Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия генома пикорна- и флавивирусов в бесклеточных белок-синтезирующих системах

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генома пикорна- и флавивирусов в бесклеточных белок-синтезирующих системах"



На правах рукописи УДК 576.858.23; 578.835.29

свиткин

Юрий Васильевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОМА ПИКОРНА~ И ФЛАВИВИРУСОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ БЕЛОК-СИНТЕЗИРУВДИХ СИСТЕМАХ

03.00.06 - вирусология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

МОСКВА '1989 ■

На правах рукописи УДК 576.858.23; 578.833.29

СВИТКИН Юрий Васильевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОМА ПИКОРНА- И ФЛАВИВЦРУСОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ БЕЛОК-СИНТЕЗИРУЩИХ СИСТЕМАХ

03.00.06 - вирусология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

МОСКВА '1989 •

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Научный консультант: член-корреспондент АМН СССР,

^доктор биологических наук В.И.Агол

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН СССР,

доктор биологических наук Л.П.Овчинников

член-корреспондент АМН СССР, доктор медицинских наук Н.В.Каверин

доктор медицинских наук Л.Б.Эльберт

Ведущая организация: Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского

• АМН СССР

Защита состоится " " _ 1989 г. в _ часов

на заседании специализированного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита .

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Автореферат разослан " " _ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

(О.А.Медведкина)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Работа открывает новое направление в исследованиях реализации генетической информации пикорна- и флавивирусов. Это направление основано на использовании эффективных бесклеточных систем, позволяющих моделировать и изучать in vitro синтез вирус-специфических белков. Результаты исследований позволили решить ряд вопросов, связанных с инициацией и элонгацией синтеза вирус-специфических полипептидов, порядком кодирования их на вирусном геноме, механизмами процессинга полипептидов-предшественников и ролью протеаз. На модели полиовируса продемонстрирована принципиальная возможность участия механизмов трансляции в экспрессии аттенуированного или вирулентного фенотида ятзммрв. Полученные результаты сопоставлены с • данными исследований первичной структуры и организации вирусных геномов.

Актуальность проблемы обусловлена важной ролью пикорна- и флавивирусов в инфекционной патологии человека и ограниченностью представлений о механизмах реализации их генетической информации.

Пикорнавирусы являются возбудителями широкого круга заболеваний человека, проявляющихся, в частности, в виде параличей., энцефалитов, менингитов, миокардитов, ¡гепатитов и обычных простуд. Флави-вирусы вызывают тяжелые энцефалиты, желтую и геморрагические лихорадки, а также ряд других заболеваний.

К началу исследований было известно, что как пикорна-, так и флавивирусы содержат одноцепочечную РНК положительной полярности, которая является матрицей для синтеза всех вйрустспецифич'еских белков (Rueckert, 1976, Boulton, Westaway, 1977, Naeve, Trent, 1978, Wengler et al., 1978). Однако способ, при котором одна молекула мРНК направляет образование набора вирус-специфических белков, оставался неясным. Результаты опытов с зараженными клетками, по мне-

нию ряда исследователей, указывали на то, что при трансляции геномов пикорна- и флавивирусов используются принципиально различные стратегии. Для пикорнавирусов постулировалось существование одной точки инициации трансляции и формирование "зрелых" вирус-специфических белков путем последовательного протеолмткческого расщепления полипротеина - продукта полной трансляции геномной РНК (Rueckert, t976). Напротив, данные по синтезу белков флавивирусов in vivo были интерпретированы в пользу модели независимой инициации синтеза каждого белка (Westaway, 1977). Эта модель не укладывалась в рамки общепринятой концепции о том, что эукариотические мРНК функционально моноцистронны, то есть могут иметь лишь один участок инициации трансляции (Jacobson, Baltimore, 1968, Когак, Shatkin, 1978). Таким образом, решение вопросов, связанных с реализацией генетической информации пикорна- и флавивирусов, помимо медицинского значения представляло и общебиологический интерес и, несомненно, являлось актуальной задачей.

В связи с тем, что изучение синтеза вирус-специфических белков in vivo не позволяло получить ответы на многие вопросы, касающиеся трансляции вирусных РНК и процессинга полипептидов-пред-шествевников, в настоящей работе предпринята попытка изучить эти стороны экспрессии вирусных геномов путем моделирования in vitro. На предварительном этапе исследований были получены эффективные бесклеточные системы, адекватно моделирующие синтез большинства вирус-специфических белков. Исследования проводили на модели вируса энцефаломиокардита (ВЭМК), полиомиелита (ВП), относящихся к пикорнавирусам, и вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) - представителя флавивирусов. Выбор моделей был обусловлен большой медицинской значимостью этих вирусов {в случае ВП и ВКЭ), а также высокой мат-

рйчиой активностью вирусной РНК (в случае ВЭМК). Последнее обстоятельство позволяло синтезировать вирус-специфнческие белки in vitro в количествах достаточных для структурных исследований, что было существенно при биохимическом картировании пикорнавирусного генома.

Цель н задачи исследования. Основная цель работы состояла в изучении и сравнительном анализе способов трансляции геномов пи-корна- и флавнвнрусов, биохимическом картировании вирусных полипротеинов, изучении вопросов регуляции вирус-сиеи..¿ического бслкоього синтеза. При этом были поставлены следующие задача:

1. Оптимизировать условия трансляции РНК пикориа- и флавнвИ-русов in vitro с целью повышения выхода продуктов, соответствухдих 'вирус-специфическчм белкам.

2. Изучить кинетику аккумуляции продуктов трансляции вирусных РНК и последовательность этапов процесскнга полииептядов-предяест-венников. Установить природу лротеаз, учзствуювих в образовании "зрелых" вирус-специфических белков.

3. Идентифицировать NH,-концевые продукты проиессиига вирусных полипротеинов. Провести олигопептидный анализ вирус-специфических белков и установить взаимоотношения "предпественник-продукт" между ними. Использовзть полученные результаты для составления биохимических карт.

4. Изучить возмонности регуляции синтеза вирус-специфнчоскнх белков пикорна- и флавивирусов.

Научная новизна работы. Из клеток Кребс-2 впервые получена бесклеточн-я система, ос/ществляюаая полную и эффективную трансляцию генома ВЭМК. Трансляция сопровождалась образованием почти полного набора вирус-специфических белков, выявляемых в зараженных клетках и, в частности, функционально активной вирус-специфической

протеазы, способной правильно процессировать полипептидные предшественники. Изучена кинетика аккумуляции продуктов бесклеточного синтеза. Проведен олигопептидньш анализ ряда вирус-специфических белков. Полученные данные подтвердили модель трансляции генома ВЭМК с одной точки инициации и позволили уточнить биохимическую карту этого вируса. В фракционированной бесклеточной системе продемонстрирована неравномерность скорости элонгации полипротеина ВЭМК, в частнссти, существование барьера трансляции на границе "генов" структурных белков и полипептида F. Показано, что данный барьер активируется при дефиците фактора элонгации (eEF-2}. Впервые сделан вывод о том, что скорость элонгации на различных участках мРНК может по-разному зависеть от концентрации eEF-2.

Изучена трансляция РНК аттенуированных и вирулентных штаммов ВП типа 1 и 3 в бесклеточных системах из клеток Кребс-2 и ретикуло-цитов кролика. Впервые показано, что у вакцинных штаммов Сэбина ат-тенуация сопровондается снижением эффективности трансляции вирусных РНК. Высказана и обоснована гипотез», согласно которой первичный молекулярный эффект аттенуирующих мутаций в 5' нетранслируемой области генома связан с уменьшением сродства вирусной РНК к фактору инициации трансляции; следствием этого является снижение эффективности трансляции РНК соответствующего итамма и связанное с этим ограничение его размножения в центральной нервной системе.

Впервые изучена трансляция РНК флавивируса (ВКЭ) в системах in vitro. В бесклеточной системе из клеток Кребс-2 РНК ВКЭ направляла преимущественно синтез двух структурных белков - р53 (полипептидного компонента гликопротеида Е) и р13 (капсидноге белка С). На основании динамики аккумуляции продуктов внеклеточного синтеза, результатов их олигопептидього анализа и других даиных сформулирована схема образования структурных белков ВКЭ. Согласно этой схеме

для синтеза структурных белков используется один участок инициации трансляции и образуюшийся поедшественник подвергается поэтапному процессингу с образованием "зрелых" белков вируса. Ряд этапов про-цессинга протекает с участием протеаз клеточного1 происхождения, ассоциированных с мембранами эндсплазмзтнческого ретикулумз (в отличие от ситуации с процессингом полипротеина пикорнавирусов).

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР - чл.-корреспондентами АМН СССР Е.И.Аголом и В.А. .Пашкевичем, кандидатами биологических наук А.Е.Горбаленей , Ю.А.Ка-зачковым, В.Н. Ляпустиным и С.В.Масловой, а также сотрудниками Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологин и биоорганической химии МГУ - кандидатом биологических »пук Т.Ю.Угаровой и Т.В.Пестовой.

Практическая ценность работы. Создание принципиально новых лротиговирусных вакцин и химиотерапевтических препаратов в значительной мере тормозится из-за недостатка наших знаний об организации геномов вирусов и реализации их информации. В настоящей работе получены ответы на вопросы, касающиеся функционирования геномов пикорна- и флавивирусов, имеющих медицинское значенне. Так, например, при изучении полиовируса был открыт трансляционный механизм экспрессии аттенуирующих мутаций и продемонстрирована возможность использования бесклеточных систем для установления аттенуированно-го или вирулентного фенотипа штаммов. Результаты этих исследовании предполагается использовать при создании и испытании новнх вакцинных штаммов В11, изучении генетической стабильности вакцин в организме человека и установления причин осложнений при вакцинации (так называемого вакцин-ассоциированного полиомиелита). Проведение подобных работ является составной частью программы ВОЗ, направлен-

ной на полную ликвидацию заболеваемости полиомиелитом к 2000 году. Данные, полученные при изучении ВКЭ, послужили одним из.обоснований для вычленения флавивирусов из семейства Togaviridae и основой для разработки молекулярно-биологических критериев при формировании нового семейства Flaviviridae (Brown, 1986). Следует отметить, что разработанные бесклеточные системы трансляции могут быть испол« зованы для решения многих других задач в области вирусологии, а так хе вопросов молекулярной биологии, связанных с функционированием белок-синтезирующего аппарата эукариот.

Материалы работы используются в курсах лекций на Биологическо! факультете МГУ им. М.В.Ломоносова. Ряд методических разработок составил основу задачи большого практикума по вирусологии (Практикум по общей вирусологии, с.-143-156. Изд-во МГУ, М., 1981).

Апробация работы.. Материалы работы были доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Стратегия генома РНК-содержащих вирусов животных" (Москва, 1980), международной конференции молодых специалистов стран-членов СЭВ (Москва, 1981), 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), совещаниях экспертов ВОЗ по вопросам усовершенствования вакцин против полиомиелита с помощью современной биотехнологии (Женева, 1984, Лондон, 1986), на XIX и XX научных сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1981, 1985), на международном симпозиуме по флавивирусам (Новосибирск, 1986), на международном симпозиуме "Фундаментальные и прикладные аспекты молекулярной биологии ликорнавирусов (Москва, 1988).

Использованные сокращения. ВКЭ, ВП, ВЭМК - соответственно, в: рус клещевого энцефалита, вирус полиомиелита и вирус энцефаломио-кзрдита; ДТТ - дитиотреит, 5' НТО - S* нетранслируемая область; ПААГ - полиакриламидный гель; ФБС - фракционированная бесклеточиа

система; ФКИ - фактор, корректирующий инициацию*, ФПР - фракция промывки рибосом.

1. ТРАНСЛЯЦИЯ РНК ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА IN VITRO: СИНТЕЗ И ПРОЦЕССИНГ ПИКОРНАВИРУСНОГО ПОЛИПРОТЕИНА 1.1. Условия полной трансляции РНК ВЭМК и правильного процессии га полипептидов-предшественников

• Попытки изучить трансляцию РНК ВЭМК, используя бесклеточные белрк-синтеэирующие системы, предпринимались многими исследователями. Продукты, образующиеся в этих системах, однако, не совпадали по электрофоретической подвижности со "зрелыми" вирус-специфическими белками, обнаруживаемыми в зараженных клетках. Различие между продуктами, синтезирующимися in vivo и in vitro, было обусловлено двумя факторами: неполной трансляцией вирусной РНК и неэффективным разрезанием образующихся .полипептидов-предшественников (Boime, Leder, 1972, Hunt, 1976).

В данной работе подобраны условия, позволяющие в экстрактах из клеток Кребс-2 осуществлять полную трансляцию генома ВЭМК. В усовершенствованной бесклеточной системе образовывались почти все "зрелые" вирус-специфические белки, что свидетельствовало о правильном разрезании полипептидов-предшественников. Резкое увеличение эффективности и полноты трансляции РНК ВЭМК связано с введением двух методических приемов: использованием Са^*-завнсимой микрококковой нуклеазы для разрушения эндогенных матриц (Pelham, Jackson, 1976) вместо длительной преинкубации системы при 37° С и выбором адекватных ионных условий.

Использованная система характеризовалась очень низким эндогенным включением аминокислот. В присутствии РНК ВЭМК синтезировался набор полипептидов, характер которого зависел от концентрации ионов К+ (Рис.1) и (Agol et al., 1980). При низких концентрациях

КС1 (65 мМ) основной продукт трансляции РНК ВЭМК в экстрактах из незараженных клеток соответствовал полипептиду с молекулярной массой около 112 кД (ргеА). ргеА монет быть расщеплен in vitro с образованием структурных белков вируса (см.ниже) и, таким образом, является продуктом трансляции участка генома, кодирующего структурные белки. Повышение концентрации КС1 вызывало появление полипептидов, совпадающих при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) ( вирус специфическими белками А*, В, С, D, D1, Е, е, F, в, т, р22**, G, I и Н, синтезирующимися в зараженных клетках. Сходным образом и; менялся набор продуктов трансляции РНК ВЭМК при увеличении концентрации Mg^+ с 2,0 до 3,0 мМ. Концентрации К+и при которых вирус-специфические белки наиболее хорошо выявлялись, были в диапазонах, соответственно,'120-140 мМ и 3,0-4,0 мМ.

Из продуктов, образующихся in vitro, лишь 4 полипептида -ргеА р39, р14 и р12 - не обнаруживались среди белков, синтезирующихся in vivo. Следует отметить, что в отличие от других полипептидов, ргеА и р39 не аккумулировались в заметных количествах, когда транс .ляцию проводили в экстрактах из зараженных ВЭМК клеток Кребс-2 (Рис.1). Таким образом, набор белков, образующихся при трансляции РНК ВЭМК in vitro, особенно в экстрактах из зараженных клеток, очен близок к таковому, синтезирующемуся in vivo. Исключение могут составлять капсидные белки В и б, отсутствующие в системах in vitro.

* Основные результаты данного раздела работы были получены до принятия универсальной номенклатуры белков пикорнавирусов L-4-3-4 (Rueckert, Wimmer, 1984). В связи с этим обозначения вирус-специфических белков ВЭМК даны в соответствии с таковыми, принятыми ранее (Rueckert, 1976)

** Здесь и далее pN соответствует полипептиду с молекулярной массой N кД

КС! (ЛЧМ)

85 125 165 85 125 165 3 65 I 105 1145 I В 65 I 105 1145 | В

fe ¿-.:í frt* ¿wí —

. nrmrnt-

63 C t M? Г

-.У".' V*-/

_____)srf» —••

г»» «н* б"8? «-'J _

I ■ ХШ 1,1 Ни

!00 (А) 90(B) 84 (С) 75 (D) 65 (DI) 56 (Е)

40 38 34

23 (у, р22)

Экстракт из не-зараженных клеток

Экстракт из зараженных клеток

Рис.1, Влияние концентрации KCl на синтез вирус-специфических полипептидоа в экстрактах из незараженных и зараженных ВЭМК клеток Кребс-2

Пробы (0,1 мл) инкубировали с РНК ВЭМК, [14С]лизином и другими компонентами при 4,0 мМ MgCl2 и различных концентрациях KCl. Инкубация при 30"С 150 мин. Продукты анализировали с помощью электрофореза в градиентном 8-20* ПААГ. (Э) - эндогенная проба. (В) -белки, специфические для ВЭМК, синтезирующиеся в зараженных клетках; их молекулярные массы (в кД) н обозначения даны согласно работе Рюккерта (Rueckert, 19/6). Приведенные значения молекулярных масс были определены исходя из подвижности белков при электрофорезе в ПААГ и незначительно отличаются от истинных значений молекулярных масс, установленных на основании последовательностей аминокислот (Palmenberg, 1984). Белки р22 и у, а также Н и I синтезировались как in vivo, так и in vitro, но не разделялись при использованных условиях электрофореза. Данные белки могли быть разделены при электрофорезе в линейном 12,5t ПААГ (Svitkin et al., 1979).Полипептиды р14 и р12, мигрирующие в ПААГ между G и I, не стабильно in vitro и, как правило, выявлялись при более коротких инкубация*.

Однако, образование этих белков путем расщепления полипептида с происходит на поздних стадиях инфекции и связано с формированием вирионов (ЯиескетЧ, 1976). Очевидно, что усовершенствованные бесклеточные системы вполне можно рассматривать как адекватные модели для изучения механизмов трансляции РНК ВЗМК и процессинга полипептидов-предшественников.

1.2. Бесклеточный синтез функционально-активной вирус-специфической протеазы, ее идентификация и роль в расщеплении вирусного полипротеина

Сравнение продуктов трансляции РНК ВЭМК в экстрактах из нега-раженных и зараженных клеток (Рис.1) показывало, что последние содержат активность, способствующую расщеплении ргеА. Этой активностью могла бы обладать вирус-специфическая протеаза, предсуществую-щая в экстрактах из зараженных клеток. Предположение о существовании такой протеазы нашло подтверждение в эксперименте, в котором ргеА, полученный путем неполной трансляции РНК ВЭМК, инкубировали в присутствии ингибитора элонгации (циклогексимида) с экстрактом из незараженных или зараженных ВЭМК клеток Кребс-2 (СогЬа1епуа ег а1., 1979, Agol ег а1., 1980). При этом, в последнем (но не в первом) случае ргеА специфически расщеплялся с образованием полипептидов 01, с, а, т, в, а также р12, этому расщеплению способствовало присутствие восстанавливающего агента - дитиотреита (ДТТ). Таким образом, протеаза, расщепляшдая ргеА, аккумулируется в зараженных клетках. Следует отметить, что ограниченное расщепление ргеА происходило и в экстрактах из незараженных клеток, транслирующих РНК ВЭМК. Однако, этот факт можно объяснить синтезом вирус-специфической протеазы йе яоуо. И, действительно, результаты экспериментов Пэ-лэма (Ре1Ьаа, 1978) н наших опытов (Лго1 е1 а1., 1980) показали, что продукты трансляции РНК ВЭМК в экстрактах из незараженных клеток

вполне могут быть использованы в качестве источника протеазной активности для специфического расщепления ргеА на D1, е, в, у, G и Р12.

Значительный интерес представляла идентификация вирус-специфической протеаэы. В работе Лоуренса и Тэча (Lawrence, Thach, 1975} сообщалось, что активность, расщепляющая ргеА, соочищяется с кап-сидным белком у- С другой стороны, нуклеотидная последовательность, кодирующая протеаэу, была картирована в районе, отличном от того, который направляет синтез структурных белков (см.ниже). Для разрешения этого противоречия было проведено специальное исследование. (Gorbalenya et al., 1979, 1981, Гсрбаленя, Сзиткин 1983), где Показано, что протеаза ВЭМК, присутствующая в экстрактах из зараженных клеток, соочищается с полипептидом, имеющим молекулярную массу около 22000 (р22). По электр.офоретической подвижности р22 очень близ.ок к капсидному белку у (его молекулярная масса около 23000) и, по-видимому, был ошибочно принят за этот белок в исследовании Лоуренса и Тэча. Изучение свойств р22 показало, что он принадлежи г к тиоло-вым протеазам (Горбаленя, Свиткин, 1983). Роль белка р22 (и аналогичных белков других пикорнавирусов) в расщеплении предшественника структурных белков была подтверждена многими авторами (Palmenberg et al. ,1979; Hanecak et al., 1982). Кроме того, было показано, что аминокислотная последовательность р22 участвует в большинстве актов первичного расщепления полипротеина и может осуществлять протеоли-тическую функцию также в составе насцентных цепей и завершенных ио-липептидов-предшественников (автокаталитический процессииг) (Palmenberg, Ruecksit, 1982, Jackson, 1986).

1.3. Кинетика аккумуляции продуктов трансляции РНК ВЭМК и уточьение биохимической карты этого вируса

Исследования Т.¡О.Угароаой к сотрудников покачали, что в обра-

ботаниых микрококковой иуклеазой экстрактах из клеток Кребс-2 РНК ВЭМК транслируется преимущественно с одной точки инициации (Сияно-ва и др., 1984, игагоуа ег а1., 1984).

В связи с этим существенную информацию о порядке кодирования полипептидов на геноме ВЭМК можно было получить, анализируя кинетику аккумуляции этих полипептидов в бесклеточной системе (Табл.1).

Таблица 1

Кинетика появления вирус-специфических полипептидов в экстрактах из незараженных клеток Кребс-2, программируемых РНК ВЭМК'(Азо1 ег 3.1., 1981)

Полипептид Время появления (мин)

рге А ^ 30

Р 45

I 50

С 60

Б 60

р39 60

С 60

р14 60

65

Е 65

а 65

р22 70

с 150

При этом мы имели ввиду, что время появлешая дискретных полипептидов зависит главным образом от двух факторов: (1) расстояния соответствующего "гена" от участка ннициашш трансляции; (2) скорости процессинга полипептидов, являющихся предшественниками для данного белка. В.связи с этим данные, представленные в Табл.1, позволили картировать лишь "первичные" продукты трансляции, иными словами полипептиды, возникающие в везультате расщепления растущих

цепей полипротеина. Такими продуктами являются полипептиды А(ргеА), F и С (Rueckert, 1976). Данные табл.1 указывали на то, что эти продукты транслируются в порядке ргеЛ-F-C. Это согласовывалось с результатами картирования генома пикорнавирусов с использованием других подходов (Rueckert, 1976).

Последовательность появления полипептидов в экстрактах из клеток,' зараженных ВЭМК, в целом, соответствовала таковой, наблюдаемой в экстрактах из незараженных клеток. Однако, можно было отметить ряд отличий, связанных, по-видимому, с функционированием предсинте-зированной вирус-специфической протеазы: (1) аккумуляции ргеА не происходило, наиболее крупный продукт бь:л пгедставлен полипептидом А; (2).р14 и р12 появлялись уже на самых ранних сроках (спусти 15 мин) после начала инкубации, эффективность их аккумуляции зависела от присутствия ДТТ; (3).белки с, у, а и G аккумулировались в больших количествах и появлялись на более ранние сроки, чем в экстрактах из незараженных клеток (Agol et al., 1980).

Очень раннее появление р!4 и р12 в экстрактах из зараженных клеток (до завершения синтеза ргеА) говорило о том, что эти полипептиды отщейляются вирус-специфической протеазой от NHj-kohuo растущих цепей полипротеина, причем это отщепление происходит без всякой задержки. Ш^-концевая локализация р14 и р12 в полнпротеине была подтверждена в опытах, проведенных совместно с Т.Ю.Угаровой и сотрудниками, где использовалась икициаторная f['35S]Met-TP.HK£et (Kazachkov et al., 1982). В экстрактах из незараженных клеток метка из этой тРНК включалась исключительно в ргеА, а при его процес-синге препаратом вирус-специфической протеазы перераспределялась в р14 и р12 ("лндеркые" полипептиды). Дальнейшие исследования показали, что р14, р12 и ргеА характеризуются одинаковой Л^-концсвой аминокислотной последовательностью, соответствующей NH2-концу по-

лкпротеина (Ugarova et al., 1984).

При нротеолизе ргеА наряду с "лйдерн'£»ш,,: полипептидами и структурными белками образовывался неструктурный полипептид G. Анализ триптических пептидных карт показал, -что"пептиды G содержатся как в ргеА так и в А. Положение G относительно других белков было-определено в экспериментах типа пульс-чейз. Экстракты, программируемые

14

РНК ВЭМК, инкубировали со смесью С аминокислот в течение различных промежутков времени (от 5 до 90 мин), спустя эти сроки дальнейшее включение метки прекращали добавлением избытка немеченных аминокислот и тРНК, инкубацию всех проб продолжали до 2,5 ч для достройки полипротеина и процессинга предшественников. В- таком опыте при короткой импульсной метке радиоактивные изотопы преимущественно включаются в полипептиды с М^-концевым положением в полипротеине. При увеличении длительности метки аминокислоты будут последовательно включаться в полилептиды, расположенные дальве-от NH^-конца. Было показано, что из белков, входящих в состав А,"в первую очередь метится D1 (предшественник капсидных белков -б, ви'у), затем следует . синтез а и, наконец, G. Таким образом, порядок расположения этих трех белков в полипептиде А будет liH^-D'-a-G-COOH (Kazachkov et al., 1983).

Значительный интерес'й^ейставляло картирование р22, обладающего протеазной активностью. В'кинетических опытах этот белок появлялся на поздних срекйэс'инкубации (70 мин), т.е. позже основной мае сы вирус-специфическйх белков, включая Е (Табл.1). Этот факт можно было интерпретировать двумя способами: (1) р22 локализован в С00Н-концевой области полипротеина; (2) р22 не является концевым, а образуется «з ййлипептида-предшественника с относительно низкой скоростью- Для того, чтобы различить эти возможности были проведены опыты типа пульс-чейз (Svitkin et al., 1979). В определенные проме-

жутки времени после начала трансляции из бесклеточной системе otftit-рали по 2 пробы, одну из проб немедленно фиксировали, a яругу» про-

I

должали инкубировать а присутствии ингибитора элонгации (циклогек-симнда) для процессинга образовавиихся к этому Времени прслшестиеи-■ никоя. В stom опыте р22 (наряду с р39) »первые появлялся в пробе, которая подвергалась "ueftsy" спустя 40 мин после начала трансляции, заметно раньше, чем Е. Одновременно с р22 в системе появлялась специфическая протеазная активность, регистрируемая по образованию DI, a, G и р14 - продуктов растепления pteA. Появление р22 при чсП* эе показывало, что он образуется в результате расщепления предшественников. Для идентификации этих предшсстпеннихов вирус-специфические продукты трансляции и р22 подвергали частичаому прйтоолиэу про-теаэой из Streptonyces caeapitosus н полученные пептиды анализировали электрофорезом в ПААГ (Svitkin ft al., 1979). Кроме того, С ni и получены двумерные карты триптнческих пептидов белков D, Е, р39, р22 и Н, синтезируюяихся in vitro и in vivo. Результаты этих анализов показали, что аминокислотная последовательность р22 пходит в состав полипептияов D {наряду с последовательностью EJ и р39 (нлря-ду с последовательностью Н) (Svitkin et al,, 1979, Казачков, Свнт-кин, 1981). Как уже отмечалось при анализе кинетических опытов, р22 имеет NH^-концевую локализацию по отношению к Е. Таким образом, расположение "зрелых" вирус-специфических белков в полипептиде С будет NH2-H-p22-E-COOH, а в промежуточных предшественниках р39 и D, соответственно, NH,-H-p22-COOH и NH2-p22-E-COOH. В соответствии с этим полипептид С помимо расцепления на Н и D способен претерпевать альтернативный процессииг с образованием р59 и Е.

Полученные результаты позволили предложить уточненную биохимическую карту генома ЕЭМК, включившую полипептиды р14, р12, ü, р39 i; р22 с ранее неизвестной локализацией (Рис.2).

35 в РНК ,,

5-,--Э

бв пни

мнг----------------— соон

рг«Д_ I с

ркШ

Р12*~ в рааГ

01

Л Р

к

Рис. 2. Карта процессинга полипротеина ВЭМК (2\'1Лк1ь, А^оХ, 1983).

Положение вирус-специфических белков дано согласно данным литературы (Яиескегг, 1976, Ииескегг е! а1., 1580) И результатам настоящей работы. Полипептиды, впервые картированные в настоящей работе, обозначены звездочками.

Эти результаты были также использованы при разработке новой номенклатуры белков пикорнавирусов (1-4-3-4), отражающей их структуру, функцию и расположение в полипротеине (Яиескегг, Кхашег, 1984). Карта, представленная, на Рис.2, была полностью подтверждена после установления полной последовательности нуклеотидов в геноме ВЭМК и частичной последовательности аминокислот в вирус-специфических белках (Ра1тепЪег5 е! а1., 1984).

1.4. Неравномерность скорости элонгации пйлипротеина ВЭМК: "Барьер" трансляции на границе генов для структурных и неструктурных вирус-специфических белков и условия его активации

Известно, что движение рибосом вдоль мРЛК осуществляется с неравномерной скоростью. Замедление или временную остановку трансляции в' определенных участках матрицы можно наблюдать в бесклеточных системах, где до завершения синтез* иилипептидных цепей регистриру-

ется образование дискретных полипептндов различной длины. Как уже отмечалось, полнота трансляции РНК ВЭМК in vitro сильно зависит от условий. Довольно часто наблюдается ограничение трансляции, по-видимому, связанное с функционированием слабого "терминирующего сиг-вала", расположенного в РНК где-то на границе "генов" ргеА и F (F-барьера). Мы обнаружили, что F-барьер активируется при неоптимальных концентрациях солей (КС1, MgC^), а также при трансляции во фракционированной бесклеточной системе (ФБС).

ФБС, содержащая рибосомы и надосадочную аидкость после ультрацентрифугирования экстрактов, и другие компоненты в обычных конце«-' грациях, при программировании РНК ВЭМК направляла синтез ргеА со скоростью лишь незначительно отличающейся от таковой, "характерной для грубых экстрактов, однако синтез других белков, в частности, F был резко снижен и практически не наблюдался даже при продолжительной (3 ч) инкубации (Табл.2).

Таблица 2

Кияетика появления вирус-специфических полипептидов во фракционированной бесклеточной системе из клеток Кребс-2, програм-. мируемой РНК ВЭМК в отсутствии (-eEF-2) или присутствии 10 мкг на пробу (25 mkjjJ очищенного фактора элонгации 2 (+eHF-2) (Svitkin, Agol, 1983)

Полипептид Время появления (мин)*

-eEF-2 ♦eEF-2

ргеА 30 20

F (180) 40

I (180) 40

С (-) М>

£ (-) 60

Р14, Р12 (-) 60-80

D1 (-) 80

P22 (-) 80-100

Скобки означают, что полоса соответствующего полипептида была очень слаба; (-) - соответствующий полипептид не выявлялся

Изучение причины активации F-барьера в ФБС показало, что она связана с дефицитом белкового.фактора (первоначально обозначенного нами как фактор элонгации X (eEF-X)). eEF-X был очищен из цито-плазматических экстрактов клеток Кребс-2 по способности повышать образование полипептида F и других неструктурных белков в ФБС. Очистка включала фракционирование (NH^^SO^ (осаждение между 50 и . 70% насыщения), хроматографию на ДЭАЭ-Сефацеле (элюция между 100 и 225 мМ KCl), гельфильтрацию на Сефакриле S-300 (элюция в области белков с молекулярной массой около 100 кД) и хроматографию на фосфо-целлюлозе (элюция между 125 и 250 мМ KCl).

Для характеристики eEF-X материал, элюирующийся с фосфоцеллю-лозы, анализировали с помощью электрофореза в ПААГ. Показано, что материал, элюирующийся при 250 мМ KCl и содержащий активность eEF-X, представлен практически единственным полипептидом с молекулярной массой около 105 кД. Сравнение молекулярной массы и хроматографи-ческих свойств eEF-X с другими белками, участвующими в трансляции, выявило его сходство с эукариотическим фактором элонгации 2 (eEF-2). "Кроме того, высокоочшценные препараты eEF-X обладали следующими активностями характерными для eEF-2: (1) способностью стимулировать синтез полифенилаланина в присутствии поли (U), очищенных и обработанных 0,5 М KCl рибосом, eEF-1 и аминоацилированных тРНК; (2) способностью подвергаться ADP-рибозилироваиию в присутствии NAD и токсина дифтерии. Обе отмеченные активности соочищались при хроматог-рафиях. на Сефакриле S-300 и фосфоцеллюлозе как с активностью eEF-X, так и с полипептидом р105. Можно также отметить, что высокоочшценные препараты eEF-2, выделенные из клеток Кребс-2 по методу Нолана и др. (Nolam et al., 1979) или из ретику.<. . ,итов кролика по методу Кемпера и Меррика (Kemper, Merrick, 1979), обладали активностью eEF-X.

Таким образом, eEF-X идентичен eEF-2, и активация F-барьсра в ФБС связана с дефицитом eEF-2. По-видимому, этот фактор в значительной степени удалялся из экстрактов при их ультрацентрнфугировании. И действительно, прямое определение содержания eEF-2 в ФБС методом ADP-рибозилирования показало, что оно в 6-7 раз ниже, чем в стандартных экстрактах.

Специальные опыты были поставлены для того, чтобы выяснйть влияет ли eEF-2 специфически на F-барьер или же он в равной мере повышает скорость элонгации на всех участках матрицы. Данные по кинетике аккумуляции продуктов трансляции РНК ВЭМК в ФБС в отсутствие и присутствии экзогенного eEF-2 подтвердили справедливость первого предположения. eEF-2, добавленный в ФБС в количествах', увеличнваю-.щих его содержание там примерно в 16 раз, лишь на-10-201 повышал включение метки и на 20i среднюю скорость элонгации полипротеина в пределах ргеА (судя по максимальным размерам незавершенных полипеп-. тидов, выявляемых при коротких инкубациях). Напротив, появление F, I, С, Е, р22 и протеазной активности (судя по аккумуляции D1, р14 и р12) под влиянием eEF-2 резко ускорялось (Табл.2). Так, временные интервалы, разделяющие завершение синтеза ргеА и появление F в отсутствие и присутствии экзогенного eEF-2, были, соответственно, около 150 (180-30) мин и около 20 (40-20) мин, т.е. различались примерно в 7,5 раза. Это означает, что eEF-2 специфически повышает скорость элонгации полкпротеина в районе генома, предшествующем или совпадающим с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид F. Таким образом, изменение содержания eEF-2 или активности этого фактора может по-разному влиять на скорость элонгации полипептидной цепи на различных участках мРНК.

Считается, что функция eEF-2 в процессе элонгации связана с образованием комплекса eEF-2-GTP, который взаимодействует с пре-

транслоцированной рибосомой (содержидей пьптидил-тРНК в А-участке, деацилированную тРНК в Р-участке). Это взаимодействие способствует транслокации, т.е. диссоциации деацилированной молекулы тРНК, передвижению мРНК относительно рибосомы на один кодон и переносу молекулы пептидил-тРНК в Р-участок. После гидролиза GTP eEF-2 диссоциирует от рибосомы, которая теперь может начать новый цикл элонгации, взаимодействуя с тройным комплексом eEF-1-СТР-аминоа-цил-тРНК. Необходимость в бблыиих концентрациях eEF-2 для элонгации в районе F-барьера РНК ВЭМК пока трудно объяснить в связи с недостаточностью наших знаний о природе этого барьера. Одно из объяснений может, например, заключаться в том, что претранслоцирован-ные рибосомы, остановившиеся или заторможенные в районе F-барьера, имеют пониженное сродство к комплексу eEF-2-GTP.

Значительный интерес представлял вопрос о том, выражается ли F-барьер в нефракционцрованных экстрактах, транслирующих РНК ВЭМК, а также в зараженных клетках. Детальный анализ кинетики аккумуляции вирус-специфических полипептидов в нефракционированной системе из клеток Кребс-2 выявил задержку появления F относительно других белков. Сходная задержка была отмечена в лизате ретикулоцитов, транслирующем РНК ВЭМК (Shih et al., 1979). Эти факты хорошо объясняются замедлением элонгации полипротеина на границе "генов" ргеА и F. Однако возможно и альтернативное объяснение, состоящее в том, что позднее появление F связано с задержкой процессии га соответствующего района полипептидной цепи (Jackson, 1986). Очевидно, что для выбора одной из этих возможностей необходимы дальнейшие эксперименты.

Имеющиеся данные указывают на то, что барьеры трансляции на РНК ВЭМК реализуются также in vivo и, более того, эти барьеры, по-видимому, усиливаются в ходе инфекции. Так известно, что в клетках,

зараженных ВЭМК, трансляция вирусной РНК лимитируыгся стаяй&П элонгации, причем скорость элонгации снижается по Mépfe развития Имфёк-ционного процесса (Jen et al., 1978, Ramabhadrañj tháéh, 1981). Кроме того сообщалось, что в клетках, заражении* кардиовирусами, вирус-специфические белки образуются в неэкёимолярных количествах, в частности, на поздних стадиях инфекции происходит предпочтительное образование структурных белков (LucSSiLehard, 1974, Paucha et al., 1974). Такую регуляцию белковогъ синтеза можно объяснить усилением выражения F-барьера, HanpJwfepj вследствие частичной инактивации eEF-2.

1.5. Заключение

Результаты'нестоящей работы согласуются с концепцией о том, что трансляция РНК ВЭМК начинается с уникзльного участка инициации (Rueckert, 1976). Такой механизм инициации трансляции справедлив . для большинства, но не для всех пикорнзвирусов. Так, для инициации . полипротеина вируса ящура используется 2 находящихся в фазе AUG кодона, разделенных 84 основаниями (см. Palmenberg, 1987). У поли-овируса в одной из бссклеточных систем наряду с участком инициации синтеза полипротеина используются другие инлцнаторные сайты, находящиеся в центральной области вирусного генома (снлигже); возможность использования этих необычных участков инициации для синтеза вирус-специфических белков in vivo, однако, не доказана.-

Элонгация полипротеина ВЭМК, по крайней мере in vitro, происходит с неравномерной скоростью. Основной барьер трансляции находится где-то на границе "генов" для структурных и неструктурных вирус-специфических белков. Структурные особенности вирусной РНК, обусловливающие существование этого барьера, не ясны. Экспрессия барьера трансляции на РНК ВЭМК in vitro модулируется активностью фактора элонгации eEF-2.

Хотя РНК ВЭМК транслируется с одной точки инициации, ни in vitro ни in vivo не образуется гигантского продукта, соответствующего полноразмерному полипротеину. Это означает, что полипептидная цепочка подвергается эффективному расщеплению еще в процессе своего синтеза на рибосомах. Имеющиеся данные указывают на то, что как первичный (котрансляционный), так и вторичный (пост трансляционный) процессинг пикорнавирусного полипротеина осуществляется вирус-специфическими протеазами без участия каких-либо клеточных компонентов (Krausslich et al., 1988). В нашей работе впервые идентифицирована протеаза ВЭМК (р22) и продемонстрирована ее роль в расщеплении предшественника структурных белков. Впоследствии было показано участие р22 или его структурного домена в расщеплении других полипептидных предшественников, а также в автокатализе расщепления полипротеина (Palmenberg, Rueckert, 1982). Белки аналогичные р22 1 или ЗС по "современной номенклатуре (Rueckert, Wimmer, 1984)/ выполняют функцию протеаз у всех исследованных пикорнавиру-сов. Однако, у энтеро- и риновирусов в качестве протеазы также функционирует белок 2А, катализирующий расщепление полипротеина на границе структурных и неструктурных полипептидов (Блинов к др., 1985, Krausslich et al., 1988).

Сравнивая организацию полипротеинов различных пикорнавирусов, необходимо отметить их высокое сходство. Тем не менее, имеются и определенные различия (Kazachkov et al., 1983, Palmenberg, 1987). Так, лидерные или I-белки (р12 и р14 у ВЭМК) присутствуют только у кардио- и афтовирусов. При этом у афтовирусов, в отличие от кардио-вирусов, L-белки, по-видимому, являются протеазами, катализирующими свое собственное отщепление от Р1. Полипептид 2А (G) входит в состав Р1 (А) только у кардиовирусов. Этот факт можно связать с тем, что белок 2А кардиовирусов протеазой, по-видимому, не являет-

ся и не способен к самоотвеплению, как в случае эитеро- и ринови-русов. У афтовирусов-участок генома, кодирующий полипептид 2А, вовсе делетирован. Значение этих вариаций • репликации тех или иных групп вирусов пока не ясно.

2. ТРАНСЛЯЦИЯ РНК ПОЛИОВИРУСА IN VITRO: РОЛЬ CIS-ДЕПСТВУЩПГО СТРУКТУРНОГО ЭЛЕМЕНТА В S' НЕТРАНСЛИРУЕМОП ОБЛАСТИ ГЕНОМА И TRANS-АКТИВИРУЮЩЕГО ФАКТОРА В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ И НЕПРОВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ 2.1. Особенности трансляции РНК ВП в бесклеточных системах из клеток Кребс-2 и ретикулоцитов кролика

РНК ВП является малоэффективной матрицей при трансляции in vitro в сравнении с РНК других пикорнавирусов, например ВЭМК (Shih et al., 1978). В бесклеточной системе из клеток Кребс-2, в условиях оптимальных для- включения меченых аминокислот, РНК ВГ1 типа 1 штамма М-1-2р (близкого производного штамма Mahoney) значительно хуже стимулировала включение меченых аминокислот в белок, чем РНК ВЭМК. Основной продукт трансляции РНК ВП представлял полипептид, соответствующий предшественнику структурных белков (Р1). Синтез продуктов, кодируемых центральным и 3* концевым районом генома, осуществлялся с низкой эффективностью (Svitkin et al., 1985). Сходным образом транслировалась РНК ВП в экстрактах из клеток HeLa (Dorner et al., 1984). Причины различии в эффективности и полноте трансляции РНК ВП и ВЭМК не ясны.

В обработанных микрококковон нуклеазой лнэатах ретикулоцитов РНК ВП направляла синтез белков, большинство из которых не совпадало при электрофорезе в ПААГ с вирус-специфическими белками, синтезирующимися в зараженных клетках (Рис.3). Образование этих "аберрантных" полипептидов, как показали исследования Дорнера и др. (Corner et al., 1984), связано со способностью ретикулоцитной ci:c-

темы осуществлять трансляцию РНК ВП с "ненормальных" внутренних участков инициации, расположенных в центральном районе генома. При использовании РНК штамма М-1-2р можно было наблюдать и корректную инициацию в начале рамки считывания полипротеина, регистрируемую по некоторой аккумуляции Р1 (Рис.3). Мы подтвердили данные Дорнера и соавторов о том, что эффективность корректной инициации РНК ВП может быть значительно повышена при добавлении в лизат факторов инициации из гетерологичного источника. В наших опытах фракция солевой (0,5 M КС1) промывки рибосом (ФПР) из клеток Кребс-2 значительно стимулировала образование Р1, одновременно ингибируя синтез аберрантных полйпептидов. Очевидно, что ФПР содержит активность, способную корректировать трансляцию РНК ВП ^фактор, корректирующий инициацию (ФКИ)]. ФКИ был частично очищен путем фракционирования ФПР iNH^^SO^ (осаждение между 40 и 504 насыщения), хроматографии на ДЭАЭ-Сефацеле (элюция между 140 и 210 мМ КС1), хроматографии на ге-парин-Сефарозе (элюция между 100 и 1000 мМ КС1). Альтернативно ФКИ выделяли непосредственно из грубых экстрактов клеток Кребс-2 путем фракционирования на колонке с гепарин-Сефарозой, осаждения (NH^SO^ и хроматографии на ДЭАЭ-Сефацеле как описано выше. В последнем случае наблюдались более высокие выходы активного фактора.

Частично очищенный препарат ФКИ был охарактеризован с помощью гельфильтрации на Сефакриле S-300 (Рис.4). При использованной ионной силе (0,1 мМ КС1) активность ФКИ соочищалась с активностью фактора инициации 2 (eIF-2), определенной в реакции образования трой-

Met

ного комплекса eIF-2-Met-тРНК^ -GTP- Максимум обоих активностей приходился на фракцию белков с молекулярной массой около 450 кД. Поскольку молекулярная масса свободного eIF-2 составляет .150 кД (Benne et al., 1979), мы заключили, что в данной фракции eIF-2 связан с другим белком. Таким белком мог быть фактор инициации eIF-2B. Иэ-

12.3

Рис.3. Продукты трансляции РНК БП типа 1 втаммз M-1-ZP в лизатзх рс-тикулов кролика в сравнении с вирус-специфическими полипептидами, синтезирующимися in vivo (Гвиткин и др., 1989).

О» — Р 1 — — РЗ «а — 3 CD

зео;^--

Q.R

rs е о» -.

— 30

Y — 2 —

rzf

6 —VP О

9 ~vpi

с

О -YP3

Бесклеточную трансляцию РНК (30 мкг/мл) проводили в отсутствие (трек 1) или присутствии (2) 1,6 мг/мл белка ФПР из клеток Кребс-2. Пробы иикубиропали при 50°С в течение 60 мин. На греке 3 представлены белки, синтезирующиеся в клетках HeLa, зараженных птаммом М-1-2р. Обозначение внрус-спецнфнчсских белков, синтезирующихся in vivo, и аберрантных продуктов бесклсточной трансляции дано согласно работам Рюккерта и Уиммера (Rueckert, Kimner, 1984) и Дорнера и др. (Dorncr et al., 1984).

вестно, что комплекс eIF-2-eIF-2B (молекулярная масса 390-450 кД) имеет важное функциональное значение и стабилен при процедурах фракционирования, которые не включают растворы с высокой ионной силой (Konieczny, Safer, 1983). Анализ очищенных препаратов ФКИ с помощью электрофореза в ПААГ, в самом деле, выявил в нем наличие полипептидов с молекулярными массами, близкими к таковым у субъединиц комплекса eIF-2-eIF-2B, наряду с некоторыми другими компонентами. Наши попытки более полно очистить препараты ФКИ с помощью хроматографии на катионообменниках (СМ-Сефадсксе или фосфоцеллюлозе) не дали желаемых результатов в связи со значительными потерями активности. Следует отметить, что хроматогрзфня на СМ Сефадексе позволяла получать высокоочнщенный и активный в реакции образования тройного комплекса препарат eIF-Z. Этот препарат, однако, проявлял ливь слабую активность как ФКИ. По-видимому, высокая ионная сила, использован'

во г в$л м .

0.4 ■ 1 ; • 1 4 \

0.3

\\ 1 •

0.2 - N /

у / / |\ *

0.1 ■ // • \ \ \

/ / 'у..... \ V . д ^. ____

9 1

25 1

^—^

«

20 О

Ж

X

э

13 X

■—.

Б

X

10 9

(М

и.

5

•

16 20 24 28 32 36

№ франции • 6 1» 22 14 2« 21 31

Е22=

| - "»Нг -

Щ '-V Р •

-*Р1

-V р»

Рис.4. Фракционирование ФКИ на колонке с Сефакрилом Б-300 (5у:ик1п е1 а1., 1988).

(А) - распределение белка и активности е1Р-2. Активность е1Р-2 определяли в реакции образования тройного комплекса е1Р-2-тМ^^-СГГР и связывания этого комплекса с нитроцеллюлоэными фильтрами (Б1ае11е1ап ег а1. , 1979). Для калибровки колонки использовали следующие маркеры: голубой декстран (ВЬ), ферритин (Р, 450 хД), альдолазу из мышц кролика (АЬ, 160 кД, бычий сывороточный альбумин (ВБА^ 67 кД) и миоглобин лошади (М, 17,8 кД). (Б) - распределение активности ФКИ. РНК штамма М-1-2р (0,6 мкг) транслировали при 30°С 90 мин в лизатах ретикулоциток (20 мкл), содержащих следующие добавки: а - без добавок, 6-4 мкг нефракционированного ФКИ, с 19 по 32-1 мкл в 10 раз сконцентрированных фракций 19-32 хроматографии, представленной на панели (А), с-

пая при катионообменной хроматографии приводила к диссоциации функционально-активного комплекса полнпептидов.

Бесспорно, кофракционкрованне ФКИ с комплексом eJF-2-eIF-2B нельзя рассматривать как строгое доказательство идентичности этих двух компонентов. Тем не менее, тот факт, что большинство других факторов инициации трансляции должно отделиться от ФКИ при использованных процедурах очистки в значительной степени подтверждает высказанную мысль. В связи с этим мы допускаем, что наблюдаемые эффекты ФКИ на трансляцию РНК ВП обусловлены комплексом eIF-2-eIF-2B. Роль eIF-2, как принято считать, заключается в доставке амииоацили-рованной инициаторной тРНК в форме тройного комплекса к 40 S рйбо- . сомным субъединицам; кроме того eIF-2 способен связываться сайто-'специфическим образам с некоторыми вирусными и невирусными молекулами мРНК (Kaempfer et al., 1978, 1981, Perei-Bercoff, Kaempfer, • 1982). eIF-2B обеспечивает рецнклинг или каталитическое действие eIF-2-(Matts et al., 1983). Можно предположить, что снабжение белок-син-тезирующего аппарата активным eIF-2 в ретикулоцитных лиэатах ограничено и что инициация на 5>-концевом участке РНК ВП больше зависит от наличия eIF-2 по сравнению с инициацией на внутренних сайтах. Развивая эту гипотезу, следует подчеркнуть, что начальный этап трансляции полипротеина пикорнавирусов включает взаимодействие рибосом с центральным участком 5'-нетранслцруемрй области (НТО) мРНК (Pelletier, SonenbeTg, 1988, Trono et al., 1988). Этот механизм отличается от сканирующей модели инициации трансляции эуяариотичес-ких матриц, согласно которой 40 S рибосомные субчаствны первона* чально взаимодействуют с 5' концом мРНК, обычно содержащим кэп-структуру (Kozak, 1983). Детальный механизм взаимодействия рибосом с центральным сегментом 5' НТО РНК BII неясен. Могхно предположить, что эгому взаимодействию предшествует образование комплекса данного сегмента с elF-2. Очевидно, что при таком механизме для инициа-

ции синтеза полипротеина eIF-2 будет требоваться в стехиометричес-ких, а не в каталитических количествах.

2.2 Различия в эффективности.тРан^ДйЦии РНК аттенуированных и вирулентных штаммов ВП

Вирулентность штаммов ВП варьирует в очень широких пределах. Одни штаммы способны вызывать эпидемии, Тогда как другие {примером являются штаммы, полученные А.Сэбиным) усйешно используются в качестве живых вакцин. Причины столь существенных вариаций в вирулентности штаммов долгое время оставались неясными. Лшаь в последние годы стали известны полные нуклеотидные последовательности вакцинных штаммов и ряд подходов позволил идентифицировать мутации, существенные для аттенуации (см. обзоры Racaniello, 1986, 1987, Nomoto, Wimmer, 1987, Almond, 1987, Агол, 1988). Было показано, что а^тенуирующие мутации локализованы в 5' концевой половине генома (Agol et al., 1983, 1985, Omata et al., 1986) и что изменения 5'НТО наиболее существенны для экспрессии аттенуированного фенотипа (Evans et al., 1985, Westrop et al., 1986, Nomoto, Kimmer, 1987). Очевидно, что 5' НТО РНК ВП должна содержать структурные элементы, участвующие в инициации трансляции. Эти элементы или сигналы могут по-разному функционировать в геномах аттенуированных и вирулентных штаммов. Это предположение нашло подтверждение в экспериментах, в которых трансляция РНК аттенуированных и вирулентных штаммов Ml была изучена in vitro (Svitkin et al., 1985).

Как показано на Рис.5, в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 РНК аттенуированного штамма Сэбина типа 1 - LSc-1 (клона вакцинного штамма LSc-2ab) транслируется менее эффективно, чем РНК вирулентного штамма М-1-2р (клона штамма Mahoney). Среди РНК нескольких полиовирусов типа 3 наименьшей активностью в стимуляции синтеза белка также прСквлял геном аттенуированного штамма Leon

"9- ' I

О

Количество РИК (мкг)

Рис.5. Эффективность трансляции РНК аттенуированных и вирулентных

штаммов ВП в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 (Svitkin et al., 1985).

(А) - РНК ВП типа 1 штаммов М-1-2р (МАН) и LSc-1 (Б) и (В) - РНК ВП типа 3 штаммов Saukett (SAU), 452/62 3D (3D), Leon 12a.b (SAB), Leon/37 (Leon) и штамма 119 (199). Указанные количества РНК инкубировали в пробах (25 мкл) в присутствии j 55Sjметноннна в течение 60 минут. Включения метки в пробах, не содержащих экзогенных РНК, были в опытах А, Б и В, соответственно, 4800, 3360 и 9500 имп/мин; включени- в пробах, содержащих РНК, даны за вычетом этих значений.

12a.jb. Более" того, сравнение вирулентного штамма ВП типа 3 Leon/37 с его аттенуированным производным Leon 128^ и нейровирулентным ре-вертантом штамма Leon 12atb (штаммом 119) показало, что сниженная матричная активность коррелирует с аттенунрованньм фенотипом. Электро-Форетическнй анализ выявил в пробах, транслирующих РНК аттенуированных штаммов, более низкую аккумуляцию PI (соответствующего КН^конце-вому району полипротеина). Это указывало, что обнаруженный дефект трансляции РНК аттенулрованных штатзв связан с нарушением инициации синтеза полипротеина. И действительно, сравнительная оценка скоростей элсшгации

полипротеина в пределах PI у аттенуированных и вирулентных штаммов не выявила сколько-нибудь заметных различий.

Следует отметить, что нуклеотидные последовательности штаммов ВП типа 3 Leon 12a^b и Leon/37 различаются лишь по 10 точечным мутациям, причем только 2^из них (в положениях 220 и 472) локализованы в 3' НТО. Единственное отличие в этом районе между штаммами Leon 12a.jb и 119 касается позиции 472, в этой позиции находится ци-тозин в вирулентных штаммах 119 и Leon/37 и уридин в аттенуирован-ном штамме Leon 12a^b (Stanway et al-, 1983, 1984, Cann et al., 1984). Эти и некоторые другие данные указывают на то, что у ВП типа 3 эффективность трансляции вирусных РНК контролируется той же генетической детерминантой (включающей нуклеотид № 472) , что и нейровирулентность. Представляется обоснованным предположить, что между данными' сторонами экспрессии вирусного генома существует причинно-следственная связь. Сходная ситуация реализуется, по-видимому, и со штаммом полиомиелитной вакцины типа 1, где ключевую роль в экспрессии аттенуированного фенотипа играет мутация в положении 480 (Nomoto, Wimmer, 1987).

Значительный интерес представлял вопрос о причинах различий матричной активности РНК разных штаммов £П. Одно из возможных объяснений относительной неэффективности геномов аттенуированных штаммов могло бы заключаться в их более высоких требованиях к факторам инициации трансляции. Поскольку в лизатах ретикулоцитов корректная инициация трансляции РНК ВП зависит от добавления экзогенных факторов, представлялось удобным использовать эту систему для проверки данной гипотезы.

Мы изучили влияние препаратов ФПР и ФКИ, полученных из клеток Кребс-2 (см.раздел 2.1.), на трансляцию РНК аттенуированных и вирулентных штаммов ВП. Бьшо показано, что в использованных концент-

р.ацнях оба препарата практически не эффективны в стимуляции синтеза Р1 на РНК агтенуированного штамма ВП типа 3 (Leon 12аjb). В то же время, в присутствии факторов трансляция РНК близкородственных вирулетных штаммов Leon/37 и 119 сопровождалась значительной аккумуляцией Р1. В наибольшей степени стимуляция образования Р1 под влиянием факторов была выражена в системе, программируемой РНК высоковирулентного штамма дикого типа 4S2/62 3 D.

Принципиально сходные результаты были получены с ВП типа 1, хотя штаммовые различия в этом случае проявлялись несколько слабее i В отличие от РНК вакцинного ВП типа 3, РНК аттеиуированного штамма типа 1 (LSc-1), в принципе, отвечала на добавление препаратов ФПР и ФКИ; при этом'стимулирующий эффект зависел от доза добавленных факторов (Рис.б). Под влиянием одинаковых концентраций ФКИ стимуляция корректной инициации РНК штамма LSc-1 выражена значительно слабее, чем штамма М-1-2р. Это становится ясным при сравнении наклонов прямых, отражающих зависимость аккумуляции Р1 от добавления ФКИ, в системах трансляции РНК аттеиуированного и вирулентного штаммов.

Различия в ответзх систем, программируемых РНК аттенуирован-ных и вирулентных штаммов, на добавление ФКИ (или, возможно, e!F-2-eIF-2B) укрепляет гипотезу о том, что изменение взаимодействия специфического сегмента вирусной РНК с одним или несколькими белковыми факторами и, как следствие, ухудшение инициации трансляции дает вклад в аттенуированный фенотип штаммов Сэбипа. Логично также предположить, что дефект трансляции РНК аттенуированных штаммов модулируется активностью eIF-2. Этот дефект в очень большой степени может быть выражен в клетках центральной нервной системы, где размножение вакцинных штаммов сильно ограничено (La Monica ct а!., 1987)..

о х

5 2

С 5 5

ФКИ (мкг)

Рис.6. Влияние ФКИ на аккумуляцию полипептида Р1 в ретикулоцитных лизатах, транслирующих РНК вирулентного и аттенуироваиного штаммов ВП типа 1 ег а1., 1988).

РНК штаммов М-1-2р (МАН) и ЬБс-1 Cl.Sc) присутствовали в концентрациях 0,5 мкг на пробу (20 мкл). Для предотвращения процес-синга Р1 концентрация ДТТ была снижена и составляла 0,1 мМ (вместо 5 мМ); в специальных опытах было показано, что процессинга Р1 в этих условиях не происходит. Пробы инкубировали с указанными концентрациями очищенного ФКИ и [^^метионином При 30°С в течение 90 мин. После электрофореза в ПААГ и флюорографии полосы Р1 вырезали из геля для определения радиоактивности.

2.3. Заключение

Детальный механизм инициации трансляции РНК ВП, как и других пикорнавирусов, остается неясным. Этот механизм плохо укладывается в рамки сканирующей модели, объясняющей инициацию трансляции большинства эукариотических мРВК (Когак, 1983). Так, на 5' конце РНК ВП не блокирована кэп-стружтгрой, а содержит ковалентно-свя-занный.белок - VPg (Ьее ег а.1,, 1977, Р1апееап е\. а1., 1977). Кроме того, из общих соображений, структурные особенности 5* НТО РНК ВП должны представлять препятствия для сканирования этой области

40 S рибосомными субъединицами. Такими особенностями 3' НТО являются большая протяженность (около 750 нуклеотидов)» Множественность (7-8) нереализуемых AUG триплетов (Toyoda ét ài;j 1983) и выраженная вторичная структура (Блинов и др., 1968* Hiipenko et al., 1989, Rivera et al., 1988).

В нашей работе (Svitkin et al., 1985) впервые Выказана гипотеза, Что 5'НТО РНК ВП содержит нуклеотиднуК) йЪбйедбйательно'сть, прямо или косвенно участвующую во взаимодействии С рибосомами или инициирующими факторами; мы также предя0й61ШШ* ЧТО сила этого взаимодействия изменяется под влиянием й+Тенуйруюаих мутаций. Недавно представление о cis-действукяаем структурном элементе в 5' НТО РНК ВП получило* дополнительные экспериментальные обоснования (Pelletier, Sonenberg, 1988, Trono et al., 1988); Этот элемент картирован в центральном районе 5* ЙТ0 (Trono et al., 1988) и в слу-. чае штаммов Сэбина должен включать основную детерминанту аттенуа- • ции (сегмент между нуклеотидами 471*481 ). Все эти данные укрепляют концепцию о том, что трансяяйяя РЯК ПВ и нейровирулентность штаммов контролируется одним и Тем se функциональным модулем.

Какие компоненты белок-синтезирующего аппарата узнают-специфическую нуклеотидную последовательность в 5' НТО РНК ВП? Наши данные говорят о том, что по крайней мере одним из таких компонентов является trans-активирующий фактор белковой природы (ФКИ). ФКИ необходим для трансляции РНК ПВ с начала рамки считывания полипротен-иа, причем в больших количествах для геномов аттенуированных штаммов, чем вирулентных. Имеющиеся данные показывают, что содержание ФКИ в различных клетках различается, в частности, оно значительно тте в клетках Кребс-2 или HeLa, чем в ретнкулоцитах. Это означает, что эффективность трансляции РНК ВП и относительная эффектйв» HÔÊïb трансляции геномов аттенуированных и вирулентных штаммов мо-

жет существенно зависеть от типа клеток. Иными словами, в клетках, дефицитных по ФКИ, будет наблюдаться ограничение трансляции РНК ПВ, причем в первую очередь будет блокироваться трансляция РНК ат-тенуироваиных штаммов. В связи с этими соображениями, снижение

» л.

тропизма аттенукрованных штаммов к клеткам моторных нейронов при сохранении.способности размножаться в клетках кишечника или культуре ткани возможно связано с особенностью белок-синтезнрующего аппарата нервных клеток, е частности, с недостатком в них ФКИ.

Поскольку ФКИ может представлять eIF-2 или комплекс eIF-2-eIF-2B следует отметить, что ключевая роль этих факторов в регуляции белкового синтеза, в том числе и в клетках нервной ткани (нейробластомы), хорошо известна (Ochoa, 1983, London et al., l987, Salimans et al., 1985). Активность eIF-2 может быть ингибирована фесфорилироваиием при участии протеинкиназ, каждая из которых регулируется специальным образом. Очевидно, что изучение этих взаимосвязанных регуляций может способствовать нашему пониманию патогенеза полиомиелитыой инфекции.

3. ТРАНСЛЯЦИЯ РНК ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА IN VITRO: ОРГАНИЗАЦИЯ, СИНТЕЗ И ПРОЦЕССИНГ ПРЕДШЕСТВЕННИКА СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ФЛАВИВИРУСА Вирусы эукариот с одноцепочечной РНК положительной полярности используют две основные стратегии для синтеза вирус-специфических белков. Во-первых, эти белки могут образовываться путем протеолити-ческого расщепления высокомолекулярных полипептидов-предшественников. Во-вторых, вирус-специфические белки могут образовываться путем трансляции различных, в частности, субгеномных мРНК. Способ синтеза вирус-специфических белков в клетках, зараженных флавиви-русами, долгое время оставался неясным, так как в этих клетках не удавалось выявить ни высокомолекулярных полипептидов-предшествен-

ников ни субгеномных РНК. С целью изучения Способа образования флавивирусных белков в настоящей работе были использованы бесклеточные белок-синтезирукшше системы из клеток Кребс-2 и ретикулоци-тов'кролика, программируемые РНК вируса клещевого энцефалита.

3.1. Синтез структурных белков ВКЭ о бссклеточион системе из клеток Кребс-2

. При добавлении в бесклеточную систему из клеток Крсбс-2 44 Б геномная РНК ВКЭ значительно стимулировала включение меченых аминокислот в белки. Включение метки и характер продуктов, образующихся при трансляции, существенно зависел от ионного состава инкубационной смеси. В отличие от РНК пикорнавирусов (ВЭМК, ВП) РНК ВКЭ максимально стимулировала включение метки при низких концентрациях КС1 (65-75 мМ). В этих условиях синтезировался гетерогенный набор полипептидов с молекулярными массами от 13 до 160 кД (5У11к].п ег а1., 1978, 1981). Анализ кинетики аккумуляции этих по- • яипептидов с целью выяснить, транслируются ли они с одной или нескольких точек инициации, не позволил сделать однозначных выводов (5у1гк1п а!,, 19/8). Однако, результаты опытов с инициаторной £ [^Б] МеЧ"-тРНК^е* и опйгопептидное картирование продуктов трансляции показали, что большинство синтезирующихся полипептидов имеет общую Ш^-концевую последовательность аминокислот и считывается с участка генома, кодируюйего структурные белки (БуНкхп е1 а1.,1981). Таким образом, синтез этих продуктов инициировался в одном, а терминировался в различных учэгетхах мРНК.

Наряду с продуктами преждевременной терминацни трансляции в бесклеточной системе аккумулировались полипептиды р53 и р13. По. электрсфоретической подвижности 1и пептидны?.« картам эти полнпептиды соответствовали гликопротенл'у (Е) и нуклеОкапсидному белку (С), входящим в состав вирионов В'КЭ СЭутлМп ег а!., 1981). ПовымеМйе

концентрации КС1 увеличивало выходы р53 и р13, одновременно ингиби-руя аккумуляцию недостроенных полипептидов. При концентрации ионов К+ 125 мМ накопление недостроенных полипептидных цепей сводилось к минимуму и продукты в основном были представлены р53 и р13, а также дублетом полипептидов рЗб/рЗЗ (Рис,7). В связи с этим дальней- шие опыты были проведены при концентрации ионов К+ 125 мМ.

В некоторых экстрактах наряду с образованием структурных белков происходил ограниченный синтез полипептидов рб9, р79 и р93, совпадающих при электрофорезе с неструктурными внрус-специфически-ми белками (соответственно, NS3*, prNS3 и NS5), обнаруживаемыми в зараженных клетках (Рис.7); образованию этих белков способствовала частичная замена хлорида кзлия на его ацетат. Для полипептидов рбЧ, синтезированных in vitro и in vivo, была доказана идентичность, для чего использован анализ продуктов их частичного протео-лиза химотрипсином (Свиткин и др., 1986). Следует отметить, что по сравнению со структурными белками все три высокомолекулярных продукта синтезировались in vitro с очень низкой эффективностью, ко' торая варьировала от опыта к опыту.

3.2. Организация области генома ВКЭ, кодирующей структурные

белки

Для того, чтобы выяснить какие из полипептидов кодируются последовательностями нуклеотидов, непосредственно примыкающими к участкам инициации транслядии, <йали проведены опыты с инициатор-ной f[35S]Met-TPHK^et. Показано, что формил [355]метионин способен включаться лишь в один из структурных белков, а именно в р13. Другими продуктами, содержавшими данную метку, являлись полипептиды

рЗб и рЗЗ. Учитывая, что после исчерпывающего переваривания трип-

* 1

Обозначение неструктурных флавивирусных белков дано согласно современной номенклатуре (Rice ет al., 1985). prNS3 является пред-лгёствендиквм б^лка NS3 (5vilkin et al., 1981)

сином продуктов трансляции РНК ВКЭ формил [3SS]MeTHOHi»h обнаруживался главным образом в составе одного пептида (Svitkin et al., 1981), можно заключить, что при трансляции РНК ВКЭ in vitro используется один участок инициации трансляции и что р13, р36 и рЗЗ занимают Л^-концевое положение в полнпротеине. Для выяснения способа образования белков ВКЭ весьма важно было знать порядок появления их во времени. В связи с этим была изучена кинетика появления этих белков в бесклеточной системе из клеток Кребс-2, причем как в обычном эксперименте, так и в эксперименте типа "пульс-чейз", когда к пробам через определенные интервалы времени добавляли ингибитор элон-■ гации (циклогексимид) и инкубацию продолжали в присутствии этого ингибитора для 'выявления возможных посттрапсляционных модификаций, (Рис.7Б). Основные результаты этих опытов можно сформулировать следующим образом, Полипептид р53 образуется раньше, чем р13. Количество рБЗ не изменялось при инкубации в присутствии циклогекси- • мида; наоборот, р13 образовывался главным образом во время инкубации с циклогексимидом. Эти данные говорят о том, что р13 возникает в результате расцепления белка-предшественника. Кандидатом на ропь предшественника является дублет рЗб/рЗЗ, количество которого снижается при длительной инкубации. Параллельно со снижением содержания рЗб/рЗЗ и накоплением р13 наблюдалось появление дублета р23/р20. Доказательство того, что рЗб/рЗЗ действительно предшественник р13, было получено при анализе триптических гидролизатов этих белков. Этот анализ показал, что практически все олигопепти-ды р13 представлены в наборе олигопептидов рЗб и рЗЗ. Можно также допустить, что дополнительным источником р13 могут быть недостроенные по длине (и потому не выявляемые в виде дискретных полос) по-липептиды-лредпественники.

Характер кинетихи аккумуляции полипгптидов in vitro, а также

Время (мин)

а б в в в »

гМ-й!= 1

С -рзв г ~|»33 ' -р"

,10- •

»и- * еР А- г

м —

15 30 60 75 9С 120 ПЧПЧПЦПЧПЧПЧПЧ

II . I I I I I 1 I ' 1 »

ашшвшг?«« >

- р93 :|й

► -р53

*рЗЗ -р23

<» «а

А

В

Рис.7. Продукты трансляции РНК БКЭ в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 при [К+] 125 мМ (Свиткин и др., 1986)

(А) Продукты трансляции РНК ВКЭ (д) сравнивали с мечеными белками, синтезирующимися в незаряженных (а) или зараженных ВКЭ (б) клетках, а также с мечеными белками, выделенными из очищенных препаратов ВКЭ (в). Представлены также продукты, образующиеся в бесклеточной системе в отсутствие экзогенных матриц (г) или присутствии РНК ВКЭ и 0,5% Тритона Х-100 (е). Инкубация при 30°С в течение 3 ч. Вирусные полипептиды, обнаруживаемые в зараженных клетках или в очищенных вирионах, обозначены слева; справа обозначены характерные продукты бесклеточного синтеза, не выявленные в зараженных клетках. (Б) Кинетика накопления полипептидов в бесклеточной системе. В обозначенные промежутки времени из системы отбирали али-кеоты, которые разделяли на две порцин. Одну из них (п, "пульс") сразу же фиксировали для электрофореза, а другую (ч, "чейз") продолжали инкубировать в присутствии циклогексимида. Общее время инкубации проб, содержащих циклогексимид, - 3 ч.

тот факт, что метка из инициаторней £Ме1-тРНК£,е1 включается в р13 и дублет рЗб/рЗЗ, но не в р53, позволили предложить следующую схему образования структурных белков ВКЭ (Рис.8). Структурные белки имеют общий предшественник (обозначенный как ртБ), кодируемый 5*-концевой областью вирусного генома. В ргБ полипептизы С и Е. за-

иямают, соответственно, Nl^- и СООН-конпевое положение. Первыми этапами ограниченного процессмнга prS является выяепление из него р53; в результате этого события возникает также промежуточный предшественник, который идентичен или близко родственен дублету полипептидов рЗб/рЗЗ. рЗб/рЗЗ процессирует более медленно, распадаясь на NH2- н СООН-концевой фрагменты, соответственно, р13 и р23/р20. Полипептиды р23 и р20 нестабильны in vitro и подвергаются быстрой деградации. Можно предположить, что in vivo эти полипептиды являются предшественниками для третьего структурного белка ВКЭ - низкомолекулярного полипептида М, который обнаруживается з вкрионах, но не в инфицированных клетках.

Следует отметить, что недавно стали известны полные первичные структуры генома флавнвирусов, в частности, вирусов желтой лихорадки (Rice et al., 1985), Западного Ннла (Castle et al., 1985, 1986, Wengler et al., 1985) и Канджнн (Coia et al., 1:J8), а также частичные нуклеотидные последовательности геномов других флавнвирусов, включая ВКЭ (Pletnev et al., 1986, Yaaishchikov, Pletnev, 1988). Эти результаты выявили одну протяженную открытую рамку считывания для всех флавивирусных белков. Биохимические карты этих вирусов хорошо согласуются со схемой образования белков ВКЭ, представленной на Рис.8. Так, порядок кодирования структурных белхов ВКЭ, установленный на основании последовательности нухлеотидов в знрусном .'еноме и частичной последовательности аминокислот в вирусных белках - С-ргМ-Е, причем ргМ является предшественником белка М и имеет молекулярную массу 19 кД (Pletnev et al., 1986).

Как уже отмечалось, неструктурные вирус-специфические белкн (по крайней мере NS3) также могут транслироваться in vitro с геномной РНК ВКЭ. На основании кинетики появления этих полигептняов можно предполагать, что районы их кодирования расположены вслед

баями

-------соон

Рис.8. Схема образования структурных белков ВКЭ из предшественника 1рг5 обозначен пунктиром, поскольку в бесклеточных системах и зараженных клетках он не обнаруживается, так как подвергается протеолизу еще до завершения синтеза)

за районом, кодирующем ргБ. Такое предположение соответствует данным по организации генома ВКЭ (УатэЬсЬхкоу, Р1егпеу, 1988). Эффективность синтеза неструктурных белков, однако,была слишком мала, что сильно затрудняло-изучение механизма их образования. Тем не менее ясно, что в конце структурного района генома существует некий регуляторный сигнал, ограничивающий бесклеточную трансляцию. Природа этого сигнала неизвестна. Ясно, однако, что данное ограничение должно по крайней мере частично сниматься в зараженной вирусом клетке.

3.3 Характер продуктов трансляции РНК ВКЭ в лизате ретикуло-цитов: роль мембран в процессинге насцентного полипептида-предшественника

Приведенные выше данные указывали, что структурные белки ВКЭ образуются при созревании предшественника. В бесклеточной системе из клеток Кребс-2 этот процесс воспроизводится. Однако при трансляции РНК других флавивирусов в лизатах ретикулоцитов структурные белки как таковые не накапливались, хотя образующийся продукт содержал аминокислотные последовательности этих белков (Wengler

445 рнк

аГ. , 1979, Мопскгоп, Ке51амау, 1982). Разный характер продуктов бесклеточного синтеза мог быть связан с различиями в матрицах (вирусных РНК) или с различиями в использованных бесклеточных системах. В связи с этим нами были исследованы продукты трансляции РНК ВКЭ в лизатах ретикулоцитов кролика.

Оказалось, что при всех исследованных ионных условиях продукт трансляции РНК ВКЭ в ретикулоцитной системе - это гетерогенный набор цолипептидов, не содержащий заметных количеств зрелых структурных белков. Такой результат позволял предположить, что в лизатах ретикулоцитов, в отличие от экстрактов из клеток Кребс-2, отсутствуют какие-то компоненты, необходимые для созревания предшественника структурных белков флавивирусов. Для проверки этого предположения в лизат ретикулоцитов вносили различные фракции экстракта из клеток Кребс-2 и-изучали способность реконструированных ' систем обеспечивать образование структурных белков ВКЭ. Сначала было обнаружено, что добавление сравнительно небольших количеств экстракта из клеток Кребс-2 приводит к появлению р53 и р13. Затем экстракт из клеток Кребс-2 фракционировали с помощью ультрацентрифугирования, и было показано, что активный фактор содержится во фракции осадка, состоящего в основном из рибосом и мембран. В конечном счете, протеолитическая активность была выявлена во фракции мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума, очищенной от примеси рибосом (с помощью обработки раствором, содержащим .этилен-диаминтетраацетат натрия, и ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы). Следует также отметить,что продукты трансляции РНК ВКЭ в экстрактах из клеток Кребс-2, обработанных тритоном Х-100 с целью солюбилизацяи мембран, напоминали продукты, синтезирующиеся в лизатах ретикулоцитов, в частности, они не содержали "зрелых" р53 и р13 (Рис.7А, трек е). Эти данные пока-

зывают, что по крайней мере некоторые этапы процессинга полипептидов-предшественников флавивирусов осуществляется при участии клеточных протеаз, ассоциированных с мембранами шероховатого эндоплаз-матического ретикулума.

В специальном опыте было показано, что предшественник структурных белков ВКЭ способен подвергаться мембран-зависимому протео-лизу только в процессе синтеза, причем до того как его размер превысит определенную критическую длину. Это, по-видимому, связано с тем, что соответствующие участки связывания с мембранами и протео-лиза закрыты в готовой белковой молекуле. По приблизительной оценке критический размер насцентного предшественника, компетентного к мембран-зависимому протеолизу, меньше 56 кД.

3.4. Заключение

Прогресс в молекулярной биологии вирусов животных, наблюдаемый в последнее время, связан главным образом с расшифровкой протяженных н'уклеотидных последовательностей вирусных геномов и разработкой эффективных бесклеточных систем способных синтезировать вирусные . макромолекулы. Оба пойхода успешно используются для выяснения способов реализации генетической информации пикорна- и флавивирусов.

Данные по первичной структуре геномов флавивирусов показывают, что в них имеется единственная протяженная открытая рамка считывания. В соответствии с этим, а также исходя из наших данных, в геноме этих вирусов функционирует одна точка инициации трансляции и вирус-специфические белки образуются в результате расщепления полипептида-предшественника. Эти факты отвергают представление о том, что инициация синтеза каждого флавивирусного белка осуществляется независимо и что на геномной РНК имеются множественные участки инициации трансляции (№е51аыау, 1978, 1980). В этом отношении фла-вивирусы схо^ы с пикорнавлрусами. Более того, структурные белки

обоих групп вирусов закодированы в 5'-концевом сегменте генома. Однако, более детальное рассмотрение выявляет определенные различия. Так, сегменты генома, кодирующие структурные и неструктурные белки ВКЭ разделены каким-то регуляторным сигналом, резко ограничивающим образование неструктурных белков in vitro, а бесклеточная трансляция РНК ВЭМК сопровождается достаточно эффективным накоплением неструктурных полипептидов. Впрочем, можно отметить, что при трансляции РНК ВЭМК также, по-видимому, имее место задержка или останоика после считывания генов, кодирующих структурные белки, причем этот барьер становится почти непреодолимым при некоторых условиях (как, например, при дефиците eEF-2). Другое различие между флавивирусами и пикорнавирусами касается способа созревания вирус-специфических • белков. У флавивирусов, как видно на примере ВКЭ, процессинг полипротеина происходит при участии клеточных протеаэ, ассоциированных с мембранами. В то же время, в созревании белков пикорнавируссг клеточные протеазы и мембраны существенной роли не играют, а этот процесс осуществляется исключительно при участии вирус-спеиифичес-ких протеаз.

У альфавирусев, в отличие от флавивирусов, структурное белки закодированы в 3»-прилегающем сегменте генома, и их синтез направляется особой субгеномной РНК (Kennedy, 1980). Однако, как у аль-фавирусов, так и у флавивирусов структурные белки образуются в результате зависимого от мембран созревания насиентного предшественника (Schlesinger, Kääriäinen, 19S0).

Таким образом, структурная организация генома флавивирусов уникальна, но включает в себя крупные блоки, которые в иных комбинациях используются другими вирусами.

ВЫВОДЫ

• 1. Найдены условия, позволяющие полностью и эффективно транслировать РНК ВЭМК в бесклеточной системе из клеток Кребс-2. Трансляция сопровождается образованием почти всех вирус-специфических белков. • ?

а) Показано, что один из продуктов трансляции РНК ВЭМК является вирус-специфической протеазой, способной осуществлять правильный процессинг полипептидов-предшественников. Вирус-специфическая про» теаза идентифицирована как полипептид р22.

•6} Изучена кинетика синтеза и процессинга продуктов трансляции РНК ВЭМК. Идентифицированы Ы^-концевые продукты расщепления полипротеина. Методами пептидного картирования изучена взаимосвязь "предшественник-продукт" между белками, синтезирующимися in vitro. Это позволило уточнить биохимическую карту ВЭМК, в частности, картировать вирус-специфические белки р14, р!2, G, р39, Н, р22.

в) Продемонстрирована неравномерность скорости элонгации вирусного полипротеина и существование "барьера" трансляции на границе генов для структурных и неструктурных белков. Показана возможность активации этого барьера во фракционированной бесклеточной системе, дефицитной по фактору элонгации eEF-2. Высказано предположение, чте барьеры трансляции и eEF-2 играют роль в регуляции синтеза вирус-специфических белков в зараженных петках.

2. Изучена трансляция in vitro РНК аттенуированных и вирулентных штаммов ВП типа 1 и 3.

а) В бесклеточной системе из клеток Кребс-2 инициация трансляции РНК ВП осуществляется в начале рамки считывания полипротеина; основным продуктом трансляции является предшественник структурных белков вируса Р1. .

б) В бесклеточной системе из клеток Кребс-2 матричная активност! РНК у аттенуированных штаммов Сэбина снижена по сравнению с таково{ у нейровируленткых штаммов; дефект трансляции связан с нарушением инициации синтеза вирусного полипротеина.

в) В лизате ретикулоцитов кролика инициация трансляции РНК ВП осуществляется главным образом "некорректно", а именно, в участках, расположенных в середине генома, а не в начале рамки считывания полипротеина; эта аномалия связана с дефицитом фактора инициации. Фактор, корректирующий инициацию (ФКИ), выделен из клеток Кребс-2

и'частично очниен. ФКИ ссочпщается с комплексом инициирующих факторов eIF-2-eIF-2B, имеющим молекулярную массу около 4SO кД.

г) В лизате ретикулоцитов как грубые, так и очищенные препараты ФКИ значительно хуже стимулируют "корректную" инициацию РНК атте-нуированных штаммов, чем вирулентных; эти различия в наибольшей степени проявляются с ВП типа 3.

д) Высказана гипотеза о том, что вэаимодсистЕле специфического сегмента вирусной РНК с белковым фактором игрзет важную роль в механизме трансляции этих РНК, аттенуации ВП в патогенезе полиомиелита .

3. Изучена трансляция in vitro РНК ВКЭ.

а) В бесклеточной системе из клеток Кребс-2 основными продуктами трансляции РНК ВКЭ являются структурные белки вируса - белок нуклеокапсида (С) и гликопрстеид (Б).

б) Изучена кинетика аккумуляции вирус-специфических белков в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 и идентифицированы NlU-кон-, цевые продукты расщепления полипротеина. Показано, что in vitro структурные белки ВКЭ транслируются преимущественно с едкой точки инициации в порядке (Nf^) С-р23/р20-Е (COOK), где р23/р20 - предположительный предшественник белка М.

в) Показано, что предшественник структурных белков ВКЭ подвергается процессингу во время его синтеза. Процессинг происходит при участии клеточных прстеаз, ассоциированных с мембранами, и не наблюдается в лизате ретикулоцитов, дефицитном по мембранной фракции.

г) На основании полученных результатов предложена схема образования структурных белков ВКЭ из полипептидов-предшественников.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДОКЛАДА

1. Свиткин К).В., Агол В.И. Эффективная бесклеточная система трансляции РНК вируса энцефаломиокардита. Докл. АН СССР, т. 238, 744-747 (1978).

2. Угарова Т.Ю., Свиткин К.В. Бесклеточный синтез белков в экстрактах, выделенных из клеток асцитной карциномы Кребс-2. 3 кн.. "Физико-химические методы молекулярной биологии". Изц-во МГУ, М., стр. 96-118 (1978).

3. SvitJcin У.У., Agol V.l. Complete translation of encephalo-myocarditis virus RNA and faithful cleavage of virus-specific proteins in a cell-free system from Krebs-2 cells. FEBS Lett.,

v. 87, 7-11 CI9783.

•4. Svitkin У.V., Lyapustin V.N., Lashkevich V.A., Agol V.I. A comparative study on translation of flavivirus and picornavirus RNAs in vitro: Apparently different modes of protein synthesis. FEBS Lett"., v. 96, 211-215 (1978).

5. Gorbalenya A.E., Svitkin Y.V., Kazachkov Y.A., Agol V.I. Encephaloayocarditis virus-specific polypeptide p22 is involved

in the processing of the viral precursor polypeptides. FEBS Lett., v. 108, 1-5 (1979).

6. Svitkin Y.V., Gorbalenya A.E., Kazachkov Y.A., Agol V.I. Encephalomyocarditis virus-specific polypeptide p22 possessing a proteolytic activity. Preliminary mapping on the viral genome. FEBS Lett., v. 108, 6-9 (1979).

7. Agol V.I., Chumakov K,M., Dmitrieva T.M., Svitkin Y.V. Functional and structural studies on the genome of picornaviruses. In: Sov. Sci. Rev, (Biology). Harvood Acad. Publ. GmbH, Chur.,

p. 319-370 (1980).

8. Агол В.И., Свиткин Ю.В., Угарова Т.Ю., Черновская Т.В., Ляпустин B.U., Лашкевич В.А. Инициация трансляции фпавивирусных и пикорнавирусных РНК. В кн.: "Стратегия генома PHK-содержащих вирусов животных", с. 3-4. Тез. докл., М. (1980).

9. Горбаленя А.Е., Свиткин Ю.В., Казачков Я).А. Идентификация вирус-сдецифического полипептида, вовлеченного в процессинг структурных белков вируса энцефаломиокардита. В кн.: "Стратегия генома PHK-содержащих вирусов животных", с. 11. Тез. докл., М. (1980).

10. Свиткин Ю.В., Горбаленя А.Е., Казачков J0.A., Агол В.И. Синтез и процессинг белков вируса энцефаломиокардита в бесклеточной системе. В кн.: "Стратегия генома PHK-содержащих вирусов животных", с. 38-39. Тез. докл., М. (1980).

11. Свиткин Ю.В., Ляпустин В.Н., Угарова Т.Ю., Черновская Т.В. Трансляция генома вируса клещевого энцефалита в бесклеточвой системе. В кн.: "Вирусы и вирусные инфекции человека", с. 123. Тез. дом М. (1981).

12. Горбаленя А.Е., Свиткин Ю.В. Протеаза вируса энцефаломиокардита. "В. кн.: "Вирусы и вирусные инфекции человека", с. 116, Тез. докл., М. (1981).

13. Казачков Ю.А., Свиткин Ю.В. Характеристика продуктов транс ляции РНК вируса энцефаломиокардита in vitro. В кн.: "Конференция

молодых специалистов по медицинской вирусологии", с. е-7 Тез. докл., М. (.1981).

14. Ляпустин В.Н., Свиткин Ю.В. Изучение продуктов трансляции генома вируса клещевого энцефалита in vivo и in vitro. В кн.; "Конференция молодых специалистов по медицинской вирусологии",

с. 8-9. Тез. докл., М. (1981).

15. Черновская Т.В., Свиткин В.В., Ляпустин В.Н. Инициация трансляции пикорнавирусной и флавивирусной РНК. В кн.: "Конферен» ция. молодых специалистов по медицинской вирусологии", с. 13. Тез. докл., М. (1981).

' 16. Свиткин Ю.В. Применение электрофореза на пластинах и радиоавтографии для анализа многокомпонентных белковых смесей. В кн.: "Практикум по общей вирусологии". Изд-во МГУ, М., стр. 143-156 (1981).

17: Свиткин Ю.В., Агол В.И. Фактор, способствующий полной трансляции генома вируса энцефаломиокарднта. Докл. АН СССР, т. 258., 1013-1015 (1981).

18. Svitkin Y.V., Ugarova T.Y., Chernovskaya T.V., Lyapustin V.N., Lashkevich V.A., Agol V.I. Translation of tict-borne encephalitis virus (flavivirus) genome in vitro: Synthesis of two structural polypeptides. Virology, v. 110, 26-34 (1981).

19. Gorbalenya A.E., Svitkin Y.V., Agol V.I. Proteolytic activity of the nonstructural polypeptide p22 of encephaloayocar-ditis.virus. Biochem. Biophys. Res. Conrnun., v. 98, 9S2-960 (1981).

20. Kaz.achkov Y.A., Svitkin Y.V., Chenovskaya T.V., Siyanova E.Y., Ugarova T.Y., Agol V.I. Leader polypeptides encoded in the 5'-region of the encephalomyocarditis virus genome. FEBS Lett., v. 141, 153-156 (1982).

21. Kazachkov Y.A., Svitkin Y.V., Agol V.I. The position of polypeptide G on the encephalomyocarditis virus polyprotein cleavage шар. FEBS Lett., V, 154, 161-165 (1983).

22. Svitkin Y.V., Agol V.I. Translational barrier in central region of encephalomyocarditis virus genome. Modulation by elongation factor 2 (eEF-2). Eur, J. Biochem., v. 133, 145-154 (1983).

23. Горбаленя A.E., Свиткин Ю.В. Протеаза вируса энцефаломиокарднта: очистка и роль SH-групп в процессинге предшественника структурных белков. Биохимия, т. 48, с. 442-453 (1983).

24. Свиткин Ю.В., Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Агол В.И.

Мембран-зависнмый процессииг насцентного предшественника структурных -белков флавивируса (вируса клещевого энцефалита) в бесклеточных системах. Тез. докл. 16 конференции ФЕБО, с. 230, М. (1984).

25.. Svitkin Y.V., Lyapustin V.N., Lashkevich V.A., Agol V.I. Differences between translation products of tick-borne encephalitis virus RNA in cell-free systems fTon Krebs-2 cells and rabbit reticulocytes: Involvement of membranes in the processing of nascent precuTSOTS of flavivirus structural pToteins. Virology, v. 135, S36-541 (1984).

26. Svitkin Y.V., Maslova S.V., Agol V.I. The genomes of attenuated and virulent poliovirus strains differ in their in vitro translation efficiences. Virology, v. 147, 243-252 (1985).

27. Свиткин Ю.В., Маслова С.В. Снижение матричной активности РНК полиовируса при аттенуации. В кн.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", с. 209-210. Тез. докл., М. (19В5).

28. Свиткин Ю.В., Лйпустив В.И., Лашкевич В.Д., Агол В.И. Синтез и мембран-зависимый процессинг предшественника структурных белков вируса клещевого энцефалита (флавивируса) в бесклеточных системах. Молекулярная биология, т. 20, 1251-1263 (1986).

29. Lyapustin V.N., Svitkin Y.V., Ugarova Т.Г-. lashkevich V.A., Agol V.I. A tentative model of formation of structural proteins of tick-borne encephalitis virus (flavivirus). FEBS Lett., v. 200, 314-316 (1386).

30. Svitkin Y.V.', Pestova T.V., Maslova S-У-» Agol V.I. Point mutations modify the response of poliovirus RNA t.o a translation initiation factor: A comparison of neurovirulenl .and attenuated strains. Virology, v. 166, 394-404 (1988).

31. Свиткин Ю.В., Пестова Т.В., Маслова С.В. Возможное участие факторов инициации трансляции в регуляции экспрессии аттенуи-рующих мутаций полиовируса. Молекулярная генетика, микробиология в вирусология, if 4, 3-6 (1989).