Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ РИСА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ РИСА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ"

^¡гЗ^ЗЛ^

На правах рукописи

Ильницкая Елена Тарасовна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ РИСА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2007

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт риса в 2003-2007 гт.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Мухина Жанна Михайловна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Зеленский Григорий Леонидович

кандидат биологических наук Гучетль Сайда Заурбиевна

Ведущая организация - Кубанский государственный аграрный

университет

Защита состоится « 30 » мая 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.026.01 в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт риса по адресу:

350921, г. Краснодар, п /о Белозерное. тел./факс (8612) 29-41-49

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса.

Автореферат разослан « 28 » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последнее время все увереннее обсуждается роль ДНК-технологий в ускорении процесса селекции, охране авторских прав селекционеров и зайдете продукции растениеводства от возможной фальсификации. Только анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, практически пригодные для идентификации генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков.

Процесс создания новых форм растений базируется на генетическом разнообразии и методах его использования селекционерами. Применение ДНК-технологий позволяет существенно расширить возможности традиционной селекции растений. Проявление молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является ткакеспецифичным, и их можно обнаружить на любой стадии развития растений. Методы ДНК-генотипирования и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker assisted selection - MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно ценных генов » процессе селекции и обеспечить создание новых сортов с целым комплексом заданных свойств (Хавкин Э.Е., 2003).

Успехи в молекулярной биологии риса (Oryza sativa L.) -благоприятная среда для активного использования маркерных технологий именно для этой культуры. Секвенирование генома риса и клонирование генов позволяют создавать ДНК-маркеры, эффективные в работе практической селекции.

Одним из наиболее вредоносных заболеваний риса на всей территории возделывания, в том числе и России, является пнрикуляриоз, вызываемый грибом Pyricularia oryzae С av. Селекция устойчивых сортов — наиболее эффективный подход борьбы с данной болезнью. В создании устойчивых к пирикуляриозу сортов* риса применение ДНК-маркеров может быть полезно как для непосредственного проведения селекции с

РГЛУ-МСХА 1 имени К,А» Тимирязева ЦНВЗнмени Н.И. Ж<.леэнова Фонд научной литературы Ni____з -7 п. I

помощью маркеров, так и для поиска доноров эффективных генов резистентности.

Цель н задачи исследований. Целью работы являлось создание селекционного материала риса, устойчивого к пирикуляриозу, с помощью методов молекулярного маркирования.

В проводимых исследованиях были поставлены следующие

задачи:

1. Выполнить программу скрещиваний, направленную на интрогрессию генов устойчивости к пирикуляриозу РИ, Р12, Р(33 и Рг-Ь в генотипы отечественных сортов.

2. Оценить возможность применения ДНК-маркеров, тесно сцепленных с генами РИ, Р12, Р1ЗЗ (Кт224, Ят527, 5811140, Р.т72, ЯтЗЮ) в данной работе: отработать параметры ПЦР для каждого маркера и определить полиморфизм изучаемых локусов у родительских форм.

3. Получить растения с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу РИ, Р12, РИЗ в одном генотипе.

4. Провести апробацию ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригенной маркерной системы гена Рг-Ь для практических задач селекции.

5. Изучить образцы рабочей коллекции ВНИИ риса ДНК-маркером гена Рг-Ь в целях поиска доноров эффективного гена устойчивости к пирикуляриозу.

6. Подобрать оптимальную методику выделения ДНК из растений риса для проведения массовых анализов, необходимых при маркерной селекции.

Научная новизна исследований. Впервые в практике селекции риса в России использована методика ДНК-маркнро&ания. Получены образцы, несущие гены устойчивости к пирикуляриозу А-Л Р1-2, Рг-ЗЗ, Р1-Ъ и обладающие комплексом признаков, соответствующих местным агроклиматическим условиям. Изучено 72 образца рабочей коллекции ВНИИ риса маркерной системой Рг-Ь гена, идентифицирован 1 сорт, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу Рг-Ь. Оптимизирована методика выделения ДНК из растений риса для проведения маркерной селекции. ^

Научно-практическая ценность работы. Полученные растения риса, несущие гены Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-b могут быть использованы как доноры указанных генов в селекционных программах на устойчивость к пирикуляриозу, Созданные образцы, в отличии от линий зарубежной селекции с данными генами, имеют период вегетации, соответствующий местным агроклиматическим условиям, и генетическую основу, близкую отечественным сортам. Показана эффективность применения ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригеиной маркерной системы гена Pi-b для практической селекции. Сорт Пхеньян-3 по данным молекулярного анализа несет ген Pi-b и рекомендован в качестве донора эффективного гена в селекции на устойчивость к пирикуляриозу. Разработанная методика выделения ДНК из растений риса позволяет в течение нескольких часов проводить экстракцию ДНК из значительного количества образцов и при этом не требует дорогостоящих реактивов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2004 - 2006 гг., а также были представлены на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 18-19 декабря 2003г.); международной конференции «Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004г.); 13-м международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Э миология. Экология и здоровье» (Алушта, 5- 12 сентября 2004 г.); 6-м международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 13-17 июня 2005 г.); международной научно-практической конференции «Устойчивое производство риса: настоящее и перспективы» (Краснодар, 5-9 сентября 2006г.).

Публикация результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ.

Объем н структура диссертации. Диссертация состоит m введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждение, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы. Работа m ложе на на 85

5

страницах машинописного текста, включающих 6 таблиц и 14 рисунков. Список использованной литературы включает 143 источника, в том числе 111- иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2003 г, по 2007 г. в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института риса и в опытном хозяйстве ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калинеико.

В целях создания на генетической основе российских сортов линий риса с генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, была проведена гибридизация ряда отечественных сортов с образцами зарубежной селекции - донорам и указанных генов. Из российских сортов в комбинациях скрещиваний были использованы Атлант, Аметист, Вираж, Боярин, Дружный, Снежинка, Хазар, Янтарь. Все отечественные сорта риса принадлежат к подвиду О sativa japónica, В проводимой работе в качестве доноров генов устойчивости задействованы линии indica: Cl04-Lac (несет ген Pi-i\ С101-А-51 (Pi-2\ ClOl-Lac (Pi-J+Pi-33) и сорт ВЫ (донор гена Pi-b, japónica).

Гибридизацию растений риса осуществляли используя пневмокастрацию цветков и опыление «твелл»-методом (Лось Г.Д., 2003).

72 образца го рабочей коллекции ВНИИ риса было проанализировано ДНК-маркерной системой гена Pi-b в целях поиска сортов-доноров данного фактора устойчивости.

* Для выделения ДНК из образцов рабочей коллекции ВНИИ риса использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, получаемые путем инкубации на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте, при температуре 25-27°С. Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод (Murray M.G„ Thompson W.F. 1980).

Из растений, задействованных в процессе маркерной селекции, образцы ДНК выделяли по разработанной упрощенной методике:

Свежесрезанную часть листа (2-Зсм) растирали в 500 мкл экстагирующего буфера в пластиковой пробирке объемом 1,5 мл. Буфер

б

использовали следующего состава: 1М Tris-HCl (рН 7.5), 5М NaCl, 0.5М EDTA (рН 8.0), 10% SDS. Инкубировали образцы при 60°С в течение 1 - 3 часов. Отделяли супернатант центрифугированием при 12000 об/мин. К перенесенной в чистую пробирку верхней фазе добавляли 300 мкл охлажденного изопропанола, оставляли на 20 минут, предварительно перемешав. После этого образец центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин. Полученный осадок ' промывали 100 мкл 70% этанола, высушивали и растворяли в 100 мкя 0,1 *ТЕ буфера.

Концентрацию выделенной ДНК определяли

спектрофотометрически по стандартной методике (Маниатис и др., 1984) и методом разведений полученных препаратов - электрофорез проб в ara розном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, и последующая визуализация в ультрафиолете с учетом порога чувствительности. бромистого этидия (Остерман Л .А., 1981).

Идентификацию генов Pi-1, Pi-2, Pi-33 в процессе селекции осуществляли тесно сцепленными микросателлитнымн маркерами: для гена Pi-2 использовали Rm527 и SSR140, для Pi-I - Rm224, для гена Pi-33 - Rm72, Rm310. Сиквенс праймерных пар на микросателлитные локусы доступен на сайте gnimene.com.

При исследовании маркерной системы гена устойчивости к пирикуляриозу Рг-Ь использовали следующие праймерные пары: Ft GAA CAG СТТGCT CGG ААТ ССА; R2 TAC TGC ATT GTG CAG СТТ GTG; R3 ATA CAT CGA CCA GCT ATT TGC С; F4 CAT CAA CGA AGT CCA GCT CA; R5 CCG CGC TAT СТТ GTA CAT ТС; R6 СТС AGC ATA TGT GGC AGC ТС.

Указанные праймеры могут быть использованы в нескольких комбинациях. Каждая комбинация должна включать в себя один прямой праймер (Fl, F4) и два обратных (R2+R3 wih'RS+R6). Идентификацию аллелъного состояния гена Pi-b в процессе маркерной селекции осуществляли комбинацией праймеров F1R2R3.

Праймерные последовательности, использованные в работе, синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Россия.

*7

ПЦР проводили с 40-50 нг ДНК в конечном объеме 25 мкл. Использовали следующий состав реакционной смеси: 0,05мМ dNTPs, 0,3 цМ каждого праймера, 25mM KCL, бОтМ Tris-HCL (pH 8,5), 0,1% Тритон Х-100, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, 1,5мМ MgCLi, 1 единица Taq-полимеразы. В пробирки с реакционной смесью добавляли минеральное масло для предотвращения испарения жидкости. ПЦР проводили в амплификаторе Терцнк, производства НПО «ДНК-Технология», Россия.

Амплификацию осуществляли при следующих условиях: начальная денатурация ДНК при 94 °С в течении 5 минут, следующие 35 циклов включали: 30 секунд денатурация при 94 "С, 30 секунд отжиг праймеров при Т "С, 35 секунд элонгация при 72 "С, последний цикл синтеза 3 минуты при 72 "С. Экспериментально были подобраны оптимальные условия ПЦР: для маркеров RM224, RM72, RM310 отжиг праймеров осуществляли при Т=56 "С, RM527 - Т=57 °С, ssrMO - Т=60 °С, лучший результат ПЦР с праймерными комбинациями маркерной системы гена Pi-b получали при Т=60 °С.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР маркеров RM527 и RM224 использовали 8% акриламидный гель на основе I *Трис-боратн01Ч> буфера. Электрофорез проводили при напряжении 25ÖV в течение 3 часов. Для идентификации продуктов ПЦР микросателлитных локусов RM72, RM3I0, SSR140 и внутригенного маркера гена Pi-b использовали электрофорез в агарозном геле. Визуализировали амплнфицировзниые фрагменты ДНК в ультрафиолетовом свете, предварительно окрашивая геленые пластины раствором бромистого этидия.

Метод х2 (х и-квадрат) применяли для оценки соответствия расщепления. в выборке, определенное на основании ДНК-анализа, теоретически ожидаемому.

Предварительная оценка линий С104-Lac, С101-А-51, C10l-Lac на устойчивость к местной популяции Pyricularia oryzae проводилась в лабораторных условиях в соответствии с методическими указаниями (Фролова B.C. и др., 19S3; Аверьянов A.A. и др., 1990). В качестве контроля был использован сорт риса Лиман, проявляющий среднюю устойчивость к пирикуляриозу. Инокуляцию растений проводили

8

культурой гриба, предоставленной сотрудниками лаборатории защиты растений ВНИИ риса, выделенной с полей Краснодарского края.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '

3.1 Интрогрессня геи он широкого спектра устойчивости к иприкулярнозу Pi-i, Pi-2, Pl-ЗЗ в отечественные сорта риса с применением методов маркерной селекции

Полевые популяции P.oryzae обычно представлены смесью рас с различным патотипом. Большинство генов устойчивости к пирикуляриозу, идентифицированных у риса, определяют не поражаем ость растений ограниченным числом рас патогена. Однако существуют гены и локусы, детерминирующие устойчивость широкого спектра, они являются для селекции важным генетическим ресурсом. К таковым генам относят Pi-I, Pi-2, Pi-33 - присутствие их доминантных аллелей в генотипе растения определяет его устойчивость к широкому спектру рас возбудителя пирикуляриоза (Deng Y. et al., 2006).

В проводимой работе по введению генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-I, Pi-2, Pi-33 в генотипы сортов риса, адаптированных к местным агроклиматическим условиям, в качестве доноров переносимых генов использованы линии C104-Lac, С101-А-51, ClOI-Lac подвида indica. В условиях Краснодарского края данные линии проявили себя как очень позднеспелые, с вегетационным периодом 140- 155 дней и характеризовались низкой фертильностью. В местной зоне рисосеяния предпочтительно возделывание сортов, созревающих не более, чем за 125 дней. Указанные линии-доноры были скрещены с отечественными сортами риса Атлант, Аметист, Дружный, Снежинка, Хазар и Боярин подвида japónica. При гибридизации российские сорта выступали в качестве материнских форм.

Контроль присутствия до норных генов устойчивости проводили ДНК-маркерами. M и кросагел л и тн ы е повторы, тесно сцепленные с генами Pi-I, Pi-2, Pi-33, были определены на генетическом материале линий C104-Lac, С101-А-51, ClOI-Lac и уже эффективно использовались

9

в селекции (Grrish Kumar К. et al-, 2000; Jiang J., Wang S.t 2002; Correa-Victoria F.J. et al., 2003). Предварительная оценка линий C104-Lac, C101-A-51, CIOl-Lac на чувствительность к местной популяции возбудителя пирикуляриоза показала их устойчивость..

На первом этапе необходимо было оценить возможность применения данных маркеров в проводимой работе: отработать параметры ПЦР для каждого маркера и определить полиморфизм изучаемых локусов у родительских форм. Выбор температуры отжига праймеров — один из ключевых факторов обеспечения высокоспецифичной ПЦР. Если температура окажется завышенной, отжиг не будет происходить, если заниженной - резко увеличится количество неспецифических продуктов ПЦР-реакции. Каждый из праймеров, применяемых для ПЦР, имеет свою оптимальную температуру отжига. При отработке условий амплификации используют усредненное значение температур, близкое к рассчитанным (Та = 4°C*(G + С) + 2°С*(А + Т) - 3), где G, С, А, Т - количество гуанидиновых, цитозиновых, аде ни новых и тиминовых оснований в нуклеотидной последовательности праймера, соответственно, и на практике устанавливают эмпирическое (Dieffenbach C.W.et al, 1995). Так для маркеров RM224, RM72, RM310 наилучший результат был получен при температуре отжига равной 56 °С, RM527 - при 57 °С, SSR140 - при 60 °С.

При работе молекулярными маркерами для селекционных задач важным фактором является время, затрачиваемое на лабораторный эксперимент. Более удобны в работе маркеры, которые позволяют проводить точную идентификацию результатов в агарозном геле, так как на визуализацию продуктов ПЦР уходит 40-60 минуг. В нашем исследовании возможность определения разницы аллельного состояния изучаемого микросателлитного повтора в геноме родительских форм, при электрофорезе ампликонов в агарозном геле, показали маркеры RM72, RM3I0, SSR140. Точную идентификации ПЦР-продуктов маркеров RM224 и RM527 проводили в 8% полиакриламидном геле.

Материнские формы для гибридизации были высеяны с учетом разницы периода вегетации. Процесс гибридизации осуществляли пиевмокастрацией и опылением «твел л »-методом.

Полученные семена гибридов первого поколения высеяли для возвратных скрещиваний с отечественными сортами риса, задействованными в данной программе. Рекуррентные российские сорта высевали в три срока, с разницей в 10 дней, тем самым увеличивая вероятность совпадения периодов цветения обеих родительских форм. Следует отметить, что растения р! имели высокую стерильность (до 95%). После проведения первой серии беккроссов, комбинации с сортами Дружный и Снежинка были исключены из дальнейшей программы по причине отсутствия семян ВС|. По другим комбинациям были получены ВС| популяции, однако часть проростков обладали пониженной жизнеспособностью и к генеративной стадии выжило до 65% высаженных растений. Из всех растений были выделены образцы ДИК, ПЦР-аналнзом с маркерами генов Р1-1, Р1-2, Р1-33 оценили в них наличие переносимых аллелей (рис. 1,2).

РМ 12 3 4 5 6 7 8 Боярин

Рисунок 1. Результаты электрофореза продуктов ПЦР локуса Яш224

РМ - линия С104-Ьас - донор гена Л*-/; Боярин - сорт-реципиент; 1 -8-анализируемые ВС1 -растения.

11

На рисунке 1 представлены результаты ДНК-анализа с маркером Р1-! гена ВСррастений из комбииации скрещивания С104-ЬасхБоярнн. Видно, что растения под номерами 3 и 5 несут только аллель, унаследованную от материнской формы - сорта Боярин. Образцы I, 2, 4, б, 7, 8 являются гетерозиготными по локусу Яш224 - на их электрофореграмме четко читаются и донорная и материнская аллели.

Хазар 12 3 4 5 РьЗЗ

Рисунок 2. Результат электрофореза продуктов ПЦР локуса (ЪпЗЮ

Р1-33 - линия С101-Ьас - донор гена Р1-33\ Хазар - сорт-

реципиент; 1 - 5 - анализируемые ВСЬрастения.

На рисунке 2 показаны результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР маркера ЯтЗЮ с ДНК растений из ВСг популяции комбинации С)01-ЬасхХазар. Донорная аллель выявлена в растении под номером 2, которое является гетерозиготным по изучаемому локусу. Остальные - несут только аллель, унаследованную от сорта Хазар.

Среди растений поколения ВС|, несущих переносимую аллель, отмечали те, которые показали наименьший период вегетации до цветения, их в первую очередь использовали в качестве отцовских форм при последующем беккросснровании с российскими сортами. Растения, в генотипе которых аллели устойчивости не были обнаружены, выбраковывали. В ВСгпопуляциях фертильность возросла и в среднем составляла около 50%.

В полученных BCi-гшпуляциях работа проводилась по той же схеме. Отобранные по молекулярным данным растения, несущие донорные аллели, вовлекали в следующий беккросс, предварительно выбраковав образцы с нежелательным морфотипом.

Начиная с поколения ВС3, дальнейшие возвратные скрещивания не проводили. Известно, что доля генома рекуррентной родительской формы в потомстве ВС3 составляет 93.75% (Jena К.К: et al., 2003). Растения, анализ ДНК которых показал присутствие донорных генов, были использованы для получения BCjF; поколения. Самоопыление растений риса, гетерозиготных по селектируемым генам, дает возможность перевести приоритетную аллель в гомозиготное состояние. В популяции ВСз были отобраны растения с наименьшим вегетационным периодом и наибольшей фертнлыюстью метелки. Семена этих растений высеяли для получения сегрегирующей ÖC3F2 популяции. Маркерный анализ полученной популяции выявил образцы, несущие вводимые целевые гены в гомозиготном состоянии.

Боярин Pi-33 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 3. Результаты электрофореза продуктов ПЦР локуса Rm72

Боярин - сорт-рециниент; Pi-ЗЗ - линия CtOl-Lac - донор гена Pi-33\ 1 - 7 - анализируемые ВСЗР2-растения.

Так, на рисунке 3 представлен анализ ДНК семи растений из поколения ВС^ комбинации С101-Ьас*Боярин. Образцы 4 и 5 являются гомозиготами по локусу 1*т72, сцепленным с геном Р1-33.

Для селекции риса на современном этапе желательным является низкорослый тип растений, с высокой интенсивностью первоначального роста, устойчивый к полеганию, с продуктивной метелкой и неосыпающимися в фазу полной спелости колосками. Среди растений, которые по результатам ДНК-анализа, несли гены Р/-/, Р1-2, Рг-ЗЗ в гомозиготном состоянии, удалось отобрать несколько форм, совмещающих в себе скороспелость, низкорослость, неосыпаемость и фертильность колосков. Семена этих растений были высеяны и в потомстве отобрали лучшие экземпляры.

В рабочую коллекцию ВНИИ риса передано 6 образцов, несущих гены Р1-1 (присвоены номера каталога 04433, 04434), Р1-2 (04435, 04436), Рг-33 (04437, 04438). Данные образцы риса могут выступать в качестве доноров генов Р1-1, Рг-2, Р1-33. Главные их преимущества над линиями СЮ4-Ьас, С101-А-51, С101-Ьас - вегетационным период (110- 120 дней), адаптированный к местным климатическим условиям и генетическая близость отечественным сортам, что позволит избежать высокую стерильность гибридов в селекционных программах.

При работе в популяциях, полученных от российского сорта Атлант, отбор вели также и на более удлиненную зерновку по сравнению с формой зерновки реципиентного родителя. Растения из ВСр-поколении с донорными аллелями и с максимальной фертильностью метелки были размножены. Расщепляющуюся ВС^г популяцию проанализировали ДНК-маркерами. Среди растений, несущих Р1-2 ген, отобрали лучшие по морфометрическим характеристикам. Семена отобранных растений высеяли* » потомстве произвели отбор наиболее раннеспелых форм и характеризующихся приоритетным морфотипом, маркерами оценили присутствие в образцах гена Рх-2. К настоящему времени из комбинации с сортом Атлант выделено 15 растений, несущих Рг-2 ген и имеющих положительные * морфометрические характеристики. Семена данных растений высеяны для отбора лучших образцов в потомстве.

На рисунке 4 представлены результаты электрО(|юретического разделения продуктов ПЦР локуса Кт527, сцепленного с геном Р1-2, Семь из десяти анализируемых растений подлежат выбраковке.

Рисунок 4. Результаты электрофореза продуктов ПЦР маркера Rm527

Pi-2 — линия С101-А-51 — донор гена P¡-2; Атл — сорт-реципиент

Атлант; 1 - 10 - анализируемые BCl-растения.

Одновременно, совместно с отделом селекции, семеноводства и технологии выращивания риса ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Кал и нем ко с 2004 года работ у вели и по несколько другой схеме (рис.5). Главной задачей было получить растения риса с пирамидированными генами Pi-1, P¡-2, Pi-33 в одном генотипе. Исследования показывают, что при совместном действии данные гены проявляют максимальную эффективность (Hittalmani S. et а)., 2000). В разных странах проведены селекционные программы, в которых объединение генов Pil, Pi2, Р133 в одном генотипе использовали как стратегию создания стабильной длительной устойчивости риса к пирикуляриозу (Girish Kumar К. et al., 2000; Correa-Victoria F.J, et al,, 2003). Сорта Боярин и Вираж были скрещены с линиями С101-А-51 и C101-Lac - донорами генов устойчивости соответственно P¡2 и Pi+ПЗЗ. Гибриды первого поколения использовали для получения F2 популяции.

Среди широкого спектра расщепления по многим признакам в F2 поколении каждой комбинации было отобрано несколько растений, обладающих положительными морфометрическими характеристиками. Отобранные 62 растения проанализировали методом ПЦР на наличие вводимых аллелей, 23 из них выбраковали. Остальные растения использовали для получения Fj популяций. В 2006 году изучили маркерами 150 растений из поколения F3 на стадии кущения. После уборки для ДНК-анализа были отобраны еще 60 растений, обладающих комплексом ценных признаков (скороспелостью, низкорослостью, хорошей озерненностью метелки, неосыпаемостью и фертильностью колосков). Среди всех- проанализированных образцов удалось выявить три, несущие совместно гены Pi-1 и Pi-ЗЗ в одном генотипе. Эти растения скрестили с формами, анализ ДНК которых показал наличие гена Pi-2 в гомозиготном состоянии,

С101-A-S1 к Вираж CtOI-Lac* Вираж

(PI2Pi2) | (pt2pi2> (Pt1PH+Pi33Pi33) j (pifp/i+рШрШ}

F2 F2

Индивидуальный отбор Индивидуальный отбор

ПЦР-анализ ПЦР-анализ

i

F3 F3

Индивидуальный отбор Индивидуальный отбор

ПЦР-анализ ПЦР-анализ

Р/2Р/2 * РПРП+Р/ЗЗ&ЗЗ

Я/2р/2+Р/1 рН+Р133р133

Рисунок 5. Схема пирам иди рования генов №/, Р1-2,РиЗЗ

На рисунке 5 представлена схема выполнения работ по объединению генов на примере комбинации с сортом Вираж. В настоящее время полученные гибридные растения, несущие пирамидированные гены Р!-1, Р1-2, Р1-33, выращиваются во ВНИИ риса. В потомстве этих растений будет наблюдаться расщепление - донорные гены находятся в

гете роз и гостом состоянии, однако с помощью маркеров будут выявлены формы с тремя генами в гомозиготном состоянии.

3.2 Введение гена Рг-Ь расосисцифимсскон устойчивости к пнрикулириозу н генетическую основу сортов селекции ШИШ риса

Янтарь и Хазар.

Ген Pi-b является одним из эффективных генов устойчивости к пирикуляриозу в зоне рисосеяния Краснодарского края (Коломнец Т.М., 1990). При этом Pi-b ген относится к наиболее изученным генам риса, он клонирован и сиквенирован (1'sun oda Y. et al., 2000), Знание нуклеотидной последовательности гена позволяет создавать внутригенные маркеры, особенно ценные для задач маркерной селекции. В лаборатории биотехнологии ВНИИ риса при сотрудничестве с японским научно-исследовательским центром NIAS была разработана внутри генная маркерная система гена Pi-b (Супрун И.И., 2006). Созданные маркерные пары кодоминантны - позволяют идентифицировать и доминантную, и рецессивную аллели, а также гетерозиготное состояние, что особенно важно при селекционной работе с применением ДНК-маркеров.

Ранее проводимое фитопатологическое тестирование рабочей коллекции ВНИИ риса не выявило образцы риса, несущие ген Pi-b (Зеленский Г.Л., 1993).

Нами начата программа по созданию линий, несущих Pi-b ген, на генетической основе отечественного риса. Донором iwa использован японский сорт BL1. Изначально линии и сорта подвида japónica с геном Pi-b получали при скрещивании элитных japónica сортов с образцами подвида indica — первичными донорами гена. Молекулярные данные, полученные при изучении ДНК ряда сортов подвида japónica, несущих ген Pt-b, указывают на наименьшую долю генома indica-типа в сорте IÏLI (Miyamoto M. et а!., 1996). Полное созревание данного сорта в местных условиях происходит на 160 — 170 дни вегетации. Районированные сорта селекции ВНИИ риса Янтарь и Хазар скрестили с ВЫ.

Гибридные семена использовали для получения F3 популяции. Визуализацию переносимой аллели устйчивости осуществляли с

17

помощью созданного ДНК-маркера. 135 растений из Рг популяции оценили методом ПЦР на наличие вводимого гена. По результатам маркерного анализа в выборке получено следующее соотношение: 29 растений несут доминантную аллель в гомозиготном состоянии, 75 — в гетерозиготном, 31 растения — гомозиготы по рецессиву. Методом хн-квадрата оценили статистическую достоверность соответствия

полученного в популяции расщепления теоретически ожидаемому. Полученные данные соответствуют ожидаемому моногенному расщеплению 1:2:1, подтверждая кодом инантность маркера.

Следует отметить, что созданная маркерная система включала в себя несколько возможных комбинаций праймеров, позволяющих идентифицировать аллельное состояние гена Л'-6. На начальных этапах исследования разработанного маркера, при изучении ДНК контрастных сортов, а также смеси их ДНК с целью имитации гетерозиготного состояния гена, наибольшую эффективность показывала комбинация Р4К5Я6. Однако при проведении анализа Р2-популяции, в продуктах ПЦР с данной комбинацией праймеров обнаруживались неспецифические амплифицировапные фрагменты. Вероятно, это связано с тем, что образцы ДНК растений из Р2-популяции выделяли по упрощенной модифицированной методике. На стадии отработки созданного маркера использовали для ПЦР высокоочищенную ДНК, экстрагированную СТАВ-методом, В ходе работы была определена комбинация, оптимально подходящая именно для проведения маркерной селекции (Р1И2КЗ). Получаемые ПЦР-продукты доминантной и рецессивной аллелей различаются более чем на 100 пар нуклеотидов, это обеспечивает их безошибочную идентификацию при электрофорезе в агарозном геле (рис. 6).

Среди растений Р2, несущих доминантную аллель Р1-Ь в гомозиготном состоянии отобрали лучшие, и их использовали в качестве отцовских форм при возвратных скрещиваниях на рекуррентные родительские формы - сорта Янтарь и Хазар.

В настоящее время получены ВС2 семена. Последующие беккроссы позволят создать линии риса с комплексом ценных признаков

районированного сорта и имеющие эффективный ген устойчивости к пирикуляриозу.

ВЫЯнт I 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 6. Результаты электрофоретическго разделения продуктов ПЦР с комбинацией праймеров Р11121*3

ВЫ - сорт риса, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу Р1-Ь\ Янт - Янтарь, отечественный сорт-реципиент; 1- 8 - образцы из гибридной Р2 популяции ВЫхЯнтарь

3.3 Изучение образцов рабочей коллекции ВНИИ риса внутри генной маркерной системой гена Р1~Ь Поиск доноров резистентности - один из главных этапов в селекции устойчивых к пирикуляриозу форм риса. Традиционно для идентификации генетической плазмы, несущей устойчивость к пирикуляриозу, применяют фитопатологические исследования. Однако такие анализы трудоемки и для их проведения необходимы совместимые изоляты возбудителя, а присутствие одного гена устойчивости иногда могут фенотипически скрывать другие гены, определяющие резистентность к той же расе гриба. Использование ДНК-маркероа позволяет безошибочно идентифицировать аллели генов устойчивости в анализируемых растениях (Сокаи ау - Во ппапз С.А., 2003).

Проведено изучение 72 образцов из рабочей коллекции ВНИИ* риса на предмет присутствия доминантной аллели гена Р1-Ь (рис.7). Аллель, определяющая устойчивость к пирикуляриозу выявлена в корейском сорте Пхеньян-3, поступившем в коллекцию в 2005 году.

ВЫ I 2 3 4 5 б ВЫ

Рисунок 7. Результаты анализа образцов рабочей коллекции ВНИИ риса внутригенной маркерной системой гена Р1-Ь

ВЫ - сорт риса, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу Р1-Ь\

1 - 6 - образцы рабочей коллекции ВНИИ риса.

Пхеньян-3 может быть использован в селекции на устойчивость к пирикуляриозу как донор гена Р)-Ь. При этом указанный сортообразец по данным лаборатории исходного материала, приведенным в отчете о НИР за 2006 год,' обладает ценными характеристиками. Период вегетации — 80-122 дней, высота растений - 103 см, площадь флагового листа - 54 см1. Масса 1000 зерен - 22 г, грещинсватость зерновок-9%, стекловидность -84%, общий выход крупы - 68,4% и целого ядра - 99,4%.

выводы

Т. Показана возможность проведения маркерной селекции с отечественными сортами риса с использованием микросагеллитных маркеров, тесно сцепленных с генами Р1-2, Рг-ЗЗ: Ит224, Яш527, 5511140, Рт72, КтЗЮ.

2. ДНК-маркер гена Р>-Ь использован для поиска доноров данного гена. Изучены 72 образца из рабочей коллекции ВНИИ риса. В корейском сорте Пхеньян-3 выявлен ген устойчивости к пирикуляриозу р1-Ь.

3. Показана эффективность для селекционной практики внутригенной кодоминантной маркерной системы гена Р'ьЬ, определена оптимальная комбинация праймеров для проведения маркерной селекции,

4. В рабочую коллекцию ВНИИ риса переданы образны 04433, 04434, 04435, 04436, 04437, 04438, несущие гены Р1-1, Р1-2, Р1-33, что подтверждено данными молекулярного анализа, и обладающие комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края,

5. Получены образцы с пирам иди рованнммн генами Л'-/, Р'г-2, Рг-33 в гетерозиготном состоянии,

6. На основе отечественных сортов созданы беккроссные ВС2 линии, несущие ген Рг-Ь.

7. В работе представленных исследований использованы образцы ДНК, выделенные по модифицированной нами методике, тем самым доказана ее эффективность для задач маркерной селекции риса.

Рекомендации для селекционной практики

- Рекомендовать образцы, переданные в рабочую коллекцию ВНИИ риса в качестве доноров генов /V/(присвоены номера каталога 04433, 04434). Р12 (04435, 04436/ Р133 (04437, 0443К) для использования их в селекции на устойчивость к пирикуляриозу;

- Использовать образец с пирамиднровапиымн генами РН^П2+Р133 как исходный материал для создания сортов риса со стабильной устойчивостью к пирикуляриозу;

- Полученный в работе селекционный материал с генами устойчивости использовать для дальнейшей работы, направленной на создание образцов устойчивых к пнрикуляриозу и обладающих комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края;

- Использовать маркерную систему гена Рг-Ь для изучения образцов, поступающих в рабочую коллекцию ВНИИ риса с целью выявления доноров данного гена;

- Рекоммендовать сорт Пхеньян 3 как донор гена Pi-b;

- Применять модифицированную методику выделения ДНК для массовых анализов в последующих селекционных программах с применением молекулярного маркирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

). Супрун И.И., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т. Системы молекулярного ДНК-маркирования и их использование в селекционно-генетических исследованиях риса // Рисоводство.- 2003.- № 3,- С. 25-30.

2. Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М. Селекция устойчивых к пнрикуляриозу сортов риса с использованием методов молекулярной биологии И Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы 5-;й региональной науч-практ. конференции молодых ученых 18-19 декабря 2003 г. / КубГАУ, - Краснодар, 2003. - С. 315-317.

3. Kharitonov Е.М., Mukhina Zh. М., Ilnitskaya Е.Т., Suprun J.I. Marker assisted selection on rice blast resistance // Proceeding of the conference « Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» 15-17 September 2004.- Turin, 2004,- P.410-411.

4. Супрун И.И., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т. Создание сорта риса с длительной полевой устойчивостью к пнрикуляриозу П Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосйстем: материалы докладов международной научно-практической конференции 29 сентября

- 1 октября 2004 г.- Краснодар, 2004.-C.I49-151.

22 ,

5. Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М. Пирамидиро&ание генов устойчивости к пирикуляриозу риса PiI, Pi2, Pi33 с помощью молекулярных маркеров // Рисоводство,- 2004.-№.5,- С.32-33.

6. Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М. Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с привлечением методики маркерной селекции // Эволюция научных технологий в растениеводстве: Сборник научных трудов, посвященных 90-летию КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко,-Краснодар, 2004.- Том 3.- С.284-286.

7. Ильницкая Е.Т. Использование маркеров при п и рам и днрован ии главных генов в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу // Нетрадиционное растениеводство. Эннология. Экология и здоровье: материалы 13-го Международного симпозиума. - Симферополь, 2004. -С. 433.

8. Ильницкая Е.Т., Волкова С.А., Мухина Ж.М. Селекция риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением методов молекулярного (микросателлитного) маркирования // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: материалы 6-го Международного симпозиума. - Москва-Пущино, 2005. - Том. П.-С.288-290.

9. Ковалев B.C., Мухина Ж.М., Ильницкая Е.Т., Супрун И.И., Волкова С.А. Комплексный подход к селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением молекулярных маркеров // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук,- 2006.-№4.- С. 10- 12.

10. Ильницкая Е.Т. Использование ДНК-маркера гена Pi-b в целях поиска доноров устойчивости к пирикуляриозу и иитрогрессии гена в российскую генплазму риса И Устойчивое производство риса: настоящее и перспективы; материалы международной научно-практической конференции,- Краснодар, 2006.- С. 328-329.

11. Костылев П.И., Вожжова H.H., Ильницкая Е. Т., Мухина Ж.М. Перенос генов устойчивочти к пирикуляриозу в сорта риса с помощью маркерного контроля // Устойчивое производство риса: настоящее и перспективы: материалы международной научно-практической конференции.- Краснодар, 2006.-С. 98-107.

12. Супрун И.И., Ильницкая Е.Т, Разработка внутригенной маркерной системы для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b //

23

Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края: сборник -тезисов конференции грантодержагелей регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «Юг России».- Краснодар, 2006.- С. 170- 171.

Подписано в печать 26.04.2007 г. Формат60*54 ^

Бумага офсетная Офсетная печать

Псч.л. 1 Заказ №255 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13