Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стратегия трансляции пикорнавирусов на модели вируса энцефаломиокардита

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Стратегия трансляции пикорнавирусов на модели вируса энцефаломиокардита"

£

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ.М.В.ЛОМОНОдСВА

УГАРОВА Татьяна Юрьевна

СТРАТЕГИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ПИКОРНАВИРУСЭЗ НА МОДЕ»! ВИРУСА ЭШЩШОШЖАРДИТА

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1991

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЗОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЬ'РСПТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

УГАЮВА Татьяна Юрьевна

СТРАТЕГИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ПИКОРНАВИРУСОВ НА МОДЕЛИ ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДПТА

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форма научного доклада

Моекза - 1991

Работа выполнена ь Мзя^акулътетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химки ям. А.Н.Белозерского, МГУ.

Офациалыше оппоненты:

Член-корресг ндент АМН, доктор медицински:: наук, профессор В.В.Кавер;ш,

доктор биологических наук, профессор Б.А.Гвоздев, ■ доктор химических чау к, профессор Э.И.Будовский.

Ведущая организация: Институт белка АН СССР.

1тся "(()"

Защита диссертации состоится ^ОУ-^уп№ 1991 г.

* /Г часов на заседании Специализированного Сбвета Д.0Й3.05.70 по защите диссертаций на соискании ученой степени доктора наук при Московском Государственном Университете им. Ы.В.Ломоносова по адресу: 119690 ГПС, Ченинские гори, МГУ, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

-Л- _м

Автореферат разослан "1$.." 1991

Ученый секретарь Специализированного Сонета кандидат химических наук./ / В.Н.Каграманов

ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение стратегии трансляции пикорнавирусов вот уже более ^¿О лет тем переплетено с изучением трансляции у эукариот. Устагоила-ниа в конце 60-х годоэ (¿лКо^Сп , КьИтЮг-е. , кос) способа образования пикорнавирусных белков - путем синтеза полипротеина-пред-шестзенника с последугапиы разрезанием - привело к идее, что функциональная моноцистронность тшкорнавирусных РНК, кодирующих ргсколъ-ко белков, объясняется тем, что эукарг.тг.ческие рчбссиш, в отличие от бактериальных, не могут непосредственно взаимодействовать с внутренними, последовательностями мРКК и способны осуществлять инициацию трансляции только вблизи 5-конца мРЕК. Эта идея послужила мощным .стимулом к созданию сканирующей модели ишшации трансляции эукари-от {Ноха£., 1Э78), согласно которой первоначально узнается 5-кокец мРНК и происходит посад-.а ^З'-суб частицы вблизи.5-конца, которая затем сканирует 5- нетранслируемую"область (5—НТО) до инициирующего кодона. Центральный постулат сканирующей модели - абссл^тнач необходимость свободного 5-коы;а для инициации трансляции эукарлоткчес-кигл рибосомами - оставался общепризнанным в точение 10 лет. Парадокс, однако, заключается е том, чю дальнейшее изучение стратегии трансляции пикорнаЕирусоз привело к накоплению данных по функционированию и структуре их РНК, которые плохо укладывались б сканирующую модель и ставили под сомнение ее универсальность. Прямее доказательство существования у полиовируса независимо? от 5-конца "внутренней" инициации трансляции ( ¿¿/.^ 1983) су-

щественно изменило представление о возможностях взаимодействия эу-кариотических рибосом с мРНК а открыло новую страницу в изучении механизмов инициации трансляции у эукариот.

Таким образом, актуальность изучения стратегии трансляции пикорнавирусов имеет два аспекта - один, чисто вирусологический, обусловленный важной ролью пикорнавирусов в инфекционной патологии человека и животных, и второй, более общий, обусловленный большим значением моделей "пикорнавирус-зараяекная клегка" и"пикор-навируснне РНК-эунаркотические белоксиитезируицие.системы" в изучении фундаментальных вопросов трансляции и ее регуляции у эукариот. Выбор в качестве объекта изучения вируса энцеваломиокардата (ВЗМО объясняется преимуществами, которые дает исследователю модель "Ва.®-клетки Кребс-2". Поскольку ВЗ.К это мышншй вирус, а клетки Кребс-2 - перевиваемые клетки мыши, пару "В3.1К-клетки Кребс-2 "модно рассматривать как систему, максимально приближенную к естественной паре "вирус и клетка-хозяин".

Дополнительными преимуществами этой модели являются легкость культивирования клеток асцитной карцинадщ Кребс-2, их высокая продуктивность, облегчающая препаративное получение ВЭ1.К, РНК ВМ.К и различных субклеточных фракций, а также высокая матричная активность РНК ВЭМК, позволящая ¿"/'''^получать достаточные для структурах исследований количества вирусспецкфических белков.

Цель и задачи исследования:

Основная цель работы состояла в изучении трансляционной стратегии ВЭГЖ, обеспечиваидей преимущественную экспрессии вирусспецифи-ческих белков в зараженных клетках, В ходе работы решалось несколько задач:

I. На начальных этапах исследования решались задачи главным образом феноменологического характера, связанные с описанием состояния белоксинтезирующего аппарата клеток Кребс-2 после внедрения генетической информации ВЭМК:

- изучение динамики синтеза клеточных и вирусных белков, а таххз общей белоксинтезирущей активности зара-кешшх клетор;

- изучен з способности экстрактов из зараженных клоток поддергивать трансляцию вирусних и клеточных мРИС;

- изучение судьбы клеточных мР11К в зараженных клетках;

- определенна уровня образования 40^-преиньаторного комплекса в зараженных клетках;

- изучение функциональной активности фактора интдиацци -2 в зараженных клетках.

. 2. Другая группа задач била связана с изучением конкретных механизмов, обеспечпваюднх преимущественную трансляции вирусных РНК:

- изучение конкуренцич РНК ВЗ.К с копированными клаточнчмл РНК;

- изучение способности факторов инициации из зарсденшх клеток поддерживать трансляции г.эпированшх мРНК в условиях конкуренции с РКК ЗЗЖ; •

- исследование влияния различных факторов и фракций факторов инициации на трансляционную конкуренцию .между РНК ВЭЖ и кэпирозанными мРНК.

3. И, наконец, важнейшая группа задач была связана с изучением

>собенностей функционирования РНК ЗЙ.К, как матрицы для синтеза бел-

:ов, с изучением осооенностей инициации трансляции РЕК ВЭ1ЛК.

- получение высокоэффективного препарата инициаторной фсрмилI -ме тионил-тРНКф2 т;

■ идентификация //-концевых продуктоз расцепления полипротеина ВЭЖ;

■ изучение числа сайтов инициации, ф^нкциошфунцях на РНК ВЭЖ;

• изучение роли отдельных участков 5-нетракслируеь;ой области Во!.К з инициации трансляции и трансляционной конкуренция.

Научная новизна работа. Показало, что угнетение синтеза клеточных белков в инфицированных 33.it клерках происходит путем постепенного заыешенкя меточного синтеза вирусспецифическим на фоне прогрессирующего -снижения осщай Селоксинте?ируеде£ активности клеток.

Впервые показано, что экстракт!:, выделенные из зарахенных клеток, сохраняют способность транслировать клеточные мРШ, т.е. угнетение синтеза клеточных белков, индуцированное ВУ.2С, ке связано с модификацией б?локсинтазирующего аппарата, приводящей к нарушению инициации трансляции клеточных ыРНК. Показано, чте в зараяешшх клет ках не происходит ¡¡и ускорения распада предсинтезированшх мРНК, ни кх необратимой инактивации. Обнаружено, что экстракты из кезаражен-шх клеток, программируемые поли (А) -содержащим-! РНК, выделенными из зараженных клеток, .являются адекватной моделью, в которой воспроизводятся два эффекта, имеющие место в зчраг.енных BS.К клетках - избирательное угнегение синтеза клеточные бел-.ов и общее угнетение транс ляции. И оба эти эффекта связаны с попсутствием вирусспецифических РНК.

Епервые раскрыт механизм тотального подавления синтеза белков, развиващегооя с середины инфекционного цикла: показано, что нарушения происходят па ранних стадиях инициации трансляции и выражаются в угнетении образования -Ю^-преинициаторксго комплекса.

Впервые показано, что ^аракение клеток Кребс-ü ВЗ!.К не приводит к интактквации факторов инициации, необходимых .для трансляции кэпи-роваиных клеточных мРНК, или к тако* модификации факторов инициации,-которая давала бы односторонние преимущества PIK В<*Ж при совместной трансляции РНК B3I.K и клеточных ыРНК. Впервые обнаружено, что способность препаратов суммарных факторов инициации из клеток Кребс-2 восстанавливать трансляцию кэппрованшх клеточных мРШ, по'давленнув в присутствии РНК вак, определяется соотношением как минимум трех

азличных коьгпонентов и не oso:"утся к извезтной моде .та конкуренция, осящей название "дискриминирующего ли-лт прущего фактора".

Ene" вые показано, что в полипротеике ВЭЖ существует У/-ко,тцевая вдернат последовательность, которая синтезируется в сос^озе полипеп-ида преЛ (LPj), и, после его расщепления, выявляется в с идо двух :еструктур® к (лидершх) полипелткдов pl4 v pi.i. Устаноьлена пдзчтич-:ость j/-концевой аминокислотной последовательности pJ4 и.р12, что ;оказало существование единственного сайта инициации полипротеипа и газволило локализовать его на вирусной РНК.

При изучении пнациаторного фрагмента Р1!К ^ЗЖ (участка 5-нетран-¡лируекой осЗласти с 31о по БЗЗ шел, ответственного за независимую ог ¡-конца "внутреннюю инициацию") впервые определены некоторче функции сдельных его частей. В соогаве ойшрного фрагмента í4fíó-833 нкл), Абсолютно неооходикого для внутренней ьшщиацгл, впервые обнаружен гчасток Б48-763 нкл, который определяет способность РНК ВЛК к трансляционной 1:оккуре:щин с ®тш РНК. Показано, что 5-прпксн;.'.альный участок днициаторного фрагмента (315-484 нкл), не являясь абсолютно «обходимым для внутренней инициации, многократно повышает siíthb-юсть функционирования яняцпаторкого фрагмента. Впервые показано, что инициаторный фрагмент мо.тет быть собран ¿я '.'Нп> из двух кова-лентно несвязанных участков (315-484 нкл) и (485-СЗЗ нкл) с почти полным восстало?чением функциональной активности. Впервые в экстрактах клеток Кребс-2 обнаружен белек (рб8), который специфически связывается с инициаторным фрагментов РНК ЕЭЖ, и установлено, что местом его связывания является участок 315-484.

Основные результаты диссертации были получены в соавторстве с чл.-корр. АМН СССР, проф. В.И.Аголом, д.б.и. Ю.В.Сбкткиным (раздел 1,3), д.х.н. й.Н.Шатскчм (раздел 4), к.б.к. А.М.Дияуром (раздел • 1,2), к.б.н. В.А.Гиневской (раздгл I), к.б.к. Чернсвской (раздел 3) и к.х.н. А.Г.Езстафьевой (раздел 4).

Практическая ценность работа.

Выбранное нош направление - это использование эффективных бес-клаточш'х систем для исследования стратегии тренс^шцич пякорнавнру-соз к тоделирозания 'процессов регуляции транс^тщш при пикорнавирус-ной инфекции. Били олубликоваш два методических руководства по получению и использованию белоксинтезирувдих экстрактов клеток Кребс-2 и обзор по бесклеточным белоксинтесирущим системам иг клеток эукариот, которые способствовали распространению этого метода. Проведенные в послэдниз годи модификации мегсда позволили повысить эффективность бесклеточной систе.лы из клеток Кребс-2 и полностью освободиться от эндогенной нуклеазной активности. Последнее обстоятельство позволило успешно использовать эту систему для изучения стратегия трансляция поллгетшл РНК растительных вирусов. Система может быть рекомендована для изучения стратегии трансляции полпцистронкых м?НК вирусного и клеточного происхождения.

Предложенные модификации метода получения формил-мет-тР1Кфет существенно упростили и удешевили методику и позволили получить препараты кпициаторией формяд -).:ет-тР1!Ьфет с высоким уровнем апно-ацилирования и формулирования, эффективно функционирующие Сп \'!Ьо . Эти препараты с успехом были использовали дет изучения стратегии трансляции флавизирусов ¡<а модели вируса клещевого энцефалита. Метод молшт бить рекомендован для изучения У-концевых продуктов трансляции любых мРНК в басклеточлых системах, происходили: из эукариоти-ческях клеток.

Полученные результаты углубляют знания о механизмах регуляции синтеза белков в яарахекных гшкорнавирусамя клетках, о стратегии трансляции шкорнавирусов и механизмах инициации трансляции в эуха-риотических клетках. . *

Апробация работы: Материалы работы были дслокень' л обсуждены на симпозиума, "Структура и функция нуклаинозых кислот и луклвопротеидоя", посвященной памяти А.Н.Белозерского, (Москва> 19?'!^, на Всесоюзчом симпозиуме "Структура и молекулярное основы репродукции рНК-содаржа-цих вирусов" (Рига, 197^), на конференции "Вопросы медищчюкой вирусологии" ("Лсква, 1975), на Всесоюзной конфарз.чции по транспортным РНК (К;:ев, 1976), на 1У Вс.ассознои биохимическом съезде (Ленинград, 1979), на Международном симпозиуме "Стратегия генома РНК-содеряащпх вирусов" (Москва, 1980), на Совэтскэ-и^альянскои симпозиуме. "йакрэ-цолакулы в функционирующей клитка" (Пуциьо-на Ска, 1980), на Всесоюзной конференции "Вирусы и вирусные ичфакаил чиловака" (Москва, 1981), на Ломоносовских чтениях (МГУ, МоскЕа, 1983), на 16 ксиферанции ФЕЮ (Москва, 1^84).

Кспо;.ьзоЕанныа сокращения: ВЭЖ - вирус энцафа^омиокардита: ВП - ¿и-рус полимиелита; ХВК - Х-зирус картофеля; ЭНЗК и ЭЗК - экстракт из н&зараханных и экстракты кз зараженных платок Кребо-2, соответственно; -ПК - АОУ-лреинициаторный комплекс (Мет-тРНКфаг • с1Г-2 . ':()*- субчастица рибосомы); мРНК кл - суммарная клеточная пошЧА)--РНК из клеток Кребс-2, дсРйК-двуспяральная РНК, 5-НТО -5-нетрачслп-руемая область мРНК, ОТР - открытая для трансляции рамка, йФ - ини-циаторный фрагиент (часть 5-Н'ГО РНК ЗЭЖ), ннл-куклеотид, ПААГ - ло-лиакриламидный гель, ДТТ - дитиотрзит, СА -

I. МЕХАНИЗМ УГНЕТЕНИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ПРИ ИНФЬКЦИИ ВЗ'.Ш.

1.1. Синтез белков в клатках Крабс-2, зарзкенных ЕЭМК

Инфекционный цикл ВЭШ в клатках Крчбс-2 составлязт около 7;5 ч и завершается лизосои клеток. Угнетение синтеза белков выявляется на относительно поздних сроках инфекции: пульсоЕся Еклычаниз ыачс^ ных аминокислот начинает снижаться только к 3,5 ч инфекции, пссла

чиго интенсивность синтеза белков быстро падает, достигая 50-605» от контроля к 4,5 ч и 20-25$ к 5,5 ч инфекции.

Чтобы количистгенно оцепить соотношение клаточннх и вирусных полипептидоз, мы использовали метод В^а^ , 1974),

позволяющий рассчитать это соотношение по коэлектрофорограммам Ц -меченых белков зараженных клеток и Н] - иечаных балков незаракен-ных клитск. Расчет строится ьа предположении, что радиоактивность, обнаруживаема,! в зонах геля, свободных от основных вируеспацифичас- " них. белков, определяется клеточными балками, синтчзируамыми в зараженных клетках.

Анализ качественного (рис.1,а) и количественного (рис.1,б; состава лолипептидов, образующихся в заракьнных клетках, показал, что пероключиние клеток на сиитез вирусных полипептидов начинается до того, как стан^ится заметным еншнив интенсивности белкового синтеза, и происходит путем постепенного завещания синтеза клеточных белков вирусспецифичискиа синтезом. В первые чаоы посла заражения, оинтаь вирусных и клеточных белков идет одноиренанно, • к ^ часам доля вирусных балкоз достигнет 50$ и только через 4,5 ч ыюэь образующиеся полипептиды представлены в основном аирусспаци^ическими продуктами.-При лом синтоз есэх клеточных белков торгозится равномерно.

Начиная с 3,5 ч развивается прогрессирующее угнетенна тотального синтеза белка, резкое падание синтеза как клеточных, так и вирусных балков. Доля вирусспецифичаоних продуктов к 5,5 ч инфекции достигает 70$.

Такил образом, процесс "сманы матриц" в системе "ВЭ«АК - клетки Кребс-2" происходит путем постепенного замещения клеточного синтеза вирусспецифичоским на фоке прогрессирующего снижения общей балок-синтеаируюа'ей активности клзток.

16 -к _

§

сх м

я «

о

к ь

о ■ ,

время после заражения

ж

Рис.1. Синтез балков з клетках Кробс-2, зараячннкх ВЭМК

СА^ Балки, рингвоирущивсл через 2,5 ч и 4,5 ч чнфскцли.

Клерки метили по методу "пульс-чейз": инкубировали со сиасыо - амиьокислот 30 иш:, затем еще 30 иик со ЮО-кратним

избытком нямаченых алинокислог. Клетки разрушали 0,1^-ным

тритонов Х-100, ядра удаляли, белки осаждали ацатоноы и

растворяли в ДСЧ-содаржащеы буфере для электрофореза. ¿елки

анализировали в 7,5-2Г$ ПДАГ, на каждый трек наносили

50000 иип/иин [^с] - балков. Клетки ¡летали (а) с 2 до 2,5 ч

инфчкции, (6} с 4 до '>,5 ч инфекиии. I л 4 - кезаразвкныа

клетки, 2 и 3 - зараженное клетки, I к 2 - "пульс"; 3 и 4 -

- "пулъс-чойз".

(Б) Относительная интенсивность синтеза клеточных и гирус--специфических полипептидиэ в зараженных клетках. Урсван!-синтеза белков в зараженных клетках выражен в процентах от синтеза в незарежзнных клатках. I - готалькиЯ синтез белков,

2 - синтез клеточных белков, 3 - синтез зйрусслзцифичаскчх белков. Кривая I рассчитана по включиьию С аыинокислот .

в зараженные и нззаражонные клетки (.15 мин 37°). Кривые 2 к

3 рассчитаны по электрофорегряммач, полученный, цоц козлактпо форазе ]-иаченых белков из незаряженных к |.-4С: -ночиних оалков из зараженных плеток (рзхдая течка - среднее из 3-х независимых ояытов).

- 10 -

1.2. Способность экстрактов из заоаканных клеток (ГчЗК) трдчслироьать клоточныи ц?НК (мРНКкл).

К началу исследований л литературе сложилось представление, что в результата пикорнавирусной инфекции происходит модификация транслирующего аппарата клзток, которая приводит- к нарушении инициации трансляции мРНКкл, ко не угнетает, а возможно, стимулирует трансляцию пинорнавирусных РНК. Мы проверили згу гипотезу в прямых опытах на мо/ели "ВЭМК - клетки Крибс-2. Была изучена способность экстран-тоз, выделанных из зараженных ВЗЫК клеток транслировать мРНКкд(Табл. I).

ТаЗлига I

Трансляция РНК ВЭ!1К и иРНКкл ь экстрактах из иезаракенпих (ЗНЗК) и заражаьных клеток (Э31С.)

te Щеточник экст- ¡Эндогенное¡Включение в присутствии экзогеа-опыта! ракта !включение I_ных матриц_

! 1 i ; i ¡ ! РНК B3V.K i «РНК

1 казараженнце яарг.кеннне 1217 412 I3I44 5812 6542 2401

2 иезараженные заракенннч . 2556 731 I39I6 7773 6Э87 5526

3 назараханные зараконные 5128 735 25465 5240 15097 5375

Болокскнтазируювда экстракт (фракции Sgg) выделяли из зарьхен-ных и назаражанных клеток через 4,5 ч инкубации при 37е. Для оозобож дения от эндогенных матриц экстракты праинкубировали 30-45 мин при 37° в условиях, при которых происходит завершение начатых полипептидов цепай, но на происходит инициации новых (.5 u!,l и 125 u.V. KCl). Зятем, путец сиены ионного состава экстрактов хроматографией на Софадяксе 0-25 (грубый), создавали условия, разрешающие инициацию (.3,5 Mf.i MgC^ и 85 ыМ tíCIy, и вносили'экзогенные мРНК-сщмарньк

поли(А)-РНК. из незараионныхпклаток КреСс-2 или ГЬК ВЗМК. Включение [I4cj -лизина (имп/мшО, 37 , 60 ниц. Пробы содержали 0,8-1,2 ад

А260 проинкубированной фракции 5*30, 4,5 миг PliK ВЗМК или 4,0 мкг

üPHK л (в оп. К; 1 - 3,0 мкг мРНКас).

В первую очередь нас интересовал вопрос, будет ли у экстрактов, выделанных из зараженных ВЭМК клеток, избирательно снижена способность транслировать мРНКкл. На этот вопрос был получен четкий отрп-цательнь . ответ: относительная эффективность тр&нелчции мРНКкл по сравнению с РНК ВЭМК в ЭЗК были не нихэ, а как правило, даже выше, чен ь ЭНЗК. Следовательно в ЭЗК ест** все фактсры, необходимые для трансляции ыРНКкл. Результат был зесьма неожиданным, противоречил сложившиеся прелстаБланиям, а потому был подвергнут тщательной проверке. Проверялось предположение, что и зараженных клетках образуется некий фактор-ингибитор инициации и?ККгл, который теряется или ин-активируется при приготовлении ЗЗК. Однако, при бсйх модификациях опыта (при снижении теипорахуры с 37° до 30°, при истользовании фракции ¿10 вместо .$30, при исключении стадии прзиккубации пли стадии гельфильтрацик) результат стэйьо воспроизводился: инфекция ВЭМК нэ приводит к избирательной потере способности ЭЗК транслировать

"РНККЛ-

В то же время свойства ЭЗК и ЭНЗК не идентичны. Основное отличие заключается в общей (настзбиратолькои} снижении активности ИЗК при трансляции эндогенных и екзогеньызг и?ПК клеточного или вируенто происхождения. Это свойство ЭЗК, по-видимому, отражает прогрессируйте в снижение белоксинтезирующей активности в зараженных ВЭгЛК клетках

Итак, избирательное угнетенна синтеза клоточиыу белков дрл инфекции ВЭИС (а) развивается на фоне общего снижения активное*'** транслирующего аппарата, (б) не связано с инактивацией г.радсуществу-ющего фактора, необходимого для трансляции иРНКК1, но не для РНК ВЭМК, (в) не связано с образованием ^(¿иоуо фактора, препятствующего считыванию мРНКкл, ио не РНК ВЭ1£К. Скорее всего специфичность транслирующего аппарата БЭ^К-зараяоннкх клчток по отношению к и РНК ' не изменяется.

В этой ситуации наиболоа простым объяснением угнетения синтеза клеточных белков и предпочтительного синтеза вирусных балков в ВЭШ-инуицированных клетках могло бы быть разрушение или функциональная инактивация клеточных кРНК.

1.3. Состояние нРКК л в зараженных ВЗ!.!К клетках.

Обычно пришшаатся, что угнетение синтеза клеточных балков при пинорнавирусной инфекции ни связано с распадом или инактивацией мРНК . Однако ото утверждение базировалось на косвенных данных,и важно было прослабить судьбу мР11Ккл в зараженных клетках в прямых экспериментах. Были изучены стабильность предсинтезированных иРНК(Д . в зараженных клетках и функциональная активность мРНКкл, выделанных из зараженных клеток.

Чтобы изучить судьбу предварительно моченной мРНКкл, пульс-ма-ченныа радиоактивным уридином клотки подвергали так называемому "холодному чейзу" - длительном инкубации на холоду с избытком намеченных уридина и цитозина (Магьки^, , 1973). В отличив от

* с

простого разбавления матки намечанным уридином, "холодный" чейз эффективно прекращает включение метки в РНК при дальнейшей инкубации при 37е. Сравнивали РНК, выделенные из зараженных и незараженных клеток через 4,5 ч инкубации при 37°. Характер распределения иРНК из зараженных и незаражеиных клеток в ШАГ оказался очень сходным (Рис.2). Имеющиеся незначительные отличия в зоне быстродвияущихся РНК, сглаживаются при дальнейшем повышении эффективности чейза с помощью кордицапина.

Таним образом заражение клаток ВЭМК не ведет к ускоренному, рас-' паду мРНКкл. Одновременно с нами сходные результаты были получены на клетках ¡_ > зараженных вирусом меиго ( Со(&у а-/., 197*0.

Для определения функциональной активности мРНК „препараты

л ь

а о

й ^

га о

Л» л ч

Ног/еоа . оакчи":

Рис.2. Коэлектрофораз полн(А.)-содср::'.ацих РНК, выделенных из зараженных (•-• ) и незараженннх (о-—° ) клаток.

Клв УР"

тетки раздолялп на, дно порции, одну метилиг, (I ч 37°) [зн7 ридиноц, другую [14С] -уридином. Меченные -уридиноа

клетки заражали ЗЭМК, и зарцкенныа и незараженные клетки инкубировали в сродо с немачонными уридиноц и цитидинои при 4° 12-14 ч ("холодный" чеЛз), а затем при 37° 4,5 ч. Обе порции клеток объединял«, выделяли поли(А)содоркацуи РНК и анализировали аа в градиентном 2- 6,75>а ПААГ. По оси ординат радиоактивность каждой фракции в процентах от общей радиоактивности, обнаруженной в гелз.

поли(А)-РНК выделяли из зараженных ВЭМК клеток и транслировали в ЭНЗК. Активность препаратов через 4,5 инфекции составляла в разных опытах от 80 до 140$ от активности контрольных РНК. Это еще ничего не говорит об активности собственно м?НКкл, т.к. в препаратах поли (А)-РНК содержатся и впрусспецифическка РНК. Оценку Еклада различных форм РНК проводили путан фракционирования препаратов в градиьнте концентрации сахарозы с последующим определением матричной активности каждой фракции (Рис.3,"а,б). Трансляционный профиль полиШ-РНК из зараженных клеток отличается от контрольного наличием трех зон-с

Рис.3. Трансляционные профили поли(А)-содержащих РНК, выделенных из

назараженных (а) и зараженных БйИК (бJ клеток.

Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы (5-20$);

(--) - оптическая плотность; (-------) - стимуляций

включения ["с} - лизина при добавлении в бесклеточную систему 10 мкл соответствующей фракции (ци^ры дани за вычетом эндогенного сключения).

разной активностью. Пик максимальной активности находится в зона 37^ вирусной РНК, второй пик активности соответствует легким (легче

1&?рРНК) мРНК . Материал из области I8S-285 обладал крайне низкой активностью или даже угнетал остаточное включение ЭНЗК. В этой зоне наряду с !»РИКйЛ сядшентаруют двуспиралыше формы вкрусспвцифи«8ских РПК-РФ (20£) и РД (>205), и ингибирующий эффект, по-видикому, связан с их присутствием. Ингибирующва действие дсРНК на транслирующий аппарат клеток Крабе-? было показано рани« {Roitrison , tlo-thws . 1973).

Действительно, после удаления дсРКК на целлюлозе. CP-II (Эрик-

сон, 1972J з 3-7 раз повышалась активность полиШ-РНК зар&'-.анных клаток и только на 10-20/» активность контрольных РНК. Очищенные от дсРНК nj- 'параты дважды фракционировали в градиоктах концонтрации сахарозы, .обирая материал, содииантирующиЯ медленнее 18$. После такой очистки эффективность трансляции "легкой" иРНК{Л, из зараконных клаток и анг логичной фракции мРНКчл из незарадснных клеток существенно не отличается. Поскольку синтез всех клеточных белков в инфицированных клетках угнетается равномерно (см. раздел I.IJ, этот вызод мояно экстраполировать и на тяжелые нРККкл.

Несколько другие данные были получены в работа {¡MwiCiïCC , eThack% 1974;: клеточная JOS'РНК, выделанная из зараженных ВЭ;Ж клаток плазмоцитоиы, транслировалась в экстрактах клеток Кребс-2 примерно в 2 раза хуже, чэц контрольная tiPHK. Можно предположить, что снижение активности связано с примесью дсРНК в препаратах 105РНК.

Итак, в клетках Крабс-2 поело-их заражения ВЭ!„К, на происходит ни ускорения распада предшествующих мРНК, ни их на обратимой инактивации. Клеточные мРНК остаются потенциально активны:«!, но лорестают транслироваться. Позднее было показано, что они сохраняются в зараженных ВЭ;.!К клетках в вида 100 ¿'-комплекса (Куроедов и др., 1981}.

1.4. Конкуренция мРНК л и РНК ВЭМК in vitro : моделирование вирусиндуцированного угнетения синтеза клеточных балков

Поскольку ЭЗК сохраняют способность транслировать м?НКкл, а клеточныа мРНК зараженных клаток сохраняют способность транслироваться in y!¿го , возникает вопрос, почему в зараженных ВЭМК клетках транслируются преимущественно вирусные РНК. Наиболее прсстое объяснение состоит в том, что РНК ВЭМК исходно имеет некие преимущества по сравнению с мРНКкл при взаимодействии с транслирующим аппаратом клаток Кребс-2, а потому, когда в платках одновременно при-

сутствуют матрицы двух типов, транслируются предпочтительно вирусные И1К.

Косвенно на такую возможность указывала значительно Солео высокая эффективность трансляции ?НК ВЭ1.1К по сразнени» с моточными иРНК, а также ее способность транслироваться In vilrc в более широкой диапазоне соловых концентрации, чем ыРНКкл.

Способность РНК ВЭМК успешно конкурировать с иР11Ккл была впервые продемонстрирована в работе {Ltxwiencc , ^bacfi , 197*0, при трансляции in п'тго смеси матриц -IOS'uPHK клеток плазмоцитомы и РНК ВЭМК.

В наших опытах было показано, что конкурентное угнетение >№НКкл происходит при совместной трансляции в экстрактах клето.ч Кробс-2 гомологичных мРНК и РНК ВЗ:.;К. Может ли этот эффект, наблюдаемый ih vitro при произвольно выбранном соотношении клеточных и вирусных мРНК объяснить избирательное угнетение синтеза клеточных белков in VI /о ? Необходимо было выяснить, происходит ли конкурентное инги-бирование клеточных мРНК при тех соотношениях вирусных и клеточных матриц, которые реально существуют в зараженных клетках.

Мы изучали эффективность трансляции ыРНКкл в составе суммарной поли(А,)-РНК. из зараженных клеток, которая является естественной смесью клеточных и вирусспецифичаских РНК и содержит их в соотношениях, близких к имеющимся в цитоплазме зараженных клеток.

В состава суммарной поли(А)-РНК, выделенной из зараженных клеток через 4,5 ч после начала инфекции, мРНКкд транслируются с крайне низкой эффективностью. Однако и эффективность трансляции.вирусной РНК восы.ш низкая (Рис.4,а}. После удаления дсРНК на целлюлоза СР--II резко возрастают эффективность трансляции вирусной РНК, но активность иРНКкд остается на низком уровне (Рис.4,б^. Содержание 37У вирусной РНК в этом препарате не превышало 15—20^». Этого количества

оказалось достаточно, чтобы подавить трансляцию иРНК . Посла удаления 37^ РНК активность и?НК„_ полностью восстанавливается (Рис.4,в).

Рис.4. Трансляция полиШ-РНК из зараженных клеток при последовательной очистка от зирусспецифичезких РНК.

(а) Суммарная полиШ-РНК: (I) РНК ВЭг.'.К; (2} баз экзогенных РНК; (3) поли(А)-?НХ из нозараненних клеток; (4) поли(А)-?НК из зараженных клеток, (б) ЛолиШ-Р.ЧК поело удаления дсРНК на СР-П: (I) без экзогенных РНК; (2) поли(А)-РНК из незара-канкых клеток; (3) поли(А)-РНК из зараженных клеток: (4; РНК ВЭ.МК; (5) белки ВЭ.МК, синтезированные ¿я "''го . (в) Поли(.А) -РНК после удаления Ъ1д РНК: (I) РНК ВЭ'.Ж; (2) без экзогенных мРНК; (3) "легкие" поли(А)-РНК из пазаракошшх клеток; (4) "легкие" поли(А)-РНК из зараженных клеток; (5) белки 331!К, синтезированные ¿п \Sivo .

Таким образом в ЗНЗК программируемых поли(А)-РНК из эаранзнных клеток, воспроизводятся два эффекта наблюдаемые в ВЭМК-инифицирован-ных нлатках: I) преимущественная трансляция вирусных и избирательное угнетение трансляции клеточных мРНК, С2) общее угнетение синтеза балков.

а

Нужно отметить, что обуае угнетенна трансляции при моделировании ih \-iiro оказалось более глубокий и болаа ранним, чам в зараженных клитках. Не исключено, что это связано с искусственным увеличением количества двуспиральных последовательностей, происходящим при выделении PIiK, за счет комплементарного взаимодействия плюс и минус нитей РП. Возможно, что invito PI1,-на имеет достаточно протяженных • двуспиральных структур, а двуспиральная РФ, как пзвистно, накапливается только к концу рапликативного цикла {Ct[ma. . ¿hrenfe¿d % 1974;.

Модельные опыты показывают, что регуляция синтеза балков в зараженных BjUK клитках Крабс-2 обусловлена в порвую очоредь накоплонивм вирусспаци[ических РНК, причем 37.? РНК ответственна за избирательное угнетение трансляции иРНК л, а дсРНК может вызывать общае ингибирова-ние трансляции.

1.5. Уровень образования преинициатсрного комплдкса и (.1ат-тРНКфат-связиваю!цая активность фактора e-IF -2 в зараженных ВЭМ клетках.

Как правило, обще'о кнгибироьание синтеза балков связано с там или иным нарушением ранних стадий инициации трансляции, приводящих в конечном счете к угнетению образования комплекса иницкаторной Мат-тРНКф!ет с 40 <7 субчастицей рибосомы, так называемого "преинициа-торного комплекса" (4й5*-ПК,). Таков механизм угнетения трансляции в лизатах ретикулоцитов в отсутствии гемина, под влиянием дсРНК, при дефиците ATP, а также в экстрактах, обработанных интерфероном кла- ■ ток, под влиянием дсРНК.

Мы исследовали уровень образования 40У-ПК в зараженных ЗЗЖ клетках на разных стадиях инфекции, характеризующихся различной интенсивностью синтеза банков (Рис. 5 и б).

а м : 4 1 Я\ Л! (» ' 1

к к л ' 1 " 1 1 1 ^ 1 1 ыб : <г :: Т Г1 1 ! "^"""Ч.-'у / Ч? ь-

Нис. б.

Рис.5. Образование 40^-ПК через 10 ит. (а), 2,5 ч (б), 3,5 ч (в) и 5,5 ч (г) инфекции.

Зарахенные и незараженные клетки инкубировали 5 мин о цикло-гексииидом (МО мкг/мл), метили -матионином и разрушали тритоном Х-100 в изотоническом буфере. Цитоплазматические экстракты фракционировали з градиенте 15-4070 концентрации сахарозы. Радиоактивность каждой фракции определили поело осаждения 1^-ныи цетавлоном (бромистым цетилтриметилаымони-ем).

Рис.6. Эффективность синтеза белков (•-• ), образование -ПК

(о-----о ), и скорость поступления [ н] -метионина

(я------я ) в зараяенные клетки (в % от контроля).

По мера развития инфекции уровень ^ОЯ -ПК снижается (рис.5) причем наблюдается хоровая корреляция между уровнем синтеза балков и содержанием ВД^-ПК (рис.5): до 2,5-3 ч интенсивность валового синтеза белков и эффективность образования -ПК сохраняется на

исходной уровно, а в период между 3,5 и 5,5 ч содержание 405 -ПК и белоксинтези^.к.ая активность падают синхронно, снижаясь до 20^ от исходного уровня к 5,5 ч инфекции.

Кроыи того, было обнаружено, чти в зараженных клетках существенно меньше образуется £3н] -Иот-тРНК и комплексов [ %J ~"''0T"T?liK с белковыми факторами трансляции (гетерогенный материал, седимантирув-

щий медленние 40,5' -субчастицы). Двукратное снижение [ Зн] -Мет-тРНК происходит уже через 20-30 чин после начала инфекции и является, таким образом, наиболее ранним изменением из когда-либо наблюдавшихся в зараженных пикорнарирусами клетках. До 3-4 ч инфекции количество [Зн] -Мет-тРНК остаотся на сниженном, но постоянном уровне, а к 5,5 ч катастрофически падает (рис.5.). Было выяснено, что эффект Н9 связан с нарушением проникновения l^h] -метионина в зараженные клетки: до 4 ч инфекции поступление f -матионина на отличается от нормы и только к 5 ч снижается на 20-40;» (рис.б).

Возможность того, что снижение уровня 1.1ет-тРНК может быть связано с функциональной инактивацией тРНК, как это описано для других случаев ( Веder , Stiers' . 1973; ifeKqjct ei dJy. , 1989), мы про' веряли, сравнивая способность препаратов тРНК из зараженных и ноза-раженных клеток (1) поддерживать трансляцию в тРНК-зависимой системе; (2) акцептировать меченные аминокислоты.

Эффективная тРНК-зависш.;ая система была получена из зародышей пшеницы путем пропускания экстрактов через ДЕАЕ-цеЛлюлозу при 0,3 М KCl. Добавление экзогенных тРНК в 20 и более раз стимулировало транс ляцию мРНК из клеток Крвбс-2 или РНК растительных вирусов BTU и ВМК в этой системе. РНК ВЭМК оказалась не способной транслироваться как в исходных, так и в тРНК-зависимых экстрактах зародышей пшеницы, снабженных асцитными тРНК, и поэтому не была использована в этих опытах в качестве матрицы. Этот факт несовместимости мРНК и транс-

- 21 - •

лируюдей системы мы не подвергали более детальному исследованию, однако он интересен саы по себе, поскольку указывает на существование специ^и- тских требований РНК ВЭ1.1К к белоксинтеэирующому аппарату.

Препараты т?НК, выделенные через 4,5 ч инЛакции подчеркивают трансляцию в тРНК-зависимой системе столь ха эффективно, как и тРНК из гезараже. них клеток. Незначительное (около 15/») снижение активности тРНК наблюдается только через 5,5 ч инфекции. Акцепторная способность тРНК снижается также только к 5,5 ч инфекции (на 15-20/а), когда количество [ ^ti] -Ыат-тРНК в зараженных клетках в 20-30 раз ниже, чек в контрольных.

Таким образом снижение уровня Мет-тРНК в зарезанных клетках па связано с инактивацией тРНК, и его причины остаются невыясненными.

В свою очередь, снижение уровня Мат-тРНК на является, по-види-иому, причиной угнетения образования 405-ПК в зараженных клетках, поскольку между этими процессами не наблюдается корреляции (рис.5,).

Ключезу» роль в образовании 40^-ПК играет фактор инициации а1Р2, осуществляющий присоединение !.(ат-тРНКф0т к 40-S субчастица через промежуточную стадию тройного комплекса [рат-тРНКф31 • о1Р2 • GTPj . Обычно угнетение образования 40^-ПК происходит в результате инактивации фактора aIF2 и развивается в такой последовательности ( Saftr ,¿OL^iis , 1981).

Воздействие, угнетающее Фосфорилирование Нарушение взаимотрансляцию -— сА-субъединицы—»-действия ell-'2 с

е1Р2 кофакторами

XelT-2-гЪ)

Накопление неактивного Потеря elf2 способнос- Угнетение образова-

комплекса eIP2 х GPP-тк связывать -— ния 403 -ПК

Мет-тРНК"9Т: нарушения Ф

образования Мет-тРНКМат • eIF2-9TP

Ми изучали влияние инфекции ВЭ1.1К на Мот-тРНК-связываюцую активность а1Р2. Было показано, что е1Р2, выделенный через 5,5 ч инфекции, когда в заращенных клетках почти нецело подавлено образование АО^-ПК, полностью сохраняет способность связывать Мет-тРНКф8Т ш -/¡{го (рис. 7,а).

Можно высказать два предположения: падение уровня 40£*-ПК происходит либо (I) в результате потори способности е1Р2 связывать тройной коиплекс с ^03 субчастицей, либо (2) в результате изменения сос-

I 5 Т V

Рис.7. Активность е1Р2 из зараженных клеток

(а) Связывание [°HJ - М«т-тРНКфвт в препаратах еХР£ , выделенных из незаражекных ) и зараженных клеток (о) через 5,5 ч инфекции. Активность в1Р2 тестировали в составе суммарных факторов инициации (elP^), получаемых путем промывки рибосом 0,5 to KCI с последующий осаждением, сульфатом аммония 170#). Инициатооную тРНКф , очищенную от элонгаторных тРНК, ацили-ровали [°н] -цетионином (си.раздел 3.1), и образование тройного комплекса [Мет-тРНКф81 • eIF2 • G-TPj тестировали на нитроцвллюлозных фильтрах (Рапи » Wool, 1976).

тава внутриклеточной среды (возникновения неблагоприятных ионных и/или энергетических условии). Чтобы выбрать между этими предположениями; !.' ! изучали образование 40о'-ПК Ln vi}го , в ЭЗК и в ЭНЗК, помещенных в стандартные (оптимальные для трансляции »"'^у ) ионные и энергетические условия. Как видно на рис.7,б, в ЭЗК и ЭНЗК, помеченных ¡ идентичные условия, образование 40У-ПК происходит одинаково эффективно. Полученные данные свидетельствуют w функциональной стабильности éIF-2 и других макромолакулярных компонентов ПК зараженных ВЭМК клетках. ;

Угнетение образования -ПК 1п ч'МО связано, по-видимому, с изменением состава внутриклеточной среды. Это там более вероятно, что во второй половине инфекционного цикла проницаемость плазматической мембраны повышается и состав внутриклеточной среды меняется (Carrasco ,1978, Botris il ¿t- , 1977;. Известно также, что инициация трансляции крайне чувствительна к незначительным колебаниям соотношения ADP/ATP и 9РР/&ТР в цитоплазма клаток {Uucui et&¿-. , 1985;.

Таким образом, общая интенсивность синтеза белков в клетках Кребс-2, зараженных ВЭМК, регулируется на уровне образования 40£-ПК. При этом подавление образования WS'-IIK не связано с инактивацией фактора eIP-2.

1.6. Заключение

Вирусиндуцированное угнетение синтеза клеточных белков является универсальным явлением,.сопровождающим пикорнавирусную инфекцию, однако, скорость, глубина и последовательность событий зависят от конкретной темы "Зирус-клетка". Две наиболее интенсивно изучаемые системы "ПВ-клетки 'Htld- " и "ВЭМК-клетки Кребс-2'1 стоят на крайних полюсах в отношении динамики синтеза белков. ПВ вызывает раннее глу-

бское угнетенно синтеза клеточных болков, наступаюдео до начала интенсивного в:..,уссг.оци¿лческого синтеза. В клетках Кребс-2, зараженных BXIK до нечала заметного синтеза вирусных Оолков вообще не происходит сниконин синтеза клеточных белков и только с 2-х часов инфекции одновременно начинается нарастание синтеза- вирусных белкоз и нригрессирувдоа угнетение клеточного синтеза при неизменном уровне тотального синтеза белков. С 3,5 ч инфекции начинает снижаться об-' щан болоксиНтззирующая активность клеток: падает синтез как клеточных, так и вирусных белков, i./и этой доля вирусных полипептидов в валовом продукте продолжает нарастать, достигая 70-75-S к 5,5 ч инфекции.

Как в клетках HtLa . зараконных ПВ (см.Zhrtnjttci , luno/, 1979), так и в клетках Кробс-2, зараконных BSUK, клеточные мРНК остаются структурно неповрежденными, и, после извлечения из клеток, способны транслироваться In vitro .

Различии в динамике синтеза клоточнис белкоз при сохранении целостности и потенциальной активности клеточных мРНК свидетельствует о том, что причины угнетения синтеза клеточных белков в этих двух системах скорее всего различны. Действительно, экстракты из зараженных ВЭЫК клеток Кробс-2 сохраняют способность транслировать клеточные мРНК, тогда, как экстракты из зараконных ПВ клеток Hela транслируют вирусные РНК, но на способны транслировать клеточные ¡¿РНК (см.Koch , Koch ,1985). По-видимому, в инфицированных ВЭШ клетках Кребс-2 сохраняется исходная специфичность транслирующего аппа- ■ рата, тогда как в инфицированных ПВ клетках Ue/a белоксинтезирую-щий аппарат модифицируется. Было показано, что модификация выражается в инактивации фактора, необходимого для инициации трансляции клеточных мРНК, но не нужного вирусным РНК I QrL-fo e~t ,1983).

Что касаотся ЗЭМК - индуцированного угнетенна синтеза баллов, то оно в первую очередь обусловлено накоплением в зараженных клетках ли-русспецг "ических РНК. Избирательное угнетение синтеза клоточнгх белков происходит в результате конкурентного вытеснения из Селокслнта-зируюцего аппарата клешчных ¡¿РНК вирусными по море накопления последних. Зтсг. эффект наблюдается при внесении в экстракты из незара-зешшх клеток естественной снеся клеточнух и вирусных поли(Л;-содер-у.ащих РНК.

Начиная с 3,5 ч инфекции конкуренция вирусных и клеточных ыРНК протекает на фоне прогрессирующего снижения белоксинтозирукыий способности зараяоккых клеток. Хороиая норролнгия между уровнем --ПК и уровнем синтеза белков в зараженных клетках дает основание утверждать, что угнетение образования '(О^-ПК является непосредственной причиной снижения белоксинтезирующей активности зараженных ВЭМК клеток, или по крайней море, одной из основных причин. 3 тс де время изучение механизма общого угнетения трансляции у)-ггс> не дало однозначных результатов. Было показано, что дсРНК, внесенная в смеси с другим роли(А)-?НК из зараженных клеток, вызывает общее снижение белоксинтезирующей активности экстрактов. При этом роль дсРНК может состоять в простом связывании е1Р-2, имеющего к ней повышенное сродство ( Ха.е.то{ег ■е/Ь О^С. ,1982}. Но исключено, что этот эффект имеет место в клетках на самых поздних стадиях инфекции, когда накапливается ощутимое количество РФ. Однако, на более ранних стадиях инфекции ни прямое связывание е!Р-2, ни его каталитическая инактивация, индуцируемая дсРНК, не играют, по-видимому, заметной роли, поскольку показано, что фактор е1Р-2 и другие гакромолекуляр-ные компоненты -ПК не подвергаются инактивации, и, при помещении их в оптимальные ионные и энергетические условия, обрэзу ;т ¿л \1'пго нормальное количество 405*-ПК. Hai.6o.iae вероятной причи-

ной снижения уровня 'ЮЗ'-ПК и общего угнетения трансляции в зараженных клетках является вирусиндуцированное изменение состава внутриклеточной среды.

Тот факт, что преимущественная трансляция РНК ВоМК обеспечивается главным образом ее способностью успешно конкурировать с клеточными мРНК за белоксинтезирувщий аппарат клеток Кребс-2 ставит два основных вопроса: Ш какова роль факторов инициации в конкуренции вирусных и клеточных мРНК. (2) Какие особенности структуры РНК ВЭМК определяют ее преимущества в инициации трансляции по сравнению с' клеточными матрицами.

2. РОЛЬ ФАКТОРОВ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ В КОНКУРЕНЦИИ РНК ВЭМК И КЭПИРОВАШШХ мРНК.

2.1. Влияние eJF<f из заражонных клеток на раздельную и совместную трансляции кэпированных мРНК и РНК ВЭ..1К.

Сопоставление приведенных выше результатов с литературными данными давало основание предположить, что механизмы, ооаспечиваюдие преимущественную трансляцию пикорнавирусных РНК в системах "ПВ-клет-ки Не а" и "ВЭМК-клетки Кребс-2" различны. Экстракты и препараты е1Р из инфицированных ПВ клеток He¿a, способны обеспечить трансляцию РНК ПВ, но неактивны с кэпированными »РНК клеточного или вирусного происхождения. Было показано, что в клетках Не/а происходит инактивация aIF-4F ( 7аhara, et ,1981; Síchinson et a¿. ,.1982), фактора, непосредственно взаимодействующего с кзпом на 5-конце мРНК . и необходимого для инициации трансляции кэпированных матриц zt ,1983), но не пикорнавирусных РНК. Таким образом, процесс сиены матриц в зараженных ПВ клетках Hela осуществляется путем ви-русиндуцироваяной модификации белоксинте^ирующего аппарата.

Приведенные в раздело I данные свидетельствовали о том, что в зараженных ВЭМК клотках Кробс-2, по-видимому, не происходит модификации бо/оксинтезирующего аппарата. Чтобы проверять это предположение, мы провели сравнительное изучение активности суммарных eíP^, выделенных из зараженных и незараленных клеток. Оба препарата о.ТР^ с розной эф4активностью стимулировали трансляцию мРНК л в экстрактах клеток Крабс-2, обработанных микрококковой нуклеазой. Стимуляция трансляции РНК B3Í.1K также была одинаковой. Это свидетельствует об отсутствии инактивации факторов инициации е зараженных 33!,Ж клетках и хорошо согласуется с данными о сохранении способности ЭЗК транслировать мРНКкл (см. раздел 1.2). Однако нельзя было исключить возможность такой модификации eIP¿r, которая давала бы односторонние преимущества вирусным некэпированйыа РНК при их совместной трансляции с кэпированныии ыРНК. Поэтому мы изучали влияние el?^ из зараженных и нозараженных клеток на трансляционную конкуренцию мРНК глобина к РНК ВЭМК (рис.8). В присутствии РНК В5МК трансляция мРЛК глобина подаз-ляется, а добавление восстанавливает трансляцию аРНК глобина,

причем elPy из зараженных и незараненных клеток одинаково эффективны. Аналогичные результаты получены при использовании вмосто мРНК глобина суммарных мРНК из клеток Кребс-2.

Таким образом, в зараженных ВЭМК клетках Кребс-2 не происходит инактивации факторов, необходимых для инициации трансляции кэпиро-ванных мРНК, а также такой их модификации, которая могла бы приводить к снижению конкурентоспособности кэпированнкх мРНК в присутствии РНК ВЭМК.

Полученные результаты доказывают, что механизмы, обеспечивающие преимущественную трансляцию пикорнавирусных РНК в системах "ПВ--клетки Hela" и "ВЭМК-клетки Кробс-2", действительно различны. В . отличие от зараженных ПВ клеток Hola, в зараженных B3;.iK клетках

Се.-.ок л взруса «■ 1

ГЛО<5ИН а а в г д

Ркс.8. Влияние е1Рд< из зараженных клеток на конкуренцию между РНК ВЭМК и мРНК глобина, (а) ыРНК глобина; (6} РНК ВЭМК; (в-д) мРНК глобина + РНК ВЭМК; (г) из непаражонных

клеток; (л) из зараженных клоток (4,5 ч инфекции). ■

Кребс-2 не происходит изменения специфичности Селоксинтззируюцего аппарата, и преимущественная трансляция РНК ВЭМК обеспечивается, главным образом, за счет ■высокоэффективного механизма инициации трансляции РНК 'ВЭМК, позволяющего ой успешно конкурировать с клеточными мРНК. Объектом конкуренции являются немодифицировашше факторы инициации.

2.2. Влияние очадонннх факторов инициации на трансляционную конкуренции кэпированных ыРНК и РНК ВЭМК в нефракционироэанных экстрактах.

Когда кэпированные мРНК конкурируют друг с другом, объектом их конкуренции является а11-МР ( УЬасЬ , 1982). Так как этот

фактор не нужен для трансляции пикорнавирусных РНК, то очевидно, что

он не может быть объектом конкуренции между ними и копированными мРНК. Фактор, лимитирующий совместную трансляцию и дискриминирующий между к; 'ированными и пикорнавирусными РНК окончательно на идентифицирован, хотя есть указания на e'lF-43 ( ßoii-vi ,1976) и elF-2 ( Roten et яД ,1982). Для поиска лимитирующего фактора обычно неполную фр£кционированныв системы, в которых инициацию могут лимитировать не те компоненты, которые реально лимитируют еа in viv'o .

Для изучения роли факторов в конкуренции мы считали целесообразным использовать нефракционированныч экстракты, в которых соотношения компонентов транслирующего аппарата в максимально возможной степени приближены к имеющимся в клетках. Экстракты клеток Кребс-2 насыщали смесью РКК ВЭМК и колированных мРНК (суммарных мРНК клеток Кребс-2 или иРНК глобина) и обогащали факторами инициации. Факторы eIP-2, eIP-3 и eIP-4B, выделенные из солевой промывки ретику^оцитных рибосом, были функционально активны в фракционированной системе и стимулировали индивидуальную трансляцию мРНК глобина и РНК ВЭйК в пересыщенных матрицами экстрактах. Однако, ни один из них, в отличив от alP^í , не снимает конкуренцию нейду клеточными и вирусными РНК (Рис.9). Эти данные свидетельствуют о том, что концентрация eIP-2, -3 и -4В в экстрактах клеток Крабе не лимитирует совместную трансляцию, и могут быть интерпретированы двояко: либо ни один из этих факторов на является объектом конкуренции между мРНКкд к РНК ВЭМК, либо среди них есть дискриминирующий фактор, но aro активная форма возникает в результате взаимодействия с другим или, другими компонентами, которые находятся в экстоактах в лиг.'итнр.ующи;-количествах.

Р ПППП

-белок А

СГЭ —~ - - —— — — -глобин •

Рис.9. Влияние е1Р-2, е1Р-3 и е1Р~4В на конкуренцию между РНК ВЭ1.1К и мРНК глобина, (а) РНК ВЭ;Ж; (б) мРНК глобина; (в-е) РНК ВЭ!.!К+мРНК глобин; (г; е1Р-4В; (д) е1Р-3;(е) еХС-2.

2.3. Влияние различных ¿>ракций е!?.^ на трансляционную конкуренцию кэпированных мРНК и РНК ВЗМК.

Некоторые новые представления о характере конкуренции кэпированных иРНК и РНК ВЗМК были получены при использовании другого экспериментального подхода - при последовательном фракционировании

и изучении действия полученных фракций на совместную трансляцию матриц.

Препарат (балки солевой промывки рибосом из клеток Кребс--2, осажденные при 70/5 насыщении СА), делили на 2 фракции: е1Р$ 1 (25-40% насыщения СА) и е1Р5 П (40-70% насыщения СА). Фракция е1Р^ П, наряду с другими белками, содержит е1Р-4А и е1Р-2 с кофакторами и не содержит в1Р-3, е1Р-4В и е!Р-4Р, которые находятся во фракции е1р£ I. Обо фракции восстанавливают трансляцию мРНК глобина в при-

сутствии PIIK ВЭ'/IK, однако характер их действия различен (Рис.10,А). В присутствии elF^n возрастает относительная доля глобина з суммарном продукта и увеличивается абсолютное количество всех синтезируемых белков. Конкуренция мехду РНК ВЭМК и глобкновоп цРНК (или мРНК из клеток Кребс-2) полностью снимается. Удаление elf—'»А из olP^. П с псмсцыо хрокатографии на фосфоцеллюлозе, не снижает способности П восстанавливать трансляцию мРНК глобина.

Таким образом, elP^r П содержит фактор, лимитирующий совместную трансляцию копированных мРНК и РНК ЗЭмК и являющийся объоктом их конкуренции и (или) содержит фактор, повышающий концентрацию эффективной формы этого компонента в экстрактах. Очовидно, что elP-'+A не н?.~ ляется фактором, имитирующим совместную трансляцию jярусных и клеточных матриц.

Фракция al?g I не стимулирует индивидуальную' трансляции гло-биновой мРНК, уморонно угнатаот индивидуальную трансляцию РНК BSi.'.K и сильно влияет на совместную трансляцию частиц. При этом конкуренция между ними не снимается, но ее результаты меняются: в экстрактах, обогащенных elP^ Г, транслируется преимущественно глобиповая мРНК, а трансляция РНК ВЭМК подавляется (Рис.ЮА). Восстановить трансляцию РНК B3UK можно внесением elP^f П (РисЛСА, и). Суммарные мРНКкл также угнетают трансляцию РНК ВЭМК в обогащенных alP^ I экстрактах. Следовательно elF^ I содержит фактор(ы), делающие кэпиро-ванные мРНК более сильными конкурентами и (или) избирательно угнетающие инициацию РНК ВЭМК.

Описанные эффекты не специфичны для факторов из клеток Крабе-?: фракции elP g I и elP^ П, полученные из el^y ретикулоцитов кролика сходным образом влияют на конкуренцию вирусных и клеточных мРНК.

При дальнейшем фракционировании е!Р3/ I в градиента концентра-

А

(1Р0 кЛ)-

|ЗИзй и

:. i

» ••90

ей в г д е ж 8

аовгдежз, и

Рис.10. Влияние различних фракций е1р£ на конкуренцию между РНК ВЭМК и мРНК глобина.

А. Влияние в1Р5 (?(>> СА), е1Р^ I (25-<*С$ СА) и е1Ру П (40-70£ СА): (а) мРНК глобина; (б,з) РНК ВЭМК; (в-ж) мРНК глобина + РНК ВЭМК; (г} в1Ру ; (д) е1Ру I; (о) е1Р^ П; (ж) I + П; (з) е1Р^ I.

Б. Влияние фракций, полученных при разделении е1Ру I в градиенте концентрации сахарозы: (а} ыРНК глобина; (6} РНК ВЭМК; (в-и) ыРНК глобина + РНК ВЭМК; (г; II; (д)

I; (е) фракция градиента из зоны >11,3^ ; (к) фракция градиента из зоны 5-6 5" ; (з) смесь фракций из зоны>11,Э5' и 5-8У ; (и) тот но материал, что в (з), но двойное количество.

цил сахарозы в 0,5 М КС1 (в условиях, при которых происходит диссоциация надмолекулярных комплексов; (РисЛО.Б) ни одна ив фракций на сохраняла присущей е1Ру I способности инвертировать результаты конкуренции. Фракция, садиментирующая между 5-Б 3 (содержит е1Р-4В и 42), восстанавливала синтез глобина, не угнетая трансляцию РНК ВЭМК (РисЛОВ, ж). Но при добавлении к ней материала, содшмнтирующего

быстрее 11,3 ^(зона седиментации eIP-З), который сам по себе но влиял на результаты конкуренции (Рис.103, е), эффект elF^ I восстанавливался: в экстрактах, обогащенных белками из этих двух фракций градиента, ..ранслируется преимущественно глобиновая мРНК, а трансляция РНК ВЭМК подавлена (Рис.МВ, с,и).

Таким сбразсм, хоросо известная способность суммарных elP^восстанавливать трансляцию копированных мРНК в присутствии РНК ВЭМК слагается из действия по меньшой море трех компонентов, по-разному влияющих на конкуренцию матриц.

В отличив от клеточных и большинства вирусных мРНК, РНК ВЭМК,

с копированными мРНК, вытесняя их из транслирующего аппарата. Судя по данным, приведенным в разделе I, этот механизм является центральным в обеспечении эффективной трансляции РНК ВЗ!.(К в присутствии избытка клеточных матриц, но чтобы адекватно оценить его значение нуя-но было выяснить сохраняется ли в зараженных ВЭМК клетках исходная специфичность транслирующего аппарата.

Было показано, что препараты еИ?^ , выделенные из зараженных клеток через 4,5 ч инфекции заметно не отличаются от е1Р5- из неза-раженных клеток по способности снимать конкурентное ингибирование кэпированных мГНК в присутствии РНК ВЭМК. Этот результат, полученный на суммарных е1Р5* (что практически исключает возможность утраты регуляторных элементов), позволяет сделать вывод, что в клетках Кребс-2, зараженных ВЭМК, преимущественная трансляция вирусной РНК обеспечивается баз инактивации и без такой модификации факто-

2.4. Заключение

как и другие РНК пикорнавирусов, на имеет кэпа на 5-конце. При этом скорость инициации у РНК ВЭМК выше, чем у кэпирочанных йА ,1978), и при совместной трансляции РНК ВЭиК.успешно конкурирует

ров, которая давала бы вирусным РНК одностронние преимущества, т.е. баз извинения специфичности транслирующего аппарата. Следовательно, в зароненных ВЭМК клетках Крабс-2 реализуется иной механизм преимущественной трансляции вирусной РНК, чем в системе "ПВ-клотки Hola", и основной составляющей этого механизма является, по-видимому, конкурентное вытеснение клеточных мРНК из транслирующего аппарата по море накопления РНК ВЭМК. Исключительно высокая конкурентоспособность РНК ВЭМК (см. раздол I.'f) может объясняться более высоким о о сродством к некоторым факторам инициации (eIF-2, е!Р-4В) по сравнению с кэпи-ровшишаи мРНК %V, ,1982; \

Sa»i(i , icha-ffrit* ,1978)..И хотя факторы, дискриминирующие между РНК ВЭМК и кэпировашшкк иРНК, точно не извостны, в литературе имоют-ся указания именно на эти два фактора. В наиих опытах добавление к экстрактам функционально активных eIF-2, eIP-З или elF-4B ко восстанавливало трансляцию глобиновой мРНК. или суммарных клоточных мРНК в присутствии. РНК ВЭМК. И хотя это однозначно указывает на то, что сами по сабе eIP-2, eIP-З и eIF-'t не лимитируют совместную трансляцию клеточных к вирусных PllK в экстрактах »«леток Кребс-2, это но означает, что ни одйн из них на участвует в дискриминации между матрицами Возможно, что активная форча дискриминирующего факзора возникает при взаимодействии фактора с другими белками (кофакторами), и лимитирующей является концентрация последних.

Для о1Р-2 известно, что после каждого акта инициации фактор освобождается в неактивной форма и для его регенерации необходимо взаимодействие с фактором eIP-2B ( HttÜ etal. ,1983), концентрация которого и определяет уровень активного о1Р-2. Если бы дискриминирующим фактором был е1Р-2, то в. нефракционированных экстрактах, предполагающих необходимость роциклинга е1Р-2, для снятия конкуренции матриц потребовалось бы в первую очередь повысите концентрацию

фактора aIP-2B.

Для изучения конкуренции кэпированных иРНК и РНК ВЭ.'.'К мы использовали последовательное фракционирование суммарных elF^ и опрадчле-ние влияния полученных фракций на совместную трансляцию патриц. Полученные из суммарных elPg две фракции - elP^ I и eIPs П активно влияют ча конк!ренцию матриц, причем действуют не одинаково. Фракция eIPs П не только восстанавливает трансляцию кэпированных мРНК в присутствии РНК 'ВЗМК (синтоз глобина увеличивался в 20-30 раз), но и значительно (в 2-3 раза) стимулирует трансляцию РНК ВЭМК.

Таким образом, е1Р^ П содержит дискриминирующий фактор (объект конкуренции кэпированных мРНК и РНК B3L1K) и повышает трансляцию в экстрактах в целом. Эти активности на связаны с фактором е1Р-4А,т.к. после его удаления из elP^ П на фосфоцеллюлозе, способность оставшейся фракции увеличивать суммарный синтез белков в экстрактах сохраняете.;,Посла удаления elP-^A во фракции elF^ II, наряду с другими балками, остаются е1Р-2 с кофакторами, аIF-4C и е1Р-5. Можно предположить, что оба наблюдаемые при добавлении elP^ П эфЬекта, связаны с увеличением содержания активной (обусловленной присутствием кофакторов) формы eIP-2: общая интенсификация трансляции может быть связана с первой функцией eIP-2 (присоединением образованием 'tQS' -ПК), а снятие конкуренции - со второй функцией eIP-2 (обеспечением присоединения мРНК к 40У-ПК). Проверка этой гипотезы требует дальнейших исследований.

Иное действие оказывает на совместную трансляцию клеточных и вирусных матриц фракция eIFs I. Обогащение экстрактов elPj- I приводит к тому, что РНК ВЭМК становится менее эффективной матрицей. Это особенно сильно проявляется в присутствии кэпированных мРНК: в условиях конкуренции транслируются преимущественно кэпированнка мРНК, а трансляция РНК ВЭ.'.Ж подавлена.

'1>ономон трансляционной конкуронции довольно хорошо изучен и создана модель '''дискриминирующего лимитирующего фактора" {ihc/ch ¿t&L, 1982), хорошо описывающая конкуренцию кэпированных мРНК друг с другом. Объектом конкуренции кэпированных иРНК является oIP-43?, и, в меньшей степени, eIF-4A, который, помимо самостоятельной функции,является субъединицией е1Р-4Р. При обогащении системы дискриминирующим фактором трансляция всех матриц возрастает, причем более сильные конкуренты стимулируются в большей степени, а болео слабые - в меньшей.

Соверионно очевидно, чти конкуренция между копированными мРНК и РНК ВЭМК имеет более сложный механизм и не может бить сведена к модели дискриминирующего лимитирующего фактора. Даже эффект elP^ П, внешне похожий на эффект лимитирующего фактора (стимуляция трансляции всех РНК), существенно отличается от него: при добавлении elPy П относительная стимуляция слабого конкурента (кэпированных мРНК) на порядок выше, чей относительная стимуляция сильного конкурента (РНК ВО:,III). Это свидетельствует о том, что до внесения е1Р5 П конкурентное давление было практически односторонним - со стороны РНК ВЭМК на клеточные мРНК, но не наоборот. И что совсем необычно, изменяя соотношение 'факторов инициации в экстрактах (в пользу факторов, входящих в elPg- I) можно РНК ВЭМК превратить в слабого конкурента и создать условия, при которых транслируются почти исключительно копированные иРНК.

Необычный характер конкуренции РНК B3UK с кэлированными мРНК может иметь только одно объяснение - существование различий в механизмах инициации кэпированных мРНК и пикорнавирускых РНК.

Несмотря на очевидное различие конкретных механизмов, обеспечивающих преимущественную трансляцию пикорнавпрусних РНК в системах "ПВ-клетни Hela" и "ВЭЦК-клетки Кребс-2", в них можно заметить глу-

бинноа сходство. Как способность РНК ПВ транслироваться модифицированным болоксинтезирующим аппаратом, неактивным в трансляции копированных i'PHK, так и способность РНК ЗЭМК вытиснять клоточныа м?ПК из наыодиф1дированного белоксинтазирующего аппарата, а также противоположный характер влияния различных фракции oIPj на копированные мРНК и РНК ВЭлЖ '-ри совместной трансляции - все это свидетельствует об одном и том же: о глубоком отличии механизма инициации кэпированнкх мРНК с одной-стороны и пикорнавирусных - с другой. Изучение особенностей инициации трансляции пикорнавирусных РНК тробует прежде всего изучения инициаторных участков этих РНК.

3. САЙТЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИЙ НА РНК ВЭНК

3.1. Получение инициаторной формил -метионил-тРНК':

Инициаторная мет-т?НКф8Т, у которой Л^-группа метионина блокирована формильной группой (ф-мат-тРНКф8Т) дзет ф-мат е ^-концевое положение синтезирующихся балков. В отличие от -^-концевого мет, ф-мет не отцепляется от растущей полипептидной цепи {Hausman .1970), что и позволяет использовать ф-мет-тРНКф0Т для обнаружения аминокислотных последовательностей (полипоптидов и пептидов), на- • посредственно примыкающих к инициаторному кодону, и определить число инициаторных сайтов, функционирующих на РНК.

При воспроизведении ряда методов {Ro^Bhandozy, yGhos'n. ,1968; Scbofittd' ,iarvtcniK ,1968\Ta'/>etzhL , Ufüta. ,1968; Stanley. , 1972), мы не получили препаратов ф - мат-т?НК"ат с высоким

уровнем аминоацилирования, необходимым для юс эффективного функционирования. Поэтому была прозадона оптимизация метода ацилированин о использованием очинённой икициаторной тРНЙог из клеток Крабс-2 и аминоацил-тРНК-синтотаз из Е.coli- . Было показано, что основным фан-

тором, определяющим полноту аминоацилирования, является не столько соотношение т?НК и аа-тРНК-синтетаэ, сколько их концентрация, и максимальная полнота аминоацилирования достигается при вполне определенной и весьма низкой концентрации тРНК. Оптимизация только этого фактора позволила в несколько раз повысить уровень аминоацилирования, хоти вклад других параметров также был весьма ощутимым.

Была предложена также эффективная модификация метода ферментативного даацилирования неформилированних молекул, позволившая существенно упростить и ускорить stj процедуру путей создания условий для проведения второй реакции непосредственно за первой без промежуточ- ' •ного зтапа выявления РНК из реакционной смеси.

В результате введенных модификаций были получены препараты с уровнем аминоацилировашшх тРН!Сф0Т существенно более высоким, чей тот, который обычно достигается Lh vitro .

Соответственно и эф5активность функционирования этих препаратов в бесклеточных экстрактах многократно превышала обычный уровень. .

Некоторые характеристики препаратов, приведенные ниже, убедительно свидетельствуют' о возможности получения достаточного количества меченного ф -метионилом материала для структурных исследований в стандартных микрэпробах (50—100 нкл) бесклеточной ба-локсинтезирующой системы. '

Основные характеристики препаратов -мет-тРНК,^

Полнота аминоацилирования тРНК"ет ......................... 70-90%

Эффективность формилирования [й5^]-мет-тРНКф9Т ............ ЭЪ% ■

Эффективность деацилирования неформилг.рованных молекул .... 95$ Удельная радиоактивность ф [-ивт-т?НКфвт.., 8'106-2,5-107имп^мин

Эффективность включения в белки при концентрации

ф [35/j -мет-тРНКМ0т 8 шг/мл............................. 8-17%

Время полужизни в экстрактах при 30° ...................... 15 мин

Эти прапараты были использованы для идентификации У -концевых полипептидов ВЭМК и определения числа точек инициации на РНК ВЭМК.

3.2. Ж -концевые белки и пептиды B3i,!K

К началу исследований было извостно, что пикорнавирусы содержат одноцепочечную РНК положительной полярности, которая квляотсн матрицей для синтеза всех вирусспецифических белков (см. ,1976). Постулировалось существование одной точки инициации трансляции и формирование зрелых белков путем протеолитического расщепления полипротеина-предшественника. Для определения числа точек инициации, функционирующих на РНК ВЭМК, мы изучали: (IJ полипоптиды, метящиеся при трансляции Ihvllro РНК B3UK в присутствии ф -мет-тРНК|ат , (2) Ж-кинцевые триптические пептиды индивидуальных белков и суммарных продуктов трансляции. Были использованы экстракты клеток Kpoöc-2, обработанные нинрононновой нуклеазой, в которых при полной трансляции РНК ВЭМК (150 млн, 3 uUgM С12, 135 мМ KCl) образуются почти все ■белки, обнаруживаемые в зараженных ВЭМК клетках (Свиткин, Агол,1Э78). Сверх того, in vitro синтезируются 4 полипаптида, три из которых, мигрирующие в ПААР в зоне 112 кД (преА.), 14 кД (pI4J и 12 кД (р12), метятся ф-[ 35-?/-мет11онином в присутствии -мет-тРНКфат (Рис.II, трек 2). При этом слабо метятся такжо полипоптиды в области вирусных болков А и В. Такой результат может быть получен как при независимой инициации всех этих болков, так и при взаимоотношениях между этими белками типа предшественник-продукт. При 30-минутной инку-бшии, когда успевает протранслироваться только 5-концевая часть РНК ВЭМК; .//-концевая метка обнаруживается в белке преА, слабо метятся белки в зоне А и В, а р14 и р12 отсутствуют. Посла обработки образца вирусспецифичоской протаазой (5 мин 30°) матка из зоны белков преА, А и В переходит в низкомолекулярные белки р!4 и р12. Из этого

о —

^i: 2 з

Ulf

9

— pre A

A В

DI

т- -

G--

--£

—л

-—г

4 5 6

— G

— pl4 -P12

Рис.П. Полипаптиды ВЭМК, меченные в Л'-концовоы положении. РНК

ВЭМК транслировали при 3 uM МдС^ и 135 ыМ KCl в присутствии [35^]-Увт (I,5,6) или ф [*35^]-ивт-тРНК|0Т (2,3,4): 1,2 - 150 мин 30°; (3-6) - 30 мин 30°; трансляцию прекращали добавлением циклогвксимида (250 ыкг/ыл) и пробы (4-6) инкубированы еще 5 мин 37°С с фракцией «f^gg из зараженных ВЭМК клеток (источник вирусспецифической протеазы).

следует, что болки р14 и р!2 синтезируются в составе U -концевой части Высокомолекулярных полипептидов и отщепляются от них вирусной протаазой.

Таким образом, было показано, что в полипротеине ВЭМК ^-концевое положение занимает лидерная последовательность аминокислот, которая, после отщепления от N -конца полипротеина обнаруживается в балках р14 и р12, т.е. в белках, на накапливающихся в зараженных клетках. Эти опыты также показали, что ф-мет-содержаьие полипептиды, мигрирующие в области белков А и В но являются истинными белками А

и В (предшественниками капсидных белков), а являются недостроенными молекулами пре-А, что было подтворндоно анализом пептидных карт преА, А, р14 и р12: сходные между собой аминокислотные последовательности р14 и р12 входят в состав преА, но их нот в составе белка А. Образование незавершенных молекул преА происходит, по-видимому, в результате преждевременной тарминации в определенных участках вирусной РНК.

Включение ф в У-концевое положение двух белков р!4 и

и р12, синтезирующихся в состаао полипептида преА можот означать,что (I) инициация синтеза преА происходит на двух близко расположенных, находящихся в фазе А^-кодонах, и тогда белки р14 и р12 различаются по А'-концевой последовательности и образуются при расщеплении преА в одной точно; (2) инициация полипептида проА происходит на одном

- кодоно, и тогда р14 и р12 соде ¡жат одинаковые /У-концевые последовательности и могут образоваться яри расщеплении про4 в двух разных точках, хотя ость и другие возможности возникновения гетерогенности. Чтобы ответить на вопрос о числе сайтов инициации для полипротеина ВЭМК, мы сравнивали N -концевые триптические пептиды преА, р!4 и р12.

Белки р14, р!2 и преА, моченные ф)[ '^З] -мат, подвергали ис-чорпывашому гидролизу трипсином - ТФХК (трипсин, обработанный специфическим инактиватором химотрипсина). Образующиеся при этом набо-. ры пептидов из балков р14 и р!2 должны содержать только по одному меченому ( А/ -концевому) пептиду, а набор пептидов из преА - один или два меченых пептида, в зависимости от способа инициации преА. Было показано (РисЛ2 а-в), что оба лидерных белка, а также их высокомолекулярный прадшостванник праА, содержит один и тот жа М-кон- . цавой пептид, т.е. всо 3 балка имеют одинаковую УК-концавую аминокислотную последовательность. Это было подтверждено при прямом оп-

Рис.12. Триптические пептиды белков преА, р14, р12 и суммарных продуктов трансляции РНК ВЭМК, меченных в присутствии мчт-тРНКф0Т . Белки синтезировали в присутствии ф -тРНКфСТ , разделяли в ДСН-содержацеи ПААГ, окисляли надыу-равьиной кислотой, и обрабатывали трипсиноы-ТФХК. Лиофили-зированные пептиды анализировали методом высоковольтного электрофореза при рН 10,2 (а-г) или рН 1,9 (д,е): (а) - пептиды преА, (б) - пептиды р14, (в) пептиды р12, (г-е) - пептиды суммарных продуктов трансляции, синтезированных при 3,1 ыМ М^С12 (г,д) и при 5,1 иМ М^С12 (е).

редалекии частичной аминокислотной последовательности балков р14 и р12 путем автоматической деградации по Эдмену. Анализировали образцы р!4 и р12, меченные смесью [Зн] -аминокислот. Использовали 2 сыаси по 4 [Зн] -аминокислоты в каждой, как указано в, подписи к рис.13. Было обнаружено, что в положении I у обоих балков находится аланин, а в положении 5 и .7.- глютаминовая кислота (рис.13).

Рис.13. Опроделание частичной /V-концевой последовательности поли-

паптидоз р14 и р!2. Балки, меченные в присутствии (3hJ -Ala,

[Зн] - i au, Í3h] -VaI и í3hj -Asp (верхний ряд) н _ [Зн] - Pia, [Зн] -Не, Í3>Ü -Рго и [Зн] -Gfu (нижний ряд),

разделяли в ДСН-ПААГ, элюировали муравьиной кислотой и подвергали автоматической деградации по Эдману (<faW?/7, ,1957). 1>ТГ - производные аминокислот разделяли с помощью высокоэффективной Жидкостной хроматографии на Ultra sphere CIS, и просчитывали радиоактивность соответствующих пиков, ориентируясь на злюция стандартов ФТГ-аминокислот.

Как ясно из предыдущих опытов, последовательность р14 и р12 в действительности начинается с матионина, но так как //-концевой ма-тионин, в отличив от ф-мот, отцепляется от растущей цепи, он отсутствует у сформировавшихся р14 и р12. Таким образом, из изученных 9 позиций 4 позиции в белках р!4 и р12 заняты одними и теми же аминокислотами. На основании всех приведенных данных можно с уверенностью

с

заключить, что р14 и р12 имеют одинаковую .У-концевую последовательность, а значит их синтез (и синтез полипротеина) начинается с единственного инициаторного кодона. Когда эта часть работы была закончена, стала известна первичная структура РНК ВЭМК ( fbEmehiir^ ¿t&¿„ 1984), что позволило идентифицировать этот инициаторный кодон, как первый Аиз-болыаой открытой для трансляции рамки (OTP):

Последовательность

нуклоотидов AU9 ÖCC АСА АСС AUS GAA CAA ЗАЭ AM

Выведенная послйдова- , , . г.

тольность аминокислот Uot Ala Ihr Thг Met Giu bin vCU Ihr

Последовательность , аминокислот pI4 и pI2 Met Ala

Первичная структура РНК ВЭМК подтвердила также существование ли-дерной аминокислотной последовательности, предшествующей в полипротеине капсидныы белкам. Однако, теоретически рассчитанная молекулярная масса лидера составляет около 8 кД, что ниже, чем величины, определенные по электрофоретической подвижности (14 и 12 кД). Так как между С-концом лидера и У-концом следующено за ним капсидного белка .S , имеется только один сайт расщепления для вирусной протеазы (последовательность 6tu -Gty ), наблюдаемая гетерогенность лидерных полипептидов, по-видимому, объясняется не отщеплением их в различных участках полипротеина, а посттрансляционной модификацией или аномаль] ной подвижностью в ПААГ. Наблюдавшееся в эксперименте изменение положения лидерных полипептидов относительно вирусных белков Н и I в зависимости от условий электрофореза, свидетельствует об аномальной подвижности этих полипептидов, чем, по-видимому, и объясняется завышение воличин молекулярной массы, определенных по подеикности.

Интересно, что второй AUG большой OTP РНК ВЭМК, расположенный через 3 кодона от инициаторного и имеющий оптимальное для ини-

_ _ _ ¡stu - Ш _

циации нуклеотидное окружение ЙССХ flÜQ^G ( Коюк ,1932,1984), но используется для инициации.

Итак, инициация полипротеина R3MK происходит в единственном уникальной инициаторном сайто. Но вопрос о тон, могут ли на РНК ЗЭМХ Функционировать другие инициаторныа сайты, отличные от сайта инициации полипротеина, но йог считаться районным. Чтобы отзотить на этот вопрос, мы анализировали Л^-концавые триптичаскиа поптиди суммарных продуктов трансляции РНК ВЗМК методами высоковольтного электрофореза при рН 1,9 и 10,2, нисходящей хроматографии и гольфильтрации на био-гела Рб. При анализа триптических гидролизатов балков, образующихся in vitro в условиях, оптимальных для синтеза полипротаина (3,1 мМ MgC^, 135 мМ KCI) бил обнаружен только один мотящийся ф- i^s]-ме-тионином паптид, элоктрофоретичоская подвижность которого совпадала с. подвижностью >V-концевого пептида полипротеина-РисЛ2, г,д). Но можно было предроложить, что если на РНК ВЗМК существует дополнительный сайт инициации, то условия, оптимальные для ого функционирования, будут отличаться от условий, оптимальных для сайта инициации полипротеина. Исходя из этого предположения мы варьировали условия трансляции от 3,1 мМ до 5,1 ыМ MjCIgi от 75 мМ до 135 ыМ KCI; от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл РНК ВЗМК, использовали также экстракты из зараженных клеток. При большинстве вариантов на било выявлено дополнительных пептидов. Но при увеличении концентрации MgCIg с 3,1 до 5,1 ■ мМ мы обнаружили наряду с .V-концевым пептидом полипротаина, 2 минорных меченных ф-[^"^-матионином пика, резко отличающихся от него по подвижности: при рН 1,9 минорные пептиды активно мигрировали к катоду в отличие от И/ -концевого пептида полипротаина, почти не сдвигающегося со старта (Рис.12,е), а при рН 10,2 паптид полипротеи- • на и минорные пептиды мигрировали к противоположным полюсам. Оба минорных пика имели близкую электрофоретическую подвижность и не ис-

н.тачоко, что оба пептида происходят из общего болна и один из них появляется в результате нополного трипткческого гидролиза. Нам не удалось идентифицировать полипоптид (ы), из которого они происходят. Трудности были связсны с том, что суммарная радиоактивность 2-х минорных пептидов составляла от I до Ю,!> от радиоактивности мажорного пика, а при анализе болков, синтезирующихся при 5,1 мМ появ-

ляется множество дополнительных меченных -мотиошшом полос,

представляющих собой недостроенные молокули полипрстеин? Среди них но удалось идентифицировать минорный полипептид-(ы) другой природы.

3.3. Новкй белок ЦЭМК, образующийся Iп кг'/л? при суперопти-

. р ■

мальной концентрации Мд .

После того, как были измонени условия выделения'Экстрактов и условия трансляции 1п \ziir0 (Карасов, Мирошниченко, Угарова,¿989), что сущестгонно улучшило параметры бесклоточпой системы из клеток Крибс-2, среди продуктов трансляции, образующихся в субоптимальных для синтоза полипротеина условиях, был обнаружен белок, отличающийся по элоктрсфоретичоской подвижности в ПААГ от известных продуктов . расщепления полипротеина. Ка риспоказаны наборы и динамика синтеза белков ВЭМК в оптимальных для синтоза полипротеина условиях (2,1 м!.5 Н^Ас, 90 м!Д КС1 и 80 цМ КАс, -0,1 мМ спермина) и после увеличения концентрации НаАс до 3,6 мМ.

Увеличение концентрации МдАс на 1,5 мМ приводит к замедлению синтеза белков полипротеина примерно в 2 раза: белок проА или Р1 по новой номенклатуре (Яке^е^ ,\{Лтт£Г, 1984) появляется через 45 мин вместо 20-30 мин, а белок Р (2с) через 90 мин вместо 45 мин. Ка фоне недостроенных молекул Р I ужо через 15 мин синтезируется маклрный полипзптид, но совпадающий по подвижности ни с одним известным продуктом расщепления полипротеина (РисЛ4,Б). Его молекулярная масса

была оценена в 28 кД (р28) по подвижности в трис-фосфатной буферной системе с ДСН в градиентном ПААГ с возрастающей сшивкой. В этой системе аномалии подвижности, связанные с аминокислотным составом, характерные для использованной ранее системы Лзммли,- сводятся к минимуму, и подвижность балков строго соответствует их молекулярной массе ( Т>ша(с1 &1-, ,1986). При использовании в качестве маркеров

1 2 3 4~ 5 6 7 I" 23 4- 567' I 2 3 4 5

Рис.14. Трансляция РНК ВЭМК в оптимальных условиях (а), при повышенной концентрации МдАс (б) и в присутствии Vh/+Ac (в). Условия: (а) 18 м!.1 трис-HCI, pH 7,5, 90 мМ KCl, 80 м!.! КАс, 0,1 мМ спермина, 2,1 мМ !^Ас; (б) то же, но 3,6 мМ 'lgAc;(D-- баз РНК; (2-7)-1,9 мкг РНК ВЭМК. Инкубация: Ш-60 мин, (2)-15 мин, (3)-30 иин, (4)-45 мин, (5)-60 мин, (6)-Э0 мин, (7Ы30 мин. (в) 2,1 М. М^Ас, 32 мМ KCl, 160 цЦУН,,Ас: 1-60 мин, 2-15 мин, 3-30 мин, 4-60 мин, 5-90 мин. Электрофорез меченных ['^-3] -метионинсм продуктов трансляции проводили в тр-с-фосфатной системе с ДСН, в градиентном ПААГ (9-26$ АА) с возрастающей сшивкой (0,18-1,05$ бис АА). Белки элоктрофоретически переносили на нитроцеллюлозу и радиоавто-графировали.

капсиднцх балков из очищенных вирионов р28 движется моягду билкаыи ск (31,7 кД) и ^ (25,1 кД), слогка опораная балок ß> (29 кД). Мажорному белку р28 всегда сопутствовал минорный белок p6't, мигрирующий чуть медленное Салка Д1 (1авс-62 кД). Р28 образуется на только при повышенной, но и при оптимальной концентрации Mg Ас (2,1 мМ) при изменении соотношения КС1/КАс в пользу КАс (32 uM KCl, I&O мИ КАс), при замене КАс на Ун^Ас (90 аМ KCl, 80 мИ/Н^Ас) и особенно при низком соотношении КС1//Н4Ас (32 м!.! KCl, 160 мМ/н^Ас). Во вспх эт'-х случаях скорость появления преА (PI) снижена, а синтезу р28 сопутствует раннее появление продукта З-копцозой области РНК ВЭМК - белка РЗ. В то хо врамя добавление фракции мембран или е1Р$ из клеток Кребс-2 на влияет на синтез р28.

Белок р28 является продуктом трансляции надаградированной РНК, т.к. вслод за ним синтезируются вса остальные белки, закодированные в РНК ВЭМК. Скорость его появления свидательствуот о том, что он должен быть закодирован вблизи инициаторного кодона. Существует две возможности: либо он появляотся в результате преждевременной торминации трансляции //-концевой части полипротоина, либо в результата инициации трансляции на альтернативном сайте внутри OTP полипротеина. Первое предположение представляется мало вероятным, поскольку для получения V-концевого фрагмента полипротеина с молекулярной массой 28 кД терпинация должна происходить где-то в середине кодирующей области белка ji . Элонгеционный "барьер" на РНК ВЭМК обнаружен значительно дальше, на границе генов для структурных и неструктурных балков и этот барьер преодолевается добавлением фактора элонгации аЕР2 (Snzf-ICin , ßcjO-t ,1983). В наших опытах добавление фракции соловой промывки рибосом, содержащей факторы элонгации,.не угнетало образование р28.

Скорае всего р28 является продуктом альтернативной инициации.

Чтобы локализовать ого кодирующую последовательность на РНК ВЭМК необходимо проанализировать последовательность аминокислот р28. Сдоданные в этом отношении попытки натолкнулись на трудности препарат/.вно-го выделения р28: в области р28 мигрируют высокоактивные сериновыо и моталлопротошш, расщепляющие его при элпции из голп.

3.4. Заключение

В нашеИ работе были получоны строгие доказательства; что инициация трансляции полипротоина ВЭМК происходит с единственного инициаторного сайта на РНК ВЭМК. После того, как була определена пеоапчная структура РНК ВЭМК (PaCmtncerq, ¿1984), сравнение частичной аминокислотной последовательности лидорных болков р14 и р!2, отщепляющихся от У-концовой части полппротопна, с последовательность:}, щ:подон-ной из первичной структуры РНК, позволило локализовать сайт инициации полипротеина на первом большой OTP РНК ВЭМК. Инициация полипротеина' на единственном }tU(r имеет моею у большинства, но на у всех пикорнааирусов. Так инициация полипротоина вируса ящура (aivro-вирус) происходит на двух находящихся в фаза

т. разделенных 64 ко-донаыи (Carrot et ,1934). Таким образом, у двух групп пшшрнчви-русов, имеющих лидерные или L -белки, инициация полипротеина происходит не одинаково.

При изучении триптических перевароз суммарных продуктов трансляции' РНК ВЭМК, моченых ф-/"^^>/-мотио11ином при супероптимальной концентрации McjCIg, был обнаружен по крайней море один инициаторный погтиц, отличный от л/-концоеого пептида полипротоина. Это свидетельствует о том, что при некоторых условиях на. РНК ВЭМК функционирует сайт инициац"и, отличный от сайта инициации полипротоина. Это не уникальная ситуация для пикорнавирусов. При трансляции Ln vi'iro РНК ПВ, наряду с сайтом инициации полипротеина, используется и другой

инициаторный сайт (Роботы группы cJireo^e¿e¿ ), а в лизатах ретикуло-цктов кролика, сайты инициации, находящиеся з центральной области Ж ПВ, используются значительно более эффективно, чом сайт полипротеина ( borner ti &С. ,1984). Не известно, используются ли внутренние сайты инициации ¿л vivo .

В нашей работе был обнаружен новый белок р28, эффективно синтезирующийся а экстрактах клеток Кребс-2 в условиях, частично угнетающих синтез полипротоина. Белок р28 обладает уникальными свойствами

- на фоне примерно двукратного замедления синтоза У -концевого белка полипротоина B3L1K преА (PI), р28 образуется ужа через 15 мин, раньие всех других балков ВЭМК, к до 45 мин (время появления преА) остается единственным дискретным мажорным белком. При ряде воздействий, стимулирующих синтез р28, прослониваотсп также раннее появление поли-поптида РЗ, закодированного в 3-концовой трети РНК ВЭМК. Не исключено, что белок р28, появление которого интерферирует с синтезом ^-концевых белков полипротеина, является продуктом инициации на внутреннем сайте.

Если р28 является продуктом альтернативной инициации, можно попытаться локализовать его кодирующую последовательность, исходя из предпосылки, что на ее 5-концо должен быть , а на 3-конце -

- место кодирования сайта расцепления Gin /S£y {Ser ) (см.Рис. 15). По этому формальному критерию инициирующими могут быть 3 внутри ОТР полипротеина: ñUfrg , расположенный в начала кодирующей области капсидноге белкауЬ, £Uâ30 - в области У-концевого домена белка £ (2с) и &UGдг,. - из середины кодирующей области белка H (Зав). Первое предположение может быть отброшено: при инициации в зоне белка ji белок р28 не мог бы выщепиться из предшественника, так как через 15 мин не может образоваться вирусная протеаза, которая

закодирована в 3-концевой части РНК ВЭМК (см.Рис.15;. Дво другие возможности представляются весьма вероятными: полипептид 2с'128,9 кД, стартующий с в положении '(610-4612, расположен вблизи вирус-

ной протеазы р22 (Зс), а полипелткд 3 а/вс (28,2 кД), стартующий ЛиФ в положении 5549-5557, включает оо в свой состав и мог бы выщелляться авточаталитичоски.

Итак, остаются только два возможности локализации р28. Он можот быть или балком 2с-укороченным с ¿'-конца белком 2с(5), или по^ипеп-тидом Заве, содержащим укороченный с У -конца белок Зав (Н) и вирусную протеазу Зс (р22).

Р1 Р2 РЗ

3

:16 р. г а 2о ?Ь 2с ЗоЬ Зс 3d

■ i li i ,. 1^3"

Б

о-

28, ?К

J РЗ

' 2с'ЗаЬс, " 2с'РЗ

! ЗаЬс

28.2К—ЧЗКЯ I

I [==) 3d, I РЗ'

Рис.15. Карта известных балков ВЭЧК и возможные.места локализации

р28.

Положение вирусных белков дано согласно литературный данным (си.Свиткин.1989); использована новая номенклатура белков пикорнавирусов (RuecXexi , Wimmer- -,1984;; наличие лидерной последовательности установлено.в данной работе. . Условные обозначения: 0---* -5<-НТ0 РНК BaUKcVIfc, полис-блоком и инициаторныи кодовом полипротеина; u^iy--внутренние AU<? OTP полипротеина с укапанном их порядкового номера. Прямоугольники - балки ВЭМК, черный прямоугольник -- вирусная протеиназа Зс (р 22).

Отмочянноа выше раннее появление сопутствующих полипаптидов -- РЗ, а такке минорного полипаптпда pS't, который по молекулярной мас-со может соответствовать Зс^Ззвс, свидетельствует скорее в пользу локализации р28 в С-концевоП области Р2, хотя выбор между этими предположениями моено будет сдо:.:ть после анализа первичной структуры р28. Показано, что белок 2с, наряду с белками РЗ области, участвует в репликации РНК пикорнавирусов ( Plucks , Wünmzr ,1986). Существование дополнительного сайта инициации, обеспечивающего лорзленп только тех белков, которые участвуют в репликации РНК, могло бы иметь реальный биологический смысл на начальных фазах репликации. Имеются сообщения, что в клетках зараженных пикорнавпрусами, вирусспецифические белки образуются в кеэнвниолярнкх количествах, в частности на ранних стадиях инфекции происходит предпочтительное образование белков, закодированных в 3-концевоЙ части генома (см.Koch ,Koch ,1985). Такую регуляции синтеза белков можно было бы объяснить существованием дополнительного сайта инициации в этой области генома.

ФРАГМЕНТ 5-КТО РНК B3UK, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ШЦЩЩШ ТРАНСЛЯЦИЙ ПОЛИПРОТЕИНА.

Для описания инициации трансляции кэпированнкх мРНК принята сканирующая модель ( Kojak, 1978, 1983'). В соответствии с этой мо- ( делью первоначально узнается 5-конец мРНК с находящимся на ном нэпом, AOS' субчастица связывается с мРНК вблизи 5-конца, а затем движется вдоль цепи РНК до инициаторпого ЙЦ6-кодона, с которого и начинается трансляция.

Сразу не после установления первичной структуры пикорнавирус-ных РНК стало очевидным, что особенности их организации плохо совместимы со сканирующей моделью. К этим особенностям относятся отсутствие кэпа, мощная вторичная структура в непосредственной бли-

зости от 5-конца, необычная длина (до 1-200 пил) и неординарная структура 5-НТО, коториэ содержат до I4 ^¿Л? и множество терминирующих кодоноз, предшествующих инициаторному. Ряд косвенных данных функционального характера, такг.е свидетельствующих о различит в способах инициации кзпирозанных и пикорназирусных мРНК, С:-:л:! приза-дони в предыдущих разделах.

Недавно били получены прямые доказательства существования у пи-корнавирусных РНК механизма инициации, отличного от модели Козак. Было показано, что внутри 5-НТО РНК ПЗ существует специфическая локальная последозатегдность, содержащая несколько сотен нуклооткдов, которая ответственна за инициацию трансляции, и инициация осуществляется баз участия 5-конца {РеНе&гг ^ а£. ,1988). Этот особый тип инициации получил наззанио "внутренней инициации". Началось интенсивное изучения структуры инициаторнах фрагментов РНК пикорнави-русов и выявление транс-]акторов, обоспочивзющих внутреннюю инициацию.

Для РНК ЗЭЖ било показано, что ае 5-НТО также направляет внутреннюю инициацию трансляции, и эта способность сохраняется при удалении с 5-конца 260 нкл или 338 нкл, несколько снижается при удала-нии 450 нкл и полностью исчезает при удалении 484 {^йпд е-Ь а£-. , 1989).

Этим ограничивались данные о значении различных участков 5-НТО ■ РНК ВЭМК для внутренней инициации перед началом навой работы. Работа по изучению инициаторного сегмента 5-НТО РНК ВЭ1.1К выполнялась совместно с группой И.Н. Шатского (сектор нуклоопротеидоз, зав.сектором чл.корр. АН СССР, профессор А.А.Богданов.)

_ 54 -

4.1. Значимость различных участков иницизторного брагмента 5-НТО ГНК ВЭМК 1Л» внутроннай иьициации трансляции .

Участок к!ШК, соответствующий последовательности 3I5-II55 РНК ВЭМК, был клонирован под Т7-проу.отором и на основа этой исходной конструкции А.Г.Евстальевой были получаны модифицированные варианты 5-НТО РНК ВЭМК (Рис.16).РНК-транскрипты юстировали на способность к трансляции в экстрактах клеток Кребс-2. Транскрипты содержали участки 5-НТО, укороченные или имеющие внутренние дслоци.:, инициа-торный кодов я положении 833-835 и фрагмент кодирующей последовательности 833-1155 без терминирующего кодона, захватывающий область балка L и часть капсидного белка <3*с общей кодирующей емкостью 12 кД. Исходный транскрипт, содержащий 5-НТО, укороченную до 315 нуклаоти-да - ir 315 по нашей номенклатуре (см. подпись к рис.16), эффективно транслируется в условиях, оптимальных для трансляции РНК ВЭМК (0,1 мМ спермина, 2,1 мМ МдАс, 51 мМ KCl, 120 uM КАс), давая гетерогенный продукт с злоктрофоротичаской подвижностью болов низкой, чом можно было ожидать, исходя из копирующей емкости транскрипта. (РисЛ7а).. Аналогичный набор полипептидов от 25 кД до 10-12 кД образуется при трансляции получанного методом адресованного разрезания фрагмента РНК ВЭМК, содержащего нативную (не укороченную) 5-НТО и участок кодирующей области с 833-1180 нкл. Отсутствие терминирующего кодона у этих матриц может приводить к скоплению на них рибосом, несущих все j болев короткие полипептиды в форма пептидил-тРНК, чем можно, по край ной море частично, объяснить геторогенкость продукта. Другим источником необычных свойств продукта может быть аномальная подвижность входящего в ого состав лидарного белка (7,9 кД), мигрирующего в ПААГ, как было ранее показано, в виде дуплета с кажущейся молекулярной массой 12 и 14 кД (см.. раздел 3.1).

Г.оиЗа.

нн -ъ^^Ччч ^

¿X <0 5 €

¿00 400 ЮЬ ЬСИ, Н'С »X 10* г,

тгмгюлги ■ спком^а йлмв-лАимл» _

п ../о.,, Г1а ¡т »аа ; тгЛМЧЧ

31

ь

4. 4- + + 4

___-----, + X 4

¿г ьбз __

"¿Г 648 ««»^

¿••765 '

^з'5 л 4вб*б47 г-

Ь 3,5 Л 70,.763 ^ ^

Л 707-723 Ь- 315 - 837

315 - 831

^ 315 - 817

{>• 315 - 4В5

X 4 4

Л. 4 4

+ т +

Э14 6.3/ + +-ь +

э1!_ + 44 +

Э»6 •«> ++ +

Рио.16. РНК-транскрипты, содержащие полную и модифицированные формы инициаторного сегмента РНК ВЭМК.

Обозначение транскриптов: первая цифра означает положоние 5-концсвого. нуклеотида транскрипта в последовательности РНК ВЭМК. Если транскрипт не содержит кодирующей области, то дается вторая цифра-положенио 3^-концового нуклеотида ■ транскрипта. Символом Д отмечены внутренние делоции, а цифры под этим символом - 5- и 3-концевые нуклеотиды транскрипта, сближенные в результате делеции. Вверху: нумерация последовательности РНК ВЭМК и сайты рестрикции.

•з.-вэ»

тс

а

¿л- i . J t •.

r I?i MM K+

I

I

l

• Xf

I 2 1314,5 6,-7'8' Sion "I 2.[З1.1,5 6 789,t0III2I3

6 51 щ б г ii vii tv+

, ------------*T ' ' ' —- ^ .

12 3 4 5 б 7 '8 9 1 2 3 4 5 6 78 9

Рис.17. Трансляция транскриптов, содержащих модифицированные формы

иф рнк вэ:.',к. а,г) 171 мМ К+ б) III мМ К+ в) 51 мМ К+

а,б,в: I-без РНК; 2,3-0,6 мкг ir 315; 4,5-0,5 ыкг ir 485

б,7-0,5 ыкг ir 563; 2,9-0,4 ыкг ir 648 (для рис.а) и 0,3 мкг ir 765 (для рис.б,в); 10,11-0,3 мкг '¿г 765 (для рис.а) 3,5,7,9,П-в присутствии mf6MP

г: 1,2- ~tr 315; 3,4- ir. 315 д 701_7б3; 5,6- ir 315д 707_723;

7,8-^485; 9,I0-fr 563; II, 12-tr 765; 13-без РНК. Концентрация везде 0,3 мкг/пробу; 2,4,6,8,10,12-транскрипты были предварительно обработаны соединениями ртути.

Расчеты включения

[35S]lld (с

учетом встречаемости метиониловых остатков) показали, что "tf* 315 транслируется более эффективно, чем полноразмерная РНК ВЭМК. Следовательно, участок 5-НТО с 315 по 833 положение содержит все сигналы, необходимые для внутренней инициа-

ции трансляции, т.е. включает полный шшциаторный фрагмент (ИJ) РНК ВЭМК. Это хорошо согласуется с данными (^"лл^ &t., 1989).

При укорочении 5-НТО до'425 нкл эффективность трансляции ^ 485 резко снижается и составляет приблиэителшо 10/1 от эффективности трансляции ^315. Удалоние с 5-конца о^о 78 нкл (-/л 563) или 163 нкл (■¿г 648) приводит к полной потере способности к трансляции, а при удалении 240 нкл ( it- 765) трансляции восстанавливается, но на крайне низком уровне. (Рис.17а).

Таким образом, последовательное укорочение 5-НТО приводит к уменьшению, исчезновению и возобновлению трансляционной активности укороченных РНК. Это, по-видимому, связано с пароходом от внутронной к зависимой от 5-конца инициации трансляции. Чтобы проверить это предположение ии изменили условия трансляции с оптимальных для внутренней инициации (171 мМ К+) на субоптимальнио (III мМ К+) и на оптимальные для инициации трансляции неполированных мРНК по зависимому от 5-конца механизму (51 мМ К+) (Рис.17 б,в). По маро снижония концентрации К+, эффективность трансляции ¿"315 и ^"485 понижается, опускаясь для 4^485 при 51 иМ нияе определяемого уровня, а эффективность трансляции -if 765 заметно возрастает. Транскрипты с промежуточной длиной 5-НТО 563 и ¿г 648 и при 51 мМ К+ были практически неактивными. Эти дакныа показывают: (I) что остаточная трансляционная активность^ 485 осуществляется по внутроннему механизму; (2) что последовательность 315-488 не является абсолютно необходимой для внутренней инициации, но-многократно увеличивает ее эффективность; (3) что транскрипты с укороченным до 563 нкл и до 648 нкл 5-НТО утрачивают способность к внутренней инициации, но еще содержат структуры, препятствующие инициации с 5-конца; (4) при укорочении 5-НТО до 70 нуклеотидов, примыкающих к инициаторному AUG-, становится возможной инициация, зависимая от 5-конца.

Из этих опытов но ясно, имеет ли значение для внутренней инициации та часть последовательности 5-НТО, которая входит в состав "молчащих" транскриптов ¿Л563 и?/"648. Частично ответ на этот вопрос был получен при тестировании транскриптов с внутренними делециями 5-НТО:

^315й ОД8-647-^ 315й 701-763 и 315Д 707-723' Оказалось, что они но транслируются ки при высокой, ни при низкой ионной сило. Даже такое "минимальноо" нарушение первичной структуры, как удаление 15 нкл (•¿Г 315^ 707-723^ приводило к полной потере способности к рнутренней инициации. (Рис.17, г). Это свидетельствует о значимости участков 488-647, 701-753 и 707-723 для внутренней инициации.

Когда речь идет о значимости участков первичной структуры, возникает вопрос, важна ли данная последовательность сама по себе, или важна та вторичная структура, которая складывается при участии данной последовательности. Для 5-НТО РНК ВЭМК создана и экспериментально подтверждена модель вторичной структуры. Показано, что инициатор-ный фрагмент РНК ВЭМК складывается в характерные 4 домена и такая вторичная структура является консервативной для кардио- и афтовиру-сов {РШре-пко ¿¿а^.,1989;-см. рис.4&).

• Анализ вторичной структуры транскриптов, проведенный А.Г.Евс-тафьовой, показал, что удаление с 5-конца 314 нкл не повлокло практически никаких изменений пространственной организации оставшейся части 5-НТО, т.о. вторичная структура^ 315 соответствует нативной. Дальнейшее укор чепие 5-НТО и внутренние делоции вызывают изменения вторичной структуры, но эти изменения затрагивают только те домены, к которым принадлежат делегированные последовательности. Так, удаление 315-484 (^485) удаляет домены 1,2 и разрушает нижнюю (вариабельную} часть домена .3 , а верхняя часть домена 3 и домен 4 остаются неизменными. У ¿^563 разрушена структура всего до-

иена 3, а у •¿/'648 удалена почти вся последовательность, составлявшая домен 3, при полном сохранении структуры домена 4. У У~ 765 сохраняется лишь нижняя часть четвертого домена. У 315^ удалена верхняя часть домина 3 , при полной сохранении структуры 1,2,4-го доменов и нижной части домена 3 , у/л315д 701-763 " гг 315д 707-723 ПР1: полноц сохранении 1-го, 2-го и 3-его доминав, происходят изменения структуры 4 домена. Сопоставление этих данных с трансляционной активностью транскриптов приводит к следующим выводам': домены 1,2 и нижняя часть домена 3 не являются необходимыми для внутренней инициации, но многократно увеличивают ее эффективность.

Ворхняя часть домена 3, а также домен 4 абсолютно необходимы для

»

внутренней инициации. Совершенно очевидно, что и первичная и вторичная структуры могут иметь самостоятельную ценность для процессов,из которых складывается феномен внутренней инициации, но их роль, как правило,, трудно разграничить. Это относится как к описанным выше, • так и последующим экспериментам.

Мы изучали способность инициаторногс фрагмента, состоящего из двух ковалентно несвязанных участков направлять внутреннюю инициацию трансляции. Полный инициаторный фрагмент (315-833) с разрывом связи между 484 и 485 нуклеотидными остатками получали путем гибридизации ¿Г485 и 1г 315-485. Было показано (Рис.19), что после отжига -¿г485 с {г 315-485, эффективность трансляции гибрида (Рис.19,о,к, . о) резко повышается по сравнению с ^"485 (ж,л,п.) и становится близкой к эффективности трансляции ковалентно непрерывного г^" 315 (д,и, н). Однако, свойства гибрида и ¿л 315 не идентичны. В частности, наборы продуктов трансляции гибрида и315 насколько отличаются: при трансляции гибрида отсутствуют наиболее быстро движущиеся полипапти- • да.

Piîc.iâ. Вторичная структура инипиаторного ^раг.^ента РЖ /¡ЗМК

согласно Пилипекко и др. ( Pi-Cipenko et cit. ,1ЬВ9).

Последовательности.удаленные при конструировании мутанткых иорм КФ с внутренними делецаями, заключены в ра:.-ки.

а. где зчклмнопр

Рис.19. функциональная активность инициаторного фрагмента, состоящего из дзух ковалонтно несвязанных участков, а - без РНК; б,в,г-1,5 мкт РНК 33:.;К; д,и, н-0,6 мкг -¿-315;

в,о,к,о - 0,6 мкг гибрида Ь- '»85 \\{г 315-48'»;

г,х,л,п-0,5 мкг ¿Л <(Ц5; з,м,п-0,3 мкг 765.

Раноо при изучении трансляции ^315 было показано, что по времени появления крупные полипоптиды опорежают малкио. Можно предположить, что гибридные молекулы монее стабильны в белоксинтезирующих акстрактах, и отсутствие наиболее мелких пептидов связано с тем, • что в экстрактах гибрид достаточно быстро распадаотся. Том на менее, РНК В31.1К (315-833), имеющий разрыв фос¿орнодиэфирной связи между 484 и 485 нуклаотидными остатками, и удерживаемый, как единое образование, с понощью вторичной структуры, близок по своей способ-' ности к осуществлению внутренней, инициации к ковалентно непрерывному 'ЛФ, отличаясь от псслоднего, по-видимому, меньшей стабильностью.

Большая протяженность и сложность структуры инициаторного фрагмента ставят вопрос о том, какие компоненты транслирующего аппарата узнают отдельные последовательности и структуры ИФ. В частности возникает вопрос, существуют ли, помимо известных факторов инициации, ¿акторы, специфичные для внутренних инициаций вообще, •

- 62 -

или может бить, дли конкретной пары ^пикорнавирус-клетка'.

Было показано, чтс в экстрактах клеток Крабс-2 и в белках солевой промывки рибосом клеток Кробс-2 имеется белок р58, который при низкой ионной силе (.53 ы!.'. К+) проявляет РНК-свпзыва.оцио свойства, а в условиях оптимальных для внутренней инициации трансляции (170 цЦ К+) специфически свьзываетсн с ннициаторным Фрагментом РНК ВЗМК. Местом узнавания являотся 5-проксг.мальный участок ИФ, а именно последовательность 315—'+34: при 170 мМ К+ этот белок связывается с всеми транскриптами, содержащими последовательность 315-484 (£-315,^315-837, "^315 д 701-763' а така£а с последовательностью

315-484, отдаленной от И5. Балок р58 но связывается ни с одним транс-криптом, лишенным этой последовательности, ни с антисенс -'¿"315, ни с ifrUMV к (Рис.19).

Вполне остаственно предположить, что р58 представляет собой специфический фактор, играющий неизвестную пока роль в механизме внутренней инициации, а функция участка 315-484 состоит во взаимодействии с этим фактором. Тогда резкое снижение активностиЬ~ 485 по сравнению с zr 315 можно рассматривать как результат утраты сайта связывания р58; а восстановление активности после гибридизации ~tf 485 и^315--485, как результат воссоздания этого сайта.- Факт восстановления функциональной активности при гибридизации последовательностей 485-I155 и 315-484 до уровня активности коаалонтно непрерывного Mi имеет еще один интересный аспект: это свидетельствует об отсутствии сканирования рибосомами нуклеотидной последовательности домена 3 (в нижней части которого имеется разрыв), что подтверждает принципиальное отличив механизма инициации трансляции, направляемого инициаторным фрагментом РНК B3I.1K от сканирующего механизма.

~ - — 67 кД

• Щ *_43 втг

кд

12 3

« *»_Ô7 кД

^ _a3

12 3 4

кД

• •

? -

» f »j . • — 43 Г,

67 кЛ 3 l'j.

■ ' I ■

I 2 3 4?б 7 8 910 1И213

Рис.20. Взаимодействие балка р58 с различными делецискньши мутантами

шшциаторного фрагмента РНК ВЭМК. ;

я?

Моченые сР-транскоипти инкубировали с экстрактами клеток Кребс-2 или фракциями фзктооов инициации, подвергали облучению УФ, обрабатывали смосью нуклдаз и болни анализировали ь ПААГ.

а) с экстрактам клеток Кребс-2 инкубировали: I - iy- 485,2-ib 315, 3 -if 563; б) с -экстрактами клеток Кребс-2 инку' бировалп: I -т^ 315-637, 2 -it 485, 3 -ir648, 4 -Ъ*dnîL-315; eJ пробы с 1-8 инкубиривали с фракциями ¿L^ : I, 3, 6 - fJF5ï, фракция ib-Щ'о СА; 2, 4, 7 -eX-Fs!}% фракция 40-70$ СА, 5, 8 - сдесь фракций 25-40$ СА И 40-70$ СА; пробы 9-13 инкубировали с экстрактами клоюк Кребс-2. J.,2,II -■¿ГЫ5Д701_.763;3,4,5,12 -^515-70^4е5_04е: 6:7,. 3,13 -ir<UHV4,\ 9 -t- 315; 10 -{г 315-484.

Б

- 64 -

4.2. функциональная гетерогенность инициаторного фрагмента

РНК ВЭ.'Ж

Большой размер Iii косвинно указывает на сложность выполняемых им функций. Логично предположить, и это было показано на примере фрагмента 315-48'f, что отде!ьиыо участки ИФ могут и.моть специфические (частичные) функции, которые могут сохраняться поело удаления или повреждения других участков и поело утраты ыутантными формами Iii своей интегральной функции - способности к внутренней инициации. Известна, по крайней мере, еце одна функция ИФ - конкурентное инги-бирование копированных мРНК при совместной трансляции матриц, которое реализуется на уровне взаимодействия с факторами инициации. Неизвестно, сопряжена ли способность к конкурентному ингибированию копированных мРНК с полным ИФ, или она присуща определенному участку ИФ.

Мы изучали способность исходной и мутантных форм ИФ конкурировать с матрицами с различным типом инициации трансляции: с РНК ВЭМК (внутренняя инициация), с РНК ХВК (кэп-зависимая инициация) и с не-кзпированным транскриптом, несущим последовательность РНК 4 вируса, мозаики люцерны - tfoiJ. Al ^-(зависимая от 5-конца, кэп.-нозависи-мая инициация). Две последние матрицы инициируют трансляцию по сканирующему механизму, но írdcíñV4, так же, как исходная РНК 4 , не зависит от группы кзп-евнзываюцих факторов ^Sontnée^ ,£uer¿//¡ , Lee. ,1982).

. 7r 315, содержащий полный ИФ, при совместной трансляции резко угнетает экспрессию всех тестированных РНК (рис.2/). ИФ, вычлененный из 5-НТО РНК ВЭМК, оказывается более эффективным конкурентом, чем полноразмерная РНК ВЭМК: конкурентное угнетение трансляции РНК ВЭМК наблюдается уже при эквимолярнон соотношении матриц и усиливается при двукратном молярном избытке ¿-3I5. Трансляция РНК ХВВ,

одной из самых эффективных кэпированиых матриц, практически полностью подавляется при двукратном молярном избытке сГ 315. Добавленная в том же количестве апт.смислэвая РНК {iraML'i 15) очонь слабо влияет на трансляции РНК ХЗК (.Рис.2/,б).

Таким образом, присущая РНК 33!.:К снисобнчсть ингибирозать трансляцию кэпированных мРНК, в полной мора сохраняется у ¿а315.

Удаление кодирующей области, инициаторного кодона и примыкающих к инициаторному кодону 17 нуклеотидов (tr 315-837, if 315-831 и lr 315-817) на лишает транскрипты способности угнетать трансляцию РНК 33UK, РНК ХВК и "trXcLWii, хотя степень угнетения не столь глубокая, как у V~3I5. При укорочении-инициаторного фра-мента с 5-конца до 485, 563 и 6'»8 нкл способность к конкурентному угнетению трансляции сохраняется, но при дальнейшем укорочении до 765 нуклоотида полностью утрачивается. Степонь влиянии укороченных с 5-конца транс-криптоз на трансляцию РНК ЗЗМК с одной стороны и на трансляцию РНК ХВК и ifoUMV4 с другой, различны: ¿л 485,/л 563 и zt" 648 являются весьма слабыми конкурентами для РпК öüi.iK, но эффектно конкурируют с РНК ХВК и {f^LtlV4.

5-проксимальикй участок инициаторного ¡ррагмента (¿г 315-485) практически но влияет на трансляцию ни одной из тестированных РНК.

Гибридизация ir 485 с if 315-484, которая резко повышает эффективность трансляции'¿г 485, не ведет к полному восстановлению способности конкурировать • с РНК j'bi.iK. Возможно, что это связано с малой устойчивостью гибрида в условиях трансляции, но не исключено, что ИФ с разрывом ковалентной связи все же функционирует менее эффективно, чем нативный ИФ, что проявляется'только в условиях конкуренции( рис/3, S-1, рис. 2.1, а).

Формы ИФ с внутренними делециями, неактивные в трансляции, отличаются по своей способности к конкурентному угнетению трансляции

U ^ -160

$ » ' fefthfifc».»»! W 3 * 1« ь и гс m v . •

ïf f .. ~ *- < ,-r. fc e f

If - К __ '

Г Г '

i 2 3 4 5 б 7d y II fa Itf17 1920 10 12 14 J6 i8 .

,-23

I 2 a

w. «9

-- -28.;

123* 5 S 7 8 Э 12345

Рис.2/. Конкуренция транскриптов, содержащих полный и модифицированные формы ИФ с РНК ВЭМК (а), РНК ХВК (б) яЬч&ММ (в,г;.- : (а)- I-бвз РНК; 2-20 - 1,2 ш<г РНК ВЭМК; 3 и 4 - 0.3 и 0,6 -, шт ir 315; 5 и 6 - 0,15 и 0,3 икг"^ 315-831; 7 и 8 - 0,06 и 0,12 икг if 3.15-488; 9 и 10 - 0,24 и 0,48 мкг 1^485; II и . 12 - смесьb* 315-485 и ¿"435 'без предварительного отжига; 13 и 14 - то же, с предварительным отжигом; 15 и 16 -

■6"315д ¿,38-648 0,24 11 "кг« 17 и 18 ~ °'3 и °»6

315Д70?_72д; 19 :: 20 - 0,15 и 0,3 нкг^2€3. (6} 1-3 - 2,0 мкГМК ХВК; 2 - 0,6 мкг^315; 3 - 0,6 мигранта 315. (в; - 1-5 - I мкг trJÂMV4,2 и 6 - 0,9 мкг&- SI5; 3 и ? — I мкг^ 315-837; 4 и 8 - 0,9 мкг^-485; 5 и 9 - I икг^563. (г) 1-5 - I MKrtrWW4, 2 - 0,6 мкг^315^ад8_548; 3 - 0,6

мкг if 315д 701-763« ^ - э»6 ик1"^'315Д701-7'3; 5 ~ 0,6 икг -¿А- 315-831.

iiPHK. TV 315 д 4gg_¡348 Эффективно угнетает трансляции всех PsIK, ^ Л 701-763 и ^ Д 707-723 "Fакг 1140011 и н0 влияют на их трансляцию.-*

Суммируя Lea эти г.ан.но, моу.но сдолать выводи что способность угнетать трансляция мРНК присуща всем формам ИФ, у которых сохранена последовательность 648-763 (структурный демон 4).

Этой способностью, хотя и на в одинаковой степени, обладают транскрипты, как активные в трансляции, так и не транслирующиеся из-за отсутствия кодирующей области (укороченные с 3-конца) или из-за отсутствия необходимой для внутренней инициации последовательности 488-647 (. 315/^ 488-6^7^ • Несмотря на некоторые количественные различил (максимально подавляется трансляция РНГ ХВК, меньше и только при высокой ионной сила трансляции írMHVfy, и ощо меньше трансляция РНК ВЭМЮ, нот принципиальной разницы в характере влияния модифицированных форм ИФ на трансляцию матриц с разными типами инициации. 'Следовательно, последовательность 648-7ьЗ (структурный домен 4) направляет процесс, лимитирующий как совместную трансляцию

мРНК с внутренним типом инициации,так и совместную трансляцию. . этих ГНК с копированными или наг.зппрпванш-ми иРНК, икши'.ирующиг' трансляцию по зависимому от 5-коьиа ма/аниэму. ,

Таким образом, -в составе АФ РНК 33!»К (315-833) в пределах об- i ширной области 485-764, абсолютно необход>1ыой внутренней инициации, удалось выделить участок 548-76'+, который определяет способность РНК ВЭМК конкурировать с другими мРНК.'

4.3. Заключение

РНК БЗМК, как и другие пикориавир/счые РНК, использует нзоо'ыч-ный механизм для инициации трансляции. Главное aro отличив от г.по- ' соба инициации, используемого большинством РНК, транслирующжся в эукариотических клетках, состоит в том, что рибосомы связываются

нопосрадстзенно с внутренними участками 5-нетранслируемой области РНК боз При Д3ар«*1 пльного узнавания 5-конца РНК ( ,

,±^8,узла &С &0. ,1988).

Согчасно сканирующий модели инициации трансляции {Ксхак ,1983, 1989) необходимым условтм инициации г.о;г;пентидной цепи рибосомами аунариотичпсхих клеток явлчется наличие свободного 5-конца иРНК и ого участие в инициации трансляции. Сканирующий механизм предпола-гаот/^ервоначальное связывания рибосом (40.^ -субчастиц) мРНК происходит- вблизи'5-конца. Показано, что большую роль з этом процессе .играет узнавание кэи-структуры специальной группой фалторов инициации, причем процесс запускается фактором с!Р-4Р. Пикорнзвирусные РНК ре икето нт-структуры и на используют фактора 4Р для запуска механизма инициации \z-c.Jockivn ,Цоме£1 ^оанлх/:/ ,1990).

О механизме внутренней инициации, изучение которой началось с 1958 г., пока мало что изьестко. Два основных вопроса сводятся к следующему: что представляют собой инициаторныа фрагменты пикогна-вирусных РНК, направляющие внутреннюю инициацию, и какие транс-факторы участвуют в ое реализации. Сейчас.оба эти направления стремительно развиваются.

Определение границ инициаторного фрагмента РНК ВЭИК, проведанное в нашей работе, показало, что он находится между 315 и 834 нук-лоотидными остатками вирусной РНК, что достаточно хорошо сгласуется с данными ,(1988). Четко также определены границы ини-

циаторного фрагмента у РНК вируса ящура ( , ЬесК ,1990)

к !'.енее четко для полксвируса. {ъи.^'Лск&оп е* лА ,1990).

Во всех изученных случаях иницизторные фрагменты представляют собой протяженные нуклеотидные последовательности длиной в нескольк( сот пуклептидов, организованные в несколько структурных доменов,кон снрьативных для кардио- (ВЗМК) и афто-вирусов (вирус ящура) с од-

ной стороны и для энт«ро (полисвирусы) и ринов/русы г другой (си.

Pi ¿hen ко rX-. ,1989 айв).

Для изучения значимости отдельных участков и.чиниаторкого фрагмента РНК ВЭМК нами были использованы различные долоциенчнл мутанта 5-НТО, (с укороченным с 5-копца ИФ и с ИФ, содержащий внутренние да-' леции).

Определение эффективности трансляции этих мутантов и их способности угнетать трансляцию других РНК показало функциональную гетерогенность ИФ и позволило выявить некоторые функции отдельных его участков(и структурных доменов, в которые эти участки организованы).

Эти исследования поззолили различать в составе Ии* 3 главных функциональных участка (см.Рис.21): (I) последовательность 315-484 нкл, организованную в несколько относительно небольших демонов к входящую з нилнюю часть домена з, (2) последовательность 455-647,. представляющую собой верхнюю часть домена Ьи (3) последовательность 701-763, организованную в дсмен 4'. (I) последовательность 315-484 но является абсолютно необходимой для внутренний инициации трансляции, не ее присутствие многократно повыыает эффективности этого процесса. Эффзктизность трансляции //485, лишенной последовательности 315-484, на порядок ниже эффектов трансляции Z/3I5, содержащего полный (315-833) ИФ. После гибридизации ¿/-485 и ¿/"315-435 активность восстанавливается, т.е. стимулирующий аффект последовательности 315-485 на процесс внутренней инициации проявляйся к в составе ИФ, реконструированного из дзух козалантно несвязанных участ ков.

Эффективность функционирования ИФ, состоящего из двух фрагментов, не связанных козелентко, дает строгое доказательство того, что в процесса внутренней инициации но происходит сканирования 5-НТО рибосомами, по крайней до 484 позиции.

Свою^энхамсерную" функцию последовательность 315-484 выполняет в ассоциации с белкой р58, найденной в экстрактах клеток Кребс-2. Этот ÖcJ'ok специфичен для 5-КТ0 FKK B3I.IK к кастой его связывания является участок 315-484. В лизатах ретикулоцитов обнаружен аналогичный белок (р57), специфически связывающийся С s'-HTC РНК ВЗМК

( tanq , УЛ/х/чег, 1990) и РНК вируса ящура (I'#2 , Вес* ,1990).

С7 d

Связывание р53 с ИФ 23UK происходит в широкой диапазона ссла-зых концентраций и но тробуот предварительного плавления зторичной структуры РНК (происходит с равной эффективностью, как в присутствии, так и а отсутствии АТР). Это свидетельствует о высоком сродства р58 к ИФ ЗЗМК, что делаат этот белок хорошим кандидатом на роль фактора, запускающего процесс внутренней инициации. Если это так, то роль находящихся на участка 315-484 детерминант, специфически узнаваемых р58, во внутренней инициации ьожчо сравнить с ролью кэл-гтруктуры при зазисимой от 5-конца инициации: и те и другие детерминанты обеспечивают первичное узнавание мРНК и многократно стимулируют инициации. Процессы, происходящие в дальнейшей, принципиально отличны -- сканирование рибосомами 5-НТО в одном случае, и механизм, исключающий сканчрование -• в другом.

(2) Участки последовательности, абсолютно необходимые для внутренней инициации, расположены после 484 положения. Любые делации в зоне 485-763 приводят к полной инактивации ИФ ВЭМК. В этой обширной области можно выделить последовательность 485-648, составляющую верхнюю часть доиана 3. Укорочение последовательности с 5-конца до 563 нуклаотида (¿^563), которая разрушает вторичную структуру всего домена 3, или делетированиа области 485-647 (¿"315^ 485-С47^* ПРИ котором удаляэтея верхняя часть домана 3 без серьезны* изменений структуры нижней его части; полностью инактивирует ЙФ. Поскольку де лация 485-647 не ведат к кЗмбнанию структурной организации осталь-

Alione областей 1'.-?,то мояно сделать одкозна»ш1й в»эод,что участок 485-647 нужен для внутренней инициации как такорсй.1'; настоящее зрекя не известно како/-нибудд конкретной функции этого района /'Л.

(&) Последовательность 701-763 в дог.:ене 4,абсол:отно необходима для внутренней инициации,!! делении 62 или 15 нкл s это?', области (ir и ^ полностью лишают эти трачскригты спо-

собности к трансляции.Одновременно теряется присущая РЖ "Д.;.С и полному Ift способность угнетать матрпчнута активность РНК XiíK .и М/4 при совместной трансляции ¿n vibo .Таким образом,домен 4 ответственен за конкурентное угнетение м?ДК,обладающих зависимо?! от 5-кэ:пщ инициацией.Поскольку конкурен"ия происходит на уровне взаимодействия мРНК с факторами инициации (см.раздел 2),можно сделать вывод,что последов?-v, тельность домена 4 взаимодействует с трансляционннм ''актором, обдам для внутренне:-: и зависимое от b-конца инициации. .

Наличие домена 4 недостаточно для э 'Активно" конкуре,'тин с ?КХ .¿ЭМК.Лля этого необходим также участок который сам по себе

неактивен в конкуренции: 4, tj_g.- ч,имеююий эти два участка,по своему конкурентному потенциалу сра:;к;;м с ^£15-оо7,обладании полном Это ::о.ует свидетельствовать о сопряженности тушгг!/ 5-и З^проксималь-ных участков I"1,Косвенно на это указшз&ст и тот факт,что деления в домене 4 снижает уровень связывания рГ>3,которое имеет место па участке Е15-4-в4(рис.20в). !.;о«но заключить,что 1м> пикорнавирусов,содержание по несколько сотен пкл.не i.-огут рассматриваться как личе"ние структуры. Пеоьоначальнь'е представления,совмещающие идею внутренне!! посадки рибосом с элементами сканирующей модели( étlQ, ,[237; ¿t ttL.j I'jffl/оказались непоаЕовочнкми.Отделыше части И"» не только чункчиональ-но связаны,но и организованы в компактные структуры,в которых сайты связывания необходимых для внутренней инициация компонентов,по-видимо-му,определенным образом ориентирован« зу>уг относительно друга.

ВЫВОДЫ

I. йзучона регуляция синтеза белкэа 2 клетках Кребс-2, инфицированных вирусом энцефслоь'иокерднта:

а) Показано, что в зараженных клетках не происходит ни ускоренного распада клеточных мРНК, ни их необратимой инактивации.

б) Найдена адекватная модель, воспроизводящая Ф \fiin два эффекта, имеющих место в зараженных клетках - избирательное уп пение синтеза клеточных белкоз в общее угнетение трансляции. Такой моделью являются экстракты нззарааенных клеток Кребс-2, программируемые суммарными голи(А)-содернащими РНК, выделенными из зараженных клеток. По:;аьано, что оба эффекта связаны с присутствием вирус-специфических мРНК.

в) Показано, что в зараженных ВЭМК клетках не происходит модификации балоксинтезирующзго аппарата, приводящей i; нарушению инициации трансляции клеточных иРНК или дающий односторонние преимущества РНК ВЭМК, и предпочтительная трансляция РНК ВЭ.ДК обеспечивается, главным образец, за счет высокоэффективного механизма инициации •трансляции РНК ВЭ^К, позволяющего ей успешно конкурировать с клеточными мРНК за факторы инициации трансляции.

г) Покаьано, что конкуренция РНК ВЭМК с кэпировашшми мРНК имеет

более сложный механизм, чем конкуренция между кэпированпыми мРНК, и

не может быть сведена :: известной модели "дискриминирующего лимитирующего фактора, описывающей конкуренцию кэпированных матриц друг с другом.

д) Раскрыт механизм общего^избирательного подавления синтеза белков в зараженных ВЭМК клетках. Показано, что нарушения'происходят на ранних стадиях инициации трансляции и выражаются в угнетении образования 40£?-преинициато'рного комплекса. При этом кз происходит

необратимой инактивации фактора uIP-2 и других иакрочолокулярных компонентов, образующих 405 -пречнициаторный комплекс.

2. Проведено изучение числа сайтов инициации, функционирующих на РНК ВЭМК, и полипептидйв, закодированные вблизи иниц:\аторных сайтов:

а) Предложены модификации метода получения инициаторной форыил-р^]--мет-тРНКфвт , позволяющие получать препараты с высоким уровнем аминоацилирования и Формулирования, аффективно функционирующие in Vl'lrQ.

С) Показано, что А"-концевой белок полипротеина преА содержит лидер-ную У-концевую последовательность, которая поело расщепления преА выявляется в вида двух лидерннх полипептидов pl't и р12.

в) Установлено, что pI4, р12 имеют одинаковую Л'-концовуй аьинокио-лотную последовательность, что свидетельствует.о существовании единственного сайта инициации для пилипротоиьа ВЭМК. Сравнение выведанной и экспериментально полученной для р14 и р!2 //-концевой последовательности аминокислот позволило локализовать ини-циаторный сайт на первом AU& ранки считывания полипротаина.

г) Получаны данные, свидетельствующие о возможности функционирова ния на РНК ВЭМК при некоторых условиях дополнительного сайта инициации внутри кодирующей области полипротьина.

3. Изучена значимость различных участков 5-НТО РНК ВЭМК для внутрен-г ней инициации трансляции.

а) Фрагмент 5-НТО РНК ВЭ.'№ от 315 до 833 нкл, соединенной 5-концевым участком кодирующей последовательности (833-1155) более аффективно направляет внутреннюю инициацию трансляции, чем натизная 5-НТО полнораямарной РНК ВЭМК, и вызывает конкурентнее ингибировпние трансляции РНК ВЭМК. Таким образом, участок 315-833 является пол-

- 74 -

ным инициаторным фрагментом РНК ВЗМК.

б) Показана функциональная гетерогенность иницчаторного Фрагмента РНК ВЭик и определены некоторые функции отдельных его частей.

Последовательность 315-484 не является абсолютно необходимой, но ее присутствие многократно повышает эффективность функционирования инициаторного фрагмента. Послодоватальности 485-647 и 701-763 необходимы для внутренней инициации. Участок 701-763 определяет способность РНК ВЭМК конкурировать с мРНК с эависимым от 5-конца Типом инициации трансляции.

в) Показано, что ковалзнтно непрерывный инициаторный фрагмент и шшциаторный фрагмент, реконструированный путем гибридизации двух ковалентно несвязанных сегментов РНК (315-484) и (485-1155) обладают ¡.римерно одинаковой способностью направлять внутреннюю инициацию трансляции. Это является строгим доказательством отсутствия сканирования рибосомами области домена 3.

г) Обнаружен з экстрактах клеток Кребс-2 белок р58 специфически взаимодействующий с 5-НТО РНК ВЭМК и показано, что местом его связызания являатся последовательность 315-484.

СПИСОК РАБОТ.ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛА',! ДОКЛАДА.

1.Угарова Т.Ю.,Свиткин Ю.В..ГинеЕская З.А.,Агол В.К. Выделение и трансляция в бесклеточной системе матрично-активно:': РНК из цитоплазм! клеток аспитнои карциномы Кребс-2.Докл.АН СССР,т.21,с.996-999,(1973).

2. Угарова Т.Ю..Свиткин Ю.Б. .Гиневскаг? Л.А.,Агол П.П. Трансляция клеточных и вирусных РНК в экстрактах из клеток,зараженных вирусом энцзфаломиокардита.Докл.АН СССР,т.214,с.1210-1213,(1974).

3.Гиневская В.А..Свиткин 10.В..Угарова Т.Ю.,Агол В.И. Стабильность цитоплазматических (А)-содержащих РНК в клетках, зараженготх вирусом энцефаломиокардита .Докл.АН СССР,т.219,с.477-480,(1974).

4. Svitkin y.V.,UGarova f.U..Ginevskava V.A..Kalinina И.о..Scarlat x.v.

Y.I, Efficiency of trsnsla fcion of viral and cellular ciWIAD

in extracts from cells infected with encephalonyocarditis virus. 1ntervirology,v.4,p.214-221,(1974).

5.Свиткин.П.В. .Гиневская 3.А.,Угарова Т.•). Отсутствие функциональной инактивации клеточных м-РНК,выделенных из клеток Кребс-2,зараженных вирусом Э1ше';1Яломиокардита.Т! кн.:""опроси медитишскоМ вирусологии," ;,i.c.2;i-30,(I975).

6. Попов А.К.,Федотов А.Р..Дворкин Г.А..Угарова Т.П..Свиткин Я.Я., "кд^лсние ;:н 'ормагаонно;: РНК глобина кролика.Биохимия,т.46.с.S39--Р42,(1075).

7.Угарова Т.Л. .Гиневская Р..А..Свиткин Г>.И.,Агол *V.I. Функциональная активность ::ь\>оог.!апио1Шнх РНК.гаделешщх из клеток Кребс-2,заражен-нк:; вирусом энае '-аломяокардита.Докл. АН СССР,т.223,1269-1272, (1975).

8.Угарова Т.К). Бесклеточные белоксинтезирувсие системы из клеток эукариот.Л кн.:пйтоги науки и техники.Молекулярная биология" изд. :!:;нита,т.7,с.58-141,(197б).

Э.Угарова Т.Ю. Кесклеточная белоксинтезирулщая система из клеток асгитной карипногда Кребс-2.В кн.:"Современные методы в биохимии." зд. "Медицина", т .3,358-368, (1977).

10. Угарова Т.Ю.,Свиткин Ю.З. Бесклеточннй синтез белков в экстрактах, выделенных их клеток асцитной карциномы Кребс-2.Л кк.:"Физико-хиш-ческие методы в молекулярном биологии." ,Язд. МГУ,с.96-Т18,(1978).

11. Svitkin X.V.,Ugnrova T.U.,Ginevskaya V.A.,Agcl V.I. A cell free nodel of the encephnloinyocai'ditis virus induced inhibition of host cell protein syntesis.Virology,v.87,p.199-203,(1978).

12.Дижур A..i. .Угароиа Т.Ю. .Угнетение образования преинигиаторного комплекса (мет-тРЖк?-40 Ъ* субчастПца рибосоми) в клетках "ребс-2,зараженных вирусом эш:е<*аломиокардита.Докл.АН СССР,т247,с990-993(1979).

13. Агол Л.И.,Гинэвс;'а/1 А..Романова Л.ТЛ. .Свгткчн В.3.,Угарова Т.Ю., Черновскнч Т.Л.,Чумачов К.!.!. Биосинтез белков вирусов животных. \лтериалы 1У всесоюзного биохимического съезда.Тез.симг..докл.с.55-56. Изд. "Науке" ,..1., (1979).

14.Агол 1!.'Л. .Свпткин D.4..Угарова T.KJ. .Черног.скал Т.В. .Ляпустян В.Н., Лашкивич З.А.. Инициация тоансляцим плчвивирусных и пикорнавирусных РНК .3 кн.:" Стратегия гонома РНК -содеркадих вирусов у.т,тзотянх." c.S-4,M.(I980).

15. Длжур А..'.'., Угарова Т.Ю, .Изучение кет-т РНК^^связыЕающей активности в клетках Кребс-2,зараженных вирусом энцефаломкокаргита.

Там &е,с.П.

16.Угарова Т.Г|. .Черновска! Т.В.,Свиткик Ю.5. Пнициания трансляции РНК вируса знце'оа.чому.окярдпта ir, vitro .Там же. с.50-52.

Г>.Угарова Т.К..Дпжур A.M..Факторы инициации трансляции J клетках Кребс-2,зараженных вирусов ^нцефалохюкардита.З ки:"Макромолекулы в '-ункпиониручшчй клстке."с.88,П.у1",;шо,(19Я0).

10. дикур A.M.,Угарова Т.Ю. Активность -акторов инициации трансляции в клетках кребс-2,зараженных вирусом ^нце'паломиокардита. доклады АН СССР,т.261,е.1013-1016,11981).

jf). Svitiiin Y.V.,Ugarovn i.Y. .Chernovnkaya T.V. ,L.yapustic V.K.,

Lashkevich. V.A. ,Agol V.I. Trcnsletion of tick-bom encephalitis virus (flavivirus) ¿enome in vitro: Syntesis of two structural polypeptides. Virology,1531 v.110,p.26-34,(1981)

20. Uizhoor .l.M.,Ugarova T. Y.,Study on the Met-titNA-binding activities in Krebs-2 cell,infected with encepualocyocarditis virus.'

FEBS Lett.,v.128,p.43-45,(1981)

21. Kazachkov Y.A.,Svitkin Y.V..Cnernovskaya T.V..Siyanova Y..Ugarovp T.Y.,Agol V.l. Leader polypeptides encoded in the 5-i'egion of the 1 encephelomyocaraitis virus genome.FEBS Lett.,v.141,p.153-156,(1982)

22.0иянова Е.Ю.,Черновска'1. Т.В. .Свиткин Ю.В. .Казачков Ю.А..Угарова Т.Ю. Сравнение//-концевых трицтических пептидов,происходящих из белков npeA.pi4.pI2 и суммарных продуктов транслялии РНК вируса эндеЛало-миокардита.Молек.генет.бикроб.вирусол. №2,0.41-45,11984).

23. .Угарова Т.Ю..Сиянова Е.Ю.Дижур A.M. Влияние различных фракций «акторов инициации ка трансляционную конкуренцию клеточных мРНК и РНК вируса &нцефаломискардита^ез.докл. 16 конф. ФЕ50,с.39,М(1984]

¡¿4. Ugarove 'I.j., Siyanova E. 1. .Svitkin Y.V. ,Xa':ach]iuV l.A. ,3aratovd L„A.,Agol V.X. Partial N-trn.unal erino .-,cid jequcmcca of :>oly-Feptirtss p'i4 and p12 of enc^piioi om^'ocaniitis viruy ;irj identical and correspond to tho ir-terminun of the viral polyprot^in. FiSS. Lett.,v.170,p.339-342,(15Й4).

25. Ljapustin V.N. ,Svitkin Y.V.,Ubarova '¿.1. ,Lashktvici V.A.,A;jol V.I. A tentative model of formation Df .-uructural proteins of tick--bnrno encephalitis virus (floviviru3).FEbS Lett. ,v.20C,p.3'i4--316, (19t-6).

¿¡6.Угарова Т.Ю..Первичная структура r.'i'KX я трансляционная стратегия эукариот.:.'ол<:чулярнач биология. ,т.21,с.888-414,(1937).

27.Карасев А.В..Мирошниченко Н.А.,Угарова Т.Ю. Использование бесклеточноМ системы из клеток асцитной кари."нош Кребс-2 для трансляции РКК вирусов растени!:.Молекулярная биология. т.23,с.П >-126,(1539).

28. Evstafieva A.G.,Borodin A.V.,Ucarova '£. ,Shat3ky I.::. Functional heterogeneity of the 5-noncoding fragment responsible fi-.:- the internal initio jion of enceptalomyocarda tis virus KNA translation.

In : "Regulation of translation." p .¿5 ,RJ £0, Latviya, (19 9).

•29. Borovjabin A.V.,»:vstafievfi A.G.,U^arova f.Y. .Sliofcs'/.y I.N.

A factor tnut specifically bina- to tле 5-untranslated гейДоц of enccphalorr-7ocar,liti3 virus КИЛ.FKBS. Le 11.,v.261 ,p .237-240, (1990).

30. Evetafievs A .G.',U.3arov& T.Y., Chernov B.K. ,Shatsky I.E. A cocplex HIIA sequence dotrroinja the internal initiation of oncephalotnyocaT^-ditis virus HN^ tran.~Ietion.."!ucleic AcidsKet. v. 19,p.¿65-671(1991).'

31. Borovjagin A,V.,Ezrokiii К.У. ,Posfcaps«ev V.M. .Ugarova T.Y., Byrtrova X.F.jShataky i.N. A . -prccelninteraction within the interviral translation initiation re^iun cf encephalomyocarditis viru3 HNA. Nucleic Acids.Kos. ,v.19, 499S-5005 , (1991).