей для выявлении полиморфизма мнкросателлнтных локусов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr проводилась наборами для проведения ПЦР (комп. Си-(Ьнзим, г.Москва, Россия) в реакционном объеме 25мкл. Параметры ПЦР смеси: в 25 м tu? смеси содержится 10 нг геномной ДНК, IX ПЦР буфер (20 мМ Трис-HCl, pH 8,4, 50 мМ KCl), 0,1 mM каждого dNTP н 1ед. Taq-полимеразы.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8% акриламидный гель на основе Т1>Е. Электрофорез проводили при напряжении 250V в течение 3 часов. Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым этидием

Статистическая обработка данных была выполняли методами кластерного, дисперсионного н дискриминатиого анализа согласно методиками описанными Г.ФЛакиным и Б.Л. Доснеховым.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание виутригенного ДНК маркера лля гена устойчивости к пнрнку.шрнозу риса РМа

Наиболее удобными и эффективными являются внутригенные ДНК-маркеры, Для их разработки необходимо знание нуклеотидной последовательности гена и его положение на хромосоме.

Доминантный ген устойчивости к пирикуляриозу РИа ссквенирован и имеются предположения о его роли в формировании иммунитета риса. Он расположен в области центромеры 12-той хромосомы. В этом локусе располагается кластер И генов, включающий тесно сцепленные Р1-1а и РМаг гены, идентифицированные Клуо$а№а с коллегами. Доминантная и рецессивная аллели этого гена отличаются одной аминокислотной заменой: в положение 918 серпна нааланин. Это обусловли вает наличие двух аллелей данного гена: р1-1а" и РЫа*. Нуклеотидная последовательность полученной праймерной нары, используемая дли выявления данною полиморфизма, представлена в таблице 3.1.

lOmM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Тритон X-IOO, 0,23 цМ каждого праймера, 0,25 единицы 5и Taq-полимеразы, в общем объеме 25мкл.

Электро(|юрез проводили в 3% агароэном геле, на основе 0,5хТрис-боратного буфера (0,045 M Трис, 0,045 M Борной кислоты, 1мМ ЭДТА, рН=8,2) при напряжении 120V в течение 1ч часа, в камерах для горизонтального электрофореза Gel Electrophoresis Apparatus GNA-10Ö фирмы Pharmacia.

2,2 Изучение бноразпообразня нзолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr Государственной российской коллекции патогена на основе полиморфизма мнкросателлитных локусов.

В рамках сотрудничества с ВНИИ фитопатологии было начато исследование образцов из Государственной российской коллекции Magnoporthe grísea (Herbert) Barr молекулярно-гснстическимн методами. Изучаемая коллекция охарактеризована по культурально-морфологическим признакам, количественный и качественный состав генов (а)вирулентности в грибных штаммах коллекции выявлен на основе фитопатологических тсстов с использованием сортов-дифференциаторов риса.:

Происхождение нзолятов:

- Япония: F-67-57n.95-85 Rit 17. Set-1. 138 ARU 19. Ken 82-9. Ken 82-П, Ken S3-16, Ken 83-2L F-67-57, Ken 60-19, Nada 66-16, P-2b. 138A. Ken 53-83, TM-68-126, Jna 168, Ken 54-20;

- Краснодарский край, Россия: P-40, KK-97-8, KK-97-10, КК-97-4 3, КК-97-18sem, KK-96usl2, KK-96usl.3, КК-97-24, KK-97-Sct, KK-97-9zcr:

- Славянский р-н, Краснодарский край, Россия: Кр-03-01*, Кр-03-02*;

- Херсон6,Украина: ХС-21 RI I22.S4, ХС-40, XC-3RScTR,R4. ХС-3 RSct R8, ХС-45мет, ХК-40 R335n42-90R1119, ХС-85.87, XK-40RÄRm ХС-78ccm.s6>

- Крымская область, Украина: КП-57мет.85. КП-71.И. КП-32, КП-57мст R1I14, КП-57мет R1II4, КП-58узл. КП-68узл.«6 КП-70, КП-68мет.85, KTI<74usl.8S, КН-18, КП-63, КП-10.83, КП-8.к*

- Одесская область, Украина: ОК-17узл, OK-23met, КП-16 RüR&íj. ОК-19 R7.S6, OK-28sem, ОК-26 RI 122-1122-1118;

- Франция: РН-31 R1U2, CJ-125;

- Средняя Азия: CA

♦Примечание: Моноизоляты Кр-03-02 и Кр-03-01 были выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии согласно методическим указаниям, разработанным в ВНИИ фитопатологии.

Для генотипирования изолятов и моноизолятов фнтонатогена использованы 23 «нейтральных» микросатсллитных маркеров, характеризующиеся высоким полиморфизмом, ко-доминантным характером наследования.

Для выделения грибной ДНК также использовали СТАБ-метод.

Амплификация микросателлитных последовательностей для выявлении полиморфизма микросателлитньтх локусов Magnoporthe grisca (Herbert) Вагт проводилась наборами для проведения ПЦР (коми. Си-(Ьнзим, г.Москва, Россия) в реакционном объеме 25мкл. Параметры ПЦР смеси: в 25мкл смеси содержится 10 нг геномной ДНК, IX ПЦР буфер {20 мМ Трнс-HCI, рН 8,4, 50 мМ KCI), 0,1 тМ каждого dNTP и 1ед, Taq-полимсрззы.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8% акрипамидный гель на основе ТБЕ. Электрофорез проводили при напряжении 250V в течение 3 часов. Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым этидием

Статистическая обработка данных была выполняли методами кластерного, дисперсионного и дискриминатного анализа согласно методиками описанными Г.ФЛакиным и Б.А. Доспеховым.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание виутрнгенного ДНК маркера для гена устойчивости к пнрнкулярнозу риса РМа

Наиболее удобными и эффективными являются внутригенные ДНК-маркеры. Для их разработки необходимо знание нуклеотидной последовательности гена и его положение на хромосоме.

Доминантный ген устойчивости к пнрикуляриозу Рка секвенирован и имеются предположения о его роли в формировании иммунитета риса. Он расположен в области центромеры 12-той хромосомы. В этом локусс располагается кластер К генов, включающий тесно сцепленные РЫа и Рыа2 гены, идентифицированные Клуо5а\уа с коллегами. Доминантная и рецессивная аллели этого гена отличаются одной аминокислотной заменой: в положение 918 серн на на аланнн. Это обусловливает наличие двух аллелей данного гена: РМа* и Нуклеотидная по-

следовательность полученной и рай мер но и пары, используемая для выявления данного полиморфизма, представлена в таблице 3.1.

Таблица 3.1 - Нуклеотидиая последовательность прайм еров для идентификации доминантной аллели входящей в состав доминантной маркерной системы гена РМа

Название Последовательность мононуклео-прайме- тидов

_ЕЗ__

ARRRlpR:CAAGTCAGGTTGAAGATGC i-taR/pi- ATAGC(24n.o) tab*; L :G CTGC TTGTTCG A A CAGCGC | CTGC(24 n.o)_

Для проверки эффективности созданной маркерной системы была поставлена пробная ПЦР с сортами KI (положительный контроль) н Nipponbare (отрицательный контроль} см. рис. 3.1.

Рисунок 3.1 Генетическое разнообразие, выявляемое с помощью доминантного маркера АККШрМаК/ркаЬ Примечание: маркер молекулярного веса ДНК. Сорт: К1 (положительный контроль), ЫЬ- МрропЬаге (отрицательный контроль).

Из рисунка 3.1 видно, что аллельная миграция наблюдалась только в случае использования сорта, несущего доминантную аллель гена РМа (положительный контроль); и отсутствовала у сорта с рецессивной аллелью гена (отрицательный контроль).

Таким образом, анализ результатов предварительного апробирования созданной аллельспецифичной ДНК-маркерной системы показал ее эффективность при идентификации доминантной аллели гена устойчивости к пирикуляриозу Рма, что свидетельствует о перспективности ее использования в программах маркерной селекции на устойчивость риса к пирикуляриозу.

3.2 Поиск источников гена устойчивости РИа среди сортов н сортооСразцоп коллекции исходного материала ВНИИ риса при помощи маркерной системы АК1Ш1р1-(а№рМаЬ

С использован кем созданного доминантного маркера устойчивости проверено наличие гена РЫа в 66 сортах и сортообразцах из коллекции исходного материала ВНИИ рнса (см. рнс 3.2).

Рисунок 3.2- Электрофоретическое разделение продуктов амплификации праймеров АККЯ1рМаЯ/р1-1аЬ

Примечания: сорт: К1 (положительный контроль), ТМЬ - Nipponbare (отрицательный контроль), 1-65 номера сортов, представленных на сгр.б

Данные эксперимента показали, что ген РМа выявлен в сортах 1И 36 (ЖЯ1)и К1 (Франция).

33 Изучение бноразнообразня нзолятов Magnoporthe grísea (Herbert) Barr Государственной российской коллекции патогена на основе молекул ирно-гене г нческого подхода

В виду сопряженной эволюции возбудителя Magnoporthe grísea (Herbert) Barr и поражаемого им растения Oryza sativa, изучение фнто-патогена - важная составляющая часть селекционных программ, нацеленных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса. Генетическая паспортизация патогена в различных зонах рисосеяния, кроме того, имеет большое значение для изучения его мирового генетического многообразия, что является одной из ключевых задач совместных усилий ученых из международных исследовательских центров (CIRAD, IRRI, CDC). Мониторинг расового состава паразита в разных рисосеющих регионах мира необходим для разработки правильной селекционной стратегии в создании устойчивых сортов риса.

Стремительное развитие биотехнологии привело к появлению современных молекулярно-генетнчсских методов исследования расового состава данного {как и многих других) патогена. В первую очередь -это возможность установления генетического родства между выделенными изолятами патогена на основе применения молекулярных маркеров, в том числе - и с изолятами с известными генами (а)вирулентности. Кроме того, генетическая паспортизация изолятов патогена, необходима при защите авторских нрав держателей коллекций последнего.

В рамках данного исследования проведена генетическая паспортизация единственной в России коллекции патогена, держателем которой является Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии. ДНК 59 изолятов коллекции с известными генами (а)вирулентностн, охарактеризованных, кроме того, по комплексу культурально-морфологическнх свойств ,была любезно предоставлена нам для проведения молекулярного (мнкросателлнтного) анализа сотрудниками лаборатории микологии и иммунитета ВНИИФ. Моно-нзоляты Кр-03-02 и Kp-03-0f выделены во ВНИИ риса в лаборатории биотехнологии из Краснодарской популяции патогена

Высокий полиморфизм, выявляемый SSR-маркерами, ко-домнпантиый тип их наследования, аллельсненифичность определяют ценность этой маркерной системы позволяет говорить о возможности ее использования для оценки генетической изменчивости между изолятами Magnoporthe grísea (Herbert) Barr.

Идентификация и паспортизация изолятов может выполняться на основании данных о аллеяьных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого изолята. В связи с этим для оценки степени генетического сходства среди избранных нами изолятов коллекции ВНИИ фитопатологии, и составления их ДНК-фингерпринта, было использовано 23 нейтральных, т.е. пе сцепленных с каким либо геном, микросателлитных маркеров, отобранных исходя из принципа максимального полиморфизма, основанного на литературных данных. От анализа двух маркеров отказались, в связи с тем что они пе показали полиморфизма на изучаемых изолятах. Как видно из табл. 3.2, маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух до двенадцати аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам Pyrms 43 — 44, Pyrms 59 — 60, Pyrtns 99 - 100 и Pyrins 125 - 126.

ti

Таблица 3,2 Полиморфизм микросатсллитных л о кусов изолятов Государственной российской коллекции Magnoporlhe grisea (Herbert) Barr,

№ пп Прай-мер Размер ам-нлиф шифрованных аллелей, П.О- Число выявленных аллелей

1 2 3 4

]. Pyrms 7 -8 99-159 7

2. Pyrms 15 -16 ■ 133-177 6

3. Pyrms 37 -38 190-205 4

4. Pyrms 39 -40 430-510

5. Pyrms 43 -44 166-344 ...... 9

6. Pyrins 45 -46 200-257 175-185 7 4

7, IPyrms 47 - Us

8. ST3 59 '! 168-367 60 9

9. Pyrms 61 -j 220_285 62 i 4 !

10. Pyrms 63-1 g? 64 5 1

11. Pyrms 67-; 194.775 OS ; 6 :

12. Pyrms 77-; 106.208 7

13. Pyrms 81-: [84 232 7

Ig1™ 831 160-663 8

15. Ц™ 87 174-250 7 6 í

16. Pyrms 93 -Í 94 i "

К® [Ш Прай-мер Размер ам-шшфиниро-ванных аллелей. и.о. Число выявленных аллелей

1 2 3 4

17. 18. Ругтз 99 -100 173-255 10

Ругтз101 - 102 454 2

19. Ругтз107 - 108 290-350 5

20. Ругтз 115| 36<М53 ■ 5

21. Руппз 125| )20_зб4 -126 . 12

Примечание: п.о. пар нуклеогидных оснований

На рисунках 3.4-3.5 представлено аллельное разнообразие в микро-сателлитных локусах патогена, выявленное изученным» маркерами. Наибольшее аллельное разнообразие (9-12 аллелей) показали маркеры Руггп5 43 - 44, Ругтш 59 - 60, Ругтя 99 - 100 н Ругта 125 - 126. Остальные маркеры можно условно разделить на две группы, исходя из выявленного ими полиморфизма. К первой - относятся следующие: Ругтз 7 - 8, Ругшэ 15-16, Ругтз 39-40, Ругтз 45-46, Ругтз 67-68, Ругтз 77-78, Ругтз 81-82, Ругтз 83-84, Ругтз 87-88, Ругтя 93-94 с количеством аллелей от 6 до 8 на один микросателлптный л оку с. К фуппс маркеров, выявивших проявивших еще более низкий полиморфизм, принадлежат: Ругтз 37 - 38, Ругтз 37-38. Руггш 47-48. Руппз 61-62, Ругтз 63-64, Ругтз 107-108. Число аллелей на один локус здесь было равным 5-4 и даже 2 - по маркеру Ругт$ 101-102 .

После идентификации аллелей и определения их размеров в соответствии с маркером молекулярпот веса ДНК, был проведен учет частоты встречаемости аллелей по каждому маркеру у исследованных изолятов. На приведенных ниже диаграмме (рис. 3.3) показаны частоты встречаемости аллелей микросателлитных маркеров, выявленные ь ходе исследования.

Рнсунок 3.3 Частота аллелей, выяведпная у изучаемых изолятов патогена в микросателлитном локусе Рупп 125-126 Примечание; и.о. — пар нуклеотлдных оснований

У большинства маркеров выявляются аллели, которые наиболее распространены у исследованных изолятов. Так, к примеру, у 11 из 23 использованных маркеров более 50 % изолятов совпадали по одному из аллелей. Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества изолятов свидетельствует об относительной генетической их близости. Это внолне может являться следствием того, что различные группы изолятов, сформировались на основе небольшого числа исходных популяций. Наряду с этим можно предположить, что аллели наиболее распространенные у исследованных изолятов. могут характеризовать некий общий тин возбудителя пирикулярноза, который образовался путем естественного отбора.

Рисунок 3.4 Генетическое разнообразие, выявленное в локусе Ругтпз 125-126

Примечание: т\у.- маркер молекулярного веса ДНК. Изоляты: 1 -Ка^а 66-16, 2-Кеп 54-20, З-ТН-68-126, 4-Кеп 60-19, 5^-67-57, б^па 168, 7-Кеп 53-83, 8-Р-2Ь, 9-138А, 10-ХС-40, П-ХС-3 Я8ст Я8, 12-ОК-266из1, 13-КР-16 К6К6.82, 14-КР-32, 15-КН-18.

Рисунок 3.5 Генетическое разнообразие, выявленное в локусе

Pjrms 7-8

Примечание: mw.- маркер молекулярного веса ДНК.Итоляты 1-Nada 66-16, 2-Кеп 54-20. З-ТН-68-126, 4-Кеп 60-19, 5-F-67-57, 6-Jna 168, 7-Кеп 53-83, 8-P-2b, 9-138А, L0-XCM0, 11-ХС-З R8ct R8, 12-OK-266usl, 13-КР-16R6R6.82, I4-KP-32, 15-КИ-18, 16-ХС-85.86.

По результатам анализа о наличии аллелей у изолятов, использованных в работе, была составлена матрица. Среди всех изученных изолятов не было обнаружено двух с илентнчиым набором аллелей.

Таким образом, Результат эксперимента показал эффективность использования полиморфизма микросателлнтных локусов для изучения ге нети чес ко m разнообразия возбудителя пирикуляриоза.

Возможность различать изоляты на основе полиморфизма микросателлнтных маркеров подтверждает перспективность их использования в идентификации изолятов.

На основании комплекса исследования полиморфизма микросатсл-литных локусов была выполнена классификация изолятов возбудителя пирикуляриоза по величине их генетического сходства. Для этой цели использовали кластерный анализ Уорда (Ward's method). Результаты кластеризации представлены на рисунке 3.6.

TwOieprwnlw Vanabl« Wud'tfntthod Ptrorn diu3f*«T4rit

(Wirt ímnñn ti! ^ A

¿ri JÍ-J j Щ- J ¡'■^•Vlí]5 Ь-í y -¡ ::

Рисунок 3.6 Дендро грамма изученных изолятов Magnoporthe grísea' (Herbert) Barr, поданным микросателлитного анализа.

Примечание: На данном рисунке по оси абнисс указаны названия изолятов в порядке их генетического сходства, по оси ординат — «расстояние» между изолятами или их группами, выраженное в условных еленииах,

В результате разрезания иерархического кластерного дендрита по расстоянию 0,6 усл. ед. были выделены четыре кластера, численность и качественный состав которых охарактеризована в таблице 3.5 . К кластеру номер один отнесены изоляты: KK-97-8CT; Set-1; Ken 82-11; Ken 82-9; Ken 83-16; Ken 83-21; XC-40; F-67-57; КП-57мег Ken 60-19; КП-63; Nada 66-16; P-2b; КП-32; Ken 53-83; P-40; CJ-I25; PH-31 R1112; TH-68-126; Ken 54-20. В состав второго кластера вошли изоляты: КК-97-24; 138 ARm9; КК-97-10; КК-96узл..,: КК-96узл..3; Кр-03-01; КК-97-4г: 138Л; ОК-23мет; КК-97-9зер; Jna 168; CA. Третий кластер представлен следующими изолятами: ХК-40 Kjjíh4j-9oR] 11?; KH-I8; ХС-3R8CTR8R4; КП-8.83; ХС-45мет; КП-10.83; КП-57мет.85; КП-71.^; КП-58узл; ХС-85.86; ОК-17узл; ХС-3 RSct R8; XK-40RJW КП-бвузл.«; ХС-78сем.г5; КП-69. Четвертый кластер включает: F-Ó7-57n.95-85 Rim! ОК-26 Riiw-njMiis; КП-74узл.85; КК-97-13зер; ОК-19 Rtks; Кр-03-02; КП-68мегг.«; ХС-21 RU22.84; ОК-28сем; КК-97-8; КП-16 R<,R6 82,

Численность кластеров была различной и варьировала от 10 до 20 изолятов. В первом кластере очевидно преобладают изоляты японского происхождения. Туда же относятся оба французских и золя та. во втором - изоляты, собранные на территории Краснодарского края. Третий кластер целиком состоит из изолятов Украинского происхождения. К

четвертому - также относятся украинские и российские изоляты (см. табл. 3.3).

Таблица 3.3- Численность и доля изолятов (в %) в различных кластс-

Кла стер Число изолятов Пропс хожде н ие

Ук- Красно-раи дарекий на край Фра НЦИЯ Япо НИЯ Сре дняя азия

1 120 4(2 ! 0%); 2 (10%) * ; 2(10 %) 12(6 0%) 0 1 (8%)

2 ' | 12 1 ; (8% 7 (58%) ) 0 3(2 5%)

3 | 17 Г 1 17 1 (Ш 0 0%) I * 1 0 0 0

4 10 6 I (60 ¡3(30%) %) \ 0 1 (10 %) 0

Ито го 59 28 1 и !1б /47 ' 1 - [ /17 %) р/0>|%) 1 (2%)

*Примечание: п скобках после абсолютного значении частот изолятов одного происхождения приведена их доля от числа изолятов в кластере.

Для проверки кластерного решения были использованы дисперсионный и дискримннантный анализы, которые показали статистическую достоверность разделения изолятов и различия долей изолятов разного происхождения в каждом кластере. Наличие одинаковых аллелей по многим маркерам у большого количества изолятов свидетельствует об относительной генетической их близости. Проведенное в рамках данной работы исследование по анализу генетического родства между изолятами возбудителя нирикуляриоза коллекции ВНИИ фитопатологии позволило создать генетические «отпечатки» каждого изолята этих изолятов.

Выявлена корреляция между географическим происхождением штаммов и их генетическим полиморфизмом, определенным с помощью мнкросателлитных маркерных систем.

п

выводы

1. На основе молекулярного полиморфизма создан внутригенный доминантный маркер к гену расос пеци фи чес ко Я устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta - ARRRIp¡-taR/p¡-taL. Основанный на ПЦР методах маркер гена Pi-ta удобен для маркерной селекции, прост в применении, дает быстрый результат, и относительно недорог, а, следовательно, может быть использован для анализа большого количества образцов.

2. С использованием созданного доминантного маркера устойчивости ARRRlpi-taR/pi-taL, проведен поиск гена Pi-ta в 66 сортах и сорто-образцах из коллекции исходного материала ВНИИ риса.

3. Впервые проведена ДНК-паспортизация образцов Государственной Российской коллекции возбудителя пнрикуляриоза, держателем которой является ВНИИ фитопатологии, с целью изучения биоразнообразия патогена.

4. На основании данных об аллельном полиморфизме микросател-литных локусов, выявленных при помощи ДНК-маркеров, было показано, что каждый из исследованных моноизолятов Magnaporthe grysea обладает уникальным, свойственным лишь ему «ДНК-паспортом».

5. Показана возможность идентификации изолятов возбудителя Pyricularia oryzae Cavara на основе высокого микросатедлитного полиморфизма,

6. Проведенная кластеризация образцов из Государственной Российской коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза на основе молекулярно-генетического анализа позволила установить велечины их генетического родства.

7. Выявлена статистически достоверная корреляция между географическим происхождением штаммов и их генетическим полиморфизмом, определенным с помошью микросателлнтных маркерных систем.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

1. 8 селекции на устойчивость к пирикуляриозу рекомендуем использовать маркерную систему ARRRIpi-taR/pi-taL, что позволит сэкономить время и избежать фитопатологического теста, требующего использования климатических камер и совместимых рас фитопатогена.

2, Проводить анализ поступающих образцов в коллекцию исходного материала ВНИИ риса на наличие гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta.

В селекционных программах на создание сортов риса, устойчивых к п при куля риозу, использовать полученные в рамках данного исследования ДНК-паспорта изолятов патогена при проведении геноги-

нирования местных популяций паразита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ИССЛЕДОВАНИИ

1. Волкова С.А., Мухина Ж.М Изучение биоразнообразия возбудителя пи ри кул яр поза риса фитопатологи чески ми и молекулярными методами //Рисоводство. - 2004. - № 4 - С. 101-104,

2. Волкова С.А, Мухина Ж.М. Биотехнологические подходы к изучению пирикулярноза риса // Рисоводство. — 2004. - Хы 4 - С. 44-46,

3. Волкова С.А., Мухина Ж.М Фило-географическое изучение Magnaporthe grísea (Herbert) Barr фитопатологическнми н молекулярными методами // Материалы докладов международной научно-практической конференции. Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкоспстем. - Краснодар. - 2004, - №3- С. 47-48.

4. Волкова С.А., Мухина Ж.М Фнло-географнчсское изучение популяций Magnaporthe grísea (Herbert) Barr н Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов. Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных исследований в регионах. - Краснодар. - 2004. - С. 52-53.

5. Волкова С.А., Мухина Ж.М. Филогеографическое изучение популяции возбудителя пирикулярноза <7 Материалы всероссийской научно-практической конференции. Развитие инновационных процессов в рисоводстве - базовый принцип стабилизации ограсли. Краснодар. - 2005. - С.51 -52

6. Волкова С.А., Ковалев B.C., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т., Супрун И.И. Комплексных подход к селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением молекулярных маркеров it Доклады российской академии сельскохозяйственных наук. - 2006. - №4. - С. 10-12.

7. Волкова С.А., Мухина Ж.М. Использование метода молекулярного маркирования для решения проблемы пирикулярноза // Материалы международной научной конференции. Устойчивое производство риса настоящее и перспективы. - Краснодар. -2006. - С. 199-201.

Отпечатано 0 типографии vJCâpmica» 35000Q г Краснодар' уя. Комыуняро* 73/1 тираж tOOs -заказ 4143