Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур

Насонов, Андрей Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур"

На правах рукописи

□03456013

НАСОНОВ Андрей Иванович

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ СВОЙСТВ ОСНОВНЫХ РНК-КОМПОНЕНТОВ

БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ В СВЯЗИ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

№

Краснодар 2008

003456019

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Краснодарского НИИ сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко в период с 2000 по 2007 год

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Плотников Владимир Константинович

доктор биологических наук Соколов Олег Игоревич

доктор биологических наук, профессор Федулов Юрий Петрович

Кубанский государственный университет

Защита состоится 19 декабря 2008 г. в 14.00 на заседании диссертационного

совета при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещён иа сайте http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан _ _ 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Никитина В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генотип в терминах молекулярной биологии - это сложная, муль-тикомпонентная система, включающая не только хранителя генетической информации (ДНК), но и продукты её реализации на уровне РНК и белков. Эта система формируется в согласии с условиями окружающей среды, и именно поэтому один и тот же набор генов генотипа может приводить к формированию несколько отличающихся друг от друга фенотипов. Синтез белка - основной процесс, обеспечивающий реализацию генетической информации в морфологические и физиологические особенности организмов. Этот уникальный процесс, связывающий генотип с фенотипом, обусловлен трансляцией матричной РНК в полипепгидную цепь белка при помощи полирибосом. Основу рибосом составляют, как известно, рибосомные белки и рибосомная РНК. Низкомолекулярная адаптерная РНК, или тРНК - второй по представительству класс клеточных РНК после рибосомных РНК.

Методы генной инженерии за последние 20 лет позволили установить, что наиболее лабильным компонентом системы регуляции экспрессии генов является стабильность (время полужизни) мРНК, которая зависит как от гена, на котором синтезирована эта мРНК, так и от условий окружающей среды [Плотников, 2003, 2005, 2007]. Кроме того, как выясняется из всей совокупности данных по структуре рибосом и из особенностей катализируемой рибосомой реакции образования пептидных связей в процессе биосинтеза белка, каталитический центр этой реакции (пепти-дилтрансферазный центр рибосомы) определяется доменом большой рибосомной РНК, без участия рибосомных белков, т.е. имеет рибозимную природу [Спирин, 2001; 2005]. В целом эти исследования позволяют предполагать, что норма реакции организма на изменения окружающей среды на молекулярном уровне выражается в изменении количества и качества (стабильности) РНК в клетках зерновых культур.

Эти теоретические предпосылки определяют возможности применения молекулярно-биологических подходов к разработке лабораторных методов оценки биологических особенностей зерновых культур в ходе селекционного процесса, что в перспективе привело бы к существенному развитию теории селекции и предоставило методы отбора по ряду биологических признаков, отличающихся от традиционных методов меньшей трудоёмкостью и большей экономичностью, что позволило бы в конечном итоге ускорить начальные этапы селекции и сократить сроки выведения новых форм злаков.

распада мРНК in vivo и in vitro, отражающее генетические особенности и физиологическое состояние растений [Plotnikov, Bakaldina 1996, Плотников 2003], что позволило резко упростить оценку стабильности мРНК, при помощи простейшей бесклеточной системы. Эта система получила название оттр от латинского выражения "omnia mea тесит porto" ("все своё ношу с собой"), предложенного академиком A.C. Спириным для характеристики относительной самодостаточности мРНК [Spinn, 1978].

В настоящее время уже многое известно о молекулярных процессах, лежащих в основе дифференциальной стабильности мРНК эукариот, однако исследования в этом отношении рибо-сомной РНК находятся в зачаточном состоянии. Вместе с тем, несомненная роль этой РНК в регуляции экспрессии генов и её значительное количество в клетке делают рРНК наиболее реальным объектом разработок селекционно-значимых широкомасштабных методов исследования экспрессии генов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось углубление и расширение исследований природы феномена тождества дифференциального магний-зависимого распада РНК злаков in vivo и in vilro (в системе ommp) и обоснования возможности применения этой системы в качестве принципиальной основы для создания методов оценки важнейших биологических особенностей селекционного материала в селекционно-значимых масштабах. В соответствии с целями были оп ределены следующие задачи исследования:

1) сравнить закономерности распада мРНК фермента катаболизма лизина LKR-SDH в зер не обычной и opaque-2 кукурузы in vivo (в условиях блокады транскрипции актиномицином Д) in vitro (в системе ommp);

2) изучить влияние мутации регуляторного гена opaque-2 на содержание катионов магни в РНК зерна кукурузы и изучить стабильность рРНК in vivo (в условиях блокады транскрипци актиномицином Д) и in vitro (система ommp: электрофоретический спектр рРНК);

3) изучить динамику сортоспецифического содержания катионов магния в РНК в процесс созревания зерна озимой мягкой пшеницы;

4) с помощью системы ommp исследовать сортоспецифические закономерности изменени стабильности мРНК LKR-SDH в ходе созревания зерна различных сортов озимой мягкой пшени цы;

5) изучить влияние температуры выращивания и условий освещения на содержание ка тионов магния в РНК проростков пшеницы;

6) изучить сортоспецифическую вариабельность содержания катионов магния, содержани РНК и ДНК в зрелом зерне сортов озимой мягкой пшеницы, предварительно ранжированных се лекционерами по морозостойкости прямыми методами;

7) исследовать электрофоретический спектр магний-содержащей рРНК зрелого зерна ози мой мягкой пшеницы в связи с морозостойкостью сортов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- установлена сортоспецифическая вариабельность содержания катионов магния в высокополимерной РНК проростков озимой мягкой пшеницы под влиянием температуры проращивания и условий освещения;

- установлена сортоспецифическая вариабельность содержания нуклеиновых кислот (РНК; ДНК) в зрелом зерне и катионов магния в высокополимерной РНК зерна и в самом зерне озимой мягкой пшеницы, коррелирующая с морозостойкостью сортов;

- в ходе электрофоретических исследований долгоживущих РНК зрелого зерна озимой мягкой пшеницы показано, что стабильность 25S рРНК in vitro снижается по мере сортоспецифического увеличения содержания катионов магния в зерне;

- показано влияние мутации регуляторного гена opaque-2 на содержание катионов магния в РНК зерна кукурузы и стабильность in vivo и в системе ошшр рРНК и индивидуальной мРНК LKR-SDH, определяющей синтез фермента, осуществляющего в зерне превращение лизина в глутамин;

- изучена сортоспецифическая динамика изменения стабильности индивидуальной мРНК LKR-SDH в ходе созревания зерна озимой мягкой пшеницы;

- установлено, что in vivo и in vitro закономерности распада для мРНК тождественны, а для рРНК

- противоположны: стабильная in vivo рРНК, содержащая повышенное количество катионов магния, - не стабильна в системе оттр\

- предложена гипотетическая модекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы, согласно которой морозостойкость прямо пропорциональна стабильности мРНК клетки и обратно пропорциональна стабильности рРНК (in vivo) и количеству катионов магния в РНК.

Научно-практическая ценность работы. Факты, представленные в работе о вариабельности содержания катионов магния в РНК и особенностях изменения при этом стабильности мРНК и рРНК, конкретизируют представления о движущих факторах и молекулярных механизмах распада РНК в системе ommp, и в целом - о механизмах регуляции экспрессии генов в ходе созревания зерна злаков и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Полученные данные о вариабельности стабильности мРНК LKR-SDH, фермента осуществляющего превращения лизина в глутамин, которым особенно богат аминокислотный состав запасных белков (глиадинов) в зрелом зерне озимой мягкой пшеницы, позволяют рекомендовать молекулярно-биологический признак «относительная стабильность мРНК LKR-SDH зрелого зерна в системе ommp» для разработки перспективного РНК-маркёра в целях ускорения селекции по улучшению технологических качеств зерна пшеницы. Показано, что такие молекулярно-биологические параметры как количество катионов магния, содержание РНК и ДНК в зрелом зерне, а также электрофоретические особенности рРНК зрелого зерна могут быть использованы для создания метода оценки морозостойкости озимой мягкой пшеницы, отличающегося относительной простотой и способного обеспечить

оценку селекционного материала в селекционно-значимых масштабах. Существенным условием при этом является изучение зерна сравниваемых сортов одного года репродукции и полученных с одного поля (одинаковый агрофон).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Основой дифференциального распада мРНК и рРНК в системе ошшр является вариабельность содержания в РНК катионов магния.

2. Зрелое зерно озимой мягкой пшеницы является самым оптимальным объектом, позволяющим проводить разработки относительно простых молекулярно-биологических методов оценки селекционного материала озимой мягкой пшеницы по таким признакам, как морозостойкость сортов и технологические свойства зерна.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийской конференции «Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека» (Ставрополь, 2001), Международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), IV и V региональной научно-практической конференции молодых учёных «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2002, 2003), V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), конференции «Аминокислотное питание животных и проблема белковых ресурсов» (Краснодар, 2004), 9-й, 10-й, 11-й Международной Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006, 2007 гг.), I Всерос сийской научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромыш ленного комплекса" (Краснодар, 2007), VII молодёжной научной конференции «Биотехнология растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2007), VI съезде Российского обществ физиологов растений и Международной конференции «Современная физиология растений: от мо лекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Международной конференции «Научное наследи Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москв

2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Повышение эффек тивности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству» (Казань

2008), VI съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирс 2008).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 30 ра бот, в том числе 3 работы в журналах рекомендуемых ВАК для публикации.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов списка литературы. Работа изложена на 179 страницах, содержит 28 таблиц и 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на этиолированных и зеленых проростках, созревающем и зрелом зерне мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) озимых сортов селекции Краснодарского научно-исследовательского института сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко, селекции других научных учреждений России, а также ближнего и дальнего зарубежья, морозостойкость которых была ранжирована селекционерами методом прямого промораживания. В экспериментах с созревающими и зрелыми зерновками кукурузы (Zea mays L.) использовали инбредную линию Висконсин 64А (W64A+/+) и её высоколизиновый спонтанный мутант opaque-2 (W64 01/02).

Для получения созревающего зерна кукурузы (20-й день после опыления) и созревающего зерна пшеницы (молочная и восковая спелость) растения выращивали в поле, в нужный момент времени после искусственного самоопыления у кукурузы или от естественного самоопыления у пшеницы зерно снимали и фиксировали жидким азотом. Ингибитор синтеза РНК - актиномицин Д (500 мкг/початок) или ингибитор синтеза белка - циклогексимид (5 мг/початок) вводили в ножку и основание початка кукурузы, через 8 часов опытные и контрольные початки, в которые вводили равный объём бидистиллированной воды, снимали с растения и фиксировали жидким азотом. Проростки пшеницы выращивали на смоченной водой фильтровальной бумаге при 20°С. Эксперименты по блокаде транскрипции генов актиномицином Д (20 мкг/мл).) проводили на этиолированных проростках. По окончании экспериментов растения срезали и фиксировали жидким азотом. Биологически активное вещество фуролан использовали в фазе начала выхода в трубку в дозе 4 г/га.

РНК выделяли двумя методами: фенольно-детергентным по Plotnikov and Bakaldina (1996) и высаливанием (модифицированный метод). Согласно первой методике суммарную РНК выделяли экстракцией фенол/хлороформ и осаждением LiCl с мочевиной в конечной концентрации 4 М каждый. Вторая методика выделения, представляет собой модификацию, в которой отсутствует депротеинизация раствором фенол-хлороформа и этап концентрирования препарата этиловым спиртом, и использовалась, преимущественно для выделения РНК из сухого зерна пшеницы и кукурузы. Для экстракции РНК использовали буфер (200 мМ трис-HCl, рН 8,5) который содержал 50 мМ MgCl2. При выделении РНК из созревающего или зрелого зерна буфер содержал сахарозу (250 мМ) для освобождения от крахмальных гранул.

Поли(А)-содержащую мРНК отделяли от суммарной РНК методом аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе (Плотников и Бакалдина, 1997). Относительную длину терминальной поли(А)-последовательности суммарной поли(А)-содержащей мРНК определяли с помощью ступенчатой термальной элюции поли(А)+-мРНК с колонки поли(У)-сефарозы при 35°С и при 65°С (Плотников и Бакалдина, 1997). Количество РНК в каждой фракции определяли спектрофотомет-рически как описано выше. Соотношение количества РНК высоко- и низкотемпературной фрак-

ции - (A)„650C/(A)n35°C, использовали в качестве характеристики степени полиаденилирования мРНК.

Для изучения распада специфических мРНК in vitro водные растворы суммарной высокополимерной РНК (0,5 мг/мл) инкубировали 10 мин при 65°С (ommp-система). Количество РНК контрольных и опытных образцов определялили методом ОТ-ПЦР или гибридизацией по-ли(А)+мРНК с радиоактивно меченными олигодезоксирибонуклеотидными зондами непосредственно на колонке поли(У)-сефарозы (сэндвич-гибридизация).

В работе применяли ген-специфичные дезоксирибонуклеотидные зонды, комплементарные мРНК лизинкетоглутаратредуктазы-сахаропиндегидрогеназы (LKR-SDH), аспартаткиназы-гомоссриндегидрогеназы (AK-GSDH), убиквитина (Ub) и субъединица а фактора элонгации трансляции 1 (eEF-la). Зонды метили концевым включением радиоактивной метки с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и [у33Р] АТФ ("Изотоп", Россия) [Остерман, 1983; Маниатис и др., 1984]. Результаты оценивали с помощью сцинтилляционного счётчика Rack Beta Spectral ("LKB", Швеция). Молекулярную гибридизацию проводили как описано ранее (Бакалдина, Алексеенко, Плотников, 2001).

Полуколичественную ОТ-ПЦР проводили реактивами и по рекомендации фирмы "Fermentas". кДНК синтезировали с использованием в качестве затравки олиго(дТ)18 с помощью обратной транскриптазы M-MuLV согласно инструкции фирмы производителя. ПЦР проводили на кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции с использованием праймеров комплементарных мРНК (GenBank). Амплификацию проводили (АНК-16, Синтол) по следующей программе: 93°С -30 сек., 62°С - 30 сек., 72°С - 30 сек.; 22 цикла для LKR-SDH и 25 для AK-HSDH.

Электрофорез РНК проводили, как описано в Маниатис с соавт. (1984). Анализ рибосомной РНК осуществляли денситометрированием снимков электрофореграмм в компьютерной программе GelPro31.

Для отделения поли(А)-хвостов от мРНК использовали два метода: 1) классический метод -ферментативное переваривание: инкубация суммарной РНК (1.5 мг/мл) в растворе содержащем 0.03 М цитрата натрия, 0.4 М хлорида натрия, панкреатическую РНКазу (20 мкг/мг РНК) и РНКазу Ti (100 ед/мкг РНК) при 37 °С в течении 60 минут; 2) разрабатанный нами метод - щелочной гидролиз: инкубация суммарной РНК (1.5 мг/мл) в растворе содержащем 25 мМ Ка2НР04, рН= 11, при 60 °С в течение 15 минут.

Поли(А) выделяли афинной хроматографией на олиго-<1Т-целлюлозе, для изучения гипер-хромного эффекта использовали один из двух методических приемов, позволяющих разрушить стэкинг - взаимодействие оснований нуклеотидов: 1) нагревание водного раствора поли(А) до 95°С; 2) растворение поли(А) в 50% растворе этилового cnnpTa(v/v). Измерение проводили на спектрофотометре СФ 26 при 260 нм.

Нуклеотидный состав поли-А-содержащих сегментов определяли по включению радиоак-тивномеченных (Р33) трифосфатов рибонуклеотидов in vivo: 5 мБк каждого из 4 рибонуклеотидов в 20 мл дистиллированной воды давали под корни проростков в независимом эксперименте, в течение 24 часов. Поли-А-сегмент от мРНК отсекали мягким щелочным гидролизом, выделяли аффинной хроматографией на олиго-дТ-целлюлозе, высушивали и замеряли радиоактивность на сцинтилляционном счётчике радиоактивности Rack Beta. От суммы четырех независимых экспериментов рассчитывали процентное содержание каждого нуклеотида.

Гидролиз рибосомной РНК (1 мг/мл) проводили 3 минуты при 70°С 0,05М КОН (конечная концентрация) с последующей нейтрализацией 0,6 объёма холодной 1 М HCLO4. Выпавшие в осадок соли удаляли центрифугированием. Надосадочную жидкость промеряли на СФ-26 при 260 нм.

Определение количества нуклеиновых кислот осуществляли методом Шмидта и Тангаузена в модификации Флека и Монро. Навеску шрота отмывали несколько раз 0,3 М хлорной кислотой (НСЮ4), РНК гвдролизовали щёлочью (0,3 М КОН), ДНК подвергали кислотному гидролизу (0,5 НСЮ4) с последующим спектрофотомегрированием [Трудолюбова, 1977].

Содержания катионов магния (Mg++) в РНК, в золе проростков, созревающего и зрелого зерна пшеницы и кукурузы определяли согласно ГОСТу 30502-97 методом атомно-абсорбционной спектроскопии (Perkin Elmer 3110, USA) по стандартной методике в присутствии катионов стронция (0,2% S1CI2). Количество и качество клейковины в исследуемых образцах зрелого зерна озимой мягкой пшеницы определяли в соотвегсвтии с ГОСТ 13586.1-68. Содержание белка в зерне озимой пшеницы определяли в соответствии с ГОСТ 10846-91. Спирторастворимую белковую фракцию получили методом Осборна. Электрофорез глиадиновой фракции белков осуществляли в крахмальном геле с мочевиной в стеклянных трубках [Зерно. Методы анализа, 2004; Плешков, 1976].

В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ингибитора синтеза РНК - акгиномицина Д - на содержание катионов магния н степень распада ген-специфических мРНК созревающего зерна обычной и opaque-2 кукурузы

Стабильность мРНК играет существенную роль в регуляции метаболизма злаков и является наиболее лабильным звеном оперативной реакции растительного организма на изменяющиеся условия окружающей среды. Ранее в лаборатории молекулярной биологии Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко было показано, что Mg^-зависимый распад мРНК in vitro (система оттр) происходит тождественно деградации транскриптов в живой клетке (in vivo) и отражает генетические особенности и физиологическое состояние растений [Плотников, 2003, 2007].

Самым старым, но до сих пор широко применяемым методом для оценки стабильности РНК в живой клетке (in vivo) является фармакологическая блокада активности генов (синтеза РНК) с последующим наблюдением скорости распада РНК. Чаще всего для этой цели используют антибиотик актиномицин Д, способный интеркалировать в пару оснований ДНК (между гуанином и цитозином) и тем самым прекращать деятельность ферментов ДНК-зависимых РНК-полимераз.

В нашей работе тождество распада мРНК in vivo (таблица 1) и in vitro (таблица 2) было продемонстрировано на примере ген-специфической мРНК бифермента катаболизма лизина -LKR-SDH созревающего зерна обычной и opaque-2 кукурузы. Эти исследования показали, что снижение стабильности мРНК этого фермента является центральным звеном развития высоколи-зинового синдрома, так как накопление свободного лизина стимулировало синтез лизин-богатых белков (ферментов), что приводило к дисбалансу метаболизма в зерне кукурузы (Плотников, 2005)

При этом было показано, что мутация регуляторного гена opaque-2 увеличивает содержание катионов магния в РНК зерна кукурузы на 60%. Актиномициновая блокада транскрипции повышала содержание катионов магния в зерне обычной кукурузы, но не изменяла в зерне мутанта.

Таблица 1 - Влияние актиномицина Д на относительное содержание ген-специфических мРНК аспартаткиназы-гомосерин дегидрогеназы (AK-GSDH) и лизинкетоглутаратредуктазы-сахаропицдегидрогеназы (LKR-SDH) в созревающем зерне обычной и opaque-2 кукурузы (in vivo; 20 день после опыления), % от контроля

Генотип мРНК Актиномицин Д

W64A+/+ AK-GSDH 81±6,3

LKR-SDH 123±7,2

W64A Ог/Ог AK-GSDH 121±б,5

LKR-SDH 97±4,5

Таблица 2 - Влияние актиномицина Д на содержание катионов магния ( К^^) в препаратах РНК из созревающего зерна кукурузы (20-ый день после опыления) и на степень распада мРНК ЬКЮ^ОН и убиквитина (1Л>) в системе оттр

Генотип Вариант Количество Mg1*, % оставшейся мРНК в системе ommp

мкг/мг РНК LKR-SDH иъ

W64A+/+ контроль 10,30±0,2 27,64±3,0 108,0±5,0

актиномицин Д 24,4±0,3 3,30±1,0 30,0±4,0

W64AO2/O2 контроль 26,6±0,4 3,66±0,2 53,0±3,0

актиномицин Д 26,8±0,4 8,55±1,0 60,0±4,0

Сортовая специфичность динамики содержания катионов магния в рРНК и стабильности мРНК ЬЬЖ-ЯШ! в ходе созревания зерна различных сортов озимой мягкой пшеницы

Дальнейшие исследования в этом направлении на четырех сортах озимой мягкой пшеницы показали, что стабильность мРНК ЬКИ-ЗВН имеет достоверную сортовую гетерогенность на всех этапах созревания зерна, в том числе и при использовании РНК из зрелого зерна (рисунок 1).

Применение зрелого зерна значительно упрощает анализ и открывает новые перспективы исследований в направлении улучшения технологических свойств зерна озимой мягкой пшеницы. Увеличение стабильности мРНК ЬКК-БОН повышает синтез, а, следовательно, активность этого фермента, превращающего лизин в глутамин.

Рис. 1. Динамика стабильности мРНК ЬКГ^ОН в ходе Это, в свою очередь, стимулирует синтез

созревания зерна четырёх сортов озимой мягкой пшениц _

запасных белков, которые очень богаты глу-

тамином, и тем самым способствует повышению количества клейковины.

Нами это было продемонстрировано на примере влияния биологически активного вещества фуролан, которое стабилизировало мРНК ЬКИ^ШН в ходе созревания зерна (таблица 3) и усиливало синтез богатых глутамином запасных белков (глиадинов), что приводило к повышению содержания клейковины (таблица 4).

30.03.2006 06.06.2006 13.062006

Дата сбора зерна

Таблица 3 - Динамика содержания мРНК ЬКЯ-8БН в ходе созревания зерна озимой мягкой пшеницы

Сорт Фаза созревания Контроль Фуролан

Дея молочная 98±4,00 5б±3,20

восковая 5,3±1,50 16,7±2,01

Батько молочная 85±3,25 72,7±3,30

восковая 0,99±0,06 2,7±0,41

Таблица 4. - Влияние препарата фуролан на качество зерна озимой пшеницы

Сорт Содержание белка, % Содержание сырой клейковины, % Качество клейковины, е.п. ИДК

контроль фуролан контроль фуролан контроль фуролан

Краснодарская 99 9,3 11,2 12,8 18,0 80 60

Дея 11,8 13,4 16,5 20,4 80 70

Батько 11,8 14,2 19,2 24,0 75 70

Эти факты позволяют нам рекомендовать дальнейшие молекулярно -биологические исследования в направлении использования признака «стабильность мРНК ЬКК-ЭОН» зрелого зерна как РНК-маркёр технологических свойств озимой мягкой пшеницы, позволяющий оценить специфическую норму реакции растения на условия окружающей среды.

Содержание катионов магния в пшенице и её морозостойкость

Исследования молекулярно-биологических механизмов морозостойкости является актуальным направлением науки, позволяющим надеяться на разработку принципиально новых методов оценки степени морозостойкости сортов озимой мягкой пшеницы. Особенно перспективно в этом отношении изучение закономерностей изменения стабильности РНК.

Была показана принципиальная перспективность использования системы оттр для исследования природы морозостойкости и создания методов её оценки озимой мягкой пшеницы на примере полифункционального белка - субъединицы а фактора элонгации трансляции 1 (еЕЕ-1а), оперативно реагирующего на воздействие условий окружающей среды. Под влиянием закаливающей температуры (4°С) стабильность мРНК еЕР-1а возрастала у высокоморозостойкого сорта Зимородок, но снижалась у среднеморозостойкого сорта Безостая 1 независимо от метода определения количества индивидуальной мРНК (таблица 5).

Таблица 5 - Стабильность мРНК еЕЕ-1 а проростков пшеницы, определённая различными методами

Гибридизация ОТ-ПЦР ИС, %

синтез кДНК

Сорт Температура, °С Поли( А)+ мРНК на поли(У)-сефарозе ИС, % мРНК в рас- с о11|>о-с1(Т)18 с праймера-ми

творе ИС, % 1Л М1

Праймеры

Ш иь Ш № IX/ 1Л ЬЬ

Зимородок 20 90 99 62 83 89 109

(высокоморозостойкий) 4 284 134 70 202 97 95

Еезостая1 20 230 124 85 126 240 -

(среднеморозостойкий) 4 85 85 63 71 124 -

Однако обнаруженные закономерности распада мРНК в системе оттр не могут быть использованы в широких масштабах, как того требует селекционная практика, поскольку эти методы трудоёмки и дороги. Необходимо было найти более простые, но адекватные методы исследования РНК.

Теоретические и экспериментальные предпосылки создания метода оценю! биологических особенностей злаков на основе генетико-физиологической предопределённости щелочного гидролиза РНК

Известно, что факторы внешней среды определяют длину поли(А)-хвоста мРНК, нами были предприняты эксперименты по разработке относительно простого метода оценки его длины в суммарной мРНК на основании ярко выраженных физико-химических особенностей полиадени-ловой кислоты: самой высокой устойчивости к щелочному гидролизу и самой высокой величиной гиперхромного эффекта. Было показано, что возможно отсечение поли(А)-последовательности от молекулы мРНК по её З'-некодирующей области, которая сильно обогащена фрагментами поли(У)

(схема). В отличие от полиадениловой, Ма0Н полиуридиловая кислота обладает самой

слабой устойчивостью к щелочному гидролизу и самой низкой величиной гиперхромного эффекта. Как и предполагалось, кратковременный щелочной гидролиз отсекал терминальную поли(А)-последовательность от молекулы мРНК по (и)„А-последовательностям, а возможные "обрывки" полиуридиловой кислоты на сказывались на величине гиперхромного эффекта. Этот метод дал вполне удовлетворительные результаты по оценке морозоустойчивости и фотопериодизма сортов озимой мягкой пшеницы (таблица 6 и 7).

т7С5'ррр5'Хтр

поли(А)

1-5* -концевая не транслируемая область;

2 - кодирующая область;

3 - З'-концевяя гетерополимерная область

(сюда "бь&г" щёлочь в первую очередь);

4 - поли(А)-хвосг

Схема молекулярная организация мРНК эукариот

Таблица 6 - Оценка относительной длины поли(А)-хвостов мРНК проростков пшеницы, полученных ферментативным и щелочным методом, по гиперхромному эффекту (%) в опытах по влиянию освещения

Сорт/Условия Метод получения поли(А)-хвоста

ферментативный Щелочной

оптические единицы, Агбо гиперх. эффект, % оптические единицы, Л2бо гиперх. эффект, %

вода 50% спирт Вода 50% спирт

Русса

в темноте,18ч 0,010 0,016 60±5 0,041 0,038 0

На свету, 8 ч 0,020 0,040 100±8 0,061 0,066 10±2

Зимородок

в темноте, 18ч 0,025 0,055 120±8 0,041 0,053 29±5

На свету, 8 ч 0,025 0,045 80±7 0,035 0,037 0

Таблица 7 - Влияние низкой положительной температуры на длину поли(А)-хвостов мРНК, полученных щелочным гидролизом РНК проростков пшеницы (по гиперхромному эффекту, %)

Сорт

Температура, "С

Оптические единицы, А26о

Вода

50% спирт

Гиперхромный эффект, %

Зимородок (высокоморозостойкий)

0,033

0,020

0,048

0,037

45±4

85±6

Безостая 1 (среднеморозостойкий)

0,033

0,019

0,047

0,028

42±4

47±7

Таблица 8 - Зависимость эффективности щелочного гидролиза рРНК от генотипа и физиологического состояния проростков пшеницы

Сорт Условия освещения 1/ОП260

Зимородок в темноте 18 часов 2,78 1,72 1,18

на свегу 8 часов 4,17 2,08 1,54

Русса в темноте 18 часов 5,88 4,17 1,54

на свету 8 часов 12,82 - 1,79

При этом было отмечено закономерное выпадение нерастворимых осадков, скорее всего гидрата окиси магния К^(ОН)2 х (Н20)п. Это наблюдение послужило отправной точкой для изучения содержания катионов магния в РНК, проростках, созревающем и зрелом зерне злаков.

Роль катионов магния в определении стабильности РНК и морозостойкости озимой мягкой пшеницы

Корректное применение актиномицина Д для остановки транскрипции возможно только в отсутствие света из-за наличия фотодинамического эффекта, поэтому этот подход был применён для выяснения вопроса о соотношении содержания катинов магния в рРНК и её стабильности только для этиолированных проростков пшеницы.

Данные, представленные в таблице 9, показывают, что после частичного распада рРНК в четырёхсугочных этиолированных проростках пшеницы имеет относительно высокое содержание катионов магния. Следовательно, чем выше содержание катионов магния в рРНК, тем она стабильнее (большее время полужизни). Это вполне согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что, чем больше содержится магния в рРНК, тем активнее синтезируют бе-

лок (полифенилаланин) рибосомы из зародышей пшеницы в бесклеточной системе синтеза белка (от vitro) на искусственной матрице (поли-У) [Sperrazza and Spremulli, 1983].

В сравнении с РНК трёхсуточных проростков, РНК четырёхсуточных проростков у высокоморозостойкого сорта Зимородок содержала больше катионов магния, а у слабоморозостойкого сорта Русса - меньше. В сравнении с РНК трёхсуточных проростков, РНК четырёхсуточных проростков у высокоморозостойкого сорта Зимородок содержала больше катионов магния, а у слабоморозостойкого сорта Русса - меньше (таблица 9).

Таблица 9 - Влияние актиномицина Д на содержание катионов магния (Mg++) в высокополимерной РНК этиолированных проростков озимой мягкой пшеницы

Сорт Вариант Относительное содержание катионов магния в РНК,%

1 2 3

Зимородок (высокоморозостойкий) 3-х сут. проростки 100 100 100

4-х сут. проростки 260 163 200

4-х сут. проростки, актиномицин Д 280 214 200

Русса (слабоморозостойкий) 3-х сут. проростки 100 100 100

4-х сут. проростки 67 56 38

4-х сут. проростки, актиномицин Д 89 82 50

По-видимому, у первого сорта рост проростков сопровождается стабилизацией рРНК, а у второго - дестабилизацией. Следовательно, степень стабильности рибосомной РНК клетки является важным компонентом системы, определяющей морозостойкость сорта.

Было установлено, что в высокополимерной РНК из клеток злаков содержание катиона магния (М§++) существенно варьирует в зависимости от генотипа (сорта) и условий окружающей среды. Дальнейшие исследования показали, что содержание катионов магния в РНК имеет тесную взаимосвязь с общим содержанием этого катиона в золе проростков и, что наиболее важно, в золе зрелого зерна (таблица 10).

Эта взаимосвязь между содержанием катионов магния в зерне сортов озимой мягкой пшеницы и их морозостойкостью была подтверждена на более широком наборе сортов, морозостойкость которых была определена предварительно прямыми методами в отделе селекции и семеноводства пшеницы КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко (таблица 11).

Таблица 10 - Относительное содержание катионов магния (М§++) в зерне, этиолированных проростках и РНК двух сортов озимой мягкой пшеницы, различающихся морозостойкостью, % к контролю

Сорт

Зрелое зерно

зерно

высокополи мерная РНК

4-х суточные проростки

Проростки

высокополи мерная РНК

поли(А)-мРНК

Зимородок(контроль-высокоморозостойкий)

100

Безостая 1 (среднемо-розостойкий)

146±5

169±7

133±4

164±5

134±6

Таблица 11 - Содержание суммарной РНК, ДНК и катионов магния в шроте зрелых

сухих зерновок сортов озимой мягкой пшеницы, ранжированных по морозостойкости (сорта репродукции 2003 года)

Сорта, по мере снижения морозостойкости РНК; мкг/мг ДНК; мкг/мг ] ; мкг/мг золы

Альбидум114 4,25±0,15 1,47±0,105 145

Кинельская 4,08±0,39 1,28±0,036 146

Зимородок 4,11±0,24 1,07±0,070 198

Юбилейная 100 3,54±0,15 1,12±0,050 216

Победа 50 3,48±0,18 0,85±0,028 166

Крошка 3,51±0,24 0,98±0,032 180

Дея 3,42±0,15 0,89±0,039 182

Безостая 1 3,03±0,27 0,88±0,049 190

Русса 3,60±0,06 1,08±0,06б 195

Ласточка 2,82±0,27 0,74±0,056 192

Чем выше было содержание катионов магния в зерне, тем ниже морозостойкость. Это соответствие выполнялось на 80%: сорта Зимородок и Юбилейная 100, не укладывались в эту зависимость в нащих экспериментах. При этом среднеморозостойкие сорта озимой мягкой пшеницы достоверно отличаются от высокоморозостойких сортов содержанием РНК и ДНК в зрелом зерне (таблица 11).

Слабоморозостойкие сорта также как и высокоморозостойкие имели высокое содержание нуклеиновых кислот в зрелом зерне (таблица 12), но отличались от последних не только уровнем

содержания катионов магния, но и электрофоретическим спектром рибосомной РНК зрелого зерна (рисунок 2, таблица 13).

Таблица 12 - Содержание катионов магния и РНК в зрелом зерне в группах сортов

озимой мягкой пшеницы, ранжированных по морозостойкости

Группы сортов Среднее значение содержания Mg в золе, % Среднее значение содержания РНК, мг/г

Высокая морозостойкость -9 сортов 15,2±0,2 3,7±0,02

Морозостойкость средняя и выше средней -11 сортов 15,9±0,3 3,5±0,02

Морозостойкость слабая и ниже средней - 4 сорта 17,8±0,3 3,6±0,03

Суперслабая морозостойкость - 6 сортов 20,3±0,2 3,9±0,04

На рисунке 2 представлены электрофореграммы суммарного препарата РНК проростков (1 дорожка), зрелого зерна пшеницы (2 дорожка) и кукурузы линии Висконсин обычной и opaque-2 содержащие две полосы рРНК 25S и 18S

1 2 W64A+/+ W64A о2/о2

Рисунок 2 Электрофореграмма рибосомной РНК (25S и 18S) из проростков пшеницы (1 ) и зрелого зерна пшеницы (2) и кукурузы линии W64A+/+ и W64A о^о2 в агарозном геле

Соотношение этих полос снижалось по мере снижения морозостойкости, как мы видим из таблицы 13.

Таблица 13 - Соотношение морозостойкости и особенностей электрофоретического спектра рРНК (258/188)

Морозостойкость сорта Сорт Отношение 25S/18S

Московская 39 1,19

Высокая Девиз 1,16

Станичная 0,98

ПалПич 0,85

Слабая Немчиновская 24 0,83

Пегас 0,71

Очень слабая 7591 0,68

SOS 1787 0.6

Антониус 0.58

Таким образом, комплекс относительно простых методов: оценка количества катионов магния в золе зрелого зерна озимой мягкой пшеницы, оценка количества суммы нуклеиновых кислот самой простой модификацией метода Шмидта и Тангаузера (в методе используется только хлорная кислота и гидрат окиси калия) и элекгрофоретический спектр рРНК, выделенной из зрелого зерна простым солевым переосаждением, открывают хорошие перспективы для развития простейшего молекулярно-биологического метода оценки морозостойкости сортов озимой мягкой пшеницы. По нашим наблюдениям и литературным данным (Полевой, 2001), необходимым условием корректности проведения оценки морозостойкости является то, что зерно сравниваемых сортов должно быть одного года репродукции и получено с одного поля (одинаковый агрофон).

Обоснование гипотетической молекулярно-биологической формулы морозостойкости озимой мягкой пшеницы

В целом, приведённые выше результаты свидетельствуют о том, что норма реакции растительного организма на изменения условий окружающей среды на молекулярном уровне выражается в изменении количества и качества (стабильности) РНК в клетках зерновых культур. Особенно интересна и полезна в этом отношении долгоживущая РНК зрелого зерна, основная часть которой представлена некодирующей рРНК.

При проведении исследования динамики содержания катионов магния в РНК проростков озимой мягкой пшеницы было установлено, что под влиянием закаливающей температуры содержание магния в РНК снижалось, однако при этом степень полиаденилирования мРНК у высокоморозостойкого сорта Зимородок увеличивалась (таблица 14).

Таблица 14 - Сортоспецифическое влияние температуры выращивания зелёных четырёхсу-точных проростков озимой пшеницы на относительное содержание катионов магния в РНК и степень полиаденилирования мРНК

Сорт Температура выращивания, "С Степень полиаденилирования мРНК (А)п65°С/(А)п35°С Относительное содержание в РНК, %

Зимородок (высокомо- 20 1,2±0,01 100

розостойкий) 4 1,8±0,05 40

Безостая 1 (средне- 20 1,3±0,07 100

морозостойкий) 4 1,0±0,03 40

Вместе с тем бьио отмечено, что под влиянием закаливающей температуры ИС мРНК увеличивался, ИС рРНК снижался (таблица 15). Следовательно, снижение содержания катионов магния определяло стабилизацию мРНК, но дестабилизировало рРНК.

Таблица 15 - Влияние закаливающей температуры (4°С, 8 ч) на индекс стабильности мРНК и рРНК четырехсуточных зеленых проростков озимой мягкой пшеницы

Сорта Морозо- Контроль опыт ИС опыт - ИС кон-

устойчивость (20°С) (4°С) троль %

ИС поли(А) мРНК, %

Зимородок высокая 14 ±2,2 60 ± 6,3 46

Безостая 1 средняя 25 ± 1,6 44 ±5,1 19

ИС рРНК, %

Зимородок высокая 80 ± 6,2 60 ± 5,8 -20

Безостая 1 средняя 80 ± 3,9 30 ± 4,0 -50

Эти факты требуют дополнительных фундаментальных исследований, так как являются принципиально важными для понимания биологического смысла оперативной связи во взаимоотношениях стабильности мРНК и рРНК. Возможно, стабилизация мРНК вызывает ускорение обмена рРНК, что необходимо для эффективного функционирования рибосом. В пользу этого предположения свидетельствуют литературные данные о том, что в опухолевых клетках животных мРНК имеет большее время полужизни по сравнению с таковой нормальных клеток [Плотников, 1992], но рРНК опухолевых клеток содержит на 30-50 % меньше магния [Берлинских, 1983].

Также было выяснено в экспериментах по блокаде транскрипции актиномицином Д, что долгоживущие рРНК проростков пшеницы (таблица 9) и созревающего зерна кукурузы (таблица 2) имеют повышенное содержание катионов магния.

Сопоставление данных о содержание магния в долгоживущей (стабильной) РНК и содержания катионов магния в зрелом зерне сортов озимой мягкой пшеницы, различающихся по морозостойкости привело нас к гипотезе относительно молекулярного механизма морозостойкости озимой мягкой пшеницы.

Т (мРНК) МОМП=-<2-

Т^рРНК)х[М8++]рнк

Рисунок 3 - Молекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы (МОМП) (Гипотеза) т

у период полураспада (полужизни) РНК

рнк

содержание катионов магния в РНК

Согласно этой формулы, морозостойкость прямо пропорциональна стабильности мРНК клетки и обратно пропорциональна стабильности рРНК (in vivo) и количеству магния в РНК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что содержание основного структурообразующего катиона магния (Mg++) варьирует в РНК проростков, а также в РНК созревающего и зрелого зерна злаков в зависимости от генотипа (сорта), стадии развития и условий окружающей среды, что является основой тождества закономерностей магний-зависимого распада мРНК in vivo (в услови блокады транскрипции актиномицином Д) и in vitro (система ommp: вода + PHK[Mg++]).

2. In vivo и в системе ommp показано, что мутация регуляторного гена opaque-2, которая на 60% увеличивает количество катионов магния в РНК созревающего зерна кукурузы, дестабилизирует мРНК фермента лизинкетоглутаратредуктазы-сахаропиндегидрогеназы (LKR-SDH), осуществляющего превращение лизина в глугамин, что является ключевым моментом в формировании высоколизинового синдрома.

3. Показано, что в ходе созревания зерна различных сортов озимой мягкой пшеницы снижается содержание катионов магния в высокополимерной РНК, при этом снижается стабиль ность mPHKLKR-SDH.

4. Биологически активное вещество фуролан стабилизирует мРНК LKR-SDH в ходе созревания зерна озимой мягкой пшеницы, что сопряжено с увеличением доли фракции запасных белков-глиадинов, аминокислотный состав которых обогащен глутамином, и повышением технологических качеств зерна пшеницы.

5. Экспериментально показана перспективность применения кратковременного щелочного гидролиза РНК проростков для оценки биологичесих особенностей пшеницы (морозостойкость, фотопериодизм) по величине гиперхромного эффекта терминальной поли(А)-последовательности мРНК и степени гидролиза рРНК.

7. Предложена гипотетическая молекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы, согласно которой морозостойкость прямо пропорциональна стабильности мРНК клетки и обратно пропорциональна стабильности (in vivo) рРНК и количеству катионов магния в РНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Плотников, В.К. Распад мРНК в системе ommp (in vitro): диагностика и прогнозирование биологических свойств злаков / В.К. Плотников, А.И. Насонов // Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека: материалы Всероссийской конференции, Ставрополь, 2001. - С. 14-15.

Plotnikov, V.K. Molecular-kinetic markers of plant stress resistence / V.K. Plotnikov, A.I. Nasonov, D.V Smetanin // Plant under environmental stress. International Symposium, Moscow, 2001. - P. 222. Насонов, А.И. Генетико-физиологическая предопределённость щелочного гидролиза РНК из проростков пшеницы / А.И. Насонов, Д.В. Сметанин, В.К. Плотников // Сб. науч. тр. молодых учёных КНИИСХ, Краснодар, 2002. - С. 122-128.

Сметанин, Д.В. Изменение структуры мРНК в процессе её распада в системе ommp (in vitro) / Д.В Сметанин, А.И. Насонов, В.К. Плотников // Тезисы научных докладов 3-его съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002. - С. 520.

Насонов, А.И. Влияние экзогенных факторов на стабильность РНК пшеницы / А.И. Насонов, H.A. Кузембаева // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы IV региональной научно-практической конференции молодых учёных, Краснодар, 2002. - с. Насонов, А.И. Генетико-физиологические закономерности щелочного гидролиза мРНК и рРНК из проростков пшеницы / А.И. Насонов, Д.В. Сметанин, В.К. Плотников // V съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», Пенза, 15-21 сентября 2003. -с.468.

7. Суркова E.B. Влияние физиологически активного соединения фуролан на биохимические показатели зерна пшеницы / Е.В. Суркова, А.И. Насонов // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы V региональной научно-практической конференции молодых учёных, Краснодар, 2003 - С. 62-63.

8. Кузембаева, H.A. Биохимические основы действия фуролана на качество зерна озимой пшеницы / H.A. Кузембаева, Н.И. Ненько, А.И. Насонов [и др.] // Эволюция научных технологий в растениеводстве Т. 3.: сб. науч. тр. в честь 90-летия со дня образования Краснодарского НИ-ИСХ им. П.П. Лукьяненко, Краснодар, 2004. - С. 48-52.

9. Насонов, А.И. Изменение содержания катионов магния в РНК озимой мягкой пшеницы в зависимости от генотипа и условий роста / А.И. Насонов, В.К. Плотников, А.И. Ладатко // Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем: материалы VIII Международной научной экологической конференции, Белгород, 27-29 сентября 2004. - С. 144-145.

Ю.Плотников, В.К. Вариабельность содержания катионов магния (Mg++) в РНК проростков озимой мягкой пшеницы / В.К. Плотников, А.И. Насонов, А.Г. Ладатко // Аминокислотное питание животных и проблема белковых ресурсов: сб. ст. по материалам конф., Краснодар, 2005. -С. 349 - 352.

П.Насонов, А.И. Содержание катионов магния в пшенице как молекулярно-кинетический маркер эффекта взаимодействия "генотип-среда / А.И. Насонов, H.A. Кузембаева, В.К Плотников [и др.] // Биология - наука XXI века, 9-я Международная Пущинская конференция молодых ученых, 18-22 апреля 2005: сб. тезисов, Пущино, 2005. - С. 357.

12. Плотников, В.К. Особенности молекулярной физиологии озимой мягкой пшеницы сорта Безостая 1 / В.К. Плотников, А.И. Насонов, H.A. Кузембаева [и др.] // Безостая 1-50 лет триумфа: сб. материалов международной конф., поев. 50-летию создания сорта озимой мягкой пшеницы Безостой 1, Краснодар, 2005. - С. 212 - 220.

13. Насонов, А.И. Взаимоотношения стабильности матричной и рибосомной РНК в созревающем зерне озимой пшеницы под влиянием фуролана / А.И. Насонов, В.В. Гаража, Н.А Кузембаева [и др.] // Биология - наука XXI века, 10-ая международная Пущинская конференция молодых ученых 18-22 апреля 2006: сб. тезисов, Пущино. - С. 357.

14. Насонов, А.И. Сортоспецифичность действия акгиномицина Д на прорастания семян озимой мягкой пшеницы / Насонов А.И., Окон Е.А., Кузембаева H.A. [и др.] // Биология - наука XXI века, 10-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 апреля: сб. тезисов, 2006, Пущино, с. 367.

15.Плотнюсов, В.К. Молекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) / В.К. Плотников, А.И. Насонов, H.A. Кузембаева [и др.] // Материалы VI съезда Российского общества физиологов растений, Сыктывкар, 2007. - Ч. 2. - С.321-322.

16. Плотников, В.К. Влияние мутации регуляторного гена OPAQUE-2 на содержание катионов магния в РНК созревающего зерна кукурузы и длину терминальной поли-А-последовательности мРНК / В.К. Плотников, Н.М. Чумак, Д.В. Сметанин, А.И. Насонов // Материалы VI съезда Российского общества физиологов растений, Сыктывкар, 2007. - 4.1. - С. 208-210.

17. Окон, Э.А. Сортовые особенности реакции пшеницы на актиномицин Д и синтетический регулятор роста фуролан / Э.А. Окон, А.И. Насонов, Е.К. Яблонская [и др.] // Материалы VI съезда Российского общества физиологов растений, Сыктывкар, 2007. - 4.1. - С. 339 - 341.

18. Ненько, Н.И. Влияние препарата фуролан на физиолого-биохимические характеристики созревающего зерна озимой пшеницы / Н.И. Ненько, В.К. Плотников, II.A. Кузембаева, В.Н. Гаража, Е.В. Суркова, А.И. Насонов, Ю.С. Поспелова, Н.Г. Малюга // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - № 6. - С. 715-721.

Nen'ko, N.I. The effect of Furolon on the physiological and biochemical characteristics of ripening winter grain / N.I. Nen'ko, V.K. Plotnikov, N.A. Kuzembaeva., Garaga V.N., Surkova E.V., Nasonov A.I., Pospelova Yu.S., Malyuga N.G. // Applied Biochemistry and microbiology. - 2007. - V. 43. - N 6.-P. 635-640.

19. Насонов, А.И. Соотношение интенсивности роста и электрофоретического спектра рибосом-ной РНК проростков озимой мягкой пшеницы / А.И. Насонов, Е.К. Яблонская, Е.А. Окон [и др.] // Биология - наука XXI века, 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, 29 октября-2 ноября 2007: сб. тезисов, Пущино, 2007. - С. 153.

20. Иваненко, Е.Е. Закономерности изменения количества РНК и катионов магния в зерне сортов озимой мягкой пшеницы в связи с их морозостойкостью / Е.Е. Иваненко, А.И. Насонов, В.К. Плотников // Биология - наука XXI века, 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, 29 октября-2 ноября 2007: сб. тезисов, Пущино, 2007. - С. 202.

21. Плотников, В.К. Генетическое разнообразие особенностей основных компонентов белоксин-тезирующей системы клетки в связи с морозостойкостью озимой мягкой пшеницы / В.К. Плотников, А.И. Насонов, Е.Е. Иваненко [и др.] // Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства: материалы международной конференции, Москва, 2007. - С. 98-99.

22. Плотников, В.К. Стабильность РНК и морозостойкость озимой мягкой пшеницы / В.К. Плотников, А.И. Насонов, Е.Е. Иваненко [и др.] // Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства: материалы международной конференции, Москва, 2007. - С. 99-100.

23. Насонов, А.И. Качественные и количественные особенности рибосомной РНК зрелого зерна озимой мягкой пшеницы в связи с её морозостойкостью / А.И. Насонов, Е.Е. Иваненко, Д.С. Карлов [и др.] // Научное обеспечение агропромышленного комплекса (85-летию Кубанского

государственного аграрного университета посвящается): материалы I Всероссийской конференции молодых учёных, Краснодар, 2007. - С. 42 - 44.

24. Насонов, А.И. Содержание РНК и катионов магния в зрелом зерне как молекулярный маркёр морозостойкости сортов озимой мягкой пшеницы / А.И. Насонов, Е.Е. Иваненко, В.К. Плотников // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: VII молодёжная науч. конф., Москва, 2007. - С. 25-26.

25. Плотников, В.К. Взаимосвязь морозостойкости озимой мягкой пшеницы с содержанием катионов магния в РНК / В. К. Плотников, А. И. Насонов, Е.Е. Иваненко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2008. - Вып. 2 (апрель-июнь). - С. 89-92.

26. Кузембаева, Н.А. Молекулярные основы действия фуролана на белковый состав и качество зерна озимой пшеницы / Н.А. Кузембаева, А.И. Насонов, Е.К. Яблонская [и др.] // Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных, Казань, 2008. -С. 262-267.

27. Насонов, А. И. Сортовая специфичность динамики относительной стабильности мРНК лизин-кеторедуктазы-сахаропиндегитрогеназы (LKR-SDH) в созревающем зерне озимой мягкой пшеницы / А. И. Насонов, Д. В. Сметанин, Н. А. Кузембаева [и др.] // Материалы VI съезда биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. - С. 155.

28. Плотников, В. К. Закономерности in vivo и in vitro Mg^-зависимого распада рибосомной и матричной РНК озимой мягкой пшеницы / В. К. Плотников, А. И. Насонов, Н. А. Кузембаева // Материалы VI съезда биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. - С. 99.

29. Плотников, В. К. Явление молекулярной сегрегации Mg^-содержащей поли(А+)-мРНК растений в ходе аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе / В. К. Плотников, А. И. Насонов, Н. А. Кузембаева // Материалы VI съезда биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. - С. 76.

30."Насонов, А.И. Взаимосвязь содержания катионов магния (Mg++), стабильности РНК и интенсивности метаболизма в клетках эукариот / А.И. Насонов, СЛ. Полежаев, В.Г. Рядчиков [и др.] // Труды Кубанского Государственного Аграрного университета, 2008. - № 2(11). - С. 104-110.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота. Поли(А)мРНК - полиаденилированная матричная РНК

Поли(А)+ мРНК - поли(А)мРНК, полученная аффинной хроматографией на поли(У)-сефарозе. Поли(А)++мРНК - поли(А) мРНК, полученная при повторной очистке поли(А)+мРНК аффинной хроматографией на поли(У)-Сефарозе. дНТФ - дезоксирибонуклеотидтрифосфат. ИС - индекс стабильности мРНК.

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция. ЦГС - циклогексимид.

AK-GSDH - аспартаткиназа-гомосериндегидрогеназа.

eEF-la - субъединица a фактора элонгации трансляции 1.

LKR-SDH- бифермент лизинкетоглутаратредуктаза-сахаропиндегидрогеназа.

SSPE - стандартный солевой фосфатный буфер.

Ub - убиквитин

70S - рибосома бактерий и синезелёных водорослей (прокариот), а также органелл эукариот: хло-ропластов и митохондрий

50S - большая субчастица прокариотической рибосомы (70S) 30S - малая субчастица прокариотической рибосомы (70S) 23S - большая рРНК прокариот 16S - малая рРНК прокариот

5 S - низкомолекулярная рРНК прокариот, вместе с большой рРНК (23 S) входит в состав большой

субчастицы (70S)

80S - рибосома эукариот

60S - большая субчастица эукариотической рибосомы (80S) 40S - малая субчастица эукариотической рибосомы (80S) 28S - большая рРНК эукариот, кроме растений 18S - малая рРНК эукариот

5,8S - низкомолекулярная рРНК эукариот, вместе с большой рРНК (28S) входит в состав большой

субчастицы (80S)

25S - большая рРНК растений

На правах рукописи НАСОНОВ Андрей Иванович

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ СВОЙСТВ ОСНОВНЫХ РНК-КОМПОНЕНТОВ

БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ В СВЯЗИ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

Автореферат

Подписано к печати__2008 г. Формат 60X84/16.

Усл. печ. л. 1 Тираж 100. Заказ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Насонов, Андрей Иванович

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Концепция «Мир «РБК».

1.1.1 Рибозимы.

1.1.2 Роль распада мРНК в явлении «молчание генов» у трансгенных растений.

1.1.3 Явление РНК-интерференции.

1.1.4 Долгоживущая мРНК зрелых семян.

1.2 Дифференциальная стабильность РНК.

1.2.1 Стабильность мРНК. Факторы, определяющие селективную деградацию мРНК.

1.2.1.1 Цис-факторы стабильности РНК. Структура мРНК и её роль в стабильности молекулы.

1.2.1.2 Транс-факторы, участвующие в регуляции распада РНК.

1.2.2 Стабильность рибосомной РНК.

1.2.2 Актуальность электрофоретических исследований. рибосомной РНК.

1.2.3 Роль катионов магния в стабильности РБК и метаболизме эукариот

1.2.4 Распад магнийсодержащей РНК в высокоочищенных препаратах {in vitro).

1.2.5 Дифференциальный распад специфических мРНК in vivo и в системе оттр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур"

Актуальность проблемы. Генотип в терминах молекулярной биологии - это сложная, мультикомпонентная система, включающая не только хранителя генетической информации (ДНК), но и продукты её реализации на уровне РНК и белков. Эта система формируется в согласии с условиями окружающей среды, и именно поэтому один и тот же набор генов генотипа может приводить к формированию несколько отличающихся друг от друга фенотипов. Синтез белка - основной процесс, обеспечивающий реализацию генетической информации в морфологические и физиологические особенности организмов. Этот уникальный процесс, связывающий генотип с фенотипом, обусловлен трансляцией матричной РНК в полипептидную цепь белка при помощи полирибосом. Основу рибосом составляют, как известно, рибосом-ные белки и рибосомная РНК. Низкомолекулярная адаптерная РНК, или тРНК - второй по содержанию класс клеточных РНК после рибосомных РНК.

Методы генной инженерии за последние 20 лет позволили установить, что наиболее лабильным компонентом системы регуляции экспрессии генов является стабильность (время полужизни) мРНК, которая зависит как от гена, на котором синтезирована эта мРНК, так и от условий окружающей среды [Плотников, 2003, 2005, 2007]. Кроме того, как выясняется из всей совокупности данных по структуре рибосом и из особенностей катализируемой рибосомой реакции образования пептидных связей в процессе биосинтеза белка, каталитический центр этой реакции (пептидилтрансферазный центр рибосомы) определяется доменом большой рибосомной РНК, без участия рибосомных белков, т.е. имеет рибозимную природу [Спирин, 2001; 2005]. В целом эти исследования позволяют предполагать, что норма реакции организма на изменения окружающей среды на молекулярном уровне выражается в изменении количества и качества (стабильности) РНК в клетках зерновых культур.

Изучение изменения стабильности РНК в зависимости от внешних и внутренних сигналов значительно сдерживалось отсутствием простого и эффективного метода её оценки. В лаборатории молекулярной биологии КНИ-ИСХ им. П.П. Лукьяненко более 20 лет проводятся исследования посттранскрипционной регуляции синтеза белка у злаковых растений на уровне стабильности РНК. В начале 90-ых годов XX века в ходе работ по выделению полиаденилированной мРНК из различных тканей зерновых культур было обнаружено явление тождества дифференциального распада мРНК in vivo и in vitro, отражающее генетические особенности и физиологическое состояние растений [Plotnikov, Bakaldina 1996, Плотников 2003], что позволило резко упростить оценку стабильности мРНК, при помощи простейшей бесклеточной системы. Эта система получила название оттр от латинского выражения "omnia теа тесит porto" ("все своё ношу с собой"), предложенного академиком А.С. Спириным для характеристики относительной самодостаточности мРНК [Spirin, 1978].

В это же время в мировой молекулярной биологии происходят значительные события, связанные с изучением регуляции экспрессии генов на уровне стабильности мРНК: в 1990 году было открыто явление «молчание генов» в трансгенных растениях, что определяется усиленным распадом мРНК перенесённого гена; а в 1998 году было открыто явление РНК-интерференции, осуществляющей регуляцию потока генетической информации путем усиления дифференциального распада ген-специфических мРНК

Рибонуклеиновый год, 2006]. Последнее открытие было увенчано Нобелевской премией по физиологии и медицине за 2006 год. Эту премию получили американские исследователи Эндрю Файр и Крейг Меллоу.

В настоящее время уже многое известно о молекулярных процессах, лежащих в основе дифференциальной стабильности мРНК эукариот, однако исследования в этом отношении рибосомной РНК находятся в зачаточном состоянии. Вместе с тем, несомненная роль этой РНК в регуляции экспрессии генов и её значительное количество в клетке делают рРНК наиболее реальным объектом разработок селекционно-значимых методов исследования экспрессии генов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось углубление и расширение исследований природы феномена тождества дифференциального магний-зависимого распада мРНК злаков in vivo и in vitro (в системе оттр) и обоснование возможностей применения этой системы в качестве принципиальной основы для создания методов оценки важнейших биологических особенностей селекционного материала в селекционно-значимых масштабах. В соответствии с целями были определены следующие задачи исследования:

1) сравнить закономерности распада мРНК фермента катаболизма лизина LKR-SDH в зерне обычной и opaque-2 кукурузы in vivo (в условиях блокады транскрипции актиномицином Д) и in vitro (в системе оттр)\

2) изучить влияние мутации регуляторного гена opaque-2 на содержание катионов магния в РНК зерна кукурузы и изучить стабильность рРНК in vivo (в условиях блокады транскрипции актиномицином Д) и in vitro (система ommp: электрофоретический спектр рРНК);

3) изучить динамику сортоспецифического содержания катионов магния в РНК в процессе созревания зерна озимой мягкой пшеницы;

4) с помощью системы оттр исследовать сортоспецифические закономерности изменения стабильности мРНК LKR-SDH в ходе созревания зерна различных сортов озимой мягкой пшеницы;

5) изучить влияние температуры выращивания и условий освещения на содержание катионов магния в РНК проростков пшеницы;

6) изучить сортоспецифическую вариабельность содержания катионов магния, содержания РНК и ДНК в зрелом зерне сортов озимой мягкой пшеницы, предварительно ранжированных селекционерами по морозостойкости прямыми методами;

7) исследовать электрофоретический спектр магнийсодержащей рРНК зрелого зерна озимой мягкой пшеницы в связи с морозостойкостью сортов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- в ходе электрофоретических исследований долгоживущих РНК зрелого зерна озимой мягкой пшеницы показано, что стабильность 25 S рРНК снижается по мере сортоспецифического увеличения содержания катионов магния в зерне;

- показано влияние мутации регуляторного гена opaque-2 на содержание катионов магния в РНК зерна кукурузы и стабильность in vivo и в системе оттр рРНК и индивидуальной мРНК LKR-SDH, определяющей синтез фермента, осуществляющего в зерне превращение лизина в глутамин;

- установлено, что in vivo и in vitro закономерности распада для мРНК тождественны, а для рРНК — противоположны: стабильная in vivo рРНК, содержащая повышенное количество катионов магния, - не стабильна в системе оттр;

- предложена гипотетическая молекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы, согласно которой морозостойкость прямо пропорциональна стабильности мРНК клетки и обратно пропорциональна стабильности рРНК (in vivo) и количеству катионов магния в РНК.

Научно-практическая ценность работы. Факты, представленные в работе о вариабельности содержания катионов магния в РНК и особенностях изменения при этом стабильности мРНК и рРНК, конкретизируют представления о движущих факторах и молекулярных механизмах распада РНК в системе ommp, и в целом — о механизмах регуляции экспрессии генов в ходе созревания зерна злаков и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Полученные данные о вариабельности стабильности мРНК LKR-SDH, фермента осуществляющего превращения лизина в глутамин, которым особенно богат аминокислотный состав запасных белков (глиадинов) в зрелом зерне озимой мягкой пшеницы, позволяют рекомендовать молекулярно-биологический признак «относительная стабильность мРНК LKR-SDH зрелого зерна в системе оттр» для разработки перспективного РНК-маркёра в целях ускорения селекции по улучшению технологических качеств зерна пшеницы. Показано, что такие молекулярно-биологические параметры как количество катионов магния, содержание РНК и ДНК в зрелом зерне, а также электрофоретические особенности рРНК зрелого зерна могут быть использованы для создания метода оценки морозостойкости озимой мягкой пшеницы, отличающегося относительной простотой и способного обеспечить оценку селекционного материала в селекционно-значимых масштабах. Существенным условием при этом является изучение зерна сравниваемых сортов одного года репродукции и полученных с одного поля (одинаковый агрофон).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Основой дифференциального распада мРНК и рРНК в системе оттр является вариабельность содержания в РНК катионов магния.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийской конференции «Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека» (Ставрополь, 2001), Международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), IV и V региональной научно-практической конференции молодых учёных «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2002, 2003), V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), конференции «Аминокислотное питание животных и проблема белковых ресурсов» (Краснодар, 2004), 9-й, 10-й, 11-й Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006, 2007 гг.), I Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (Краснодар, 2007), VII молодёжной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2007), VI съезде Российского общества физиологов растений и Международной конференции «Современная физиология растений: от i молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова — фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), Всероссийской научнопрактической конференции молодых учёных «Повышение эффективности 1 растениеводства и животноводства — путь к рентабельному производству»

Казань, 2008), VI съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 30 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 179 страницах, содержит 28 таблиц и 13 рисунков. Список литературных источников включает 316 наименований, в том числе 226 - зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Насонов, Андрей Иванович

148 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что содержание основного структурообразующего катиона магния (Mg**) варьирует в РНК проростков, а также в РНК созревающего и зрелого зерна злаков в зависимости от генотипа (сорта), стадии развития и условий окружающей среды, что является основой тождества закономерностей магний-зависимого распада мРНК in vivo (в условиях блокады транскрипции актиномицином Д) и in vitro (система ommp: вода + PHK[Mg++]).

2. In vivo и в системе ommp показано, что мутация регуляторного гена opaque-2, которая на 60% увеличивает количество катионов магния в РНК созревающего зерна кукурузы, дестабилизирует мРНК фермента лизинкетоглутаратредуктазы-сахаропиндегидрогеназы (LKR-SDH), осуществляющего превращение лизина в глутамин, что является ключевым моментом в формировании высоколизинового синдрома.

5. Экспериментально показана перспективность применения кратковременного щелочного гидролиза РНК проростков для оценки биологиче-сих особенностей пшеницы (морозостойкость, фотопериодизм) по величине гиперхромного эффекта терминальной поли(А)-последователь-ности мРНК и степени гидролиза рРНК.

6. Обнаружено, что имеется сортоспецифическая вариабельность в содержании РНК, ДНК и катионов магния в зрелом зерне озимой мягкой пшеницы и в электрофоретическом спектре его рРНК, коррелирующая с морозостойкостью сортов пшеницы. 7. Предложена гипотетическая молекулярно-биологическая формула морозостойкости озимой мягкой пшеницы, согласно которой морозостойкость прямо пропорциональна стабильности мРНК клетки и обратно пропорциональна стабильности (in vivo) рРНК и количеству катионов магния в РНК.

150

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дифференциальная стабильность мРНК играет существенную роль в регуляции метаболизма злаков и является наиболее лабильным звеном оперативной реакции растительного организма на изменяющиеся условия окружающей среды (стрессоустойчивость, фотоморфогенез, влияние биологически активных веществ и др.). Ранее в лаборатории молекулярной биологии Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко было показано, что Mg*4"-зависимый распад мРНК in vitro (система оттр) происходит тождественно деградации транскриптов в живой клетке (in vivo) и отражает генетические особенности и физиологическое состояние растений (Плотников, 2003, 2007).

В нашей работе тождество распада мРНК in vivo и in vitro было продемонстрировано на примере ген-специфической мРНК бифермента катаболизма лизина - LKR-SDH (лизинкеторедуктазы-сахаропиндегидрогеназы) и ген-специфической мРНК убиквитина созревающего зерна обычной и opaque-2 кукурузы. Эти исследования показали, что снижение стабильности мРНК этого фермента является центральным звеном развития высоколизино-вого синдрома в зерне кукурузы.

Дальнейшие исследования в этом направлении на четырех сортах озимой мягкой пшеницы показали, что стабильность мРНК LKR-SDH имеет достоверную сортовую гетерогенность, в том числе и при использовании РНК из зрелого зерна. Применение зрелого зерна значительно упрощает анализ и открывает новые перспективы исследований в направлении улучшения технологических свойств зерна озимой мягкой пшеницы. Увеличение стабильности мРНК LKR-SDH повышает синтез, а, следовательно, активность этого фермента, превращающего лизин в глутамин. Это, в свою очередь, стимулирует синтез запасных белков, которые очень богаты глутамином, и тем самым способствует повышению количества клейковины.

Нами это было продемонстрировано на примере влияния биологически активного вещества фуролан, которое стабилизирует мРНК LKR-SDH в ходе созревания зерна, усиливает синтез богатых глутамином запасных белков (глиадинов) и приводит к повышению содержания клейковины.

Эти факты позволяют нам рекомендовать дальнейшие молекулярно — биологические исследования в направлении использования признака «стабильность мРНК LKR-SDH» зрелого зерна как РНК-маркёр технологических свойств озимой мягкой пшеницы. В методическом плане этому способствуют нанобиотехнологические разработки на основе коллоидного золота, которые могут значительно упростить анализ количества ген-специфической мРНК методом ОТ-ПЦР [Богатырёв и др., 2002, 2005].

Использование системы ommp может служить основой для создания эффективных молекулярно-кинетических РНК-маркёров стрессоустойчиво-сти и фотопериодизма злаков, позволяющих на молекулярном уровне в лабораторных условиях оценивать амплитуду молекулярно-физиологических реакций растительного организма (норму реакции). Это направление исследований по сути ориентировано на создание лабораторных молекулярно-биологических методов районирования сортов культурных злаков.

Описанные теоретические предпосылки определяют возможности применения молекулярно-биологических подходов к разработке лабораторных методов оценки биологических особенностей зерновых культур в ходе селекционного процесса, что в перспективе привело бы к существенному развитию теории селекции и предоставило методы отбора по ряду биологических признаков, отличающихся от традиционных методов меньшей трудоёмкостью и большей экономичностью, что позволило бы в конечном итоге ускорить начальные этапы селекции и сократить сроки выведения новых форм злаков.

Однако обнаруженные закономерноти распада мРНК в системе ommp не могут быть использованы в широких масштабах, как того требует селекционная практика, поскольку эти методы трудоёмки и дороги. Необходимо было найти более простые, но адекватные методы исследования РНК.

Поскольку было известно, что факторы внешней среды определяют длину терминальной поли(А)-последовательности мРНК, нами были предприняты эксперименты по разработке относительно простого метода оценки длины поли(А)-хвоста суммарной полиаденилированной мРНК на основании ярко выраженных физико-химических особенностей полиадениловой кислоты: её самой высокой устойчивости к щелочному гидролизу и самой высокой величиной гиперхромного эффекта. Было показано, что отсечение поли(А)-последовательности от молекулы мРНК возможно, так как поли(А)-хвосту в молекуле мРНК предшествует З'-некодирующая область мРНК, сильно обо-гащённая фрагментами (U)nA. В отличие от полиадениловой кислоты, полиуридиловая кислота обладает самой слабой устойчивостью к щелочному гид ролизу и самой низкой величиной гиперхромного эффекта. Как и предполагалось, кратковременный щелочной гидролиз отсекал терминальную по-ли(А)-последовательность от молекулы мРНК по (Ц)пА-последователь-ностям, а возможные "обрывки" полиуридиловой кислоты на сказывались на величине гиперхромного эффекта. Этот метод дал вполне удовлетворительные результаты по оценке морозоустойчивости и фотопериодизма сортов озимой мягкой пшеницы.

В ходе этих экспериментов было отмечено, что кратковременный гидролиз рибосомной РНК также давал вполне адекватные результаты, как по морозоустойчивости, так и по фотопериодизму сортов озимой мягкой пшеницы. При этом было отмечено закономерное выпадение нерастворимых осадков, скорее всего гидрата окиси магния (Mg(OH)2 х (Н20)п). Это наблюдение послужило отправной точкой для изучения содержания катионов магния в РНК, проростках, созревающем и зрелом зерне злаков.

Было установлено, что в высокополимерной РНК из клеток злаков содержание основного структурообразующего катиона магния (Mg**) существенно варьирует в зависимости от генотипа (сорта) и условий окружающей среды. Дальнейшие исследования убедили нас в том, что содержание катионов магния в РНК довольно хорошо коррелирует с общим содержанием этого катиона в золе проростков и, что наиболее важно, в золе зрелого зерна. Была показана тесная корреляция между морозостойкостью сорта озимой мягкой пшеницы и её морозостойкостью, которая была определена предварительно прямыми методами в отделе селекции и семеноводства пшеницы КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко. Чем выше было содержание катионов магния в зерне, тем ниже морозостойкость.

Дальнейшие исследования показали, что среднеморозостойкие сорта озимой мягкой пшеницы достоверно отличаются от высокоморозостойких сортов содержанием РНК и ДНК в зрелом зерне. Слабоморозостойкие сорта таюке как и высокоморозостойкие имели высокое содержание нуклеиновых кислот в зрелом зерне, но отличались от последних не только уровнем содержания катионов магния, но и электрофоретическим спектром рибосомной РНК зрелого зерна.

Таким образом, комплекс относительно простых методов: оценка количества катионов магния в золе зрелого зерна озимой мягкой пшеницы, оценка количества суммы нуклеиновых кислот самой простой модификацией метода Шмидта и Тангаузера (в методе используется только хлорная кислота и гидрат окиси калия) и электрофоретический спектр рРНК, выделенной из зрелого зерна простым солевым переосаждением, открывают хорошие перспективы для развития простейшего молекулярно-биологического метода оценки морозостойкости сортов озимой мягкой пшеницы по вышеупомянутому ряду параметров зрелого зерна, при том условии, что зерно сравнивыемых сортов - одного года репродукции и получено с одного поля (одинаковый агрофон).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что норма реакции растительного организма на изменения условий окружающей среды на молекулярном уровне выражается в изменении количества и качества (стабильности) РНК в клетках зерновых культур. Особенно интересна и полезна в этом отношении долгоживущая РНК зрелого зерна, основная часть которой представлена некодирующей рРНК.

К настоящему времени усилиями мировой молекулярной биологии стало ясно, что множество транскрибируемых последовательностей в течение ряда лет оставалось незамеченным. Обнаружение в последнее десятилетие десятков тысяч новых некодирующих РНК (нкРНК) изменило существующие представления о роли, которую играют РНК в клетке. Оказалось, что нкРНК выполняют множество функций с использованием не известных ранее механизмов: нкРНК участвуют в регуляции транскрипции генов, сплайсинге и регуляции деградации РНК. Они вовлечены в трансляцию и её регуляцию, в процессинг и модификацию рибосомных РНК, в защиту от вирусных инфекций и мутагенной активности мобильных генетических элементов, а также в ряд других процессов. РНК потеснили белки на их пьедестале главных молекул, обеспечивающих жизнедеятельность клеток (Макаров и Крамаров, 2008).

Становится всё более очевидной роль РНК в регуляции основного биологического феномена - взаимодействия "генотип-среда". Обнаружение длинных полиаденилированных нкРНК (Макаров и Крамаров, 2008) теоретически объясняет молекулярный механизм тождественности магний-зависимого распада РНК in vivo и in vitro, отражающего как генетические особенности организма, так и его физиологическое состояние, что позволяет в относительно простых экспериментах оценивать норму реакции растительного организма на молекулярном уровне. Фундаментальные исследования в этом направлении позволят эффективно использовать познание молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов растений в разработке новых методов оценки биологических свойств селекционного материала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Насонов, Андрей Иванович, Краснодар

1. Бердинских, Н.К. Белоксинтезирующий аппарат клеток при опухолевом росте / Н.К. Бердинских. Киев: Наукова думка, 1983. - 176 с.

2. ГОСТ 30502-97. Корма, комбикорма, комбикормовое сырьё (атомно-адсорбционный метод определения содержания магния. — Введ. 1999-01 — 01. Минск: ИПК: Изд-во стандартов, 1998. — 6 с.

3. Гродзинский, Д.М. Системы надёжности растительных организмов / Д.М. Гродзинский. Киев: Наукова думка, 1977. - 367 с.

4. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон и др. М.: Мир, 1991. - 543с.

5. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (С основами статистической обработки результатов исследований) / Б.А. Доспехов. — М.: Колос, 1979. -416 с.

6. Дэвидсон, Э. Дествие генов в раннем развитии / Э. Дэвидсон; перевод с англ. А.И. Борисова, Б.Н. Евгеньева. М.: Мир, 1972. - 342 с.

7. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот / В. Зенгер. М.: Мир, 1987. - 584 С.

8. Зерно. Методы анализа.- М.: ИПК Издательство стандартов, 2004. 132с.

9. Ивлев, A.M. Биогеохимия / A.M. Ивлев М.: Высшая школа, 1986. -127с.

10. Кантор, Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммел. — М.: Мир, 1984. Т. 1. 336с., Т. 3.- 536с.

11. Кефели, В.И. Физиологические основы конструирования габитуса растений / В.И. Кефели. М.: Наука, 1994. - 269с. '

12. Коничев, А.С. Молекулярная биология: учеб. для студ. пед. вузов / А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. -400 с.

13. Кочетков, Н.К. Органическая химия нуклеиновых кислот / Н.К. Кочетков и др. М.: Химия, 1970. - 716 с.

14. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 480с.

15. Минеев, В.Г. Агрохимия / В.Г. Минеев. М.: МГУ, 1990. - 486с.

16. Мушкабаров, Н.Н. Молекулярная биология: учеб. для студ. мед. вузов / Н.Н. Мушкабаров, C.JI. Кузнецов. М.ЮОО «Медицинское информационное агенство», 2003. - 544с.: ил.

17. Ненько, Н.И. Действие на растения регуляторов роста, синтезированных на основе фурфурола / Ненько Наталья Ивановна: автореф. дис. на сосиск. степени докт. биол. наук. Краснодар, Кубанский агроуниверситет, 1999. -52с.

18. Осборн, Т. Б. Растительные белки / Т. Б. Осборн. M.-JL, 1935. - 220с.

19. Остерман, JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопным методами / Л.А. Остерман. -М.: Наука, 1983. 304с.

20. Остерман, Л.А. Хроматография нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. — М.: Наука, 1985.-536с.

21. Патрушев, Л.И. Экспрессия генов / Л.И. Патрушев. М.; Наука, 2000. -527 с.

22. Питерман, М. Физические и химические свойства рибосом / М. Питер-ман. М.: Мир. 1967. - 304 с.

23. Полевой, В.В. Физиология растений / В.В. Полевой. М.: Высшая школа, 1989. - 464с.

24. Спирин, А.С. Рибосома / А.С. Спирин, Л.П. Гаврилова. М.: Наука. 1971.-254 с.

25. Спирин, А.С. Молекулярная биология: структура рибосом и биосинтез белка / А.С. Спирин. М.: Высшая школа, 1986. - 303.

26. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе / И.А. Тарчевский. -Казань: Фэн, 2001. 447с.

27. Фадеева, В.И. Основы аналитической химии / И.В. Фадеева и др.; под ред. Ю.А. Золотов -М.: Высш. шк., 2001. 463 с.

28. Федулов, Ю.П. Системный анализ морозоустойчивости озимых культур / Федулов Юрий Петрович : автореф. дис. на соиск. степени док. биол. наук. Санкт-Петербург, 1994. - С.45.

29. Шахов, А.А. Фотоэнергетика растений и урожай / А.А. Шахов. — М.: Наука, 1993.-411с.

30. Шевелуха, B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе / B.C. Шеве-луха. -М.: Колос, 1992. 594с.

31. Шеуджен, А.Х. Магниевое питание риса и эффективность применения магниевых удобрений / А.Х. Шеуджен, В.В. Прокопенко. Краснодар. 1999.-С. 98

32. Шеуджен, А.Х. Биогеохимия / А.Х. Шеуджен. Майкоп: ГУРИПП "Адыгея", 2003. - 1028 с.

33. Алёшин, Е.П. Содержание и вынос элементов минерального питания рисом / Е.П. Алёшин, М.М. Щукин, А.Х. Шеуджен // Агрохимия. 1986. -№9. - С. 82-87.

34. Аравин, А.А. Роль двухцепочечной РНК в подавлении экспрессии генов эукариот / А.А. Аравин и др. // Молекулярная биология. 2002. - Т. 36. -С. 240- 251.

35. Арион, В.Я. Обнаружение «скрытых» рибонуклеаз в высокоочищенных препаратах РНК / В.Я. Арион и др. // Молекулярная биология. 1982. -Т.16.-№1.-С.201-209.

36. Бакалдина, Н.Б. Холодоиндуцированные изменения стабильности мРНК субъединицы альфа фактора элонгации трансляции 1 у проростков пшеницы и ячменя / Н.Б. Бакалдина, Ж.В. Алексеенко, В.К. Плотников // Физиология растений. 2001. — Т. 48, № 6. — 1-7.

37. Баршевская, Т.Н. Неспецифическая деградация РНК в присутствии ионов магния / Т.Н. Баршевская, JI.E. Горюнова, Р.Ш. Бибилашвили // Молекулярная биология. 1987. - Т. 21. - № 5. - С. 1235-1241.

38. Батыгин, Н.Ф. К вопросу о теории зимостойкости и построении модели сорта / Н.Ф. Батыгин // Повышение зимостойкости озимых зерновых: под. ред. B.C. Шевелуха. М.: Колос, 1993. - С. 14-22.

39. Бекман, Э.М. Автолитическая деградация РНК: влияние различных факторов на динамику процессов / Э.М. Бекман и др. // Молекулярная биология. 1986. - Т. 20. - № 2. - С. 527 - 538.

40. Богатырев, В.А. Оптические свойства конъюгатов коллоидного золота с олиготимидином и их изменение при реакции гибридизации с полиадени-ловой кислотой / В.А. Богатырев и др. // Коллоидный журнал. 2005. - Т. 67. - № 4. - С. 458-468.

41. Бучаченко, A.JI. Магнитный изотопный эффект магния ключ к механо-химии фосфорилирующих ферментов как молекулярных машин / A.JI. Бучаченко, Д.А. Кузнецов // Молекулярная биология. - 2006. - Т. 40. - С. 1219.

42. Власов, В.В. Химические рибонуклеазы / В.В. Власов и др. // Молекулярная биология. 1998. - Т. 32. - С. 62-70.

43. Воронина, А.С. Регуляция на уровне трансляции в раннем развитии эукариот / А.С. Воронина // Молекулярная биология. 2002. - Т.36, № 6. - С. 956-969.

44. Доукинс, Р. Опасна ли генная инженерия? / Р. Доукинс // Современная биотехнология. Мифы и реальность. М.: Тайдекс Ко, 2004. - С. 162-164.

45. Евтеева, И. Н. 2000. Новая эндорибонуклеазная активность 26S протеасом из клеток линии А431 / И. Н. Евтеева и др. // Цитология. Т. 42. - № 7. - С. 675—680.

46. Ельская, А.В. Регуляция белкового синтеза у высших организмов / А.В. Ельская //Молекулярная биология. 1999. - Т. 33. - С. 1043.

47. Зарудная, М.И. Исследование конформационных переходов в поли(А) методом буферной ёмкости / М.И. Зарудная // Молекулярная биология. -1998. Т. 32. - №3. - С. 508-514.

48. Зарудная, М. И. Полиаденилирование про-мРНК. 2. Образование 3'-концевых поли(А)-последовательностей мРНК дрожжей, растений, прокариотов и вирусов / М.И. Зарудная // Бюполимепи i клггка. 2001. - Т. 17. -№ 2. - С. 40 - 55

49. Кораблева, Н Фракционный состав белков пшеницы, культивируемой в Узбекистане / Н. Кораблева и др. // Хлебопродукты. 2004. - №3. - С. 3132.

50. Крицкий, М.С. Коферменты и эволюция мира РНК / М.С. Крицкий, Т.А. Телегина // Успехи современной биологии. 2004. - Т. 44. - С. 341-364.

51. Клячко, H.JI. Матричные РЕЙС и трансляционный контроль в растениях / H.JI. Клячко // Физиол. и биохим. культурных растений. 1991. - Т. 23. - С. 419-426.

52. Клёнов, М.С. Формирование гетерохроматина: роль коротких РНК и метилирования ДНК / М.С. Клёнов, В.А. Гвоздев // Биохимия. 2005. - Т.70. -Вып. 11.-С. 1445-1458.

53. Кузнецов, В.В. РНК-интерференция. Использование метода для создания нокаутных организмов и клеточных линий / В.В. Кузнецов // Биохимия. — 2003. Т. 68. - Вып. 10. - С. 1301-1317.

54. Кузьмин, А.Н. Роль магния в питании растений и влияние его на урожай сельскохозяйственных культур / А.Н. Кузьмин // Сельское хозяйство за рубежом. Растениеводство. 1974. - №5. - С. 14-16.

55. Куличкова, В.А. Специфические ДНК-связывающая и эндорибонуклеаз-ная фктивности прочно связанных с хроматином малых РНП / В.А. Куличкова // Молекулярная биология. — 1999. — Т. 33, № 5. — С. 764-771.

56. Макарова, Ю.А. Некодирующие РНК / Ю.А. Макарова, Д.А. Крамеров // Биохимия. 2007. - Т. 72. - № 11. - С. 1427 - 1447.

57. Овчинников, JI.A. Мажорные белки мРНП в структурной организации функционировании мРНК в клетках эукариот / JI.A. Овчинников и др. // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35. - С. 548-558.

58. Осборн, Д. Дж. Нуклеиновые кислоты и прорастание семян / Д. Дж. Ос-борн // Физиология и биохимия покоя и прорастания семян: под. ред. М.Г. Николаевой, Н.В. Обручевой. М.: Колос, 1982. - С. 357-372.

59. Пахомова, В.М. Основные положения современной теории стресса и ниспецифический адаптационный синдром у растений / В.М. Пахомова // Цитология. 1995. - Т. 37. - С. 66-91.

60. Пильщикова, Н.В. Минеральное питание растений / Н.В. Пилыцикова // Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений. 1998. - С. 280345.

61. Плотников, В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот / В.К. Плотников // Успехи современной биологии. 1992. - Т.112. - Вып.2. - С.186-197.

62. Плотников, В.К. Способ диагностики физиологического состояния зерновых культур / В.К. Плотников, Н.Б. Бакалдина, В.А. Бибишев // Патент РФ №2084133 от 20.07.1997.

63. Плотников, В.К. Сорт озимой пшеницы «Краснодарская-39» — источник открытий в молекулярной биологии растений / В.К. Плотников // Пшеница и тритикале: сб. науч. тр. (поев. 100-летию акад. П.П.Лукьяненко) / КНИ-ИСХ. Краснодар, 2001. - С. 611-616.

64. Плотников, В.К. Генетико-физиологическая детерминация распада мРНК злаков in vitro / В.К. Плотников // Успехи современной биологии. -2003.-Т. 123.-С. 98-109.

65. Плотников, В.К. Регуляция синтеза белка в клетках эукариот на уровне стабильности мРНК / В.К. Плотников // Аминокислотное питание животных и проблема белковых ресурсов: сб. ст. по материалам конф. Краснодар, 2005.-С. 313-335.

66. Плотников, В.К. Генетический контроль и экологическая обусловленность стабильности мРНК в клетках эукариот / В.К. Плотников // Изв. Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2007. - № 5. - С. 110-119.

67. Плотников, В.К. Закономерный распад РНК in vivo и in vitro основа новых методов биотехнологии / В.К. Плотников // Наука Кубани. - 2007. - № 4.-С. 4- 15.

68. Полежаев, С.Л. Влияние качества аминокислотного питания на стабильность мРНК животных / С.Л. Полежаев // Проблемы повышения качества зерна пшеницы и других зерновых культур: сб. науч. тр. РАСХН. — М., 1998.-С. 248-255.

69. Попов, А.К. Использование хроматографии на колонке с поли(У)-целлюлозой для выделения эукариотической матричной РНК / А.К. Попов, А.Р. Федотов, Г.А. Дворкин // Биохимия. 1975. - Т. 40. - С. 45-47.

70. Пыльнева, П.Н. Особенности качественного состава золы высоколизиновой кукурузы / П.Н. Пыльнева // Физиология и биохимия культурныхрастений. 1976. - Т. 8. - Вып. 1. - С. 77-82.

71. Рибонуклеиновый год (в 2006 году сразу две Нобелевские премии присуждены за работы, объектом которых была рибонуклеиновая кислота -РНК). Электронный ресурс. / электронная газета: режим доступа: .http://www.stengazeta.net/article.html?article=2705.

72. Рядчиков, В.Г. Обмен веществ, рост белых крыс и поросят при балансе и имбалансе аминокислот / В.Г. Рядчиков, В.К. Плотников, А.В. Плотникова // Производство и использование растительного белка: Всесоюз. совещ., Краснодар, 1981. С. 216-217.

73. Рядчиков, В.Г. Баланс аминокислот как регулятор аппетита и синтеза белка у свиней / В.Г. Рядчиков, В.К. Плотников, А.В. Плотникова // Сб. науч. тр. КНИИСХ им. Лукьяненко и СКНИИЖ, 1986. С. 57-63.

74. Спирин, А.С. Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни / А.С. Спирин // Вестник Российской академии наук. 2001. - Т. 71. - С. 320-328.

75. Спирин, А.С. Рибонуклеиновые кислоты как центральное звено живой материи / А.С. Спирин // Вестник Российской академии наук. 2003. - Т. 73.-С. 117-127.

76. Спирин, А.С. Мир РНК и его эволюция / А.С. Спирин // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - №4. - С. 550-556.

77. Телегина, Т.А. Влияние ионов магния и излучения в линиях магния на транскрипционную активность нуклеоидов хлоропластов папоротника Azolla pinnata R.Br. / Т.А. Телегина, М.С. Турищева // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. - Т. 30. - С. 292-297.

78. Тимофеева, А.В. Метод количественного анализа короткоживущих РНК и продуктов их распада с помощью обратной транскрипции и полимераз-ной цепной реакции / А.В. Тимофеева и др. // Молекулярная биология. -2000.-Т. 34. №1. - С. 79-86.

79. Толкачёва, Т.В. Роль G-белков в специфичности клеточного ответа: особенности строения и функционирования а-субъединицы / Т.В. Толкачёва и др. //Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - С. 1002-1014.

80. Трифонова, Е.А. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений / Е.А. Трифонова, А.В. Кочетов, В.К. Шумный // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 120. - С. 395-405.

81. Трудолюбова, М.Г. Количественное определение РНК и ДНК в субклеточных фракциях клеток животных / М.Г. Трудолюбова // Современные методы биохимии: под ред. Ореховича. М.: Медицина, 1977. - С. 313 -319.

82. Трунова, Т.Н. Рост и морозостойкость растений / Т.Н. Трунова, Г.В. Кузина, М.А Бочарова // Рост и устойчивость растений. Новосибирск: Наука, 1988. - С. 133-144.

83. Фещенко, В.В. Влияние системы генов ppd на рост и развитие апикальной меристемы и молодых листьев у пшеницы разных биотипов /В.В. Фещенко и др. // Биол. науки. 1992. - № 6. - С. 44-51.

84. Хаитов, М.Р. Интерференция РНК / М.Р. Хаитов, B.C. Акимов //Успехи современной биологии. 2006. - Т. 126. - №3. - С. 242-249.

85. Четверин, А.Б. Новоый взгляд на рекомбинацию РНК / А.Б. Четверин // Молекулярная биология. 1996. - Т. 33. - С. 985-996.

86. Чирков, Г.П. Деградация 18 S и 288-рибосомных РНК в цитоплазме клеток печени крыс при подавлении синтеза белков / Г.П. Чирков и др. // Биохимия. 1983. - Т.48. - С. 1157-1162.

87. Belasco, J. Control of messenger RNA stability / J. Belasco, G. Brawerman (eds) New York.: Academic Press, 1993. 500 P.

88. Marschner, H. Mineral nutrition in higher plants / H. Marschner. San Diego.: Academic Press, 1995. - 887 p.

89. Abler, M.L. Control of mRNA stability in higher plants / M.L. Abler, P.J. Green // Plant Mol.Blol. 1996. - V.32. - P.63-78.

90. Ajtkhozhin, M.A. lnformosomes as a stored form of mRNA in wheat embryos / M.A. Ajtkhozhin, K.J. Doschanov, A J. Akhanov // FEBS Lett. 1976. - V. 66 -P. 124-126.

91. Amara, J. F. Specific mRNA destabilization in Dictyostelium discoideumrequires RNA synthesis / J. F. Amara and H. F. Lodish // Mol. Cell. Biol. -1987. V. 7, №12. - P. 4585-4588.

92. Anand, A. Stable trasgene expression and random gene silencing in wheat / A. Anand, H.N. Trick, B.S. Gil // Plant Biothechnol. J. 2003. - V.l, № 4. - P.241-251.

93. Anderson, M.A. Sequence variability of three alleles of the self-incopability gene of Nicotiana alata / M.A. Anderson et al. // Plant Cell. 1989. - V.l, № 4. - P.483-491.

94. Arruda, P. Regulation of lysine catabolism in higher plants / P. Arruda // Trends in Plant Sciens. 2000. - V. 5. - P. 324-330.

95. Aviv, H. Purification of biogically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidilic acid-cellulose / H. Aviv, P. Leder // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1972. - V. 69. - P. 1408-1412.

96. Bahar, B. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues / B. Bahar et al. // BMC Molecular Biology. 2007. - V. 8. - P. 108-120.

97. Baker, E.Y. Control of poly(A) length /E.Y. Baker // Control of mRNA stability: Belasco J.G., Brawerman G. eds. San Diego, CA: Academic Press, N.Y., 1993. - P.367-415.

98. Banatao, D.R. Microenvironment analysis and identification of magnesium binding sites in RNA / D.R. Banatao, R.B. Altman, Т.Е. Klein // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 4450-4460.

99. Bandyopadhyay, R. Nuclease activity associated with mRNA in its native stage: possible basis selectivity in mRNA decay / R. Bandyopadhy et al. // Mol. and Cell. Biol. 1990. - V. 10. - P. 2060-2065.

100. Bandyopadhyay, R. Secondary structure at the beginning of the poly(A) sequence of mouse P-actin messenger RNA / R. Bandyopadhyay, G. Brawerman // Biochimie. 1992. - V. 74. - P. 1031-1034.

101. Banerjee, S. RNase L-independent specific 28S rRNA cleavage in murine coronavirus infected cells / S. Banerjee et al. // J. Virol. 2000. - V. 74. - P.8793-8802.

102. Bardwell, J. С. Autoregulation of RNase III operon by mRNA processing / J. C. Bardwell et al. // EMBO J. 1989. - V. 8. - P. 3401-3407.

103. Bariola, P.A. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation / P.A. Bariola et al. // Plant J. 1994. - V. 6. -P. 673-685.

104. Bariola, P.A. Plant ribonucleases / P.A. Bariola, P.J. Green // Ribonucleases: structure and function: eds G.D. Alessio, J.F. Riordan. New York: Academic Press, 1997.-P. 163-190.

105. Bariola, P.A. Regulation of S-like ribonuclease levels in Arabidopsis. Antisense inhibition of RNS1 or RNS2 elevates anthocyanin accumulation / P.A. Bariola, G.C. Macintosh, P.J. Green // Plant Physiol. 1999. - V. 119. - P. 331-342.

106. Belanger, F. Heat shock causes destabilization of specific mRNAs and destruction of endoplasmic reticulum in barley aleurone cells / F. Belanger, M. Brodl, T. Ho //Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1986. - V. 83. - P. 1354.

107. Belasco, J.G. Mechanisms of mRNA decay in bacteria: a perspective / J.G. Belasco, C.F. Higgins // Gene. 1988. - V. 72. - P. 15-23.

108. Beelman, C.A. Degradation of mRNA in eukaryotes / C.A. Beelman, R. Parker //Cell.- 1995. -V. 81.-P. 179-183.

109. Belostotsky, D.A. Differential organ-specific expression of three poly(A) binding protein genes from Arabidopsis thaliana / D.A. Belostotsky, R.B. Meagher// Proc. Natl. Acad. Sol. USA. 1993. - V.90. - P.6686-6690.

110. Beran, R.K. Cold temperature induction of Escherichia coli polynucleotide phosphorylase occurs by reversal of its autoregulation / R.K. Beran, R.W. Simons // Mol. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 112-125.

111. Bernstein, Ph. The pole(A)-binding protein complex is a major determinant of mRNA stability in vitro / Ph. Bernstein, S. Peltz, J. Ross // Mol. and Cell. Biol. 1989.-V. 9.-P. 6589.

112. Bessarab, D.A. RNA components of Escherichia coli degradosome: evidencefor rRNA decay / D.A. Bessarab et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95.-P. 3157-3161.

113. Bewley, J.D. Seed germination and dormancy / J.D. Bewley // Plant Cell. -1997.-V. 9.-P. 1055-1066.

114. Biggiogera, M. Rearrangement of nuclear ribonucleoprotein (RNP)-containing structures during apoptosis and transcriptional arrest / M. Biggiogera //Biology of the Cell. 2004. - V. 96. - P. 603-615.

115. Brawerman, G. The role of the poly(A) sequence in mammalian messenger RNA / G. Brawerman // Critical Reviews in Biochemistry. 1981. - V. 10. - P. 1-38.

116. Brawerman, G. Determinants of messenger stability / G. Brawerman // Cell. -1987.-V. 48.-P. 5-10.

117. Brawerman, G. mRNA decay: finding the right targets / G. Brawerman // Cell. 1989. -V. 57.-P. 9-10.

118. Brawerman, G. mRNA degradation in eukaryotic cells: an overview / G. Brawerman // In control of mRNA stability: eds. J.G.Belasco, G. Brawerman. -San Diego, CA: Academic Press, N. Y., 1993. P. 149-159.

119. Brannvall, M. Metal ion cooperativity in ribozyme cleavage of RNA / M. Brannvall and L.A. Kirsebom // PNAS. 2001. - V. 98. - P. 12943-12947.

120. Brewer, G. Regulation of c-myc mRNA stability in vitro by a labile destabilizer with an essential nucleic acid component / G. Brewer and J. Ross // Mol. Cell. Biol. 1989. - V. 9. - P. 1996-2003.

121. Brewer, G. Characterization of c-myc 3'-5' mRNA decay activities in vivo an in vitro system / G. Brewer // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 34770-34774.

122. Brocklehurst, P.A. Ribosomal RNA integrity and rate of seed germination / P.A. Brocklehurst, R.S. Fraser // Planta. 1980. - V. 148. - P. 417-421.

123. Bushell, M. Translation inhibition during the induction of apoptosis: RNA or protein degradation? / M. Bushell et al. // Biochemical Society Transactions. -2004.-V. 4.-P. 606-610.

124. Butler, J.S. RNA processing generates the mature 3'end of yest CYC1messenger RNA in vitro / J.S. Butler, T. Pratt // Scince . 1988. - V. 242. - P. 1270-1274.

125. Byrne, D.H. Half-life of oat mRNAs in vivo and in polysome-based in vitro system / D.H. Byrne , K.A. Seeley, J.T. Colbert // Planta. 1993. - V.189. -P.149-156.

126. Cai, C.Q. Nitric Oxide-Dependent Ribosomal RNA Cleavage Is Associated with Inhibition of Ribosomal Peptidyl Transferase Activity in ANA-1 Murine Macrophages / C.Q. Cai et al. // The Journal of Immunology. 2000. - V. 165.- P. 3978 -3984.

127. Cairrao, F. Cold shock induction of RNase R and its role in the maturation of the quality control mediator SsrA/tmRNA / F. Cairrao et al. // Mol. Microbiol.- 2003. V. 50.-P. 1349-1360.

128. Cannistraro, V.J. Specific endonucleolytic cleavage sites for decay of Escherichia coli mRNA / V.J. Cannistraro, M.N. Subbarao, D. Kennell // J. Mol. Biol. 1986. - V. 192. - P. 257-274.

129. Cannistraro, V. J. Purification and characterization of ribonuclease M and mRNA degradation in Escherichia coli / V. J. Cannistraro, D. Kennell // Eur.J. Biol. 1989. - V. 181. - P. 363-378.

130. Caplen, N.J. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems / N.J. Caplen et al. // Proc. Natl. Acad. Sc.-2001.-V. 98-P. 9742-9747.

131. Carpousis, A.J. mRNA degradation: a tale of poly(A) and multiprotein machines / A.J. Carpousis, N.F. Vanzo, L.C. Raynal // Trends in Genetics. -1999.-V. 15.-P. 24-28.

132. Casey, J. L. Iron-responsiveelements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation / J. L. Casey et al. // Science. 1988. - V. 240.1. P. 924-940.

133. Castelli, J.C. A study of the interferon antiviral mechanism: apoptosis activation by the 2-5A system / J.C. Castelli et al. // J. Exp. Med. 1997. - V. 186.-P. 967-72.

134. Chanda, P. K. Cloning, sequence analysis, and expression of alteration of the mRNA stability gene (ams+) of Escherichia coli / P. K. Chanda et al. // J. Bacterid. 1985. - V.161, № l.-P. 446-449.

135. Cech, T.R. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena-. involvement of guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence / T.R. Cech, A.J. Zaug, P.J. Grabowski //Cell. 1981. - V. 3. - P. 487-496.

136. Cech, T.R. Ribozymes, the first 20 years / T.R. Cech // Biochem. Soc. Trans. -2001. V.30. -P.l 162-1166.

137. Chekanova, J.A. Evidence that poly(A) binding protein has an evolutionarily conserved function in facilitating mRNA biogenesis end export / J.A. Chekanova, D.A. Belostotsky // RNA. 2003. - V. 9. - P. 1476-1490.

138. Chen, C. Elevation of RNase R in response to multiple stress conditions / C. Chen, M.P. Deutscher // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 34393-34396.

139. Cheng, Z.-F. Quality control of ribosomal RNA mediated by polynucleotide phosphorylase and RNase R / Z.-F. Cheng, M.P. Deutscher // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - P. 6388-6393.

140. Cheng, Z.-F. An important role for RNase R in mRNA decay / Z.-F. Cheng, M.P. Deutscher// Mol. Cell. 2005. - V. 17. - P. 313-318.

141. Chetverin, A.B. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qp replicase / A.B. Chetverin, H.V. Chetverina, A.V. Munishkin // J. Mol. Biol. 1991. - V. 222.-P. 3-9.

142. Chetverina, H.V. Cloning of RNA molecules in vitro / H.V. Chetverina, A.B. Chetverin //Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 2349-2353.

143. Chicas, A. Characteristics of post-transcriptional gene silencing / A. Chicas, G. Macino // EMBO repots. 2001. - V. 2. - P. 992-996.

144. Cole, P.E. Conformational changes of transfer ribonucleic acid. Equilibriumphase diagrams / P.E. Cole, S.K. Yangs, D.M. Crothers // Biochemistry. 1972. -V. 11.-P. 4358-4368.

145. Colegrove-Otero, L.J. RNA-Binding Proteins in Early Development / L.J. Colegrove-Otero, N. Minshal, N. Standart // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology / Editor: Wickens M. 2005. - V. 40. - P. 21 - 73.

146. Copois, V. Impact of RNA degradation on gene expression profiles: assessment of different methods to reliably determine RNA quality / V. Copois et al. // J. Biotech. 2006. - V. 8. - P. 259-270.

147. Court, D. RNA processing and degradation by RNase III / D. Court // In control of mRNA stability: eds G. Brawerman, J.G. Belasko. — New York: Academic Press, 1993.-P. 70-116.

148. Cowan, J.A. Structural and catalytic chemistry of magnesium-dependent enzymes / J.A. Cowan // BioMetals. 2002. - V. 15. - P. 225-235.

149. Dantonel, J.-C. Transcription factor TFIID recruits factor CPSF for formation of 3' end of mRNA / J.-C. Dantonel et al. // Nature. 1997, (London). - V. 389.-P. 399^102.

150. Day, D.A. Post-transcriptional gene regulatory mechanisms in eukariotes: an overview / D.A. Day, M.F. Tuite // Jornal of Endocrinology. 1998. - V. 157. -P. 361-371.

151. De Rocher, E.J. Direct evidence for rapid degradation of Bacillus thuringiensis toxin mRNA as a cause of poor expression in plant / E.J. De Rocher // Plant Physiol. 1998. - V. 117. - P. 1445-1461.

152. Del Prete, M.J. Degradation of cellular mRNA is a general early apoptosis-induced event / M.J. Del Prete et al. // FASEB J. 2002. - V. 16. - P. 20032005.

153. Deng, X.-W. The chloroplast genome exists in multimeric forms / X.-W. Deng, R. A. Wing, W. Gruissem // PNAS. 1989. - V. 86. - P 4156-4160.

154. Deutch, C.E. Posttranscriptional regulation of a salt-inducible alfalfa gene encoding a putative chimeric proline-rich cell wall protein / C.E. Deutch, I. Winicov // Plant Mol. Biol.- 1995. V.27. - P. 411-418.

155. Deutscher, M.P. Degradation of stable RNA in bacteria / M.P. Deutscher // J.Biol.Chem. 2003. - V.278. - P. 45041-45044.

156. Deutscher, M.P. Degradation of RNA in bacteria: comparison of mRNA and stable RNA / M.P. Deutscher // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 659666.

157. Diehn, S.H. Premature polyadenilation at multiple sites within a Bacillus thuringiensis toxin gene-coding region / S.H. Diehn et al. // Plant Physiol. -1998.-V. 117.-P. 1433-1443.

158. Dickey, L.F. Light regulatory sequences are located within the 5' portion of the Fed-1 message sequence / L.F. Dickey, M. Gallo-Meagher, W.F. Thompson //EMBOJ. 1992. -V. 11.-P. 2311-2317.

159. Dickey, L.F. Light modulation of ferredoxin mRNA abundance requires an open reading frame / Dickey, L.F. et al. // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 11711176.

160. Dilella, A.G. Degradation of 16S RNA in thermally injured Staphylococcus epidermis / A.G. Dilella, A.E. Sobota // Ohio Acad. Sci. 1980. - V. 80. - P. 813.

161. Donovan, W.P. Polynucleotide phosphorylase and ribonuclease II are required for cell viability and mRNA turnover in Escherichia coli K-12 / W.P. Donovan, S.R. Kushner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -.1986. V. 83. - P. 120-124.

162. Draper, D.E. A guide to ions and RNA structure / D.E. Draper // RNA. 2004. -V. 10.-P. 335-343.

163. Dreyfus, M. The poly(A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria / M. Dreyfus, P. Regnier // Cell. 2002. - V.l 11. - P. 611-613.

164. Ebel, H. Magnesium metabolism / H. Ebel, T. Gunther // Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 1980. -V. 18. P. 257-270.

165. Fialcowitz, E.J. A Hairpin-like Structure within an AU-rich mRNA-destabilizing Element Regulates trans-Factor Binding Selectivity and mRNA Decay Kinetics / E.J. Fialcowitz // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 22406 -22417.

166. Fleischmann, J. Polyadenylation of ribosomal RNA by Candida albicans / J Fleischmann, H. Liu // Gene. 2001. - V. 265. - P. 71-76.

167. Flavell, R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication / R.B.Flavell // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. V. 91. - P. 3490-3496.

168. Fu, P. Diffential expression of dehydrin in spring and winter cereals during cold acclimation / P. Fu et al. // Plant Physiol. 1994. - V. 105. P. 169-173.

169. Fu, H. High-level tuber expression and sucrose inducibility of a potato Sus4 sucrose synthase gene require 5' and 3' flanking sequences and the leader intron / H. Fu, S. Y. Kim, W. D. Park // Plant Cell. 1995. - V.7. - P. 1387-1394.

170. Fuchs, P. 18S rRNA degradation is not accompanied by altered rRNA transport at early times following irradiation of HeLa cell / P. Fuchs et al. // Radiation Research. 1990. - V. 121. - P. 67-70.

171. Gallie, D.R. The cap and poly(A) tail of gene to regulation mRNA translational efficiency / D.R. Gallie // Genes Dev. 1991. - V. 5. - P. 21082116.

172. Gallie, D.R. Posttranscrlptional regulation of gene expression in plants / D.R. Gallie // Annu. Rev.Plant Physiol. Mol. Biol. 1993. - V.44. - P.77-106.

173. Gallie D.R Translational control of cellular and viral mRNAs / D.R. Gallie // Plant Mol. Biol.- 1996. V.32. - P. 145-158.

174. Galili, G. Lysine catabolism: a stress and development super-regulated metabolic pathway / G. Galili et al. // Current Opinion in Plant Biology. -2001.-V. 4.-P. 261 -266.

175. Gamier C. Heat-shock protein 90 (hsp90) binds in vitro to tubulin dimer and inhibits microtubule formation / C. Gamier et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 250. - P. 414^19.

176. Georgellis D. Decay of ompA mRNA and processing of 9S RNA are immediately affected by shifts in growth rate, but in opposite manners / D. Georgellis, S. Arvidson, and A. von Gabain // J. Bacteriol. 1992. - V.174. - P. 5382-5390.

177. Gil, P. Characterization of the auxin-iducible SAUR-AC1 gene for use as a molecular genetic tool in Arabidopsis / P. Gil et al. // Plant Physiol. 1994. -V. 104.-P. 777-784.

178. Gil, P. Multiple regions of the Arabidopsis SAUR-AC1 gene control transcript abudence: the 3 '-untranslation region functions as an mRNA instability determinant / P. Gil, P.J. Green // EMBO J. 1996. - V. 15. - P. 1678-1686.

179. Gil, P. Regulatory activity exerted by the SAUR-AC1 promotor region in transgenic plants / P. Gil, P.J. Green // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 34. - P. 803-808.

180. Green, P.J. Control of mRNA stability in higher plants / P.J. Green //Plant Physiol. 1993. - V. 102. - P. 1065-1070.

181. Green P.J. Control stability of mRNA in higher plants // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 63-78.

182. Halicka, H.D. Segregation of RNA and separate packaging of DNA and БУЧА in apoptotic bodies during apoptosis / H.D. Halicka, E. Bedner, Z. Darzynkiewicz // Exp Cell Res. 2000. - V. 260. - P. 248-256.

183. Hammett, J.R. Storage and metabolism of poly(adenylic acid)-mRNA in germinating cotton seeds / J.R. Hammett, F.R. Katterman // Biochemistry. -1975. -V. 17. P. 3250-3256.

184. Han, H. Mapping RNA regions in eukaiyotic ribosomes that are accessible to methidiumpropyl-EDTA z Fe(II) and EDTA z Fe(II) / Han, H. et al. //

185. Biochemistry. 1994.-V. 33.-P. 9831-9844.

186. Hautala, J.A. Increased expression of a eukaryotic gene in Escherichia coli through stabilization of its messenger RNA / J.A. Hautala et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1979. - V.76, № 11. - P. 5774-5778.

187. Henderson, I.R. Dissecting Arabidopsis thaliana DICER function in small RNA processing, gene silencing and DNA methylation pattering / I.R. Henderson et al. // Nature Genetics. 2006. - V. 38. - P. 721-725.

188. Hentze, M. W. Homology between IRE-BP, a regulatory RNA-binding protein, aconitase, and isopropylmalate isomerase / M. W. Hentze, P. Argos // Nucleic Acids Res.-1991.-V. 19.-P. 1739-1740.

189. Higgs, D.C. At phytochrome A mRNA degradation appears to occur via two distinct pathways / D.C. Higgs, J. T. Colbert // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 1007-1019.

190. Higgs, D.C. Abundance and half-life of the distinct oat phytochrome A3 and A4 mRNA / D.C. Higgs, L.J. Barnes, J.T. Colbert // Plant Mol.Biol. 1995. -V. 29.-P. 367-377.

191. Ho, T.D. Response of barley aleurone layers to abscisic acid / T.D. Ho, J.E. Varner // Plant Physiol. 1979. - V. 57. - P. 175-178.

192. Hoat, T.X. Specific cleavage of ribosomal RNA and mRNA during victorin-induced apoptotic cell death in oat / T.X. Hoat et al. // Plant J. 2006. - V. 46. -P. 922-933.

193. Holmberg, L. Probing the structure of mouse Ehrlich ascites cell 5.8S, 18S and 28S ribosomal RNA in situ / L. Holmberg, Y. Melander, and O. Nygard // Nucleic Acids Res. 1994. - V. 22. - P. 1374-1382.

194. Houge G. Selective cleavage of 28S rRNA variable regions V3 and V13 in myeloid leukemia cell apoptosis / G. Houge et al. // FEBS Lett. 1993. - V.315. P. 16-20.

195. Houge, G. Finemapping of 28S rRNA sites specifically cleaved in cells undergoing apoptosis / G. Houge et al. // Mol. Cell. Biol. 1995. - V. 15. - P. 2051 -2062.

196. Horlitz, M. Gene-specific trans-Regulatory Functions of Magnesium for Chloroplast mRNA Stability in Higher Plants / Horlitz M., P. Klaff // The J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 35638 - 35645.

197. Hsu, D. Degradation of rRNA in Salmonella Strains: a novel mechanism to regulate the concentration of rRNA and ribosomes / D. Hsu, L.-M. Shih, Y.C. Zee // J. Bacteriol. 1994. - P. 4761-4765.

198. Hutchins, C.J. Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avocado sunblotch viroid / С J. Hutchins et al. // Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14. -P. 3627-3640.л I

199. Jackson, R.J. Do the poly(A) tail and 3 '-untranslation region control mRNA translation / R.J. Jackson, N. Standart // Cell. 1990. - V. 62. P. 15-24.

200. Johnston, W. RNA-catalyzed RNA polymerization: accurate and general RNA-templated primer extension / W. Johnston et al. // Scienc. 2001. - V. 292.-P. 1319-1325.

201. Kaplan, R. Decay of ribosomal RNA in Escherichia coli cells starved for various nutrients / R. Kaplan, D. Apirion // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250. - P. 3174-3178.

202. Kemper, L.D. The role of opaque-2 in the control of lysine-degradingactivities in developing maize endosperm / L.D. Kemper // The Plant Cell. -1999. -V. 11. P. 1981-1993.

203. Klaff, P. mRNA decay in spinach chloroplast: psbA mRNA degradation is initiated by endonucleotic cleavage within the coding region / P. Klaff // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23, №23. - P. 4885-4892.

204. Klaff, P. RNA structure and regulation of gene expression / P. Klaff, G. Riesner, G. Steger // Plant Mol. Biol. 1996. - V. 32. P. 89-106.

205. Klein, D.J. The contribution of metal ions to the structural stability of the large ribosomal subunit / D.J. Klein, P.B. Moore, T.A. Steitz // RNA. 2004. -V. 10.-P. 1366-1379.

206. Koculi, E. Charge density of divalent metal cations determines RNA stability / E. Koculi et al. // J. Am. Chem. Soc. 2007. - V. 129. - P. 2676-2682.

207. Kodrzycky, R. The Opaque-2 mutation of maize differentially reduces zein gene transcription / R. Kodrzycky, R.S. Boston, B.A. Larkins // Cell. 1989. V. l.-P. 105-114.

208. Konstantinova, I.M. The specific endoribonuclease activity of small nuclear and cytoplasmic a-RNPs / I.M. Konstantinova et al. // FEBS Lett. 1999. - V. 462.-P. 407-410.

209. Krikorian, Ch.R. In vitro mRNA degradation system to study the virion host shutoff function of Herpes simplex virus / Ch.R. Krikorian and G. S. Read // J. of Virology. 1991. - V. 65. - P. 112-122.

210. Kuai, L. Polyadenylation of rRNA in Saccharomyces cerevisiae / L. Kuai et al. // Proc. Natl. Ac. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P. 8581-8586.

211. Laloi, M. Plant cold-induced uncoupling protein / M. Laloi et al. // Nature. -1997.-V. 389.-P. 135-136.

212. Lamattina, L. Estimation of rRNA synthesis and degradation rates insenescing wheat leaves / L. Lamattina et al. // Arch. Biochem. Biophys. -1988.-V. 260.-P. 285-292.

213. Lange, H. Degradation of a polyadenylated rRNA maturation by-product involves one of the three RRP6-like proteins in Arabidopsis thaliana / H. Lange et al. // Molecular and Cellular Biology. 2008. - V. 28, No. 9. - P. 30383044.

214. Leaver, C. J. The molecular integrity of chloroplast ribosomal ribonucleic acids / C.J. Leaver, J. Ingle // Biochem. J. 1971. - V. 123. - P. 235-243.

215. Leffers, H. The sequence of 28S ribosomal RNA varies within and between human cell lines / H. Leffers, A. H. Andersen // Nucleic Acids Res. 1993. — V. 21.-P. 1449-1455.

216. Lewandowska, M. Polyadenylation and decay of 26S rRNA as part of Nicotiana tabacum response to cadmium / M. Lewandowska et al. // Acta Biochimica Polonica. 2007. - V. 54. - P. 747-755.

217. Li, Z. The soybean SAUR open reading frame contains a cis-element responsible for cycloheximid-induced mRNA accumulation / Z .Li et al. // Plant Mol. Biol. 1994. - V. 24. - P. 715-723.

218. Li, Z. Exoribonucleases and endoribonucleases/ Z .Li, M.P. Deutscher // EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology: editor Curtiss R. III. Washington, DC: ASM Press; 2004. - Chapter 4.6.3.

219. Lincoln, J.E. Diverse mechanism for the regulation of ethylene-inducible gene expression I J.E. Lincoln, R.L. Fischer // Mol. Gen. Genet. 1988. - V. 212.-P. 71-75.

220. Lu, Y. K. Characterization of the thylakoid membrane in a chlorophyll-deficient ch5 mutant of Arabidopsis thaliana / Y. K. Lu, С. M. Yang, and Y. R. Chen // Bot. Bull. Acad. Sin. 1995. - V. 36. - P. 33-40.

221. Lupoid, D.S. Polyadenylation occurs at multiple sites in maize mitochondrial cox2 mRNA and is independent of editing status / D.S. Lupoid, A.G. Caoile, D.B. Stern//Plant Cell.-1999. V. 11.-P. 1565-1578.

222. Mackie, G. O. Evolution of cnidarians giant axons / G. O. Mackie // Evolutionof the first nervous systems: ed. P. A. V. Anderson. NY.: Plenum, 1989. - P. 395-407.

223. Marcotte, W.R.J. Abscisic acid-responsive sequence from the Em gene of wheat / W.R.J. Marcotte, S.H. Russel, R.S. Quatrano // Plant Cell . 1989. -V.l. -P.969-976.

224. Margossian, L.J. Ethylene-regulated expression of a tomato fruit ripening gene encoding a proteinase inhibitor I with a glutamatic residue at the reactive site / L.J. Margossian et al. // Proc. Natl. Ac. Sci. USA. 1988. - V.85. -P.8012-8016.

225. Maruyama, H.B. Agglutination of bacterial spheroplast: agglutination-dependent of Escherichia coli ribosomal ribonucleic acid / H.B. Maruyama // J. Bacteriol. 1973. - V. 115. - P. 47-51.

226. Marzluff, W. F. Multiple regulatory steps control histone mRNA concentrations / W. F. Marzluff, N. Pandey // ZBS. 1988. - V. 13. - P. 49-69.

227. Melefors, O. Genetic studies of cleavage-initiated mRNA decay and processing of ribosomal 9S RNA show that the Escherichia coli ams and rne loci are the same / O. Melefors, A. von Gabain // Mol. Microbiol. — 1991. — V. 5.-P. 857-864.

228. Miller, L.L. Thermal injury and recovery of Bacillus subtilis / L.L. Miller, Z. J. Ordal //Appl. Microbiol. 1972. - V. 24. - P. 878-884.

229. Misra, V.K. The linkage between magnesium binding and RNA folding / V.K. Misra and D.E. Draper// J. Mol. Biol. 2002. - V. 317. - P. 507-521.

230. Moon, J. The Ubiquitin-Proteasome Pathway and Plant Development / J. Moon, G. Parry, M. Estelle //The Plant Cell. 2004. - V. 16. - P. 3181 - 3196.

231. Morelli, J.K. Biphasic stimulation of translational activity correlates with induction of elongation factor 1 subunit a upon wounding in potato tubes / J.K. Morelli, Ch.K. Shewmaker, M.E. Vayda // Plant Physiol. 1994. - V. 106. - P. 897-903.

232. Moss, E.G. RNA interference: is a small RNA world / E.G. Moss // Curr. Biol.-2001.-V. 11.-P. 772-775.

233. Mullet, J. E. Transcription and RNA stability are important determinants of higher plant chloroplast RNA levels / J. E. Mullet, R. R. Klein // EMBO J. -1987.-V. 6.-P. 1571-1579.

234. Mulligan, R.M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of maize mitochondrial gene expression R.M. / Mulligan, P Leon, V. Walbot // Mol. Cell. Biol.-1991.-V. 11.-P. 533-543.

235. Munroe, D. Tales of poly (A) / D. Munroe, A. A. Jacobson // Gene. 1990. -V.91.-P. 151-158.

236. Murphy, D. Vasopressin RNA in the neural lobe of the pituitary: dramatic accumulation in response to salt loading / D. Murphy, A Levy, S Lightman, D. Carter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86. - P. 9002-9005.

237. Newman, T.C. DST sequences, highly conserved among plant SAUR genes, target reported transcripts for rapid decay in tobacco/ T.C. Newman et al.// Plant Cell. 1993. -V. 5. - P. 701-714.

238. Nakabayashi, K. Genome-wide profiling of store mRNA in Arabidopsis thaliana seed germination: epigenetic and genetic regulation of transcription in seed / K. Nakabayashi et al. // The Plant Journal. 2005. - V. 41. - P. 697-709.

239. Nissen, P. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis / P. Nissen et al. // Science. 2000. - V. 289. - P. 920-930.

240. Pan, T. Divalent metal ions in RNA folding and catalysis / T. D. Pan, M. Long, and О. C. Uhlenbeck. // The RNA world: ed. R. F. Gesteland, and J. F. Atkins. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1993. - P. 271-302.

241. Pelletier, J. Insertion mutagenesis to increase secondary structure within the 5' noncoding region of a eukaryotic mRNA reduces translational efficiency / J.

242. Pelletier, N. Sonenberg // Cell. 1985. - V.40, №3. - P. 515-526.

243. P6rez-Amador, M.A. Identification of BFN1, a bifunctional nuclease induced during leaf and stem senescence in Arabidopsis / M.A. Perez-Amador et al. // Plant Physiol.-2000.-V. 122.-P. 169-179.

244. Peumans, W.J. Some aspects of the synthesis of long-lived messenger ribonucleopro-teins in developing rye embryos / W.J. Peumans, L.I. Caers, A.R. Carlier // Planta. 1979. - V. 144. - P. 485-490.

245. Plotnikov, V.K. Differential stability of zein mRNA in developing corn kernel / V.K. Plotnikov, N.B. Bakaldina // Plant Molecular Biology. 1996. - V. 31. -P. 507-515.

246. Raghavan, B. Seed germination // Developmental Biology of Flowering Plants. Springer-Verlag, New York. 2000. - P. 7-24.

247. Rajjou, L. The effect of a-amanitin on the Arabidopsis seed proteome highlights the distinct roles of stored and neosynthesized mRNAs during germination / L. Rajjou et al. // Plant Physiol. 2004. - V. 134.- P. 1598-1613.

248. Ren, Y.-G. Coordination of divalent metal ions in the active site of poly(A)-specific ribonuclease / Y.-G. Ren, L.A. Kirsebom, A. Virtanen // J. Biol. Chem. 2004. - V.47. - P. 48702-48706.

249. Reverdatto, S.V. mRNA deadenylation by PARN is essential for embryogenesis in higher plants / S.V. Reverdatto et al. // RNA. 2004. - V. 10.-P. 1200- 1214.

250. Ross, J. H4 histone messenger RNA decay in cell free extracts initiates at or near the 3' terminus and proceeds 3' to 5' / J. Ross, G. Kobs // J. Mol. Biol. -1986.-V. 188.-P. 579-591.

251. Ross, J. Messenger RNA turnover in eukaryotic cells / J. Ross // Mol. Biol. Med. 1988. - V. 5.-P. 1-12.

252. Ross, J. Control of messenger RNA stability in higher eukaryotes / J. Ross // Trends Genet. 1996. - V. 12. - P. 171-175.

253. Rothnie, H.M. Plant mRNA З'-end formation / H.M. Rothnie // Plant Mol. Biol. -1996.-P.43-61.

254. R6mer, R. tRNA conformation and magnesium binding. A study of a yeast phenylalanine-speeific tRNA by a fluorescent indicator and differential melting curves / R. Romer and R. Hach // Eur. J. Biochem. V. 55. - P. 271-284.

255. Sachs, A. B. Messenger RNA degradation in eukaryotes / A. B. Sachs // Cell. 1993. - V. 74. - P. 413-421

256. Santiago, Т. C. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae / Т. C. Santiago et al. // Nucl. Acids Res. 1987. -V. 15.-P. 2417-2428.

257. Saville, B.J. A site-specific self-cleavage reaction performed by a novel RNA in Neurospora mitochondria / B.J. Saville, R.A Collins // Cell. 1990. - V. 61. -P. 685-696.

258. Seeley, K.A. Distribution of phytochrome and chlorophyll-a/b-binding-protein mRNAs in etiolated Avena seedlings / K.A. Seeley, J.T. Colbert // Planta J. — 1992. -V. 187,№ 4. P. 532-536.

259. Seeley, K.A. Red light-independent instability of oat phytochrome mRNA in vivo / K.A. Seeley, D.H. Byrne, J.T. Colbert // Plant Cell. 1992. - V. 4. - P. 29-38.

260. Segal, G. A New Opaque Variant of Maize by a Single Dominant RNA-Interference-Inducing Transgene / G. Segal, R. Song, J. Messing // Genetics. -2003.-V. 165.-P. 387-397.

261. Schoenberg, D.R. Ribonucleases involved in eukaryotic mRNA turnover / D.R. Schoenberg, E. Chernokalskaya // mRNA metabolism and post-transcriptional gene regulation: eds. J.B. Harford and D.R. Morris. NY.: Wiley Press, 1997. - P. 217-240.

262. Shapiro, D. J. Regulation of messenger RNA stability in eukaryotic cells / D. J. Shapiro, J. E. Blume, D. A. Nielsen // BioEssays. 1987.- V. 6.- P. 221-232.

263. Shaul, O. Magnesium transport and function in plants: the tip of the iceberg / O. Shaul // Biometals. 2002. - V. 15. - P. 309-323.

264. Shaw, G. A conserved AU sequence from the 3'untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation / G. Shaw, R. Kamen //

265. Cell. 1986. - V. 46. - P. 659-678.

266. Sheng, J. Negative and positive regulation of a novel praline-rich protein mRNA by fungal elicitor and wounding / J. Sheng, R. D'Ovidio, M.C. Mehdy // Plant J. 1991.-V. 1.-P. 345-354.

267. Sheu, J.-J. Control of transcription and mRNA turnover as mechanisms of metabolic repression of alpha-amylase gene expression / J.-J. Sheu et al. // Plant J. 1994. - V. 5. - P. 655-664.

268. Shirly, B.M. A potential role for mRNA turnover in the light regulation of plant expression: ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase small subunit in soybean / B.M. Shirly, R.B. Meagher // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 3377-3385.

269. Silengo, L. Stabilization of mRNA with polar effects in an Escherichia coli mutant / L. Silengo // Mol. Gen. Genet. 1974. - V. 134, № 1. - P. 7-19.

270. Skott, W.G. The crystal structure of an all-RNA hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic cleavage / W.G. Skott, J.T. Finch, A. Klug//Cell. 1995. - V. 81.-P. 991-1002.

271. Slomovic, S. Polyadenylation of ribosomal RNA in human cells / S. Slomovic et al. // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 34. - P. 2966-2975.

272. Sobol, P.T. ICP0 prevents RNase L-independent rRNA cleavage in Herpes simplex virus type 1-infected cells / P.T. Sobol, Mossman K. L. // J. of Virology. 2006. - V. 80. - P. 218-225.

273. Sperrazza, J.M. Quantitation of cation binding to wheat germ ribosomes: influences on subunit association equilibria and ribosome activity/ J.M. Sperrazza, L.L. Spremulli // Nucleic Acids Res. 1983. - V. 11. - P. 2665 -2679.

274. Spirin, A.S. Eukaryotic messenger RNA and informosomes. Omnia mea mecumporto / A.S. Spirin // FEBS Lett. 1978. - V. 88. - P. 15-17.

275. Stelzer, R. X-ray microprobe analyses of vacuoles of spruce needle mesophyll, endodermis and transfusion parenchyma cells at different seasons of the year / R. Stelzer et al. // Botanica Acta. 1990. - V 103. - P. 415-423.

276. Stern, D.B. Control of plastid gene expression: 3' inverted repeats act as mRNA processing and stabilizing elements, but do not terminate transcription / D.B. Stern, W. Gruissem // Cell. 1987. - V. 51. - P. 1145-1157.

277. Sullivan, M.l. Posttranscriptional regulation of nuclear-encoded genes in higer plants: the role of mRNA stability and translation / M.l. Sullivan, P.J. Green // Plant Mol. Biol. 1993. - V. 23. - P. 1091-1104.

278. Sunitha, I. An in vitro system derived from Friend erythroleukemia cells to study messenger RNA stability / I. Sunitha, L. I. Slobin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - V. 144. - P. 560-574.

279. Susi, P. Characteristics of RNA silencing in plant similarities and differences across kingdoms / P. Susi, M. Hohkuri, T. Wahlroos // Plant Mol. Biol. 2004. -V. 54, № 1.-P. 25-38.

280. Thompson, A. Regulation of gene expression in develop pea seed / Thompson, A.: Ph. D. thesis Durham Univ., 1989. 146 p.

281. Taylor, C.B. RNS2: A senescence-associated RNase of Arabidopsis that diverged from the S-RNases before speciation / C.B. Taylor et al. // Proc. Natl. Ac. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 5118-5122.

282. Taylor, C.B. Identification and characterization of genes with unstable transcripts (GUTs) in tobacco / C.B. Taylor, P.J. Green // Plant Mol. Biol. -1995.-V. 28.-P. 27-38.

283. Thomashow, M.F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance / M.F. Thomashow // Plant Physiol. 1998. - V. 118. - P. 1-7.

284. Timofeeva, A.V. Size distribution of the urokinase mRNA decay intermediates in different tissues and cell lines / A.V. Timofeeva et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1517. -.P. 33-45.

285. Tomlins, R.I. Precursors ribosomal ribonucleic acid and ribosomeaccumulation in vivo during the recovery of Salmonella typhimurium from thermal injuiy / R.I. Tomlins, Z.J. Ordal // J. Bacterid. 1971. - V. 107. - P. 134-142.

286. Topp, H .-Whole-body degradation rates of transfer-, ribosomal-, and messenger ribonucleic acids and resting metabolic rate in 3- to 18-уеаг-оЫ humans / H Topp, Schoch G. // Pedeatric Res. 2000. - V. 47. - P. 163-175.

287. Venkov, P.V. Differential stability of 28S and 18S rat liver ribosomal ribonucleic acids / P.V. Venkov, A.A. Hadjiolov // Biochem. J. 1969. - V. 115. -P. 91-94.

288. Vincent, H.A. Substrate recognition and catalysis by the exoribonuclease Rnase R / H.A. Vincent, M.P. Deutscher // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 29769-29775.

289. Wasilewska, L.D. Preferential stimulation of the plant mRNA synthesis by gibberellic acid / L.D. Wasilewska, K. Kleczkowski // Eur. J. Biochem. — 1976. -V. 66, №2.-P. 405^112.

290. Waters, L.C. Ribonucleic acid synthesis in germinating cotton seeds / L.C. Waters, L.S.III Dure // J. Mol. Biol. 1966. - V. 19. - P. 1-27.

291. Wertz, I.E. Diverse molecular provocation of programmed cell death / I.E.

292. Wertz, M.R. Hanley // Trends Biochem Sci. 1996. - V. 21. - P. 359-364.

293. Wickens, M. Life and death in the cytoplasm: messages from З'-end / M. Wickens, P. Anderson, R.J. Jackson. // Curr. Opin. In Gen. & Dev. 1997. - V. 7. - P. 220-232.

294. Winkles, J.I. Drosophila ribosomal RNA stability increases during slow growth conditions / J.I. Winkles, W.H. Phillips, R.M. Granger // J. Biol. Chem.- 2006. V. 260. - P. 7716-7720.

295. Wreshner, D.H. Differential mRNA stability to reticulocyte ribonucleases correlates with 3' noncoding(U)nA sequences / D.H. Wreshner, G. Rechavi // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 172. - P. 333-340.

296. Wu, L. The formation З'-end in plants / L. Wu, T. Ueda, J. Messing // Plant J.- 1995.-V. 8.-P. 323-329.

297. Yen, Y. Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana / Y. Yen, P. J. Green // Plant Physiol. 1991. - V. 97. - P. 1487-1493.

298. Zhang, S. Fungal elicitor-induced bean prolinerich protein mRNA down regulation is due to destabilisation that is transcription and translation dependent / S. Zhang et al. // Plant Cell. 1993. - V. 5. - P. 1089-1099.

299. Zhang, S. Binding of a 50-kD protein toa U-rich sequence in an mRNA encoding a proline-rich protein that is destadilized by fungal elicitor / S. Zhang, M.C. Mehdy // Plant Cell. 1994. -V. 6. - P. 135-145.

300. Zhang, S. The role of RNA polemerase IV in plant small RNA metabolism / S. Zhang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V. 104. - P. 4536 -4546.

Информация о работе

Насонов, Андрей Иванович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культур - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы