Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита

Хоретоненко, Михаил Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. МЛ. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПРЕДПРИЯТИЕ ПО ПРОИЗВОДСТВУ БАКТЕРИЙНЫХ И ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНСТИТУТА ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. МЛ. ЧУМАКОВА РАМН»

На правах рукописи

ХОРЕТОНЕНКО МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ! К УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ И СОЗДАНИЮ НОВЫХ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Государственном учреждении Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН и ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Тимофеев Андрей Викторович.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Борисова Татьяна Константиновна.

доктор биологических наук Ляпустин Виктор Николаевич.

Ведущая организация:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита состоится ^ 2005 г. в У/ часов на заседании

Диссертационного совета Д. 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М Л. Чумакова РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_&_» ^2ш5с?л.$ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О

Медведкина

Клещевой энцефалит (КЭ) — острое инфекционное природноочаговое заболевание, распространенное практически на всей территории Европы, Урала, Сибири и Дальнего Востока. Заболевание вызывается вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus. К тому же роду относится целая группа других возбудителей таких особо опасных инфекций, как японский энцефалит, желтая лихорадка, лихорадки Денге, вирус Западного Нила и др.

В связи с резким ростом миграции населения человек все чаще вступает в контакт с дикой природой, что в свою очередь приводит к увеличению вероятности контакта с переносчиками и возбудителями природноочаговых инфекций для лиц так называемой неиммунной прослойки. Таким образом, проблема защиты населения от КЭ становится все более острой как в Европе, так и в России, где традиционно эндемичными по КЭ являются Дальний Восток и Сибирь.

Основным средством профилактики КЭ в настоящее время является вакцинация. На территории Российской Федерации для вакцинации используются лиофилизоваяная культуральная инактивированная концентрированная очищенная вакцина производства ФГУП «ПИПВЭ им. МЛ. Чумакова РАМН», Москва (далее ККОВКЭ ИПВЭ), а также жидкие культуральные инактивированные концентрированные очищенные вакцины производства ФГУП НПО «Вирион», Томск (ККОВКЭ Вирион), компании Immuno AG, Австрия (FSME-Immun) и Chiron-Behrmg, Германия (Encepur). Несмотря на доказанную эффективность вышеперечисленных вакцин для профилактики КЭ (Timofeev, Karganova, 2003), работы по их усовершенствованию представляются актуальными в силу следующих причин. В первую очередь, это касается удаления из состава вакцин ненужных компонентов, что позволило бы минимизировать местные и общие побочные реакции, а также решить задачу снижения себестоимости производства, а следовательно, и цены конечного продукта. Другой не менее важной задачей является улучшение структуры иммунного ответа у вакцинируемых за счет введения в ее состав других протективных вирусных антигенов. Здесь следует упомянуть неструктурный белок вируса КЭ NSI. Способность этого белка вызывать комплексный протективный иммунный ответ в составе рекомбинантного аденовируса была однозначно показана ранее в экспериментах на мышах (Timofeev et al, 1998).

В этой связи мы сосредоточили свое внимание на изучении процесса сорбции инак-тивированного концентрированного очищенного препарата вируса КЭ на гидроокиси алюминия в отсутствие и в присутствии такого важного компонента вакцины, как человеческий

сывороточный альбумин (ЧСА). Вторым направлением наших исследований было изучение возможностей экспрессирующих эукариотических систем, несущих в своем составе ген белка NSI, а также их сочетанного применения для создания протективного иммунного ответа против КЭ. Третьим направлением явилось исследование иммуногенности отдельных линейных участков белка NS1 с помощью синтетических пептидов, а также возможности индукции с их помощью протективного иммунитета против КЭ на модели экспериментальных животных.

Актуальность проблемы

В настоящее время для профилактики КЭ применяются инактивированные очищенные цельновирионные вакцины как отечественного, так и зарубежного производства. Несмотря на высокую эффективность данных препаратов, доказанную многочисленными клиническими исследованиями, проблема поиска новых подходов к профилактике КЭ остается актуальной.

В современных вакцинах против КЭ в качестве адыованта используется гель гидроокиси алюминия, призванный за счет сорбции депонировать антиген в месте введения вакцины. К моменту начала данной работы имелись данные о том, что он не влияет на иммуно-генность препарата [Эльберт и др., 1984]. Наряду с этим данный компонент вакцины потенциально повышает вероятность местных и, возможно, общих побочных реакций на вакцинацию. Поэтому понадобились дополнительные исследования необходимости введения в состав вакцины геля гидроокиси алюминия в качестве растворителя.

Известно, что оболочечный белок Е вируса КЭ, являющийся основным иммуногеном при вакцинации против КЭ, индуцирует в основном гуморальный иммунитет и слабо стимулирует клеточный иммунный ответ [Mathew et al., 1996; Mathew et al., 1998]. Ранее было показано, что неструктурный белок NS1 вируса КЭ наряду с белком Е является одним из основных антигенов при инфекции этим вирусом [Ляпустин и др., 1983]. Во многих исследованиях подтверждается потенциальная протективная активность белка NS1 флавивирусов, в том числе и вируса КЭ [Jacobs et al., 1992; Timofeev et al., 1998; Тимофеев и др., 2001]. Известно, что этот белок является индуктором клеточного иммунитета [Mathew et al., 1996; Timofeev et al., 2004]. Таким образом, сочетанное применение современной вакцины против КЭ и белка NS1 потенциально будет обеспечивать более комплексный и длительный иммунитет. Это определило остальные направления наших исследований.

В настоящее время ведется активный поиск новых способов иммунизации против вирусных инфекций. Одним из таких подходов является использование вирусных векторов для

одновременной иммунизации прошв нескольких заболеваний. Одна из распространенных экспериментальных моделей — вирус осповакцины [К^Ы et эй., 1991; Pincus et эй., 1992; Fonseca et эй., 1994]. Необходимо было изучить возможность создания рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего белок N81 вируса КЭ, и способность такой конструкции защищать животных от вирусной инфекции.

Для иммунизации против различных вирусных инфекций в настоящее время используется способ прайм-бустерной иммунизации, основанный на использовании разных экс-прессирующих систем. Нами была поставлена задача изучить на экспериментальных животных возможность формирования протективного иммунитета против КЭ с использованием совместной иммунизации рекомбинантным вирусом осповакцины и бактериальной плазми-дой, несущими ген белка N81 вируса КЭ.

Еще одним перспективным способом иммунизации является использование синтетических пептидов-фрагментов вирусных антигенов в качестве профилактических препаратов. Сведения об иммуногенных свойствах синтетических фрагментов белка N81 немногочисленны. Поэтому необходимо было изучить возможность формирования протективного иммунитета против летальной инфекции КЭ у экспериментальных животных с помощью пептидных препаратов.

Цель и задачи исследования

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования было: (1) в результате изучения закономерностей процесса сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия в присутствии и в отсутствие ЧСА обосновать необходимость использования геля гидроокиси алюминия в вакцине против КЭ; (2) изучить протективную активность рекомбинантного вируса осповакцины (РВОВ), несущего ген белка N81 вируса КЭ, против КЭ в экспериментах на животных; (3) изучить протективную активность экспрессирующих систем на основе РВОВ и бактериальной плазмиды при прайм-бустерной иммунизации в экспериментах на животных; (4) изучить иммуногенные свойства синтетических пептидов-фрагментов белка N81 вируса КЭ и возможный механизм их протективного действия.

Научная новизна

Впервые подтверждено ингибирующее действие ЧСА на процесс сорбции инактиви-рованных вирионов КЭ на геле гидроокиси алюминия. Установлено, что в присутствии ЧСА степень сорбции инактивированных вирионов КЭ снижается в 3-4 раза. Получены кинетиче-

ские кривые этих процессов, а также предложен возможный механизм ингибирования, заключающийся в конкурентной сорбции инактивированных вирионов КЗ и ЧСА.

Впервые показана протективная активность РВОВ, несущего ген белка N81 вируса КЭ, в экспериментах на мышах.

Впервые показана возможность формирования эффективного иммунитета при прайм-бустерной вакцинации с использованием РВОВ и бактериальной плазмиды рМУ45, несущих ген белка N81 вируса КЭ, в экспериментах на мышах.

Впервые установлены иммуногенные свойства синтетического пептида-фрагмента белка N81 вируса КЭ. Впервые показана протективная активность данного пептида в экспериментах на мышах. Установлена его способность вызывать образование антител к белку N81 у животных. Экспериментально подтвержден антителоопосредованный механизм про-тективного действия этого пептида.

Практическая значимость

Полученные результаты, описывающие процесс сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия, указывают на то, что использование гидроокиси алюминия в качестве адъюванта вакцины против КЭ практически нецелесообразно. Это касается только препаратов, в которые после их очистки в качестве стабилизатора добавляется ЧСА. Также отказ от гидроокиси алюминия должен удешевить производство, обеспечить лучшую стандартность вакцины и, возможно, снизить риск местных реакций у вакцинируемых без снижения иммуногенности и протективной активности препарата.

Показана возможность формирования протективного иммунитета у животных против вируса КЭ с помощью последовательной иммунизации рекомбинантным вирусом осповак-цины и бактериальной плазмидой, несущими ген белка N81 вируса КЭ. В будущем возможна разработка нового перспективного вакцинного препарата на основе указанных экспресси-рующих систем для профилактики КЭ. Данный подход также представляется перспективным в рамках изучения возможности одновременной вакцинации от нескольких инфекций.

Продемонстрированная в работе протективная активность пептидов-фрагментов белка N81 вируса КЭ открывает новые возможности для профилактики и, потенциально, лечения КЭ. В перспективе возможна разработка препарата на основе изученного синтетического пептида для профилактики КЭ. Важным преимуществом подобного подхода является снижение белковой нагрузки при вакцинации и, как следствие, уменьшение числа побочных реакций. Также возможно использование данного пептида как компонента вакцины против КЭ с целью формирования более полного иммунитета у вакцинированных.

Использование как генно-инженерных систем, так и пептидов для профилактики КЭ позволяет значительно снизить биологическую опасность производства вакцины против КЭ, в настоящее время связанную с необходимостью накопления большого количества патогенного вируса.

Благодарности

Автор выражает благодарность дирекции Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. M.П. Чумакова РАМН (директор — академик РАМН Дроздов С.Г.) и дирекции ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН» (директор — Белова Г.А.) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Автор глубоко благодарен заместителю директора Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по научной работе проф., д.б.н. В.П. Грачеву за постоянное внимание в ходе выполнения данной работы и заведующему отделом биотехнологического контроля ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ Чумакова РАМН» к.м.н. Киктенко А.В. за искреннюю поддержку в ходе проведения исследований. Автор искренне благодарен научному руководителю данной работы заведующему лабораторией концентрации и очистки вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН д,м.н. Тимофееву А.В. за постоянное внимание и руководство в ходе выполнения данной работы. Данная работа была бы невозможна без моих коллег и соавторов большинства работ, сотрудников, в настоящем и прошлом, Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН и ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН»: д.б.н. Ожерелкова СВ., д.б.н. Хапчаева ЮХ, к.б.н. Воровича М.Ф., к.б.н. Овсянниковой Н.В; заведующего лабораторией генетики вирусов Института биологии гена РАН д.м.н. Альтштейна А.Д., руководителя научной группы Института биоорганической химии им. М.И. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН д.х.н. Вольпиной О.М. Благодарность выражается научным и техническим сотрудникам лаборатории концентрации и очистки вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, группы усовершенствования вирусных вакцин ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН», лаборатории генетики вирусов Института биологии гена РАН, научной

группы под руководством д.х.н. Вольпиной О.М. Института биоорганической химии им. M.И. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за содействие в выполнении ряда экспериментов.

2. Результаты и их обсуждение.

Все представленные данные основаны на результатах нескольких независимых экспериментов.

2.1. Изучение кинетики сорбции инактивированного очищенного препарата вируса КЭ на

гидроокиси алюминия.

В настоящее время в производстве многих вакцин широко используется гель гидроокиси алюминия. Его назначение — адсорбция вирусных антигенов, их депонирование в месте введения вакцины и формирование более эффективного иммунного ответа за счет интенсивного включения в реакцию организма на вакцинацию компонентов местного иммунного ответа—медиаторов воспаления, макрофагов и т.д.

Тем не менее, ранее указывалось, что применение геля гидроокиси алюминия в качестве растворителя при вакцинации против КЭ практически не влияет на титры нейтрализующих антител в сыворотках доноров-добровольцев [Эльберт и др., 1984]. Мы предположили, что это может быть связано с ингибированием сорбции инактивированных вирионов КЭ на теле гидроокиси алюминия посредством ЧСА.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали суспензию инактивированных, сконцентрированных и очищенных с помощью хроматографии вирионов КЭ (ИКОВКЭ) в 0.1 М Трис-буфере (рН 7.4), предоставленных к.б.н. М.Ф. Воровичем, ФГУП "ПИПВЭ им. МЛ. Чумакова РАМН".

Данный препарат разводили в два раза гелем гидроокиси алюминия и добавляли 10 %-ный раствор ЧСА до концентрации ЧСА 0.1 %. Также готовили ИКОВКЭ, разведенный в два раза гелем гидроокиси алюминия без добавления ЧСА. В качестве контролей использовали ИКОВКЭ, разведенный в два раза водой для инъекций с добавлением 10 %-ного раствора ЧСА до концентрации 0.1 %, и ИКОВКЭ, разведенный в два раза водой для инъекций без добавления ЧСА.

Для двух экспериментальных серий проб—ИКОВКЭ с гелем гидроокиси алюминия с добавлением и без добавления ЧСА — строили кинетическую кривую, отбирая пробы через 3,15, 30 мин, 1,2,4,8 и 24 часа. Пробы центрифугировали, отбирали супернатант и в нем

определяли условную концентрацию инактивированных вирионов КЭ методом прямого им-муноферментного анализа (ИФА). Степень сорбции определяли по формуле:

где Со, — концентрация вирионов в супернатанте в данный момент времени; Сип, — концентрация вирионов в контрольной пробе.

Контрольная проба для серии «ИКОВКЭ с гидроокисью алюминия в присутствии ЧСА» — ИКОВКЭ, разведенный водой для инъекций, с добавлением ЧСА. Контрольная проба для серии «ИКОВКЭ с гидроокисью алюминия в отсутствие ЧСА» — ИКОВКЭ, разведенный водой для инъекций, без добавления ЧСА,

Результаты эксперимента представлены на рис. 1.

Как видно из полученных результатов (рис. 1), в присутствии 0.1 % ЧСА сорбция ИКОВКЭ на геле гидроокиси алюминия заметно снижается по сравнению с сорбцией в препаратах, не содержащих ЧСА. В среднем максимальная степень сорбции ИКОВКЭ в отсутствие ЧСА составляет 80-90 %, в присутствии ЧСА — 20-30 %. Таким образом, показано, что ЧСА в концентрации 0.1 % обладает значительным ингибирующим действием по отношению к процессу сорбции ИКОВКЭ на геле гидроокиси алюминия.

Нами было показано, что при последовательном добавлении в раствор ИКОВКЭ геля гидроокиси алюминия и ЧСА с интервалом 1 час степень сорбции ИКОВКЭ не снижается заметным образом и также составляет 85-90 %. Отсюда следует, что в данном случае мы имеем дело с конкурентным ингибированием ЧСА процесса сорбции ИКОВКЭ на геле гидроокиси алюминия.

Рисунок 1. График зависимости степени сорбции ИКОВКЭ на гидроокиси алюминия от времени. Пунктиром обозначена кинетическая кривая сорбции ИКОВКЭ в отсутствие ЧСА, сплошной линией — кинетическая кривая сорбции в присутствии ЧСА.

На основании полученных результатов можно говорить о целесообразности исключения из состава современной вакцины против КЭ геля гидроокиси алюминия в качестве растворителя. Следует отметить, что в первую очередь необходимо отказаться от использования ЧСА как стабилизатора, поскольку этот препарат, как компонент человеческой крови, может быть контаминирован ВИЧ и вирусом гепатита С. Следует заметить, что ранее австрийскими исследователями показано, что исключение гидроокиси алюминия из состава вакцины производства Baxter Immuno AG приводит к увеличению процента побочных реакций при вакцинации [Marth, Kleinhappl, 2001]. Но в работе [Zent et al., 2004] показано, что отсутствие в вакцине производства Chiron Behring каких-либо белковых стабилизаторов не приводит к увеличению числа побочных эффектов. Поэтому, пока не будет снято указанное противоречие и ЧСА будет применяться в качестве стабилизатора в готовой вакцине, можно рекомендовать отказаться от использования в качестве растворителя геля гидроокиси алюминия, что

несколько удешевит процесс производства, контроля и транспортировки вакцины, сделает препарат более стандартным, а также, возможно, позволит снизить число побочных реакций.

Следует отметить, что к настоящему моменту получены данные о возможном иммунопатологическом действии гидроокиси алюминия. При изучении причин макрофагального миофасциита—патологического состояния, характеризующегося рассеянной артромиалгией и синдромом хронической усталости, — было установлено, что одной из возможных причин заболевания может быть введение вместе с вакциной гидроокиси алюминия, остающейся в месте инокуляции и слабо стимулирующей иммунный ответ [Gherardi et al., 2001]. Это еще один довод в пользу исключения гидроокиси алюминия из состава вакцины против КЭ.

2.2. Изучение рекомбинантного вируса осповакцины, несущего ген белка NS1 вируса КЭ.

В геном вируса осповакцины был клонирован ген белка NS1 вируса КЭ, штамм Най-дорф, из плазмиды pMV4S. Было показано, что полученный РВОВ способен размножаться в клетках СПЭВ, CV-1 и Rat2tk". Титр вируса на культуре клеток СПЭВ, определенный методом титрования по бляшкам на культуре клеток под агаровым покрытием, для РВОВ составлял 1065-107 БОЕ/мл, для ВОВ 107- 1075 БОЕ/мл.

Полученный рекомбинантный вирус был лишен тимидинкиназной активности и экс-прессировал (ï-галактозидазу (фен осИж^Л в то время как исходный ВОВ, штамм WR, имел фенотип то есть обладал тимидинкиназной активностью и не экспрессировал галактозидазу. Поскольку сайт клонирования находился в гене тимидинкиназы, такая смена фенотипа свидетельствовала о наличии в геноме полученного рекомбинанта гена белка NS1.

Далее изучалась способность РВОВ экспрессировать в культуре клеток СПЭВ белок NS1 вируса КЭ. Радиоактивно [,4С]-меченные экстракты клеток, зараженных РВОВ, анализировали методом радиоиммунопреципитации (РИП).

ПротеинА-сефарозу инкубировали со смесью радиоактивно меченного экстракта клеток СПЭВ, зараженных РВОВ, и сыворотки крови мышей (содержащей антитела к белку NS1 или интактной).

После отмывки преципитат протеинА-сефарозы обрабатывали денатурирующим буфером. Супернатанты, содержащие иммунопрецшштаты, анализировали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и радиоавтографии.

Преципитаты анализировали методом денатурирующего электрофореза в полиакри-ламидном геле и радиоавтографии.

Результаты опыта по оценке экспрессии белка NS1 в культуре клеток приведены на рис. 2. Из полученного радиоавтографа можно видеть, что РВОВ экспрессирует в клетках СПЭВ белок NS1 вируса КЭ.

Иммуногенные свойства РВОВ изучали на мышах линии BALB/c. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно в дозе 1065 БОЕ/мышь. Интервал между инъекциями составлял две недели Через две недели после второй иммунизации животных заражали вирусом КЭ, штамм Абсетгаров. Результаты опыта приведены в табл. 1.

Рисунок 2. Результаты анализа экстракта клеток СПЭВ, зараженных (РВОВ) Нечетные дорожки — прогретые при 95°С в течение 5 мин пробы, четные дорожки — непрогретые пробы Во всех дорожках — экстракт [14С]-меченных клеток СПЭВ, зараженных РВОВ Дорожки 1 и 2 — сыворотка крови мышей, содержащая антитела к белку вируса КЭ Дорожки 3 и 4 — сыворотка крови интактных мышей Положения димера и мономера белка ^ 1 вируса КЭ указаны стрелками.

Таблица!.

Протективная активность РВОВ против вируса КЭ на мышах.

Разрешающая доза вируса КЭ(ЛД5о) Падеж мышей, иммунизированных вирусом (числитель — число погибших мышей; знаменатель—число зараженных мышей)

РВОВ ВОВ Интактные мыши

1 2/12(17%) 9/10(90%) 16/30(53%)

10 6/12(50%) 10/10(100%) 29/30(97%)

100 9/12(75%) 10/10(100%) 30/30(100%)

Из таблицы видно, что выживаемость мышей, иммунизированных РВОВ, после заражения 100 ЛД50 вируса КЭ (штамм Абсеттаров) — дозы, стандартно используемой для проверки специфической протективной активности вакцины против КЭ, — составила 25 %. Однако при снижении дозы протективная активность препарата заметно увеличивается (выживаемость при заражении 10 ЛД 50 вируса КЭ — 50%, 1 ЛД50 — 83 %).

Таким образом, РВОВ обладает протективной активностью в экспериментах на жи-ВОТНЫХУ мышей, иммунизированных РВОВ и выживших после разрешения 10 ЛД50 вируса КЭ, штамм Абсеттаров, брали сыворотку крови по стандартной методике и анализировали методом РИП.

Результаты анализа приведены на рис. 3.

Рис. 3. Результаты анализа сывороток крови мышей, иммунизированных РВОВ и выживших после разрешения 10 ЛД50 ВКЭ, штамм Абсеттаров. Нечетные дорожки — прогретые при 95°С в течение 5 мин пробы, четные дорожки—непрогретые пробы. Во всех дорожках—экстракт ["С]-меченных клеток СПЭВ, зараженных ВКЭ. Дорожки 1 и 2 — сыворотка крови мышей, двукратно иммунизированных РВОВ и выживших после разрешения 10 ЛД» вируса КЭ, штамм Абсеттаров. Дорожки 3 и 4—сыворотка крови мышей, содержащая антигела к белку NS1 вируса КЭ. Дорожки 5 и б — моноклональные антитела к белку Е вируса КЭ, штамм Абсеттаров. Дорожки 7 и 8 — сыворотка крови интактных мышей. Положение димеров (д-NSl) и мономеров (м-NSl) белка NS1, а также белка Е вируса КЭ обозначено стрелками.

Из рисунка видно, что у животных, иммунизированных РВОВ и выживших после разрешения 10 ЛД50 вируса КЭ, штамм Абсеттаров, образуются антитела к белку вируса КЭ. В то же время в сыворотках крови выживших животных не обнаруживаются антитела к белку Е, что говорит об отсутствии выраженной инфекции у мышей.

Таким образом, впервые был получен РВОВ, экспрессирующий белок NS1 вируса КЭ в чувствительных культурах клеток — Rat2tk+, СПЭВ и CV-1 (титры 10 65- 107 БОЕ/мл). Выявлено, что РВОВ способен экспрессировать белок NS1 вируса КЭ и частично защищать мышей от летальной вирусной инфекции (табл. I). Относительно невысокая степень защиты животных при высокой разрешающей дозе, по нашему мнению, может быть связана с тем, что при первичной вакцинации РВОВ в организме мышей вырабатывался иммунитет к белкам вектора. В результате при повторной иммунизации РВОВ иммунный ответ хозяина, направленный против РВОВ, по-видимому, подавлял размножение вектора, и как следствие, снижал уровень экспрессии белков рекомбинанта, в том числе и белка NS1 вируса КЭ. Это могло привести к значительному уменьшению эффекта от повторной вакцинации.

Для проверки этого предположения нами была опробована альтернативная схема иммунизации животных против вируса КЭ с помощью разных экспрессирующих систем, а именно РВОВ и плазмиды pMV45, несущей ген белка NS1 вируса КЭ.

2.3. Изучение схемы совместной вакцинации мышей РВОВ и плазмидой pMV45.

Для оптимизации условий вакцинации с помощью РВОВ нами была предложена иная схема иммунизации — первичное введение рекомбинантного вируса осповакцины и последующее применение плазмиды pMV45, несущей ген белка NS1 вируса КЭ. Схема вакцинации с использованием различных экспрессирующих систем доказала свою эффективность в экспериментах по защите от малярии [Oliveira-Ferreira, Daniel-Ribeiro, 2001], гепатита С [Vidalin et al., 2000], а также в экспериментах, касающихся противораковой терапии [Bonnet et al., 2000; Woodland, 2004]. Основная причина использования такого подхода — совместной вакцинации — состоит в разной способности различных экспрессирующих систем к первичной и бустерной вакцинации.

Для изучения протективного эффекта смешанной схемы иммунизации мышей линии BALB/c иммунизировали РВОВ или ВОВ в дозе 1065 БОЕ/мышь. Через две недели после первой иммунизации у части мышей брали сыворотку крови для анализа методом РИП. Оставшихся животных иммунизировали повторно плазмидами pMV45 и pMVlOO в дозе 50 мкг/мышь. Через две недели после второй иммунизации у части животных брали сыворотку крови для анализа методом РИП. Оставшихся животных заражали 100 ЛД50 вируса КЭ, штамм Абсеттаров. Результаты опыта приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что совместная иммунизация РВОВ и плазмидой pMV45, несущих ген белка NS1 вируса КЭ, эффективно защищает мышей от летальной вирусной инфекции.

Таблица 2.

Изучение эффективности совместной вакцинации мышей РВОВ и плазмидой pMV45.

Номер Общее число Число вы- Иммуниза- Иммуниза- Плазмида Плазмида

группы животных живших жи- ция ВОВ ция РВОВ рМУЮО рМУ45

вотных

1 10 0 + - + -

2 10 4 + - - +

3 10 2 - + + -

4 10 8 - + - +

5 10 0 - - - -

При этом схемы иммунизации, в которых лишь один из векторов был способен экс-прессировать белок не продемонстрировали выраженного протективного эффекта. Таким образом, предложенная нами схема иммунизации мышей с использованием бустерной вакцинации рекомбинантной плазмидой обеспечивает выработку у животных протективного иммунного ответа против летальной вирусной инфекции.

У выживших после заражения вирусом КЭ животных, иммунизированных РВОВ и плазмидой pMV45, брали сыворотку крови для анализа методом РИП.

Результаты РИП приведены на рис. 4. Показано, что у выживших после заражения вирусом КЭ мышей в сыворотке крови обнаруживаются антитела к белку №1 и отсутствуют антитела к белку Е, по общепринятым в настоящее время представлениям являющиеся маркером выраженной инфекции КЭ.

На основании сказанного можно сделать вывод, что совместная иммунизация мышей РВОВ и pMV45 обеспечивает выработку протективного иммунитета у животных к высоколетальным дозам вируса КЭ. Вероятно, более выраженный эффект совместной иммунизации по сравнению с двукратной иммунизацией с помощью РВОВ объясняется тем, что удается избежать стимуляции иммунного ответа против компонентов первой экспрессирующей системы при повторной иммунизации за счет применения другого вектора.

Рис 4 Результаты анализа сывороток крови мышей, иммунизированных РВОВ и плазмидой pMV45, до и после разрешения 100 Л Д » вируса КЭ методом РИП. Нечетные дорожки—прогретые при 9 5°С в течение 5 мин пробы, четные дорожки — непрогретые пробы А — анализ сывороток крови мышей до разрешения с радиоактивно меченным экстрактом клеток Veto, зараженных рекомбинантным аденовирусом Rad51, экспрессирующим белок NS1 вируса КЭ Дорожки 1 и 2 — сыворотка крови интактных мышей. Дорожки 3 и 4—сыворотка крови мышей, содержащая антитела к белку NS1 вируса КЭ Дорожки 5 и 6—сыворотка крови мышей, иммунизированных РВОВ Дорожки 7 и 8 — сыворотка крови мышей, иммунизированных РВОВ и плазмидой pMV45 последовательно Б — анализ сывороток крови мышей после разрешения с радиоактивно меченным экстрактом клеток СПЭВ, зараженных вирусом КЭ, штамм Абсеттаров Дорожки 9 и 10 — сыворотка крови интактных мышей Дорожки 11 и 12 — моноклональные антитела к белку Б вируса КЭ, штамм Абсеттаров. Дорожки 13 и 14 — сыворотка крови мышей, содержащая антитела к белку NS1 вируса КЭ Дорожки 15 и 16 — сыворотка крови мышей, иммунизированных РВОВ и плазмидой pMV4S и выживших после разрешения. Положение ди-меров (д-NSl) и мономеров (м-NSl) белка NS1 вируса КЭ, а также белка Е обозначено стрелками.

Таким образом, впервые для вакцинации мышей против КЭ с помощью белка NS1 использована подобная схема, включающая в себя первичную вакцинацию РВОВ и бустерную вакцинацию рекомбинантной плазмидой pMV45. Показана ее эффективность и отсутствие в сыворотке крови мышей, иммунизированных указанным образом, белка Е — маркера выраженной инфекции Обе экспрессирующие системы в настоящее время активно изучаются с ТОЧКЕ зрения альтернативных способов вакцинации, а также перспектив совместной иммунизации против нескольких инфекций. Введение в потенциальный вакцинный вирус протек-тивного антигена другого заболевания, эндемичного для данного региона, позволит в целом упростить вакцинальный процесс и в значительной степени его удешевить. Применение ДНК-вакцин является, возможно, наиболее перспективным, простым и дешевым подходом для профилактики в будущем вновь возникающих опасных инфекционных заболеваний.

Тем не менее следует отметить, что чужеродная ДНК обладает потенциальной трансформирующей активностью, и это сдерживает применение подобных конструкций в качестве реальных вакцин в настоящее время.

2.4. Иммуногенные свойства пептидов-фрагментов белка №1 вируса КЭ

Для изучения нами были выбраны ряд пептидов-фрагментов белка №1 вируса КЭ. Выбор пептидов проводился по методу, предложенному Волышной и соавт. [Уо1рта et а1., 2002]. Синтез пептидов проводили твердофазным методом на смоле Ванга [ШепИепё, Meienhofer, 1987]. Аминокислотная последовательность полученных пептидов представлена в табл. 3.

Таблица 3.

Пептиды-фрагменты белка NS1.

Номер пеп- Положение в амино- Аминокислотная последовательность пептида

тида кислотной последовательности белка NS1

1 1-19 ОУОСАУОТЕШЕЬШШОЬ

2 37-55 ЕИОАЬАЗАЖЕТРЕЕСТС

3 91-112 01апртоужкнр8[хкк0ы)1

4 99-114 1КК}1Р8ШСКОК1)1КУ

5 122-138 вМШвУРЕАРЛиМУСТ

6 147-170 ЕКЮСТСУт/АЕРОУСЛКТКУРЬО

7 156-182 УАЕР0У01ЛШОТ11)РК(}Е8ТНЕСВТС

8 203-225 КЗУКШТСТУР/ЕЬЬУШиШСЗ

9 244-267 1,РА81А0Рттж1Р0У8Е<}УК0

10 275-297 ЯУтаЕЕСРОТЮ/ТтаАОСОЮЩА

11 286-308 УТГШАОСОИЮАЗУЯБГГЕЗОКУ

12 331-348 WYAME1RPVHDQGGLVRS

Препаратами иммунизировали мышей линии БЛЬБ/е двукратно с интервалом в 30 дней. Сыворотки крови животных, отобранные через 10 дней после второй иммунизации, анализировали методом ИФА на содержание антител к пептидам.

Планшету для иммуноферментного анализа сенсибилизировали препаратами пептидов. Затем в соответствующие лунки вносили двукратные разведения (начиная с 1:10) сывороток крови иммунизированных пептидами мышей. После этого в лунки вносили антитела к иммуноглобулинам мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена. После проявления с помощью орто-фенилендиамина определяли оптическую плотность проб с помощью спектрофотометра. Результаты анализа представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты ИФА сывороток крови мышей, иммунизированных пептидами.

Номер пептида Титры антител к Номер пептида Титры антител к

пептидам, 1&о пептидам, ^ю

1 1.9 7 5.3

2 4.4 8 4.6

3 <1.0 9 4.1

4 2.5 10 4.8

5 2.8 11 3.4

б 3.0 12 4.4

Как видно из полученных результатов, из всего набора пептидов только пептид № 3 не способен вызывать в организме мышей выработку антител, определяемых методом ИФА.

Сыворотки крови мышей, иммунизированных пептидами, анализировали методом РИП для определения способности антител к указанным пептидам взаимодействовать с белком №1 вируса КЭ.

Результаты эксперимента представлены на рис. 5. Из данного радиоавтографа видно, что только антитела к пептиду № 2 способны взаимодействовать с белком N81 вируса КЭ.

Таким образом, впервые показано, что синтетический фрагмент неструктурного белка N81 вируса КЭ способен вызвать у мышей образование антител к белку, фрагментом которого он является.

Для изучения протективной активности пептидов нами был выбран пептид № 2, способный вызывать у мышей выработку антител. Мышей БЛЬБ/е иммунизировали внутри-брюшинно дважды с интервалом 30 дней. В качестве контроля такую же группу мышей иммунизировали адъювантом Фрейнда. Через неделю после второй вакцинации проводили разрешение 100 ЛД50 вируса КЭ, штамм Софьин. Результаты опыта представлены в табл. 5.

Рис. 5. Результаты анализа сывороток крови мышей, иммунизированных пептидами, методом РИП. Нечетные дорожки — прогретые при 95°С в течение 5 мин пробы, четные дорожки — непрогретые пробы. Во всех дорожках — экстракт |4С-меченных клеток Vero, зараженных вирусом КЭ, штамм Софьин. Дорожки 1 и 2 — сыворотка крови мышей, двукратно иммунизированных пептидом № 1. Дорожки 3 и 4 — сыворотка крови мышей, двукратно иммунизированных пептидом № 2 Дорожки 5 и 6 — сыворотка крови мышей, двукратно иммунизированных пептидом № 3. Дорожки 7 и 8 — сыворотка крови мышей, двукратно иммунизированных пептидом № 4. Дорожки 9 и 10 — сыворотка крови интактных мышей.. Дорожки 11 и 12 — сыворотка крови мышей, содержащая антитела к белку NS1 вируса КЭ. Положение димеров (д-NSl) и мономеров (м-NSl) белка NS1 вируса КЭ обозначено стрелками.

Таблица 5.

Результаты опыта по оценке протективной активности пептида № 2 на мышах.

Группа мышей Всего мышей Выжило Выживаемость, %

Мыши, иммунизированные пептидом 8 5 63

Контрольная группа 8 0 0

Таким образом, показано, что двукратная иммунизация мышей пептидом № 2 способна эффективно защищать животных от летальной вирусной инфекции.

Сыворотки крови мышей, иммунизированных пептидом № 2 и выживших после разрешения, анализировали методом РИП с целью определить наличие антител к белку №1 и белку Е вируса КЭ. Результаты эксперимента представлены на рис. 6.

Рис. 6. Результаты анализа сывороток крови мышей, иммунизированных пептидом № 2 и выживших после разрешения 100 ЛД,0 вируса КЭ, штамм Софьин. Во всех дорожках — эхстракт "С-меченных клеток Vero, зараженных вирусом КЭ, штамм Софьин. Нечетные дорожки—прогретые при 95°С в течение 5 мин пробы, четные дорожки—непрогретые пробы Дорожки 1 и 2 — сыворот ка крови мышей, двукратно иммунизированных пептидом № 2 и выживших после разрешения 100 ЛД50 вируса КЭ, штамм Софьин. Дорожки 3 и 4 — сыворотка крови мышей, содержащая антитела к белку NS1 вируса КЭ Дорожки 5 и 6 — сыворотка крови интактных мышей. Дорожки 7 и 8 — моноклональные антитела к белку Е вируса КЭ. Положение димеров (д-NSl) и мономеров ( v - N SI ) белка N S1, а также белка Е вируса КЭ обозначено стрелками.

Таким образом показано, что у выживших после разрешения летальной дозой вируса КЗ мышей, иммунизированных пептидом № 2, в сыворотке присутствуют антитела к белку NS1 и не наблюдается антител к белку Е, являющихся маркером инфекции. Впервые установлено, что синтетический пептид-фрагмент белка NSI вируса КЭ способен достаточно эффективно, хотя и не полностью, защищать мышей от летальной вирусной инфекции.

Для подтверждения того, что антитела к пептиду № 2 напрямую участвуют в защите мышей от вирусной инфекции, нами был проведен эксперимент по адоптивному переносу сывороток крови мышей, иммунизированных пептидом № 2. При этом одному животному-реципиенту водили сыворотку крови двух животных-доноров. Через 24 часа после обработки циклофосфаном в дозе 0.2 мг/мышь животным в хвостовую вену вводили сыворотку крови мышей, иммунизированных пептидом № 2. Позже в тот же день всем мышам вводили 100 ЛД50 вируса КЭ, штамм Софьин. Наблюдение вели 3 недели. В контрольной группе животным вводили сыворотку крови мышей, иммунизированных последовательно полным и неполным адъювантом Фрейнда. Результаты эксперимента приведены в табл. 6.

Выживаемость мышей в экспериментальной группе составила 55 %, в контрольной группе все животные погибли (табл. 6). Полученные данные свидетельствуют о том, что по

крайней мере одним из механизмов, вносящих существенный вклад в защиту мышей от вирусной инфекции, является выработка антител к белку N1, стимулированная пептидом № 2.

Таблица 6.

Результаты эксперимента по изучению протективных свойств сыворотки крови мышей, иммунизированных пептидом № 2.

Группа мышей Всего мышей Выжило Выживаемость, %

Мыши-реципиенты, получавшие сыворотку животных, иммунизированных пептидом № 2 7 4 55

Контрольная группа 7 0 0

Полученные результаты согласуются с данными ракшаг et al., 1994], показавшего, что моноклональные антитела к неструктурному белку №1 другого флавивируса (Денге-2) взаимодействуют с синтетическим линейным пептидом-фрагментом указанного белка. При этом указанные антитела способны частично защищать мышей от летальной вирусной инфекции. Следует, однако, отметить, что пептид, описанный в работе ^акотаг et а1., 1994], не идентичен пептиду, использовавшемуся в данной работе, ни по аминокислотному составу, ни по локализации в молекуле белка.

Результаты нашей работы подтверждают перспективность синтетических пептидов для профилактики и, возможно, лечения КЭ. В ряде работ также указывается на потенциальную возможность использования синтетических пептидов как перспективных вакцинных препаратов для профилактики ряда инфекций [Уэ1рта et al., 1996; ^з^т et а1., 2002]. Несмотря на то, что возможное производство вакцинных препаратов на основе синтетических пептидов потребует довольно сложных с технологической точки зрения методов, оно является достойной и безопасной альтернативой современному производству цельновирионных вакцин, требующему накопления значительных количеств патогенного вируса.

3. Выводы.

1. Установлено ингибируюшее действие ЧСА на процесс сорбции инактивированных концентрированных очищенных вирионов КЭ на геле гидроокиси алюминия. Предложен возможный механизм ингибирования, основанной на конкурентной сорбции белка Е и ЧСА.

2. Впервые получен рекомбинантный вирус осповакцины, несущий ген белка NS1 вируса КЭ, штамм Найдорф. Показана способность данной рекомбинантной конструкции к размножению в культурах клеток Rai2tk+, СПЭВ и CV-1 с конечными титрами 10й-10' БОЕ/мл. Установлено, что рекомбинантный вирус экспрессирует в клетках СПЭВ белок NS1. Впервые показано, что РВОВ обладает протективной активностью в экспериментах на мышах. Установлено отсутствие выраженной инфекции вирусом КЭ у выживших животных.

3. Предложена схема иммунизации мышей совместно РВОВ и плазмидой pMV45, несущей ген белка NS1 вируса КЭ, штамм Найдорф. Показано, что такая комбинированная схема иммунизации обеспечивает протективный иммунитет у экспериментальных животных в отсутствие выраженной инфекции.

4. Впервые показана способность синтетического пептида-фрагмента неструктурного белка NS1 вируса КЭ, штамм Софьия, стимулировать образование в организме мышей антител, взаимодействующих с белком NS1. Установлено, что указанный пептид обладает про-тективной активностью против вируса КЭ в экспериментах на мышах. Установлено отсутствие выраженной инфекции у животных, иммунизированных указанным пептидом и зараженных вирусом КЭ, штамм Софьин.

5. Методом адоптивного переноса подтвержден предложенный антителоопосредован-ный механизм иммунного ответа при иммунизации синтетическим пептидом-фрагментом белка NS1.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Тимофеев А.В., Хоретоненко М.В., Ворович М.Ф., Волышна О.М., Альтштейн АД, Стивенсон Дж. Р. Изучение перспектив использования неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита в качестве вакцинного препарата. // «Актуальные вопросы вакуинно-сывороточного дела в XXI веке». Пермь. - 2003. - С. 50-52.

2. Хоретоненко М.В., Тимофеев А.В., Ворович М.Ф. Человеческий сывороточный альбумин препятствует сорбции инактивированного очищенного вируса клещевого энцефалита на гидроокиси алюминия. // Материалы Всероссийской научно-

практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней», Самара. - 2004. - С. 89.

3. Khoretonenko M.V., Vorovitch M.F., Zakharova L.G., Pashvyidna G.V., Ovsyannikova N.V., Stephenson J.R., Timofeev A.V., Altstein A.D., Shneider A.M. Vaccinia Virus Recombinant Expressing Gene of Tick-borne Encephalitis Virus Non-structural NS1 Protein Elicits Protective Activity in Mice. // Immunology Letters. - 2003. - V. 90. - P. 161-163.

Также результаты работы изложены в тезисах следующих конференций:

4. Хоретоненко М.В., Ворович М.Ф., Овсянникова Н.В., Тимофеев А.В. Вакцинация против клещевого энцефалита с помощью рекомбинантного вируса осповакцины. // Тезисы VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине», Санкт-Петербург. - 2002. - С. 399-400.

5. Хоретоненко М.В., Ожерелхов СВ., Шаповалова В.Ю., Понадцов А.А., Волкова Т.Д., Волыгана О.М., Стивенсон Дж.Р., Тимофеев А.В. Изучение иммунологических свойств пептидов-фрагментов неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита. // Тезисы 6го Международного форума по глобальной вакцинологии, Минск, Беларусь. - 2003. - С.37.

6. Altstein A.D., Aleshin S.E., Ozherelkov S.V., Khoretonenko M.V., Zakharova L.G., Pash-vikina G.V., Shneider A.M., Stephenson J.R., Timofeev A.V. Combined Vaccination of Mice Against Tick-Borne Encephalitis (ГВЕ) with Recombinant Vaccinia Virus and Plas-mid Both Carrying TBE Virus NS1 Non-Structural Gene. // 12th International Congress of Immunology, July 18-23, Montreal, Canada. - 2004.

Подписано в печать 1.02.2005 Объем 1.75 усл.п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 14 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

2? i::.,j'/::5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хоретоненко, Михаил Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-биологические свойства флавивирусов.

1.1.1. Геном флавивирусов.

1.1.2. Общие представления о структурных белках флавивирусов.

1.1.3. Общие представления о неструктурных белках флавивирусов.

1.1.4. Репликативный цикл флавивирусов.

1.1.5. Сборка и выход вируса из клетки.

1.2. Инактивированные вакцины против КЭ.

1.2.1. Подходы к усовершенствованию современной вакцины против

1.2.1.1. Адъюванты.

1.2.1.2. Способы инактивации.

1.2.1.3. Субстраты для накопления вируса.

1.2.2. Подходы к созданию новых вакцин против КЭ.

1.2.2.1. Вакцины на основе структурных белков.

1.2.2.2. Вакцины на основе неструктурных белков.

1.2.2.3. Вакцины, основанные на принципе совместной иммунизации структурными и неструктурными белками вируса КЭ.

1.3. Средства доставки флавивирусных антигенов.

1.3.1. Основные способы презентации флавивирусных антигенов в организме.

1.3.2. Комплексные исследования средств презентации флавивирусных антигенов.

1.3.3. Системы, основанные на технологии рекомбинантных вирусов.

1.3.4. Системы, основанные на технологии рекомбинантных бактериальных плазмид.

1.3.5. Вирусоподобные частицы и липосомы.

1.3.6. Рекомбинантные белки.

1.4. Адъюванты для флавивирусных вакцин.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусы.

2.2. Плазмиды.

2.3. Клеточные культуры.

2.4. Антитела.

2.5. Титрование вируса КЭ на мышах.

2.6. Титрование вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ.

2.7. Получение рекомбинантного вируса осповакцины (РВОВ).

2.7.1. Получение интеграционной плазмиды.

2.7.2. Получение РВОВ.

2.7.3. Клонирование полученного РВОВ методом бляшек под агаровым покрытием.

2.7.4. Титрование ВОВ и РВОВ.

2.8. Получение радиоактивно меченных экстрактов зараженных клеток.

2.9. Радиоиммунопреципитация.

2.10. Выбор и синтез пептидов-фрагментов неструктурного белка NS1 вируса КЭ.

2.10. Иммунизация мышей РВОВ.

2.11. Иммунизация мышей РВОВ и плазмидой pMV45.

2.12. Иммунизация мышей синтетическими пептидами-фрагментами белка NS1 вируса КЭ.

2.13. Иммуноферментный анализ (ИФА) сывороток мышей, иммунизированных синтетическими пептидами—фрагментами белка NS 1.

2.14. Иммуноферментный анализ проб на содержание инактивированных вирионов вируса КЭ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

3.1. Изучение кинетики сорбции инактивированного очищенного препарата вируса КЭ на гидроокиси алюминия.

3.2. Изучение рекомбинантного вируса осповакцины, несущего ген белка NS1 вируса КЭ.

3.3. Изучение схемы совместной вакцинации мышей РВОВ и плазмидой pMV45.

3.4. Иммуногенные свойства пептидов-фрагментов белка NS1 вируса

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита"

Клещевой энцефалит (КЭ) - острое инфекционное природноочаговое заболевание, распространенное практически на всей территории Европы, Урала, Сибири и Дальнего Востока. Заболевание вызывается вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae, роду Flavivirns. К тому же роду относится целая группа других возбудителей таких особо опасных инфекций, как японский энцефалит, желтая лихорадка, лихорадки Денге, вирус Западного Нила и др.

В связи с резким ростом миграции населения человек все чаще вступает в контакт с дикой природой, что, в свою очередь, приводит к увеличению вероятности контакта с переносчиками и возбудителями природноочаговых инфекций для лиц так называемой неиммунной прослойки. Таким образом, проблема защиты населения от КЭ становится все более острой как в Европе, так и в России, где традиционно эндемичными по КЭ являются Дальний Восток и Сибирь.

Основным средством профилактики КЭ в настоящее время является вакцинация. На территории Российской Федерации для вакцинации используются лиофилизованная культуральная инактивированная концентрированная очищенная вакцина производства ФГУП "ПИПВЭ" им. М.П. Чумакова РАМН, Москва (далее ККОВКЭ ИПВЭ), а также жидкие культуральные инактивированные концентрированные очищенные вакцины производства ФГУП НПО "Вирион", Томск (ККОВКЭ Вирион), компании Immuno AG, Австрия (FSME-Immun) и Chiron-Behring, Германия (Encepur). Несмотря на доказанную эффективность вышеперечисленных вакцин для профилактики КЭ (Timofeev, Karganova, 2003), работы по их усовершенствованию представляются актуальными в силу следующих причин. В первую очередь, это касается удаления из состава вакцин ненужных компонентов, что позволило бы минимизировать местные и общие побочные реакции, а также решить задачу снижения себестоимости производства, а следовательно, и цены конечного продукта. Другой, не менее важной задачей является улучшение структуры иммунного ответа у вакцинируемых за счет введения в ее состав других протективных вирусных антигенов. Здесь следует упомянуть неструктурный белок вируса КЭ NS1. Способность этого белка вызывать комплексный протективный иммунный ответ в составе рекомбинантного аденовируса была однозначно показана ранее в экспериментах на мышах (Timofeev et al, 1998).

В связи с этим мы сосредоточили свое внимание на изучении целесообразности присутствия в составе инактивированного концентрированного очищенного препарата вируса КЭ гидроокиси алюминия для создания эффективного протективного иммунитета, а также сорбции вирионов на гидроокиси алюминия в отсутствии и присутствии такого важного компонента вакцины, как человеческий альбумин (ЧСА). Вторым направлением наших исследований было изучение возможностей экспрессирующих эукариотических систем, несущих в своем составе ген белка NS1, а также их сочетанного применения для создания экспериментального протективного иммунного ответа против КЭ. Третьим направлением явилось исследование иммуногенности отдельных линейных участков белка NS1 с помощью синтетических пептидов, а также возможности индукции с их помощью протективного иммунитета против КЭ на модели экспериментальных животных.

Актуальность проблемы

В настоящее время в качестве адъюванта вакцины против КЭ используется гель гидроокиси алюминия, призванный за счет сорбции депонировать антиген в месте введения вакцины. К моменту начала данной работы имелись данные о том, что он не влияет на иммуногенность препарата [Эльберт и др., 1984]. Однако данный компонент вакцины потенциально повышает вероятность местных и, возможно, общих побочных реакций на вакцинацию. Поэтому были необходимы дополнительные исследования необходимости введения в состав вакцины геля гидроокиси алюминия в качестве растворителя.

Известно, что оболочечный белок Е вируса КЭ, являющийся основным иммуногеном при вакцинации против КЭ, индуцирует в основном гуморальный иммунитет и практически не стимулирует клеточный иммунный ответ. Ранее было показано, что неструктурный белок NS1 вируса КЭ наряду с белком Е является одним из основных антигенов при инфекции [Ляпустин и др., 1983]. Во многих исследованиях подтверждается потенциальная протективная активность белка NS1 флавивирусов, в том числе и вируса КЭ [Jacobs et al., 1992; Timofeev et al., 1998; Тимофеев и др., 2001]. Известно, что этот белок является индуктором клеточного иммунитета [Mathew et al., 1996; Timofeev et al., 2004]. Таким образом, сочетанное применение современной вакцины против КЭ и белка NS1 потенциально будет обеспечивать более комплексный и пролонгированный иммунитет. Это определило остальные направления наших исследований.

В настоящее время ведется активный поиск новых способов иммунизации против вирусных инфекций. Одним из таких подходов является использование вирусных векторов для одновременной иммунизации против нескольких заболеваний. Одна из распространенных экспериментальных моделей — вирус осповакцины [Konishi et al., 1991; Pincus et al., 1992; Fonseca et al., 1994]. Необходимо было изучить возможность создания рекомбинантного вируса осповакцины, способного экспрессировать белок NS1 вируса КЭ, и способность такой конструкции защищать животных от вирусной инфекции.

Еще одним перспективным способом иммунизации является использование синтетических пептидов-фрагментов вирусных антигенов в качестве профилактических препаратов. Сведения об иммуногенных свойствах синтетических фрагментов белка NS1 немногочисленны, и необходимо было выяснить особенности иммунного ответа у животных при иммунизации рядом фрагментов указанного белка, а также изучить возможность защиты животных от летальной инфекции КЭ с помощью указанных пептидных препаратов.

Цель и задачи исследования

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования было: (1) в результате изучения закономерностей процесса сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия в присутствии и в отсутствие ЧСА обосновать необходимость использования геля гидроокиси алюминия в вакцине против КЭ; (2) изучить протективную активность рекомбинантного вируса осповакцины (РВОВ), несущего ген белка NS 1 вируса КЭ, против КЭ в экспериментах на животных; (3) изучить протективную активность экспрессирующих систем на основе РВОВ и бактериальной плазмиды по принципу прайм-бустерной иммунизации в экспериментах на животных; (4) изучить иммуногенные свойства синтетических пептидов-фрагментов белка NS1 вируса КЭ и возможный механизм их протективного действия.

Научная новизна

Впервые подтверждено ингибирующее действие человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) на процесс сорбции инактивированных вирионов КЭ на геле гидроокиси алюминия. Установлено, что в присутствии ЧСА степень сорбции инактивированных вирионов КЭ снижается в «4 раза. Получены кинетические кривые этих процессов, а также предложен возможный механизм ингибирования, заключающийся в конкурентной сорбции инактивированных вирионов КЭ и ЧСА.

Впервые показана протективная активность РВОВ, несущего ген белка NS1 вируса КЭ, в экспериментах на мышах.

Впервые показана возможность формирования эффективного иммунитета с помощью прайм-бустерной вакцинации с использованием РВОВ и бактериальной плазмиды pMV45, несущих ген белка NS1 вируса КЭ, в экспериментах на мышах.

Впервые установлены иммуногенные свойства синтетического пептида-фрагмента белка NS1 вируса КЭ. Впервые показана протективная активность данного пептида в экспериментах на мышах. Установлена его способность вызывать образование антител к белку NS1 у экспериментальных животных. Подтвержден антителоопосредованный механизм протективного действия этого пептида.

Практическая значимость

Полученные результаты, описывающие процесс сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия, указывают на низкую целесообразность использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта вакцины против КЭ. Это касается только препаратов, в которые в качестве стабилизатора после очистки добавляется ЧСА. Наряду с этим отказ от гидроокиси алюминия должен удешевить производство, обеспечить лучшую стандартность вакцины и, возможно, снизить риск местных реакций у вакцинируемых без снижения иммуногенности и протективной активности препарата.

Показана возможность формирования протективного иммунитета у животных против вируса КЭ с помощью последовательной иммунизации рекомбинантным вирусом осповакцины и бактериальной плазмидой, несущими ген белка NS1 вируса КЭ. В будущем возможна разработка нового перспективного вакцинного препарата на основе указанных экспрессирующих систем для профилактики КЭ. Данный подход также представляется перспективным в рамках изучения возможности одновременной вакцинации от нескольких инфекций.

Продемонстрированная в работе протективная активность пептидов-фрагментов белка NS1 вируса КЭ открывает новые возможности для профилактики и, возможно, лечения КЭ. В перспективе возможна разработка препарата на основе изученного синтетического пептида для профилактики КЭ. Важным преимуществом подобного подхода является снижение белковой нагрузки при вакцинации и, как следствие, уменьшение числа побочных реакций. Также возможно использование данного пептида как компонента вакцины против КЭ с целью формирования более полного иммунитета у вакцинированных.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Хоретоненко, Михаил Владимирович

выводы.

1. Установлено ингибирующее действие ЧСА на процесс сорбции инактивированных концентрированных очищенных вирионов КЭ на геле гидроокиси алюминия. Предложен возможный механизм ингибирования, основанной на конкурентной сорбции белка Е и ЧСА.

2. Впервые получен рекомбинантный вирус осповакцины, несущий ген белка NS1 вируса КЭ, штамм Найдорф (РВОВ). Показана способность данной рекомбинантной конструкции к размножению в культурах клеток Rat2tk+, СПЭВ и CV—1. Установлено, что рекомбинантный вирус экспрессирует в клетках СПЭВ белок NS 1. Впервые показано, что РВОВ обладает протективной активностью в экспериментах на мышах. Установлено отсутствие выраженной инфекции вирусом КЭ у выживших животных.

4. Впервые показана способность синтетического пептида-фрагмента неструктурного белка NS1 вируса КЭ, штамм Софьин, стимулировать образование в организме мышей антител, взаимодействующих с белком NS1. Установлено, что указанный пептид обладает протективной активностью против вируса КЭ в экспериментах на мышах. Установлено отсутствие выраженной инфекции у животных, иммунизированных указанным пептидом и зараженных вирусом КЭ, штамм Софьин.

5. Методом адоптивного переноса подтвержден предложенный антителоопосредованный механизм иммунного ответа при иммунизации синтетическим пептидом—фрагментом белка NS1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хоретоненко, Михаил Владимирович, Москва

1. Грицун Т.С., Лисак В.М., Ляпустин В.Н., Королев М.Б., Лашкевич В.А. . Медленно седиментирующий гемагглютинин вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1989. - № 34 (4). - С. 449-454.

2. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. — 1990. № 35(6). - С. 471-474.

3. Деменев В.А., Гайдамович С.Я., Захарычева Т.А., Иванов Л.И. Изучение усиления инфекционности вируса клещевого энцефалита в эксперименте. // Материалы научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Москва. 1999. - С. 21.

4. Ершов Ф.И., Баринский И.Ф., Подчерняева Р.Я., Грибенча С.В., Попова О.М. Иммуностимулирующий эффект индукторов интерферона // Вопр. вирусол. 1983. - № 28(4). - С. 74-79.

5. Каган Н.В. Экспериментальные материалы к активной иммунизации мышей против весеннее-летнего (клещевого) энцефалита препаратами живого и убитого вируса. // Арх. биол. наук. 1939. - № 56 (2). - С. 97-111.

6. Ефимова В.Ф., Эльберт Л.Б., Крутянская Г.Л., Кост А.А., Будовский А.И., Коликов В.М. УФ-инактивация вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1982.-№ 1.-С. 94-98.

7. Левкович Е.Н., Засухина Г.Д., Чумаков М.П., Лашкевич В.А., Гагарина А.Г. Тканевая культуральная вакцина против клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1960. - № 3. - С. 233-236.

8. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В.А. Особенности включения радиоактивности углеводов в структурные белки вируса клещевого энцефалита // Мол. ген. микробиол. вирусол. 1987. — № 3. - С. 24-26.

9. Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Характеристика низкомолекулярного невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. 1983. — № 2. — С. 200-207.

10. Матвеева В.А., Бугрышева Ю.В., Бахвалова В.Н., Морозова О.В. Секреция гетерокомплекса гликопротеинов Е и NS1 вируса клещевого энцефалита на поздней стадии инфекции // Вопр. вирусол. 1997. - № 42 (4). -С. 179-182.

11. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Линия гетероплоидных клеток 4647: изучение применение, перспективы. // 1994. Москва. — С. 3-7.

12. Морозова О.В. Максимова Т.Г., Попова Р.В., Марцинкевич О.Н., Бахвалова В.Н. Экспрессия гена NS1 вируса клещевого энцефалита в грам— негативной бактерии из носоглотки мыши // Молек. биол. 2001. - № 35(1). -С. 157-162.

13. Морозова О.В., Попова П.М., Максимова Т.Г., Митрофанова Е.Е., Бахвалова В.Н. Сравнение иммунного ответа, индуцированного ДНК— и инактивированной вакциной против клещевого энцефалита // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунол. — 2000. — № 2. С. 54-57.

14. Первиков Ю.В., Эльберт Л.Б., Крутянская Г.Л., Рубин С.Г., Хотлубей Л.И. Иммунный статус волонтеров, привитых различными типами вакцин против клещевого энцефалита. // «Вирусы и вирусные инфекции». Материалы конференции, Москва. 1981. - С. 57-58.

15. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. // Изд-во АМН СССР, Москва-Ленинград. — 1986. — С. 172-190.

16. Смородинцев А.А., Каган Н.В., Левкович Е.Н. Экспериментальные материалы к активной иммунизации против клещевого весенне-летнего энцефалита// Журн. микробиол. — 1941. — № 4. С. 3—12.

17. Смородинцев А.А., Левкович Е.Н., Данковский Н.Л. Эпидемиологическая эффективность активной иммунизации против клещевого (весенне-летнего) энцефалита // Журн. микробиол. 1941. - № 4. - С. 12-20.

18. Тимофеев А.В., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стивенсон Дж.Р. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген белка NS1 вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. — 2001. — № 46. — С. 22—24.

19. Эльберт Л.Б., Ворович М.Ф., Терлецкая Е.Н., Лисицина Е.А., Атанадзе С.Н., Сидорович И.Г., Хозинский В.В., Тугизов Ш.М., Кущ А.А., Хапчаев

20. Ю.Х., Тимофеев А.В. Изучение протективной активности препаратов из вируса клещевого энцефалита, выращенного с использованием различных клеточных культур // Ж. микробиол. 1992. - № 1. - С. 25-28.

21. Эльберт Л.Б., Красильников И.В., Ефимова В.Ф., Жайдес В.М., Березин В.Е., Артамонов А.Ф., Тимофеев А.В., Жданов В.М. Способ получения вакцины против клещевого энцефалита // Авторское свидетельство СССР № 1387232 от 8 декабря 1987 г.

22. Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Грачев В.П., Русанов В.М., Крохина М.А. Иммунизация доноров инактивированной концентрированной очищенной вакциной против клещевого энцефалита для получения иммунных препаратов крови // Вопр. вирусол. 1984-№ 1. - С. 56-59.

23. AbuBakar S., Azmi A., Mohamed-Saad N., Shafee N., Chee H.Y. Antibody responses of dengue fever patients to dengue 2 (New Guinea С strain) viral proteins. //Malays. J.Pathol. 1997.-V. 19(1).-P. 41-51.

24. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 695-700.

25. Allison S.L., Stadler К., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 5816-5820.

26. Allison S.L., Stiasny K., Stadler K., Mandl C.W., Heinz F.X. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 5605-5612.

27. Amberg S.M., Nestorowicz A., McCourt D.W., Rice C.M. NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: In vitro and in vivo studies. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 3794-3802.

28. Arias C.F., Preugschat F., Strauss J.H. Dengue 2 virus NS2B and NS3 form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain. // Virology. — 1993. — V. 193.-P. 888-899.

29. Barret P.N., Dorner F., Plotkin S.A. // In: Vaccines, ed. Plotkin S.A. & Orenstein W.A., 1999 by W.B. Sauders Company.

30. Bazan J.F., Fletterick R.J. Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses. // Virology. 1989. - V. 171. - P. 637-639.

31. Bielefeldt-Ohmann H., Beasley D.W., Fitzpatrick D.R., Aaskov J.G. Analysis of a recombinant dengue-2 virus-dengue-3 virus hybrid envelope protein expressed in a secretory baculovirus system. // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78(11). - P. 27232733.

32. Blackwell J.L., Brinton M.A. BHK cell proteins that bind to the 3' stem-loop structure of the West Nile virus genome RNA. // J. Virol. 1995. V. 69. - P. 56505658.

33. Blackwell J.L., Brinton M.A. Translation elongation factor—1 alpha interacts with the 3' stem-loop region of West Nile virus genomic RNA. // J. Virol. — 1997. -V. 71. — P. 6433-6444.

34. Bock H.L., Klockmann U., Jungst C., Schindel-Kunzel F., Theobald K., Zerban R. A new vaccine against tick-borne encephalitis: initial trial in man including a dose-response study. // Vaccine. 1990. - V. 8. - P. 22-24.

35. Boege U., Heinz F.X., Wengler G., Kunz C. Amino acid compositions and amino-terminal sequences of the structural proteins of a flavivirus, European tick-borne encephalitis virus. // Virology. 1983. - V. 126. - P. 651-657.

36. Bohle В., Orel L., Kraft D., Ebner C. Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs induce low levels of TNF-alpha in human В lymphocytes: possible adjuvants for Thl responses. // J. Immunol. 2001. - V. 166(6). - P. 3743-3748.

37. Bonnet M.C., Tartaglia J., Verdier F., Kourilsky P., Lindberg A., Klein M., Moingeon P. Recombinant viruses as a tool for therapeutic vaccination against human cancers. // Immunol. Lett. — 2000. V. 74. - P. 11-25.

38. Brawner I. A., Trousdale M.D., Trent D.W. Cellular localization of Saint Louis encephalitis virus replication. // Acta Virol. 1979. - V. 23. - P. 284-294.

39. Bray M., Lai C.J. Dengue vims premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response. // Virology. 1991. - V. 185(1). - P. 505-508.

40. Brinton M.A., Fernandez A.V., Amato J. The 3'-nucleotides of flavivirus genomic RNA form a conserved secondary structure. // Virology. — 1986. — V. 153. — P. 113-121.

41. Cardiff R.D., Russ S.B., Brandt W.E., Russell P.K. Cytological localization of dengue-2 antigens: An immunological study with ultrastructural correlation. // Infect. Immun. 1973. - V. 7. - P. 809-816.

42. Cardosa M.J. Dengue vaccine design: issues and challenges. // Br. Med. Bull. 1998. - V. 54. - P. 395-407.

43. Chambers T.J., Hahn C.S., Galler R., Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression, and replication. // Ann. Rev. Microbiol. — 1990. — V. 44. -P. 649-688.

44. Chambers T.J., Nestorowicz A., Amberg S.M., Rice C.M. Mutagenesis of the yellow fever virus NS2B protein: effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication. // J. Virol. 1993. - V. 67(11). - P. 67976807.

45. Chen C.J., Kuo M.D., Chien L.J., Hsu S.L., Wang Y.M., Lin J.H. RNA-protein interactions: Involvement of NS3, NS5, and 3' noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 3466-3473.

46. Chen Y., Maguire Т., Hileman R.E., Fromm J.R., Esko J.D., Linhardt R.J., Marks R.M. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. // Nat. Med. 1997. - V. 3. - P. 866-871.

47. Chen W., Lin Y., Liao C., Hsieh S. Modulatory effects of the human heat shock protein 70 on DNA vaccination. // J. Biomed. Sci. 2000. -V. 7(5). - P. 412419.

48. Chu P.W., Westaway E.G. Molecular and ultrastructural analysis of heavy membrane fractions associated with the replication of Kunjin virus RNA. // Arch. Virol.-1992.-V. 125.-P. 177-191.

49. Chu P.W.G., Westaway E.G. Replication strategy of Kunjin virus: Evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. // Virology. 1985. - V. 140. - P. 68-79.

50. Cleaves G.R., Ryan Т.Е., Schlesinger R.W. Identification and characterization of type 2 dengue virus replicative intermediate and replicative form RNAs. // Virology.-1981.-V. 111.-P. 73-83.

51. Crooks A.J., Lee J.M., Easterbrook L.M., Timofeev A.V., Stephenson J.R. The NS1 protein of tick-borne encephalitis virus forms multimeric species upon secretion from the host cell. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 3453-3460.

52. Cui Т., Sugrue R.J., Xu Q., Lee A.K., Chan Y.C., Fu J. Recombinant dengue virus type 1 NS3 protein exhibits specific viral RNA binding and NTPase activity regulated by the NS5 protein. // Virology. 1998. - V. 246. - P. 409^17.

53. Elliott S.L., Pye S., Le Т., Mateo L., Cox J., Macdonald L., Scalzo A.A., Forbes C.A., Suhrbier A. Peptide-based cytotoxic T-cell vaccines: Delivery of multiple epitopes, help, memory and problems. // Vaccine. 1999. - V. 17. — P. 2009-2019.

54. Falgout В., Markoff L. Evidence that flavivirus NS1-NS2A cleavage is mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 7232-7243.

55. Falgout В., Miller R.H., Lai C.—J. Deletion analysis of Dengue virus type 4 nonstructural protein NS2B: Identification of a domain required for NS2B-NS3 proteinase activity. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 2034-2042.

56. Falgout В., Pethel M., Zhang Y.-M., Lai C.-J. Both nonstructural proteins NS2B and NS3 are required for the proteolytic processing of Dengue virus nonstructural proteins. // J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 2467-2475.

57. Falconar A.K.I., Young P.R., Miles M.R. Precise localization of sequential virus subcomplex and complex В epitopes on the nonstructural-1 protein. // Arch. Virol.-1994.-V. 137.-P. 315-326.

58. Fonseca B.A., Pincus S., Shope R.E., Paoletti E., Mason P.W. Recombinant vaccinia viruses co-expressing dengue-1 glycoproteins prM and E induce neutralizing antibodies in mice. // Vaccine. 1994. - V. 12(3). - P. 279-285.

59. Girgsdies O.E., Rosenkranz G. Tick-borne encephalitis: development of a paediatric vaccine. A controlled, randomized, double-blind and multicentre study. // Vaccine. 1996 - V. 14. - P. 1421-8

60. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., Blinov V.M. N-terminal domains of putative helicases of flavi- and pestiviruses may be serine proteases. // Nucleic Acids Res. 1989.-V. 17.-P. 3889-3897.

61. Grun J.B., Brinton M.A. Separation of functional West Nile virus replication complexes from intracellular membrane fragments. // J. Gen. Virol. 1988. — V. 69. -P. 3121-3127.

62. Guirakhoo F., Bolin R.A., Roehrig J.T. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. // Virology. 1992. - V. 191. - P. 921-931.

63. Guirakhoo F., Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C. Fusion activity of flavi viruses: Comparison of mature and immature (prM-containing) tick-borne encephalitis virions. // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 1323-1329.

64. Hahn C.S., Hahn Y.S., Rice C.M., Lee E., Dalgarno L., Strauss E.G., Strauss J.H. Conserved elements in the 3' untranslated region of flavivirus RNAs and potential cyclization sequences. // J. Mol. Biol. 1987. - V. 198. - P. 33-41.

65. Halstead S.B. Immune enhancement of viral infection. // Prog. Allergy. — 1982.-V. 31.-P. 301-364.

66. Halstead S.B. In vivo enhancement of dengue virus infection in rhesus monkeys by passively transferred antibody. // J. Inf. Dis. 1979. - V. 140;527-533.

67. Halstead S.B., Nimmanitya S., Cohen S.N. Observations related to pathogenesis of dengue hemorrhagic fever. IV. Ralation of desease severity to antibody response and virus recovered. // Yale J. Biol. Med. 1970. - V. 32. - P. 311-328.

68. Heinz F.X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. // Adv. Virus Res. -1986.-V.31.-P. 103-168.

69. Heinz F.X., Allison S.L., Stiasny K., Shalich J., Holzmann H., Mandl S.W., Kunz C. Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogens for vaccination against tick-borne encephalitis. // Vaccine. — 1995. — V. 13. P. 19361942.

70. Heinz F.X., Berger R., Tuma W., Kunz C. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. // Virology. 1983. - V. 126. - P. 525-537.

71. Heinz F.X., Kunz C., Fauma H. Preparation of a highly purified vaccine against tick-borne encephalitis by continuous flow zonal ultracentrifugation. // J. Med. Virol. 1980. -V. 6. - P. 213-221.

72. Holzmann H., Vorobyova M.S., Ladyzhenskaya T.P., Ferenczi E., Kundi M., Kunz C., Heinz F.X. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. // Vaccine. — 1992. V. 10(5).-P. 345-349.

73. Tshak R., Tovey D.G., Howard C.R. Morphogenesis of yellow fever virus 17D in infected cell cultures. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 325-335.

74. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W. High-level expression of the tick-borne encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: Protection elicited in a murine model. // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 2086-2095.

75. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W. Protection elicited by a replication-defective adenovirus vector expressing the tick-borne encephalitis virus non-structural glycoprotein NS1. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 2399-2402.

76. Jan L.R., Yang C.S., Trent D.W., Falgout В., Lai C.J. Processing of Japanese encephalitis virus non-structural proteins: NS2B-NS3 complex and heterologous proteases. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 573-580.

77. Kadare G., Haenni A.L. Virus-encoded RNA helicases. // J. Virol. 1997. — V. 71.-P. 2583-2590.

78. Kelly E.P., Greene J.J., King A.D., Innis B.L. Purified dengue 2 virus envelope glycoprotein aggregates produced by baculovirus are immunogenic in mice. // Vaccine. 2000. - V. 18. - P. 2549-2559.

79. Khromykh A.A., Kenney M.T., Westaway E.G. trans-complementation of flavivirus RNA polymerase gene NS5 by using Kunjin virus replicon-expressing BHK cells. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 7270-7279.

80. Khromykh A.A., Sedlak P.L., Westaway E.G. cis- and trans-acting elements in flavivirus RNA replication. // J. Virol. 2000. - V. 74(7). - P. 3253-3263.

81. Khromykh A.A., Sedlak P.L., Westaway E.G. trans-Complementation analysis of the flavivirus Kunjin ns5 gene reveals an essential role for translation of its N— terminal half in RNA replication. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 9247-9255.

82. Khromykh A.A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: Construction and applications. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 1497-1505.

83. Kliks S.C., Nimmanitya S., Nisalak A., Burke D.S. Evidence that maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1988. - V. 38. - P. 411^19

84. Ко K.K., Igarashi A., Fukai K. Electron microscopic observation on Aedes albopictus cells infected with dengue viruses. // Arch. Virol. — 1979. V. 62. — P. 4152.

85. Konishi E., Mason P.W. Proper maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane protein. // J. Virol. 1993. -V. 67.-P. 1672-1675.

86. Konishi E., Pincus S., Fonseca B.A., Shope R.E., Paoletti E., Mason P.W. Comparison of protective immunity elicited by recombinant vaccinia viruses that synthesize E or NS1 of Japanese encephalitis virus. // Virology. 1991. - V. 185. -P. 401-410.

87. Konishi E., Win K.S., Kurane I., Mason P.W., Shope R.E., Ennis F.A. Particulate vaccine candidate for Japanese encephalitis induces long-lasting virus-specific memory T lymphocytes in mice. // Vaccine. — 1997. V. 15. - P. 281—286.

88. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus. // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 733-740.

89. Kummerer B.M., Rice C.M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. // J. Virol. 2002. -V. 76.-P. 4773-4784.

90. Kunz C., Heinz F.X., Hoffman H. Immunogenicity and reactogenicity of a highly purified vaccine against tick—borne encephalitis. // J. Med. Virol. 1980. - V. 6.-P. 103-109.

91. Mackenzie J.M., Jones M.K., Young P.R. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication. // Virology. 1996. - V. 220. - P. 232-240.

92. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A. // Virology. 1998. - V. 245. - P. 203-215.

93. Mandl C.W., Heinz F.X., Stockl E., Kunz C. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. // Virology. 1989. - V. 173. - P. 291-301.

94. Markoff L., Falgout В., Chang A. A conserved internal hydrophobic domain mediates the stable membrane integration of the dengue virus capsid protein. // Virology. 1997. - V. 233. - P. 105-117.

95. Markoff L.J., Innis B.L., Houghten R., Henchal L.S. Development of cross-reactive antibodies to plasminogen during the immune response to dengue virus infection. // J. Infect. Dis. 1991. - V. 164. - P. 294-301.

96. Marth E., Kleinhappl В. Albumin is a necessary stabilizer of TBE-vaccine to avoid fever in children after vaccination. // Vaccine. 2001. - V. 20. - P. 532-537.

97. Mason P.W. Maturation of Japanese encephalitis virus glycoproteins produced by infected mammalian and mosquito cells. // Virology. 1989. - V. 169. - P. 354364.

98. Mathew A., Kurane I., Rothman A.L., Zeng L.L., Brinton M.A., Ennis F.A. Dominant recognition by human CD8+ cytotoxic T lymphocytes of dengue virus nonstructural proteins NS3 and NS1.2a. // J. Clin. Invest. 1996. - V. 98. - P. 16841691.

99. Matsumura Т., Shiraki K., Sashitaka Т., Hotta S. Morphogenesis of dengue-1 virus in cultures of a human leukemic leukocyte line (J-l 11). // Microbiol. Immunol. 1977. - V. 21. - P. 329-334.

100. Morozova O.V., Maksimova T.G., Bakhvalova V.N. Tick-borne encephalitis virus NS3 gene expression does not protect mice from homologous viral challenge. // Viral Immunol. 1999. - V. 12. - P. 277-280.

101. Murphy F.A. Togavirus morphology and morphogenesis. // In: The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. Schlesinger RW, eds. - 1980. - New York. - Academic Press - P. 241-316.

102. Murphy F.A., Harrison A.K., Gary G.W. Jr, Whitfield S.G., Forrester F.T. St. Louis encephalitis virus infection in mice. Electron microscopic studies of central nervous system. // Lab. Invest. 1968. - V. 19. - P. 652-662.

103. Murray J.M., Aaskov J.G., Wright P.J. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM. // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 175-182.

104. Nam J.H., Cha S.L., Cho H.W. Immunogenicity of a recombinant MVA and a DNA vaccine for Japanese encephalitis virus in swine. // Microbiol. Immunol. — 2002.-V. 46.-P. 23-28.

105. Ng M.L. Ultrastructural studies of Kunjin virus-infected Aedes albopictus cells. // J. Gen. Virol. 1987. - V. 68. - P. 577-582.

106. Ng M.L., Hong S.S. Flavivirus infection: Essential ultrastructural changes and association of Kunjin virus NS3 protein with microtubules. // Arch. Virol. 1989. -V. 106.-P. 103-120.

107. Ng M.L, Yeong F.M., Tan S.H. Cryosubstitution technique reveals new morphology of flavivirus-induced structures. // J. Virol. Methods. 1994. - V. 49. -P. 305-314.

108. Nowak Т., Wengler G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus. // Virology. 1987. - V. 156. - P. 127-137.

109. Ohyama A., Ito Т., Tanimura E., Huang S.C., Hsue J. Electron microscopic observation of the budding maturation of group В arboviruses. // Microbiol. Immunol. 1977. - V. 21. - P. 535-538.

110. Oliveira-Ferreira J., Daniel-Ribeiro C. Protective CD8+ T cell responses against the pre-erythrocytic stages of malaria parasites: an overview. // Mem. Inst. Oswaldo Crus. 2001. - V. 96. - P. 221-227.

111. Pan C.H., Chen H.W., Huang H.W., Tao M.H. Protective mechanisms induced by a Japanese encephalitis virus DNA vaccine: requirement for antibody but not CD8(+) cytotoxic T-cell responses. // J. Virol. 2001. - V. 75. - P. 11457-11463.

112. Parrish C.R., Coia G., Hill A., Mullbacher A., Westaway E.G., Blanden R.V. Preliminary analysis of murine cytotoxic T cell responses to the proteins of the flavivirus Kunjin using vaccinia virus expression. // J. Gen. Virol. — 1991. V. 72. -P.1945-1953.

113. Phillpotts R.J., Stephenson J.R., Porterfield J.S. Antibody-dependent enhancement of tick-borne encephalitis virus infectivity. // J. Gen. Virol. — 1985. — V. 66.-P. 1831-1837.

114. Porter K.R., Kochel T.J., Wu S.J., Raviprakash K., Phillips I., Hayes C.G. Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immuno-stimulatory motifs on antibody responses. // Arch. Virol. 1998. - V. 143. -P. 997-1003.

115. Preugschat F., Strauss J.H. Processing of nonstructural proteins NS4A and NS4B of dengue 2 virus in vitro and in vivo. // Virology. 1991. - V. 185. - P. 689697.

116. Proutski V., Gould E.A., Holmes E.C. Secondary structure of the У untranslated region of flaviviruses: Similarities and differences. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 1194-1202.

117. Pugachev K.V., Nomokonova N.Y., Dobrikova E.Y., Wolf Y.I. Site-directed mutagenesis of the tick-borne encephalitis virus NS3 gene reveals the putative serine protease domain of the NS3 protein. // FEBS Lett. 1993. - V. 328. - P. 115-118.

118. Putnak R., Fuller J., VanderZanden L., Innis B.L., Vaughn D.W. Vaccination of rhesus macaques against dengue-2 virus with a plasmid DNA vaccine encoding the viral pre-membrane and envelope genes. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003. - V. 68. P. 469-476.

119. Randolph V.B., Stollar V. Low pH-induced cell fusion in flavivirus-infected Aedes albopictus cell cultures. // J. Gen. Virol. 1990. - V. 71. - P. 1845-1850.

120. Randolph V.B., Winkler G., Stollar V. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein. // Virology. 1990. - V. 174. - P. 450-458.

121. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. Crystal structure of the envelope glycoprotein E from tick borne encephalitis virus. // Nature. — 1995. — V. 375.-P. 291-298.

122. С. M. Rice, E. M. benches, S. R. Eddy, S. J. Shin, R. L. Sheets, and J. H. Strauss. Nucleotide sequence of yellow fever virus: Implications for flavivirus gene expression and evolution. // Science. 1985. - V. 229. - P. 726-733.

123. Robertson J.S., Nicolson C., Riley A.-M., Bently M., Dunn G., Corcoran T. Assessing the significance of reverse transcriptase activity in chick cell-derived vaccines. //Biologicals. 1997. -V. 25. - P. 403-414.

124. Russell P.K., Brandt W.E., Dalrymple J.M. Chemical and antigenic structure of flaviviruses. // In: The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. Schlesinger RW, eds. - 1980. - New York. - Academic Press. - P. 503-529.

125. Saini M., Vrati S. A Japanese encephalitis virus peptide present on Johnson grass mosaic virus-like particles induces virus-neutralizing antibodies and protects mice against lethal challenge. // J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 3487-3494.

126. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

127. Shapiro D., Brandt W.E., Russell P.K. Change involving a viral membrane glycoprotein during morphogenesis of group В arboviruses. // Virology. — 1972. — V. 50.-P. 906-911.

128. Shi P.Y., Li W., Brinton M.A. Cell proteins bind specifically to West Nile virus minus-strand 3' stem-loop RNA. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 6278-6287.

129. Schmaljohn C., Custer D., Vanderzanden L., Spick K., Rossi C., Bray M. Evaluation of tick-borne encephalitis DNA vaccines in monkeys. // Virology. 1999. -V. 263.-P. 166-174.

130. Simmons M., Murphy G.S., Kochel Т., Raviprakash K., Hayes C.G. Characterization of antibody responses to combinations of a dengue-2 DNA and dengue-2 recombinant subunit vaccine. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001. - V. 65. -P. 420-426.

131. Stadler K., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by furin. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 8475-8481.

132. Stephenson J.R., Lee J.M., Bailey N., Shepherd A.G., Melling J. Adjuvant effect of human growth hormone with an inactivated flavivirus vaccine. // J. Infect. Dis. 1991. — V. 164.-P. 188-191.

133. Stephenson J.R. Wilton-Smith P., Lee J.M. Antigenic variation among members of the tick-borne encephalitis complex. // J. Gen. Virol. 1984. — V. 65. — P. 81-89.

134. Stiasny K., Allison S.L., Marchler-Bauer A., Kunz C., Heinz F.X. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 8142-8147.

135. Stocks C.E., Lobigs M. Posttranslational signal peptidase cleavage at the flavivirus C-prM junction in vitro. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 8123-8126.

136. Stocks C.E., Lobigs M. Signal peptidase cleavage at the flavivirus C-prM junction: Dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 21412149.

137. Tan B.H., Fu J., Sugrue R.J., Yap E.H., Chan Y.C., Tan Y.H. Recombinant dengue type 1 virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA— dependent RNA polymerase activity. // Virology. 1996. - V. 216. - P. 317-325.

138. Teo K.F., Wright P.J. Internal proteolysis of the NS3 protein specified by dengue virus 2. // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78. - P. 337-341.

139. Timofeev A.V., Butenko V.M., Stephenson J.R. Genetic vaccination of mice with plasmids encoding the NS 1 non-structural protein from tick-borne encephalitis virus and Dengue 2 virus. // Virus Genes. 2004. - V. 28. - P. 85-97.

140. Timofeev A.V., Kushch A.A., Vorovitch M.F., Tugizov S.M., Elbert L.B., Lvov D.K. A study of the NS3 nonstructural protein of tick-borne encephalitis virususing monoclonal antibodies against the virus. // Arch. Virol. — 1990. — Suppl. 1. — P. 119-124.

141. Trent D.W. Antigenic characterization of flavivirus structural proteins separated by isoelectric focusing. // J. Virol. 1977. - V. 22. - P. 608-618.

142. Valdes K., Alvarez M., Pupo M., Vazquez S., Rodriguez R., Guzman M.G. Human Dengue antibodies against structural and nonstructural proteins. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - V. 7. - P. 856-857.

143. Venugopal K., Jiang W.R, Gould E.A. Immunity to St. Louis encephalitis virus by sequential immunization with recombinant vaccinia and baculovirus derived PrM/E proteins. // Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 1000-1005.

144. Volpina O.M., Titova M.A., Zhmak M.N., Koroev D.O., Oboznaya M.B., Volkova T.D., Ivanov V.T. Structure prediction for peptides capable of induction antibody formation in mice. // Russian J. of Bioorg. Chemistry 2002. - V. 28. - P. 387-395.

145. Wang S., He R., Anderson R. PrM- and cell-binding domains of the dengue virus E protein. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 2547-2551.

146. Wengler G., Wengler G. Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release. // J. Virol. 1989. - V. 63. - P. 2521-2526.

147. Wengler G., Wengler G. The NS 3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. // Virology 1993. - V. 197. - P. 265-273.

148. Wengler G., Wengler G., Gross H.J. Studies on virus-specific nucleic acids synthesized in vertebrate and mosquito cells infected with flaviviruses. // Virology — 1978. V. 89. - P. 423-437.

149. Whitfield S.G., Murphy F.A., Sudia W.D. St. Louis encephalitis virus: An ultrastructural study of infection in a mosquito vector. // Virology. 1973. - V. 56. -P. 70-87.

150. Whitton J.L., Sheng N., Oldstone M.B., McKee T.A. A "string-of-beads" vaccine, comprising linked minigenes, confers protection from lethal-dose virus challenge. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 348-352.

151. Winkler G., Heinz F.X., Kunz C. Studies on the glycosylation of flavivirus E proteins and the role of carbohydrate in antigenic structure. // Virology. 1987. — V. 159.-P. 237-243.

152. Winkler G., Maxwell S.E., Ruemmler C., Stollar V. Newly synthesized dengue-2 virus nonstructural protein NS1 is a soluble protein but becomes partially hydrophobic and membrane-associated after dimerization. // Virology. 1989. - V. 171.-P. 302-305.

153. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan Т.Е., Stollar V. Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural protein NS 1 is a dimer. // Virology. -1988.-V. 162.-P. 187-196.

154. Wu C.J., Huang H.W., Tao M.H. Induction of cross-protection against two wild-type Taiwanese isolates of Japanese encephalitis virus using Beijing—1 strain DNA vaccine. // Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 3938-3945.

155. Wu H.C., Huang Y.L., Chao T.T., Jan J.T., Huang J.L., Chiang H.Y., King C.C., Shaio M.F. Identification of B-cell epitope of dengue virus type 1 and its application in diagnosis of patients. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 977982.

156. Wu H.H., Chen C.T., Lin Y.L., Lee S.T. Sub-fragments of the envelope gene are highly protective against the Japanese encephalitis virus lethal infection in DNA priming—protein boosting immunization strategies. // Vaccine. — 2004. V. 22. — P.

157. Wu S.C., Yu C.H., Lin C.W., Chu I.M. The domain III fragment of Japanese encephalitis virus envelope protein: mouse immunogenicity and liposome adjuvanticity. // Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 2516-2522.

158. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Formation of the flavivirus envelope: Role of the viral NS2B-NS3 protease. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 1995-2003.

159. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Processing of the intracellular form of the West Nile virus capsid protein by the viral NS2B-NS3 protease: An in vitro study. // J. Virol. 1994. -V. 68. - P. 5765-5771.

160. Yamshchikov V.F., Compans R.W. Regulation of the late events in flavivirus protein processing and maturation. // Virology. 1993. - V. 192. — P. 38-51.793.800.

Информация о работе

Хоретоненко, Михаил Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы