Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная и функциональная организация нетранслируемых областей генома пикорнавирусов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная организация нетранслируемых областей генома пикорнавирусов"
московский государственный университет
ИМЕНИ М.Б. ЛОМОНОСОВА
на правах рукописи
удк 576.852.23:547.963.3
1ШИПЕНКО Евгевйй Вячеславович:
структурная и функциональная организация нетранслирувш областей геном пикорнаеирусов
ОЗ.ОО.ОЗ - молекулярная биология
диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
москва 1994
Работа выполнена в лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН
Научный консультант:
член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор
В. И. Агол
Официальные оппоненты:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор
А. с. спирин
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор
Н. В. Каверин
доктор химических наук И. Н. [Датский
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии
на заседании Специализированного совета Д.053.05.70 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва Б-234, Воробьевы горы, МГУ, ГОШ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан " /)Н6АРЛ 1995 г.
им. В. А. Энгельгардта РАН
Защита состоится " " ФЕВРАЛЯ 1995 г. в
часов
Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук
В. Н. Кагрэмансв
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.1 Актуальность проблемы
Проблема реализации генетической информации является одной из сновных в молекулярной биологии. Экспрессия гена осуществляется осредством транскрипции и трансляции. При трансляции одной из сновных стадий, определяющих эффективность перевода генетической нформации от МРНК к белку, является стадия инициация. До недавнего ремени господствовала точка зрения, что инициация трансляции у сех эукариотических мРНК идет по одному механизму: взаимодействие >яда эукариотических факторов инициации трансляции с кэп-структурой [РНК опосредует присоединение 40э рибосомальной субъединицы ^посредственно к 5'-концевому сегменту РНК. После этого ;убъеднница непрерывно движется в 3'-направлении ("сканирует") |Доль 5'-нетранслируемой области (5-НТ0) РНК до первого ¡нициаторного ко дона (аш в контексте рцрурулшри, где подчеркнуты ¡акболее важные позиции, влияющие на эффективность инициации трансляции на данном дис). Затем происходит сборка рибосомы и гачинается синтез белка.
Определение первичной структуры многих эукариотических генов лишило новый класс эукариотических мРНК (около 10% от общего тела), либо не имеющих кэп-структуры либо обладающих протяженной (от 300 до 2000 нуклеотидов) 5-НТО с многочисленными инициаторными содонами в ней. При этом синтез белка начинается лишь с удаленного стартового кодона, игнорируя все предыдущие дао триплеты. Наличие тодобных мРНК противоречило общепринятому механизму инициации ¡трансляции. Было выдвинуто предположение о существовании для некоторых мРНК данного класса альтернативного кэп-независшого механизма внутренней инициации трансляции (БИТ), заключающегося в присоединении 40э рибосомальной субъединицы (либо рибосомы) к внутреннему сегменту 5-НТ0 мРНК. Такая посадка, вероятно, опосредована многоточечным взаимодействием рибосомы с некими цис-элементами матрицы. Поэтому, выявление структурных и функциональных особенностей организации подобных цис-элементов способствовало бы пониманию нового механизма инициации трансляции. Помимо фундаментального значения в понимании механизмов реализации генетической информации и ее регуляции, подобные исследования представляют и чисто практический интерес, поскольку многие вирусные геномы, онкогены, гены, определяющие тканевую дифференцировку и т.д. кодируют мРНК с предполагаемой БИТ.
Перспективным объектом в изучении механизма ВИТ является семейство пикорнавирусов, вызывающих многие заболевания человека и животных, проявляющиеся в виде энцефалитов, менингитов, миокардитов, гепатитов, обычных простуд и т.д.. Геном пикорнавирусов представляет из себя одноцепочечную РНК положительной полярности, длиной 7500-8000 нуклеотидов, которая является матрицей для синтеза всех вирус-специфических белков, кодируемых в единой открытой рамке считывания. Пикорнавирусная РКК имеет протяженную 5-НТО (от 600 до 1100 нт) с многочисленными aug триплетами. Правильность выбора объекта была подтвервдена впоследствии - именно на примере пикорнавирусов впервые было доказано существование неканонического механизма BLIT. Определение структурных и функциональных особенностей центральной части 5-НТО РНК пикорнавирусов значительно способствовало бы детальному изучению механизма ВИТ и, обусловленной ею, эффективности репродукции вирусов в различных системах.
Изучение структурных особенностей концевых фрагментов НТО РНК (как 5'-, так и 3'-) пикорнавирусов также предсталяет большой научный и практический интерес, поскольку эти участки РНК вовлечены в процесс репликации вирусного генома. Знание пространственной организации этих цис-элементов позволит целенаправленно планировать исследования механизма репликации.
На основе фундаментальных знаний о строении и функциональной значимости отдельных элементов НТО РНК пикорнавирусов открываются перспективы в разработке новых эффективных вакцин и других противовирусных препаратов.
I.1 Цель и задачи исследования
Основная цель работы состояла в определении вторичных структур НТО РНК пикорнавирусов, выявлении потенциальных третичных взаимодействий, анализе общих и специфических особенностей организации НТО РНК у различных представителей пикорнавирусов и в выявлении функционально важных трансляционных цис-элементоз 5-НТО РНК пикорнавирусов посредством создания новых рекомбинантных геномов и их детального изучения ¿n vítro и in vivo. При этом были поставлена и решались следующие задачи:
I. Построение на основе филогенетического анализа консенсускых (для больших групп представителей пикорнавирусов) моделей вторичных структур функционально зажных сегментов НТО.
Z. Экспериментальное подтверждение построенных моделей укладки
РНК ка примере ряда представителей каждой структурной группы.
3. Выявление локальных различий в организации НТО внутри каждой группы вирусов, имеющих обще элементы вторичной структуры, и анализ их возможного происхождения.
4. Поиск возможных консенсусшх третичных взаимодействий в НТО РНК пикорнавирусов.
5. Создание рекомбинантных геномов у представителей групп пикорнавирусов, имеющих различную структурную организацию 5-НТО РНК. Их детальное изучение с целью выявления функционально важных цис-элементов, вовлеченных в процесс ВИТ.
6. Выявление общих закономерностей выбора места посадки рибосомы на внутренний сегмент РНК в процессе ВИТ.
1.3 Научная новизна и практическая ценность работы
На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей РНК около тридцати представителей семейства пикорнавирусов были построены два типа консервативных вторичных структур для сегментов 5-НТО РНК (длиной около 500 нуклеошцов), обеспечивающих ВИТ у пикорнавирусов. Эти сегменты получили навание "'внутренний сегмент присоединения рибосомы", (ires). Было показано, что из четырех родов семейства пикорнавирусов, энтеро-(дредставигели - вирусы полиомиелита, коксакивирусы) и риновирусы (возбудители острых респираторных заболеваний) - 3?-группа - имеют один тип укладки ires'a; в то время как кардио- (представители -вирус энцефадомиокардита мышей, вирус энцефаломиелита мышей Тейлера) и афтовирусы (вирусы ящура) - КА-грулпа - имеют другой. ires'h ЭР- и КА-групп не имеют никакого сходства на уровне первичной и вторичной структур РНК, и, следовательно, одна и та же функция - присоединение рибосомы к внутреннему участку РНК - может обеспечиваться различными цис-элементаш РНК. Предложенные модели вторичных структур РНК были экспериментально подтверждены методами ферментативного и химического зондирования одно- к двуцепочечных участков РНК на примере ряда представителей ЭР- и КА-групп. На основе структурных данных было предложено объяснение аттенуирувдих мутаций в 5-НТО РНК полиовируса типов I и 3 с точки зрения ослабления консервативных элементов вторичной структуры. Это предположение было впоследствие подтверждено как нашим анализом реверсий в природных изолятах вируса полиомиелита, так и при целенаправленном ослаблении структурных элементов ires'а в работах других авторов.
С помощью филогенетического анализа РНК представителей ЭР-группы были выявлены потенциальные участки третичных взаимодействий, в ■случае реализации которых ires приобретал бы дзухдолъную пространственную конфигурацию. Предложенные взаимодействия консервируются у всей ЭР-группы и хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными по зондированию РНК, Интересно, что аттенуируюцдае мутации полиовируса типа 2 локализованы внутри одного из районов потенциальных третичных взаимодействий и приводят к .уменьшению его термодинамической стабильности, что, возможно, влияет на эффективность трансляции его РНК (особенно, в нервной ткани).
На основе анализа первичной структуры РНК били построены и экспериментально подтверждены вторичные структуры 3-КТО РНК у эктеро- и риновирусов. У знтеровирусов найдено консервативное третичное взаимодействие (аналогичное связи между d и т петлями тРНК), способное образовать каркас Г-обрэзной пространственной конфигурации терминального сегмента РНК. В 5' -концевом, "репликативном" сегменте 5-НТО РНК ЭР-группы, имеющем консервативную "клеверообразяую" вторичную структуру, было найдено аналогичное третичное взаимодействие. Выдвинута гипотеза о сходной, тРНК-полобной пространственной организации 5'- и 3'- цис-сегментов КТО ЭР-группы, вовлеченных в процесс репликации генома пикорнавирусов.
Наряду со сходством в строении ires'ob и "репликзтявяых" сегментов геномов разных пикорнавирусов были обнаружены некоторые межродовые и внутриродовые различия в организации их НТО. Рыла выдвинута и обоснована гипотеза об эволюции НТО РНК пикорнавирусов посредством дупликаций ее отдельных участков и целых доменов. Полученные данные можно использовать в эволюционных построениях.
Существенно различаясь по нуклеотидной последовательности и имея различные типы укладки ihes'ob, геномы всех пикорнавирусов имеют схожий элемент в 3'-концевом фрагменте 5-НТО. Этот элемент состоит из олигопиримидина и - на расстоянии 20-24 нуклеотвдов от него - aug триплета ("молчащего" для ЭР-группы и инициаторного для КА-группы). Было выдвинуто . предположение о значимости этого элемента для ВИТ- и связанных с ней инфекционности и репродуктивной способности пикорнавирусов.
Для проверю! данной гипотезы на основе полиовируса типа I, штамм Mahoney (представителя ЭР-групш), было создано более 20
рекомбинантных геномов с делениями, вставками и точечными нуклеотиднкми заменами в области тандема олигопиримидик/молчащий äug. Были- изучены матричные активности рекомбинантных РНК, инфекционность и бляшечный фенотип мутантов. От ряда мутантяых вирусов с ухудшенной репродуктивной способностью было отобрано и изучено более 40 различных псездоревертантов с частичным восстановлением функциональной активности. Была определена первичная структура РНК всех ревертантов в районе тандема олигопиримидин/AüG. На основе этих данных был охарактеризован новый трансляционный регуляторный цис-элемент РНК, определяющий эффективность ВИТ - тандем олигохшримидина (комплементарного 3'-кинцу lös риоосомальной РНК) и aus (молчащего лиоо инициаторного) на определенном (15-30 нуклеотидов) расстоянии от него. Выдвинута гипотеза о сходстве ВИТ эукариотических мРНК с прокариотической инициацией трансляции. При этом, у эукариотических матриц имеются два существенных отличия: во-первых,, помимо тандема олигопиришдин/AUG, необходимо наличие примыкающего к нему протяженного цис-элемента (ires'а), и, во-вторых, aug выступает в роли сигнала, не обязательно означающего начало белкового синтеза (трансляция начинается только в том случае, когда aug имеет книциаторный контекст). Поскольку все представители ЭР~группы имеют одинаковую ' с полиовирусом структуру ires'а, вышеизложенные результаты были экстраполированы на всю группу, что в дальнейшем получило подтверждение в работах других авторов на отличных от полиовирусэ объектах.
Для изучения роли тандема олигсггаримидин/aug у КА-группы в качестве объекта был выбран вирус энцефаломиелита мышей Тейлера (ВЭМТ), штаммы gdvii к веАп. Создано более 30 рекомбинантных геномов по стратегии, использовавшейся при изучении полковируса. Изучены матричные активности мутантных РНК в двух бесклеточшх белок-синтезирующкх системах и их инфекционность, стабильность и фенотип рекомбинантных зкрусов в культуре клеток вкк-21. Было показано, что в этих системах тандем олигошфимидин/aug не играет существенной роли в посадке рибосомы на внутренний участок РНК ВЭМТа.
Поскольку тандем олигопщзишдин/инициаторшй aug зволюционно консервируется у всей КА-группы, было выдвинуто предположение о его возможной значимости для эффективности ВИТ и, следовательно, для размножения вируса, в некоторых специализированных системах,
например, таких, как нервная ткань. Была изучена нейровирулентность около 20 различных рзкомбинантных вирусов вирулентного штамма gdvii ВЭМТ, имеющих различные мутации в РНК в области тандема олигопиримидин/AUG. Было изолировано более дюжины различных псевдоревертантов от ряда аттенуированных мутантов, определена первичная структура .их РНК, для некоторых изолятов исследована вирулентность. В результате была доказана необходимость тандема олигопиримидин/aug в геноме ВЭМТ для размножения в нервных клетках мышей. Таким образом, впервые была показана тканеспецифичность зтого трансляционного цис-элемента.
На основании совокупности данных была выдвинута и обоснована
"ПТЛТТУЛ ТЧО Q О, С\ 7ТО/Ч CXVf'ffr ~Г\Г\ ТТТ7Г m О 3 * * 2 о jitip^itirciiiyuil^jxil/auc hjpj* посадгсс
рибосомы на внутренний сегмент РНК в процессе ВИТ. Функциональная значимость тандема проявляется по разному, с одной стороны, в одной ' и той же трансляционной системе, если тандем примыкает к разным типам ires'ob (ЭР- либо КА-группы), а, с другой стороны, в различных трансляционных системах у одного и того же объекта.
На примере ВЗМТ было доказано, что при посадке рибосомы существует лишь один, жестко фиксированный в пространстве внутренний локус РНК, с которого рибосома способна начать движение вдоль РНК (будь то поиск aug или синтез белка). Для зтого участка РНК было обосновано и введено понятие стартового окна (СО) -отдельного функционального цис-элемента РКК, принимающего участие в ВИТ. Была разработана стратегия идентификации СО у матриц с ВИТ; для ВЭМТа были определены размер, локализация и особенности строения СО; показано взаимоотношение между ires'om и СО. Введенное понятие является универсальным для всех мРНК с ВИТ.
Предложена и обоснована общая для всех пикорнавирусов (а, возможно, для всех РЖ с BITE) модель посадки рибосомы на внутренний участок РНК.
Полученные данные по структурной организации нетранслируемых областей пикорнавирусов широко используются при изучении рож структурных элементов в инициации трансляции и репликации, при выявлении РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе этих механизмов, также как и при изучении агтенуации вирусов. Обнаружение тканеспецифического элемента, играющего большую роль в аттенуации вирусов, дает новый перспективный подход к созданию вакцин для ряда вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и животных. ■ '
б
1.4 Апробация работы
Материалы работы были доложены и обсуждены на и двустороннем советско-американском симпозиуме "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 1989); Международных съездах, симпозиумах и конференциях: "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), "Регуляция трансляции в вирус-инфицированных клетках животных" (Мадрид, 1991), "Биосинтез белков" (Пущино, 1991), "Трансляционный контроль" (Колд Спринт Харбор, 1992 и 1994), "Генетическая рекомбинация и дефектные интерферирующие частицы у РНК-содержащих вирусов" (Мадрид, 1994), "Молекулярная биология пикорнавирусов" (Корпилампи, Финляндия, 1994); на тх Международном Вирусологическом Конгрессе (Глазго, 1993), ш Всероссийской конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1993), а также на семинарах в МГУ, Кембриджском университете и Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.
1.5 Использованные сокращения
5- и 3-КТО - 5' и 3'-нетранслируемая область; ВИТ - внутренняя инициация трансляции; ires - внутренний сегмент присоединения рибосомы; СО - стартовое окно; ЭР (-группа) - группа энтеро- и риновирусов; КА (-группа) - группа кзрдио- и афтовирусов; ВЭМТ -вирус энцефаломиелита мышей Тейлера; ВЭМК - вирус энцефаломкокардита мышей; ОРС - открытая ража считывания; РЛК -ретикулоцитный лизат кроликов; нт - нуклеотид(ы); ТГЩго - 5C?i тканевая цитопатогенная доза; ЦДбо - 50% патогенная доза.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НЕТРАНСЛИРУЕШХ ОБЛАСТЕЙ РНК СЕМЕЙСТВА ПИКОРНАВИРУСОВ
2,1 Основные теоретические и экспериментальные подходы
Объектом для этой части работы являлись все известные в то время первичные структуры НТО РНК различных пикорнавирусов. Для обнаружения сходства и различий з организации НТО применялся филогенетический анализ. Выделяли группа вирусов с достоверным сходством первичных структур в том или ином сегменте НТО. Для этих групп было проведено выравнивание нуклеотэдных последовательностей друг относительно друга с целью получения максимального сходства внутри каждой группы.
Отцравным пунктом для построения моделей вторичных структур в различных сегментах НТО являлось предположение об их универсальности для всей группы вирусов со сходкой первичной структурой РНК, поскольку было резонно предположить, что сходные функции должны быть опосредованы одинаковыми типами РНК-белковых взаимодействий. Построенные с помощью сравнительного анализа модели укладки НТО имеют консервативные элементы вторичной структуры, причем сохранение двуцепочечных участков в геномах разных вирусов анализируемой группы обеспечивается не только за счет консервативных пар нуклеотидов, но и посредством компенсаторных замен (замена одной Уотсон-Криковской пары на другую в одном и том же участке дуплекса РНК).
Одноцегочечные участки вторичной структуры подвергались дополнительному сравнительному анализу на возможность образования консенсусных третичных взаимодействий.
Лля проверки построенных моделей применяли метод ферментативного и химического зондирования одно- и двуцепочечных участков РНК: целостную РНК из очищенного вируса обрабатывали либо нуклеазами, вносящими специфические разрывы в выпетленных [в дуплексе] участках, либо химическим реагентом, специфически модифицирующим одноцепочечные основания. Условия обработки были подобраны таким образом, чтобы в среднем один разрыв (модификация) приходился на 150-250 нт; таким образом, в результате обработки каждым реагентом получался набор фрагментов с разрывами (модификациями) после каждого доступного основания. Для их идентификации на полученном препарате проводили обратную транскрипцию (параллельно с реакциями определения нуклеотидной последовательности) с помощью ДНК-затравки и с использованием изотопных нуклеозидтрифосфатов, с последующим разделением в полиакриламидном геле. Теоретические модели проверяли на примере нескольких различных вирусов каждой группы.
2.2 Вторичная структура центральной части 5-НТО знтеро-_и
риновирусов и функциональная значимость ее отдельных элементов Пикорнавирусные 5-Н10 отличаются друг от друга как по длине, так и по первичной структуре. Тем не менее, при сравнении опубликованных нуклеотидных последовательностей геномов энтеро- и риновирусов (ЭР-группа) был обнаружен протяженный участок (около 400 нт), з котором было возможно надежно провести выравнивание. Для
анализа были использованы первичные структуры РНК полиовирусов типа I (штаммов Mahoney И LSc 2ab) , ТИПЭ 2 (штаммов Р712 ch 2аъ и Lansing), типа 3 (ШТЙММОВ Leon/37 И 119, Leon 12 а^ И 23127), коксакивирусов ТИПОВ В1, ВЗ и В4, риновирусов ТИПОВ IB, 1А, 2, 14 и 89, бычьего энтеровируса.
С помощью сравнительного метода была построена модель вторичной структуры центрального сегмента 5-НТО. Соображения термодинамической стабильности также принимались во внимание. Модель представлена на рис. I. Последовательность между нуклеотидами 236 и 628 организована в форме трех отдельно стоящих доменов. Основные черты этой модели полностью консервируются у гСшСлсгнчЕшд сегментов других ЭР геномов. При этом организация домена I поддерживается в основном посредством компенсаторных замен, в то время как домены 2 и 3 имеют значительное количество консервативных пар, что позволит ниже выдвинуть ряд предположений о функциональной значимости этих пар.
С А С J с G U G д 5
V • А
С • Ч С- > с
UACAtlSAi AUÖUACUC—
ASUCUG.-, АС CACUÖ
4SQ С U
С/»'0
с' а
'Рис. I. Консервативная модель втошчной структуры
центральной части 5-НТО ЭР-групхы на примере пслиовируса типа 3 штамма
Leon/3 7 (236-616 HT).
Эта модель была проверена с помощью методов химической модификации и нуклеазной обработки. Чувствительность к нуклеазе Б1 и модификации даметилсульфатом служила доказательством
\
(3 G G С С О
CCUG
неспаренности нуклеотидов, в то время как подверженность расщеплению нуклеазой cv свидетельствовала о существовании двуцепочечной структуры. Этигли методами были исследованы РЖ пяти штаммов полиовируса (LSc 2аЬ, Mahoney, Р712 ch 2ab, Leon 12 а^, Leon/37) и коксакивирус штамма в1. Полученные данные хорошо соответствовали предсказанной модели укладки РНК.
К началу работы было известно, что некоторые замены нуклеотидов в центральной части 5-НТО РНК полиовирусов приводят к значительному снижению нейровирулентности вируса и эффективности трансляции таких матриц in v-ítro. После построения модели вторичной структуры РНК было обнаружено, что две таких замены (транзиция a4¡¡o на G у вакцинного штамма lsc типа I и транзиция с472_ на и у вакцинного штамма Leon 12 ахь типа 3) приводят к разрушению либо уменьшению стабильности консервативных пар А480~и5г5 (нумерация полиовируса типа I) и c47z-g (нумерация полиовируса типа 3) домена 2. Рыло выдвинуто предположение, что именно уменьшение стабильности важных элементов вторичной структуры РНК, а не замены нуклеотидов сами по себе, приводит к изменению фенотипа вирусов и снижению матричной активности их РЖ,
Подтверждение выдвинутой гипотезы было получено при изучении изолятов после вакцинации Сзбиновским штаммом типа I (lsc гаь). Мз шести изолятов в трех случаях наблюдали обратную реверсию g48o на а с восстановлением исходной а-о пары, а в трех других случаях была обнаружена транзиция и на с, в результате которой образуется g-c пара вместо исходной а-и. Было показано, что восстановление пары тем либо другим способом приводит к повышению матричной активности РНК изолятов до уровня таковой у вирулентного штамма (Mahoney). Тем самым подтверждалась гипотеза о влиянии элементов вторичной структуры на репродуктивную способность вируса и его матричную активность. В работе skinner et ai. (1989) была доказана важность стабильности и ряда близлежащих пар, выделенных наш как потенциально зажные элементы вторичной структуры,
У всех, без исключения, представителей энтеро- и риновирусов, первичная структура геномов которых была определена позднее, укладка центрального сегмента 5-НТО РНК полностью совпадает с предложенной моделью.
Параллельно с нами близкая модель укладки была теоретически предсказана В работе Rivera et al. (1988).
Одновременно с построением данной модели Peiletier and sonenberg (1988) доказали наличие ВИТ у полиовируса (а позднее ВИТ была доказана у рино- и коксакивирусов). Границы цис-элемента, обеспечивающего посадку рибосомы на внутренний участок РНК, в основном совпадали с сегментом, для которого была построена консервативная модель вторичной структуры.
2.3 Модель вторичной структуры центральной части 5-НТО РНК кардио- и афтовирусоз
Первичные структуры 5-НТО РНК кардио- и афтовирусов (КА-группа), с одной стороны, и ЭР-группы, с другой, сильно различаются. Было выдвинуто предположения; что представители КА-гр.уппы также могут иметь общую, но иную модель вторичной структуры этого района.
Для анализа были взяты все опубликованные к тому времени первичные структуры 5-НТО РНК кардиовирусов - вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМК) (штаммы rrr, в и d), менговируса, ВЭМТ (штаммы gdvii, da И веап 83 36) - и афтоеирусов - вирусов ящура, штаммы а 119, а, 6i и о . Трудность построения
1 2 X О 1 Кэш
консервативной модели укладки РНК заключалась в том, что з 5-НТО кардиовирусов и афтовирусов было найдено лишь несколько относительно небольших участков, имеющих достоверное сходство по первичной структуре. С помощью сравнительного анализа для гомологичных участков были выведены консервативные элементы вторичной структуры, обозначенные зс и лс на рис. 2. Далее, модели вторичных структур всего центрального сегмента 5-НТО (около 450 нуклеотидов) для кардио- и афтовирусов строились раздельно, исходя из внутриродовых элайнментов. Когда эти модели были построены, оказалось, что, несмотря на существенные различия в последовательностях нуклеотидов, кардио- и афтовирусы имеют общую (консенсусную) пространственную конфигурацию центрального сегмента 5-НТО БНК (рис. 2).
Модель была экспериментально проверена методами химического и ферментативного зондирования одно- (диметилсульфат и нуклеаза si) и двуцепочечных (нуклеаза cv) участков на примере РНК ВЭМК штамма rrr для всего центрального сегмента и ВЭМТ штамма gd vii для доменов 4 и 5. Экспериментальные данные хорошо согласовались с теоретической моделью.
Для ряда пикорнавирусов (как КА-группы, так и
Ii
неклассифицированного по первичной структуре вируса echo 22),
геномы которых были расшифрованы позднее, вторичная структура РНК
также могла быть описана в рамках предложенной модели.
"зс"
- G — Па ■ С
•С А Г
С A A G G А
G U И С С U
G G G U G С ! . * ЗИЛ
G U С С (AGO
G't G-C
д>и— no G • С
/ эго
с
"3V"5 и
, и й
G G А
"1"
. А С а
U *А U *А С-С G • С
G •С ш G U С a G а С ■ G
и •А / А и НО—U-A
С G / С G , и»А
С G И си С А С ft
G И С ■ G
С •G А ;; * G С С "G
С G G U 180
«С —и •G 340—С 5 / j и
С •G с и A U
G А А* •U G G А
с С А И С А • li
G G •С А С G G • U
ч U0 и" UA '* С ■и u J С " G G ill С и с О'С «"« »(■(
А «и ii А
С G U А G-C
G ■и 'J А МО G • С
и • А — 360 G С \ А * У
__G •С и и G А С и 0 G \ и G А С " G
G U G С С А С G
J л
220 —-
С
С
. с
V«-
с
С G
с ии
с и" и
А А А
С
и— гоо
с
и и с
С . G A A-U ,
G • С С -G С • G • С • G
'«•А G*U G -С A-U ,
0 С
^С и G G G С U U
G А С С С G А А 6,1 » i I
I
го
A G G U G U С С А С
С С G G G ОС С
С"5"
С А С G G
Рис. 2. Консенсусная для КА-группы модель укладки центральной части 5-НТО, примыкающей к стартовому кодону. Номера нуклеотидов соответствуют расстоянию от стартового кодона. Представлена вторичная структура РНК вируса ящура, штамм А12Ц9. В кавычках указаны номера доменов; домены 3 и 4 подразделены на консервативный (с) и вариабельный (V) субдомены.
Одновременно с нашей работой по построению модели вторичной структуры РНК Jang et al. (1988) доказали ВИТ у кардиоЕирусов на примере ВЭМК (а позднее ВИТ была доказана у ВЗМТ и вируса ящура).
ires, обеспечивающий кэп-независимую посадку рибосомы на матрицу, соответствовал сегменту, включающему домены 2-5 консенсусной для КА-группы модели укладки РНК. Позднее было показано, что минимальные нарушения в наиболее консервативных структурных элементах ЗС, 4С и 5 приводят практически к полной инактивации iresa.
2.4 Вероятная компактная структура цис-активного трансляционного элемента в 5-НТО РНК знтеро- и риновирусов
Предыдущие исследования выявили, что ires пикорнавирусов, обеспечивающий независимое от кэпа внутреннее присоединение
рйийСОмЫ К РНК, ИмббТ Д35 хЖм УКЛЭДКЙ. ПОСКОЛЬКУ реГуЛЯТОрВЫЙ
цис-элемент РНК включает несколько сот оснований, и мутации в его различных частях изменяют трансляционную активность вирусной матрицы (а также фенотип вируса), скорее всего, ires должен иметь компактную третичную структуру. В качестве первого шага на пути к выявлению этой структуры был также использован эволюционный подход.
Сначала была выведена коясенсусная для ЭР-группы модель вторичной структуры сегмента генома с координатами 104-235 (нумерация РЖ полиовируса типа 3), не включенного в предыдущий анализ. В этом сегменте выявляются два домена, каждый из которых содержит три спиральных элемента. Модель была экспериментально подтверждена методом зондирования одно- и двуцепочечных участков на примере РЖ полиовирусов типов I и 3. Это позволило вывести консенсусную для ЭР РЖ модель вторичной структуры центральной части 5-НТО (-500 нт), охватывающей весь цис-активный трансляционный регуляторный элемент (ires) (рис. 3).
Для анализа потенциальных третичных взаимодействий были отобраны участки, предположительно находящиеся в одноцепочечном состоянии. Была изучена возможность комплементарного взаимодействия между каждой парой таких участков. Было обнаружено, что для девяти пар участков комплементарность консервируется у всех известных энтеро- и риновирусов (около 30 геномов); один из таких участков (№2) имел двух потенциальных партнеров. Расположение участков третичных взаимодействий представлено на рис. 3. Если реализуется хотя бы часть из этих третичных взаимодействий, ires ЭР-группы должен принять компактную "квззиглобулярную" структуру. Последний домен (Е), по-видимому, не связан третичными взаимодействиями с предшествующими элементами РКК. Таким образом, ЭР ires имеет как бы
"двудольную" организацию: одна "доля" включает домен Е, а вторая -
Рис. 3. Консенсусная для ЭР модель вторичной структуры ires'а и потенциальные третичные взаимодействия. Дана структура для полиовируса типа I, штамм Mahoney, координаты 104-625. Числа со знаком "прим" и без него соответствуют взаимно комплементарным участкам.
Экспериментальные данные, полученные при проверке вторичной структуры РНК, достаточно хорошо коррелируют с возможностью спаривания потенциальных участков третичных взаимодействий: во-первых, эти участки практически недоступны действию одноцепочечных реагентов, а, во-вторых, некоторые из них проявляют чувствительность к двуцепочечшм.
Хотя предложенную модель следует рассматривать как первое приближение к реальной пространственной организации РНК, ее можно эффективно применять для интерпретации влияния "парных" нуклеотидвых замен на фенотип вируса. При изучении изолятов, отобранных после вакцинации Сэбиновским штаммом P7i2 ch 2аъ полиовируса типа 2, мы обнаружили ковариацию между нуклеотидэми в положениях 398 (участок 8 на рис. 3) и 481 (участок 8'): в то время как в РЖ вакцинного штамма Сэбина, вероятно, реализуется третичная связь и-а, большинство нейровирулентных ревертантов этого вируса
претерпевают мутации в двух отдаленных друг от друга позициях ires'а, что позволяет им образовать третичную c-g пару, обладающую большей стабильностью (заметим, что в большинстве ЭР-геномов закрепляется именно c-g пара). Матричная активность РНК таких изолятов in vitro значительно выше, чем у штамма СэСина. Эти данные, хотя и косвенно, свидетельствуют в пользу реализации некоторых из предложенных третичных взаимодействий.
2.5 Модели зторичной и третичной структур 5'- и З'-концевых сегментов НТО РНК знтеро- и риновирусов, вовлеченных в репликацию генома
Одноцедачечная РНК пикорнавирусов реплицируется с помощью многокомпонентной системы вирус-кодируемых белков. Детали этого механизма мало изучены. Отправной точкой при построении моделей укладки "репликативных" цис-элементов НТО являлось предположение, что узнаваемые РНК-синтезирующим аппаратом 3'-концевые цис-элементы (+) и (-) цепей РНК: (I) должны иметь достаточно сходное строение между собой для одного генома, и (2) каждый терминальный элемент должен иметь консенсусные для большой группы вирусов мотивы, поскольку все пикорнавирусные геномы кодируют близкородственные РНК полимеразы.
Для анализа были использованы геномы около 30 представителей ЭР-группы, поскольку, как было показано ранее, о ни имеют общую структурную организацию в центральной части 5-НТО РЖ. Более-того, они имеют одинаковую вторичную структуру РНК в 5-концевом сегменте, что было известно к началу работы.
Было установлено, что 3'-концевые сегменты (+) и (-) цепей не имеет сходства на уровне первичной структуры. Поэтому мы попытались найти сходство между терминальными сегментами РНК на более высоком уровне структурной организации.
На первом этапе, применив эволюционный подход, мы вывели консенсусную модель вторичной структуры 3-НТО геномов знтеро- и риновирусов. Поскольку длина 3-КТО варьирует от 40 нт у риновирусов до 100 нт у некоторых представителей знтеровирусов, сначала был выявлен общий для всей ЭР-группы элемент (рис. 4а). Несмотря на значительное расхождение в нуклеотидных последовательностях, меаду всеми представителями ЗР-группы имеется достоверное сходство на уровне первичной структуры в ~40-нт сегменте (для риновирусов этот сегмент практически перекрывает всю 3-НТО). Была построена
консенсусная вторичная структура этого сегмента в форме почти совершенной шпилечной структуры. Этот общий элемент РНК ("сердцевина") обозначен как домен у на рис. 4а; двуцепочечный участок поддерживается у разных вирусов преимущественно компенсаторными заменами.
¿оша1п У
(а)
штв : аОШ ННУг : а1/Ш ¡туа? аида НКУ14 : сШП Р1КаЬ : аОШ Сож»2г: аШЛГ ВЕУ ! !ЛЛ/С
сохвг тм! СохБЗ : сит
СОХВ4 : С1ЛЛ1 СохАЧ : УДОс
ктау : ыяи
есн011: ШЛЮ гсн06 ■
а------- -ищтААШшаш—%аа--------------п^тамшташА ро1у<*>
а£а----- -ЦЮЮААзиЮНААХЯ-ц*---------------иКЗ№МЯ1А£ЛЖАЦА ро1у(Л)
а------- -цжлллла/еш/АМЯа-иагс-------------иаяяк/шглаптили* р°1г(м
гаиаасаа -УШ&АС-аСШЛ --------------иаСЛЛ^/^аОгаММ ро1;(л>
иаа----- СССТ ассисжмжааии -ссаиц------------^^исаиЛа/аииОМССЙ 4о» *
------вмшаилагешомосс ¿ом х
------яаиалёсуУСААииисаС- ¿ош X
иаа----- ССШЛСсиСдаЮССАиис^аиа-------
яш----- -ассмсииаи^чкс-ссшш--------
--- СуСульш*-а£—gддCC^AЛgaaылл/Ucccцc^oocaшiagaшiШiШДЦЛ^J Лош X
а л»« г сеамссссжж—аасс-саасц-------------летласкхудсмваад а»» х
-----ахаимсОФЛ^ЮМСОС Лоа X
-----а^аиллсссиослаилааа <1оа х
-----аешашсааисела/лсас -¡ои х
-----и£аиааяаОЗССССУАССС ¿от X •
-----а£аиаасааюиАЯОАСХХ; ¿о« X
-----^гиаасааисилал(хх: л™ х
а йо» г ССаОЛСиаНХи—акСС-ЫАсс—
а Лол г СССЧА01ССАа/--аАСС-СААСи~-
а Лог» г сссулсиаилси— аАСС-СААси—
аа <1от> г СООЧ ЛССОСЛа--0аАСС-СААш—
а <Ьа г СССТЛСИбСЖУ—ИАСС-СААси—
аов г ссашясслси—илсс-омси—
(б)
Р1Иай I еиалЫЛЛЮиаШАтххаЛСАААМ ро1у(Л)
Со*А21! еаалаШЛЯЮШкитОХАСААААА ро!уМ (В)
БЕУ : ссиаМАСАсссаохатесхююал ро1у(А)
то ! ёиаагШЯ1аатааХЮ0ас.АЯ1САМА ро1у(А)
Со*В1 : $ца«ж/сиссселтаотсесаазлл ро1у(А) СожВ! :
СохВЗ ; еианаШсисСССШиСШКССатЛА ро!у(А) СогВЗ :
СохЗД : еиааатсиССССаЮССОВССССМАА ро1у!л) Сох34 :
СолА9 > (иаа&ЧСиССССЛтХХХЖССаАОСА ро!уШ СожА9 !
БТОУ : ¡иаааиисиСССиАШКШХСаСАаЛА ро!у(Л) ЗУБУ :
ЕСН011: $иаааиисисСаСАУЧССаххааааЛЛ ро1у{А) ЕСН011!
ЕСН06 : еиаатгсиссаслшзхякхссшл ро1у(А) ЕСК06 :
4. Структурные элементы 3- -НТО РНК
СожВ! :
да/еДа-аСЛДЛД/С^ЛзсааМ^.иЖД/ааСТЛ/Лу! Ш!лСАССаСЛ/ЧУАё—исааисаиАКиуааСиСАЛ
_____ энтеро- и риновирусов.
Терминирущий кодон ОРС вирусного полипротеина взят в тзамку. Нуклеотиды, принимающие участие в Уотсон-Криковском взаимодействии, напечатаны большими буквами; те из них, которые вовлечены во вторичные или третичные взаимодействия, подчеркнуты либо выделены жирным шрифтом, соответственно. Неспавенные нуклеотиды напечатаны маленькими буквами. Дефисы использованы в целях выравнивания последовательностей, (а) Общая организация 3-НТО и первичная структура домена у. Сегменты, отделяющие домен у от терминатора и поли (А), обозначены чот г (домен г) ж йот х (домен х), соответственно. Структура доменов х (б) иг (в).
Все энтеровирусы, в отличие от риновирусов, имеют дополнительный сегмент (около 25 нт длиной) между доменом у ж
поли(А) хвостом. Было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей и выявлена консенсусная для всех энтеровирусов шпилечная структура, обозначенная как домен х на рис. 46.
Используя в качестве критерия расстояние между терминирующим кодоном вирусной ОРС и доменом у, мы подразделили энтеровирусы на две подгруппы: к первой отнесли полиовирусы, коксакивирус А21, бычий энтеровирус и энтеровирус 70, у которых спейсер состоял из нескольких нуклеотидов (полио-родственная подгруппа); ко второй -коксакивирусы В1, ВЗ, В4, А9, вирус везикулярного заболевания свиней, вирусы ЕСН06 и ЕСН011, у которых присутствовал дополнительный сегмент РНК около 35 нт длиной (коксаки-родственная подгруппа), для второй подгруппы сравнительным методом также была выявлена консервативная спиральная структура, обозначенная как домен г на рис. 4в.
К терминирующим кодонам всех ЭР-геномов примыкает олиго(и) тракт (4-5 нт), имеющий потенциал образовывать спиральный участок (обозначен э) с основаниями концевого поли(А) тракта. Этот элемент приводит к формированию "замкнутой" структуры из двух либо трех доменов для полно- и коксаки-родственных подгрупп, соответственно. В последнем случае 3-НТО приобретает структуру клеверного листа.
Построенные с помощью сравнительного анализа модели вторичных структур 3-НТО были экспериментально проверены зондированием одно-(диметилеульфатом, нуклеазами эх, рпу м и из в. сегеиэ) и двуцепочечных (нуклеаза су) участков РНК полиовирусов типов I и 3, а также коксакивируса ВЗ. Экспериментальные данные подтверждали существование всех спиральных структур.
Далее методом сравнительного внадиза у всех энтеровирусов била выявлена возможность третичного взаимодействия между одноцепочечными участками петель доменов х и у (рис. о). Ранее Алеппо е! а1. (1990) доказали, что терминальный репликативннй сегмент в 5-НТО ЭР геномов имеет структуру клеверного листа. В нем (а", следовательно и в З'-концевом сегменте негативной цепи РНК) нами также была найдена возможность третичного взаимодействия между доменами у их' (для 3'-концевых сегментов (+) и (-) цепей была принята одинаковая система обозначений, исходя из сходства в пространственной организации терминальных элементов) (рис. 5).
Пространственная конфигурация молекулы РНК, имеющей замкнутую клевероподобную вторичную структуру и межшпилечное взаимодействие,
Р\/1 З'пед
РУ1 З'РОБ
Тег
А-и
А-и О-С
с-о-
с-а-и а с а ——1
1 j и!
А-и--' ц-А
гг
СВ4 З'роб
Т1
74*0
ртз;
7380 А-У
!и- А: с-б
С-0
с-а—
У-А У-А и-А в и А А А и-А
I
А А Ц О А Ц-А
и-А
Ц-А 73«7 Ц-А / \
001у(А)
й-С
|*-и| 11=.») о-с
I я
-в-с с
~ с-о о-с V/'
Й-С О А
и д С ?ЛСЧ)
Ц-А
о-с й-с а-с о-с
и-А С-<3 и-А
с-а
-
7360 А-и С-0 А-и А-и А-и
Г'
и-а не» с—в А~и
О-С 1>-Л
ЯРЯ
С-0 ц-в с-а-
САА^АвАЦ
т
У-А
6—С
-Н
с-а-
4-С
с-а
Ь-ОСЗвв
А-и 735Эи-А
/ А 7*40
/
С-в а а »-с и-А и-л А-и
5И А-и
и-а
Ц-А Ц-А
LMMlкA С А
. О и А А А 11-А О7304 1 I '......А А А Ц—А
7 2» Ц-А
/ Ч
Рис. 5. Модели третичной структуры 3'-концевых сегментов позитивной (роз) и негативной (пед) цепей РНК полиовируса типа I (рух) и позитивной цепи коксакивируса В4 (св4). Терминирующий кодон подчеркнут. Одинаковые для доменов у и у элементы заключены в ражу. Поскольку дуплекс тег, возникающий при третичном взаимодействии, может быть состыкован как с доменом у, так и с доменом х, то обе возможности представлены на примере полиовируса и коксакивируса, соответственно.
хорошо известна на примере тРНК, принимающей Г-обрззную форму. При этом, два "плеча" тРНК состоят из последовательно состыкованных (за счет стэкинг-взаимодействий пар оснований двуцепочечных участков) антикодоновой и р-ветвей, с одной стороны, и, акцепторной и т-ветзей, с другой. В меяияшлечном взаимодействий принимают участие б- и т-ветви. Именно эти взаимодействия образуют каркас пространственной конфигурации тРНК. Поскольку (I) х и э спирали (+) цепи (х' и б' для (-) цепи), с одной стороны, и, у и г спирали (+) цепи (у и и' для (-) цепи), с другой, могут быть состыкованы за счет стэкинг-взаимодействий, и (2) существует третичное взаимодействие между х и ч (х' и у ) (рис. 5), то по аналогии с тРНК, 3'-концевые фрагменты (+) цепей (у энтеровирусов) и (-) цепей (у всей ЗР-группы) могут принимать Г-образную пространственную конфигурацию (рис. 6).
Таким образом, с помощью сравнительного анализа на уровне вторичной и третичной структур были выявлены как черты сходства, так и различия в строении терминальных цис-элементов, вовлеченных в процесс репликации энтеро- и ршовирусных геномов. Различия в организации 3-НТО (+) цепей между энтеро- и риновирусаш могут быть связаны с тем, что общий для всех ЭР геномов домен у играет
ce* 3'pís
позитивной и негативной цепей РНК полиовируса типа I и позитивной цепи коксакивируса В4.
основную роль в узнавании матрицы при инициации синтеза (-) цепей, а другие структурные элементы выполняют дополнительные функции (например, стабилизируют структуру РНК или белок-нуклеиновые взаимодействия, что имеет смысл, поскольку энтеровирусы, по сравнению с риновирусами, размножаются при более высокой температуре в естественных условиях). К настоящему моменту имеется ряд экспериментальных доказательств важности описанных выше вторичных и третичных взаимодействий з репликативных цис-элементах для репликации геномов.
2.6 Структурные перестройки в нетранслируемых областях пикорнавирусных геномов. Гипотеза об эволюции НТО путем генерации повторов
Длина 5-НТО пикорнавирусов варьирует от 600 нт у рнновирусов человека до 1200 нт у вирусов ящура, а длина 3-НТО от 40 нт у риновирусов до 100 нт у ряда энтеровирусов. Анализ организации НТО выявил ряд примеров индивидуальных и группо-специфических перестроек.
Как уже говорилось, энтеро- и риновирусы имеют общую модель укладки ires'а. У риновирусов синтез вирусного полипротеина начинается со стартового кодона, локализованного в ниспадающей ветви основания домена Е (п. 2.4). У энтеровирусов синтез белка начинается с инища торного кодона, отстоящего от домена Е приблизительно на 120 нт к 3'-концу. Была предпринята попытка
установить природу ■ этого дополнительного сегмента. Оказалось, что он является суперпозицией двух прямых повторов. Первый повторяющийся сегмент, 100 нт длиной, занимает у полиовируса типа I штамм маьопеу положения 533-645 и 670-772 (ишщиаторный AUG, открывающий рамку вирусного полипротеина, локализован в положении 743); 61$ нуклеотидов в двух повторах идентичны. Участок, разделяющий эти сегменты (646-669), является, в свою очередь, копией фрагмента 670-696 (5'-концевой части более крупного повторяющегося сегмента); в этом случае 15 из 27 нуклеотидов идентичны. Эти повторяющиеся сегменты обнаруживаются и у других сзротипов полиовируса (а также у других энтеровирусов), хотя и с тСПЫНСй GTGIICIILIu ГОМОЛОГИИ (41—4G/o К 4о—54Я? для больших й меньших
копий повторов, соответственно).
Наличие двух повторяющихся сегментов в знтеровкрусных геномах, с одной стороны, и присутствие одной копии данного сегмента у риновирусов, с'другой, позволило выдвинуть гипотетическую модель дивергенции 5-НТО РНК этих двух родов пикорнавирусов посредством дупликаций. В соответствии с предложенной реконструкцией, предшественник энтеровирусных геномов имел "риноподобную" структуру. Нз первом .этапе произошла дупликация целого сегмента s-L-c (рис, 7). Затем дуплицировался небольшой сегмент s. В результате этих событий "современные" энтеровирусы могут быть представлены в З'-концевой части 5-НТО формулой s'-l'-c-s»-s-l-c, каждый из элементов которой имеет гомологию с s-l-c сегментом риновирусов.
a L C
II »I
i
S* t' С' S 1 о I I " I О-1-1-»" 'I
1
S' Ь' О' S" 8 L О 1 ) D-i-1-1-1 1
53 Э 5«5 61i 646 б 7 О 697 Т*Э 772
Рис. 7. Реконструкция происхождения вставки в 5-НТО энтеровирусов. э и ь обозначают короткую и длинную части повторяющегося сегмента; с соответствует участку РНК, кодирующему н-концевую порцию вирусного полипротеина. Жирными линиями обозначены наиболее консервативные и функционально важные сегменты геномов энтеро- и риновирусов. Тонкие линии соответствуют энтеровирусному геномному повтору. Затемненный прямоугольник обозначает положение стартового кодона. Номера соответствуют позициям нуклеотидов полиовируса типа I.
В результате сравнительного анализа геномов энтеровирусов было
обнаружено наличие вставки в 5'-концевой части 5-НТО РНК бычьего энтеровируса. Дальнейший анализ этой вставки выявил, что "лишний" сегмент (более 100 нт) является прямым повтором консервативного репликатнвного цис-злемента (п. 2.5). Сходство между повторяющимися элементами составляет Ъ1%. Более того, эти сегменты имеют практически идентичную вторичную структуру (рис. 8).
с • б с • 5 5 • с
«с »пет05' 6Ш РТ*1С а
А .УС—»'
Рис. 8. Терминальный фрагмент 5-НТО генома бычьего энтеровируса имеет две когоги репликатнвного цис-элемента, консервативного у ЭР-группы. В рамку заключены одинаковые для двух копий пары нуклеотидов.
Еще один пример больших перестроек в 5-НТО РНК пикорнзвирусов был выявлен при сравнении первичных и вторичных структур терминальных сегментов РНК кардао- и афтовирусов, предположительно вовлеченных в процесс репликации вирусов. Мы обнаружили общий для КА геномов элемент, хотя РНК вирусов ящура имеет в нем дополнительную вставку (более 250 нт). Происхождение этой вставки достоверно установить ие удалось.
В 3-НТО коксаки-подобных вирусов имеется дополнительный (по сравнению с полио-подобными) домен г (п. 2.5). Нами было показано, что этот домен состоит из нескольких повторов олигонуклеотида, присутствующего у всех энтеровирусов и примыкающего к терминирующему кодону. Шло выдвинуто предположение о происхождении целого домена г в результате "взрыва" дупликаций.
Итак, было установлено, что большинство различий в структурной организации НТО пикорнавирусных геномов обусловлены повторами (большими и малыми). Интересной особенностью описанных геномных перестроек является тот факт, что повторялись наиболее функционально значимые цис-элементы РНК, вовлеченные в репликацию и трансляцию генома. Очевидно, генерация повторов важных цис-1элементов РНК на каком-то этапе эволюции пикорнавирусов давала вирусам с дополнительными копиями регуляторных элементов ряд преимуществ, что в значительной степени способствовало появлению видов и даже родов пикорнавирусов.
3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ТАНДЕМА ОДИГОШБШВДИН/аис ГЕНОМА ПИКОРНАВИРУСОВ:
ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ВИРУСА Для внутренней инициации трансляции пикорнавирусных РНК необходимо наличие в 5-НТО протяженного (несколько сот нуклеотидов) цис-элемента - ires'a. Как было показано выше, xres'h пикорнавирусов подразделяются на два класса, практически не имеющих мзвду собой никакого сходства на уровне первичной и вторичной структур. Тем не менее,* все шкорнавирусные геномы вблизи 3' границы iRES'a имеют один общий элемент - тандем олигопиримидина и aug со спейсером длиной 20-24 нт. Впервые о наличии олигопиримидинов перед aug в геномах пикорнавирусов и их возможной функциональной значимости было сказано в работе веек et ai. (1983). Для ЭР-группы второй элемент тандема представлен последним криптическим (не инициаторным) aug-тришютом, а для КА-группы -инициаторным кодоном. Поскольку тандем олигошфимйдин/aug является единственным консервативным для всех пикорнавирусных РНК элементом, было предположено, что он принимает участие во внутренней посадке рибосомы.
3.1 Тандем олигопиришдин/rug в геноме полиовируса является новым типом регуляторных цис-злементов трансляции У ЭР-группы олигопиримадиновый блок (около 12 нт) примыкает к 3' концу домена о, а критический дио-триплет локализуется в домене е". Было изучено влияние различных вставок, делеций, нуклеотидных замен и значительных структурных перестроек генома полиовируса типа I (штамм Mahoney) в области тандема олигощримидин/лиа.
3.1.1 Влияние удлинения спейсерного участка между олигопиримидином и дте на матричную активность и жизнеспособность вируса. Ревертанты, их структура и свойства
На первом этапе в полноразмерной кДНК полиовируса в правой части олягопиримидинового блока был содан РэгI сайт путем замены ТТТА (положения 565-568) на ссдв. Транскрипт мутантной плазмиды, ppvl/oз, был инфекционен, хотя соответствующий вирус давал несколько более мелкие бляшки, чем дикий тип (табл. I).
Используя Рзгг сайт, были созданы четыре мутантные плазмиды (табл. I) со встроенными в обеих ориентащях 23-х и 39-членными синтетическими олигонуклеотидами. Дополнительно, в результате двухкратного повтора 23-х членного линкера (в гзм ориентации) была получена конструкция рру1/оз/46 (р4б).
Транскрипты четырех (из пяти) мутантных плазшд при трансфекции культуры ткани клеток почек зеленой мартышки продуцировали вирусные бляшки (табл. I). Бляшки появлялись позже, чем при заражении транскриптом исходной плазмиды ррушаь, а их размер был существенно меньше, чем у дикого вируса.
После траксфекции транскриптом ргзм была отобрана одна первичная мелкая бляшка. При пассировании содержащегося в ней вируса потомство приобретало более крупноблшечный фенотип. Было отобрано несколько таких более крупных бляшек, и соответствующие вирусы были подвергнуты дополнительному клонированию. Была определена первичная структура РНК ряда вирусных клонов. В двух геномах была обнаружена трансверсия и-*;, в результате которой несколько "правее" вставки появлялся новый аш (табл. 2). В других ревертантах обнаружены разнообразные делеции, приводящие к потере вставки целиком либо ее частей, а иногда и примыкающих к ней нуклеотидов, Среди семи делеционных ревертантов не было обнаружено ни одной пары одинаковых деледай. Все без исключения ревертанты приобретали крупнобляшечный фенотип и являлись генетически стабильными при дальнейшем пассировании (табл. 2).
Три вирусных клона были отобраны из одной первичной бляшки, продуцированной транскриптом р2зр. Во всех ревертантах были обнаружены делеции, и снова среда них не было двух одинаковых (табл. 2).
После трансфекции транскриптом р4б на 14 день появилась единственная бляшка. В геноме полученного ревертанта Р4 6-24 отсутствовала вся вставка и примыкающий к ней остаток и (табл. 2).
, Таблица I . Мутантше конструкции полиовируса свойства и некоторые их
1 1 название яухлеотидная последовательность 1шфе)а;и-ошюаь размер бляшек матричная активность бокс А/дда спейсер
рРУ1 Мап 561 О. ТССТТТТА...................................... £73 4- + 8,0 1.00 22
рРУ1/03 ТССТ8са8...................................... ч- 4.0 0.05 22
рРУ1/03/Д4 тсс8.......................................... + 6.5 0.35 18
РРУ1/03/Д6 тсс............................................ + 3.0 0.30 16
рруг/оз/л7 тсс............................................ + <1.0 0.12 15
рРУ1/03/Д8 тсс........................................... - 0.05 14
рРУ1/03/Д10 Т............................................. - - 0.02 -
РРУ1/03/23М ТССГПТАииаПвааиаваЬс1.в................... + 1.0 0. 10
рРУ1/03/23Р ТК^а1с^ааИ;саа(;ааааЬааааз................... + 1.0 0.08 41
рРУ1/03/39Р TCCagatctggaaacacgcacccaaaggtcggttcctgatcag••• - - 0.02 57
рР\'1/03/39М TCCTgatcaggaaccgacctttgggtgcgtgtttccagatctg■• ■ + <1.0 0.07 57
рРУ1/03/46 - 0.02 68
рРУ1/03/24Р TCCTTTctttttgattgttgcttatggg.................. + 6.5 0. 30 20
Замененные и вставленные нуклеотиды обозначены маленькими буквами, а делении - дефисами. Точки использованы для выравнивания. Размеры бляшек (мм) даны на третий день после трансфекции транскриптом Е'а исключением ррУ1/оз/В7 и рруа/оз/зэм, в случае которых бляшки появлялись на 4-ый и 5-ый день, соответственно, qi квази-инфекционные конструкции (см. текст). Матричная активность транскриптов определена в экстракте Кребс-2.
Таблица 2. Структура геномов и бляшечный фенотип ревертантов, отобранных из потомства мутантов р4б, ргзм и ргзр
название куклеотидная последовательность бокс А/АХКЗ размер
спейсер бляшек
РУ1 559 589 ■А ф ишссииииА...................ииШАШСиОССШСШАи«; 22 8. 0
Р46-24 ишссшиил--------------------иШАШСиС,ССиССииА1ЮС 21
р23М иШССиШиАииШАШСААШАСАисисиШАиисиСССиССШАиОС 41
Р23М- (7)21 ишссииии А------------Ай АиШОииШАШСиСССиССииАиСС 29
Р23М- (7)59 ииисс-----------------асаи си-----АШСиСССШСШАиСС 19 6. 5
Р23М- (7)58 иШСаЛШАииииАШС А.АииАСАисиСииШАигСиССС(ЖС1Л 1А11Г,Г. ?я А п
Р23М- (7)60 цшсоташАишиАииаААииАаАисисиишАизсисссиссииАисс 28
Р23М- (5)17 ишссиииУАииииАш----------------Адасшссшадмиа; 25 5. 5
Р23М- (5)18 ишссишили------------------шиилишисссшсшАшс 23
Р23М- (10)27 иШССииША--------------------ииШАШСиСССиССШАиге 22 6. е
Р23М- (5)53 ШиССиШиАиидаАииСА--------------АШСиСССиССШАиОО 27 8. 0
Р23М- (8)57 ишссшиилиш----------------------шсисх;сдасшАиса 20 6. 5
р23Р ЦШССАСАиШААииСААиААААиААААСииШАШСиОССиССииАиСС 41
Р23Р- 14. иШССАСАиШ----------ААиАЛААСишиАШСиСССШаЛМиСС 31 5. 5
Р23Р- 15 иШССАСАиС-----------------------иАШаиаССОССШАиСС 19 6. 5
Р23Р- 16 иииосАСАисиА-------------------ШАШоисссиссииАта 22 7. 5
Бокс А и ато подчеркнуты. Точечные замены обозначены жирными маленькими буквами, а делеции - дефисами.
Четыре очень мелких бляшки (а-а) были отобраны при трансфекции рз9и. В •геномах отобранных из них ревертантов обнаружены либо транзиции (з-»а, приводявде к появления новых лис (в двух различных локусах внутри вставки), либо делеция (табл. 3). В геномах некоторых ревертантов были выявлены 1-2 дополнительные точечные замены.
У ряда ревертантов была определена нуклеотидная последовательность всей 5-КТО, но никаких дополнительных мутаций (помимо представленных з табл. 2 и 3) найдено не было. Такт! образом, именно перечисленные выше реверсии обуславливают практически полное восстановление нарушенных в результате вставок жизненно важных функций цис-элементсв полиовирусного генома.
Матричные активности транскриптоз мутантных конструкций со
Таблица 3. Структура геномов и неторые свойства ревертантов, отобранных из потомства мутанта рзэм
название нукяеотвднля последовательность |)0КС А/АШ спейсер размер бяяшек матричная активность
рч1 559 589 иииссииииа...................................иишаиисисссиссиимхх; 22 8. 5 1.00
р39М идассисАисАасААсссАСсииисссисссиоишссАСАисисиишАиисиассиссшАисс 57
Р39Ма- ■1 иШССиСАиСАааААСССАССиииССаисССисиииССАаАиСШииШАииС-иСОСиССииАиСС 21
Р39Ма- -(1)39 (ЛЛГСШСАиСАааМСССАССиииСсаиОССисиШССАСАисисииШАиисиССа/ССШАиСС 21 6. 5 0.27
Р39Ма- ■(1)40 ЦдаСШСАиСАаСААСаЗАССШиССаиСССиСШиССАСАиСиСШШАШСиСССОССШАиСО 21 5. 0 0.17
Р39Ма- -2 аиССиСАиСАОСААСССАССишССаиССОисииОССАСАисисииШАиУШСССШСШАиСС 21
РЗЭМа- ■3 1№ССиСАиСАи0ААСССАССиииССаисССиСШиССАСАисиОМ)иАиисисССиССииАи0С 21
Р39Ма- •(3)32 иШССиОАиСАиСААСССАССиииССаиСССиСиииССАСАисисииШАШСиСССиССШАиСО 21
Р39Ма- ■(3)42 иииССиСАиСАцСААСССАССШиСОаиСССиаиШССАСАисиоииШАиисиСССиССШАиаС 21 6. 0 0.26
Р39Ма- ■4 1№ССиСА»СА^0ААСССАССиШССаиСССиСиШССАСАиСиаиШиАШСиСССиССШАиС0 21
Р39Мс- -46 ШиСШ0А11САССААСССАССШиССаиССС.исиииССАСАисисииииАиисисССиССииАиСС 21 2. 5 0. 15
Р39Мс- -47 иШСШСАиСАССААССОАССтЮССаиСССиСиШССАСАиСисииШАШСиСССаССШАиСС 21 2. 5
рзэма- ■44 иШССиСАиСАОЗААСССАаС----------------------------ШАШСиСССШСШАШС 31 4. 5 0.08
Р39ма- (45)50 ШиССислиСАССААСССАаСШиССаисССисиШССАСАисисдаШАЦиСОСССиССЦиАиСС- 21 6. 0 0. 13
рзэмь- 11 иШССиСАиСАССААСССАС\дЛ^СССи0СаисиШССАСАиСиСШШАЦисиС0С111ССииАиСС в - даиссисАисАссмсссАСи^тессиссаисишссАСАисиаишиАшсиассиссииАиа:. 25
Р39МЬ- (11)28 25 2. 0 0.05
Р39МЬ- (11)29 1люссиалисассаасссаси1,ьисссиссаисиииссаааисисииииашсисссиссииаиа: 25
Р39МЬ~ (12)31 шиссисаисассаасссасалюсссиссзисиууссасаусисииииамсцсасиссшаусс, 25
Обозначения такие же, как в табл. 2.
вставками при трансляции в экстракте Кребс-2 были значительно ниже по сравнению с таковой у дикого типа (табл. I). Тем не менее, инфекционные транскрипты ргзр, ргзм, рзэм давали в 3,5-5 раз больший выход полипептида Р1 (белка-предшественника вирусных капсидных белков), чем неинфекционный транскрипт рзэр (отметим, что у этого мутанта вставка приводила к значительным структурным перестройкам в домене о). Потенциал белкового синтеза РЖ р4в- также оказался очень низким.
Матричные активности РНК всех резертаятов были существенно выше таковых у родительских транскриптов (табл. 2 и 3; рис. 9). В кавдой группе ревертэнтов, тем не менее, некоторые РНК были бпляе активны, чем другие. •
■ ? ¡6 20 24 25 32 36
расстояние между боксом А и дий
Рис. 9. Зависимость матричной активности РНК от расстояния между боксом А и лис. Квадраты соответствуют мутантным РНК на основе рззм и pPVl/oз/л серии (I, рРУ1/оз/Д8; 2, /Д7 ; 3, /Дб; 4, /Д4; 5, Р2зм-(8)57; 6, Р46-24; 7, РУ1: 8, Р2зм-(5)1е; 9, -(5)17; 10, -{8)5з; II, -(7)5з; 12, -(7)21; 13, ргзм; 14, Р2зм-(7)59). Кружки соответствуют РНК мутантов на основе ргзр серии (15, ргзр-15; 16, -16; 17, -14; 18, разр); 19 и 20, для РНК р24Р и РУ1/03-23, соответственно.
При сравнении матричных активностей РЖ ревертантов с делениями выявилось, что их активность зависит от протяженности делеции (рис. 9). В качестве меры было выбрано расстояние между двумя сохраняющимися частями генома - ишсс (боксом А) и критическим Аис586. Оптимальное расстояние, равное 22 нуклеотидам, имеется у дикого типа. Изменение дистанции между элементами тандема
приводило к прогрессивному снижению матричной активности мутантных РНК, причем этот эффект более ярко выражен при уменьшении расстояния. Снижение трансляционного потенциала РНК мутантов хорошо коррелирует с уменьшением размеров их бляшек (табл. 2).
У РНК без делеций матричная активность зависела от положения нового äug, будучи выше у РЗЭМа- (с-, а-) вирусных клонов, чем у Р39мъ- производных (табл. 3), т.е. коррелировала с длиной слейсера между* боксом А и новым крилтическим aug. Подчеркнем, что возникновение в результате точечных замен новых aug приводило как к существенному повышению (в 2-4 раза) трансляционного потенциала РНК псевдоревертантов, так и к резкому повышению репродуктивной способности мутантов (табл. 2 и 3). Некоторые вариации в эффективности трансляции, по-видимому, обусловлены наличием дополнительных мутаций во вставке; мутации, приводящие к дестабилизации искусственной вторичной структуры в некоторой степени стимулируют матричную активность. Возникновение новых aug не приводило к инициации трансляции коротких пептидов с втих триплетов.
3.1.2 Влияние делеций 'между боксом А и aug на матричную активность и жизнеспособность вируса. Ревертанты, их структура и свойства
Вышеизложенные результаты свидетельствуют о важности наличия бокса А и aug (как резидентного augmü, так и возникающих в результате точечных замен) на определенном расстоянии друг от друга, В геномах вышеописанных реЕертантов длина спейсера мезду боксом А и aug варьировала в пределах 19-31 нт. Дальнейшим шагом было выяснение минимального допустимого расстояния между этими элементами тандема.
Трансктипт плазмиды ppvi/03/&4 с делецией uuua был инфекционным, однако, более глубокое внедрение в ожгопиримидиновый блок (ppvi/оз/дю) оказалось летальным (табл. I). Матричные активности этих РНК составляли 35$ и 2% от контроля, соответственно.
Достаточно неожиданно РНК pvi/03/A4 оказалась намного более эффективной матрицей, чем РНК pvi/оз; размеры бляшек последнего вируса также были несколько меньше (табл. I). Судя по-всему, именно специфический характер нуклеотидных замен у pvi/оз вызывает ингибирование трансляции и уменьшение размеров бляшек, поскольку и удаление замененных uuua в делеционном мутанте, и их замена на
любую другую последовательность (табл. 2 и 3) в значительной степени восстанавливают данные характеристики. Объяснение этому феномену будет дано в следующем разделе.
Для определения минимального расстояния между боксом А и лис, были созданы мутанты с делениями 6, 7 и 8 нт в спейсере. Первые две РНК (ру1/оз/Д6 и ру1/оз/Д7) оказались инфекционными, хотя и с прогрессивно падающими матричными активностями и размерами вирусных бляшек (табл. I). В то же время рух/оз/дэ РНК при трансфекцш обычными дозами не давала ни одной бляшки (для сравнения, при трансфекции руз./оз/Д7 РНК в аналогичной дозе появлялось несколько сот бляшек), а ее трансляционный потенциал падал в 20 раз (табл. 1). таким образом, минимальное расстояние между элементами тандема равно 15 нт.
Поскольку транскрипт рруг/оз/дз с разрушенным тандемом при трансфекции стандартными дозами не давал вирусных бляшек, были использованы более высокие дозы мутантной РНК. В результате удалось получить ряд ревертантов, первичные бляшки которых появлялись на различные сроки (от 10 до 17 дней после трансфекции). Анализ геномов однозначно свидетельствовал о тенденции ревертантов восстановить функционально активную организацию тандема, при которой бокс А и аш (новый либо резидентный) были бы разделены спейсерным участком определенной длины. Это достигалось тремя различными путями.
Ревертантк класса I приобретали в результате точечных замен новый лив на соответствующем расстоянии от бокса А. Новые лис возникали либо сразу же за резидентным дшгвб (в случае РУ1/Д8-32), либо через три нуклеотида от него (как у ру1/д8-91 и -ю7) (табл. 4). Таким образом, новые критические дте находились на более "комфортабельном" расстоянии (17 и 20 нт, соответственно) от бокса А. Примечательно, что в двух независимых клонах дис триплеты возникли в результате одновременной транзиции двух смежных нуклеотидов: са на те.
У ревертантов класса 2 нарушение дистанции между двумя мотивами тандема исправлялось с помощью вставок. В трех независимых клонах ревертантов в спейсерный участок вставлялось 2 нт (ру1/д8-ю6, -77 и -89), а один ревертант {рчх/йа-аа) приобретал 9-ти нуклеотидную чужеродную последовательность между элементами тандема (табл. 4). В результате дистанция между боксом А и АШ увеличивалась с 14 до 16 и 23 нт, соответственно.
Таблица 4. Неторые свойства ревертантов, отобранных мутанта pPvi/оз/ВЗ (pvi/B8) из потомства
бляшка вирус нукпеотидная последовательность бокс AJAUQ спейсер размер бляшек матричная активность
PV1 559 606 UUUCCUUWAUUWAUUGUGGCUGCUUAUGCUGACAAUCACAGAUUGU. 717 747 4- -l .UAUUUCAAUCAGACAAUIGUAUCAUAAUGGG 22 9 1.0
PV1/A8 UUUCC---- -----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUGU. . UAUWCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 14 - 0.05
GD8Q1 112 UUUCC---- -----UAUJGUGGCUuCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUaU. . UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 14 2 0.28
GD803 91 UUUCC---- -----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGAugAUCACAGAUUGU. .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 20 4.5 0.16
GDS08 107 UUUCC---- -----UAUUGUGGClGCUUAUGGUGAugAUCACAGAUUGU. .UAWUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 20 4.5 0.21
GD807 82 UUUCC---- -----UAUUGUCaCUGCUUAUGaUGAuAAUCACAGAcUGU. . UAWUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 17 3.5 0.13
CD802 106 UUUCC---- -----UAUUGUGCCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGgUUaU. О . UAUUUCAAUCAGACAA.UUGUAUCAUAAUGGG 16 5.5 0.54
GD804 77 UUUCC---- -----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUaU. -----UAUUGUGGCUGOJUAUGGUGACAAUCACAGAUUaU. О . UAUUUCAAUC.AG ACAAUi IGUAUCAUAAUGGG 16 5.5 0.44
GD805 89 UUUCC---- .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 16 6 0.51
88 UUUCC---- -----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUaU. LauacgcuauJ . UAWUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 23 8 0.9
90 . -AUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 23 4.5 0.21
GD306 74 19 5.5 0.4
Внутренние aug и аутентичный стартовый кодон подчеркнуты тонкой и толстой линиями, соответственно. Остальные детали, как в табл. I и
Наконец, ревертанты класса 3 (ру1/д8-эо и -74) имели протяженную делецию (152 и 155 нт соответственно), в результате которой из вирусного генома удалялся почти весь сегмент между боксом А и инициаторным Ага74з, включая консервативный домен Е с резидентным Атозвв в нем (табл. 4). В результате такой перестройки возникали тандемы бокс А/Ате?« со спейсерными участками длиной в 23 и 19 нт, соответственно. Особо отметим, что в геномах протяженных делентов функции ато?«, выступающего в качестве (I) элемента тандема и (2) стартового кодона, совмещены.
Один ревертант, РУ1/Д8-И2, имеющий две замены, дестабилизирующие основание домена Е (табл. 4), не относился ни к одному из гррех выше перечисленных классов- т^/д^тл* довольно мелкобляшечяым, он, тем не менее, являлся достаточно генетически стабильным (по крайней мере при трех дополнительных пассажах). Объяснение этого феномена будет дано в следующем разделе.
Все перечисленные реверсии приводят к значительному увеличении синтеза вирусного полипептида при трансляции в экстракте Кребс-2 по сравнению с РНК рруг/дэ. При этом отмечается хорошая корреляция мезду размераш бляшек ревертантов и матричной активностью их РНК (табл. 4). Вариации в эффективности трансляции в значительной степени обусловлены дистанцией между боксом А и аш (а, в случае новых лив, также частично обусловлены их контекстом), что полностью коррелирует с данными, полученными при изучении мутантов со вставками и их ревертантов.
3.1.3 Значимость отдельных элементов тандема олигопиришщгн/ате
Вышеизложенные результаты свидетельствуют о критической важности тандема бокс А/лис для вируса полиомиелита. Это было дополнительно подтверждено несколькими способами.
Хотя при определении первичных структур РНК псевдоревертантов в 5-НТО не было найдено дополнительных изменений, кроме обнаруженных в области тандема бокс А/лис, нельзя было исключить возникновения дополнительных супрессорных мутаций в кодирующей области вирусного генома. Для проверки подобной возможности вместо позиций 567-568 полиовируса была введена одноцепочечная 24-х нт вставка, имеющая ато на расстоянии 20 нт от бокса А в таком же контексте, что и криптический атоззб. Плазмида рр\т1/оз/24р (р24Р) была инфекционной и, в отличие от других конструкций со вставками, при трзнсфекции транскриптом продуцировала крупнобляшечное потомство (табл. I). Соответствующий вирус был генетически
стабильным; как исходный транскрипт, так и вирусная РНК были одинакова эффективными матрицами (табл. I). Полученные результаты подтверждают положение, что наличие äug на определенном расстоянии от бокса А (вкупе с предшествующим ires'om) необходимо и достаточно для эффективной инициации трансляции.
Второй тест гипотезы о функциональной важности тандема бокс А/aug состоял в следующем. Был удален целый консервативный домен S (с резидентным augssö), что привело к потере инфекционностн (конструкция ppvi/ae; табл. 5). Однако, когда вместо удаленного домена был встроен описанный выше aug-содержащий 24-х нт линкер, была получена инфекционная плазмида ppvi/ae/24p, дающая крупнобляшечное потомство (табл. 5). Матричная активность транскрипта этой плазмида была достаточно высокой и сравнимой с активностью р24р РНК. Таким образом, допустимы любые перестройки в 5-НТ0 генома полиовируса к 3' концу от бокса А, при условии нахождения aug на соответствующем расстоянии от олигопиримидина.
Таблица 5. Мутанты полиовируса с удаленным некоторые их свойства доменом Е и
название иуклеотидная последовательность инфекци-ояность размер бляшек матричная активность
pPVl/ДЕ S63 630 тттсс........................ сс _ _ 0.12
рРУ1/ДЕ/24Р TTTCCtttctttttgattgtt gcttatgg CC 6.0 1. 00
pPVl/ÜE/24M TTTCCccataagcaacaatca aaaagaaa СС - - 0.16
pPVl-EG5 TTTCCtttctttttgattgtt gcttaCgg CC + hg ' 0.22
pPVl-EG6 TTTCCtttctttttgattgtt gcttGtgg CC + 1.0 0.37
В конструкции pPvi/дЕ были удалены 564-629 нт. Вместо удаленного сегмента были вставлены два 24-нт линкера (обозначены маленькими буквами). Мутации в линкере обозначены заглавными буквами. Мнтактный и мутированный aug в линкере подчеркнут, hg - гетерогенный.
Наконец, на основе конструкции pfvi/ae/24P была определена значимость критического aug. замена aug на gug в конструкции ppvi-eg6 сопровождалась значительным уменьшением размеров бляшек и ингибированием матричной активности мутантного транскрипта (табл. 5); мутант был нестабилен и продуцировал истинные ревертанты (с образованием aug) после первого же пассажа. Замена aug на acg в ppvi-EG5 приводила к еще большему падению матричной активности (табл. 5); после трансфекции, бляшки появлялись со значительной
временной задержкой и были гетерогенными, что объяснялось наличием в них истинных ревертантов. Эти результаты свидетельствуют о первостепенной значимости aug для функционирования регуляторного трансляционного элемента (тандема).
3.2 Функциональная роль тандема олигониришдин/aug для репродукции вируса энцефаломиелита мышей Тейлера: тканеспецифическая вариабельность
3.2.1 Тандем олигопиримидин/aug генома ВЭМТ не играет существенной роли в ситемах in vitro
В геномах вирусов КА-группы аш-элемент тандема олигопиримидин/aug представлен инициаторным кодоном, подобно некоторым ревертантам полиовируса. Чтобы выяснить значимость тандема олигопиримидан/aug, в соответствующую область РНК ВЭМТ штамма gdvii (вирулентный, вызыващий полное поражение моторных двигательных нейронов) были внесены разнообразные изменения.
У ВЭМТ олигопиримидиновый блок состоит из 12 нт. Были произведены замены различных его частей в конструкциях gd-2, -19, -го и -2i; спейсерный участок тандема был изменен в gd-э (табл. 6).
Таблица 6. Мутантные конструкции ВЭМТ итамм gdvii и свойства ж транскриптоз
нухлеотидяая последовательность
инфекционное«.
матричная активность РРЛ Кребс-2
GDVII 1042 i 07 0 TTTTCTCTTTTTATTATATTGTCAATATGG + 1. 00 1.00
GD-2 TTTTCggaTccTATTATATTGTCAATATGG + 0. 60 0.85
CD-19 TTTTCcgcagTTATTATATTGTCAATATGG + 1. 10 0.67
GD-20 TTagaTCTTTTTATTATATTGTCAATATGG + 0. 70 0.50
GD-21 TTagacgcagTTATTATATTGTCAATATGG + 0. 45 0.50
GD 9 TTTTCTCTTTTgtaatataatTCAATATGG + 1. 55 0.95
Замененные нт напечатаны маленькими буквами. Олигопиримщщновк блок и А1кзюб8 подчеркнуты толстой и тонкой линиями соответственно.
Все эти мутанты оказались жизнеспособными и генетически стабильным!' при 3-5 пассажах в культуре клеток внк-21, размеры их бляшек бьш: близки к таковым у дикого вируса (табл. 7). Мутантные РЖ обладала близкой к родительской матричной активностью (50-150%) в двуг бесклеточных системах трансляции: в экстракте Кребс-2 г
Таблица 7. Мутантные вирусы воуц и их биологические характеристики
бокс А/А1ГО размер ПД50
название нуклеотидная последовательность спейсер бляшек Оо?«
104?. 1071 1087
4/ ф
СОУП ЦидашаШШиАШАиАШСиСААУАиСССШССАААСАСОСАиА 21 3.3 2.5
00-2 ЦиШСвваиссиАииАиАииСиСААиАиСССШССАААСАСССАиА 21 2.8 2.3
00-19 ЦШиСсдсаеШАШАиАШСиСААидиСССииОСАААСАСССАиА 21 3.1 2.0
СВ-20 ииаяаиС1Ш1ДЛАШАиАиисиСААиА»СССиШСАААСАСаСА»А 16а 3. 0 4.3
00-21 Ша§ас£са8ШАШАиАШСиСАА11АиСССШССЛААСАСССАиА ~ 3. 1 >7.5
СО/й4-54 итос§***.сиАдаАиАииаисААиАиоссииосАААгАСССАиА 17 2. 1 3. 5
СП-9 иииисиСШиизиааиаиааииСААилиСССдаССАААСАСССАаА 21 2. 6 2.8
СП-7 UUШCUCUШШAaagagaaaUCAAUAUGGCШGCAAACACGGAUA 21 • 2.0 3.0
С0-51г иШисисиииииАШАиАШ.гаСААиАиСССШССААсСАиаиииА 21 3.3 2.7
Замененные и удаленные нуклеотиды обозначены маленькими буквами и звездочками, соответственно. Левая часть олигопиримидина (бокс А) и аутентичный инициаторный дте подчеркнуты толстой линией, г правая часть олигопиримидина (бокс А') - тонкой. Средние размеры бляшек (мм) даны на третий день после заражения вирусом монослоя внк-21. - расстояние между боксом А' и лис.
ретикулоцитном лизате кроликов (РЛК). Полное уничтожение олигопиримидинового тракта у gd-21 приводило лишь к двукратному ингибированию трансляции (табл. 6).
Затем спейсеряый участок между олигопиримщщном и aug был удлинен при помощи либо 108-нт вставки модифицированного сегмента полиовируса типа I (позиции 569-675) в конструкциях gd/pv-12 (-22), либо 27-нт вставки синтетического линкера в gd/i.27-40 (табл. 8). В обоих случаях во вставках отсутствовали aug. Мутантные РНК были инфекционны; размеры вирусных бляшек были уменьшены не более, чем на 40% (табл. 8). Вирусы были генетически стабильны при 5-9 пассажах в клетках внк-21.
Матричные активности транскриптов gd/pv-12 (-22) и gd/i.27-40 сотавляли 30-50% от уровня дикого типа (см. в следующем разделе табл. 14), т.е. эффект удлинения спейсерного участка между боксом А и aug был значительно слабее, чем в случае полиовируса. Некоторое падение матричной активности РНК мутантов ВЭМТ со вставками никоим образом не связано с отсутствием тандема олигопиримидин/aug, поскольку внедрение критических aug во вставки на оптимальном расстоянии от олигопиримидина в мутантах gd/pv-i (-11) и gd/i.27-43 не приводило к повышению матричной активности в экстракте Кребс-2 и даже снижало ее в РЛК (табл. 14). aug-содержащие мутанты также были инфекционными к генетически стабильными, а размеры их бляшек мало отличались от таковых у мутантов со вставками без aug (табл. 8).
Эти результаты однозначно свидетельствовали об отсутствии сколь-либо существенной функциональной роли тандема
олигопиримидин/aug у ВЭМТ В СИСТеМЭХ in vitro и резко
контрастировали с данными, полученными при изучении полиовируса. Таким образом, у пикорнавирусов значимость тандема для ВИТ в одних и тех же системах зависит от характера iRES'a.
3.2.2 Модификации тандема олигопиримидин/Аш определяют степень нейровирулентнссти ВЭМТ В отличие от полиовируса (представителя ЭР-группы), у ВЭМТ тандем олигопиримидин/aug не играет существенной роли при трансляции его РНК и репродукции вируса in vitro. Тем не менее, его эволюционная консервация у всех кардио- и афтовирусов давала основание предполагать, что он может оказаться необходимым в других системах, например, в естественном хозяина - нервной ткане мышей.
ВЭМТ штамма gdvii при церебральном заражении мышей вызывает поражение моторных нейронов. Это проявляется в виде параличей
Таблица 8. Вирусы gdvii со вставками и их биологические _ характеристики _ _
пуклеотидная последовательность
бокс A/AUG размер ПД50 спейсер бляшек (log10)
1040 1046 1053 1073
j, 4, 4, 0,
GDVI I GGUUUUC UCUUUU......................................... ............. UAUUAUAUUGUCAAUAUGGCU 21 3.3 г. ь
i—» insert
GD/i .27- ■40 GGUUUUC GGAUCUWUAUUUUAUUGAAWAGAUCUGAUCC.............. ............. UAUUAUAUUGUCAAUAUGGCU 48 1.7 7. 7
GD/I .27- •43 GGUUUUC GGAUCUUUUAUUUUAUUGuAUauGuUCUGAUCC.............. ............. UAUUAUAUUGUCAAUAUGGCU 21 2.6 s. 2
GD/I .27- ■44 GGUUUUC GGAUCUUUUAUUUUAL'UcAAUauGgcuaGAUCG.............. 21 2.6 3. 7
insert
■F*
pol lovirusl" sequence u
AGCGAAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGAAAGUGAGACUCAUUAUCUAUCUCUWGCUCCAI
3
675
Ц
GD/PV- -1 GGUUUUC GGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUGWAUCAUAA cc UAUUAUAUUGUCAAUAUGGCU 24 2. 7 4. 2
gd/pv- -11 сизишис GGAUCUGUUUUAUUGaGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUGUUuagucuA CC UAUU UJAUUGUCAAUAUGGCU 24 2. 5 4. s
GD/pv- -12 GGUUUUC GGAUCUGUUUUAUUGUGGCUCaaauUGGUGACAAUCACAGAUUGLIUAUCAUAA CC UAUU UJAUUGUCAAUAUGGCU 129 2. 3 >7. 5
GD/PV- -22 GGUUUUC GGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGCUUu'JGGUGACAAUCACAGAUUGUUuagucuA CC UAUU WAUUGUCAAUAUGGCU 129 1. 9 ">8. 0
Замененные нуклеотиды внутри вставок (insert) напечатаны маленькими буквами. Точки использованы для выравнивания, aug внутри вставок и аутентичный стартовый кодон подчеркнуты тонкими и толстыми линиями, соответственно. Бокс А подчеркнут толстой линией.
ьб 9
передних и задних конечностей, а также мышц спины. Развитие заболевания приводит в конечном итоге к летальному исходу.
Титры, пулов мутантов ВЭМТ (штамма gdvii) определяли титрованием на монослое внк-21, рассчитывали по методу Рида-Менча и выражали в тцд50. Мышей линии ва1в/с заражали церебрально десятикратными разведениями вируса, дозами от 1,5 до 7,5 log (ТЩЫ. Каждым разведением заражали по 8 двухнедельных мышей и за развитием заболеваний наблюдали в течение 45 дней. Дозу вируса, вызывающую заболевание у половины инфицированных животных (ПДео), определяли по методу Рида-Менча. При заражении каздым мутантным вирусом, пп кражей мере; у двух заболевших мыщей изымали мозговую ткань и определяли первичную структуру РНК патогена в районе стартового кодона. Для всех мутантных вирусов (за исключением gd/i.27-40 и gd/pv-12 (-22), о которых речь будет идти ниже) было показано, что геномы вводимого вируса и патогена, выделенного из нервной ткани, одинаковы.
Исходно олигопирмидиновый блок у ВЭМТ штамм gdvii состоит из 12 нуклеотидоз. В результате мутаций правой части блока у вирусов gv—2 и gd-19 оставались интактными только 5 нуклеотидов (эти нуклеотиды ихшис далее будем называть боксом А, по аналогии с полиовирусом). Эти мутанты не отличались от дикого типа ни по бляшечному фенотипу на внк-21, ни по степени нейровирулентности (табл. 7). Нуклеотидные замены в левой части олигопиримидина у мутанта gd-20 никак не сказывались на его фенотипе в внк-21, однако, этот мутант был почти на два порядка более аттенуирован для мышей, чем ' дикий вирус (табл. 7). Оставшийся у gd-20 олигопиримидиновый участок исиш был обозначен боксом А'. Наконец, уничтожение всего олигопиримидина посредством нуклеотидных замен (gd-21), никак не сказываясь на фенотипе в внк-21, приводило к полной аттенуации вируса. пд50 мутанта gd-21 была более чем на пять порядков выше, чем у дикого типа (табл. 7). Так, при заражении тридцати мышей максимальной дозой gd-21 только у одной особи наблюдали слабые парезы.
Из сказанного следует, что, во-первых, олигопиримидиновый блок вблизи 3' границы ires'а необходим для репродукции ВЭМТ в нервных" клетках мышей; во-вторых, для нормальной репродукции ВЭМТ достаточно пяти пиримидкнов подряд; в-третьих, вирусы, обладающие как только боксом А, так и только боксом А', сохраняют способность вызывать поражения нервной системы мышей, хотя и с уменьшенной
эффективностью при наличии только бокса А'.
Было выдвинуто предположение, что олигопиримкдиновые бокса (А и А') функционируют в качестве элемента тандема, где второй составляющей является инициаторный aug, и расстояние между этими элементами существенно влияет на эффективность узнавания тандема (и, как следствие, на степень аттенуации). Падение вирулентности в случае gd-20 является, по-видимому, следствием неоптимальной дистанции между боксом А' и AUGioee (16 нт). Действительно, при изучении вирулентности специально созданного мутанта gd/m-54 было обнаружено увеличение его ПДьо на порядок (табл. 7).
Мутации в спейсерном участке между олигопиримидином и AUGioea в случае gd-э не влияли на его нейровирулентяость (табл. 7), что свидетельствовало о несущественности первичной структуры этого спейсера.
Увеличение дистанции между боксом А и aug приводило к снижению (вплоть до полной потери) патогенности мутантов ВЭМТ. Действительно, при удлинении спейсера на 2? (gd/i.27-40) либо 108
НТ (gd/pv-12 и -22) И ПРИ ОТСУТСТВИИ В Нем aug (СТЭРТОВОГО ЛИбО
молчащего) вирусы становились аттенуированными (табл. 8). Поскольку бляшечный фенотип данных мутантов на внк-2х близок к таковому у дикого типа (табл. 8), эффект аттенуации, обусловленный отсутствием aug на нужном расстоянии от бокса А, является тканеспецифическим. Поражения, появлявшиеся с низкой частотой при заражении мышей аттенуированными мутантами- gd/i.27-40, gd/pv-iz и -22, были обусловлены появлением псевдоревертантов в нервной ткани мышей. Действительно, была определена первичная структура РЖ патогенов непосредственно в мозговой суспензии мышей, зараженных максимальными дозами этих мутантов. Все, без исключения, ревертанты либо теряли вставку (целиком или частично, иногда с частью примыкающей родительской последовательности РЖ), либо приобретали криптический aug во вставке (у ревертантов gd/fv-22). Структура геномов ревертантов представлена в табл. 9 и 10. В результате реверсий восстанавливался тандем бокса А и aug (аутентичного либо критического) с расстояниями между ними, варьирующими в пределах 19-28 нт.
Для ревертантов gd-40ri, r2 и r4 со епейсерным расстоянием между боксом А и шшциаторным augioós, увеличенным на I, 4 и 7 нт, соответственно, были определены ПД50. По этому показателю gd-4ori не отличался от дикого типа; однако, увеличение спейсера на 4-7 нт
Таблица 9. Структура геномов патогенов, отобранных после инфицирования мышей аттенуированным gd/i.27-40
название ' появление параличей 1 день доза ! i нуклеотидная последовательность бокс AjAVQ спейсер
СП/1.27-40 1040 1071 4. -1 GGUU^CGGAUCUUUUAUUUUAUUGAAUUAGAUCUGAUCCUAUUAUAUUGUCAAUAUGG 48
GD-40R1 1.1 7.8 GGUUUUCGGAUCUUUUА"•«»»«»**«***»*»»•»*»**•» "UAUAUUGUCAAUAUGG 22
GD-40R2 13 7.5 GGUUUUCGG AUCUUWAUU* *****»»»**«***««•»**»» WAUAUUGUCAAUAUGG 25
GD-40R3 14 7.5 GGUUUUCGGAUCUUU* ***«»•**»»•♦«»««•*««*•* »UAUUAUAUUGUCAAUAUGG 23
GD-40R4 20 7.5 GGUUUUCGG AUWUUUAWU* ****»*»»«**»»***«» »UAUUAUAUUGUCAAUAUGG 28
GD-40R5 21 6.5 GGUUWCG* * •*»**»«*•«»»•»**««» «GAUCUGAUCCUAUUAUAUUGUCAAUAUGG 26
GD-40R6 35 5.5 GGUUUUCGG AUCUUUU »«»*»«•«»«»****«*»**»***»■• WAUAUUGUCAAUAUGG 22
GD-40R7 18 7.8 GGUUUUCGG AUCUUUU •*»*****«»***«*»»»*» AUCCU/ lUU AU AUUGUC A AUAUGG 28
GD-40R8 16 7.8 GGUUUUCGGAUCUUU »*»««»«««»»«««»«««»««««»» UnUU AU AUUGUCAAU AUGG 2.3
GD-40R9 10 7.8 GGUUUUCGG AUCUUWA*»„»»*».*...».« *.«»».»«» ч »1JAUAUUGUCAAUAUGG GGUUUUCG* »»»ж*«»»**»«******» * »GAUCUGAUCCUAUUAUAWGUCAAUAUGG 22 26
Обозначения такие же как в табл. 7. Удаленные нт обозначены звездочками. Вводимая доза выражена в log (ТЦД ).
Таблица 10. Структура геномов патогенов, отобранных после инфицирования мышей аттенуированными со/ру-22 и -12
название 1 появление параличей 1 день доза куклеотидная последовательность i бокс A/AUG спейсер
GD/PV-22 юао GGUUUUCGGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGCUUUUGG. 107) J. .CCUAUlAUAUUGUCAAUAUGG 129
GD/PV-22R1 10 8.2 GGUWUCGG AUWGUUWAUUGUGGCUGCUUaUGG. . . CCUAWAUAUUGUCAAUAUGG 24
GD/PV-22R2 11 8.2 GGUUUUCGG AUCUGUUWAU***** *»*»***•»*. .****UUAUAUUGUCAAUAUGG 26
GD/PV-22R3 15 8.2 xU—1 GGUlMtJCGGAUCUGUU**'*«»*»»*»**»»«»»■». , , * * * »UliAUAUUGUCAAUAUGG 23
GD/PV-12 GGIJUUUCGGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGAAAUUGG . CCUAUll AUAUUGUCAAUAUGG 129
GD/PV-12R1 16 7.5 GGUUWCGG AUCUGUU****»•*«***«»*»*"*'», , ***«*.« *UAWGUCAAUAUGG 19
GD/PV-12R2 18 7.5 GGUUUUCGaAUCUGUUU******************. .* *UAUUAUAUUGUCAAUAUGG 25
Обозначения такие же как в табл. 8 . Удаленные нт обозначены звездочками. Вводимая доза выражена в log (ТЦЦ ).
Эти Таблица II. Фенотип юевертантов, отобранных от вируса gd/i.27-40
... _ размер ПД50
название бляшек Ct>E10)
GDVII 3.3 2.5
GD-40 1.7 >7.8
GD-40R1 3.6 2.8
GD-40R2 3. 4 4.2
GD-40R4 3. 3 4.0
приводило к возрастанию ПДво на -1,5 порядка (табл. II) данные, с одной стороны, подтверждают патогенность
ревертантов, а, с другой, указывают на зависимость степени эттенуации вируса от возрастания дистанции между боксом А и aug. Суммируя вышеизложенные
результаты, можно сделать вывод, ito длина спейсерного участка ■»вяду ' элементами тспдсмз злигопиримидин/aug должна быть в феделах 16-28 нуклеотидов, гричем при граничных значениях длины наблюдается снижение шйровирулентности почти на два порядка, а дальнейшее ее увеличение [уменьшение) приводит к полной аттенуации.
Была определена степень нейровирулентности мутантов gd/pv-i и -11, имеющих в геноме 108-нг вставку между боксом А и аутентичным ¡тартовым кодоном. Во вставке на расстоянии 24 нт от бокса А имелся глиптический aug, который можно было рассматривать в качестве »торого элемента тандема. Оба вируса вызывали летальные поражения у шей, хотя и имели Iffiso на два порядка выше, чем у дикого типа табл. 8). Мутант gd/i.27-43 с 27 кт вставкой, содержащей риптический aug на расстоянии в 21 нт от бокса А, также вызывал сражения у мышей приблизительно с той же эффективностью, что и d/pv-1 (-II) (табл. 8). ПД50 вируса gd/i.27-44 с 27-нт вставкой, одержащей aug в инициаторном контексте на расстоянии 21 нт от окса А, была близка к таковой у дикого типа (табл. 8); езначительное падение вирулентности, судя по всему, обусловлено довзском" на ' ы-конце лидерного белка девяти дополнительных минокислот.
На основе вышеизложенного были сделаны два вывода: во-первых, ля нейровирулентности ВЗМТ необходим aug на определенном асстоянии от олигопиримидина, и, во-вторых, стартовый кодон в андеме бокс A/aug несколько более эффективен с точки зрения эпродуктивной способности ВЭМТ в нервной ткани мышей, нежели риптический.
Наблюдаемые эффекты влияния тандема бокс A/aug на
нейровирулентность ВЭМТ скорее всего обусловлены различно: эффективностью инициации трансляции мутантных РНК в нервны клетках, и, как следствие, различными репродуктивными потенциалам вирусов. Это предположение тлеет под собой большую базу: во-первых имеющиеся ^amane свидетельствуют, что 3'-концевая часть 5-НТО РН пикорнавирусов'вовлечена только в обеспечение инициации трансляции а, во-вторых, взаимосвязь эффективности инициации трансляции з репродуктивной способности вирусов при геномных изменениях i тандеме олигопиримидин/дш была доказана на примере вирус; полиомиелита. Особо стоит подчеркнуть, что требования предъявляемые к организации тандемов бокс A/aug, одинаковы как i о mnjQa гтг, чновируса, тзк и у ВЗМТ.
Наконец, было исследовано значение вторичной структур! элементов тандема для нейровирулентности ВЗМТ. В случае мутант* gd-7 спирализация олигопиримидинового блока (см. в следущеь разделе рис. 146) никак не отразилась на его вирулентности (табл, 7). Аналогично, вовлечение в дуплекс стартового кодона у gd-sii (рис. 14д) не повлияло на его ЦЦ5с (табл. 7). Поскольку, с одно! стороны, спирализованный элемент тандема у GD-sir являете? одновременно и стартовым кодоном, а, с другой стороны, для начале белкового синтеза необходимо взаимодействие инициаторной тРНК с одноцепочечным триплетом aug, можно предположить что (I) после образования комплекса рибосомы с РНК происходит локальное плавление вторичной структуры РНК вблизи aug, (2) происходит "узнавание" тандема бокс A/aug рибосомой (или ее субъединицей), что, возможно, повышает стабильность РНК/рибосомального комплекса, (3) происходит сборка шшциаторного комплекса на стартовом кодоне и начинается белковый синтез.
Параметры, характеризующие поведение мутантов ВЗМТ in vitro, например, при размножении в клетках внк-21, разительно не согласуются со степенью их нейровирулентности. Обнаруженная гканеспецифкчность свидетельствует о том, что существуют Еозяин-зависимые вариации в роли тандема олигопиримидин/AUG, зероятно, обусловленные наличием (отсутствием) в трансляционном аппарате хозяина ряда транс-факторов, вовлеченных в ВИТ.
Тканеспецифичность размноаения ВЭМТ создает перспективу для ^пользования некоторых его аттенуированных мутантов з качестве кивой вакцины. При этом вакцинные вирусы будут легко и в больших соличествах накапливаться в культуре ткани, материал будет обладать
большой генетической стабильностью, и, поскольку нет никаки: дополнительных мутаций в кодирующей области, вирус будет стабильны! при хранении; при всем при этом, вакцинные вирусы будут полносты утрачивать способность размножаться в определенных тканях Поскольку все представители КА-группы имеют сходную с ВЭМ организацию 5-НТО, метод создания живых вакцин с помощы модификаций тандема олигопиримидин/дш можно экстраполировать и не другие объекты, представляющие большой практический интерес.
3.3 Возможная роль тандема - олигопиримидин/дте в посадке рибосомь
на шкорнавирусные матрицы
Как было показано выше, нарушение расстояния между двумя консервативными элементами, шисс (боксом А) и дисвзб, приводит к значительному падению эффективности инициации трансляции мутантных РНК полиовируса. В результате, уровень размножения мутантов был низок и их геномы были нестабильны. Была отобрана большая коллекция генетически стабильных псевдоревертантов с восстановленными матричной активностью РНК и репродуктивной способностью вируса. Схемы генетических изменений ревертантов, полученных от мутантов полиовируса со вставками и делециями, представлены на рис. 10а и б, соответственно. Все, без исключения, генетические изменения были направлены на восстановление тандема бокса А и див на определенном (15-31 нт) расстоянии друг от друга с оптимумом при 22 нт.
Для нейровирулентности ВЭМТ нами также была показана важность тандема олигопиримидин/див. При зтом генетические изменения у патогенных для мышей ревертантов были аналогичны таковым у юлиовируса.
Совокупность этих данных может быть объяснена следующим збразом:
Во-первых, олигопиримидиновый участок, бокс А, является существенным для кэп-независимой внутренней посадки рибосомы на шкорнавирусные РНК. Олигопиримидин можно рассматривать в качестве зункционального аналога прокариотической последовательности 1айна-Дальгарно, поскольку он комплементарен 3' концевому сегменту рибосомальной РНК.
Во-вторых, лис триплет (крштический либо иницизторный) должен [аходиться на определенном расстоянии (15-31 нт, с оптимумом в ¡айоне 22) от бокса А.
В-третьих, положение тандема бокс А/див относительно других ис-элементов п^'а является критическим (поскольку в ряде
(а)
о
ТОЧЕЧНЫЕ 3MUSH1
О h
SJ —ЫВ
A
даляции
(б)
О
D
даеции
У
о
ТОЧЕЧНЫЕ ЗАМЕНЫ
О
у
/
э
о
\
8 J ч&лД--О»
A Bf--
э
' =о
Рис. 10. Модель взаимодействия рибосомы с тандемом олигопиримидин/AUG в процессе . ВИТ. Стабильность комплекса рибосома/РНК зависит от организации тандема. Схема генетических изменений у ревертантов, отобранных от конструкций с увеличенным (а) и уменьшенным (б) спейсером между элементами тандема. А -
ОЛИГОПИРИМИДИН, В - AUG.
з
» .
юнструкцкй со вставками присутствовал олигошримидиновый участок ¡нутри вставки на допустимом расстоянии от aug; однако, это не Приводило к образованию функционально активного тандема).
На основе вышеизложенного была предложена модель (заимодействия рибосомы с тандемом олигопиримидш/AUG. 40s шбосомальная субъединица узнает тандем бокс А/aug, вероятно, в >езультате (I) комплементарности бокса А и I8s рРНК и (2) (заимодействия aug с рибосомой в районе пептидильного центра (цри 'частии, возможно, некоторых белковых факторов и транспортных РНК). !амечательно сходство данной модели внутренней посадки рибосомы на икорнавирусные матрицы с прокариотической моделью инициации :рансляции (которая, по-существу, всегда внутренняя), что, юзможно, является некоторым эволюционным реликтом. Однако, есть и тзличия: во-первых, помимо тандема необходимо наличие примыкающего : нему ires'а, и, во-вторых, на aug не всегда может начинаться ¡элковый синтез; при отсутствии у aug инициаторного контекста гибосома начинает сканирование. Предполагается, что наличие тандема ювышает стабильность РНК/рибосомального комплекса.
Однако, в некоторых системах (в определенном хозяине и в ючетании с определенным ires'om) тандем олигопиримидин/aug не (вляется необходимым.
4. МОДЕЛЬ ВНУТРЕННЕЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ПИКОРНАВИРУСОВ
ires'h пикорнавирусов очень протяженны и сложно организованы, [одразумевается наличие многоточечных взаимодействий рибосомы (или е 40s субъединицы) с различными участками РНК (вероятно, дасредованных рядом белковых факторов) в процессе посадки рибосомы :а матрицу. Возникает ряд вопросов: Каким образом в процессе БИТ ыбирается конечный продуктивный контакт рибосомы с матрицей; после юторого рибосома может начать белковый синтез либо линейное канирование вдоль матрицы? Какова протяженность участка РНК, с оторым реализуются продуктивные контакты? Имеет ли такой участок жесткую'' пространственную локализацию? Каковы требования к его :ервичной и вторичной структуре? Сколько может быть таких участков :а матрице?
Kaminski et aj. (I9S0) показали, что в бесклеточных системах рансляции синтез полипротеяяа ВЭМК начинается исключительно со тартового кодона, в то время как aug, удаленный от него всего лишь а 8 нуклеотидов к 5' концу, игнорируется. Следовательно, должны
существовать некие правила выбора стартовой точки трансляции. Потенциальным элементом, определяющим стартовую точку у пикорнавирусов мог бы быть тандем олигопиримидан/aug, локализованный в непосредственной близости. Однако, в предыдущем разделе было показано, что мутанты ВЭМТ с разрушенным тандемом мало чем отличаются от дикого вируса в бесклеточных системах трансляции и клетках внк-21. Следовательно, по крайней мере в данном случае тандем не влияет на выбор стартовой точки трансляции. Если не тандем определяет стартовую точку, то что же?
4.1 Концепция стартового окна
Исходной предпосылкой являлось предположение, что многоточечная фиксация рибосомы на матрице сгерически лимитирует участок РНК -стартовое окно (СО) - с нуклеотидами которого рибосома может эавновероятно образовать продуктивный контакт. После этого 1ачинается движение рибосомы вдоль РНК, будь то трансляция или жанироваше (рис. На).
Был создан набор мутантшх РНК, имеющих одну и ту же пару шициаторных aug кодонов (в одной либо разных ОРС), рамки которых солируют легко различимые пептиды. Такой тандем aug кодонов зставлялся в разные локусы РНК ВЭМТ правее 3' границы ires'a. Когда )ба aug находятся за границей стартового окна (рис. 116), экспрессия первой ОРС предположительно должна быть полностью обусловлена рибосомами, прибывапдкш от СО. При этом уровень шициации на первом aug зависит преимущественно от его контекста; в ю же время, aug-2 используется для начала белкового синтеза только "еми рибосомами, которые по тем или иным причинам не узнали aug-i. [о тех пор пока оба aug находятся за границей СО, отношение «спрессий ОРС I/0PC 2 остается постоянным (рис. Ид). Как только lUg—1 попадает внутрь СО, отношение эксцрессий двух ОРС должно '.вмениться (рис. Ив). Ожидается наличие полярного эффекта, оскольку близость aug-i к 5' концу СО должна повышать вероятность родуктивного -контакта рибосомы с участком СО за этим кодовом, и, ледовательно, уменьшаются шансы его узнавания в качестве нициаторного. Таким образом, отношение экспрессии ОРС I/OPC 2 олжно непрерывно снижаться по мере продвижения aug-i внутри СО в '-»5' направлении (рис. Ив, д). Пересечение aug-i кодовом 5' раницы СО должно привести к его полной инактивации как инициатора, то время как будет идти активная экспрессия ОРС 2 (рис. Иг).
ПОЗИЦИЯ AUG—1 ОТНОС. IRES'а
[с. II. Схематическое представление концепции стартового окна, (а) sEs-связанная 40s рибосомальная субъедшшца образует продуктивные «нтакты только с нуклеотидами внутри стартового окна. Если внутри СО ¡еется инициэтошый aug, то на нем начинается белковый синтез; в отивном случае, рибосома начинает сканирование РНК. (б-г) Овдаемая висимость уровня экспрессии (отражена толщиной горизонтальных релок) двух ОРС от положения их стартовых кодонов (прямоугольники) носительно ires'а. Вертикальные стрелки иллюстрируют способность босомы равновероятно образовывать продуктивные контакты с любыми клеотидами СО. (д) Теоретическое отношение экспрессий 0PC-I/0PC-2 в висимости от позиции aug—I относительно ires'а.
.2 Идентификация стартового окна (СО) в геноме ВЭМТ
Сначала была определена 3f граница ires'а РНК ВЭМТ. Из редадущих экспериментов по мутированию олигопиримиданового тракта ытекало, что 3' граница ires'а находится перед то«. Для пределения этой границы был создан набор делеционных конструкций а .основе генома ВЭМТ штамма gdvii (табл. 12). После определения атричной активности делентов, 3' граница ires'а была локализована зжду позициями I036-1043, поскольку удаление именно этого сегмента gd/A2i—зб приводило к падению уровня трансляции более чем в 100 аз. Поскольку именно делецяя I036-IQ43 полностью разрушала энсервативный для КА-группы домен 5 (1025-1044 нт, см. п. 2.3), за ' границу ires'а был принят последний нуклеотид этого домена
1043.
Таблица 12. Деленты gdvii и некоторые свойства их транскриптов
нуклеотвдкая последовательность
1034 Ю13
GGTCTTGGTT TTCTCTTTTTATTATATTGTCAATATGGCT
GGTCTTGGTT----------------------------GGCT
GGTCTTGGTT--------------------GTCAATATGGCT
GG---------------------ATATTGTCAATATGGCT
GG'fCTTGGTTTTCTCTTTg---------GTCAATATGGCT
GGTCTTGGTTTTCg-------ТТ ATATTGTCAATATGGCT
матричная активность РРЛ Кребс-2
gdvii
gd/a26-34
gd/a18-38
С,С/Д21-36
GD/A9-10
GD/A7-27
1.00 0.15" 0. 15е 0.01* 0. 30а О. 32Ь
1. 00 0. 12а 0. 12* 0. 01а 0. 13Ъ 0.33
Удаленные нт помечены дефисами, а замены - маленькими буквами. Олигопиримидин и инициа торный aug подчеркнуты толстой и тонкой линиями, соответственно.
г -.Синтез белка начинается исключительно с augum.
- Синтез белка начинается преимущественно с augms, и частично с аутентичного стартового кодона.
РНК ВЭМТ штамма веап имеет пару инщиаторшх aug, открывающих зные ОРС (рис. 12). ашю64 является основным инициаторши доном, открывающим ОРС полипротеина, a augiott направляет синтез кДа белка. В исходном вирусе экспрессия второй ОРС достаточно ла и обусловлена, вероятнее всего, рибосомами, не узнавшими рвый стартовый кодон.
3' граница ires'а у веап приходится на 1039 нт. Делеция ткрех нт (1044-1047) в спейсерном участке между ires'om и ашюм
GDVII
I—► viral frame
1068 ♦
UCAAlfMM^.
■ viral Irame
gcüc&iíste
IRES
gg^j^ (—»viral Irame
i
ugaauíaugfa
-viral frame
ugcucäugis
17X trame
. 17K frame
Рис. ±2. Положения и контексты aug триплетов в геноме ВЗМТ v итаммов GDVXI и ВеАп. Различные ОРС обозначены viral frame грамка основного вирусного полипротеина) и 17к frame (рамка белка 17 кДа у
(ВА/А4-28) приводит к умеренному снижению экспрессии основной ОРС и значительному увеличению синтеза 17 дДа белка в экстракте Кребс-2 (табл. 13). Этот эффект обусловлен изменением длины спейсера между ires'ом и AUG, поскольку мутации в ВА-б (в участке, удаленном у ВА/Д4-28) никак не влияют на экспрессию обеих ОРС. При делеции пяти ят (ВА/Д5-29) изменение отношения экспрессии двух ОРС становится зще более значительным. Подобный отклик свидетельствует о движении WGioei внутри СО в 3'->5' направлении (рис. Ид и 13). При удалении
11 нт из спейсера .(ba/ди-зо) экспрессия основной ОРС подавляется в
12 раз, в то время как синтез 17 кДа белка возрастает в 7 раз (табл. 13). Такое поведение согласуется с локализацией первого aug зблизи 5' границы СО (рис. Ид и 13).
Трансляция транскриптов делеционных мутантов в РЖ, где 1роисходат эффективный процессинг вирусного полипротеина, показала, ito ва/ди-зо не образует лкдерный пептид ь (первый в основной ЗРС). Отсутствие l отражает тот факт, что при укорочении дистанции ¿виду ires'ом и augioc.4 на II нт, первый aug оказывается вне СО и
5
Таблица 13. Эффективность экспрессии двух ОРС у мутантов ВЭМТ штамм веАп
эффективность экспрессии ОРС
название нуклеотидная последовательность РРЛ Коебс-2
! вирусная 17К отнош. вирусная 17К. отнош.
ВеАп 103В 1069 ^ А ТТТТСАСТТТТТАТСАСАСТСТСААТАТСССС .1.00 1.00 16. 5 1 00 1.00 4.00
ВА-6 ТТГТСяяаТссТАТСАСАСТСТСААТАТСССС 0. 65 0.65 16.5 0 95 0. 95 4. 00
ВА/Д4-28 ТТТТСя----сТАТСАСАСТСТСААТАТСС-СС 0.55 2.85 3.50 0 70 2.20 1. 30
ВА/Д5-29 ТТТТС------сТАТСАСАСТСТСААТАТСССС 0. 50 3.30 2.50 0 60 3. 10 0.75
ВА/Д11-30 ттгrcg-----------АСТСТСААТАТСССС 0.20а 3.80 0. 80 0 08* 7. 00 0. 05
ТТТТСЗ 1-ТАТСАСАСТСТСААТАТСССС
ВА/1.4-47 0.95 0.90 17.2 0. 95 0. 90 4. 20
Делеции обозначены дефисами, а мутации - маленькими буквами. Стартовый кодон ОРС вирусного полипротеина подчеркнут. Дано отношение эффективности экспрессии вирусной ОРС к ОРС белка 17 кДа, §ормализованных по содержанию метионина. - Синтез бежа начинается исключительно с Агатв.
становится недоступным для продуктивных контактов с рибосомой (рис Иг). Остаточный уровень экспрессии основной вирусной ОРС : ва/ди-зо обусловлен переключением белкового синтеза на augih (рис. 12).
Подчеркнем, что суммарный уровень экспрессии двух ОРС j мутантов с делециями не ниже, чем в случае РНК дикого типа. Этот факт подтверждает предположение о равновероятности продуктивных контактов рибосомы с различными нуклеотидаш внутри СО. Полученные данные также свидетельствуют о постоянной, относительно ires'а, локализации СО, не зависящей от присутствия (отсутствия) в нем стартового кодона либо других цис-сигналов.
Поскольку дистанция между ires'ом и отт в РНК веАп равна 24 нт, вышеизложенные данные позволили установить 5' границу СО в районе 14-18 нт от 3' границы ires'а (рис. 13).
ОРС-1 ОРС-2
5 7 9 h 13 ',5 17 !'? 2; 23 25 27 29 3i ПОЗИЦИЯ aug1064 ОТНОС. IRES'а
Рис. 13. Отношение экспрессий вирусного полипротеина к белку 17 Кда в зависимости от позиции augio64 при трансляции мутантов ведп в экстракте Кребс-2.
3' граница СО бала выведена на основе анализа продуктов трансляции мутантной РЖ ва/ 1.4-47 с увеличенным на 4 нт спейсером «ежду ires'см и aug—i. При трансляции в двух бесклеточных системах Фовень экспрессий обеих ОРС мутанта ba/i.4-47 не отличался от [аблюдаемых у родительской РЖ (табл. 13). Этот факт указывал на юкализацию augms* в геноме дикого типа в районе 3' границы СО, и,
следовательно, 3' граница СО находится на расстоянии -27 нт правее. ip.es'а (рис. 13).
Более строго 5' граница СО была определена в опытах с матрицами gdvii с укороченными на 7 и 9 нт спейсепами (табл. 12). В этом случае наблюдали за синтезом пептидов с двух различных aug, находящихся в основной вирусной ОРС: дтоювв и augim?, локализация которых в геноме представлена на рис. 12. В результате было показано, что укорочение расстояния между ires'om и au&osb на 7 кт (gd/a7-27) является критическим: осноеной белковый синтез идет с augu49, но augio6s еще активен. Удаление 9 нт приводит к полному переключению трансляции на второй aug кодон. Следовательно. iv граница СО находится на расстоянии 16-17 нт от iRES'a..
Суммируя все данные, изложенные в этом пункте, СО локализуется мезду 16-м и 27-м нт правее 3' границы iRES'a.
4.3 Особенности строения стартового окна
Фиксированное положение СО относительно iRES'a, с одной стороны, и, инфекционность и высокая матричная активность РЖ мутантов с протяженными вставками без aug, с другой, свидетельствуют о том, что взаимодействие рибосомы со стартовым окном не требует специфической последовательности. Способность рибосомы контактировать с СО независимо от его нуклеотидного состава была дополнительно проверена экспериментами, в которых у мутантов со вставками в район СО (позиции 16-27 относительно iRES'a) внедряли aug кодоны (в осноеной ОРС), и определяли точки инициации белкового• синтеза. У мутанта gd/pv-i aug во вставке (удаленный на 27 нт от ires'3) имеет достаточно плохой контекст (табл. 14). Как и ожидалось по концепции СО, синтез белков начинается- на двух aug: не очень эффективный на встроенном aug (в силу его плохого контекста) и достаточно высокий на истинном инициаторном augioes. У мутанта gd/i.27-44 в локус СО был внедрен aug с хорошим контекстом (как у augmes; табл. 14). Матричная активность РНК gd/i.27-44 в двух трансляционных системах была такой же высокой, как и у РНК дикого типа, при этом, как и предполагалось, инициация трансляции начиналась исключительно на искусственно встроенном aug. Способность рибосомы начинать белковый синтез на aug, внедренном в СО, независимо от первичной структуры РНК в области СО, свидетельствует о (I) постоянной локализации СС относительно iRES'a, и (2) независимости продуктивных контактов оз
Таблица 14. Матричная активность мутантов ВЭМ'Г со вставками
нуклеотидная последовательность
матричная активность . РРЛ Кребс-2
GDVII
GD/1.27-40 GD/I.27-43 GD/I. 27-44
GD/PV-1
GD/PV-11
GD/PV-12
GD/PV-22
GD/PV-2.6
1040 1046
4- 4-
ggttttc tctttt.
10S3 1073
4- 4.
TATTATATTGTCAATATGGCT
^—> insert
GGTTTTC GGATCTTTTATTTT GGTTTTC GGATCTTTTATTTT GGTTTTC GGATCTTTTATTTT SS9
ATTGAATTAG ATTGtATatG ATTcAATatG
ATCTGATCC........................... TATTATATTGTCAATATGGCT
tTCTGATCC........................... TATTATATTGTCAATATGGCT
gctaGATCC........................... TATTATATTGTCAATATGGCT
po I i о v 1 г us
sequence
GGTTTTC GGATCTGTTTTATT GGTTTTC GGATCTGTTTTATT GGTTTTC GGATCTGTTTTATT GGTTTTC GGATCTGTTTTATT GGTTTTC GGATCTGTTTTATT
GTGGCTGCTT GTGGCTGCTT GTGGCTGaaa GTGGCTGCTT GTGGCTGCTT
j-AGCGAATTGGATTGGCCATCCGGTGAAAGTGAGAC:TCATTATCTATCTGTTTGCTGGAT-|
' I 675
CC TATTATATTGTCAATATGGCT CC TATTATATTGTCAATATGGCT CC TATTATATTGTCAATATGGCT CC TATTATATTGTCAATATGGCT Cg с с aTAT t gTGTCAATATGGCT
ATGGTGACAATCACAGATTGTTATCATAA AJGGTGACAATCACAGATTGTTtagtctA tTGGTGACAATCACAGATTGTTATCATAA tTGGTGACAATCACAGATTGTTtagtctA ATGGTGACAATCACAGATTGTTATCATAA
1.00 1.00
0.45 0.50 0.18 0.45 0.85® 0.80*
0.12 0.40 0.10 0.35 0. 35 0. 30 0.25 0.25 0.12 0.40b
Все мутантные РНК инфекционны, а вирусы генетически стабильны. Замененные нуклеотиды внутри вставок (insert) напечатаны маленышми буквами. Точки использованы для выравнивания, aug внутри вставок и аутентичный стартовый ко дон .подчеркнуты тонкими и толстыми линиями, соответственно. Нуклеотиды внутри стартового окна взяты в рамку. £ - Синтез белка начинается преимущественно с aug во вставке.
- Синтез белка начинается преимущественно с augio6b, и частичко с aug во вставке.
;ервичной структуры СО.
Хотя СО функционирует не специфическим образом, присутствие нициаторного кодона вблизи 3' границы СО (gdvii и gd/i.27-44) симулирует инициацию белкового синтеза в 2 раза по сравнению с инструкциями без инициаторного aug (gd/i. 27-40 и -43). Для »бъяснешя этого феномена мы предположили, что рибосома, связанная ; ires'ом> при контакте с СО имеет большую возможность "узнать" зтартовый кодон и образовать инициаторный комплекс на нем, чем при жанцровашш (например, вследствие большего времени контакта жбосомы с aug в СО).
Далее были исследованы ограничения на пространственную организацию СО на уровне вторичной структуры. Сначала была определена нативная укладка РНК ВЭМТ в районе СО (рис. 14а). Сказалось, что у РНК дикого типа лишь 2 нт вблизи инициаторного aug находятся в одноцепочечном состоянии. Когда практически весь зпейсерный участок между ires'см и СО был вовлечен в двуцвпочечные взаимодействия, мутантная РНК (gd-7) была инфекционна и являлась цовольно активной матрицей (рис. 146). Однако, когда все стартовое экко было помещено в совершенную шпильку (gd-8), мутантная РНК полностью потеряла иифекционность и матричную активность (рис. 14в). Наблюдаемый у gd-s ингибиторный эффект был полностью обусловлен "закрытием" СО, а не запетливанием augio68. Действительно, у мутанта gd/pv-26 с такой же структурой в районе' augiosb , как у gd-8, но удаленной от ires'а благодаря протяженной вставке (и, следовательно, СО в этом случае было "открыто"), РНК была инфекционной, причем ее матричная активность не отличалась от таковой у родительского gd/pv-i, а мутангный вирус был генетически стабильным (табл. 14).
Предположение, что инактивация СО обусловлена отсутствием в нем одноцепочечных нуклеотидов, доступных для контакта с рибосомой, было подтверждено на примере мутанта gd-зо, имеющем 10-нт вставку перед AUG1068. у этого мутанта СО было запзтлено, в то время как укладка РНК вокруг инициаторного augioss оставалась как у дикого типа (рис. 14г). РНК gd-s о была неинфекционной и обладала очень низкой матричной активностью.
Наконец, было показано, что для обеспечения возможности контакта с рибосомой, достаточно нескольких неспаренных нуклеотидов в любом месте внутри СО: у gd-si augkks вовлечен в дуплекс из 9
(а)
GDVII
о
SI -v VI
— В. cereus
— Phy M T1
• О DMS
• V
• 11 ' r
(6)
GD-7
инфекционный
SCCGA_ACGUUU
U
матричная активность
KpeOc-2 45%
u ооЛ» + о ? • /
ICU- UGCAAA GG "AtlAC -л-<,,, UGUG, G'
та
33%
(в)
s и
G-A
ic-
OA-OA-
OA-
U ■С
•и •и ■G
G
-Ц
■U
-и
GD-8
в с в с » u ц
trtttttt
if f г и
и
оссАс
* о.
UGCAAA GG-A'JAC
* '*/
С с , •
, ACGDW СС А С 1 I О
.UGUG tG*
неинфекционный
матричная активность Иреос-и
Ъ%
РЕП
&%
1061
>ис. 14. Вторичная структура РНК мутантов ста в районе стартового ясна. Стартовый дис заштрихован, а локус стартового окна заключен в
(г)
*
s i и
G-A -A
4
OA-OA OA I
GD-50
s
Oici Oi
Ю57 _ АЧа
. tHa ^L'no
O-ao ' • , u-ao'"'
неинфекционный
матричная активность Кребс-2 EPJI 8% 9%
t 02 5
ш
¿CAA°
ir о
;s - AU AC A*
. GCCGA_ACGUUU CC..USUG C . AC *
w
GD-51
ее/
и и
G-C A-a ^.A-U
♦с-с - ь»
OA- U
OA-U
OA-U • •
I UCUOJUUVTOMJU 5 | а
'Ч--
«ш
инфекционный
матричная активность Кребс-2" PPI ЬЪ% 10%
пар, однако, при этом, несколько нт внутри СО оставались неспаренными (рис. 14д). РНК сп-ы бала инфекционной и обладала высокой матричной активностью.
Таким образом, для продуктивного контакта шез-связэкшй рибосомы с матрицей необходимо и достаточно наличия внутри СО нескольких одноцепочечных нуклеотидов, причем они могут находиться в различных частях СО (за исключением, по-видимому, трехнуклеотидной петли в верхушке спиральной структуры).
4.4 стартовое окно является отличньм от гиЕЗ'а функционально важным элементом
Наши исследования выявили следующие особенности организации
СО:
(Г) Эффективность, с которой инициируется белковый синтез на стартовом кодоне, зависит от его положения относительно 3' границы тиез'а. До тех пор, пока расстояние между ткеб'ом и ато не
0
I I Z D
евышает критического порога, равного для ВЭМТ 16-17 нт, aug не >жет использоваться в качестве ишщиаторного. Далее к 3' концу [еется короткий сегмент РНК (около дюжины нт) - стартовое окно, [утри которого вероятность узнавания aug рибосомой практически нейно возрастает при смещении aug к 3' границе СО. Выход aug за границу СО существенно не влияет на его инициаторный потенциал :отя и несколько подавляет его). Позиция СО фиксирована ■носительно ires'a.
(2) Эффективность продуктивных контактов рибосомы с СО не висит от нуклеотидной последовательности СО.
(3) Для функционально компетентного состояния СО необходимо и >статочно наличия внутри него нескольких одноцепочечных клеотидов, причем они могут находиться в различных участках СО.
По всей видимости, именно характер взаимодействия рибосомы с les'om определяет локализацию и характеристики СО. С другой ■ороны, инактивация СО (например, посредством его вовлечения в плекс) полностью подавляет способность ires'a направлять ВИТ. жим образом, ires и СО являются различными (хотя и ;аимозависимыми) цис-элементами РНК, имеющими разную локализацию, 'руктурные требования и функции. Функционально активные 'Нформации этих двух элементов в конечном итоге и обеспечивают [Т.
Поскольку для трансляции и сканирования требуется один и тот продуктивный контакт рибосомы с одноцепочечными нуклеотидами ;утри СО, можно предположить, что контактирующий с РНК сайт ;босомы (или ее 40s субъединицы) находится вблизи пептидильного нтра.
Для определения локализации СО в РНК других пжорнавирусов :ли использованы как вышеизложенные данные для полиовируса, так и ;убликованные в печати материалы. Оказалось, что СО у различных корнавирусов занимают идентичные локусы геномз (относительно les's), независимо от способа укладки iRES'a. У всех юдставителей КА-группы инициаторше кодоны находятся па ¡сстоянии 20-25 нт от 3' границы iRES'a, т.е. внутри СО. В отличие • этого, у представителей ЭР-группы стартовый кодон, открывающий 'С полипротеина, находится на расстоянии от 60 (для риновирусов) ! 180 (для знтеровирусоз) нт от iRES'a, Положение СО для >лиовируса легко находится из изложенных з п. 3.1.2 данных о
ревертантах с протяженными делениями, у которых стартовый кодон расположен на расстоянии 19-23 нт от iRES'a. По данным вогшап and Jackson (1392), локализация СО у риновирусов также легко определяется по эффективности утилизации стартового кодона при его смещении в сторону iRES'a; и в этом случае положение СО аналогично найденному у ВЭМТ.
Тот факт, что, несмотря на различные укладки ires'ob у КА- и ЗР-групп локализация СО относительно 3' границы ires'а практически одинакова, указывает на наличие общих закономерностей в механизмах посадки рибосомы на внутренний сегмент пикорнавирусных РНК. Различие между ЭР- и КА-группами состоит в том, что в первом случае рибосома после контакха с СО аачинает поиск aug, а во втором -синтез белка.
Фенотип и матричную активность РНК ряда мутантов полиовируса (например, pvi/03-23 и pvi/A8-ii2, см. параграф 3.1) не удавалось объяснить с точки зрения инактивации тандема олигопиримидин/aug. После разработки концепции СО их поведение становится легко объяснимым.
Действительно, у мутанта pvi/as-h2 расстояние между боксом А и критическим aug не изменялось по сравнению с исходной конструкцией ppvi/Ав (квази-инфекционяой, с очень низким уровнем трансляции мутантной РНК). Тем не менее, наличие у ревертанта мутации, дестабилизирующей основание домена Е (п. З.Г.2), в 5 раз повышало матричную активность РНК, а вирус, хотя и мелкобляшечный, был достаточно стабильным при пассировании. Поскольку в результате делеции 8 нт в РЖ dpvi/as стартовое окно "переместилось'' на двуцепочечную структуру домена Е, СО "закрылось" для контактов с рибосомой. Дестабилизирующая основание домена Е замена в ревертанте pvi/лв—И2 "приоткрыла" стартовое окно, поскольку появились сдноцепочечные нуклеотида, необходимые для контакта с рибосомой,
В случае мутанта pvi/оз-гз измененная нуклеотидная последовательность в спейсере между боксом А и aug образует дуплекс с сегментом РЖ, входящим в СО. В результате, СО мутанта практически не тлеет одноцепочечных нуклеотидов (за исключением, возможно, одного, самого 5' концевого). Это привело к 15-кратному ингибированию матричной активности мутантной РЖ и уменьшению размеров вирусных бляшек (п. 3.1.2). При пассировании pvi/03-23 удалось отобрать ряд ревертантов со значительно улучшенными
:зрактеристиками; во всех случаях были обнаружены нуклеотидные )амены (как в восходящей, так и в нисходящей ветвях' дуплекса), Приводившие к появлению в СО одкоцепочечных нукЛеотидов.
Отметь что в обоих перечисленных примерах сам криптический mg тандема по-прежнему оставался в дуплексе (в домене Е, как в 'еноме дикого типа), а длина спейсера между боксом А и aug у [сходных мутантов и ревертантов не менялась. Реверсии же приводили юлько к появлению различных одноцепочечных нуклеотидов внутри СО. »тсюда следует, что и в случае представителей ЭР-группы рибосома, :вязанная с ires'ом, осуществляет продуктивные контакты с даоцепочечными нуклеотидами внутри СО, причем эти контакты не •реоуют специфической последовательности.
Таким образом, концепция СО является универсальной для всех икорнавирусов, и, скорее всего, для других матриц с ВИТ.
Однако, у вирусов ЭР-группы (в отличие от КА-группы) тандем -лигопиримидин/aug вблизи СО необходим во всех изученных наш истемах трансляции, вероятнее всего, для образования более рочного комплекса рибосомы с РНК. Это связано, по всей видимости, о специфическими особенностями строения iRES'a (нацример, из-за тсутствия в нем сайтов взаимодействия с факторами, табилизирующими его связь с рибосомой). Таким образом, роль 'андема олигопиримидин/aug при инициации трансляции является REs-зависимой.
.5 Гипотетическая модель посадки рибосомы на внутренний участок
РНК в процессе ВИТ у пикорнавирусов
На основе данных, изложенных в разделах 3 и 4 была выдвинута ледующая модель внутренней посадки рибосомы на пикорнавирусные НК:
(1) В результате непосредственного и (или) опосредованного леточными факторами многоточечного взаимодействия рибосомы (или os рибосомальной субъединицы) с протяженным цис-злементом 5-НТО НК пикорнавирусов (ires'om), участок рибосомы (вблизи ее ептидильного центра) образует продуктивный контакт только с уклеотидами внутри определенного сегмента РНК - стартового окна.
(2) У всех ликорнзвирусных РНК локализация СО фиксирована и оответствует участку РНК, расположенному приблизительно мзвду 16 и 7 нуклеотидами к 3' концу от 3' границы ires'а.
(3) iREs-связанная рибосома способна равновероятно
образовывать продуктивные контакты с любыми нуклеотидами СО, независимо от первичной структуры соответствующего сегмента. Однако, для реализации продуктивных контактов с рибосомой необходимо и достаточно наличие нескольких одноцепочечных нуклеотидов в любом участке СО.
(4) После образования продуктивного контакта с СО, рибосома (40s субъединица) присоединяется к внутреннему сегменту РНК вблизи СО. При этом, вероятно, происходит локальное плавление структуры сегмента, ассоциированного с рибосомой.
(5) Стабильность комплекса РНК с рибосомой зависит от конкретной трансляционной систеш и от строения iRES'a. В ряде случаев ДЛН аф^ккхивнисгй йНШЩацйй ТуаНСЛйЦйй необходим ТаНДвм, состоящий, по крайней мере, из 4-5-ти членного олигопиримидина (примыкающего к iRES'y) и aug (криптического или стартового) на расстоянии 15-30 нт друг от друга. Предполагается, что наличие тандема повышает стабильность РНК/рибосомального комплекса. Существуют тканеспецифические и ■ iRES-зависимые вариации функциональной значимости тандема олигошршидин/aug.
(6) После образования РНК/рибосомального комплекса при наличии стартового кодона в пределах СО просходит сборка рибосомы и начинается трансляция; при этом, эффективность инициации белкового синтеза на aug зависит от его положения внутри СО. При отсутствии стартового кодона внутри СО, 40s рибосомальная субъединица начинает сканирование РНК в 3' направлении до первого инициаторного aug, на котором начинается белковый синтез. В обоих случаях, по-видимому, происходит "отрыв" рибосомы от ires'а при начале ее движения вдоль матрицы-; после этого может начинаться новый цикл внутренней посадки рибосомы.
5. ВЫВОДЫ
1. Обнаружены два типа укладки центральной части 5'-нетрансжруемой области РНК пикорнавирусов, обеспечивающих кэп-независимую внутреннюю инициацию трансляции: энтеро- и риновирусы имеют один тип структурной организации трансляционных цис-злементов РНК (ires), а кардио- и афтовирусы - другой.
2. Предложены и экспериментально подтверждены модели структурной организации терминальных сегментов НТО РЖ знтеро- и риновирусов,
вовлеченных в процесс репликации вирусных геномов. Обосновано существование тРНК-подобной организации репликативных цис-элементов их геномов.
3. Выявлены внутри- и межродовые различия в организации НТО пикорнавирусных геномов. Сформулирована гипотеза об эволюции НТО пикорнавирусов посредством дупликации функционально важных цис-элементов.
4. Детально исследован новый тип трансляционных регуляторных цис-элементов РНК - тандем олигопиримидин/дис. Доказано функциональное значение расстояния между компонентами этого тандема.
5. Показано, что значимость тандема олигопиримидин/дис зависит как от особенностей клетки-хозяина, так и от структуры тйеб'э. Продемонстрирована принципиальная возможность создания пикорнавирусных живых вакцин на основе его модификаций.
3. Идентифицирован и охарактеризован новый цис-элемент РНК -стартовое окно - место продуктивных контактов тяев-связанной рибосомы; после взаимодействия со стартовым окном рибосома начинает движение вдоль РНК, будь то трансляция либо поиск стартового кодона. Разработанная стратегия определения стартового окна применима для других эунаркотических РНК с неканонической инициацией трансляции.
7. Предложена и экспериментально обоснована общая для [шкорнавирусов модель внутренней посадки рибосомы на РНК.
6. БЛАГОДАРНОСТИ Для меня совершенно очевидно, что одному мне было бы не под силу провести все описанные здесь исследования. Я глубо признателен чл.-корр. РАМН профессору В. И. Аголу, в лаборатории которого были выполнены все работы, при его неизменной поддержке и участии, плодотворные научные дискуссии с Е.И.Аголом способствовали формированию научных идей и новых концепций. Первые результаты по построению консервативных моделей укладки РНК были получены совместно с В.М.Блиновым, который инициировал работы в данном управлении. Значительная часть исследований, описанных в разделах 3 и 4, была выполнена в тесном сотрудничестве с А.П.Гмылем и В.Маеловой, которым я весьма благодарен. Этот проект не был бы эсуществлен без содействия и постоянной поддержки всех коллег по лаборатории.
7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДОКЛАДА
1. Блинов, В.М., Пилипенко, Е.В., Романова, Л.И., Синяков, А.Н., Маслова, С.В., Агол, В.И. (1988), Сравнение вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого сегмента РНК нейровирулентного и аттенуированвого штаммов вируса полиомиелита. Доклады АН СССР 298, 1004-1006.
2. Pilipenko, Е. v., Blinov, V. М., Romanova, L. I., Sinyakov, А. N., Maslova, S. v., and Agol, V. I. (1989). Conserved structural domains in the 5'-untranslated region of picornaviral genomes: an analysis of the segment controlling translation and neurovirulence. Virology 168, 201-209.
3. Pilipenko, E. V., Blinov, V. M., Chernov, В. K., Dmitrieva, T. M., and Agol, V. I. (1939). Conservation of the secondary structure elements of the 5'-untranslated region of cardio- and aphthovirus RNAs. Nacl. Acids Ties. 17, 5701-5711.
4. Agol, V. I. Blinov, V. M., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Pestova, Т. V., Pilipenko, E. V., Ronanova, L. I., Svitkin, Y. V. (1989). 5'-nontranslated region of the picornaviral genome: unusual translation control. Abs, Second Bilateral Symp. USSR-USA "Structure of eukaryotic genome and regulation of its expression". Tbilisi, p. 14-15.
5. Agol, V. I. Blinov,V. M.; Grayl, A. P., Maslova, S. V., Pestova, Т. V., Pilipenko, E. V., Romanova, L. I., Svitkin, Y. V. (1989). Translation control elements within the 5'-untranslated region of the picornaviral RNAs. Abs. of the International Symp. "Molecular Organization of Biological Structures". Moscow, June 19-2 4, p. 106.
6. Pilipenko, E. V., Blinov, V. M., and Agol, V. I. (1990). Gross rearrangements within the 5'-untranslated region of the picornaviral genomes. Nucl. Acids Res. 18, 3371-3375.
7. Muzychenko, A. R. , Lipskaya, G. Y., Maslova, S. v., Svitkin, Y. V., Pilipenko, E. V., Nottay, В. K., Kew, О. И, and Agol, V. I. (1991). Coupled mutations in the 5'-untranslated region of the Sabin poliovirus strains during in vivo passages: structural and functional implications. Virus Res. 21, 111-122.
8. Agol, V. I., Gmyl, A. P., Maslova, S. v., Pilipenko, E. V., Svitkin, У. V. (1991). Towards understanding the mechanism of the internal binding of ribosoroes to picornavirus RNAs. Abs. of
the Workshop "The Regulation of Translation in Animal Virus-Infected Cells". Madrid, June 24-26, p. 15-16.
9. Agol, V. I., Gmyl, A. P., Maslova, 3. V. , Pilipenko, E. V, , Svitkin, Y. V. (1991). AUG (cryptic or initiating) and appropriately spaced oligopyrimidine block are involved in recognition of picornavirus RNAs by ribosomes. Abs. of the International Conference "Protein Biosynthesis". Pushino, August 26-September 3, p. 55.
10. Pilipenko, E. V.",. Gmyl, A. P., Maslova, S. v., Svitkin, Y. v., Sinyakov, A. N., Agol, V. I. (1992). Prokaryotic-like с is element in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. Cell 68, 119-131.
11. Pilipenko, E. V., Maslova, S. v., Sinyakov, A. N., and Agol, V. I. (1992). Toward identification of cis-acting elements involved in the replication of enterovirus and rhinovirus RNAs: a proposal for the existence of tRNA-like terminal structures. Nucl. Acids Res. 20, 1739-1745,
12. Пилипенко, S.B., Маслова, С.В., Агол, В.И. (1992). Вероятная компактная структура цис-активного трансляционного элемента в 5'-нетранслируемой зоне генома энтеровирусов и риновирусов. Мол. Биология 26, 565-572.
13. V.I.Agol, A. Gmyl, S. Maslova, Е. Pilipenko, Y. Svitkin. (1992). Structural elements in poliovirus RNA required for its efficient translation. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York, 9-13 September, p. 5.
14. Gmyl, A. F-, Pilipenko, E. V. , Maslova, S. V., Belov, G, A., Agol, V. I. (1993). Functional and genetic plasticities of the poliovirus genome: quasi-infectious RNAs Modified in the 5'-untranslated region yield a variety of pseudorevertants. J. Virol. 67, 6309-6316.
[5. Gmyl, A. P., Pilipenko, E. V., Slobodskaya, O. R., Maslova, S. v., Tolskaya, E. A., Agol, V. I. (1993). Functional and genetic plasticity of the poliovirus genome. Abs. of the IXth International congress of Virology. Glasgow, Scotland, 8-13 August, p. 275.
[6, Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Huang, M., Brown, T. D. K,, Agol, V. I. (1993). Differences in structural requirements for internal initiation of translation on cardiovirus and enterovirus RNA templates. Abs. of the IXth
International Congress of Virology. Glasgow, Scotland, 8-13 August, p. 72.
[7. Агол В.И., Пестова Т.В., Пилипенко Е.В., Гмыль A.n., Слободская О.Р., Маслова С.В. (1993). Регудяторные элементы в 5'-нетранслируемой области генома полиовируса: конструирование новых штаммов вируса. Тезисы in Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия". Пущино-на-Оке, ноябрь-декабрь 1992г., с. 98.
18. Agol, V. I., Gmyl, А.P., Pilipenko, Е. V. (1994). High frequency of deletions and insertions during reproduction of the Picornavirus genomes Abs. of the Workshop "Genetic recombination and defective interfering particles in RNA viruses". Madrid, 21-23 March, p. 17.
19. Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Maslova, S.V., Belöv, G.A., Sinyakov, A.N., Huang, M., Brown, T.D.K., Agol, V.l. (1994). Starting window, a distinct element in the cap-independent internal initiation of translation on picornaviral RNA. J. Mol. Biol,, 241, 398-414.
20. Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Khitrina, E.V., Maslova, S.V., Slobodskaya, O.R. , Agol, V.l. (1994). Host-dependent variations in the role of oligopyrimidine/AUG tandem for the reproduction of Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV). Abs. of the Vlllth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Korpilampi, Finland, 6-11 August.
21. Gmyl, A.P., Pilipenko, E.V., Agol, V.l. (1994). A possible mechanism of rearrangements of the picornaviral genomes. Abs. of the Vlllth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Korpilampi,-Finland, 6-11 August.
22. Agol, V.l., Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Maslova, S.V., Huang, M., Brown, T.D.K. (1994). Starting window, a novel cis-element involved in the internal initiation of Picornavirus protein synthesis. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York,. 24-28 August, p. 105.
23. Pilipenko, E.V., Gmyl, A.p., Maslova, S.V., Belov, G.A., Agol, V.l. (1994). Host-dependence of template activities of the Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) RNAs with altered oligopyrimidine/AUG tandem. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York, 24-28
August, p. 191.
4. PilipenXo, E.V., Gmyl, A.P., Maslova, S.V., Khitrina, E.V., Agol, V.I. (1994), Attenuation of Theiler's murine encephalomyelitis virus by modifications of the oligcpyrimidine/AUG tandem, a host-dependent translational cis-element. J. Virol., in press.
-
Пилипенко, Евгений Вячеславович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1994
-
ВАК 03.00.03
- Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека
- Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура
- Экспрессия генома пикорна- и флавивирусов в бесклеточных белок-синтезирующих системах
- Структурная и функциональная характеристика тандема олигопиримадин/AUG- нового трансляционного ЦНС-действующего элемента в геноме полиовируса
- Структурный и функциональный анализ последовательностей биополимеров, основанный на новом методе множественного выравнивания
