Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ вирионного (Е) и невирионного (NSI) гликопротеинов вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ вирионного (Е) и невирионного (NSI) гликопротеинов вируса клещевого энцефалита"

РОССИЙСКАЯ АгСАЛНЗДИЛ МЕДШЦШСКИХ НАУК

• ИНСТИТУТ ПОЖМТЗДГГЛ и бируош знтцадшггпр

Ни правах рукописи УДК 578.R33.26

ПРРГ.СМАН Кн г н нv Я Константинович

ОТРУКТУЖСМтекВДОНАЛЪШЯ АНАЛИЗ ВИРИОННОГО (Е) И КЕЗИРИОгГл'ОГО (NS1 ) ГЖКОПРОТШ^В ВИРУСА К.ШЦРВОГ0 ЭК1РШИТА.

(03.0C.06 - вирусология)

диссертация на соискание ученой степени доктори биологических наук h 'InpMH научного доклада

Работа выполнена в JiaöcjpaTopvivi радиохимии Новосибирск* институт «Зиоортшческой -химии со Российской Академии наук.

Сфициальные оппоненты:

ДОК'ГОр биологических кьук, Профессор A.A. Куш.

доктор биологических наук, лрс»1«*сс*%р К.Л. Шахани

доктор медицинских наук, профессор Я.Б. Эльб*р

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А.Энгельгарта Российской АН.

Защита состоится "odea's, 1994 г. в -¿О1** часов i заседании Специализированного совета Д.001.27.01 при Циститу полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН по адряс^ 142782, Московская обл., .Ленински!* район, пЛт Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АШ.

Научный доклад разослан "¿5" jujoJuZc* ТРЭ4 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

O.A. М^дводкина

I.Общая характеристика работы.

Среди различных оболочечных вирусов' семейство Flaviviridae обладает относительно простой вирионной структурой. Вирион состоит их трех типов полипепгидов: гликозилированного белка оболочки Е с около 53 -58 KDa; второго мембранного белка M (Mr-7-9 kDa) и, наконец, белка С (Mr-I3-I5 kDa), образующего с РНК центральную коровуп структуру вириона. Согласно существующей концепции первичный иммунный ответ инфицированного организма адресован к поверхностным В-эпитопам белка Е. К этому же гликопротеину относят и комплекс биологических свойств флавивирусов: способность к гемагглютинации эритроцитов, связыванию комплемента и образованию антител, нейтрализуодих вирусную инфекционность (Waataway, 1973). В последнее время появился ряд довольно противоречивых данных о . протективной активности гликопротеина NS1 (Shlesinger et al., 1988), входящего в группу неструктурных белков, сопровождапцих морфогенез флавивирусов (Brandt et al., 1970). В соответствии со структурой генома белок NS1 расположен в первичном полипротеине (первичным продукте трансляции) непосредственно рядом с белком Е и имеет Мг около 46-48 kDa. Однако роль этого белка и в процессах вирусного морфогенеза, и в развитии иммунного ответа инфицированного организма остается неясной.

Актуальность. Вирус клещевого энцефалита (КЭ) является полноценным представителем флавивирусов, образуя отдельный антигенный комплекс внутри этого семейства. С другой стороны вирус КЭ представляет собой наиболее активный патоген, вызывающий тяжелые нейроинфекции в странах евроазиатского континента. В этой связи возникает целый комплекс проблем, связанных с профилактикой, диагностикой, развитием патологических и иммунных процессов в ходе заболевания и, естественно, вопросами фундаментальной молекулярной биологии и иммунологии вируса. Прогресс в решении подобных проблем

находится в прямой зависимости от знания иммуногенных свойств основшх вирусных антигенов, антигенной структуры этих иммуногенов и связанной с этими структурами функциональной активности. Особое значение эти исследования приобрели в связи с интенсификацией попыток создания различного типа субъединичных, синтетических и генно-инженерных вакцин. Развитие технологии моноклональных антител позволило существенно дополнить и изменить стратегию выделения и очистки вирусспецифичных белков, изучения их структуры и функции и, наконец, идентификации вирусов.

_Ш:ЗЪ_и_задачи_исслэдоБшпш^ Исходя из вышеизложенного, общая цель данного исследования состояла в изучении структурно-функциональных свойств вирионного и невирионного гликопротеинов вируса КЭ. Конкретно: 1. комбинируя картирование белка Е моноклональными антителами с анализом серологической активности соответствующих эпитопов, связать топологии антигенной структуры с функциональной активностью; 2. исследовать иммуногекные и серологические характеристики неструктурного гликопротеина N31; 3. экспериментальные проработки решения первых двух пунктов приводят к необходимости создания различных аналитических тест-систем, применение которых возмоаио не только в научно-исследовательских работах, но и в практике здравоохранения. Создание таких систем, предназначенных для детекции антигенов вируса КЭ и соответствующих этим антигенам антител, их апробация также входило в цели данной работы.

Для выполнения поставленных целей необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. получить очищенные препараты вирусных белков Е и ыэ 1, охарактеризовать их иммуногенные и серологические свойства;

2. получить и охарактеризовать моноклональные антитела к этим белкам;

3. провести исследование антигенных структур Е и N31, их вариабельности, используя соответствующие наборы моноклональных антител;

4. провести картирование антигенных детерминант гликопротеина Е с использованием моноклональных антител, суммарных антисывороток к фрагментам и модифицированным формам белка;

5. разработать иммуно-аналитические тест-системы с использованием моноклональных антител для идентификации соответствупдих антигенов и антител.

_Научная_новизна_работы;_ В данной работе получены и исследованы панели моноклональных антител к структурному и неструктурному гликопрогеинам вируса КЭ, что позволило провести направленное исследование этих белков, их антигенной структуры, эпитопное картирование белка оболочки вируса КЭ. Разработаны и оптимизированы методы препаративного выделения и очистки структурного и неструктурного гликопротеинов вируса КЭ. Впервые установлено существование и разработан метод для выделения из вируссодержащего материала комплексов вирусных белков Е -NS1 и Е -NS1 -NS3. Используя моноклональные антитела и антисыворотки к фрагментам проведено эпитопное картирование и локализация отдельных антигенных сайтов на поверхности белка Е, частично подтвердившие и значительно дополнившие существупцие антигенные модели белков этой категории. Компаративный анализ эпитопных карт структурных гликопротеинов отдельных вирусов комплекса КЭ показал существование дифференцированности основных иммуногенов этих вирусов, что в дальнейшем было подтверждено вариантным анализом их антигенов.

Впервые показано усиление функциональной активности антигенных сайтов, связанных с нейтрализацией вирусной инфекционное™ у персистирующих вариантов вируса КЭ.

Впервые проведено сравнительное исследование иммуногенных и антигенных свойств природного неструктурного гликопротеина NS1 и его генно-инженерного аналога. В ходе исследования показана неполная адекватность этих полипептидов, их неспособность индуцировать синтез нейтрализующих антител и вызывать защиту против вирусной инфекции. Кроме того, выявлен синергический эффект в индуцировании синтеза антител к белку Е при гипериммунизации животных гетеродимером Е -NS1.

Практическая ценность работы. Проведенные исследования и полученные результаты расширяют представления о структурно-функциональной организации основных иммуногенов вируса клещевого энцефалита (Е и WS1 ), их антигенных свойствах и роли в развитии иммунологического ответа.

Разработаны иммуноаналитиче ские тест-системы для детекции антигенов белков Е и NS1 и комплементарных к ним антител. Изучена диагностическая ценность, адекватность и чувствительность различных вариантов этих тест-систем, в том числе и с применением моноклональных антител. Продемонстрирована возможность использования тест-систем в практическом здравоохранении и эпидемиологических исследованиях.

Агтдобация_работы^_ Результаты работы были представлены на международных симпозиумах "Биология клещевого энцефалита" (Новосибирск, 1987 г.), "Арбовирусы в странах Средиземноморья" (Дубровник, Югославия, 1989 г.), на Всесоюзном симпозиуме "Вакцины, диагностические средства и новая биотехнология" (Пущино, 1989 г.), Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита" (Иркутск, 1990 г.), Всесоюзной конференции "Биотехнология в медицине и.сельском хозяйстве" (Гарту, 1984).

_Публикадиил По материалам работы опубликовано 26 научных

работ.

2. Содержание работы.

В представленном докладе рассмотрены результаты научных работ, проведенных автором в 1982 -1992 гг. в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН и Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН. Эти работы находились в русле исследований научных коллективов Институтов, направленных на исследование молекулярно-биологических проблем вируса КЭ. В качестве эталонного нами был выбран штамм Софьин вируса КЭ дальневосточного подтипа, внесенный в International Catalogue of Arboviruses, 3rd ed. (1985), Ed. H.Ka^atsos, San Antonio, Texas, USA.

2.1. Получение__и__предварительная__характеристика__очищенных

препаратов_вщусщх_глжопротещов_и_моно^ ?_§™м_антигенам.

Среди весьма разнообразных методов анализа структуры и функции белков иммунологические и иммунохимические методы привлекают внимание высоким уровнем специфичности, гарантированным специфичностью взаимодействия антиген - антитело, при сохранении биологической активности структуры. В тоже время такой анализ требует в каждом конкретном случае разработки индивидуальных методов, адекватных исследуемому антигену. Естественно, что необходимым условием любого структурно-функциональный анализа вирус-специфичного белка является наличие его очищенных препаратов. Это дает возможность, во-первых, проведения изучения свойств как интактного, так и отдельных фрагментов антигена, во-вторых, получения и анализа моноспецифических антисывороток, в-третьих, получения наиболее широкого спектра моноклональных антител.

2.1.1 •Выделе™9_стр^тхрного_г^то^отеина_Е.

Выделение структурного гликопротеина Е из предварительно

очищенных препаратов вириона,фактически было сведено к оптимизации известных принципов подобных процедур, заключающихся в солюбилизации вирионных частиц поверхностно-активными веществами (детергентами) и последующим фракционированием субъединичных структур методом дифференциального цетрифугирования (Kaariainen at al., 1969). В качества ссшобилиаируицих агентов выбор был остановлен на.полиоксиэтилен (20)-сорбитан-моноолеате (твин-80) и октил- d- глюкопиранозиде (ОГП). Результаты экспериментов по выделению и характеристика получаемых препаратов белка Е приведены в таблице I.

Таблица I.

Характеристика препаратов гликопротеина Е.

'вы:

i

isi

;42 I84 I50 ;82

Приведенные результаты выделения белка Е указывают на зависимость количественного выхода белка не столько от концентрации детергента, сколько от соотношения детергент/белок. Подтверждением того, что выделенный белок представляет, собой структурный гликопротеин могу г служить результаты диск-электрофореза с определением мг белка, анализ первичной структуры отдельных пептидов, полученных в результате ферментативного гидролиза белка, и сопоставления с первичной . структурой соответствующего участка генома, а также сопоставлением суммарного аминокислотного состава данного белка с

концентрат ви-рионов_ "концентр белка :МКГ/МЛ

детергент

"тип ' : %

Твин ; ; -60 : огп ; 0,5 ; 0.5 ;

; ОГП 1,25

; огп 2,0 ;

; огп 2.0 :

гликопротейнТГ

концентрация. бёлокГантиге; мкг/мл;

тйтрТобратныё" велич.i

РТА РДПА

РСК

0,5

1.0 0,5 2,7 1,1

1500

1500 1400 6550. 2000

3.3 3,3 9,0 3,0 10,0;

2,8 2,0 2,7

4.5

5.6

130 320 220 2000 324

130 330 230

512 ;

1600 I 1280 ; 16000; 1600 :

2 4 2 40 4

640

1280;

составом аналогичных белков, имеющихся в литературе.

Используя микроколоночный жидкостный хроматограф Милихром, было проведено разделение триптического гидролизата очищенного белка Е обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке с нуклеосилом 5-C-I8. Количества полученных 4 пептидов составляли 2-5 нмоль. Автоматическую деградацию пептидов осуществляли на секвенаторе 890С (Beckman, USA). Идентификацию фенилтиогидантоинов аминокислот проводили методами ВЭЖХ и параллельно путем кислотного гидролиза до аминокислот с их идентификацией на аминокислотном анализаторе с флуорометрической детекцией (реакция с О-фталевым альдегидом).

Таблица 2.

Последовательность аминокислот некоторых триптических пептидов

гликопрогеина Е

Шифр Последовательность аминокислот Аооп AOQn

пептида --¿У -^нУ-

а2Ю А2Ю

4-3 X-Glu-Gly-Ala-Gln-Asn-Trp-Asn-Aan-X-Glu-* „ 0,95 0,1 б Thr-Glu-Cly-Ala-Gln-Asn-Trp-Asn-Asn-Ala-Glu-

8-3-2*** X-Val-leu-11 e-X-S er-X-Ala-Gln-Gly-Asp-Leu- 0,49 О Ser-Val-leu-Ile-Pro-Ser-Hia-Ala-GIn-Gly-Asp-Leu-Thr-Gly-Arg-

10-1 X-Ieu-Glu-Gly-Asp-X-Leu-* 1,0 0,16

Trp-Xeu-Glu-Gly-As p-S er-leu-Arg-8 » •

8-4 Leu-Val-X-Phe-X-X-X-X-Ala-Val-Lys-* ,, 0,49 0 _______beu:V§l:Glu-Phe-GlyzAla:Pro:Hi3-AlazVa____________________

*По данным секвенирования пептидов,

**По данным определения последовательности нуклеотидов

Этот пептид - N-концевой пептид белка Е, поскольку соответствующая ему последовательность нуклеотидов находится на 5'-конце гена белка Е; пептиду 8-3-2 предшествует последовательность Arg-Arg-, -сайт протеазы процессинга.

Полученные результаты суммированы в таблице 2. Здесь же представлены последовательности аминокислот, выведенные из нуклеотидвдх последовательностей участка генома вируса КЭ. Очевидно, что приведенные последовательности аминокислот полностью

<

, 1

соответствуют последовательностям нуклеотидов, найденным в гене бежа Е. -

Изучение суммарного аминокислотного состава гликопротеина Е вируса КЗ показало лишь его1 незначительные отличия от суммарного состава гликопротеина европейского штамма вируса (рицинусного типа) и состава, выведенного., из структуры генома (Р1е1теу еЪ а1, 1990).

I

2. 1.2. Моноклонадаше_антитела_к_бежам_Е_и Несмотря' на то, "что принципиальная схема получения моноклональных антител (МКА) представляет в настоящее время достаточно стандартную процедуру, практическое решение этой задачи для каждого конкретного антигена требует индивидуальной проработки. Для получения МКА к белку Е мы использовали две схемы иммунизации мышей - доноров спленоцитов. В первом случае 8-недельные мыши линии Ва1Ъ/с были иммунизированы 1.р. белком Е (5 мкг/мышь) с полным адъювантом Фрейнда. Реиммунизации проводили на 8 и 12 дни той хв дозой с неполным адъювантом. Спленоциты иммунизированных животных гибридазовали с миеломной линией клеток Х63/Ав 8.653 на 4 день после последней реиммунизации по стандартной процедуре. Во втором случае две иммунизации (I и 14 дни) проводили тем же антигеном и в той же дозе, но остальные (28 и 38 дни) реиммунизации выполняли 20% мозговой суспензией инфицированных сосунков мышей. Гибридизацию клеток проводили как указано выше, но использовали миелому (Бр2/0 - Хе 14).

В ходе скриннинга • реклонированных гибридом методом вот-блоттинга (детали метода приведены в соответствувдем разделе этого доклада) были отобраны стабильно продуцирующие гибридомы из каждого варианта гибридизации. Отобранные ' клеточные клоны были использованы для получения асцитов. Подбор условий получения асцитических жидкостей (ПАЖ), содержащих МКА, выявил некоторое

преимущество предварительной обработки мышей неполным адъювантом Фрейнда по сравнению с приставом (2,6,10,14 - метилпентадекан) и вазелиновым маслом. Условия получения '.ИАХ- приведены в таблице 3.

Ускорение сроков получения ИАЖ в случае предобработки неполным адъювантом Фрейнда происходит при полном сохранении как объемов асцитов, так и титров продуцируемых антител. Титры МКА при

о о

их культивировании в асцитах были в 2x10 - 4x10 раз вше, чем при их культивировании 1л vitro. Все отобранные МКА были охарактеризованы по ряду физико-химических и биологических параметров.

Взаимодействие между молекулами антител и антигена чаще всего характеризуют константами аффинитета. В случае поликлональных антисывороток измерение этих констант дает усредненное значение,

Таблица 3.

Условия получения ИАЖ мышей, продуцирующих МКА к белку Б.

предобра- срок обработ- кол-во кол-во кол-во объем ботка ки до введе- обработав- инокулир. мышей, асцита мышей ния клеток тайных клеток образов, (средний, __________(с^тетО_______мышей___________асцит______мл)__

пристан 10-25 14 1-2хЮ7 14 2,9

2£5Г- ы~21 18 1-2х1°7 17 6>6

неполный к

адьювант 1-4 43 1-20x10° 41 4,9

®Е>ейн5а_ _ _ _

тогда как МКА позволяют определять константы связывания (Кс) отдельных реакций антитела и антигена. Кс вычисляли из графика Скетчарда, построенного в координатах [МКА] связ/[МКА]своб от [МКА]связ, который представляет собой прямую линию с наклоном пк, где п- валентность МКА (=2).

Что касается биологической активности, то обе панели МКА были охарактеризованы в реакциях ингибирования гемагглютинации,

иммунопреципитации в агаре, связывания комплемента и нейтрализации вирусной активности. Кроме того. МКА были оттитрованы в иммуноферментных твердофазных тест-системах (ИФА и рот-блоттинг), а также проверены в- реакции с белком А из аигеиз.

Характеристики МКА сведены в таблицы 4 (МКА, полученные в результате "короткой" схемы иммунизации) и 5 (МКА, полученные в результате гипериммунизации мышей).

Таблица 4

Характеристики моноклональных антител (первая панель).

класс

К„

_______ЦТ!)________________________

ША

DOT

РТГА

РН РДПА

1А2

1Н11

1Е11

2НЗ

2D1

4F7

4А6

ЗВ7

5F6

5G10

5В5

5С5

5Н9

сумм. ИАХ

G. 2,0x10'

1 7

G. <10' 7

Ы <10' М 1,8х109

С1 8,9x10' <107

,8

4x10 3 4x10

10° 4x106 106

5x10° 107 10б

4x10° 5x10й

1,бх10в 6x1О7 107

М

°1 U

G. 4,2x10'

2X10-

10е

<10' 1,3x101

J1 ы

<10'

Оч 1,9x10'

м

G1 ,М

<10'

2x10-" Ю7

ю7

бх^О4 4x106 106

2x106

10' 107 107 106 106 ю7

106

40 О 40 О 40 10 О

О О 80 О 10 О

2560

О 1.8 О 2.0 О О О

О О О О О О

>7,2

О О О 103

О +

о

о о о о о о

64

РСК

о о о о о о о

о о о о о о

512

св бел

Примечания: ИФА - иммуноферментиый анализ

DOT - пятенннй иммуноферментиый анализ

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РН - реакция нейтрализации

РДПА - реакция диффузной преципитации в агаре

РСК - реакция связывания комплемента.

Значения в ИФА, DOT, РТГА, РДПА, РСК приведены в обрати

титрах; РН - как индекс нейтрализации.

Обращает внимание наличие в первой панели значительного

количества гибридом, секретируших МКА типа Ig М , причем к этому

классу относятся МКА 2НЗ с высокой Кс =2x1О9 М-1. Вторая панель отличается большим однообразием классов (лишь единственная линия гибридом секретирует А). Практически не существует различий между панелями МКА в характере титрования белка Е в ИФА. Значительная дифференцированность наблюдается при сопоставлении активности наборов МКА в серологических реакциях. За исключением одного все МКА второго набора ингибируют гемагглютинацию, а обратные титры двух МКА (1В1 и 1402) превышают 2хЮ4, тогда как активность в этой реакции ИАЖ, содержащей поликлональные антитела

о

к полному антигену вируса КЭ, составляет лишь 2,5x10 . Моноклональнне антитела второй панели более активны и в реакции иммунопреципитации, причем некоторые МКА (14Б5, 13С6, 1В1) явно превосходят по этому показателю поликлональные антитела. Ряд МКА второго набора демонстрируют высокую активность в реакции связывания комплемента, полностью отсутствующую у МКА первой панели. И, наконец, среди МКА первой панели лишь два (2НЗ и 1Н11) дают слабо позитивный ответ в реакции нейтрализации вирусной инфекционности. Во второй панели нейтрализующих МКА также немного (3), но их индекс нейтрализации составляет от 4,5 до 5,6. В первом наборе лишь 2НЗ приближается по своим характеристикам к наиболее активным МКА второй панели. Необходимо отметить и тот факт, что во всех проведенных реакциях наивысшую активность проявляют одни и те же МКА, т.е. их серологические функции как бы сопряжены.

Естественно, пока мы не можем однозначно утверждать, что схема иммунизации мышей - доноров спленоцитов непосредственно определяет репертуар гибридных клеток, секретирующих тот или тип МКА, однако результаты экспериментов показывают, что "короткая" схема иммунизации привела к получению панели МКА с заметным количеством гибридом, синтезирующих 15 м, тогда как при гипериммунизации не удалось отобрать ни одной стабильной гибридной

Таблица 5.

Шифр МКА

класс К„ (М 1)

ИФА

DOT РТГА РН РДДА РСК

2x10S >20480 4.5 128 1024

2x106 0 0 0 0

2x10 80 0 0 32

2^10б 320 0 2 0

Ю5 5120 0 0 128

2X104 80 0 + 0

2x105 1б0 0 2 0

5x105 320 5,4 512 512

2x106 >20480 0 2 0

2x106 5120 5,3 2048 >4096

104 20 0 + 64

2x106 320 0 2 0

105 1280 0 0 0

связ. белке

1В1

4В2

7С2

10С2

11А1

11В6

12В6

13D6

14D2

14D5

15В1

17С1

18А2

5.0x10 2.5x10е 3.0x10® <107 <107 <107 <107 1,2x10® 5х105

2x10 2x10€ 2x10Ê 2x10€ 105 3x10^

<10' 6.0x10 <107 <107

1,3x10'

о5 2x106 ■9 2x106 4x103

2x10° <107 1,3x1О5

Примечания см. таблицу 4

лиши, синтезирующей этот класс иммуноглобулинов.

Получение МКА к неструктурному гликопротеину NS1. Иммунизацию и первую реиммунизацию 8-недельных самок Balb/c проводили как при получении МКА к белку Е в случае гипериммунизации. Остальные реиммунизашш осуществляли на 28, 42 и 52 дни 202 мозговой суспензией инфицированных сосунков мышей. Суспензия предварительно обрабатывалась протамин-сульфатом и пропускалась через 30$ сахарозу. Для гибридизации использовали миеломы Sp2/0- Ag 14 и рз NS-1/1Ag4-1. Гибридомы, секретирупцие МКА к белку NS1 отбирали методом иммуноблотинга, используя в качестве антигена гомогенат клеток RH (почка человека) или СПЭВ (почка эмбриона свиньи), инфицированных вирусом КЭ. В другом случае отбор МКА проводили DOT -блоттингом, используя в качестве антигена очищенный белок NS1. В результате двух гибридизаций была собрана панель МКА к NS1 из 12 гибридомных линий. Иммуноглобулины, секретируемые всеми

гибридомами относились к классу Ig G1 ■ и были пассивны во всех серологических реакциях с полным антигеном вируса КЭ, включая реакцию связывания комплемента. Все отобранные МКА в иммуноблоттинге или DOT- анализе связываются с генно-инженерным аналогом NS1.

_2^1лЗ^_1^уноаффщшая_очистка_Н§;К

Экспериментальная проверка различных клонов МКА к белку NS1 показала, что в большинстве случаев ковалентное связывание МКА с -NBr-Sepharosе приводит к частичной или полной потере антителами способности взаимодействовать с антигеном. Наибольшую активность в иммобилизованном состоянии сохранял клон 4С4; при пришивке на активированную матрицу 6-8 мг иммуноглобулина на I мл геля гшмуносорбент был способен извлекать из вируссодержащей сультуральной среды до 1,5 мг антигена. Десорбцию белка с шиуно сорбента проводили диэтиламином при рН 11.5 что в соответствии с имеющимися в литературе данными приводило к зыделению димерных форм белка с Мг около 96 kDa (рис. 2). Троведение денатурирующего электрофореза в полиакриламидком геле (ПААГ) выявляет существование тандема белковых полос с Мг 46- 48 сДа. Необходимо однако отметить, что полученный препарат белка NS1 зсегда содержал в качестве минорного компонента (по выявлению в 1ФА до 10%) гликопротеин Е. В связи с этим возникла необходимость юполнительной очистки препарата NS1 хроматографией на Е-:пецифичном иммуносорбенте. В результате второй хроматографии юдержание белка Е снижалось до ( 0,2-0,52 по отношению к юнцентрации NS1. Ни электрофорез в, ПААГ, ни иммуноблоттинг не «являют белка Е в подобных количествах. Последующие хроматографии te приводили к дальнейшей очистке препарата NS1.

2.1.4. Выделенние_и__анализ__гетарокомплекса__.структурного__и

не ств^кт^1эных_§е лков.

Двухступенчатая иммуно аффинная хроматография на МКА, специфичных к NS1 и Е, проведенная для выделения неструктурного гликопротеина, позволила идентифицировать белок, контаминиру юций препарат NS1. Профили стандартных хроматограмм, построенных по титрам (точкам конечного разведения, при котором достоверно детектируется антиген), приведены на рис. 1. Как видно из результатов в каждой фракции обеих хроматограмм кроме антигена NS1 выявляется и антигены белка Е, причем если во фракциях первой хроматографии концентрация Е составляет около 10$ от NS1, то фракции хроматографии, проведенной на МКА, специфичных к белку Е (I4D5). концентрации обоих антигенов практически одинаковы. Количественную оценку содержания антигенов можно считать достоверной, поскольку чувствительность ИФМ определения этих

Рис. 1. Профили иммуноаффинных хроматограмм при выделении гетерокомплексов белков Е, N81 и ИЭЗ. а- хроматография проведена на иммуно сорбенте с МКА (4С4) к ЫЭ1 ( -о

о- ); ъ- хроматография проведена на иммуносорбенте с МКА (14В5) к

белку Е ( - • - • -). белков примерно одинакова ( см. раздел 2.2.). Результаты ИФА,

представленные кривыми титрования выделенного белкового препарата

(рис. з), однозначно указывают на наличие антигенов белков Е и

NS1. И, наконец, результаты ПААГ-электрофореза и иммуноблоттинга

подтверждают существование белковых комплексов Е и NSI (рис. 2).

Когда пробы не подвергались обработке 2-меркаптоэтанолом и

кипячению, МКА к NS1 и Е выявляют белки с Мг около 97 и 115 KDa ,

а в условиях денатурирующего электрофореза МКА к NS1 выявляют

белок с М„ ниже 50 kDa, а МКА к Е - белок с М„ около 55 kDa. В тех г г

случаях, когда иммуноаффинная колонка не отмывалась 0,12 дезоксихолатом Na, электрофорез демонстрировал существование в полученном препарате и других белков. Так в условиях нативного электрофореза выявляются полосы с Мг около 200 kDa, а в денатурирующих условиях - белки с Mf около 70 kDa. Эти белки в иммуноблотинге прокрашивается МКА к неструктурному белку NS3 (I8B2 ), а белок с Мг 200 kDa и ИКА к Е. Остается неясной причина, по которой белковый комплекс с Мг 200 kDa не детектируется МКА к NS1, хотя условия иммуноаффинной хроматографии определяют существование последнего. ИФА с использованием МКА к NS3 подтверждают наличие этого белка в выделяемом комплексе. Наконец, анализ исследуемых антигенов в инфицированной мозговой ткани иммуноферментным тированием МКА к Е и NS3 при сенсибилизации фазы иммуноглобулинами, специфичными к NS1, указывает на существование тримера Е- NS1- NS3 в процессах вирусного морфогенза (рис. 2). Поскольку основные этапы созревания вирионов происходят внутри клетки, естественно предположить, что появление структур типа Е-NS1- US3 связано с остатками эндоплазматического ретикулума с интегркрованнымми в него вирусными белками. Достатчно трудно без целевого исследования сделать однозначный вывод о роли тримера Е-NS1- NS3 в вирусном морфогенезе, хотя скорее всего он представляет собой одну из промежуточных форм репликативного комплекса.

КZ>ft ' S!

94

67 — —

11

Рис.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2. ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг аффинно очищенных препаратов NS1 (1,2). E-NS1 (3-6) и E-NS1-NS3 (7-12). Образцы 1, 3, 6-8 , были обработаны 2- меркаптоэтанолом и подвергнуты кипячению перед электрофорезом. Образцы 2, 4, 5, 10-12 не обрабатывались 2-меркаптоэтанолом и кипячением. При иммуноблоттинге образцы анализировались МКА: к NS1 -1-4, 8, 11 (4С4) ; к Е- 5. б, 9, 12 (14D5); к NS3 - 7 и 10 (18В2).

2 3 4 5 6 Ц oS

Рис. 3. Кривые титрования антигенов белкового комплекса.

Твердая фаза сенсибилизирована антителами к NS1; титрование проводили МКА к NS3 (-о - 18В2) и к Е (- • - 2НЗ).

2.1.5. Закжчение.

Изложенные в первом разделе доклада результаты исследований практически определили, дальнейшее направление работы. Разработка методов получения препаративных количеств высокоактивных очищенных препаратов гликопротеинов Е и NS1, создание наборов широкого спектра МКА к этим антигенам, позволил непосредственно перейти к разработке иммуно-аналитических тест-систем и структурно-функциональному анализу антигенной структуры белков.

2.2. Ра32аботка_метддов_шажза_адтигенов__и__направленных__к

ним_антител.

Антигенные свойства вирусов и субвирусных компонентов позволяют широко использовать иммунологическую технику для идентификации антигенных структур, анализа их вариабельности, изменения свойств в результате какой-либо модификации, и, наконец, исследования адекватности природных антигенов их синтетическим или генно-инженерным аналогам. Несмотря на общий принцип построения иммуноаналитической системы, в каждом случае качественные критерии иммуноанализа в большой степени зависят от характера участвующих в ^реакции ииммунореактантов. Не вдаваясь в теоретические основы реакции, отметим лишь, что кинетика взаимодействия антигенов и антител лоодчиняется закону действия масс:

к _

3 UgHAb] '

где [AgAb], [Ag] и [Ab] являются молярными концентрациями комплекса антиген-антитела, несвязанного антигена и несвязанных антител соответственно, а к - константа аффинитета реакции. Нетрудно видеть, что в случае равновесия количество образуемого иммунного комплекса пропорционально концентрации антител, концентрации антигена и константе аффинитета антител. Именно этими

параметрами определяется чувствительность реакции. В случае поликлональных антител определяющим моментом для реакции является концентрация специфичных для конкретного антигена иммуноглобулинов и константа их аффинитета. Использование моноклональных антител, снимая проблему гетерогенности суммарных иммуноглобулинов, предполагает выполнение ряда других требований. Необходимо отметить, что закон действия масс описывает характер реакции антиген- антитело в состоянии равновесия, т.е. когда скорость образования иммунного комплекса равна скорости его диссоциации, но не описывает кинетики процесса достижения равновесного состояния. Если реакция происходит в растворе, равновесие достигается достаточно быстро, поскольку определяющим моментом является лишь константа диффузии макромолекул. Однако, иммобилизация одного из компонентов иммунореактантов на твердую фазу может значительно замедлить достижение равновесного состояния. Т.о. качественные параметры иммуноаналитической тест-системы зависят от целого ряда факторов, носящих сугубо индивидуальный характер. Суммировать критерии селекции моноклональных антител можно в следуюцих положениях:

1. Высокая константа аффинитета (Кс) к антигену, что может позволить детектировать более низкие концентрации антигена и более эффективно вытеснять из иммунных комплексов антитела хозяина (при выявлении антигена в биологических пробах).

2. В зависимости от задачи конкретного исследования МКА должны быть комплементарны либо наиболее множественным, либо уникальным антигенным детерминантам.

3. Мультивалентность как одно из условий, способных повысить чувствительность тест-системы.

4. Способность максимально сохранять иммунокомпетентность при иммобилизации или конъюгировании с маркером.

5. Ростовые качества и продуктивность гибридом, секретирующих необходимые МКА, что определяет перспективы стандартизации тест-системы.

2.2.1. Т§ст-система_для_ета^за_ентител_к_ант .

Для выполнения задач исследования были использованы два варианта твердофазного иммуноанализаа: первый разработан на традиционных принципах 4-слойного ИФА, тогда как второй вариант представляет собой модификации метода, извесного как "DOT-blotttng". Сопоставление компонентов и основных методических приемов этих тест-систем при детекции антител приведены в таблице

6. Обе тест-системы были оптимизированы по важнейшим параметрам:

Таблица 6.

Иммунореактанты и методические приемы иммуноаналитических тест-систем для определения антител к вирусу КЭ.

ИФА DOT

В качестве антигена используется В качестве антигена используется

полиэтиленгликолевый концентрат очищенный белок оболочки вируса

вируссодержащей культуральнои (Е) среды

Антиген фиксируется на поверхно- Антиген фиксируется за счет

сти полистирольных планшетов за сорбции на нитроцеллюлозных

счет сенсибилизации твердой фазы фильтрах специфическим иммуноглобулином

Специфичные к вирусу антитела Специфичные к вирусу антитела

выявляются антииммуноглобулинами, выявляются белком А из St.aureus

меченными пероксидазой хрена меченым пероксидазой хрена

Регистрация результатов прово- регистрация результатов осущест-водится либо визуально, либо вляется визуально по наличию и измереетем_оптической_плотности________татенсивности_пятеи_на_$ильтрах_

времени инкубации, концентрации антигена, величине рабочих объемов реакционных смесей и т.д. Сопоставление специфичности, чувствительности и диагностической значимости проводилось в ходе определения специфических антител к вирусу КЭ в сыворотках крови больных с подтвержденным диагнозом КЭ и доноров, вакцинированных против КЭ. Результаты анализа 182 образцов приведены в таблице 7. Сопоставление результатов анализа показывает уверенное выявление

сывороток, содержащих антитела к вирусу КЭ, обоими методами. Лишь 3 образца (I в ИФА и 2 в^шг-блоттинге) дают позитивный ответ в одной из тест-систем. Что "же касается количественного соответствия тиров антител, то здесь распределение экспериментальных сывороток носит сложный характер. Прежде всего следует отметить тенденцию

Таблица 7.

Распределение образцов сывороток крови по титрам антител к вирусу КЭ, определяемым ИФА и юог-блоттинтом.

вот:количество сывороток с титром 0 0 ___ИФА_ Ю-2 5хЮ"3 Ю-3 сывороток 5x1О"2 _с_титром___ Ю-3 5x10-5 1 м 1 1 О' 1 1 14 1 1

15 0 > I 0 0 0 0 0

Ю-2 2 0 • 13 6 10 0 0 0

5x1О-3 0 0 5 3 40 6 5 0

Ю-3 ; 0 0 0 0 17 6 I 0

5хЮ"4 : о 0 0 0 17 13 4 4

ГО"4 : о 0 0 0 0 2 5 6

ИФА к выявлению специфических антител в более высоких разведениях. Так, если в юг-блоттинге сыворотки имеют титр 1:500, то в ИФА те же сыворотки распределяются между значениями титров от 1:500 до 1:5 хЮ4. Этот факт может свидетельствовать о более высокой чувствительности ИФА, однако неоднозначность распределения может являться следствием той самой многофакторности иммуноферментных тест-систем, о которой упоминалось выше. Достоверность тест-систем проверялась и другими методами: радиоиммуноанализом (РИА), активностью исследуемых образцов в реакции торможения гемагглютинаци (РТГА), нейтрализации вирусной инфекционности(РН). Коэффициент корреляции между твердофазными иммуноаналитическими тест-системами составил 0,9 ^ 0,06, в то время как анализ тех же образцов в традиционной реакции торможения гемагглютинации дал значительно более низкий результат (г = 0,53 - 0,02). Хорошая корреляция (г около 0,9) между иммуноферментным анализом и

нейтрализационным тестом начинается лишь при достаточно высоких титрах (> 640). Т.о. представленные здесь результаты дают основания для вывода о возможности применения разработанных тест-систем для выявления специфических к вирусу КЭ антител не только в исследовательских . но и в диагностических целях.

Введение в тест-систему МКА, к сожалению, не повысило ее чувствительность ни в случае использования МКА в качестве сенсибилизирующей подложки, ни в качестве компонента индикаторной системы.

2,2.2. Разработка_иш^ноферментных_методдв__определения

§нтигенов_вируса_КЭ.

Принципиальные схемы детекции антигенов вируса КЭ (гликопротеинов Е и NS1 ) на рис. 4. Отбор МКА для конструирования тест-систем проводили согласно принципам, изложенным ранее. В соответствии с этими критериями для детекции белка Е мы отобрали три клона (2H3-lg M, 4А6 и 5G10-Ig Gj), имеющие высокие константы связывания. В ходе работы были проверены два альтернативных варианта тест-систем. В основу первого варианта был положен иммуноме трич е ский принцип, при котором происходит прямое определение антигена, благодаря связыванию фермент-меченых антител со свободными антигенными сайтами белка (вириона), предварительно фиксированного на сенсибилизированной антителами твердой фазе. Во .втором варианте анализа (непрямом) выявление антител, связывавшихся с фиксированным антигеном осуществляли либо с помощью авидин-биотиновой системы, либо белка А из st. aureus.

Как показало специальное исследование, лучшими сорбционными характеристиками обладают суммарный иммуноглобулин и МКА 2НЗ, и именно в этих случаях наблюдалось наиболее оптимальное соотношение сигнала и фона. Оптимизация тест-системы проводилась и по типу индикаторной метки, где на конечной стадии выявления антигена

Рис. 4. Схема вариантов иммуноферментного анализа антигена вируса

клещевого энцефалита.

Рис. 5. Калибровочные кривые для Рис. 6. Корреляция между тест-определения антигена вируса КЭ, системами для определения

полученные при сенсибилизации антигекна вируса КЭ с

твердой фазы различными антителами. поликлональными и МК

антителами.

происходило с помощью: I) антител к белку Е, непосредственно конъюгированных с пероксидазой; 2) авидин-биотиновой системы; 3) белка А из St. aureus.

Чувствительность выявления антигена в тест-системах определялась по стандартному раствору очищенного белка Е, где концентрация белка в исходном растворе определялась предварительно. Предельно низкую концентрацию оценивали по максимальному разведению этого раствора, при котором еще выявлялись пятна в шг-блоттинге, либо значение оптической плотности в ИФА составляло не менее 0,1. На рис. 5 приведены кривые титрования стандартного раствора белка Е в ряде проверенных в ходе работы систем. Как видно из этих данных, чувствительность ИФА составляет около 1,5 нг/мл или 75 пг/пробе, причем использование МКА не дает заметного выигрыша в чувствительности. Иная картина наблюдалась в DOT-блоттинге. Наиболее высокочувствительной оказалась тест-система, где сенсибилизация проводилась МКА 2НЗ. а выявление антигена осуществлялось поликлональными антителами в сочетании с авидин-биотиновой системой или белком А (рис.4, варианты Д и Е). Предел определения антигена в этих тест-системах - 1,5 - 4,0 нг/мл. Более низкая чувствительность (12-15 нг/мл) была получена в иммунометрических системах, в том числе и двух центровой (рис. 4, варианты В и С), где МКА взаимодействуют с различными антигенными сайтами белка. Самую низкую чувствительность (около 20 нг/мл) имел вариант, полностью построенный на поликлональных антителах, хотя уровень корреляции мевду этой тест-системой и наиболее чувствительными вариантами был достаточно высоким (г= 0,93). Сопоставление модельных тест-систем проводили при определении антигена вируса КЭ в вируссодержащей культуральной жидкости, мозговой суспензии инфицированных животных, препаратах антивирусной вакцины, образцах

очищенного препарата вируса КЭ и, наконец, гликопротеина Е. (рис.

Оценка возмокности практического применения предлагаемых тест-систем была дана в серии экспериментов по выявлению антигена вируса КЭ в пулах клещей Ixoüea peraulkatus, собранных в природных условиях. Для проведение анализа был выбран наиболее чувствительный вариант (Е) тест-системы. В качестве референтных методов в работе были выбраны метод точечной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК), где положительными считались образцы с интенсивностью сигнала равной или превыш авдей сигнал стандарта 10 пг РНК вируса КЭ, и биологический тест по выявлению инфекционного вириона на культурах клеток линии ФЭК и белых мышах in vivo. Всего было исследовано 184 пула по 10 клещей. Прямая инокуляция первичных клещевых суспензий в мозг выявила 33 положительных пробы (биопроба I), а инокуляции культуральной среды после накопления вируса в клеточной культуре увеличило число позитивных проб до 42 (биопроба 2), т.е. эффективность выявления инфекционного материала биопробы I по отношению к биопробе 2 составила 78,5% (69,8-88,4). Результаты исследований сведены в таблицу 8. Как следует из приведенных данных, эффективности иммуноферментного определения антигена вируса КЭ и выявления вирусной РНК МГНК практически совпадают между собой. Следует отметить, что в ряде случаев и МГНК, и DOT-блоттинг выявляют наличие в пробах , вирусного материала, не подтверждаемое однако биопробой. Количество таких проб сравнительно невелико (3,2$ для DOT и 6,5$- для МГНК от общего количества обследованных пулов); при этом следует подчеркнуть, что этими методами выявляется либо вирусная РНК, либо поверхностный антиген вириона, тогда как биопроба способна определять только инфекционный вирус. С другой стороны, позитивные пробы в вот и в МГНК не перекрываются между собой.

Таблица 8.

Выявление вируса КЭ в клещах Ixodes persuloatua методами DOT- блоттинга, гибридизации нуклеиновых кислот и биопробы.

МГНК биопроба DOT- блоттинг

наличие РНК кол-во проб % (вирулентность ) наличие кол-во % антигена проб

+ 30 16,3 11,6-22,4 ; + 4 28 15,2 10,7-21

— 130 70,7 63,6-76,8 — — 136 73,& 67,0-79

+ 12 6,5 3,7-П, I - + 6 3,2 1,5-6

- 12 6.5 3,7-11,1 + - 14 7,6 4,5-1-'

Сопоставление методов DOT-блоттинга и МГНК при выявлении вирусного материала с методом биологической пробы показало, что эффективность DOT- блоттинга по отношению к биопробе I составила -84,8$ (68,7-88,4), а к биопробе 2 - 66,7% (51,3-79,2), тогда как эффективность МГНК составила соответственно - 90,9$ (76,1-96,9) и 71,4$ (56,1-83,0), что указывает на практически равные возможности обоих методов.

По аналогии с анализом антигена белка Е был разработан и метод определения антигена неструктурного гликопротеина NS1. Сенсибилизацию твердой фазы в этом случае проводили иммуноглобулинами, выделенными из антисыворотки, полученной к генно-инженерному аналогу NS1, а выявляли антиген МКА к природному белку. Чувствительность анализа составляла 1,5-2 нг/мл.

2.2.3. Заключение.

В результате данного этапа работы были созданы несколько вариантов иммуноаналитических тест-систем для индикации структурного и неструктурного гликопротеинов (Е и NS1 ), а также специфических к этим антигенам антител. Наиболее высокая

чувствительность при выявлении антигенов была получена в тест-системах, компонентам* которых являлись моноклональные антитела, и составила 1,5-2 нг/мл. Метода определения белка Е и специфичных к нему антител нашли практическое применение в организациях здравоохранения Новосибирского научного центра.

2.3. ^тигенже_характеристж 2.3.1. И^Х32логические_характеристжи_бежа_Е^ Прямой конкурентный радиоиммуноанализ показал практически полное сохранение белком Е антигенной активности, характерной для ингактных вирионов. В процессе очистки сохраняются также преципитирупцие и гемагглютинируюцие свойства белка (таблица I), при этом активность изолированного белка не уступает в титрах антигену цельных вирионов, реагируя не только с гомологичной антисывороткой, но и с антисыворотками к вирусам Омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), Шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), Негиши, Лангата и Киассанурской лесной болезни (КЛБ), являющихся представителями антигенного комплекса КЭ. При этом во всех случаях отмечались значительные величины титров (640-1280-для РПГА и 32-128 - для РДПА). Аналогичные результаты, но уже свидетельствующие об иммуногенной активности гликопротеина Е, были получены при анализе антисывороток к белку Е (анти-Е) и цельному вириону (анти-ВКЭ). Эти антисыворотки содержали в высоких титрах не только гомологичные (к белку Е вируса КЭ), но и гетерологичные (группоспецифические) антитела к другим вирусам антигенного комплекса. В таблице 9 приведены результаты определения с помощью РПГА и РДПА и реакции нейтрализации (РН) титров антител в двух кроличьих и мышинной сыворотках, полученных после иммунизации гликопрот.еинами Е, выделенными из штаммов Софыш или Минск-256. Кроличьи антисыворотки обоих типов имели практически одинаковые.

Таблица 9.

Титры антител к вирусу КЭ в сыворотках животных, иммунизированных

гликопротеином Е.

сыворотка _____™тры_*сщюроток____ индекс нейтрали_____________________РПГА__________РДПА_________зации(^_Б0Е/0Лмл)

Анти-Е-Соф (крол) 275 24 4,4

Анти-Е-256 (крол) 260 24 4,1

Анти-Е-Соф (мышь) 64 8 3,4

*- обратные титры

а мышиная -более низкие, но тем не менее легко выявляемые титры.

Способность изолированного гликопротеина вызывать полноценный иммунитет к заражению у вакцинированных мышей видна из следующих данных- иммунизация мышей белком Е (5-7 мкг в прививочной дозе) вызывала их защиту при заражении живым вирусом КЭ в пределах 100 и 300 минимальных летальных доз (M§q) ■ 2.3.2. Щм^ологические_и_антигеж

Хотя протективную активность противовирусных антител обычно связывают со структурными компонентами вириона (что и было подтверждено вышеизложенным материалом), в последнее время появились данные о протективных свойствах белка NS1, полученных в экспериментах с вирусами Желтой лихорадки и Денге. Развитие технологий клонирования рекомбинантных ДНК и получения препаративных количеств генно-инженерного аналога NS1 (a-NSI), и выделение нативного белка из тканей инфицированных животных (раздел 2.1.3) позволили исследовать и сопоставить антигенные и иммунологические свойства этих белков.

Аналог NS1 был получен экспрессией соответствующего гена в клетках E.coli в виде гибридного полипептида Э-галактозидаза- NS1 или свободного полипептида. Гибридный полипротеин (Мг -160 kDa) эксгтрессировали трансляцией бицисгрона с неполным геном ß-галактозидазы в качестве первого цистрона. Свободный полипептид

(Мг -39 кОа) был получен трансляцией гомополицистрона с сопряженной системой трансляции всех генов.

В соответствии с данными о структуре генома вируса КЗ мг ЫЭ1 составляет около 39 кКа, тогда как реальный мр природного белка составляет 46-48 Ы5а. Разница в мр легко объясняется наличием в природном белке гликозильных цепей. Оба типа а-ЫЭ1 находились в мономерной форме, что возможно повлияло на иммуногенность свободного а-ЫЭ1. Наконец отсутствие углеводных цепей также может влиять на иммуногенные свойства полипептида, хотя дегликозилирование структурного гликопротеина не приводит к заметным изменениям свойств последнего (Си1гакЬоо et а1., 1989).

Гипериммунные антисыворотки к природному (Н-Ы31) и а-МБ1 были проанализированы в тех же серологических реакциях, что и белок Е. Результаты этих исследований представлены в таблице 10. Наиболее высокий уровень комллемент-фиксирупцей активности антисыворотк к а-Ы31 связан с антигеном р-галактозидазы, являющимся составной частью химерного полипептида. Собственно сам антиген а-ЫЭ1 (в реакциях использовалась свободная форма полипептида) проявляется в РСК значительно слабее, не взаимодействуя причем с антисыворотками к природному антигену. Этот антиген не способен фиксировать комплемент и при взаимодействии с антисыворотками, полученными к полному вирусному антигену. В то же время н-Ш1 активен в этой реакции как с собственными, так и гетерологичными антисыворотками. Аналогичный вывод можно сделать из результатов, полученных в реакции преципитации, когда антисыворотки к а-ЫЭ1 дают положительный ответ с природным антигеном, а аналог белка преципитатов с гетерологичными антисыворотками не формирует. Как и следовало ожидать антисыворотки к а-ЫБ1 не ингибируют гемагглютинацию; а слабый положительный ответ при ингибировании гемагглютинации с н-ЫЭ1 (обратные титры от 10 до 160),по-видимому,

Таблица 10.

Активность антисывороток к белку п-МЭ1 и его генно-инженерному аналогу в серологических реакциях.

реакция РСК РДПА РН

антигены: антигены

___Но_крол^ _£-гал. __Е___ Э-гал: __П:

Ю 128 16 16 0 + + - - 0

11 256 16 16 0 + + - - 0

12 256 64 16 0 + + + - 0

13 256 64 64 0 + + + - 0

652 64 64 64 0 + - + - 0

653 64 32 16 0 4 - - - 0

I 654 0 0 0 0 -- - - - - 0

666 32 0 0 0 + - - - 0

667 16 0 0 0 + - - - 0

668 16 0 0 0 + - - - 0

681 512 512 32 0 + + + - 1 ,5

682 512 32 0 0 + + - - 0

15 0 0 64 16 - - + - 2,0

17 0 0 32 16 - - + + 2,0

18 0 0 8 8 - - - 0

II 655 0 0 32 64 - - + + 3,5

656 0 0 64 32 - - + + 3,5

662 0 0 32 16 - - + - 3,5

3877 0 0 16 16 - - + + 2,5

675 0 0 0 32 - - - + 4,0

1АР 0 0 16 32 - - + - 4,5

. Примечания: I- иммунизация а-ЫБ! ; II- иммунизация н-ЫБ1; 3877-иммунизация полным антигеном; 675- иммунизация белком Е; ИАЖ- иммуноасцитная жидкость мышей, иммунизирован полным вирусным антигеном.

Данные представлены:РСК и РДПА -обратные титры, РН- индекс нейтрализации.

следует отнести к антителам, образованным к минорному компоненту, т.е. белку Е.

Несколько сложнее обстоит дело с нейтрализующей активностью

исследуемых антисывороток. Из всех полученных образцов антисывороток к а-ыэ1 лишь одна дает слабоположительный ответ на

Таблица II

Титрование антисывороток к а-НБ1 и н-ыв1 в ИФА. (обратные титры)

антигены No крол. р-гал. a-NS1 n-MS1 Е

Ю 2,6-Ю6 10,5-Ю6 1.6-Ю6 Ю3

11 2,6 • 10^ 10,5-Ю6 1,6-Ю6 Ю3

13 10,5-Ю6 10,5-10б 6,5 -Ю5 4 -103

652 4-10 4 6,5-Ю5 1 ,6 -10 5 4 -Ю3

653 4-Ю4 6,5-Ю5 4-Ю4 4 -103

654 104 1,6-Ю5 4-Ю4 2,5-Ю2

666 1 ,6-Ю5 6,5-Ю5 2,5 Ю3 0

667 1 ,6 -105 1,6-Ю5 2,5 -Ю3 0

663 1 ,6-1 о5 6,5 'Ю5 104 2,5-Ю2

681 2,6-Ю6 2.6.106 1,6-Ю5 1,6-Ю3

_____682___ „§-5_iq5_____ _______4И04__ _____4-Ю2

15 0 1,2-Ю5 б,4■1О5 " "1,6-Ю5 '

17 0 6-105 6-Ю5 1,5•105

■ j 18 0 3-Ю4 1.5-Ю5 3-Ю4

655 0 Ю3 1,6-Ю5 1 ,6 -Ю5

656 0 7,5-Ю3 6,4 1Ю5 1,5-Ю5

662 0 3-Ю4 1,5'Ю5 1,5-Ю5

675 0 0 Ю2 4 .Ю4

Примечания см. к таблице 10.

грани достоверности (крол. 681). В то же время антисыворотки к H-NS1 практически все нейтрализует вирусную инфекционность, однако относится ли этот эффект к антигену NS1 или к антигену белка Е, сказать пока трудно. Ни H-NS1, ни a-NSi не проявили протективных свойств в условиях эксперимента .аналогичных для белка Е. Трехкратная иммунизация мышей a-NSi и н -NS1 (5-8 мкг в дозе ) не предотвращала заболевания и гибели животных, инфицированных по крайней мере 100 минимальными летальными дозами.

i

Иммуноферментное титрование антисывороток выявляет перекрест в связывании всех антигенов (таблица II). Лишь р-галактозидаза не дает реакции с антисыворотками к H-NS1 и a-NSi. Тем не менее тенденция к количественным различиям между н-MSl и a-NSi прослеживается при гетерологичных титрованиях, т.е. каждый из антигенов дает более высокий уровень связывания с гомологичной сывороткой. Несколько странно выглядит связывание белка Е с антисывороткой анти-а NS1, т.е. можно было бы предположить контаминацию бежа Е белком NS1. Однако, ИФА с МКА к белку MS1 не выявляет антигенов последнего в препаратах белка Е.

Проблема адекватности природных, генно-инженерных и синтетических антигенов в практическом аспекте связана прежде всего с созданием искусственных вакцин. К сожалению, все попытки экслресии в клетках Е. coli индивидуального гена белка Е на основе фрагментов вирусной РНК к успеху не привели, что скорее всего обусловлено токсичностью белка для бактериальной клетки. Практически таже ситуация сложилась и для синтетических пептидных аналогов белка Е: антисыворотки к этим пептидам были пассивными в серологических реакциях.

Анализ результатов сопоставления биологических свойств a-NSi и H-NS1 показал, что адекватность этих полипептидов не является полной. И в РСК, и в иммунопреципитации антисыворотки, полученные к этим белкам работают с H-NS1, тогда как a-NSi не способен взаимодействовать с антисывороткой к H-NS1. Очевидно, что некоторые антигенные структуры нагивного белка способны с большей мобильностью подстраиваться под паратопы антител к a-NSi, тогда как в обратном случае антигены a-NSi не комплементарны антителам к

H-NS1.

К сожалению, даже двухступенчатая иммунохроматография, где применялись сорбенты, специфичные к двум различным белкам, не

позволила получить препарат NS1, полностьи свободный от белка Е. Данные о контаминации препаратов NS1 белком Е были приведены в соответствующем разделе этого доклада. И хотя содержание белка Е в препаратах NS1 весьма незначительно, что косвенно подтверждается отрицательными результатами в экспериментах по выявлению протективных свойств NS1, при гипериммунизации антисыворотки к этому белку содержат нейтрализующие антитела и активны в иммуноферментном титровании белка Е. Если» учесть, что и протективная активность, и индукция нейтрализующих антител проявляются проявляются при иммунизации значительно более высокими дозами бежа Е, то резонно отнести развитие нейтрализующей активности антисывороток к H-NS1 за счет синергического иммуного ответа на Е и NS1 (или гетеродимера E-NS1), что вполне согласуется и с результатами иммуноферментного титрования.

2.4. _Локализ §шя_антигещых_детер(;^ант_на_структ

Анализ иммунологических свойств белков Е и NS1 подтвердил ведущее полокение структурного гликопротеина в индуцировании нейтрализующих антител и способности вызывать полноценный иммунитет у вакцинированных животных. Это обстоятельство определило ход дальнейшего исследования в направлении детального изучения локализации антигенных структур на белке Е. С этой целью было проведено эпитопное картирование белка МКА, фрагментирование CNBr с последующей оценкой иммунологических характеристик, полученных пептидов, и привязка функциональных свойств белка к определенным антигенным детерминантам.

2.4.1. Топологическое_картирование_эпит

Для картирования структуры белка из двух панелей были отбраны МКА, удовлетворяющие требованиям реципрокного блокирующего анализа, в ходе которого изучалась способность каждого из МКА связывать антиген в присутствии другого (конкурирующего) МКА.

Необходимо помнить, что "блокирующие" эффекты могут быть вызваны различными механизмами: стерическими затруднениями при связывании антител с идентичными или близко расположенными эпитопами; связывание одного из антител может аллостерически изменять другой антигенный сайт, вызывая тем самым ингибирование или усиление связывание антител, комплементарных другому сайту; вариации аффинитета антител также могут вносить заметный вклад в результаты анализа. По результатам конкурентного связывания с антигеном вируса КЭ (штамм Софьин) эпитопы белка разделяются на больших домена (таблица 12). В один из них (EI) входит 7 эпитопов, но сюда же следует отнести и сайты связывания МКА 5F6, ЭВ7, 5С5, 4F7, 5Н9, практически полностью блокирующих, т.е. выявляющих одни и те же сайты, МКА 4А6 и 1Н11. Второй домен (Е2) содержит 9 эпитопов, которые можно объединить в три поддомена: 2НЗ -1В1; 1В1- 18а2 и 18А2 -14D2, - последовательно перекрывающихся через эпитопы 1В1 и 18А2. Большшинство МКА домена Е2 однонаправленно блокируют связывание МКА домена EI. В таблице не представлен домен ЕЗ, выявляемый МКА 5G10 и 2D1 и неперекрывающийся ни с одним из основных доменов, Кроме того, имеются еще 2 независимых эпитопа (11В6 и 17С1), также не входящих ни в один из доменов (в таблице 12 не представлены). Эпитопная карта белка Е вируса КЭ (штамм Минск-256) в основном совпадает с диспозицией эпитопов антигена • вируса штамма Софьин (таблица 13), однако наблюдается перекрывание доменов EI и Е2 через сайты, выявляемые МКА 2НЗ и 13D6, и "перестановки" эпитопов 1А2 и 1Н11, 14D5 и 13D6 внутри доменов. Подобные эпитопные "перестановки" наблюдались при сопоставлении антигенных структур штаммов вируса Желтой лихорадки(17D и Asibi) Cammack: and Gold, 1986. Более драматические изменения наблюдались при картировании антигена вируса КЛБ (таблица 14). В этом случае эпитопы для МКА 2НЗ и 1Е11 оказались вне доменов, не перекрываясь

33

Таблица 12.

Эпитогшая карта вируса TBE штамм Софьин (результаты конкурентного связывания МКА против белка Е TBE штамм Софьин).

конкурирующие МКА

сорбирован. МКА LJJ CvJ GQ ^ СМ U ^ Ol О; -СО ■О СО X СМ 'О - 1 ЧО С) ю 1 " 1 са - VD CQ ос О О >"Г

1ЕП + + + 444 44 4

4в&" +44 44+ 444 444 + 4 44 44 44 444 444 +++ 4

7С2 4+ 44+ +44 + +4 4 44 4+ 44 44 44 +++ 4

4А6 444 +44 444 444 +4 ++ 4+ 44 44 4+ 4+

1А2 444 444 44 44 44 + 4+ ++ 44 44 44 444 44 +++ 44+

1Н11 444 +44 +44 +4+ ++ 444 444 444 444 4+4 +4 44 +4 4+

15В1 + +44 +44 444 44 +44 ++ +44 4++ 4+4 44 444 44+

2НЗ + +44 44 ++ +

14D5 ++ +++ ++ +

13D6 44+ +++ 44+ 4

1В1 ++ 444 +++ 444 +4 44 ++

11D1 4 44 ++ ++ 444 444 44+

12В6 44 + 44 +++ 44+ 444

18А2 4+ ++ 44 ++ 4++ 4++

10С2 44 + ++ ++^

14D2 ++ 44-t

+ - 30-50$ блокирования, ++ - 50-75$ блокирования, +++ - 75-100$ блокирования; рамкой обведены группы конкурирующих МКА.

при этом ни с одним из эпитопов. Кроме того, число эпитопных

перестановок оказывается значительно больше, чем в предыдущем

случае. Естественно, что в основе столь радикальных различий

эпитопных карт могут лежать альтерации белковой структуры на всех

уровнях молекулярной организации макромолекулы.

2.4.2. Структ£рно-фу|жцидналь1^_а^ .

Бромциан (СМВг) расщепляет белки по остаткам метионина. Судя по данным гель-электрофореза (рис.7), при расщеплении восстановленного белка образуются фрагменты , имеющие молекулярные

Таблица

Эпитопная карта вируса КЭ штамм Минск-256 (результаты конкуренте связывания МКА против белка Е вируса КЭ штамм Софьин).

■ I конкурирующие МКА

|сорби-|рован. | МКА - Щ •ч СО ^ С? IV. V, - 2 - - 1 1 ГО . 1 СЧ| 1-П Л 2' 1 1 21 -1 « - ^ 1<М Г с^ 1

| 1Е11 44+ 444 44+ + 4 44 ++1

I 4В2 4++ 444 444 44 + 4 + ++ + 4 444 4 4

17С2 444 444 444 + 4 444 ++ ++ 4+4 4 4

| 4Аб 4+4 +44 444 4++ 44+| + 4 + + 4++ 4 4

| 1Н11 444 +44 4+ 444 +4+ 444 + + + +++ 44+ 444 ++ ++ 44

| 1А2 444 +44 44 + 4+ 4+4 + 4+ +44 +++| ++ +++

115В1 444 444 44 44 +4 4+ 444 + + 44+ +++ ++ + +44 +4

|2НЗ 44 +4 4+ +4 +4 4 444| +++ + + 1

11306 ++ 444 44+ ++ +++ ++ 4+41 +44| +++ +4+| ++1 + 44

11405 1 ++1 ++ +++1 + 1 44

|1В1 1 + + +-Ч +++1 ++ ++ ++ + +

| 1 1151 4 ++ ++1 ++ +++ ++ 444

| 12В6 +4 +4 44+ ++ ++ ++ + 444 44 +44 +++1+++ ++ +++ 444 444 -

| 18А2 ++ ++1 ++ ++ ++ 4++|+++ -

110С2 + + ++ +++ ->-

I 1402 4 + ++ +++ -

См. примечания к табл. 12

массы 14,5; 10,0; 8,5; 6,0; 4,0 и 3,0 кйа, причем фрагмент с Мг 10,0 кОа слабо окрашивается кумасси, и удается надежно обнаружить .лишь путем денситомэтрирования гелей. Более сложный вид имеют электрофореграммы смеси, образующейся при обработке бромцианом невосстановленнного белка. В этом случае образуется ряд дополнительных фрагментов, представляющих собой, по-видимому, продукты неполного расщепления белка. Наличие углеводной цепи дает возможность использования специфической реакции с коканавалином А (Соп А) для локализации углеводсодержащей пептидов в первичной структуре белка. Из представленных на рис. 8 результатов видно,

35

Таблица :

Эпитолная карта вируса КЛБ (результаты конкурентного связывай МКА против бежа Е вируса КЭ штамма Софьин).

конкурирующие МКА

1 сорбиро-| ванные | МКА а' VO СО lO I s - val £ I cj col «J o 3¡ -1 íl ^ csl O

I5G10 +++ + +++ + 44

112В6 4++ ++ 4441 444

i 14D5 ++ +++ 444, ++I 4 4 +44

11В1 ++ 4+ +++I+++I ++ ++ ++I 444

113D6 + ++|+++ 444 +++| +++ ++ ++I 4 4 4 44

| 4В2 4+ + 444 +++ +++ ++ 4441 4 4 44

|7С2 4+ 44+ ++4 ++ ++I +++ ++I 4 4 ++ 44

| 1А2 +++ +++ 444 ++4 +++ 444 ++ 4441 44 444 4+4 444

14А6 + +44 +++ +++ 4++ +++! +++ +4 +44 444 4+ 444

I1H11 + ++ +++ ++ +++ +++| + + 4 444 ++I 44

115В1 ++ +4+ +++ ++ +44 ++I ++ 44 44 4+4 44+ 444

110С2 44+ 444

114D2 444 444

См. примечания к таблице 12.

что с Con А. взаимодействует единственный продукт полного расщепления белка Е- пептид с мр 14,5 Юа (дорожка I на рис 7). Этот вывод подтверждается данными о кинетике накопления этого гликопептида при инкубации белка Е с С№г; при расщеплении невосстановленного , а также на ранних сроках инкубации восстановленного белка (рис. 9) образуются дополнительные пептиды, являющиеся очевидно предшественниками фрагмента с мг 14,5 kDa. Известно, что аминокислотная последовательность бежа Е, выведенная на основании первичной структуры соответствующего гена, содержит три потенциальных сайта гликозилирования (Pietnev et al, 1990), расположенных в различных CNBr- пептидах: сайт Asn-Glu-Thi находится в 3-м от ы- конца пептиде (координаты 78-176), сайть Asn-Pro-Thr -в 10-м и 12-м (координаты 359-374 и 371-375). Приведенные данные позволяют однозначно локализовать гликопептщ

36

Ноя.вес

XI0-3,

маркеры

Ыол.вес Х1(Г3

67 —

43,5-

-53

W

lili м-.-

I 2 8 е5 м XI0-3

Н -в

-25 -20

•• -14,5

20 -

14,412 ~

3,5-

I —14,5 -10

_ ^-8,5

Ьч, -б #_3

Рис.8. Взаимодействие CNBr-фрагментов белка Е вируса КЭ с Con А.

«•i И'

Рис. 7. Электрофореграмма белка Е и его CNBr-фрагменгов в градиентном ПААГ-SDS,

Рис.9. Иммуноблот CNBr-фрагментов с МКА.

(ГП-14,5) на линейной карте белка Б как 3-й от N-конда. Наличием углеводной цепи можно объяснить различие в значениях молекулярных масс между пептидом, выявляемом экспериментально, и вычисленным на основании аминокислотной ' последовательности. Два других потенциальных гликопептида не выявляются в данных, по крайней мере, условиях эксперимента, несмотря на использование геля с высокой степенью сшивки. Скорее всего эти потенциальные сайты гликозилирования остаются нереализованными, либо углеводные цепи этих гликопептидов не содержат остатков, способных взаимодействовать с Con А, что крайне маловероятно.

Результаты взаимодействия MFCA с бромциановыми фрагментами белка Е (рис.9 ) в условиях иммуноблоттинга показали, что основным иммунокомпетентным фрагментом является ГП-14,5. Он сохраняет способность связывать МКА 4А6, 5F6, 5Н9, 3B7, 7С2 и др. Присутствие ряда эпитопов в этом регионе не противоречит теоретическим предсказаниям, основанным на анализе гидрофильности (Novak and Wengler, 1987) первичной структуры белка Е, согласно которым некоторые антигенные детерминанты могут быть локализованы в N- концевом участке . Из других CNBr- фрагментов кроме ГП-14,5, лишь I и 2 N-концевые пептиды (4 kDa) сохраняют способность связывать некоторые МКА (1Е11, 42, 1А2 и 4А7).

Выделив индивидуальные CNBr- фрагменты, мы попытались определить функциональную значимость каждого из пептидов, проанализировав активность полученных к ним антисывороток. Подобный анализ был проведен и для препаратов денатурированной и алкилированной форм белка. Антисыворотки к большинству снвг-фрагментам белка Е, а также к его денатурированной и карбоксиметилированной формам, связывают нативный белок, но их титры на 3-4 порядка ниже, чем у антисывороток к нативной форме, что свидетельствует о потере антигенами иммуногенности при

денатурации, восстановлении и фрагментировании интактной структуры. Функциональное тестирование показало полное отсутствие серологической активности у антисывороток к восстановленному белку, индивидуальным смвг- фрагментам и смеси этих фрагментов.

Анализ антисывороток в иммуноблоттинге выявил довольно высокий уровень их специфичности. Антитела к фрагментам с б и 8 Ы>а связываются только с собственными антигенами. Антитела к фрагментам с мг 3-4 кОа с большей эффективностью взаимодействуют с фрагментами 8 и 22 кОа, что указывает на ход расщепления белка при обработке СНБг. Антисыворотки к фрагментам 14,5 и 10 №а перекрестно реагируют с соответствующими фрагментами , что может служить указанием на существование дегликозилированной формы ГП-14,5, т.е. мы имее дело с суперпозицией двух пептидов: дегликозилированной формы ГП-14,5 и пептида с координатами 375-471. В дальнейшем конкурентный анализ между МКА и соответствующими антисыворопс ами подтвердил наличие в данной электрофоретической зоне двух независимых пептидов с одинаковыми молекулярными массами. Антисыворотка к нему взаимодействует и с фрагментами большей молекулярной массы, являющимися предшественниками гликопептида, что подтверждается перекрестной реактивностью антисывороток к соответствующим фрагментам и наличием углеводной цепи. Фрагмент 22 Ы)а, возможно, представляет собой полипептид из соседних снвг- фрагментов (например, 1+2+3 или ¡3+4), учитывая, что сывг- расщепление затруднено по 1-му и 2-му остаткам метионина, а фрагмент 8 кЛа может быть суперпозицией продуктов полного (4 пептид) и неполного (пептиды I и 2) расщепления. Хотя антисыворотки к фрагментам белка Е и содержат моноспецифические антитела, они пассивны в функциональном отношении, так как расщепление затруднено по 1-му и 2-му остаткам метионина, а фрагмент 8 кВа может быть суперпозицией продуктов

39

Таблица 15.

Иммунохимиче ские и серологические характеристики ' антисквороток к денатурированному, восстановленному и карбоксиметилированному белку Е и его стг-фрагментам.

Антиген для иммунизации

Номер СНВг-пелтмда на линейной карте белка Е (рис. )

' сыворотки крысы

Титры (обратные Индекс

разведения) ыт, —1- РГО

RIA EL ISA HI

сыворотки МЫШИ

Титры (обратные I разведения)

RIA ELISA HI

0,1мл

Е** IO5 IO5 1280 3,5 IO6 IO6 2560

Е*** D 2560 80 <1

640 <10 <1

СМ

CNBr-фраг-

менты Е:

(22 kDa) 1+2+3, 3+4 1600 640 <10 <1 3200 320 <10

(14,5 kDa) 3 1600 320 <10 <1 4000 160 <10

(10 kDa) II 400 80 <10 <1 1600 80 <10

(8,5 kDa) 4, 1+2 200 40 <10 <1 400 80 <10

(6 kDa) 5 200 0 <10 <1 400 80 <10

(3-4 kDa) 1,2,7,8 200 0 <10 <1 800 80 <10

Смесь CNBr-

фрагментов 400 320 <10 <1 320 <10

Примечания: * - средние значения двух экспериментальных серий;

** - нативный белок Е ("розетки");*** - денатурированный (мочев! хлоридом гуанидиния) белок Е; **** - восстановленный и

карбоксиметилированный белок Е.

полного (4 пептид) и неполного (пептиды I и 2) расщепления. Хок антисыворотки к фрагментам белка Е и содержат моноспецифическш антитела, они пассивны в функциональном отношении, как практичесю пассивны' и антисыворотки к денатурированным формам белка. Т.е. скорее всего денатурация, восстановление

<.

Таблица 16.

Структурно-функциональные характеристики и локализация антигенных детерминант белка Е TBE штамм Софьин.

Денатурация Восста- Взаимодействие

МА Класс Домен новление с CNBr-фраг-

Ig SDS мочеви- & карбок- ментами (АО

на+гуа- симетили- остатки)

НИДИН-HCl рование

I 2 3 4

I EI I М +- + + I—41; 42-77

4В2 G + + + I—41; 42-77

+78-176

7С2 G + + + 78-176

4А6 G + + - 78-176

5F6 G + + - 78-176

5С5 G EI + + - 78-176

ЗВ7 M + + - 78-176

5Н9 G + + - 78-176

4F7 M -+ + + I-4I; 42-77

IA2 G +- - - I—41; 42-77

IHII G - - - -

I5BI G - - - -

2НЗ M - - -

I4D5 G + + + 375-471 *

I3D6 G - + - -

IBI G + + - -

IIDI G E2 + - - -

I2B6 G + + + 78-176

I8A2 G - - - -

I0C2 G + +- +- 78-176

I4D2 G + + + 78-176

5GIO G - - - -

2DI G E3 - - - -

I7CI G + + + 375-471*

IIB6 G + + 78-176

фрагментирование белка приводят к значительному измунению антигенных детерминант.

Другая попытка выявить общие эпитопы нативного белка и его CNBr- фрагментов заключалась в изучении способности конкуренции между иммуноглобулинами антисывороток к цельному вирусу, CNBr-фрагментам и МКА к белку Е. Отобранные для этих экспериментов МКА имели различную функциональную активность и связывались с неперекрывающимися эпитопами антигена (раздел 2.4.1). Конкуренция (около 50$) наблюдалась между Ig G к CNBr- фрагментам 10 и 3-4 kDa и МКА I7CI и'14D5. Согласно первичной структуре белка Е смежные фрагменты 3 и 10 kDa расположены в районах 354-374 и 375-471 аминокислотных остатков. Отметим, что МКА 14D5 обладает нейтрализующей активностью, и именно в районе сайта, выявляемого этим МКА, по литературным данным локализованы замены аминокислот у escape- мутантов, выращенных в присутствии нейтрализующих МКА (по 384 аминокислотному остатку представляли собой аттенуированный штамм). Итак, несмотря на практически полное отсутствие функциональной активности у антисывороток к CNBr-фратментам, что скорее всего подтверждает гипотезу о конформационно-зависимой природе В- клеточных антигенных детерминант, способных индуцировать синтез иммунологически активных антител, нам удалось привязать к структуре белка Е МКА 17С1 и 14D5, показав локализацию их сайтов в районе 10 и II пептидов.

В сводной таблице 16 приведены антигенные свойства эпитопов денатурированных форм белка Е и его бромциановых фрагментов. Все МК связываются с молекулами нативного белка Е в условиях DOT-блоттинга, однако в условиях иммуноблоттитнга происходит значительная дискриминация МКА по способности взаимодействовать с белком Е. Это связано, по-видимому, с дифференцированной устойчивостью эпитопов к действию денатурирующих агентов. Поскольку конформация антигенных детерминант играет важную роль в их взаимодействии с антителами, было изучено влияние денатурации

на антигенные свойства белка Е. Антигенные домены Е1 и Е2 гетерогенны по своей чувствительности к различным денатурирующим обработкам. Все исследованные эпитопы имеют, видимо, пептидную природу, поскольку дегликозилироваие не влияет на их взаимодействие с МКА. Ряд зпитопов сохраняет иммунокомпетентность и при СЫВг- фрагментировании белка.

2.4.4. Фкжциональное_карт1даваш1е_белка_Е.

Сопоставив топологическую карту эпитопов белка Е (табл.12) с функциональной активностью каждого из МКА, мы попытались построить схему, представляющую распределение функциональных характеристик по антигенной структуре белка. Последовательность, в которой МКА расположены в схеме-таблице 17 полностью соответстствуют топологии распределения антигенных сайтов на белке Е и является результатом конкурентного анализа МКА (раздел 2.4.1). Обращает на себя внимание дифференцированное распределение сайтов связывания МКА между первой и второй панелями МКА. Так, все МКА из первого набора связываются с эпитопами домена Е1, тогда как МКА второго связывают преимущественно эпитопы Е2. Исключение представляют лишь два клона (4В2, 7С2) из второй панели и 2НЗ - из первой. Два МКА из первого набора идентифицируют домен ЕЗ.

Второе заключение, которое можно сделать из представленных результатов, касается дифференцированной функциональной активности доменов. Несмотря на способность индуцировать антитела с высокими Кс> домены Е1 и ЕЗ слабо активны в серологических реакциях. В то же время домен Е2, выявляемый практически лишь МКА второго набора, содержит в своей структуре антигенные сайты, индуцирующие антитела с высокой функциональной активностью. Более того, практически все формы этой активности локализованы в одном или, по крайней мере, сильно перекпывающихся регионах. Только способность гемагглютинации распределена по структуре домена довольно

равномерно. Поскольку в данном случае мы судим об активности антигенных доменов по способности соответствующих МКА подавлять те

Таблица 17.

Распределение функциональной активности эпигопов на белке Е вируса К

МКА класс К (М~Т) РТГА РСК РН РДПА Но домен _____1подкласс)______________________________________панели________

1Е11 М 2,5 '10 8 40 0 0 0 1

4В2 С1 0 32 0 0 2

7С2 С1 3,0-10® 80 0 0 2 2

4А6 С1 1.6 -10е 0 0 0 0 1

5Т6 С1 1,3-10® 0 0 0 0 1

1А2 С1 2,0.10® 20 0 0 2 1

5С5 С1 10 0 0 0 1

ЗВ7 м 0 0 0 0 1

5Н9 м 0 0 0 0 1

4Р7 м 10 0 0 + 1

1Н11 С1 0 0 1 ,8 0 1

2НЗ ы 1,8-109 0 0 2,8 103 1

14Б5 с. 6.0.109 5120 >4000 5.3 2.103 2

13Б6 С1 1 ,2.10® 320 512 5,6 0,5-103 2

1В1 0. 5,0 -109 >20000 1024 4.5 ю3 2

11Б1 5120 128 0 0 2

12В6 160 0 0 2 2

18А2 А 1280 0 0 0 2

10С2 320 0 0 0 2

1402 °1 >20000 0 0 2 2

5010 С1 4,2 -10® 80 0 0 0 1

201 в. 8,9.10® 40 0 0 0 1

или иные функции, то, естественно, предположить, что МКА первой

панели оказались слабо активными, например, вследствии условий их

получения. В пользу этого предположения свидетельствует довольно

ограниченная активность МКА 2НЗ (первая панель) и способность к

ингибированию гемагглютинации некоторыми МКА второй панели,

7 -1

имеющими довольно низкие Кс (<10 М ). Против такого предположения говорит то, что некоторые МКА второй панели (4В2,

7С2), имея высокие константы связывания мало активны в серологических реакциях. Если составляя топологическую карту эпитопов .белка Е, мы предположили, что антигенными свойствами обладает практически вся белковая поверхность, то, судя по анализу функциональной активности, на структуре белка можно выделить отдельные кластеры антигенных сайтов, способных индуцировать высокоактивные антитела. В с-Л^чае домена El это эпитопы, детектируемые МКА, 4В2, 7С2, 4Аб, 5F6 и 1А2; домена Е2- 2НЗ. 14D5, 13D6, 1В1. К сожалению, домен ЕЗ представлен лишь двумя, хотя и обладающими высоким К„, МКА.

2.4.5..Заключение.

Доменная структура представляет собой общую концепцию функциональной организации белковой молекулы, и свойства такой макромолекулы определяются специфическим характером укладки отдельных элементов вторичной и супервторичной структур относительно друг друга. Практически 9091 аминокислотных остатков полипептидной цепи вовлечены в формирование основных структурных единиц, составляющих ступени иерархической организации белковой молекулы. Не представляет исключения и антигенная структура белков, анализ которой с помощью МКА позволяет сопоставить ее альтерации с изменениями в структуре генома. Даже, учитывая случайность отбора МКА, эпитопная карта, составленная нами, может быть согласована с аналогичными картами, представленными Heinz et al. 1988; Roehrig et al., 1989, хотя антигенная структура белка Е в представлениях этих авторов не всегда соответствуют друг другу. Если эпитопная карта Neudorff представлена дискретными антигенными детерминантами , го эпитопы антигена вируса Sant Luis формируют непрерывный домен, что указывает на иммуногенную активность всего гликопротеина. Несомненно, полнота антигенной карты зависит от спектра МКА, что в свою очередь зависит от условий их получения,

45

способа маркирования конкурирующих антител, и формы антигена. В специальных экспериментах нами было показано существование различий в эпитопных картах белкаЕ и цельного вириона. В последнем случае конкурентный анализ выявлял более "компактное" состояние антигенных структур по сравнению с "розеточной" формой белка Е.

Результат эпитопного картирования белка Е в наших экспериментах позволяет в какой-то степени обьеденить модели антигенной структуры флавивирусов, выявляя промежуточные сайты между дискретными доменами, предполагая тем самым способность всей поверхности белка индуцировать синтез антител. С другой стороны, мы получили не мозаичную картину распределения функциональной активности по всем доменам, а строго локализованный сайт, практически полностью определяющий иммунологические характеристики белка Е.

2.5. Вариабе^ность^антигежой_с^^туры_Е_и_Ы31.

2.5.1. ^тигещМ_анадаз_глжопротеина_Е.

Несмотря на высокую степень биохимической и иммунологической стабильности, структурный гликопротеин Е обнаруживает значительную серологическую гетерогенность, которая реализуется в антигенном разнообразии вирусов, составляющих комплекс КЭ, и выражаен в существовании группо-, типо-,видо- и,возможно, штаммоспецифических антигенных детерминант на поверхности белка. Уже результаты первых экспериментов, выполненных методом РДЛА с использованием сорбированных антисывороток на антигенах штаммов Софьин и Минск- 256, показали существование различных типов детерминант, в том числе и монотипоспецифических, т.е. способных дискриминировать антигены этих вирусных штаммов. В настоящее время основными приемами дифференциальной детекции близкородственных вирусов являются сопоставление олигонуклеотидных карт, гибридизационное тестирование вирус-

50й РНК, картирование пептидов при ограниченном протеолизе соответствующих структурных белков. Инструментом для исследования ан-■игенннх вариаций вируса могут служить МКА. Дифференцированное |Заимодействие МКА с детерминантами различных антигенов вирусов южет быть количественно охарактеризовано величиной титра и харак-■ером кривой титрования соответствующего МКА в ИФА. На рис. 10 мож-:о видеть, что кривые титрования МКА антигенов комплекса КЭ имеют ндивидуальные особенности, отражая таким образом уровень связнва-ия каждого из антител с каждым из антигенов. Поскольку МКА были олучены к гликопротеину вируса КЭ штамма Софьин, то, естественно, то все они демонстрируют высокую активность с антигеном именно того штамма, тогда как характер кривых титрования другими антиге-ами выявляют степень перекреста с эталонным антигеном. Сопостав-ение кривых между собой формирует несколько групп сходных анти-эл, характер связывания которых, их способность дискриминировать зтиген того или иного вируса аналогичны. Выборочно результаты эедставлены на рис.10. Титрование МКА антигенами комплекса КЭ утверждает существование на структурном гликопротеине как иден-1чных антигенных детерминант, выявляемых на антигенах всего комп-жса, так и детерминант, вявление которых позволяет дифференциро-шно идентифицировать антиген данного серологического типа.

Отдельный интерес представляют МКА, способные

•дифференцировать штамм Минск-256 (рицинусный подтип) от штамма |фьин (дальневосточный подтип) При эпитопном картировании этих 'аммов (таблицы 12, 13) было обнаружено несовпадение отдельных йтов связывания для МКА 2НЗ, 1306, 1А2 и 11Н1 что казалось может ъяснить наличие этих подтипов вируса- КЭ как отдельных стабильных тигенных вариантов. Однако титрование этими МКА соответствующих тигенов не дает возможности дифферанцировкитогда как МКА 4Аб, б| 5С5 и др. уверенно я?, дискриминируют. Эти МКА» как показано в

47

Рис. 10. Титрование антигенов вирусов комплекса КЭ МКА к белку Е

штамма Софьин.

разделе 2.4.2, локализованы на ГП- 14,5, и поскольку структура генома установлена и для штамма Софьин и для штамма Neudorff, являющегося как и Минск-256 рицинусным подтипом (учитывая штетювую стабильность трудно предположить наличие существенных различий между Neudorff и Минск-256), то сопоставив их можно попытаться найти те аминокислотные замены, ведущие к антигенным вариациям. Эти гликопептиды отличаются друг от друга тремя заменами, из которых существенными представляются замены в роложениях 89 (Ser на Gly) и 116 (Thr на Ala), а несущественной, практически равноценной замена 168 аминокислоты (Val на Не). Эти данные позволяют предположить, что сайты связывания исследованных антигенов с указанными МКА включают точки аминокислотных замен или расположены в непосредственной близости от них. Скорее всего, наличие этих замен и вызывает "перестановки" в эпитопном картировании белка Е штамма Минск-256, не изменяя при этом

48

нейтрализующую активность МКА.

Предположение того, что изменение антигенных характеристик домена может быть вызвыно заменой аминокислоты в другом, домене n'jnrnivuT Г.1ЧПР ткп?т'яр>туж'п«1тиа Ti nrrafiiifmimvm яититттяи* иягпиянтгт

персистирующих шташов вируса КЭ, Изучение вирусных факторов, участвующих в развитии персистентной инфекции, продемонстрировало значительное количество изменений на биохимическом и генетическом уровнях, и, естественно предположить наличие соответствующих изменений в структуре белка. Для работы были выбраны три персистирующих штамма вируса: Васильченко, V-383 и YCS. Если первый из этих штаммов был выделен из крови больного, то два других являются его производными и были выделены из тканей зараженных исходным вирусом животных после длительной персистенции. Для иммунотипирования были отобраны МКА . способные детектировать эпитопы из различных антигенных доменов на белке Е. Кроме того, эти МКА обладали различными серологическим характеристиками. Результаты титрования МКА антигенами персистирующих вирусов КЭ представлены в Таблице 18. Данные для каждого из МКА выражены как отношение значения титров, полученное для антигена штамма Софьин к значению титров, полученных для каждого из персистирующих штаммов. В большинстве исследованных случаев наблюдается тенденция к более слабому взаимодействию МКА с антигенами персистирующих вирусов по сравнению с вирусом штамма Софьин, хотя, в целом, уровень связывания весьма гетерогенен. Даже ИАЖ мышей, содержащая поликлональные антитела к суммарному антигену, способна отличить штамм Софьин от трех персистирующих вариантов вируса. Наряду с общими сайтами, в равной степени выявляемыми МКА (14D2, 14D5, 5Н9) на антигенах всех вариантов вирусов, белок Е персистирующих штаммов содержит эпитопы, уровень связывания которых с МКА значительно ниже, чем с Софьиным, и, наконец, МКА 1Н11 практически не взаимодействует с антигенами шта-

49

Таблица 18

Титрование антигенов персистирующих штаммов вируса КЭ МКА белку Е штамма Софьин вируса КЭ.

штамм МКА Васильченко В- 383 вцс

ИАЖ 16 64 16

4А6 64 64 16

7С2 8 128 64

4В2 16 16 64

1А2 4 8 8

4А7 4 16 8

5Н9 0,5 0,5 2

2НЗ 0,12 0,25 0,25

131)6 0,25 0,5 0,25

14»5 2 2 1

1Н11 16 нв нв

10С2 4 4 4

1402 2 2 1

ммов У-383 и УСБ. Совершенно особую позицию занимают МКА 2НЗ 1306, взаимодействующие с антигенами персистирующих вирусов боле активно, чем с комплементарным антигеном. Оба МКА являются нейтра лизующими (индекс нейтрализации 2НЗ составляет 2.0, а 13Б6- 5.2) Следующим шагом было исследование способности МКА (2Н3.13С6, 14Б5 нейтрализовать инфекционность персистирующих вариантов вируса Если МКА 14В5 в большей степени нейтрализует комплементарный вир ус, то 2НЗ и 1306 более эффективно нейтрализую г персистирующи штаммы (таблица 19), что подтверждает результаты иммуноферментног титрования. Результаты подавления вирусной инфекционности при тит ровании на мышах практически не отличаются от результатов, полу ченных при титровании на бляшках, хотя количественные отличия выг лядят не столь репрезентативно.

Таким образом.используя МКА к антигену штамма Софьин, удалось выявить эпитопы на антигенах персистирущих вариантах вируса КЭ, уровень функциональной активности которых значительно изменен по сравнению с активностью аналогичных эпитопов комплементарного

Таблица 19.

Активность МКА к антигену штамма Софьин в реакции нейтрализации с персистирупцими штаммами вируса КЭ.

МКА щтамм_Васильченко_ ЗляшГмышй _____В-383_________ВЦС______ титрование (обратные титры} "бляшки "мыши "бляшки мыши ___Софьин_________ "бляйкй мыши

14D5 128 12в 256 128 512 512 512 1024

2НЗ 2048 1024 128 512 2048 1024 64 128

13D6 512 512 256 256 1024 512 64 128

Примечание: I- метод редукции бляшек; II- титрование на мышах.

антигена. Анализ первичной структуры гена белка оболочки вируса штамма Васильченко, выпоненный Gold et al.(1993) показал существование аминокилогной замены в 76 положении (Ala на Thr ) и наличие последовательности AQQ в положении 232-234, что отличает этот штамм от штаммов западного и дальневосточного подтипов. Скорее всего именно эти альтерации аллостерически приводят к усилению нейтрализупцей активности МКА 2НЗ и 13D6. Замена "критических" аминокислот, по-видимому, может приводить к варьированию уровня эффективности взаимодействия антигена и МКА не только в районе замен, но и изменять функциональную активность других антигенных доменов.

2.5.2. ^а™з_антигещ10й_вариабильндсти_К§ 1.

Сопоставление генов NS1 различных флавивирусов выявляет более высокий уровень вариабельности их структур по

Таблица 20

Титрование МКА антигенов NS1 вирусов комплекса КЗ . (обратные титры)

МКА ^ Ш 22Н8 4С4 I6BI 20В4 29GT0

антиген

КЭ (Соф) 1,6-10° ГО

0,5-10° 10°

6.4-I03 0,5-Ю6

2.5-Ю4 6,4-Ю3 2,5-104 4-102

Повассан 2,5-Ю4 6,5'10е Кегиши 6,4-Ю3___I(¿___

огл

Лангат

ШЭО

КЛБ

6,5-10° 6,5-10® 0,5-Ю6 10е 2,5-Ю4 6,5'Ю6 2,5-Ю4

2,6.10' Ю8

2.5-Ю4 Ю5

1.6-Ю3 Ю5

1,6-Ю3

6,5-I05 2,6-10

0,5-ТО6 <"Г03

2,5-Ю4 CIO3

6,4-Ю3 <Ю3

Ю2 <Ю3

IQ2 <103

0 <Г03

сравнению с генами белка Е. Иммуноферментное титрование МКА белку NS1 вируса КЭ штамма Софьин антигенами вирусов, составляющ этот комплекс, также показало значительную степень давергенц между вирусами комплекса КЭ. Результаты титрования (табл.2 указывают на существование на структуре NS1 антигенных дэтермина различной специфичности: от детерминант, являющихся общими д всех вирусов комплекса КЭ (результаты титрования МКА 4С4 мало ч отличаются от титрования ИАЖ, содержащей поликлональнне антитела до типоспецифичных, что видно по характеру титрования МКА 29GI Наличие общих и уникальных антигенных детерминант белка N различных вирусов комплекса КЭ может найти свое применение как эпидемиологических исследованиях, так и в изучении функциональн и, может быть, иммунопатологической ролей данного белка.

ВЫВОДЫ.

I. Разработаны методы выделения и очистки структурного неструктурного гликопротеинов вируса КЭ; получены два набора МКЛ белку Е и панель МКА к неструктурному гликопротеину NS1.

Т) Гликопротвин оболочки вируса Е бил идентифицирован аминокислотному составу белка, анализу первичной струkïj

г.9

триптических пептидов. Выделены и очищены гликопротеин N31 и гетерокомплексы белков Е- NS1 и Е- NS1- NS3.

2) Моноклональные антитела (МКА) охарактеризованы по ряду "физико- химических и иммунологических параметров. МКА к .белку Е ..проявляли дифференцированную активность в серологических реакциях:

q т

ряд МКА имел константы аффинитета, превышающие 10 M . МКА к белку NS1 были пассивны в серологических реакциях.

ГГ. Разработан ряд иммуноаналитических тест-систем, позволяющих детектировать антигены белков Е и NS1 вируса КЗ и специфические к ним антитела. В качестве компонентов систем были использованы МКА, что в случае анализа антигена приводило к заметному повышению чувствительности анализа, составившей Г,5 -2 нг/мл (75- 100 пг/в пробе). Диагностическая значимость и практическая ценность разработанных тест-систем была проверена при анализе сывороток крови больных (в случае определения антител) и при выявлении антигена вируса КЗ в пулах клещей. Чувствительность тест-системы для определения бежа NS1 составила 1,5- 2 нг/м.

TII. Исследованы антигенные и иммуногенные характеристики белков Е и NS1. Проведены эпигопное и функциональное картирование белка Е и локализация ряда антигенных детерминант на его структуре Исследована функциональная активность модифицированных форм белка Е и его CNBr- фрагментов.

1 ) Идентификация эпигопов гликопротеина Е штамма Софьин МКА выявила, по крайней мере, 3 независимых антигенных домена. Однако, анализ теми же МКА других представителей комплекса КЗ (Минск-256 и КЛБ) выявляет "транслокацию" эпитопов между доменами, что может указывать на антигенные способности всей белковой структуры. Однако совмещение карты антигенных сайтов с их иммунологической активностью продемонстрировало существование на антигенной структуре гликопротеина Е кластеров функциональных эпитопов,

совмещающих все вида серологической активности белка.

2) На структуре гликопротеина Е локализованы некоторые CNE фрагменты, наиболее крупный из которых гликопептид с M 14,5 Р расположен между 78 и 176'пминокислотным^оотатками. Показано, * существовует незначительное число антигенных детерминант, oöii для нятивной и дензту.рирЬванной (форм белка. Установлено, что г детерминанты расположены на ONBr- фрагменте Мг ТО 'кТ локализуемом в районе 375-471 аминокислотных остатков.

3) Анализ выделенного белка Е показал полное сохранен антигенных и иммунологических свойств, присущих цельному вириог Проведен компаративный анализ иммунологической активное нативного NS1 и его генно-инженерного аналога. Показано, v антисыворотки к обоим полипептидам активны в серологичест реакциях с нативным NS1, однако искусственный полипептид взаимодействует с антителами к природному антигену. Ни NS1, ни е аналог не проявили протективной активности и не индуцировг синтез нейтрализующих антител. Показан синергический эффе NS1 при индуцировании синтеза нейтрализующих антич гвтеродимвром Е- N51.

IV. Проведен вариантный анализ апитопов гликопротеинов Е NS1 вирусов комплекса КЗ, показаний существование дэтерминг различного уровня специфичности на иммуногенах Е и NS1.

I ) Сопоставление результатов иммунофермантного титрования N антигенами штамма Софьин и Минск-?,5fi и анализа первичных струкч гликотаптида о 14,5 позволило локализовать сайт взаимодеЯст? антигенов о соответствующими ЖА в районе 89 или 1 аминокислотных остатков.

2) Выявлены изменения в антигенной структур«? гликопротеина черсиотирутцих вариантов вируса КЗ. определяющих вируси инфек!Шонног.ть.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор глубоко признателен директору Новосибирского института биоорганической химии СО РАН - академику Д.Г. Кнорре и директору Института полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН -академику Российской АМН С.Г. Дроздову за предоставленную возможность выполнения исследований, результаты * которых представлены в данном докладе.

Постановка и развитие работы осуществлены при поддержке и прямом участии академика РАМН М.П. Чумакова и д.б.н. С.Г. Рубина, в лаборатории которых была выполнена значительная часть исследования и благодарность к которым сохранится в памяти автора.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Л.Э. Матвеевым, H.A. Цехановской, В.А. Матвеевой, В.Ф. Ямщиковым, К.В. Пугачевым, Г.И. Барамом (НИБХ СО РАН); В.В. Погодиной, Г.В. Маленко, A.C. Каравановым, И.В. Семашко, Ю.Ю. Кусовым, И.В. Виноградовой, Я.А. Сальниковым (ИПиВЭ РАМН); И.В. Назимовым, В.В. Шемякиным, О.М. Вольпиной, Т.Д. Волковой (ИКС им. М.М. Шемякина РАН), которым автор искренне благодарен за сотрудничество.

По материалам диссертационной работы опубликованы следующие статьи:

1. М.П.Чумаков, Ю.Ю.Кусов, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, Я.А. Сальников, В.Н.Рейнголд, Е.Х.Прэссман, Н.А.Цехановская. Выделение и изучение субъединичного иммуногена вируса клещевого энцефалита-гликопротеина V3. В сб.: "Арбовирусы", 1984, Таллинн, 53-55.

2. М.П.Чумаков, Ю.Ю.Кусов, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, Я.А.Сальников, В.Н.Рейнголд, Е.К.Прессман, Н.А.Цехановская. Субъединичный иммуноген вируса клещевого энцефалита. Сообщение I. Выделение и свойства гликопротэина Е. Вопр. вирусол., Г984, т.29, 694-701.

3. М.П.Чумаков,С.Г.Рубин, Ю.Ю.Кусов, И.В.Семашко, Я.А.Сальников, Е.К.Прессмян, Н.А.Цехановская. Субъединичный иммуноген вируса клещевого энцефа.тита. Сообщение II. Иммунологические характеристики гликопротеино» МЗ из двух антигенных типов ВКЭ., Вопр. вирусол., 1984, т.29, 701-706.

4. Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, В.Л.Сигитова, Н.А.Цехановская. Применение белка А в иммуносорбентном анализе антител к вирусу клещевого энцефалита. ЖМЭМ, 1Э84, N 12, О. 15-19. Б. Г.И.Барам, М.А.Грачев, И.В.Казимов, А.Г.Плетнев, Е.К.Прессман, С.Г.Рубин, Я.А.Сальников, И.В.Семашко, М.П.Чумаков, В.Б.Шемякин, В.Ф.Ямщиков. Последовательность аминокислот некоторых трштических пептидов белка оболочки вируса клещевого энцефалита. Биоорганическая химия, 1985, T.II, 1677-1680.

6. Е.Б.Миронова, Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, А.Д.Аммосов. Иммуно-ферментный анализ с визуальной индикацией для обнаружения антител к вирусу КЭ. ЖМЭИ, 1989, N I, С. 54-57.

7. Л.Э.Матвеев, А.А.Годовиков, А.С.Караванов, А.Г.Плетнев, С.Г. Рубин, И.В.Семашко, М.П.Чумаков, Н.А.Цехановская, Е.К.Прессман. Моноклональные антитела к гликопротеину вируса КЭ: предварительная характеристика. Вопр. вирусол., 1989, т. 34, 694-697.

8. Л.Э.Матвеев, А.С.Караванов, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, Е.К. Прессман. Сравнительная оценка двух иммуноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу КЭ. Вопр. вирусол., 1989, т. 34, 488-491.

9. А.С.Караванов, Л.Э.Матвеев, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, H.A. Це-хановская, Е.К.Прессман. Идентификация отдельных антигенных эпи-топов белка оболочки вируса КЭ с применением моноклональных антител. Вопр. вирусол., 1990, т. 35, 140-143.

10. Н.А.Цехановская, Л.Э.Матвеев, И.В.Сафронов, А.Г.Плетнев, С.Г. Рубин, Е.К.Прессман. Локализация антигенного участка белка оболочки вируса клещевого энцефалита с использованием моноклональных антител. Биоорганическая химия, I99T, т.17, 334-342 11& N.A.Tsekhanovskaya, L.E.Matveev, S.O.Rubin, E.K.Pressman. Epitope analysis of tick-born encephalitis complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein oi TRU vln.us.

Virus Research, 1943, v.3CT p.1- 16.

12. E.K.Pressman, A.S.Karavanov, V.A.Matveeva, L.E.Matveev, K.V. Pugachev, I.V.Vinogradov«. Comparative analysis of serological activity of tick-born encephalitis virus non-structural protein NS1 and It's analog expressed In bacterial cells. Immunol.Lett., 1993, v. 38, p. ¡73-178.

13. E.K.Pressman, G.V.Ma]enko, V.V.Pogodina. Variabilities in the antigenic structure of persisting TBE virus strains. Virus Research, 1993, v.30, p. 295-301.

14. E.K.Pressman. Heterooomplexes of tick-born encephalitis structural and non-structural proteins. FEBs Lett., 1993, v. 333, p. 268-270.

Результаты исследований защищены авторскими свидетельствами на изобретения:

1. Л.Э.Матвеев, А.Л.Годовиков, Н.А.Цэхановская, Е.К.Прессман, С.Г.Рубин, М.В.Семашко, А.С.Караванов. Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для получения моноклональ-ных антител к белку оболочки Е вирусов комплекса клещевого энцефалита. Авторское свидетельство N 153329 от 01.09.1988.

2. Л.Э.Матвеев, А.А.Годовиков, H.А.Цехановская, Е.К.Прессман, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, А.С.Караванов. Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для получения моноклональ-ных антител к белку оболочки Е вирусов комплекса клещевого энце фалита. Авторское свидетельство N 1540269 от 01.10.1989.

3. Л.Э.Матвеев, А.А.Годовиков, H.А.Цехановская, Е.К.Прессман, С.Г.Рубин, М.В.Семашко, А.С.Караванов. Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для получения моноклональ-ных антител к белку оболочки Е вирусов комплекса клещевого энцефалита. Авторское свидетельство N Tf"15RJ4 от 22.10.1989.

Результаты представлены в докладах и тезисах:

1. Е.К.Прессман. МоноклональНые антитела против вируса клещевого энцефалита. Доклады конференции "Биотехнология в медицине и сельском хозяйстве", 1984, Тарту, 28-32.

2. Т.Д.Волкова, О.М.Вольпияа, А.Шавна, Е.В.Снеткова, С.Г.Рубин, А.Г.Плетнев, Е.К.Прессман, И.В.Семашко, А.С.Караванов. Синте: экспонированных' участков гликопротеина Е ВКЭ и изучение и: иммуногенных свойств.Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума ш химии белков и пептидов, 1987, Таллинн, I63-T64.

3. Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, Н.А.Цехановская, В.А.Матвеева

A.С.Караванов, С.Г.Рубин. Методы иммуноферментного анализа i основе моноклональных антител для определения антигена вируса КЭ Тезисы докл. Всесоюзной конфер. "Современные направления создаши медицинских диагностикумов", 1988, Москва, 34.

4. Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, Н.А.Цехановская, В.Ф.Золотова, Н.А, Алексеева, А.С.Караванов, С.Г.Рубин. Иммунодиагностикумы на основ* моноклональных антител для выявления антител против вируса КЭ, Тезисы докл. Всесоюзной конф. "Современные направления создашь медицинских диагностикумов", I98S, Москва, 35.

5. Н.А.Цехановская, Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, А.Г.Плетнев, С.Г. Рубин, А.С.Караванов Исследование антигенной структуры поверхностного гликопротеина вируса КЭ с использованием моноклональных антител. Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики КЭ", Иркутск, 1990, 14.

6. Л.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, В.А.Матвеева, Н.А.Цехановская,

B.Ф. Золотова, H.A. Алексеева, А.С.Караванов, С.Г.Рубин. Использование моноклональных антител к поверхностному гликопротеину вируса КЭ в диагностических иммуноферментных тест-системах. Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики КЭ", Иркутск,

1990, Т.02.

7. U.K.Pressman, N.A.Tsekhanovakaya, b.E.Matveev, S.G.Rubin, 7.V. ShuhsViKo, A.S.KaravaiTOV. Tjocal IzatIon of several antigenic determinants of tick-born enoephal.ltIs envelope protein. Abst-Vhiit, ?ri(l Symp. on Arboviruses In the Mediterránea oótin tries, 1939, Dubrovnic, S38.

Я. И.Р.Виноградова, .Я.Э.Матвеев, Е.К.Прессман, Л.С.Караванов. Моноклональные и поликлональные антитела в тест-системе для диагностики КЭ. Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики КЭ", Иркутск, 1990, 94.