Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу"

На правах рукописи

Р

Илышцкап Елена Тарасовна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ РИСА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ

Специальность* 06 01 05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар —2007

003059102

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт риса в 2003-2007 гг.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Мухина Жанна Михайловна

Официальные оппоненты, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Зеленский Григорий Леонидович

кандидат биологических наук Гучетль Сайда Заурбиевна

Ведущая организация - Кубанский государственный аграрный

университет

Защита состоится « 30 » мая 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 026 01 в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт риса по адресу.

350921, г. Краснодар, п /о Белозерное тел/факс (8612) 29-41-49

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан « 28 » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Гончарова Ю.К.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последнее время все увереннее обсуждается роль ДНК-технологий в ускорении процесса селекции, охране авторских прав селекционеров и защите продукции растениеводства от возможной фальсификации Только анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, практически пригодные для идентификации генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков

Процесс создания новых форм растений базируется на генетическом разнообразии и методах его использования селекционерами Применение ДНК-технологий позволяет существенно расширить возможности традиционной селекции растений Проявление молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифичным, и их можно обнаружить на любой стадии развития растений Методы ДНК-генотипирования и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker assisted selection - MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно ценных генов в процессе селекции и обеспечить создание новых сортов с целым комплексом заданных свойств (Хавкин Э Е , 2003)

Успехи в молекулярной биологии риса {Oryza sativa L) -благоприятная среда для активного использования маркерных технологий именно для этой культуры Секвенирование генома риса и клонирование генов позволяют создавать ДНК-маркеры, эффективные в работе практической селекции

Одним из наиболее вредоносных заболеваний риса на всей территории возделывания, в том числе и России, является пирикуляриоз, вызываемый грибом Pyriculana oryzae Cav Селекция устойчивых сортов - наиболее эффективный подход борьбы с данной болезнью. В создании устойчивых к пирикуляриозу сортов риса применение ДНК-маркеров может быть полезно как для непосредственного проведения селекции с

помощью маркеров, так и для поиска доноров эффективных генов резистентности

Цель и задачи исследований Целью работы являлось создание селекционного материала риса, устойчивого к пирикуляриозу, с помощью методов молекулярного маркирования

В проводимых исследованиях были поставлены следующие

задачи-

1. Выполнить программу скрещиваний, направленную на интрогрессию генов устойчивости к пирикуляриозу Рг1, Рг2, РгЗЗ и Рг-Ь в генотипы отечественных сортов

2. Оценить возможность применения ДНК-маркеров, тесно сцепленных с генами Рй, Рг2, РгЗЗ (Ят224, Ят527, 8811140, Ят72, ЛтЗ 10) в данной работе отработать параметры ПЦР для каждого маркера и определить полиморфизм изучаемых локусов у родительских форм

3 Получить растения с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Рг1, Рг2, Р1ЗЗ в одном генотипе

4 Провести апробацию ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригенной маркерной системы гена Рг-Ь для практических задач селекции

5. Изучить образцы рабочей коллекции ВНИИ риса ДНК-маркером гена Рг-Ъ в целях поиска доноров эффективного гена устойчивости к пирикуляриозу

6 Подобрать оптимальную методику выделения ДНК из растений риса для проведения массовых анализов, необходимых при маркерной селекции.

Научная новизна исследований Впервые в практике селекции риса в России использована методика ДНК-маркирования Получены образцы, несущие гены устойчивости к пирикуляриозу Р'г-1, Рг-2, Рг-ЗЗ, Р1-Ь и обладающие комплексом признаков, соответствующих местным агроклиматическим условиям Изучено 72 образца рабочей коллекции ВНИИ риса маркерной системой Рг-Ь гена, идентифицирован 1 сорт, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу Рг-Ь Оптимизирована методика выделения ДНК из растений риса для проведения маркерной селекции

Научно-практическая ценность работы. Полученные растения риса, несущие гены Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ и Pi-b могут быть использованы как доноры указанных генов в селекционных программах на устойчивость к пирикуляриозу. Созданные образцы, в отличии от линий зарубежной селекции с данными генами, имеют период вегетации, соответствующий местным агроклиматическим условиям, и генетическую основу, близкую отечественным сортам. Показана эффективность применения ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригенной маркерной системы гена Pi-b для практической селекции Сорт Пхеньян-3 по данным молекулярного анализа несет ген Pi-b и рекомендован в качестве донора эффективного гена в селекции на устойчивость к пирикуляриозу Разработанная методика выделения ДНК из растений риса позволяет в течение нескольких часов проводить экстракцию ДНК из значительного количества образцов и при этом не требует дорогостоящих реактивов

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2004 - 2006 гг , а также были представлены на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 18-19 декабря 2003г), международной конференции «Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004r ), 13-м международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 5- 12 сентября 2004 г); 6-м международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 13-17 июня 2005 г.), международной научно-практической конференции «Устойчивое производство риса настоящее и перспективы» (Краснодар, 5-9 сентября 2006г )

Публикация результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждение, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы Работа изложена на 85

5

страницах машинописного текста, включающих 6 таблиц и 14 рисунков Список использованной литературы включает 143 источника, в том числе 111 - иностранных авторов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились с 2003 г по 2007 г в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно - исследовательского института риса и в опытном хозяйстве ВНИИ зерновых культур им И Г Калиненко В, целях создания на генетической основе российских сортов линий риса с генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, была проведена гибридизация ряда отечественных сортов с образцами зарубежной селекции - донорами указанных генов Из российских сортов в комбинациях скрещиваний были использованы Атлант, Аметист, Вираж, Боярин, Дружный, Снежинка, Хазар, Янтарь Все отечественные сорта риса принадлежат к подвиду О sativa japónica В проводимой работе в качестве доноров генов устойчивости задействованы линии indica C104-Lac (несет ген Pi-1), С101-А-51 (Pi-2), C101-Lac (Pt-l+Pi-33) и сорт В LI (донор гена Pi-b, japónica)

Гибридизацию растений риса осуществляли используя пневмокастрацию цветков и опыление «твелл»-методом (Лось Г Д , 2003) 72 образца из рабочей коллекции ВНИИ риса было проанализировано ДНК-маркерной системой гена Pi-b в целях поиска сортов-доноров данного фактора устойчивости

Для выделения ДНК из образцов рабочей коллекции ВНИИ риса использовали бесхлорофилльные семидневные проростки, получаемые путем инкубации на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте, при температуре 25-27°С. Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод (Murray М G , Thompson W F 1980)

Из растений, задействованных в процессе маркерной селекции, образцы ДНК выделяли по разработанной упрощенной методике

Свежесрезанную часть листа (2-Зсм) растирали в 500 мкл экстагирующего буфера в пластиковой пробирке объемом 1,5 мл Буфер

6

использовали следующего состава 1М Tns-HCl (рН 7 5), 5М NaCl, 0.5М EDTA (рН 8 0), 10% SDS Инкубировали образцы при 60°С в течение 1 - 3 часов Отделяли супернатант центрифугированием при 12000 об/мин К перенесенной в чистую пробирку верхней фазе добавляли 300 мкл охлажденного изопропанола, оставляли на 20 минут, предварительно перемешав После этого образец центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин Полученный осадок промывали 100 мкл 70% этанола, высушивали и растворяли в 100 мкл 0,1 хТЕ буфера

Концентрацию выделенной ДНК определяли

спектрофотометрически по стандартной методике (Маниатис и др, 1984) и методом разведений полученных препаратов - электрофорез проб в агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, и последующая визуализация в ультрафиолете с учетом порога чувствительности бромистого этидия (Остерман J1 А , 1981)

Идентификацию генов Pi-1, Pi-2, Pi-33 в процессе селекции осуществляли тесно сцепленными микросателлитными маркерами для гена Pi-2 использовали Rm527 и SSR140, для Pi-1 - Rm224, для гена/VU - Rm72, Rm310 Сиквенс праймерных пар на микросателлитные локусы доступен на сайте gramene com

При исследовании маркерной системы гена устойчивости к пирикуляриозу Рх-Ъ использовали следующие праймерные пары FI GAA CAG СТТ GCT CGG ААТ ССА, R2 TAC TGC ATT GTG CAG СТТ GTG, R3 ATA CAT CGA CCA GCT ATT TGC C, F4 CAT CAA CGA AGT CCA GCT CA, R5 CCG CGC TAT СТТ GTA CAT ТС, R6 СТС AGC ATA TGT GGC AGC ТС

Указанные праймеры могут быть использованы в нескольких комбинациях Каждая комбинация должна включать в себя один прямой праймер (FT, F4) и два обратных (R2+R3 или R5+R6) Идентификацию аллелыюго состояния гена Pi-b в процессе маркерной селекции осуществляли комбинацией праймеров F1R2R3

Праймерные последовательности, использованные в работе, синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Россия

7

ПЦР проводили с 40-50 иг ДНК в конечном объеме 25 мкл Использовали следующий состав реакционной смеси 0,05мМ сМТРя, О.ЗцМ каждого праймера, 25тМ КСЬ, бОтМ Тпэ-НСЬ (рН 8,5), 0,1% Тритон Х-100, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, 1,5мМ MgCL2, 1 единица Тац-полимеразы В пробирки с реакционной смесью добавляли минеральное масло для предотвращения испарения жидкости ПЦР проводили в амплификаторе Терцик, производства НПО «ДНК-Технология», Россия

Амплификацию осуществляли при следующих условиях начальная денатурация ДНК при 94 °С в течении 5 минут, следующие 35 циклов включали 30 секунд денатурация при 94 °С, 30 секунд отжиг праймеров при Т °С, 35 секунд элонгация при 72 °С, последний цикл синтеза 3 минуты при 72 °С Экспериментально были подобраны оптимальные условия ПЦР для маркеров ЯМ224, ЯМ72, ЯМЗЮ отжиг праймеров осуществляли при Т=56 °С , ЯМ527 - Т=57 °С, ббгНО - Т=60 °С, лучший результат ПЦР с праймерными комбинациями маркерной системы гена Рг-Ь получали при Т=60 °С

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР маркеров ЯМ527 и ЯМ224 использовали 8% акриламидный гель на основе 1ХТ рис-боратного буфера Электрофорез проводили при напряжении 250У в течение 3 часов Для идентификации продуктов ПЦР микросателлитных локусов ЯМ72, ЯМЗЮ, 88Я140 и внутригенного маркера гена РьЬ использовали электрофорез в агарозном геле Визуализировали амплифицированные фрагменты ДНК в ультрафиолетовом свете, предварительно окрашивая гелевые пластины раствором бромистого этидия

Метод х2 (хи-квадрат) применяли для оценки соответствия расщепления в выборке, определенное на основании ДНК-анализа, теоретически ожидаемому.

Предварительная оценка линий С104-Ьас, С101-А-51, С101-Ьас на устойчивость к местной популяции Рупси1апа огугае проводилась в лабораторных условиях в соответствии с методическими указаниями (Фролова ВС и др, 1983, Аверьянов А А и др, 1990) В качестве контроля был использован сорт риса Лиман, проявляющий среднюю устойчивость к пирикуляриозу Инокуляцию растений проводили

8

культурой гриба, предоставленной сотрудниками лаборатории защиты растений ВНИИ риса, выделенной с полей Краснодарского края

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Итрогрессня генов широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ в отечественные сорта риса с применением методов маркерной селекции

Полевые популяции Р oryzae обычно представлены смесью рас с различным патотипом Большинство генов устойчивости к пирикуляриозу, идентифицированных у риса, определяют непоражаемость растений ограниченным числом рас патогена Однако существуют гены и локусы, детерминирующие устойчивость широкого спектра, они являются для селекции важным генетическим ресурсом К таковым генам относят Pi-I, Pi-2, Pi-ЗЗ - присутствие их доминантных аллелей в генотипе растения определяет его устойчивость к широкому спектру рас возбудителя пирикуляриоза (Deng Y et al , 2006)

В проводимой работе по введению генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-], Pi-2, Pi-ЗЗ в генотипы сортов риса, адаптированных к местным агроклиматическим условиям, в качестве доноров переносимых генов использованы линии C104-Lac, С101-А-51, ClOl-Lac подвида indica В условиях Краснодарского края данные линии проявили себя как очень позднеспелые, с вегетационным периодом 140- 155 дней и характеризовались низкой фертильностыо В местной зоне рисосеяния предпочтительно возделывание сортов, созревающих не более, чем за 125 дней Указанные линии-доноры были скрещены с отечественными сортами риса Атлант, Аметист, Дружный, Снежинка, Хазар и Боярин подвида japónica При гибридизации российские сорта выступали в качестве материнских форм

Контроль присутствия донорных генов устойчивости проводили ДНК-маркерами Микросагеллитные повторы, тесно сцепленные с генами Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ, были определены на генетическом материале линий C104-Lac, С101-А-51, ClOl-Lac и уже эффективно использовались

9

в селекции (Ginsh Kumar К et al, 2000, Jiang J, Wang S, 2002, Correa-Victoria F J et al, 2003) Предварительная оценка линий C104-Lac, С101-A-51, C101-Lac на чувствительность к местной популяции возбудителя пирикуляриоза показала их устойчивость

На первом этапе необходимо было оценить возможность применения данных маркеров в проводимой работе отработать параметры ПЦР для каждого маркера и определить полиморфизм изучаемых локусов у родительских форм Выбор температуры отжига праймеров — один из ключевых факторов обеспечения

высокоспецифичной ПЦР Если температура окажется завышенной, отжиг не будет происходить, если заниженной - резко увеличится количество неспецифических продуктов ПЦР-реакции Каждый из праймеров, применяемых для ПЦР, имеет свою оптимальную температуру отжига При отработке условий амплификации используют усредненное значение температур, близкое к рассчитанным (Та = 4°Cx(G + С) + 2°Сх(А + Т) - 3), где G, С, А, Т - количество гуанидиновых, цитозиновых, адениновых и тиминовых оснований в нуклеотидной последовательности праймера, соответственно, и на практике устанавливают эмпирическое (Dieffenbach С W et al, 1995) Так для маркеров RM224, RM72, RM310 наилучший результат был получен при температуре отжига равной 56 °С, RM527 - при 57 °С, SSR140 - при 60 °С

При работе молекулярными маркерами для селекционных задач важным фактором является время, затрачиваемое на лабораторный эксперимент Более, удобны в работе маркеры, которые позволяют проводить точную идентификацию результатов в агарозном геле, так как на визуализацию продуктов ПЦР уходит 40-60 минут В нашем исследовании возможность определения разницы аплельного состояния изучаемого микросателлитного повтора в геноме родительских форм, при электрофорезе ампликонов в агарозном геле, показали маркеры RM72, RM310, SSR140 Точную идентификации ПЦР-продуктов маркеров RM224 и RM527 проводили в 8% полиакриламидном геле

Материнские формы для гибридизации были высеяны с учетом разницы периода вегетации. Процесс гибридизации осуществляли пневмокастрацией и опылением «твелл»-методом.

Полученные семена гибридов первого поколения высеяли для возвратных скрещиваний с отечественными сортами риса, задействованными в данной программе. Рекуррентные российские сорта высевали в три срока, с разницей в 10 дней, тем самым увеличивая вероятность совпадения периодов цветения обеих родительских форм. Следует отметить, что растения Р| имели высокую стерильность (до 95%). После проведения первой серии беккроссов, комбинации с сортами Дружный и Снежинка были исключены из дальнейшей программы по причине отсутствия семян ВС]. По другим комбинациям были получены ВС| популяции, однако часть проростков обладали пониженной жизнеспособностью и к генеративной стадии выжило до 65% высаженных растений. Из всех растений были выделены образцы ДНК, ПЦР-анализом с маркерами генов Р1-1, Р1-2, ¡4-33 оценили в них наличие переносимых аллелей (рис.1,2).

РМ 12 3 4 5 6 7 8 Боярин

Рисунок 1. Результаты электрофореза продуктов ПЦР л о куса Кт224

РН - линия С104-Ьас - донор гена Боярин - сорт-

реципиент; 1 - 8 - анализируемые ВС 1-растения.

11

На рисунке ! представлены результаты ДНК-анализа с маркером П-1 гена ВС|-растений из комбинации скрещивания € 104-Ьас*Боярин. Видно, что растения под номерами 3 и 5 несу] только аллель, унаследованную от материнской формы - сорта Боярин. Образцы 1, 2, 4, 6, 7, 8 являются гетерозиготными по локусу Кт224 - па их электрофореграмме четко читаются и донорная и материнская аллели.

Хазар 12 3 4 5 РьЗЗ

Рисунок 2. Результат электрофореза продуктов П11,Р л о кус а КтЗ 10

Р(-33 - линия СЮ1-Ьас - донор гена П-33\ Хазар - сорт-

рециписнт; 1 - 5 - анализируемые ВС]-растения.

11;1 рисунке 2 покачан м результаты электрофоре гического разделения продуктов ПЦР маркера КтЗЮ с ДНК растений из ВСГ популяции комбинации С101-ЬасхХазар, Донорная аллель выявлена в растении под номером 2, которое является гетерозиготным по изучаемому локусу. Остальные - несут только аллель, унаследованную от сорта Хазар.

Среди растений поколения ВС|, несущих переносимую аллель, отмечали те, которые показали наименьший период вегетации до цветения, их в первую очередь использовали в качестве отцовских форм при последующем беккроссировании с российскими сортами. Растения, в генотипе которых аллели устойчивости не были обнаружены, выбраковывали. В ВС ¡-Популяциях фертильность Возросла и в среднем составляла около 50%.

В полученных ВС2-популяциях работа проводилась по той же схеме. Отобранные по молекулярным данным растения, несущие донорные аллели, вовлекали в следующий беккросс, предварительно выбраковав образцы с нежелательным морфотипом.

Начиная с поколения BCj, дальнейшие возвратные скрещивания не проводили. Известно, что доля генома рекуррентной родительской формы в потомстве ВС} составляет 93.75% (Jena K.K. et al., 2003). Растения, анализ ДНК которых показал присутствие донорпых генов, были использованы для получения EiC^F2 поколения. Самоопыление растений риса, гетерозиготных по селектируемым генам, дает возможность перевести приоритетную аллель в гомозиготное состояние. В популяции ВСд были отобраны растения с наименьшим весегационным периодом и наибольшей фертильпостыо метелки. Семена этих растений высеяли для получения сегрегирующей ВС^Р2 популяции. Маркерный анализ полученной популяции выянил образцы, несущие вводимые целевые гены в гомозиготном состоянии.

Боярин Pi-33 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 3. Результаты электрофореза продуктов ПЦР локуса Г<т72

Боярин - сорт-реципиент; Pi-ЗЗ - линия ClOl-Lac - донор гена Pi-33\ I - 7 - анализируемые В>СЗР2-растения.

Так, на рисунке 3 представлен анализ ДНК семи растений из поколения BC3F2 комбинации ClOl-ЬасхБоярин Образцы 4 и 5 являются гомозиготами по локусу Rm72, сцепленным с геном Pi-33

Для селекции риса на современном этапе желательным является низкорослый тип растений, с высокой интенсивностью первоначального роста, устойчивый к полеганию, с продуктивной метелкой и неосыпающимися в фазу полной спелости колосками Среди растений, которые по результатам ДНК-анализа, несли гены Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ в гомозиготном состоянии, удалось отобрать несколько форм, совмещающих в себе скороспелость, низкорослость, неосыпаемость и фертильность колосков Семена этих растений были высеяны и в потомстве отобрали лучшие экземпляры

В рабочую коллекцию ВНИИ риса передано 6 образцов, несущих гены Pi-1 (присвоены номера каталога 04433, 04434), Pi-2 (04435, 04436), Pi-33 (04437, 04438) Данные образцы риса могут выступать в качестве доноров генов Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ Главные их преимущества над линиями C104-Lac, С101-А-51, C101-Lac - вегетационным период (110 - 120 дней), адаптированный к местным климатическим условиям и генетическая близость отечественным сортам, что позволит избежать высокую стерильность гибридов в селекционных программах

При работе в популяциях, полученных от российского copra Атлант, отбор вели также и на более удлиненную зерновку по сравнению с формой зерновки реципиентного родителя Растения из BCi-поколении с донорными аллелями и с максимальной фертильностью метелки были размножены Расщепляющуюся BC|F2 популяцию проанализировали ДНК-маркерами Среди растений, несущих Pi-2 ген, отобрали лучшие по морфометрическим характеристикам Семена отобранных растений высеяли, в потомстве произвели отбор наиболее раннеспелых форм и характеризующихся приоритетным морфотипом, маркерами оценили присутствие в образцах гена Рг-2 К настоящему времени из комбинации с сортом Атлант выделено 15 растений, несущих Pi-2 ген и имеющих положительные морфометрические характеристики Семена данных растений высеяны для отбора лучших образцов в потомстве

На рисунке 4 представлены результаты электрофоретичеекого разделения продуктов ПЦР локуса Кт527, сцепленного с геном Р!-2. Семь из десяти анализируемых растений подлежат выбраковке.

Атл Pi-2 12345678910

Рисунок 4. Результаты электрофореза продуктов ПЦР маркера Rm527

Pi-2 - линия С101-А-51 - донор гена Pi-2; Атл - сорт-реципиент

Атлант; 1 - 10 - анализируемые ВС 1-растения.

Одновременно, совместно с отделом селекции, семеноводства и технологии выращивания ряса ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко с 2004 года работу вели и но несколько другой схеме (рис.5). Главной задачей было получить растения риса с пирамидированнымн генами Pi-3, Pi-2, Pi-ЗЗ в одном генотипе. Исследования показывают, что при совместном действии данные гены проявляют максимальную эффективность (Hitlalmani S, et а!., 2000). В разных странах проведены селекционные программы, в которых объединение генов Pil, P¡2, P¡33 в одном генотипе использовали как стратегию создания стабильной длительной устойчивости риса к пирикуляриозу (Girish Кumar К., el а\., 2000; Correa-Victoria F.J, et al., 2003). Сорта Боярин и Вираж были скрещены с линиями CíOi-A-51 и C101-Lac - донорами генов устойчивости соответственно Pi2 и Pi+P¡33. Гибриды первого поколения использовали для получения Рг популяции.

Среди широкого спектра расщепления по многим признакам в F2 поколении каждой комбинации было отобрано несколько рас1ений, обладающих положительными морфометрическими характеристиками Отобранные 62 растения проанализировали методом ПЦР на наличие вводимых аллелей, 23 из них выбраковали Остальные растения использовали для получения F3 популяций В 2006 году изучили маркерами 150 растений из поколения F3 на стадии кущения После уборки для ДНК-анализа были отобраны еще 60 растений, обладающих комплексом ценных признаков (скороспелостью, низкорослостью, хорошей озерненностью метелки, неосыпаемостыо и фертильностью колосков) Среди всех проанализированных образцов удалось выявить три, несущие совместно гены Pi-1 и Pt-ЗЗ в одном генотипе Эти растения скрестили с формами, анализ ДНК которых покашл наличие гена Pi-2 в гомозиготном состоянии

С101-А-51 х Вираж C101-Lacx Вираж

(P/2Pi2) J (pi2pi2) (Pi1Pi1+Pi33Pi33) f (pi1pi1+pi33pi33)

J i

F2 F2

Индивидуальный отбор Индивидуальный отбор

ПЦР-анализ ПЦР-анализ

F3

F3

Индивидуальный отбор Индивидуальный отбор

ПЦР-анализ ПЦР-анализ

Pi2Pi2 х Pi1Pi1+Pi33Pi33

i

Pi2pi2+Pi1pi1+Pi33pi33

Рисунок 5 Схема пирамидирования генов Pi-1, Pi-2, Pi-33

На рисунке 5 представлена схема выполнения работ по объединению генов на примере комбинации с сортом Вираж В настоящее время полученные гибридные рас гения, несущие пирамидированные гены Pi-J, Pi-2, Pi-ЗЗ, выращиваются во ВНИИ риса В потомстве этих растений будет наблюдаться расщепление - донорные гены находятся в

гетерозиготном состоянии, однако с помощью маркеров будут выявлены формы с тремя генами в гомозиготном состоянии

3.2 Введение гена Pi-b расоспсцнфнчсской устойчивости к пприкуллрнозу в генетическую основу сортов селекции ВНИИ риса

Янтарь п Хазар.

Ген Pi-b является одним из эффективных генов устойчивости к пирикуляриозу в зоне рисосеяния Краснодарского края (Коломиец Т M , 1990) При этом Pi-b ген относится к наиболее изученным генам риса, он клонирован и сиквенирован (Isunoda Y et al, 2000) Знание нуклеотидной последовательности гена позволяет создавать внутригенные маркеры, особенно ценные для задач маркерной селекции В лаборатории биотехнологии ВНИИ риса при сотрудничестве с японским научно-исследовательским центром NIAS была разработана внутригенная маркерная система гена Pi-b (Супрун И И, 2006) Созданные маркерные пары кодоминангны - позволяют идентифицировать и доминантную, и рецессивную аллели, а также гетерозиготное состояние, что особенно важно при селекционной работе с применением ДНК-маркеров

Ранее проводимое фитопатолотическое тестирование рабочей коллекции ВНИИ риса не выявило образцы риса, несущие ген Pi-b (Зеленский ГЛ , 1993)

Нами начата программа по созданию линий, несущих Pi-b ген, на генетической основе отечественного риса Донором гена использован японский сорт ВЫ Изначально линии и сорта подвида japónica с геном Pi-b получали при скрещивании элитных japónica сортов с образцами подвида indica — первичными донорами гена Молекулярные данные, полученные при изучении ДНК ряда сортов подвида japónica, несущих ген Pi-b, указывают на наименьшую долю генома indica-типл в сорте BL1 (Miyamoto M et al, 1996) Полное созревание данного copia в местных условиях происходит на 160 - 170 дни вегетации Районированные сорта селекции ВНИИ риса Янтарь и Хазар скрестили с ВЫ

Гибридные семена использовали для получения F2 популяции Визуализацию переносимой аллели устойчивости осуществляли с

17

помощью созданного ДНК-маркера. 135 растений из Р2 популяции оценили методом ПЦР на наличие вводимого гена По результатам маркерного анализа в выборке получено следующее соотношение 29 растений несут доминантную аллель в гомозиготном состоянии, 75 — в гетерозиготном, 31 растения - гомозиготы по рецессиву. Методом хи-квадрата (у2) оценили статистическую достоверность соответствия полученного в популяции расщепления теоретически ожидаемому Полученные данные соответствуют ожидаемому моногенному расщеплению 12 1, подтверждая кодоминантность маркера

Следует отметить, что созданная маркерная система включала в себя несколько возможных комбинаций праймеров, позволяющих идентифицировать аллельное состояние гена Рг-Ъ На начальных этапах исследования разработанного маркера, при изучении ДНК контрастных сортов, а также смеси их ДНК с целью имитации гетерозиготного состояния гена, наибольшую эффективность показывала комбинация Р4Я5Я6 Однако при проведении анализа Р2-популяции, в продуктах ПЦР с данной комбинацией праймеров обнаруживались неспецифические амплифицированные фрагменты Вероятно, это связано с тем, что образцы ДНК растений из Р2-популяции выделяли по упрощенной модифицированной методике На стадии отработки созданного маркера использовали для ПЦР высокоочищенную ДНК, экстрагированную СТАВ-методом В ходе работы была определена комбинация, оптимально подходящая именно для проведения маркерной селекции (РШ2РЗ) Получаемые ПЦР-продукты доминантной и рецессивной аллелей различаются более чем на 100 пар нуклеотидов, это обеспечивает их безошибочную идентификацию при электрофорезе в агарозном геле (рис 6)

Среди растений Р2, несущих доминантную аллель Р1-Ъ в гомозиготном состоянии отобрали лучшие, и их использовали в качестве отцовских форм при возвратных скрещиваниях на рекуррентные родительские формы - сорта Янтарь и Хазар

В настоящее время получены ВС2 семена Последующие беккроссы позволят создать линии риса с комплексом ценных признаков

районированного сорта и имеющие эффективный ген устойчивости к пирикуляриозу.

ВЫ Янт 12 3 4 5 6 7 8

Рнсунок 6, Результаты электрофоретическго разделения продуктов ПЦР с комбинацией праймеров РШ2КЗ

ВЫ - сорт риса, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу П-Ь: Янт - Янтарь, отечественный сорт-реципиент; !- 8 - образцы из гибридной Р2 по!туляции ВЫ хЯнтарь

3.3 Изучение образцов рабочей коллекции ВНИИ риса внутри генной маркерной системой гена Р1-Ь Поиск доноров резистентности - один из главных этапов в селекции устойчивых к пирикуляриозу форм риса. Традиционно для идентификации генетической плазмы, несущей устойчивость к пирикуляриозу, применяют фитопатологические исследования. Однако такие анализы трудоемки и для их проведения необходимы совместимые изоляты возбудителя, а присутствие одного гена устойчивости иногда могут фенотипически скрывать другие гены, определяющие резистентность к той же расе гриба. Использование ДНК-маркеров позволяет безошибочно идентифицировать аллели генов устойчивости в анализируемых растениях (Сопачуау-ВогтапБ С.А., 2003).

Проведено изучение 72 образцов из рабочей коллекции ВНИИ риса на предмет присутствия доминантной аллели гена Р)-Ь (рис.7). Аллель, определяющая устойчивость к пирикуляриозу выявлена в корейском сорте Пхеньян-3, поступившем в коллекцию в 2005 году.

ВЫ 1 2 3 4 5 6 ВЦ

Рисунок 7. Результаты анализа образцов рабочей коллекции ВНИИ риса внутригенной маркерной системой гена Р'1-Ь

ВЫ -сорт риса, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу П-Ь\

! - 6 - образцы рабочей коллекции ВНИИ риса.

Пхеньян-3 может быть использован в селекции на устойчивость к пирикуляриозу как донор гена Р[-Ь. При этом указанный соргообразец по данным лаборатории исходного материала, приведенным в отчете о НИР за 2006 год,- обладает ценными характеристиками. Период вегетации -80-522 дней, высота растений - 103 см. площадь флагоаош листа- 54 см2. Масса 1000 зерен - 22 г, трещиноватость зерновок -9%, стекловидность -84%, общий выход крупы — 68,4% и целою ядра - 99,4%.

выводы

1 Показана возможность проведения маркерной селекции с отечественными сортами риса с использованием микросателлитных маркеров, тесно сцепленных с генами Рх-1, Р1-2, Рс-ЗЗ Ят224, 11т527, 8511140, Ят72, ЯтЗЮ

2 ДНК-маркер гена Рг-Ь использован для поиска доноров данного гена Изучены 72 образца из рабочей коллекции ВНИИ риса В корейском сорте Пхеньян-3 выявлен ген устойчивости к пирикуляриозу Рг-Ь

3 Показана эффективность для селекционной практики внутригенной кодоминантной маркерной системы гена Рг-Ъ, определена оптимальная комбинация праймеров для проведения маркерной селекции

4 В рабочую коллекцию ВНИИ риса переданы образцы 04433, 04434, 04435, 04436, 04437, 04438, несущие гены Р1-1, Рг-2, Р1-ЗЗ, что подтверждено данными молекулярного анализа, и обладающие комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края

5 Получены образцы с пирамидированными генами Р/-7, Рг-2, Р1-ЗЗ в гетерозиготном состоянии

6 На основе отечественных сортов созданы беккроссные ВС2 линии, несущие ген Р1-Ь

7 В работе представленных исследований использованы образцы ДНК, выделенные по модифицированной нами методике, тем самым доказана ее эффективность для задач маркерной селекции риса

Рекомендации для селекционной практики

- Рекомендовать образцы, переданные в рабочую коллекцию ВНИИ риса в качестве доноров генов ^//(присвоены номера каталога 04433, 04434), Р12 (04435, 04436,), РгЗЗ (04437, 04438) для использования их в селекции на устойчивость к пирикуляриозу,

- Использовать образец с пирамидированными генами Р11+Р12+РгЗЗ как исходный материал для создания сорюв риса со стабильной устойчивостью к пприкуляриозу,

- Полученный в работе селекционный материал с генами устойчивости использовать для дальнейшей работы, направленной на создание образцов устойчивых к пирикуляриозу и обладающих комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края,

- Использовать маркерную систему гена Pi-b для изучения образцов, поступающих в рабочую коллекцию ВНИИ риса с целью выявления доноров данного гена;

- Рекоммендовать сорт Пхеньян 3 как донор гена Pi-b,

- Применять модифицированную методику выделения ДНК для массовых анализов в последующих селекционных программах с применением молекулярного маркирования

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Супрун ИИ, Мухина ЖМ, Ильницкая ЕТ Системы молекулярного ДНК-маркирования и .их использование в селекционно-генетических исследованиях риса // Рисоводство - 2003 - № 3 - С 25-30

2 Ильницкая ЕТ, Мухина ЖМ Селекция устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с использованием методов молекулярной биологии // Научное обеспечение агропромышленного комплекса материалы 5-и региональной науч -практ конференции молодых ученых 18-19 декабря 2003 г /КубГАУ - Краснодар, 2003 -С 315-317

3 Kharitonov Е М , Mukhina Zh М , (lnitskaya Е Т, Suprun 1 I Marker assisted selection on rice blast resistance // Proceeding of the conference « Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» 15-17 September 2004 - Turin, 2004 - P 410-411

4 Супрун И И , Мухина Ж М , Ильницкая Е Т Создание сорта риса с длительной полевой устойчивостью к пирикуляриозу // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем материалы докладов международной научно-практической конференции 29 сентября

- 1 октября 2004 г - Краснодар, 2004 - С 149-151

22

5 Ильницкая Е Т, Мухина Ж М Пирамидирование генов устойчивости к пирикуляриозу риса Рг1, Рг2, Р1ЗЗ с помощью молекулярных маркеров // Рисоводство - 2004 -№ 5 - С.32-33.

6 Ильницкая Е Т, Мухина Ж М Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с привлечением методики маркерной селекции // Эволюция научных технологий в растениеводстве Сборник научных трудов, посвященных 90-летию КНИИСХ им П П Лукьяненко -Краснодар, 2004 - Том 3 - С 284-286

7 Ильницкая Е Т Использование маркеров при пирамидировании главных генов в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу // Нетрадиционное растениеводство Эниология Экология и здоровье материалы 13-го Международного симпозиума - Симферополь, 2004 -С 433

8 Ильницкая Е Т , Волкова С А , Мухина Ж М Селекция риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением методов молекулярного (микросателлитного) маркирования // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования материалы 6-го Международного симпозиума - Москва-Пущино, 2005 - Том II -С 288-290

9 Ковалев В С , Мухина Ж М , Ильницкая Е Т , Супрун И И , Волкова С А Комплексный подход к селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу с применением молекулярных маркеров // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук - 2006 - №4 - С 10-12

10. Ильницкая ЕТ Использование ДНК-маркера гена Рг-Ъ в целях поиска доноров устойчивости к пирикуляриозу и интрогрессии гена в российскую генплазму риса // Устойчивое производство риса настоящее и перспективы материалы международной научно-практической конференции - Краснодар, 2006 - С. 328-329

11 Костылев П И , Вожжова Н Н , Ильницкая Е Т., Мухина Ж М Перенос генов устойчивочти к пирикуляриозу в сорта риса с помощью маркерного контроля // Устойчивое производство риса настоящее и перспективы материалы международной научно-практической конференции - Краснодар, 2006 - С 98-107

12 Супрун ИИ, Ильницкая ЕТ Разработка внутригенной маркерной системы для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Р1-Ь //

23

Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края сборник тезисов конференции грантодержагелей регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «Юг России» - Краснодар, 2006 - С 170-171

Подписано I! печать 26 04 2007 г. Формат 60x84 ^

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ л 1 Заказ № 255 Тнрал? 100 зкз

Отпечатано в типографии КубГАУ ЗМЮ44, г Краснодар, ул Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ильницкая, Елена Тарасовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Понятие молекулярного маркера, основные виды ДНК-маркеров

1.2 Рис (Oryza sativa L.)- ценная культура и модельный организм в молекулярной биологии

1.3 Селекция растений с использованием ДНК-маркеров

1.4 Селекция риса на устойчивость к пирикуляриозу

1.4.1 Пирикуляриоз риса; Устойчивость к заболеванию

1.4.2 Создание резистентных к пирикуляриозу сортов риса

1.4.3 Ген Pi-b - один из эффективных генов устойчивости риса к пирикуляриозу в Краснодарском крае

1.4.4 Гены широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-l, Pi-2, Pi

2.МАТЕРИ A JT И МЕТОДЫ 45 2.1 Исходный материал

2.1.1 Родительские формы в программе интрогрессии генов устойчивости

2.1.2 Образцы коллекции исходного материала ВНИИ риса, изученные маркером гена Pi-b 46 2.2. Подготовка растительного материала и экстракция ДНК

2.3 Молекулярные маркеры, использованные в работе

2.4 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации

2.5 Гибридизация растений

2.6 Оценка устойчивости к пирикуляриозу

2.7 Статистический анализ расщепления

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Интрогрессия генов широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ в отечественные сорта риса с применением методов маркерной селекции

3.2 Введение гена расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу Pi-b в генотипы районированных сортов селекции ВНИИ риса Янтарь и Хазар

3.3. Изучение образцов рабочей коллекции ВНИИ риса внутригенной маркерной системой гена Pi-b

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу"

Актуальность проблемы. Последнее время все увереннее обсуждается роль ДНК-технологий в ускорении процесса селекции, охране авторских прав селекционеров и защите продукции растениеводства от возможной фальсификации. Только анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, практически пригодные для идентификации генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков.

Процесс создания новых форм растений базируется на генетическом разнообразии и методах его использования селекционерами. Применение ДНК-технологий позволяет существенно расширить возможности традиционной селекции растений. Проявление молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифичным, и их можно обнаружить на любой стадии развития растений. Методы ДНК-генотипирования и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker assisted selection - MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно ценных генов в процессе селекции и обеспечить создание новых сортов с целым комплексом заданных свойств (Хавкин Э.Е., 2003).

Успехи в молекулярной биологии риса (Oryza sativa L.) -благоприятная среда для активного использования маркерных технологий именно для этой культуры. Секвенирование генома риса и клонирование генов позволяют создавать ДНК-маркеры, эффективные в работе практической селекции.

Одним из наиболее вредоносных заболеваний риса на всей территории возделывания, в том числе и России, является пирикуляриоз, вызываемый грибом Pyricularia oryzae Cav. Селекция устойчивых сортов

- наиболее эффективный подход борьбы с данной болезнью. В создании устойчивых к пирикуляриозу сортов риса применение ДНК-маркеров может быть полезно как для непосредственного проведения селекции с помощью маркеров, так и для поиска доноров эффективных генов резистентности.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось создание селекционного материала риса, устойчивого к пирикуляриозу, с помощью методов молекулярного маркирования.

В проводимых исследованиях были поставлены следующие задачи:

1. Выполнить программу скрещиваний, направленную на интрогрессию генов устойчивости к пирикуляриозу /7-7, Pi-2, Pi-ЗЗ и Pi-b в генотипы отечественных сортов.

2. Оценить возможность применения ДНК-маркеров, тесно сцепленных с генами Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ (Rm224, Rm527, SSR140, Rm72, Rm310) в данной работе: отработать параметры ПЦР для каждого маркера и определить полиморфизм изучаемых локусов родительских форм.

3. Получить растения с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-ЗЗ в одном генотипе.

4. Провести апробацию ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригенной маркерной системы гена Pi-b для практических задач селекции.

5. Изучить образцы рабочей коллекции ВНИИ риса ДНК-маркером гена Pi-b в целях поиска доноров эффективного гена устойчивости к пирикуляриозу.

6. Подобрать оптимальную методику выделения ДНК из растений риса для проведения массовых анализов, необходимых при маркерной селекции.

Научная новизна исследований. Впервые в практике селекции риса в России использована методика ДНК-маркирования. Получены образцы, несущие гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b и обладающие комплексом признаков, соответствующих местным агроклиматическим условиям. Изучено 72 образца рабочей коллекции ВНИИ риса маркерной системой Pi-b гена, идентифицирован 1 сорт, несущий ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-b. Оптимизирована методика выделения ДНК из растений риса для проведения маркерной селекции.

Научно-практическая ценность работы. Полученные растения риса, несущие гены Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-b могут быть использованы как доноры указанных генов в селекционных программах на устойчивость к пирикуляриозу. Созданные образцы, в отличии от линий зарубежной селекции с данными генами, имеют период вегетации, соответствующий местным агроклиматическим условиям, и генетическую основу, близкую отечественным сортам. Показана эффективность применения ранее созданной в лаборатории биотехнологии ВНИИ риса внутригенной маркерной системы гена Pi-b для практической селекции. Сорт Пхеньян-3 по данным молекулярного анализа несет ген Pi-b и рекомендован в качестве донора эффективного гена в селекции на устойчивость к пирикуляриозу. Разработанная методика выделения ДНК из растений риса позволяет в течение нескольких часов проводить экстракцию ДНК из значительного количества образцов и при этом не требует дорогостоящих реактивов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на заседаниях методического совета ВНИИ риса в 2004 - 2006 гг., а также были представлены на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 18-19 декабря 2003г.); международной конференции «Challenges and opportunities for sustainable rice-based production systems» (Turin, Italy, 15-17 September 2004г.); 13-м международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 5- 12 сентября 2004 г.); 6-м международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 13-17 июня 2005 г.); международной научно-практической конференции «Устойчивое производство риса: настоящее и перспективы» (Краснодар, 5-9 сентября 2006г.).

Публикации результатов исследований. По материалам исследований опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждение, выводов, рекомендаций селекционной практике и списка литературы. Работа изложена на 99 страницах машинописного текста, включающих 7 таблиц и 15 рисунков. Список использованной литературы включает 143 источников, в том числе 111 -иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Ильницкая, Елена Тарасовна

выводы

1. Показана возможность проведения маркерной селекции с отечественными сортами риса при использовании микросателлитных маркеров, тесно сцепленных с генами Pi-1, Pi-2, Pi-33: Rm224, Rm527, SSR140, Rm72, Rm310.

2. ДНК-маркер гена Pi-b использован для поиска доноров данного гена. Изучены 72 образца из рабочей коллекции ВНИИ риса. В корейском сорте Пхеньян-3 выявлен ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-b.

3. Показана эффективность для селекционной практики внутригенной кодоминантной маркерной системы гена Pi-b, определена оптимальная комбинация праймеров для проведения маркерной селекции.

4. В рабочую коллекцию ВНИИ риса переданы образцы 04433, 04434, 04435, 04436, 04437, 04438, несущие гены Pi-1, Pi-2, Pi-33, что подтверждено данными молекулярного анализа, и обладающие комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края.

5. Получены образцы с пирамидированными генами Pi-1, Pi-2, Pi-33 в гетерозиготном состоянии.

6. На основе отечественных сортов риса Янтарь и Хазар созданы беккроссные ВС2 линии, несущие ген Pi-b.

7. В работе представленных исследований использованы образцы ДНК, выделенные по модифицированной нами методике, тем самым доказана ее эффективность для задач маркерной селекции риса.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

- Рекомендовать образцы, переданные в рабочую коллекцию ВНИИ риса в качестве доноров генов Р/-7(присвоены номера каталога 04433, 04434), Pi-2 (04435, 04436J, Pi-33 (04437, 04438) для использования их в селекции на устойчивость к пирикуляриозу;

- Использовать образец с пирамидированными генами Pi-l+Pi-2+Pi-33 как исходный материал для создания сортов риса со стабильной устойчивостью к пирикуляриозу;

- Полученный в работе селекционный материал с генами устойчивости использовать для дальнейшей работы, направленной на создание образцов устойчивых к пирикуляриозу и обладающих комплексом признаков, соответствующих агроклиматическим условиям Краснодарского края;

- Использовать маркерную систему гена Pi-b для изучения образцов, поступающих в рабочую коллекцию ВНИИ риса с целью выявления доноров данного гена;

- Рекомендовать сорт Пхеньян-3 как донор гена Pi-b\

- Применять модифицированную методику выделения ДНК для массовых анализов в последующих селекционных программах с применением молекулярного маркирования.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Ильницкая, Елена Тарасовна, Краснодар

1. Ван дер Планк Я. Генетические и молекулярные основы патогенеза у растений.- М.: Мир, 1981.- 236 с.

2. Глазко В.И., Глазко Г.В. Введение в генетику, биоинформатика, ДНК-технология, генная терапия, ДНК-экология, протеомика, метаболика. -К.: КВ1Ц, 2003.- 640 с.

3. Дзюба В.А. Генетика риса.- Краснодар, 2004.- 283с.

4. Дорофеева Л.Л., Кодяков А.А., Кратенко В.Н. и др. Грибные болезни риса.- Ташкент: Фан, 1992.- 96 с.

5. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Общество фитопатологов, 2001.-302 с.

6. Зеленский Г.Л. Селекция сортов риса, устойчивых к пирикуляриозу, рисовой листовой нематоде и бактериальному ожогу в условиях Российской Федерации: Автореф. дис.д-ра с.-х. наук.-Краснодар.- 1993.-48 с.

7. Зеленский Г.Л. Перспективы создания сортов риса с высокой продуктивностью и адаптивными качествами // Рисоводство.- 2003.- № 3.-С.7-11.

8. Иванченко Ю.Н. Инкубационный период пирикуляриоза риса.-Труды ВНИИ защиты растений, 1971, вып.29, с. 112-117

9. Коломиец Т.М. Отбор исходного материала риса для селекции на иммунитет к пирикуляриозу: Автореф. дис.канд. биол. наук.-Голицино.- 1990.- 21 с.

10. Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // Сельскохозяйственная биология.-1998.- № 5.- С.3-25.

11. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры.- М.: Колос, 1983.-320 с.

12. Коренев Г.В., Подгорный П.И., Щербак С.Н. Растениеводство с основами селекции и семеноводства. -М.: Агропромиздат, 1990.-575 с.

13. Коротенко T.JI. Оценка исходного материала для селекции сортов риса с высоким качеством зерна: Автореф. дис.канд. с.-х. наук.-Краснодар.- 1990.- 21 с.

14. Костылев П.И., Парфенюк А.А., Степовой В.И. Северный рис (генетика, селекция, технология).- Ростов-на-Дону: ЗАО «Книга», 2004,576 с.

15. Лабораторный экспресс-метод оценки сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу / Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. -Большие Вяземы: ВНИИФ, 1990.- 12 с.

16. Лукьянчиков В.П., Подкин О.В. Распространение рас возбудителя пирикуляриоза в основных рисосеющих районах СССР // Бюлл. НТИ ВНИИ риса Краснодар, 1978.- Вып.24.- с. 64-66.

17. Лобашев М.Е. Генетика.- Ленинград: издательство ленинградского университета, 1969.- 752с.

18. Лось Г.Д. Перспективный способ гибридизации риса // Сельхозбиология.- 1987.- № 12.- С. 107-109.

19. Лось Г.Д., Третьяков А.Р. Создание исходного материала для селекции риса // Рисоводство,- 2003.- №3.- С.12-13.

20. Льюин Б. Гены.- М.: Мир, 1987.- 544 с.

21. Ляховкин А.Г. Рис. Мировое производство и генофонд.- 2-е изд., перераб. и доп. -СПб.: «профи-информ», 2005.- 288 с.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир. 1984.-480 с.

23. Методические указания по оценке устойчивости сортообразцов риса к пирикуляриозу в инфекционном питомнике / Фролова B.C., Коваленко Е.Д., Наскидашвили Ж.Г., Силичева Т.М. и др. М.: ВАСХНИЛ, 1983.- 14 с.

24. Наскидашвили Ж.Г., Сокерина Н.Н., Зеленский Г.Л. Селекция на устойчивость к пирикуляриозу риса // Защита растений.- 1987.- № 12. -С. 18-19.

25. Остерман Л.А. 1981 Методы исследования нуклеиновых кислот.-М.: Наука, 1981,- 288 с.

26. Пересыпкин В.Ф. Болезни зерновых культур.- М.: Колос, 1979.279 с.

27. Петрова А.И. Болезни риса и борьба с ними.- М., 1968.-112 с.

28. Система рисоводства Краснодарского края: Рекомендации / Под общ.ред. Е.М.Харитонова.- Краснодар: ВНИИ риса, 2005.- 340 с.

29. Супрун И.И. Разработка ко-доминантного ДНК-маркера для гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b. Устойчивое производство риса: настоящее и перспективы. Материалы международной научно-практической конференции.- Краснодар, 2006, С.81-89.

30. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохозяйственная биология.- 1997.- №5.- С.3-19.

31. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная биология,- 2003.- №3.- С.26-41.

32. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.- С. 395-427.

33. Aharon A., Vorst O. DNA microarrays for functional plant genomics // Plant Mol. Biol.- 2001.- V. 48,- P. 99-118.

34. Ahn S.N., Tenksley S.D. Comparative linkage maps of the rice and maize genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1993.- V. 90.- P. 7980-7984.

35. Ahn S.N., Kim Y.K., Hong H.C., Han S.S. et al. Molecular mapping of a new gene for resistance to rice blast (Pyricularia grisea Sacc.) // Euphytica.- 2000.- V. 116,- P. 17-22.

36. Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Nakamura A., Fujimura Т. A codominant DNA marker closely linked to the rice nuclear restorer gene, Rf-1, identified with inter-SSR fingerprinting // Genome 1996.- V. 39.- P. 12051209.

37. Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Fujimura T. Microsatellite DNA markers for rice chromosomes // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V. 93.- P. 10711077.

38. Andaea V.C., Mackill D.J. QTLs conferring cold tolerance at the booting stage of rice using recombinant inbred lines from a japonicax indica cross//Theor. Appl. Genet.- 2003.- V.106.- P. 1084-1090.

39. Atkins J.S., Robert A.L., Adair C.R., Goto K., Kozaka et al. International set of rice varieties for differentiating races of Pyricularia oryzae //Phytopathology.- 1967.- V. 57.- P. 297-301.

40. Barry G. The use of the Monsanto draft rice genome sequence in research//Plant Physiol.- 2001.- V. 125.- P. 1164-1165.

41. Berruyer В., Adreit H., Milazzo J., Gaillard S. et al. Identification and fine mapping of Pi33, the rice resistance gene corresponding to the Magnaporthe grisea avirulence gene ACE1// Theor. Appl. Genet.- 2003.-V.107.- P.l 139-1147.

42. Bonman J., Khush G., Nelson R. Breeding rice for resistance to pest // Annu. Rev. Phytopatol.- 1992.- V. 30.- P.507-528.

43. Castiglioni P., Pozzi C., Heun M., Terzi V., Muller K.J., Rohde W., Salamini F. An AFLP-Based Procedure for the Efficient Mapping of Mutations and DNA Probes in Barley // Genetics.- 1998.- V. 149.- P. 2039-2056.

44. Causse M.A., Fulton T.M., Cho Y.G., Ahn S.N., Chungwonse J., et al. Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population // Genetics.- 1994,- V.138.-P. 1251-1274.

45. Chen D.H., Zeigler R.S., Ahn S.W., Nelson R.J. Phenotypic characterization of the Rice Blast Resistance Gene Pi-2(t) // Plant Disease.-1996.- V.80.- P.52-56.

46. Chen D.H., Chen B.T., Zhang D.P., Xie Y.F., Zhang Q.F. Pathotypes of Pyricularia grisea in rice fields of central and southern China // Plant Disease.-2001.- V.85.- P. 843-850.

47. Chen M., Presting G., Barbazuk W.B. et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome // The Plant Cell.- 2002.- V. 14.- P. 537545.

48. Chen M., San Miguel P., Bennetzen J.L. Sequence organization and conservation in sh2/al-homologous regions of sorghum and rice // Genetics.-1998.- V. 148.- P. 435-443.

49. Cho Y.G., Eun M.Y., McCouch, Chae Y.A. The semidwarf gene, sd-1, of rice (Oryza sativa L.). II. Molecular mapping and marker-assisted selection //Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.89.- P. 54-59.

50. Choi H.C., Kim Y.G., Hong H.C., Hwang H.G. et al. Development of blast-resistant rice multiline cultivars and their stability to blast resistance and yield performance // Korean J. Breed.- 2006.- V. 38.- P. 83-89.

51. Conaway C., Cartinhour S., Ayres N. et al. PCR based markers linked to blast resistance genes in rice // Proceedings of the 27th rice technical working group meeting.- 1998.- P.77

52. Conaway-Bormans C.A., Marchetti M.A., Johnson C.W., McClung A.M., Park W.D. Molecular markers linked to the blast resistance gene Pi-z, in rice for use in marker-assisted selection // Theor. Appl. Genet.- 2003.- V.107.-P. 1014-1020.

53. Correa-Victoria F.J., Tharreau D., Martinez C., Vales M. et al. Gene combinations in rice for the development of durable resistance to Pyricularia grisea in Colombia. Proc. 3rd Int. Temperate Rice Conference.- Punta del Este.-2003.

54. Deng Y., Zhu X.,-Shen Y., He Z. Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t) tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety // Theor. Appl. Genet.- 2006.- V. 113.- P. 705-713.

55. Dieffenbach C.W., Lowe T.M., Deksler G.S. General Concepts for PCR Primer Design // Nucleic Acids Res.- 1995.- V.l8.- P. 999-1005.

56. Dong Y., Tsuzuki E., Kamiunten H., Terao H., Lin D. Mapping of QTL for embryo size in rice // Crop science.- 2003.- V.43.- P. 1086-1071.

57. Fjellstrom R., Concetta A., Conaway-Bormans et al. Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea pathotypes // Crop Science.- 2004.- V.44.- P.1790-1798.

58. Foote Т., Roberts M., Kurata N., Sasaki Т., Moore G. Detailed comparative mapping of cereal chromosome regions corresponding to the Phi locus in wheat // Genetics.- 1997.-V. 147.- P. 801-807

59. Girish Kumar K., Hittalmani S., Srinivasachary K. Marker assisted backcross gene introgression of major genes for blast resistance in rice // Advances in Rice Blast Research.- 2000,- P.43-53.

60. Goff S.G., Ricke D„ Lan Т.Н., Presting G., Wang R. et al. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica) // Science.- 2002.-V.296.-P. 92-100.

61. Goto K., Kosaka Т., Yamada M., Matsumoto S. et al. Joint studies on fungus strains of rice blast. 2. Special report of forecasting the occurrence of diseases and insect pests injuries.- 1964.- V. 18.-P. 1-132.

62. Goto K., Yamanaka Т., Narita Т., Ichicawa T. et al. Joint studies on fungus strains of rice blast. 1. Special report of forecasting the occurrence of diseases and insect pests injuries.- 1961.- V.18.-P. 1-86.

63. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.S. Molecular markers and their applications in wheat breeding // Plant Breed.- 1999.- V.l 18.- P. 369-390.

64. Harushima Y., Yano M., Shomura A., Sato M., Shimano Т., et al. A high-density rice genetic map with 2275 markers using a single F2 population // Genetics.- 1998,- V.148.- P. 479-494.

65. Hittalmani S., Parco A., Mew T.V., Zeigler R.S., Huang N. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice // Theor. Appl. Genet.- 2000,- V.100.- P. 1121-1128.

66. Huang N., Angeles E.R., Domingo J., Magpantay G., et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: marker-assisted selection using RFLP and PCR // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V. 95.- P. 313320.

67. Ichicawa N., Kishimoto N., Inagaki A., Nakamura A. et al. A rapid PCR-aided selection of a rice line containing the Rf-1 gene which is involved in restoration of the cytoplasmic male sterility // Mol. Breed.-1997.- V. 3.- P. 195-202.

68. Inukai Т., Nelson R.J., Zeigler R.S., Sarkarung S. et al. Allelism of blast resistance genes in near-isogenic lines of rice // Phytopathology.- 1994.-V. 84.- P. 1278-1283.

69. Jena K.K., Moon H.P., Mackill D.J. Marker assisted selection- a new paradigm in plant breeding // Korean J. Breed.- 2003.- V.35.- P. 133-140.

70. Jeung J.U., Hwang H.G., Moon H.P., Jena K.K. Fingerprinting temperate japonica and tropical indica rice genotypes by comparative analysis of DNA markers // Euphytica.- 2005.- V.146.- P.239-251.

71. Jiang J. and Wang S. Identification of a 118-kb DNA fragment containing the locus of blast resistance gene Pi-2(t) in rice // Mol. Genet. Genomics.- 2002,- V.268.- P. 249-252.

72. Jones C.J., Edwards K.J., Castaglione S. et al. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories // Mol.Breed.- 1997.-V.3.- P.381-390.

73. Jones D.A. and Jones J.D. The role of leucine -rich repeat proteins in plant defences // Adv. Botan. Res.- 1997.- V.24.- P. 89-167.

74. Khush G.S., Brar D.S., Hardy B. Rice genetics VI,- Los Banos.-2001.- 488 p.

75. Kinoshita Т., Report of Committee on Gene Symbolization, Nomenclature and Linkage Groups // Rice Genetics Newsletter- 1995.- V. 12.-P. 9-153.

76. Kosaka Т., Yamada M., Matsumoto S., Matsuyama N. et al. Joint studies on fungus strains of rice blast // Japan. J. Breed.- 1972.- V.2.- P. 2530.

77. Kiyosawa S. Gene analysis for blast resistance // Oryza.- 1981.-V. 18.- P. 196-203.

78. Kiyosawa S. Genetic and epidemiological modeling of breakdown of plant disease resistance // Annual Review of Phytopathology.- 1989.- V. 20.-P.93-117.

79. Kiyosawa S., Yamaguchi H., Yamada M. The influence of resistance gene frequencies in rice plants on virulence gene frequencies in blast fungus population in Japan //Ann. Phytopath. Sos. Jap.- 1982.-V.48.- P. 199-209.

80. Kurata N., Moore G., Nagamura Y, Foote T. et al. Conservation of genome structure between rice and weat // Biotechnology- 1994.-V. 12.- P. 276-278.

81. Kurata N., Umehara Y., Tanoue H., Sasaki T. Physical mapping of the rice genome with YAC clones // Plant Mol. Biol.- 1997.- V. 35.- P. 101-113.

82. Lang N., Subudhi P., Virmani S., Brar D. et al. Development of PCR-based markers for thermosensitive genetic male sterility gene tms3(t) in rice (Oryza sativa L.) // Hereditas.- 1999.- V. 131.- P. 121 -127.

83. Levy M., Shahjahan K.M., Valent B. Lineage structure, avirulence locus polymorphism and organization of pathotype diversity in rice blast fungus // Abstract 3rd Int. Rice Genet. Symp.- Manila, the Philippines.-1995.-poster 81.

84. Lippman Z., Tanksley S.D. Dissecting the genetic pathway to extreme fruit size in tomato using a cross between the small fruited wild species L.pimpinellifolium and L.esculentum Var. Giant Heirloomi // Genetics.-2001.- V.158.- P.413-422.

85. Liu G., Lu G., Zeng L., Wang G.L. Two broad-spectrum blast resistance genes, Pi9(t) and Pi2(t), are physically linked on rice chromosome 6 // Mol. Genet. Genomics.- 2002.- V.267.- P. 472-480.

86. Mackill D.J. Classifying japonica rice cultivars with RAPD markers // Crop Sci.- 1995.- V.35.- P. 889-894.

87. Mackill D.J., Bonman J.M., Such H.C. Genes for resistance to the Philippine isolates of rice blast pathogen // Rice Genetics Newsletter.- 1985.-V.2.- P.80-81.

88. Mackill D.J., Bonman J.M. Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice // Phytopathology 1992.- V.82.- P.746-749.

89. Mackill D.J., Zhang Z., Redona E.D. Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice // Genome.- 1996.- V.39.- P.969-977.

90. McCouch S.R., Chen X., Panaud O., Temnykh S., Xu Y., et al. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding // Plant Mol. Biol.- 1997.- V.35.- P. 89-99.

91. McCouch S.R., Kochert G., Yu Z.H., Wang Z.Y., Khush G.S., Tenksley S.D. Molecular mapping of rice chromosomes // Theor. Appl. Genet.-1988.- V.76.- P. 815-829.

92. McCouch S.R., Nelson R.G., Tohme J., Zeigler R.S. Mapping of blast resistance genes in rice // Rice blast disease.-1994.- V. 1.- P. 167-186.

93. McCouch S.R., Temnykh S., Lukashova A., Coburn J., DeClerck G., et al. Microsatellite markers in rice: abundance, diversity, and applications //

94. Rice genetic 4. Proceeding of the fourth international rice genetic symposium.-LosBanos.- 2001.- P. 117-135.

95. McCouch S.R., Yeytelman L., Xu Y., Labos K.B., Clare K., Walton M. et al. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.) // DNA Res.- 2002.-V. 9.- P. 199-207.

96. Mekwatanakarn P., Kositratana W., Phromraksa Т., Zeigler R.S. Sexually fertile Magnaporthe grisea rice pathogens in Thailand // Plant Disease.- 1999,- V.83.- P. 939-943.

97. Mew T.V., Parco A.S., Hittalmani S., Inukai T. et al. Fine-mapping of major genes for blast resistance in rice //Rice Genet. Newsl.- 1994,- V.l 1.- P. 126-128.

98. Miyamoto M., Ando I., Rybka K., Kodama O., Kavasaki S. High resolution mapping of the indica-derived genes. I. Pi-b // Mol. Plant-Microbe Interact.- 1996.- V.9.- P. 6-13.

99. Mohan M., Nair S., Bhagwat A., Krishna T.G., Yano M., Bhatia C.R., Sasaki T. Genome mapping, molecular marker and marker-assisted selection in crop plants // Molecular Breeding.- 1997,- V.3.- P. 87-103.

100. Monna L., Miyao A., Zhong H.S., Yano M. et al. Saturation mapping with subclones of YACs: DNA marker production targeting the rice blast disease resistance gene, Pi-b // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V.94.- P. 170-176.

101. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research.- 1980.- V.10.- P. 4321-4325.

102. Nakajima Т., Sonoda R., Yaegashi H. Effect of a multiline of rice cultivar, Sasanishiki, and its isogenic lines on suppressing rice blast disease // Annals of Phytopathological Society of Japan.- 1996.- V. 62.- P. 227-233.

103. Oka H.I., Lin K.I. Genetic analysis of resistance to blast disease in rice (by biometrical genetic method) // Japanese Journal of Genetics.- 1957.-V.32.- P. 20-27.

104. Openshau S.J., Jarboe S.J., Bears W.D. Marker assisted selection in backross breeding. In: Analysis of molecular marker data // Joint plant Breed. Symp. Ser., Corvallis, Oregon, USA.- 1994.- P. 41-43.

105. Ou S.H. Rice diseases Commonwealf Mycological Institute, U.K., 1985.- 380 p.

106. Qu S., Liu G., Zhou В., Bellizzi M., Zeng L. et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice // Genetics.-2006.- V.172.- P.1901-1914.

107. Ribaut J.M., Hoisington D. Marker-assisted selection: new tools and strategies // trends in plant science.- 1998.- V. 3.- P.236-239.

108. Roeder M.S., Wendehake K., Korzun V. Construction and analysis of a microsatellite-based database of European wheat varieties // Theor. Appl. Genet.- 2002.- V.106.- P. 67-73.

109. Saghai Maroof M.A., Yang G.P., Biyashev R.M. et al. Analysis of the barley and rice genomes by comparative RFLP mapping // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.92.- P. 541-551.

110. Saji S., Umehara Y., Baltazar A.A., Yamane H., Tanoue H. A physical map with yeast artificial chromosome (YAC) clones covering 63% of the 12 rice chromosomes // Genome.- 2001.- V. 44.- P. 32-37.

111. Sasaki R. Inheritance of rice blast resistance // Japan. J. Genet.-1922.- V.I.- P.81-85.

112. Sasaki T. The progress in rice genomics // Euphytica.- 2001.- V. 118.- P. 103-111.

113. Schlotterer С., Soller M. Polymorphism and locus-specific effects on polymorphism at microsatellite loci in natural Drosophila melanogaster populations// Genetics.- 1997.- V.146.- P. 309-320.

114. Science of the rice plant. Volume Three. Genetics / Edited by Matsuo Т., Futsuhara Y., Kikushi F., Yamaguchi H. -Tokyo: Food and agriculture policy research center, 1997.- 1003 p.

115. Shinoda H., Toriama K., Yunoki Т., Ezaka A., Sakurai Y. Studies on the variety resistance of rice to blast // Bull. Chugoku Agric. Exp. Stn. Ser. A.-1971.- V.20.- P.1-25.

116. Tanksley S.D. Molecular markers in plant breeding // Plant. Mol. Biol. Rep.- 1983.- V.l.-P. 3-8.

117. Temnykh S., Park W.D., Ayres N., Cartinhour S., Hauck N., Liporich L., Cho Y.G., McCouch S.R. Mapping and genome organization of microsatellite in rice (Oryza sativa L.) 11 Theor. Appl. Genet.- 2000.-V. 100.-P. 697-712.

118. Thomas M.R., Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analyzed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet.- 1993.- V.86.- P. 985-990.

119. Tsunoda Y., Jwa N.S., Akiyama K., Nakamura S., Motomura Т., et al. Cloning of the rice blast resistance gene Pi-B II Advanced in rice blast research.- 2000.-V.1.- P. 9-16.

120. Umehara Y., Inagaki A., Tanoue H., Yasukochi Y., Nagamura Y. Construction and characterization of a rice YAC library for physical mapping //Molecular Breeding.- 1995.- V.I.- P. 79-89.

121. Visscher P.M., Halely C.S., Tompson R. Marker assisted introgression in backcross breeding programs // Genetics.- 1996.- V.144.- P. 1923-1932.

122. Wang G.L., Holsten Т.Е., Song W.Y., Wang H.P. Construction of a rice bacterial artificial chromosome library and Identification of clones linked to Xa-21 disease resistance locus // Plant J.- 1995.- V.7.- P. 525-533.

123. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of plant short tandem DNA repeats // Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.88.- P. 1-6.

124. Wang Z. X., Yano M., Yamanouchi U. et al. The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes // The Plant Journal.- 1999,- V.19.- P. 55-64.

125. Witcombe J.R., Hash C.T. Resistance gene deployment strategies in cereal hybrids using marker-assisted selection: gene pyramiding, three-way hybrids, and synthetic parent populations // Euphytica.- 2000,- V.112.- P. 175186.

126. Wu J., Jiang J., Chen H., Wang S. Fine mapping of rice blast resistance gene Pi-2(t) II Acta agronomica sinica.- 2002.- V.28.- P. 243-254.

127. Wu K.S., Tanksley S.D. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice // Mol. Gen. Genet.- 1993.-V.24L- P. 225235.

128. Yamada M. Pathogenic specialization of rice blast fungus in Japan // Jap. Agr. Res. Quart.- 1985.-V. 19,- P. 178-183.

129. Yamamoto Т., Kuboki Y., Lin S.Y., Sasaki Т., Yano M. Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1, Hd-2 and Hd-3, controlling headingdate of rice, as single Mendelian factors // Theor. Appl. Genet.- 1998.- V. 97.-P. 37-44.

130. Yan J., Zhu J., He C., Benmoussa M., Wu P. Molecular marker-assisted dissection of genotype-environment interaction for plant type traits in rice (Oryza sativa L.) // Crop science.- 1999.- V. 39.- P. 538-544.

131. Yang Т., Yu Y., Nah G., Atkins M., Lee S. et al. Construction and utility of 10-kb libraries for efficient clone-gap closure for rice genome sequencing // Theor.Appl.Genet.- 2003.- V. 107.- P. 652-660.

132. Yano M., Harushima Y., Nagamura Y., Kurata N., Minobe Y., Sasaki T. Identification of quantitative trait loci controlling heading date in rice using a high-density linkage map // Theor. Appl. Genet.- 1997.- V.95.- P. 1025-1032.

133. Yao F.Y., Xu C.G., Yu S.B., Li J.X. et al. Mapping and genetic analysis of two fertility restorer loci in the wild-abortive cytoplasmic male sterility system of rice // Euphitica 1997.- V. 98.- P. 183-187.

134. Yokoo M., Kikushi F., Fujimaki H., Nagai K. Breeding of blast resistance lines (BL1 to 7) from indica-japonica crosses of rice // Japan. J. Breed.- 1978.- V.28.- P. 359-385.

135. Yoshimura S., Umehara Y., Kurata N., Nagamura Y., Sasaki Т., Minobe Y., Iwata N. Identification of a YAC clone carrying the Xa-1 allele, a bacterial blight resistance gene in rice // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V. 93.-P. 117-122.

136. Yoshimura S., Yamanouchi U., Katayose Y., Toki S. et al. Expression of Xal, a bacterial blight resistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1998.- V. 95.-P. 16631668.

137. Yoshimira S., Yoshimura A., Iwata N., McCouch S.R., Abenes M.L., Baraoidan M.R., Mew T.W. Tagging and combining bacterial blight resistance genes in rice using RAPD and RFLP markers // Mol. Breed.- 1995,- V.I.- P. 375-387.

138. Young N.D. A cautiously optimistic vision for marker-assisted breeding//Mol. Breed.- 1999.- V.5.- P. 505-510.

139. Tanksley S.D., Restriction fragment lenth polymorphism maps and the concept of graphical genotypes // Theor. Appl. Genet.- 1989.- V. 75.- P. 95-101.

140. Yu Z.H., Mackill D.J., Bonman J.M., McCouch S.R., Guiderdoni E. Molecular mapping of genes for resistance to rice blast // Theor. Appl. Genet.-1996.- V. 93.-P. 859-863.

141. Yu J., Hu S„ Wang J., Wong G.K., Li S., Deng Y. et al. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica) II Science.- 2002.-V.296.-P. 79-91.