Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генно-инженерные аналоги неструктурных белков NS1 и NS3 вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генно-инженерные аналоги неструктурных белков NS1 и NS3 вируса клещевого энцефалита"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

ПУГАЧЕВ Константин Владимирович

УДК 578.833.29 + 579.254.22 + 578.22.224

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ АНАЛОГИ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ

NS1 И NS3 ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск — 1992 г.

Рабата выполнена в Ноносибирском институте биооргдаической химии СО РАН, ^ ! ■

Научный: руководи гель - доктор химических наук Д.Г.Плетнев.

Сфшиальнке оппоненты: доктор биологических наук Мертвецов Н.П.

кандидат биологических наук Каргинов Б.А..

Беда&я :органиеакий: НИИ' милсвуляркой оиодогии НТк "Вектор"

Зашита состоится _____1992, г. в часов на

заседании Споцишгипироринногс соь"о •< 003.52.01 при Новосибирском институте оиоорганнческой хи.'-ои -ю РАН по адресу: 680090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаь.-'нтьева 3.

О диссертацией можно ознакомить-.,: библиотеке- Новосибирского института Оиооргашческой химии гу ГДЙ.

Автореферат разослан "М* ________ 1992 г.

Ученый секретарь

Сл I о ни ад и и ро ь ш ш о г п совета,

кандидат химически).' наук

О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность пробдзмн. В:-грус клетевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству Maviviridae, включающему около 70 прэдстаалте-лей, некоторые из которых являются возбудителями таких тяяегзк заболеваний человека как японский энцефалиг, желтая лахоршсе, лихорадка Денге, клещевой энцефалит и др. Сложность решения кш: научных, так и практических задач, связанных с проблемой клещевого энцефалита, ранее обуславливалась ограниченностью традиционных вирусологических подходов, а также высокой патогенностью ВКЭ для тавотных и человека и вытекашей отсюда опасностью работы с вирусным материалом. В настоящее время применение методов молекулярной биологии и, в частности, генетической инженерии позволяет в значительной степени обойти эти трудности.

В 1939 году в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР была завершена работа по созданию библиотеки вирусной кДНК и изучению первичной структуры генома^ ВКЭ. Результаты этой работы открыли широкие возможности для детального исследования молекулярных механизмов развития инфекционного процесса, а таксе позволили приступить к получении генно -иимнернш: аналогов вирусных белков. Это очень важно, поскольку только глубокое понимание молекулярно-биологических основ взаимодействия вируса и клетки и использование новейших дости&ений биотехнологии могут привести в конечном итоге к решению проблемы лечения и профилактики клещевого энцефалита.

являлось конструирование ДНК-копий генов неструктурных вирусных белков NS1 и NS3 и исследование возможности их экспрессии в бактериальных клетках, а также создание рекомбйнантных плазмид, возводящих нарабатывать указанные белки и изучать их биохимические свойства в эукариотических бесклеточных системах трансляции. Б задачу исследования входило также выяснение некоторых морфологических и функциональных особенностей белка NS? ВКЭ. Ранее в лаборатории в клетках, инфицированных ВКЭ, при помсаг моноклональных антител была обнаружена короткая форма белка NS3 с молекулярным весом 49 кДа, названная NS3'. Поэтому путем экспрессии in vitro различных участков гена NS3 и ряда его мутантнш. вариантов, полученных методом сайт-направленного мутагенеза, необходимо было экспериментально подтвердить существование двух форе.*, белка (полноразмерной и короткой), а также доказать, что

8-цокцзвоЗ домйн ' белки bs3 БКЭ является вируссайци^чвсйоЛ upor¿¡»-сой, принимающей участие в процессинге вирусного полипротеина.

В процессе

pi-Лоты, исходя, кз перехривбэдахся кЛНКНЙрагаентов генома БКЭ и |iiüti синтетических олигонузлёотидов, осуществлена сборка индивиду-ельенх генов неструктурных белков' KSI и NS3 ВКЭ. На основе плаз-«ецЕнх векторов серии pus разработана новая система экспрессии в кдзтках E.coli индивидуальных генов в составе искусственных поли-Е-астронных оперонов, позволящая укеньзить токсическое воздействие чзгзродшк ■ белков на бактериальную клетку. Используя эту систему, ло-лучекы эффективные ■ бактериальные продуценты белков и NS3 ЕЮ. Разработан способ выделения белков ksi и HS3 из продуцирующих ехзтож. Сконструирована рехомбинантвые плазмидн, позволяющие нара-^¿¿ппать указанные белей в эукариотичэских системах трансляции In vitro. Это дало возможность уже сегодня приступить к исследовании ггшуно логических свойств генно-ипженершх аналогов белков ksi и í.'JS БКЭ и возможности иг. использования в качестве антигена в новых фтрг— к стадюс-пещфлеских диагностакумах и как компонентов вагс-цяш протав ЕКЭ.

Впервые для флавивирусов путем экспрессии различных участков гена IïS3 БКЭ в лизате ретихулецитов кролика продемонстрировано суцзстЕоваааз короткой формы белка N33. названной î!S3' (M.в. 49 5Да). которая била, выявлена такие и в зараженных ВКЭ эукариотичес-ких клетках при подаад моноклональных антител I8B8. С целью Еияснения механизма образования белка KS3' методом сайт-направленного мутагенеза получено 6 мутантшх вариантов гена №3. В результате экспресс.а мутантов (в том числе в составе блока генов ÏIS2B-HS3) in vitro доказано, что в ы-концевой части белка КЗЗ ВКЭ заключена вирусспецифическел протеаза, принимавдая участие

„ 138

в процессинге вирусного полипротекна, и что остаток Ser играет ключевую роль в протеазной активности HS3. Крош этого показано, что появление белка ns3' не является результатом аутокаталитичес-кого расщепления - самого белка KS3, обусловленного действием его ы-концевого протеазного домена.

П£блжшии^_гэтробашя_работы. По материалам диссертации опу-блнковано 3 статьи. Получено 2 авторских ^свидетельства на изобретение .

Структ^£а_и_обьем_работы. Диссертация излоаена на 155 страни-

игл, лгслу.угжик 20 рчоукроз, 6 т-йбгкц :< список литератур;* HS" ~с;;лтш). Л'-;сс.зрт!Жконй&я работа состоит из введеч-д, ?]>эх гл;т> п ы.г-олот.. Глгша I - "Se.iwjr и-тавнгирусоз' г- v,x P0op:3fcEfö" (Лнтзри-туршгй обзор). Глава 2 сояоряи? излогвипе и Обсувдоние результатов полученных в работе. Глава 3 - экспериментальная часть.

'СОДЕРЖАНИЕ- РАБОТЫ . ' ' ' • ' CSopxaj^siicnpeccngj^ К

главтшй с^муяогеичм £ллв\5вдру.сов отяо.спт белок' вирусной обогот-ш В и неструктурный белок NS1. Однако в последнее время в лйтзрагзфЭ стали появляться джккз о тон?. что' и другие неструктурные вчр?<СТ8. белки'. {помимо HS1) вызывают шслунный ответ' организма.' В частности для ряда флавивярусо? упэ 'показало, что первши; белею®, в отчетна которые в крог-и пзцизнтов появляются - специфические антитела, являются неструктурное,бе¿;я N33 и ÜS5. Из Данных.работы, прозох:?-мой в настоящее время, нашей лабораторией совместно с Ш15П (г. Хабаровск), уже сегодня.'мокно'сделать вмвод, "что динамика некошзэ-кия в • крови' больных' и .титры зн'титед" к-' различным, белкам ВКЭ еялызэ отличаются в зависимости от. стадии и, формы. заболевания. Поэтог^ целъй данвой части работы- являлось конструирование .ДНК-копий гонов NS1 и HS3 ВКЭ и их экспрессия , в клетках Е.coli'длй последузззго изучения возможной™ использования .полученных.' бактериальных аналогов в новых форчо-' и' сталиоепёцифичес'кйх диагностических тест-системах, а-также в качестве компонентов .вакцины'гтропсв ВКЭ. . ■• Первоначальной задачей являлось конструирование индивидуальных генов 7JS1 и NS3- ВКЭ, пригодных • для-' экспрессии в клетках E.coli. Она была решена, при- помощи' традиционных; генно-искйпарпнх подходов,•'исходя из ряда'. перекрывающихся 'кЛИК^фрагментов гекока ВКЭ с' известной нуклеотидной "последовательностью-и набора сштета-че'скиХ'олигонуклеотидов. Затем на основе экспрессируиада векторов серии рш был получен набор рекомбинантннх'.плазмид (см. на сдеш рис.1.), , напргшляюищх биосинтез, белков NSi (а также', его длинной формы'NS1'.) и NS3 ВКЭ В .Клетках' E.ooli,' На сегоДняшниЯ день ацалоричйых плазмидных. конструкций'в литературе не'описано. ■'•..' Плазмиды' pUR29DSiB й pUE290SÄE -в ' условиях' индукции промотора Pi а'с\ обеспечивают • высокий' уровень синтеза' в бактериях (выход 80 чг/л ; культуры ) ■ гибридных .полипротёинов ■ Р-галактозидаза-NSi и р-галактозидаза-NSl '■. При. этой NS1-специфические аНтитела связнва-ются тоЛько с'получВнными .гибридными белка»«' (рис. 2а).'

''""'-' V • '•' .з ' '

5'

ЙНК впэ

—L£1e£L

;ai

I*-«!

..liyrtwäTiiiBa

Lsc24

LecZv^SJSSS.

H

«tissa-*j

! pua9casr

pSSISlI

P-J—'sal

nUSa»«S3

esss-tea

E.coîS

In vitro

ten- I

t ч ,

сшгг ИСТС >

Si?SSP cm !

C3T6SP

G7SSAP

♦ !

«T55SP 0Ш

?i!с. I. Общая схема плазмидных конструкций, полученных в работе, в проекции на геном ВКЭ.

При получении продуцентов индивидуальных белков Ь'31 (HS1 ' ) и ызз мк столкнулись с серьезными затруднениями. Первоначально нами предпринимались неоднократные попытки экспрессии указанных индиви-дуалъкых генов в составе таких векторов, как полуконституитивкые вектора серии рис, индуцибелыше вектора серии pïïQ, термоиндуци-бельные вектора рСЕ119. pCEQ3 .и pCEQ6. Однако они оказались безуспешными. Исходя из результатов этих предварительных экспериментов, был сделан вывод, что индивидуальные белки NSI (KS1 ' ) и NS3 ВКЭ токсичны для бактериальных клеток. Их появление либо вызывает гибель бактерий, либо активизирует процессы рекомбинации ДНК, приводящие к нарушениям структуры исходных плазмид, исключающим возможность наработки чужеродных белковых последовательностей. Ничего подобного не наблюдалось при экспрессии химерных белков Р-галактозидаза-NSl и р-галактозидаза-NSl '. Поэтому мы предположили, что бактериальная Э-галактозидаза способна каким-то образом экранировать токсичные эпитопы чужеродного полипептида, и попытались экспрессировать индивидуальные гены hsi (NS1') и NS3 в соста-

ве век-торов серии рта, которые раньше не использовались для аналогичных целей. Были сконструированы плазмкди рШ290Ы31 ', р1ГО290К31, рУН(Ыв 1 )о» рШ291Ы53 -И РТО291 №3)г.

а)

1234 5678 3 ¡0 II

180

кДэ. -

Щ «ч 9Щ

116

к Да

б)

4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

N51

59 кД*.

Щ

т

и

КЗ КЗ) 5=3

Н ^ Г 5 к?

¿Ь!

А'** с* в У* *»»«• ч ¿V

= ~ } К51

Г**} {ДОЗ

Рис. £. а - результат электрофореза лизатов клеток, несущих плазмидн рШ290 до и после I часа индукции Р1ае-промотора (I и 2).

рШгЭОЭАВ до и после I и 2,5 часов индукции ( 3, 4, 5), р1ГО290&№ до и побле I и 2,5 часов индукции (6, 7, 8); дорожки 9, 10 и II -иммуноблоттинг с использованием ВКЭ-специфических антител проб 2, 4 и. 7.- б - электрофорез лизатов клеток, содержащих плазмиду риЖЫ51 )2 до и после I и 2,5 часов индукцииП, 2, 3): 4, 5, 6 -

иммуноблоттинг проб I, 2, 3; иммуноблоттинг лизатов клеток, несущих плазмиды рШРг9(Ж51 до и после 0,5, I и 2,5 часов индукции (7, 8, 9, 10), рШ290Ы31 ' до и после I и 2,5 часов индукции (II, 12, 13). '..••-.

При получений.этих плазмид мы использовали два перспективных

подхода. Во-первых, это создание искусственных полицистронных оперонов, в которых цистроны сопряжены таким образом, что терминирующий кодон первого цистрона входит в состав участка связывания с рибосомами второго цистрона. В случае этих'конструкций в качестве первого цистрона выступает ген р-галактозидазы, содержащийся в векторной части плазмид. Второй подход - это создание гомополицис-тронов с сопряженной системой трансляции всех генов. Поэтому в плазмидах рикшв! >? и рик?91(нзз)2 нами была осуществлена дупликация генов N31 и нэз.

В клетках, содержащих ллаомиду p'iPiNSi Ь, наблюдается э<1Фек -.тивдый синтез белка NS1 (М.в. 39 кЛа), который в данном случае является единственным- . белковым продуктом, связывашимся с NS1-специфичными антителами . Выход продукта ири 2-часовой иидук-' ции промотора составляет не менее 20 мг/л (рис. 26, 1-6).

В противоположность pUR(NSi)г-содержащим клеткам плазмида '. PUR290NS1 обеспечивает в кле.тках е. coli низкий уровень' синтеза ■ белка NS1 (рис. 26, 7-10). Таким образом, дупликация гена NS.1, 'осуществленная в.плазмиде pUB(NSl)2, позволила значительно увеличить выход его белкового продукта в бактериальных клетках.

В клетках E.coli; содержащих плазмиду pUR290NSl', при помощи иммуноблоттинга вместо единственного ожидаемого" белка MS 1 ' (46 кда) выявляются два вирусспецифических продукта (46 и 44 кДа),' Хотя уровень синтеза этих белков в клетках очень низок .(рис.26, II-13), тем не менее обнаруженный феномен образования'_ двойного продукта гена HS1 ' представляет для нас. большой интерес и подлежит .дальней».ему изучению.

,Уровень' синтеза белка. NS3 (69 кДа) как-в случае pUR£9.lNS3, так и рШ291 (NS3 >2 "оказался низким. Кроме полноразмераого 'белка в клетках, при . помощи антител выявляются также продукты гена »S3 меньшего размера (46, 29 и 28 кДа). Еыход суммарного продукта, в случае эти конструкций составляет 0,4 и 1,0 мг./л (рис..За,-J-5).

Удаление 5'-концевой части гена NS3 (илазмида pUT<291NS3* ),' кодирующей первые 174 остатка белка ведет к резкому увеличению выхода (£0 мг/л.) укороченного продукта," обозначенного NS3* (51 _ кДа; рис.За, 6-7; Зв). Можно предположить, что низкий выход полноразмерного HS3 в предыдущих случаях мог быть обусловлен наличием в ном ы-концеьой части, которая, как будет показано ниже, содержит домен : вирусной протеазы. Эта часть может быть токсична д.пя бактерий и вызывать деградацию полноразмерного NS3 протеазами E.coli.

Набор дополнительных коротких продуктов гена NS3* оказался аналогичным наблюдаемому для полноразмерного гена. Следовательно, наиболее вероятной причиной появления коротких пептидов является реннициашя трансляции мРНК с. промежуточных .Met-кодонсш генов. MS3 И NS3*.

Ранее в лаборатории был получен препарат моноклональных антител I8B2. к вирусному белку NS3. Эти антитела специфически связываются только с полноразмерными белками NS3 и NS3 (рис..36) и не

а)

6}

2 3 4 5 6

NS3 HS3

- 46

., 29

j нс N33

-¿.язз'

»4

ис

в) 12 3 4 5

"й не

►4 *

•*• MS3

Рис. 3. а - результат иммуноблоттинга с использованием, БКЭ-_ специфических антител лизатов клеток, несущих плазмиды рШ291 после-3 часов индукции Р1ас-промотора (I), pUR29i(NS3)2 после 0.5.

2 -й 3 часов .иццукции' (2, 3, 4), pUK29iNS3' после-3 часов индукции (5), PUB291NS3 после 2 и 3 часов индукции (6, 7). б - дорожки 1-6 ' иммуноблоттинг с использованием МкАт I8B2 проб' 1-6 на рис. IIa. В скобки заключены полосы, являющиеся результатом неспецифического связывания МкАт с. белками E.coli (препарат антител предварительно, не был истощен на бактериальные белки), в - электрофорез лизатов клеток, содержащих плазмиды pUR29I до и после. I часа .индукции (I, 3), PUR291NS3 до и после 2 и 3 часов индукции (2, 4, .5). Цифрами обозначены молекулярные массы белков в кДа

взаимодействуют с короткими продуктами генов, которые выявляются при помощи поликлональных антител. Исходя из этого был сделан вывод, что антигенная детерминанта, распознаваемая МкАт'18В2, по-видимому, локализуется между 174 (начало NS3*) и 236 а.к.• остатком (стартовый Met-кодон для пептида с М.в. 46 кДа). белка NS3.

Как оказалось, плазмиды pUR290NS1', pÜR290NS1, . pUR.(NSl )2, . pl!R291NS3. pUR291(HS3)j H pUR?91NS3*стабильны в клетках' E.coli В условиях индукции Р^ас-промотора. При этом.наблюдается синтез с.о-ответствуицих белков РКЭ, но без обнаруженных первоначально "признаков их токсического воздействия на бактерии.Таким образом, можно сделать вывод, что на основе плазмидных. векторов серии рШ нами', разработана новая система экспрессии чужеродных генов в • клетках "•".coli, которая позволяет снизить токсическое "воздействий белково-•<• придукта на клетку. Однако, учитывая результаты экспрессии ге-

нов мзз и NS3*. говорить о полном устранении с ее помощью признаков чужеродности продукта для бактерии, по видимому, нельзя.

При выделении индивидуальных, белков из клеток-продуцентов главная трудность заключалась в том, 'чтобы ' отделить требующийся продукт от бактериальной Э-галактозидазы, что косвенно подтверждает предположение о способности р-галакт'озидазы каким-то образом вступать в комплекс с чужеродным белком и -экранировать' часть его токсических эпитопов. Поэтому нами была разработана 'также простая мгтодика выделения генно-шкенерннх .аналогов' бежсов ВКЗ, основанная на их избирательной экстракции из 'осадка, ' собранного после разрушения продуцирупдих клеток, раствором 2,5 M гуанидина-гидрохлорида. Она оказалась одинаково пригодной,для NS1, NS1', NS3-и NS3*.

Сегодня в ИПиВЭ (г, Москва) уне ведутся интенсивные исследования иммунологических свойств полученных- аналогов.' В частности, на их основе разрабатываются новые диагностикумы. Кроме этого, .недавно получены протективные сыворотки 'кроликов к бактериальному NS3, что, салю по себе, очень интересно с "фундаментальной точки', зрения. Пассивная иммунизация мышей такими сыворотка»«! предохраняет их от гибели после введения 100 летальных доз итого 'вируса. • .

^сп£ессия_гена_к§1._1блока_^^ ' Поскольку.'

икглунологические характеристики. и биохимические .свойства - эукарио-' ■ тических полипротеинов и их бактериальных аналогов зачастую оказы-' .вазтся различными, было бы разумным попытаться. разработать также способ наработки белков ВКЭ в условиях, максимально, приближенных к естественным условиям нивотной клетки'. Поэтому, нами были сконструированы рекомбинантнке плазмидные ДШ; .обеспечивающие возможность .' получении соответствуют« вирусных, белков, в,'эукарйо.тических 6èc-клеточных системах трансляции (рис'Л.).' ■•-''-•.' ".-.,■'''-Плазмиды pGEMR/H, pGEMl09. и-.pGEMshl- позволяют нарабатывать :в. лизате ретикулоцитов кролика■ белок nsIî'ôjiok полноразмерного* белка '• оболочки , Е с NS1; искусственно - укороченную форму белка оболочки; 'обозначенную Е', 85 кДа), которая»' согласно' .модели' антигенной, организации белка Е, покрывает всю■ éro 'иммунологическй-значимую-. область; а также ■ блок E'-NSl.' '.Указанные-белковые продукты.у спешно извлекаются из транслирующих смесей .'при-помощи, иммунопрешпитации-с использованием поликла'налышх -ВКЭ-Специфических антител, что., подтверждает их антигенную специфичность-. .-"-■•.■ •-.-..'•,'

• ; '.а: - : ' ■ ' '

Как известно, существует программа внедрения в промышленность новых достижений биотехнологии, основанных на бесклеточном синтезе белка. Если она получит свое развитие, то разработанные нами конструкции могут быть взяты за основу для наработки главных иммуногенов ВКЭ методами бесклеточного синтеза.

Короткая_форма_бе.жа^^ ВКЭ. Характерной чертой'многих вирусов (в том числе флавивирусов) является то, что при экспрессии их геномов в инфицированных клетках сначала синтезируется длинный 'белок-предшественник, ко- и посттрансляционный процессинг которого приводит к формировании зрелых вирусных полипротеинов. Для' флавивирусов показано, что часть их белков образуется с участием"клеточных протеаз. За расщепление же между NS2A/NS2B,' NS2B/NS3, NS3/NS4A И NS4B/NS5 ДОЛЕНа отвечать какая-то вирусная протеаза, которая долгое время оставалась неизвестной. На стыках указанных белков в предшественнике всех флавивирусов обнаруживается консервативный мотив Lya/Arg-Arg^ciy/ser (K/SK^G/S; расщепление происходит после пары остатков основных аминокислот).

Недавно-на основании результатов компьютерного анализа аминокислотных последовательностей фдавйвирусных полипротеинов Горбале-ня и Кунин (Москва) и Базан и Флеттерик (Калифорния) выдвинули гипотезу о том, что состоящий из 180 а.к. N-концевой участок белка NS3 флавивирусов представляет собой домен вирусной сериновой протеаза, и что одной из функций белка NS3 мозйт являться расщепление предшественника по перечисленным'выше позициям. Согласно теоретическому предсказанию, в работе каталитического центра ы-концевоЯ протеазн HS3 главную роль должна играть триада аминокислотных остатков: His-54. Asp-78 и Ser-138, причем ключевую функцию выполняет Ser-138, окружение которого вы . . _ . . _

ЮЕНг и 0ЕН4 с помощью метода делеционных мутантов уке продемонстрировано, что присутствие н-концевого участка белка ыэз необходимо при расщеплении вирусного полипротеина на границе Б случае указанных вирусов протеолиз между -№52В/№53 обусловлен суз-активностью предполагаемой сериновой протеазы (т.е. расщепление происходит исключительно, когда протеаза сама входит в состав гидролизуемого полипротеина!.

Ранее в лаборатории были получены МкАт 18В2, упоминавшиеся

сов: Gly-Thr-Ser -Gly-Ser-Pro

1 38

выше. С их помощью в' эужариотических клетках, зараженных ВКЭ, наряду с полноразмерным белком- №33 (69 кДа.) был выявлен дополнительный продукт гена MS3 ВКЭ с М.ь. 49 кДа, неизвестный ранее для флавивирусов и названный нами NS3' • • ." .,

На данном ьтапе- работы нам необходимо было доказать, что в м-концевой частя белка-NS3 ВКЭ содержится домен вирусной еериновой протеазы, и что Ser-138 играет ключевую роль в его работе. Кро'ме' этого, нужно было установить' локализацию белка N53' на -вирусном предшественнике и попытаться выяснить механизм его образования." ДЛЯ ЭТОГО бЫЛИ НОЛучеш КОНСТРУКЦИИ pGEM-NS3, pGEM-NS3* и ps-г.вз (последняя несет блок генов NS2B-NS3 ВКЗ; рис Л).

Плазмиды pGEM-NS3, pGEM-NS3* в соответствии со схемой (рис.4) линеаризовали подходящими рестриктазами и использовали в Качестве матрицы для синтеза in vitro соответствующих мРНК с использованием РНК-полимеразы SP6. Полученные мРНК затем транслировали в лизате

рвснг-мз рвснг-тз'

п

п

РЭ

кг из

В(1П В«»Н1

........ '""j1 DMA

И-3

41

RHC

—I-

4 г

mRNAi

бслсж NS3

Рис.4. Схема получения набора мРНК с плазмид^ ■ рОЕМЗ-ШЗ И рОЕМ2-ЫЗЗ В проекции на белок ыэз. Указаны мол. веса белка N53 в кДа. Точкой"отмечено положение на белке потенциального сайта расщепления вирусной протеазой. Позиции 1 и 2 (см. в тексте) отмечены стрелками.

у: I

рз МЭ Р2 М2 F1 KÜa — 90

• ' - - 66 f ~ ~ • - 45

Рис.5. Экспрессия фрагментов 1ена NS3 ВКЭ in vitro. Обозначение мРНК, у кранное над каждой ли-■!Иг;й, см. на рис.4. " RNA" - КОНТрОЛЬ ЧИСТ"->н системы.

— 34.Т

ретикулоцитов кролика. S-меченнке продукт» трансляции осаедали при помощи иммунопреципитации с использованием поликлональной ас' цитнЬй жидкости мышей и анализировали электрофорезом ь ШАГ. . ■ Аналогично картине, наблюдавшейся' в .заратешмх ЗКЗ клетках, трансляция, полноразмерной. NS3-MFHK .(РЗ) такие ведет к образованию двух, лелкових продуктов размером 69 и 49 кДа. (NS3 и, возможно, NS3'рис.5).'По нашему мнению, существует три наиболее вероятных .причина образования in vitro продукта с М'.в.' 49 кДа: I) преждевременная термпнация трансляции мРНК' (в .позиции 2 на рис.4); 2) .реинициация трансляции с одного из промежуточных Met-кодонов (в /позиции i); 3) протеолитическое расщепление .полноразмерного белка NS3 (в позиции I или 2). ■■ ■

■ ■ Если верно первое предположение; то трансляция мг и мз (см. рис 4)' должна дабать как полноразглзрнне продукты этих mFHK, так и одинаковый в обоях случаях дополнительный полипелтид с М.в. 31 кДа. Однако при трансляции Í.ÍE и ИЗ наблюдается образовакие только 'полноразмерных белков (.46 й 50 кДа,■соответственно; рис.5). Если бн было верно второе предположение, тогда при трансляции Р2 наряду с .полным продуктом (65 кДа) должен появляться добавочный полипептид о меньшим' молекулярным весом (46- кДа), чем в случае РЗ (49 кДа)',.Однако в обоих случаях (P?. и РЗ)'короткий продукт скпяыв&ет-' с,я одинаковым. Последнее наблюдение', исключает также возможность посттрпнсляииокного расщепления NS3 в позиции I. Таким образом, единственной возможной причиной формирования полипептида с М'.в. 49 кДа. (при трансляции' F2 и РЗ мРНК),является расщепление N33 в позиции 2, Но для такого расщепления, видимо, необходим н-конневой Фрагмент бежа, поскольку в случае М2 и МЗ наблюдается образование только полноразмерннх нерасщопленннх продуктов. Поэтому, учитывая также, что внутри бежа NS3 в районе 459-461 а.к. (в позиции 2 на рис.4) имеется потенциальный сайт расщепления вирусной протеязой (RRO).,' мы предположили, что короткий продукт трансляции, in vitro гена N33 RKD с м.п. -49 кДа и белок-NS3', нандешжй с помощью моноклинальных антител в зараженных, БКЭ животных клетках, формируются но одному и тому же механизму, а именно, благодаря аутокаталити-чесниму протеолизу полноразмерного.NS3 по внутреннему KRG-сайту за сче.т деятельности предполагаемой. мтконцевого ' протеазного домена белка. В последствии зтч предположение не подтвердилось. Тем не

'1.1

менее, на данном этапе работы нам удалось: I) подтвердить в модельной системе существование MS3'; 2) локализовать расположение аминокислотной последовательности NS3' внутри NS3 (от начала кзз и, примерно, до позиции 2 на схеме); 3) продемонстрировать, что для выщепления HS3' из полноразмерного NS3 не требуется участие каких-либо других вирусных белков, но 4) необходимо присутствие N-концевого участка белковой молекулм.

С помощью метода сайг-направленного мутагенеза на частично дуплексной плазмидной ДНК в ген HS3 были введены мутации, индуцирующие аминокислотные замены в каталитическом центре предполагаемой протеазы (gtsgsp -> gtagsp, gipgsp, gstgsp и gtsgap), а также в возможном внутреннем сайте расщепления бежа (qrrg -» hctg и qrsw). Как оказалось (рис.6а), ни одна из этих замен не влияет ка выщеп-ление NS3' во время экспрессии in vitro мутантных форм гена. Отсюда следует, что появление NS3' в ходе процессинга вирусного полипротеина не может быть связано непосредственно с активностью N-концевой сериновой протеазы белка NS3.

При экспрессии блока генов NS2B-NS3 ВКЭ (плазмида pS-2B3) in vitro наблюдается формирование индивидуальных белков NS2B, NS3 и KS3' (рис.66, дорожка 7). Мутации по внутреннему rrg-сайту белка NS3 или замена его Ser-140 на Ala не влияют на ход процессинга блока.'Мутации в белке NS3, затрагивающие остаток Ser-138 (GTSGSP -» GTAGSP, GIPGSP, GSTGSP), полностью блокируют процессинг (рис.,66, 1-6). Отсюда следует, что I) в N-концевой части белка NS3 ВКЭ, действительно, содержится домен вирусной протеазы, который в описанных экспериментах отвечает за расщепление на границе NS2B/NS3, и что 2) остаток Ser-138, действительно, выполняет ключевую функцию в его работе. Причем 3) важное значение для деятельности протеазы имеет правильное расположение остатков в ее каталитическом центре (перестановка местами Thr-137 и Sei—138 ингибирует активность фермента). 4) При экспрессии блока NS2B-NS3 указанные мутации препятствуют не только • расщеплению продукта на границе NS2B/NS3. но блокируют также и образование HS3' (чего не наблюдалось при экспрессии индивидуального гена NS3). По-видимому, в ходе процессинга участка вирусного полипрогеина, содержащего последовательности белков NS2B и NS3, сначала должен отщепиться NS2B с образованием свободного М-конца NS3. и только после этого происходит формирование NS3', что, по-видимому, отражает порядок событий

в реальных условиях зараженной клетки.

Остаток Ser-140 не является существенным для работы фермента, поскольку точковая мутация Ser-140 -» Ala (gtsgsp -» gtsgap ) не влияет на ферментативную активность N-копцевой сериновой протеазы

а) 1 2 3. 4 5 6 7 8

90

NS3 NS3'

б)

NS2B-NS3-NS3 -NS3* "

в? Ср? "ч® СЭ git ._ 66 "й» _ Ы

Ш Щ — 45

- 34.7

I 234 5 6789 Ю

— 90

i СЗЭ С~7Р ТТГ5 — ""

«чя •

' ■ с, j

_ „3 •

- SS

- 43

- 34.7

NS2B

(

- 13.4

- 14,3

Рис.6, а - экспрессия in vitro мутантных форм гена NS3: с мутациями GTSGSP -> GTA.GSP, GIPGSP, GSTGSP И GTSGAP (2-5); QRKG HCTG и QHSW (6,7); I - контроль чистоты системы; 8 - нативный IÍS3. 6 -экспрессия блока HS2B-NS3 и его мутантных вариантов: 10 - контроль чистоты системы; 7 - нативный блок; блок с мутациями в NS3 GTSGSP -» GTAGSP, GIPGSP, GSTGSP И GTSGAP (1-4); QKRG -» HCTG И QRSW (5,6); 9 - мРНК Р2 (см. рис.4); 8 - Р2 + блок с мутацией GTSGSP GIPGSP.

KS3. Он не мокет также выполнять компенсаторную функцию в случае мутации по Ser-138, т.к. достаточно мягкая замена Ser-138 -» Ala или перестановка местами Thr-137 и Ser-138 полностью инакгавируот вирусную протеазу.

В случае ВКЭ при расщеплении блока NS2B-NS3 Ы-концевая сери-новая протеаза бежа NS3, > скорее всего, также выступает как cys-действующая, поскольку совместная трансляция мутантной NS2B-NS3-MPHK (продукт не способен саморасщепляться из-за мутации

GTSC-Sp-i-GIPOSr Б KâïcVbiï'HMOCKOM ЦОНТ-ре СОбСТВЭГООЙ протвазы) И МгКК F2 (бел,со!;ьй продау козвт являться Поставщиком агтишого транс-ÂSScii^epo Сор-эпта) не привода? к фзржфогвдкю кщдаидувяьвк;: бьдкob К83 к Н32Б {рис.66, дорожа 8).

вывода

1. Исходя из перекрыващихся кДНК-$рагмен-тоБ генома ВКЗ и ряда сштетичесхкх одягонуклеотидов, осрэствлзна cóoprs кадавядуалышА геков ksi и кзз Б1СЗ. ■

2. На основе плазшвннх векторов серии рТШ разработана система экспрессии в клетках. E.coli индивидуальных геноз в составе искус-ствзнзыд полишстронных оперонов, позволяющая умэпькитъ то:;с-,гчас-ксс воздействие чукеродаых белков на бактериальную клетку. Используй эту систему, получены эффективные бактериальные продуценты белков KS1 и NS3 ВКЭ. Разработан способ выделения белков KS1 и КЗЗ кз продуцирующих .клеток.

3. Сконструированы рекомбинанташе плазмидные ДНК, позволяющие нарабатывать белки К31 и HS3 и исследовать их свойства в зукабиотических бесклеточшх' системах трансляции, -

4. Доказано, что в N-концевой части неструктурного'белка NS3 ВКЗ

золочена вкрусспеци£ическая протеаза, приним'апцая. " участие ■ в

продзссиЕге вирусного белка-предшественника. Показано, что оста-

-133 -

ток Ser играет ключевую роль в протеазнойактивности N33.

5. Впервые для флавивирусов на примере ВКЭ продемонстрировано и доказано экспериментально существование.короткой форма белка изз. обозначенной HS3' (М.в. 49 кДа). Показано, что образование белка КЗЗ' не является результатом аутокаталитичесного расйепйения пол-норагшрного белаа- 1¡S3, обусловленного действием его н-ковдевого протеазного доменй. 4

С£ШОШ£б pOGyjILïciTH S-îCCSpTUiw üriyw.'iUtüSJÄ21 ö ¿¿ЭДОШК работах:

1. Пугачев К.З., Плзтнэв А.Г., Ямщиков В.5., Горн 3.3. "-ег.скбн-налтнал плаамздайл ЛКК ршгэОВАЕ, хмшфущея гйбрстй г-галактсзвдаза-NSi-белок вируса клеевого знцеуслгга, и способ ее конструирования. Авторское свидетельство .''I67S733, 1991 г.

2. Пугачев К.В., Плетнев А.Г., Ямвдкоз B.Ö.. -Горн В.В. Резомби-кантная плагмидаая ДК рхжгн, кодирующая короткую форму, белка B8t вируса клещевого энцефалита, и способ ее копструировения. Заявка на изобретение K-176I543/I3, положительное рзшенна от 24.03.90.

3. Пугачев К.В., Плетнев А.Г. Эксгг.^ссия в клетках Escherichia coli гена белка KS1 вируса кле«ево.--с -.¿Ецефйиита. Молекуляр. биология, I9S0, Т.24. .'Йэ, С Л631-1639.

4. Пугачев К.В., Плетнев А.Г., Матвеев Д.Э. Ехспрессия з г.летках Escherichia coli гена белка N33 вируса клетевого энцефалита. Молэ-куляр. биология, 1392, Т.26, KI, С.15Э-168.

5. Pugachev К.У., Kcrsohoncva :î.Yu. , ïtorozova О.У., Pletnav д.G. А short îcrr.1 ol the tiok-bome encephalitia viras I'S3 proti_!_n. Lett.,1992, N . /, <T . pp. vÇ-c^