Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура"

На правах рукописи УДК 578.835.2:577.21:619:616-076.

ЛОМАКИНА Наталья Федоровна

СТРУКТУРА ГЕНА РНК-ПОЛИМЕР АЗЫ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЯЩУРА

03.00.06 "Вирусология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Научный руководитель: Рыбаков Сергей Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор. Официальные оппоненты: Котова Маргарита Васильевна,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ВНИИЗЖ, г.Владимир); Цыбанов Содном Жамьяновнч, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (ВНИИВВиМ, г. Покров). Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, г. Москва.

Защита состоится июня 1996 г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 120. 60. 01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан " $ " мая 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета -

В.А. Мищенко

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Высококонтагиозное заболевание ящур по-прежнему представляет угрозу для некоторых регионов мира, в том числе и нашей страны. Совершенствование мер борьбы с ящуром невозможно без всестороннего изучения его возбудителя. Особого внимания заслуживает выяснение взаимосвязи структуры и функции вирусного генома. Наиболее информативным подходом в подобных исследованиях служит сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей вариантов или мутантов одного и того же вируса, различающихся по биологическим свойствам. На протяжении ряда лет во ВНИИЗЖ проводились работы по изучению трех близкородственных вариантов природного изолята вируса ящура А22 Азербайджан/65, отличающихся патогенностью для крупного рогатого скота (КРС): эпителиотропного А:2550, миотропного А22550/4, аттенуированного А22645. Развитие методов секвенирования позволило вплотную подойти к выяснению молекулярных основ патогенности и аттенуиции. Мутации в любом гене могут привести к ослаблению вирулентности или аттенуации, если они ограничивают функции, важные для репродукции вируса. Объектом нашего исследования стал ген РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура. Интерес к данной области генома вызван исключительной значимостью РНК-полимеразы в размножении вируса.

РНК-зависимая РНК-полимераза является ключевым ферментом репродукции всех РНК-содержащих вирусов, за исключением ретровирусов. Ее структура тесным образом связана с выполняемыми функциями и стратегией транскрипции и репликации генома вируса, которому она принадлежит. Знание структуры и механизма функционирования РНК-полимераз' открывает перспективу возможности вмешательства в процесс репродукции рибовирусов с целью предотвращения развития вирусной инфекции путем непосредственного воздействия на этот фермент. Уникальной особенностью всех РНК-зависимых РНК-полимераз служит полимеразный домен, который обеспечивает полимеразную функцию фермента и, благодаря своей консервативности, является единственным общим для всех рибовирусов генетическим элементом, позволяющим восстановить степень филогенетического родства между вирусами.

В вирусе ящура ЗЭ ген, кодирующий РНК-полимеразу, относится к наиболее консервативным участкам генома, что делает его удобным объектом для разработки современного высокочувствительного и специфичного способа выявления всех семи серотипов вируса ящура

без уточнения типовой принадлежности, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Цели и задачи исследований имели научный и практический характер. В научном плане основной целью нашей работы было определение нуклеотидной и аминокислотной последовательностей РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура А22645, а также выяснение генетических изменений в этой области генома, произошедших в процессе аттенуации. Практическая цель исследований заключалась в разработке способа выявления вируса ящура всех семи серотипов (без уточнения типовой принадлежности) с помощью ПЦР на основе РНК-полимеразы. В этой связи предстояло решить следующие задачи:

-подобрать оптимальные условия секвенирования твердофазным вариантом метода химической модификации;

-определить первичную структуру гена РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура Агг645;

-провести сравнительный структурно-функциональный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК-полимеразы разных афтовирусов;

-на основе консервативных участков гена РНК-полимеразы сконструировать праймеры для ПЦР, универсальные относительно всех семи серотипов вируса ящура;

-разработать методику выявления вируса ящура в инфицированном материале с помощью ПЦР.

Научная новизна. Впервые определена нукдеотидная последовательность РНК-полимеразы аттенуированного варианта вируса ящура и проведено ее сравнение с близкородственными вирулентными вариантами природного юолята А22 Азербайджан/65.

Обнаружено, что в результате селекции вируса по патогенности в гене РНК-полимеразы произошли мутации, часть из которых привела к замене аминокислот в белковой последовательности. В аттенуированном вирусе одна из замен приходится на консервативную аминокислоту, входящую в функционально важный сайт фермента, и поэтому теоретически может иметь решающее значение в изменении биологических свойст вируса.

Впервые отмечена вариабельность в З'-нетранслируемой области генома вируса ящура на участке, непосредственно прилегающем к поли(А)-структуре.

Сконструированы универсальные праймеры на основе гена РНК-полимеразы, позволяющие выявлять все 7 серотипов вируса ящура в ПЦР.

Практическая значимость работы. В процессе исследований подобраны оптимальные условия секвенирования твердофазным

вариантом метода химической модификации. Разработана и предложена "Методика выявления вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области гена РНК-полимеразы," которая утверждена директором института 14 марта 1995 года.

Апробация результатов исследований. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии я эпизоотологии" (Покров, 1992 г.), Всероссийской конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995 г.), на XXV Всемирном ветеринарном конгрессе (Йокохама, Япония, 1995 г.), а также на заседаниях Ученого Совета ВНИИЗЖ 1992-1995 гг.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и 1 находится в печати. Нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура зарегистрирована в Базе данных нуклеотидных последовательностей Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL Nucleotide Sequence Database) [9].

Структура н объем работы. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 9 таблицами. Диссертация. содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 194 ссылки на первоисточники, и приложение.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты определения нуклеотидной последовательности гена РНК-полимеразы и З'-нетранслируемой области генома аттенуированного вируса ящура Аг:645;

результаты сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК-полимеразы вируса ящура разных вариантов и серотипов;

- метод выявления вируса ящура с помощью ПЦР на основе амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы.

Собственные исследования

Материалы и методы

Биологический .материю. Аттенуированный вариант Аг2б45 апатогенен для крупного рогатого скота, получен серийными пассажами при пониженных температурах в культуре клеток СПЭВ (30°С) и в первичной культуре клеток почки теленка (34°С).

В работе также использовали афтозный материал и клеточные

культуры, инфицированные вирусом ящура разных серотипов и штаммов, хранившиеся в различных условиях.

Праймеры, использованные в работе, перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при амплификации кДНК! и ссквенироваиии 3D гена вируса ящура (ВЯ) А22645.

№ Последовательность праймера Координаты

Обозначение в 5'-> 3' направлении по 3D гену Объект

1 17D GTAAAACGACGGCCAGT 379-395 pUC19

2 13т AAGCTTGCATGCC 452-440 pUC19

3 17R CAGGAAACAGCTATGAC 481-465 pUC19

4 ATCGACCCCGAACCACACCA (-23Н-4) ВЯ 3C-3D ген

5 - CCGACCGTGCCGTTCTCGAAGT 419-398 ВЯ 3D ген

6 LD AGCTTGCACCCACCGT 59-74 ВЯ 3D ген

7 LR TCGTCCTTCAGGAAGGTC 497-480 ВЯ 3D ген

8 ОЛИГО(с1Т)|2 тттттттттттт поли(А)

Методы. Генноинженерные работы в основном проводили по методикам, изложенным в руководствах [Маниатис с соавт., 1984; Мазин с соавт., 1990].

Нуклеотидные последовательности определяли твердофазным ■вариантом метода Максама-Гилберта на DEAE-бумаге DE-81 [Чувлило и Кравченко, 1983] в нашей модификации и методом Сэнгера [Sanger F., 1977].

Результаты исследований

Создание клонотеки гена РНК-полимеразы

3D ген, кодирующий РНК-полимеразу, расположен вблизи концевой поли(А)-последовательности, что позволило использовать для синтеза кДНК традиционный метод с олиго((1Т)-затравкой [Маниатис Г., 1984] с последующим синтезом второй цепи ДНК в присутствии РНКазы Н и ДНК-полимеразы E.coli (Gubler, 1983). В результате клонирования кДНК в составе вектора pUC19 в E.coli получили около 100 клонов, гибридизутощихся in situ с двухцепочечным фрагментом кДНК гена РНК-полимеразы A2i550. Размер вставок по оценке в агарозном геле колебался в пределах 3001200 п.н. Для дальнейшей работы были отобраны 6 клонов (11Н1, 6НЗ, 5Н1,'4НЗ, 1Н4, 10Н1) с наибольшим размером встроенной кДНК. Все б клонов содержали З'-нетранслируемую область генома, прилегающую к поли(А)-концу, и З'-часть гена РНК-полимеразы. Поэтому клон 3D5,

включающий 5'-концевую часть гена, был получен с помощью ПЦР .и праймеров № 4,5 (см. таблицу 1).

Оценку клонированных фрагментов кДНК проводили путем секвенирования их концевых участков, прилегающих к сайтам полилинкера плазмиды р!_1С19, по которым осуществляли рестрикцию и мечение. Это позволило установить их локализацию относительно вирусного генома, ориентацию в плазмиде и определить их точную длину (таблица 2).

Таблица 2 . Характеристика клонированных в р11С19 фрагментов кДНК гена РНК-полимеразы вируса ящура А22Й45.

Название клона Координаты по ЗБ гену Размер фрагмента в нуклеотидах Ориентация прямой цепи кДНК в плазмиде

№ клон Сайт рестрикции на полнлинкере для 5'-конца вставки Встроенная цепь

1 11Н1 392-1510 1118 НЫШ комплемент.

2 6НЗ 543-1474 931 ЕсоЫ прямая

3 5Н2 550-1504 954 НЫШ комплемент.

4 4НЗ 635-1495 860 НЫШ комплемент.

5 1Н4 788-1495 707 ЕсоМ прямая

6 10Н1 595-1510 915 НЫШ комплемент.

7 39В 347-1510 1163 • ЕсоШ прямая

8 ЗБ5 -23-419 442 ЕсоМ прямая

Стратегия секвенирования гена РНК-полимеразы

Руководствуясь опубликованной последовательностью гена РНК-полимеразы вируса ящура А:г550 [Сосновцев, 1994], мы построили рестрикционные карты полного гена и клонов 11Н1 и 6НЗ, в которых встроенные кДНК инвертированы относительно друг 'друга. С их помощью провели аналитическую рестрикцию и проверили эффективность включения радиоактивной метки по внутренним сайтам вставок, что позволило наметить стратегию секвенирования (рис. 1). Был использован подход секвенирования блоками длиной не более 300 н. Извлечение фрагментов и введение метки осуществляли

3DS п 39В ЕНЗ 6H3 ---^ ^-- -------р.

305 п 11Н1 4НЗ 11H1.10H1.5H2.4H3r -► "-----► •-к- -—-с

Bj 3D5 6НЗ 11 HI 6Н3.1Н4

Hindlll Sail BamHI Aval полн(А)

J g^g-1 ' той uaaST

3SB

305

SH3

11 HI

Б)

5HZ

Рисунок 1. Стратегия секвеннрованля гена РНК-полимеразы вируса ящура А22645. А). Схематическое изображение гена РНК-полимеразы с прилегающими нетранслнруемой областью (штриховая линия) и поли(А)-последователыюстыо генома. Нумерация нуклеотидов произведена с начала гена.

Б). Расположение фрагментов кДНК клонов 3D5, 6НЗ, 11Н1, 39В, 5Н2, перекрывающих полный ген. Менее протяженные кДНК остальных клонов не приведены.

В). Направление секвенирования (изображено стрелками) отдельных фрагментов заклонированных кДНК с указанием соответствующего

клона и ориентации прочитанной цепи (-прямая,

----комплементарная). Праймеры обозначены следующим образом:

□ -LD, О -17D, ^ -17R, а -13т.

как по сайтам полилинкера плазмиды, так и клонированных кДНК. Последовательность клона ЗБ5 и концевые участки встроенной кДНК клонов 5Н2, 10Н1, 4НЗ определяли методом Сэнгера с помощью синтетических праймеров к полилинкеру плазмиды р1/С19 (17Б, 17К, 13т) и к фрагменту 59-74 гена ЗБ (праймер ЬО). В остальных случаях использовали твердофазный вариант метода Максама-Гилберта [Чувпило-Кравченко, 1983].

Оптимизация условий секвенирования ДНК

Известные варианты секвенирования методом химической модификации [Максам-Гилберт, 1986; Данилюк с соавт., 1986; Чувпило и Кравченко, 1983; Rosenthal et al., 1985, 1986] обладают некоторыми недостатками, заключающимися в многочисленности операций [Максам-Гилберт, 1986; Данилюк с соавт., 1986], отсутствии строгой специфичности в реакциях модификации по пиримидиновым основаниям [Чувпило и Кравченко, 1983], потерях коротких олигонуклеотидов при переосаждении спиртом, недоступности твердофазного носителя [Rosenthal et al., 1985, 1986]. Поэтому, проанализировав все известные подходы к секвенированию этим методом, мы остановились на твердофазном варианте с использованием ионообменной DEAE-бумаги DE-81, модифицировав отдельные его стадии. Ключевыми моментами нашей методики, отличающей ее от предложенной ранее [Чувпило и Кравченко, 1983], является оптимизация следующих основных стадий: модификация пиримидиновых оснований, элюция ДНК с твердофазного носителя, осаждение ДНК без потерь низкомолекулярных фрагментов. При проведении химической модификации по цитозину NaCl и NaOH были заменены на LiCl и LiOH, модификацию тимина проводили в присутствии 0,2-0,4 мМ KMnO-t [Rosenthal et ai„ 1986], а для десорбции ДНК с твердофазного носителя после завершения химических модификаций и пиперидинового гидролиза был использован 1,5 М LiClO-t вместо 1 М NaCl [Данилюк с соавт., 1986]. Это позволило в дальнейшем применить ацетон для осаждения ДНК и исключить потери низкомолекулярных фрагментов ДНК.

Секвенирующий электрофорез проводили при постоянной мощности 45 или 60 вт (6-8% ПААГ, -100 мМ ТВЕ). В ряде случаев столкнулись с явлением аномальной электрофоретической подвижности ДНК, затрудняющей определение отдельных участков последовательности. Добавление формамида до 40% в общепринятый состав секвенирующего геля позволило устранить эту проблему и получить удовлетворительные рузультаты.

Нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы и З'-концевой нетранслируемой области генома

Определена нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы вируса ящура А22645 с прилегающей З'-концевой нетранслируемой частью генома и поли(А)-структурой. Ее анализ обнаружил, что терминирующий кодон TGA расположен в том же положении, что и в исходном штамме А::550 [Сосновцев, 1994] и смещен на 9 нуклеотидов в сторону нетранслируемой области по

сравнению с другими типами и штаммами вируса ящура Ci-SS [Martinez-Salas, 1985; Villaverde, 1988], Aul 19 [Robertson, 1983, 1985], Aioól [Carroll, 1984], OiK [Forss, 1984]. Последовательность гена имеет длину 1419 н. и не содержит инсердий и делеций. Вариабельность нуклеотидов отмечена в З'-концевой нетранслируемой части, непосредственно прилегающей к поли(А)-последовательности (позиция 1501). В разных клонах варьируют длина (от 3 до S нуклеотидов) и состав этого участка. Имеются косвенные данные, свидетельствующие о неслучайности наблюдаемой вариабельности. Ранее Porter с соавт. (1978) проанализировали З'-концевую часть генома шести представителей вируса ящура Аю61, ОбVI, Сз997(Ь), C;997(S), SAT 1, SAT 2 и обнаружили высококонсервативную последовательность из 11 нуклеотидов UCCCGCUUCCU, расположенную на расстоянии 6-7 н. от поли(А)-структуры. В нашем случае соответствующая последовательность находится в позициях 1490-1500. Пограничный участок из 6-7 н., отделяющий ее от поли(А), был разным во всех исследованных последовательностях [Porter et al., 1978]. Отмечаемая нами вариабельность в позиции 1501 как раз приходится на упомянутый пограничный участок. Это позволяет нам сделать вывод о существовании гетерогенности популяции вируса ящура серотипа А22 в З'-концевой нетранслируемой области генома на участке между высококонсервативной последовательностью (1490-1500) и поли(А)-цепочкой. Причина или роль этого явления в репродукции вируса ящура на сегодняшний день не выяснены.

Нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы аттенуированного варианта вируса ящура А::645 с прилегающей З'-концевой нетранслируемой областью зарегистрирована в базе данных нуклеотидных последовательностей Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL Data Base) [9].

Структура и консервативные мотивы РНК-полимеразы афтовирусов

В РНК-зависимых РНК-полимеразах рибовирусов выделяют несколько консервативных мотивов, которые образуют полимеразный домен фермента и связаны с выполнением определенных функций [Poch, 1989; Bruenn, 1991; Koonin, 1991]. Поскольку существует корреляция между первичной структурой мотивов, их функцией и таксономической принадлежностью вирусов [Poch, 1989; Tordo, 1992; Koonin, 1992], мы попытались установить структуру консервативных мотивов в афтовирусах. С этой целью провели сравнение 16 аминокислотных последовательностей РНК-полимеразы вируса ящура серотипов А:: (3 варианта) [Кузьмин, 1989; Сосиовцев, 1994; Ломакина.

19 9 53, Аю [Carroll, 1984], An (2 варианта) [Robertson, 1983, 1985], Ch' [Forss, 1984], Ci (9 изолятов) [Martinez-Salas, 1985; Villaverde, 1988].

Функциональный полимеразный домен в семействе РНК-зависимых РНК-полимераз пикорнавирусов расположен в С-концевой половине белковой молекулы. В афтовирусах ему соответствует фрагмент 232-371, который включает четыре консервативных мотива, согласно [Poch, 1989]: мотив А (232-247), мотив В (289-315), мотив С (333-343), мотив D (359-371). Мотив А, с характерной для всех одноцепочечных позитивных рибовирусов последовательностью £)xxxxD (позиции 240-245), в афтовирусах представлен как J2YSAFD.*

Интересные изменения отмечены в мотиве В, предполагаемом центре связывания нухлеотидов. Согласованная последовательность пикорнавирусов GxPS£rxxxTSxxN(S/T) (позиции 295-308) в афтовирусах приобрела вид GMPS£Ü/D)CSAT(S/G)Ix(N/S)T. Обозначились пять дополнительных консервативных аминокислотных остатков в позициях 296 (М), 300-302 (CSA), 305 (I), но обнаружены замены двух инвариантных остатков: в полимеразе вируса ящура Ац произошла замена глицина на аспарагиновую кислоту (299 G-»D), а в аттенуированном A;i645 - замена аспарагина на серии (307 N->S). Обе замены являются уникальными для данных позиций, поскольку замещающие аминокислотные остатки не были отмечены ни в каких других семействах вирусных полимераз, анализируемых в работах [Poch, 1989; Bruenn, 1991; Koonin, 1991]. Глицин (п. 299) инвариантен во всех семействах вирусных РНК-полимераз, а аспарагин (п. 307) - в позитивных одноцепочечных, двухцепочечных и некоторых негативных одноцепочечных рибовирусах. Судя по их высокой консервативности, они выполняют определенную функциональную роль. Поэтому не исключено, что обнаруженные замены либо компенсируются другими дополнительными мутациями, способствующими сохранению функции, либо влекут фенотипические изменения. Примечательно, что в подтипе А12 наряду с заменой инвариантной аминокислоты 299 G-*D в мотиве В произошла еще одна замена 304 S-»G, отсутствующая в других афтовирусах. Мотив С (333-343), с характерным для всех позитивных рибовирусов признаком YGDD (п. 336-339), ответственный за каталитическую функцию, абсолютно консервативен во всех афтовирусах и имеет вид MISYGDDIWA.

' Двойным подчеркиванием выделены инвариантные аминокислотные остатки, консервативные для всех групп вирусных последовательностей, приведенных в работах [Poch; Bruenn: Koonin].' Одной чертой отмечены аминокислотные остатки, консервативные лишь для определенной группы вирусов. В скобках указаны варианты аминокислот, всречающиеся в данной позиции.

Мотив D, присутствующий в пикорнавпрусах как Gxxxxxxx&, представлен в афтовирусах консервативной последовательностью SLGQTITPAD&SD (п. 359-371).

Помимо мотивов A-D, согласно [Poch, 1989], в афтовирусах присутствуют еще три консервативных участка, выделяемых в работе [Bruenn, 1991]. Мотив 6, с инвариантными аминокислотными остатками LKR (п. 386-388), подобен всем пикорнавирусам. Мотив 7 (п. 415-452) содержит консервативный остаток ароматической аминокислоты фенилаланина в п. 443, которому предшествует последовательность с основными свойствами. Мотив 8, как и в других пикорнавирусах, сохраняет два консервативных остатка в п. 461 и 462 с основными (аргинин в п. 461) и ароматическими (триптофан в п. 462) свойствами.

Сравнительный анализ близкородственных вариантов вируса

ящура подтипа А22

Результаты попарного сравнения трех близкородственных представителей вируса ящура подтипа А22, отличающихся пато-генностью для крупного рогатого скота, приведены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК-полимеразы вируса ящура штамма Аи550 и полученных из него вариантов Аы550/4 и Аиб45.__

Сравниваемые Гомология

варианты последовательностей Количество замен Молчащие замены

вируса ящура в процентах

НК АК НК АК Кол-во %

550 - 550/4 98,4 98,3 22 8 12 54,5

550 - 645 99,1 99,4 12 3 9 75,0

645 - 550/4 98,2 98.1 26 9 15 57,7

Сокращения: НК - нуклеотидная последовательность, нуклеотиды;

АК - аминокислотная последовательность, аминокислоты.

Отмечены 30 позиций нуклеотидной последовательности, в которых произошли точечные мутации. Некоторые мутации совпали с встречающимися в других серотипах вируса ящура, а часть из них характерна только для данного варианта подтипа А22 (Таблица 4). Так мутации в положениях 119, 313, 376, 575, повлекшие замену аминокислот, отмечены только для Агг550/4, а замена нуклеотида 920 характерна лишь для Ад645.

Результаты попарного сравнения (Таблица 3) исходного эпителиотропного Агг550 и аттенуированного А22645 с миотропным

Таблица 4. Нуклеотидные (аминокислотные)* замены, выявленные при сравнении- ' генов РНК-полимеразы близкородственных вариантов вируса ящура подтипа А22.

Координаты Нуклеотнд (аминокислота) Замены, встречающиеся в других

Аг:550 A21645 Av¡550/4 типах вируса ящура Аю, А12. Oí, Ci"

36 С T С С

119 С (Ser) с T (Phe) С (Ser)

203 204 А (Gly) G A (Gly) G c (Ala) A А, С A, G

226 227 С (Arg) G С (Arg) G G (Ala) С С, G С, G

249 G G С А, С

306 А A С С

313 G (Val) G (Val) А (Ие) G

315 T T С т, С

324 T T с с

357 T T с с, т

372 G G А G, А

375 T T G A, G, Т

37 б A (Lys) A (Lys) С (Gin) A (Lys)

3SS A (Thr) G (Ala) G (Ala) G (Ala)

540 С С T С,Т

575 С (Thr) С (Thr) A (Asn) С

621 T С С С

73S T T С А, Т

828 G A G A, G

906 G A G А

920 A (Asn) G (Ser) A (Asn) A (Asn)

1011 A G A А

1038 С T С С,Т

1134 A (Gin) С (His) A (Gin) G (Gin), С (His)

1202 T С T С

1205 A G G A, G

1246 С (Arg) С (Arg) G (Gly) С (Arg), G (Gly)

1344 T С С С,Т

'В скобках приведены аминокислотные замены. "Использованы опубликованные данные [Carroll, 1984; Robertson, 1983, 1985; Forss, 1934; Martinez-Salas, 1985; Villaverde, 1988].

Ац550/4, высокий процент гомологии их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей свидетельствуют о большом сходстве на молекулярном уровне между эпителиотропным и аттенуированным вариантами.

На рисунке 2 представлена схема расположения замен в генах рассматриваемых вирусов. Сравниваются варианты Агг550/4 и А22645 с исходным штаммом Ап550. Судя, по характеру расположения нуклеотидных замен, изменчивость в двух производных вариантах А22550/4 и А22645 происходила разными путями и коснулась двух противоположных частей гена. В миотропном множественные мутации по 18 позициям произошли в 5'-части гена (1-750 н.), а в аттенуированном Агг645 изменениям подверглась З'-часть по 9 позициям.

Несколько иная картина наблюдается на уровне аминокислотных последовательностей. В миотропном варианте в N-части молекулы, соответствующей 5'-концу гена, сохраняется значительное количество замен по 7 аминокислотам. В аттенуированном вирусе единственная в этой области замена аминокислоты, соответствующая 388 н., совпадает с заменой в вирулентном Агг550/4 и, очевидно, не оказывают существенного влияния на изменение биологических свойств вируса.

Большего внимания заслуживает С-концевая часть РНК-полимеразы. У миотропного варианта произошла замена лишь одной аминокислоты (п. 1246 н.). В аттенуированном варианте на этом участке отмечено 2 замены (п. 920, 1134). Замена в положении 1134 н. (Q->H) встречается среди вируса ящура других серотипов. Мутация 920 н. приходится на область 883-1026, кодирующую аминокислотную последовательность исключительно консервативную среди рибовирусов животных и растений [Domier, 1987; Kainer, 1984]. Этот домен ответственен за основную функцию РНК-полимеразы и включает два функциональных участка: участок связывания нуклеотидов GxxxTxxxN(S/T), консервативный мотив В [Poch, 1989; Bruenn, 1991; Koonin, 1991], и участок каталитической активности фермента YGDD, мотив С [Poch, 1989; Bruenn, 1991] (рис. 2). Мутация нуклеотида 920, повлекшая замену аспарагина на серин, затрагивает функционально значимую консервативную аминокислоту (N) сайта связывания нуклеотидов. Серин в этом положении не встречается ни в каких РНК-содержащих вирусах. Вполне возможно, что изменения в этом функциональном сайте могли сказаться на активности фермента и привести к изменениям фенотипа вируса. Замена нуклеотида 1011 затрагивает второй функциональный участок, но приходится на третью позицию в кодоне, кодирующем глицин (G) и является молчащей.

№-хонец С-конец

А22550 5. Э вя V КТ Т_N_3'

элителнотропный о ' ' ' 500 ' ' ' 1000 ' 1400 н.

. гг-п,, Р АА I ОА N в

22550,4 __.♦_♦.♦_♦..!♦._____

миотропнын ■ • • ' "

А22645

аттенунрованный

А|

В)

■ СхххТхххЫ (Э/Т! 083 920

мотиа В

V в

(У]600 — 1011 1026 н.

мотив С

Рисунок 2. Расположение нуклеотндных и аминокислотных замен в РНК-полимеразе трех близкородственных вариантов вируса ящура А22.

А). Сравниваются миотропньш А22ЭЭО/4 и аттенуированный А22645 варианты с исходным эпителиотропным штаммом А22550. На схеме обозначены нуклеотидные (») и аминокислотные (♦) замены в однобуквенном коде, отличающиеся от АиээО. Гомологичные участки последовательностей обозначены одинаково.

Б). Домен полимеразной активности РНК-полимеразы, кодируемый фрагментом 883-1026 н. Выделены два консерватиных мотива, соответствующие функциональным сайтам: мотив В - сайт связывания нуклеотидов; мотив С - сайт каталитической активности. Альтернативные варианты аминокислот взяты в скобки. Сверху, указаны аминокислоты, характерные для вируса ящура А22645.

Наличие мутаций нуклеогидов в функционально важных участках гена отмечено также для родственных изолятов вируса типа Ci [Viilaverde, 19SS] и свидетельствует о случайности мутационного процесса. Закрепление функционально важной мутации на аминокислотном уровне (S в п. 920 н.) в нашем случае можно объяснить селекцией.

Таким образом, сравнительный анализ гена РНК-полимеразы трех близкородственных представителей вируса ящура А22 позволяет сделать вывод, что изменение патогенных свойств вируса ящура сопровождается мутациями в гене РНК-полимеразы. В миотропном варианте множественным изменениям подверглась ¿'-часть гена, а в аттенуированном - З'-часть. На молекулярном уровне аттенуированный вариант Ап645 сохранил большее сходство с исходным эпителиотропным Агг550 (99,1% гомологии), при этом процент молчащих мутаций в нем выше, чем в миотропном А22 5 5 0/4 (75% против 54,5%).

Следует отметить, что исследуемые представители вируса ящура подтипа А22 различаются способностью к росту при повышенных температурах. Из вирулентных представителей наиболее устойчивым оказался миотропный А:з550/4. Аттенуированный вариант Аг;645 был термочувствительным [Дрягалин с соавт., 1980].

По сведениям из литературных источников для ряда термочувствительных мутантов вируса ящура отмечена корреляция между признаком термочувствительное™ и аттенуацией или снижением вирулентности [McCahon, 1981; Mackenzie, 1975; Дрягалин, 1970]. Между тем показано, что термочувствительность вируса ящура Оз обусловлена мутациями в РНК-полимеразе [Lowe, 1981]. Для полиовируса установлено, что мутация в РНК-полимеразе, вызвавшая его аттенуацию для мышей, в то же время изменяла термочувствительность вируса [Tardy-Panit, 1993].

Сопоставляя рассмотренные данные, логично предположить, что сайты, ответственные за термочувсгвительность, находятся в РНК-полимеразе и имеют налосредственное отношение к атгенуированному фенотипу. Мутация нуклеотида 920 в аттенуированном варианте А:2б45 повлекла замену аминокислоты 307 N-»S, входящей в функционально важный сайт фермента, участвующий в процессе полимеризации РНК, и, по всей видимости, может иметь решающее значение в изменении биологических свойств вируса, среди которых может оказаться и патогенность. Способность к росту при повышенной температуре варианта Аг2550/4 скорее всего вызвана мутациями в 5'-части гена РНК-полимеразы. Однако, окончательный вывод о связи между мутациями в области гена РНК-полимеразы и

изменением патогенности вируса ящура А22 можно будет сделать только после анализа полноразмерных геномов изучаемых представителей вируса ящура.

Разработка метода выявления вируса ящура с помощью ПЦР

Логическим продолжением исследований по структуре гена РНК-полимеразы гена стала разработка способа выявления вируса ящура без его типирования с помощью ПЦР. В литературе описаны подобные работы, основанные на амплификации различных участков вирусного генома, в том числе области 3D гена [Meyer, 1991; Donini, 1992; Forsyth, 1994; Laor, 1992; Lin, 1992] и VP1 [Laor, 1992; Forsyth, 1994; Drygin, 1994]. Однако не во всех случаях используемые для этих целей праймеры позволили выявить вирус ящура [Donini, 1992; Forsyth, 1994; Laor, 1992; Lin, 1992]. Поэтому мы предприняли попытку поиска своей универсальной пары праймеров и опробовали ее на 7 серотипах вируса ящура.

Схема проведения анализа методом ПЦР приведена в таблице5.

Таблица 5. Стратегия выявления вируса ящура с помощью ГЩР.

№ пп Стадия Способ анализа

1. Выделение РНК гуанидина тиоцианат + фенол [Chomczynski, 1987]

2. Синтез кДНК ревертаза AMY или MMLV, праймеры олиго(с1Т)12 или LR

3. ПЦР Taq-полимераза. праймеры LD и LR; 25-30 циклов: денатурация 93°С 0,8 мин.; - отжиг 48°С 0,7 мин.; синтез 72°С 0,6 мин.

4. Электрофорез 2% агароза; 50 мМ ТВЕ, 100 в

5. Детекция в ультрафиолете окраска бромистым этидием, 50 мкг/мл, фрагмент длиной ~ 450 н.п.

6. Гибридизация 32Р-меченный зонд

Выбор праймеров для ПЦР. В результате сравнения 16 нуклеотидных последовательностей гена РНК-полимеразы вируса ящура подтипов Оь С\, Аю, А12, А22 были выявлены несколько высококонсервативных участков. Из них выбрали два участка 59-74 и. 480-497, специфичные для афтовирусов и одновременно универсальные для всех исследованных серотипов вируса ящура, к которым и были синтезированы праймеры LD и LR (см. таблицу 1).

Обратная транскрипция успешно проходила в присутсвии как ревертазы вируса птичьего миелобластоза (AMV), так и рекомбинантной ревертазы вируса лейкемии мыши Молони (MMLV), хотя последнего фермента требовалось по единицам активности в 10 раз больше на реакцию. В качестве затравки использовали олиго(<ЗТ)(2 или праймер LR. Синтез кДНК эффективнее проходил с праймера LR, поскольку он специфичен для образования кДНК с вирусной РНК, в то время как onnro(dT)i2 обеспечивал синтез с любой полиаденилированной РНК, в том числе и клеточной, о чем наглядно свидетельствовали контрольные образцы из эпителия языка здоровых животных.

Полимеразная цепная реакция. В работе исследовали материал, инфицированный вирусом ящура всех семи серотипов, с разными условиями и сроком хранения (таблица 6). Исходный титр в исследуемых образцах составлял 4-7 ^ИДзо в 0,1 мл при титровании на животных (морские свинки, КРС, свиньи).

Амплификацию фрагмента кДНК размером в 449 н.п. с праймерами LD и LR проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: по 0,4 пмоль каждого dNTP; по 0,4 пмоль праймеров LD и LR; 40,2 мМ трис-HCl, рН 8,8; 9,6 мМ (NH^SO.,; 3 мМ MgCh; 0,006% твин-20, 1 ед. Taq-полимеразы. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Положительный результат получили с ¡0 подтипами и штаммами всех 7 серотипов вируса ящура независимо от условий и срока хранения исследуемых проб (таблица 6). При анализе образцов двух штаммов концентрированного вируса везикулярной болезни свиней и эпителия языка здоровых животных (КРС и свиньи), взятых в качестве контроля, был получен отрицательный результат.

Продукты амплификации исследованных образцов были проверены в гибридизации с радиоактивно меченным полным геном РНК-полимеразы вируса ящура А2з550, сконструированным генноинженерным способом. Гибридизационный анализ подтвердил результаты, полученные с помощью ПЦР.

'Возможности метода. В результате проведенных исследований была разработана и составлена "Методика выявления вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области гена РНК-полимеразы". На примере 10 подтипов и штаммов вируса ящура показана возможность выявления возбудителей всех семи серотипов без уточнения типовой принадлежности при амплификации фрагмента 59-497 гена РНК-полимеразы в ПЦР с помощью предложенных нами LD и LR праймеров. Используя серию десятикратных разведений вирусной РНК,

Таблица 6. Характеристика вирусного .материала, исследованного в ПЦР.

Тип вируса, Титр, lgHflso Условия хранения Результат

штамм в 0.1 мл способ Срок ПЦР»

Вирус ящура

SAT Г - замороженная культуральная среда 1 месяц да

SAT 1 шт.96 4.48 афтозная суспензия4 1 год да

SAT 2 шт. 325 4.67 афтозная суспензия : глицерин (1:1)6 1 год да

SAT 3 шт. 3/4 4.57 афтозная суспензия 1 год да

Asia 1 №48 5.0 афтозная суспензия : глицерин (1:1) 2 года да

С, №564 4.9 лиофилизир. вирусная суспензия 6 лет да

Oi №194 6.9 афтозная суспензия 6 лет да

Аз: №550 4.6 лиофилизир. вирусная суспензия 6 лет да

AJJ №550/2 - афты в глицерине 10 лет да

An N3645 6-7 лиофилизир. вирусная суспензия 11 лет да

Контроли: Количество:

Вирус

везикулярной

болезни свиней:

Т-75 85 мкг/млг концентрированный, ФБР 2 месяца нет

0-72 109 ч/млд концентрированный, сахароза 2 месяца нет

Эпителий языка

здоровых

животных:

свинья - нет

КРС - нет

' Пассирован в культуре клеток ВНК-21.

а 10% афтозная суспензия в фосфатном буферном растворе (ФБР). 610% афтозная суспензия в ФБР с глицерином, 1:1. в Положительный результат ПЦР - да; отрицательный результат - нет. г Оценка по оптической плотности в УФ по белку.

д Количество вируса в физических частицах по данным электронной микроскопии.

визуально продукт амплификации удавалось определить в пробах, разбавленных в 1000 раз и содержащих не менее 600 пг РНК.

Для анализа достаточно не более 100 мг образца ткани. Его можно применять на ранних этапах с целью дифференциации ящура от других заболеваний с везикулярным синдромом. Результат может быть получен в течение одного дня.

Уместно отметить, что в последние годы широкое распространение как у нас в стране [Дрыгин В.В. с соавт., 1991, 1994], так и за рубежом [Laor О., 1991; Donini G., 1992; Forsyth M., 1994], получили тест-системы на основе гена VP1, позволяющие лидировать вирус ящура. Однако, необходимо учитывать, что вариабельность области VP1 настолько выражена, что в ряде случаев [Laor О., 1991; Stram Y., 1993] используемые праймеры не срабатывают в ПЦР. Преимущество использования праймеров к области гена РНК-полимеразы для выявления вируса ящура в ПЦР заключается в универсальности, позволяющей определить все его серотипы. В заключение можно сказать, что оба способа выявления вируса ящура, как на основе гена РНК-полимеразы, так и VP1, не исключают, а взаимно дополняют друг друга.

Выводы.

1. Определена нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы аттенуированного вируса ящура Аг:645. Размеры гена и предсказанной аминокислотной последовательности составляют соответственно 1419 н. и 473 а.о., что на 3 кодона превышает длину аналогичных последовательностей вирусов подтипов Аю, Au, Ci, Oi.

2. Определена нуклеотидная последовательность 3'-нетранслируемой области генома аттенуированного вируса ящура A2i645, в которой обнаружена вариабельность на участке, непосредственно прилегающем к поли(А)-структуре. В разных клонах варьирует длина (от 4 до 8 н.) и состав этого участка.

3. Установлено, что в области гена РНК-полимеразы аттенуированный вариант Аг:645 вируса ящура отличается от исходного эпителиотропного штамма Аг:550 заменой 12 нуклеотидов и 3 аминокислот (130 Т->А, 307 N-»S, 378 Q->H). Отличие от миотропного варианта А22550/4 составляет 26 нуклеотидных и 9 аминокислотных заменГ

4. Установлена структура функциональных консервативных мотивов A (DYSAFD, п. 240-245), В ( GMPS(G/D)CSAT(S/G)Ix(N/S)T, п. 295-308), С (MISYGDDIWA, п. 333-343), D (SLGQTITPADKSD, п. 359-371) РНК-полимеразы афтовирусов. В атгенуированном варианте

А::645 обнаружена замена инвариантной аминокислоты в мотиве.В (307 а.о. N-»S), участвующем в процессе полимеризации РНК, что может иметь решающее значение в изменении биологических свойств вируса наряду с мутациями в других участках генома.

5. Сконструирована универсальная пара праймеров к участкам 59-74 и 497-4S0 области гена РНК-полимеразы вируса ящура, которая позволяет выявить в ПЦР все семь серотипов вируса без уточнения их типовой принадлежности.

6. Разработана "Методика выявления вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области гена РНК-полимеразы," которая утверждена директором ВНИИЗЖ.

Практические рекомендации

В методику секвенирования твердофазным вариантом метода химической модификации на DEAE-бумаге [Чувпило и Кравченко, 1983] рекомендуем внести следующие изменения: для модификации цитозина использовать гидразингидрат с 1,5 М LiCl и 0,01 М LiOH, модификацию тимина осуществлять после тепловой денатурации в

0.2.0,4 мМ KMnCU; в этом случае элюцию ДНК с носителя после завершения реакций следует проводить в водном растворе 1,5 М LiClO-t с последующим осаждением ацетоном (10:1) и спиртом.

Для хорошего разделения участков ДНК со сложной вторичной структурой в секвенирующем электрофорезе в общепринятый состав полиакриламидного геля целесообразно ввести формамид до 40%.

В целях диагностики заболеваний с везикулярным синдромом с подозрением на ящур рекомендуем использовать "Методику выявления вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области гена РНК-полимеразы," утвержденную директором ВНИИЗЖ 14 марта 1995 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Грибанов О.Г., Курман И.Я., Ломакина Н.Ф. Выделение плазмидной ДНК, свободной от РНК // Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. научн.-практ. конф. 17-21 апреля 1995 г,-Владимир, 1995,- С. 18.

2. Грибанов О.Г., Ломакина Н.Ф., Матвиенко Н.И., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A. Увеличение выхода обратной транскрипции с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus II Биохимия,- 1996.-(в печати).

3. Ломакина Н.Ф., Рыбаков С.С. Нуклеотидная последовательность гена РНК-полимеразы аттенуированного варианта вируса ящура и

ее сравнение с вирулентными родственными вариантами подтипа А22//М0Л. ген., микробиол., вирусол.- 1996.- № 1,- С.35-40.

4. Ломакина Н.Ф., Рыбаков С.С. Сравнение гена РНК-полимеразы аттенуированного и вирулентных штаммов вируса ящура А22 // Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. научн.-практич. конф. 17-21 апреля 1995 г.-Владимир, 1995,-С.8.

5. Ломакина Н.Ф., Рыбаков С.С., Дрыгин В.В., Колосов С.Н., Ломакин А.И. Выявление вируса ящура с помощью ПЦР на основе амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы // Вирусн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. научн.-практич. конф. 17-21 апреля 1995 г.- Владимир, 1995,- С.29.

6. Ломакина Н.Ф., Фалина Г.М., Андреев В.Г., Рыбаков С.С. Определение нуклеотидной последовательности гена РНК-полимеразы аттенуированного штамма вируса ящура // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. научн. конф. ВНИИВВиМ.- Покров, 1992,-Ч.1.-С.173.

7. Ломакина Н.Ф., Фалина Г.М., Щербаков А.В.. Дрыгин В.В., Дрягалин Н.Н., Быкова Л.А., Рыбаков С.С. Клонирование фрагментов гена РНК-полимеразы аттенуированного варианта вируса ящура А22 Н Мол. ген., микробиол., вирусол.- 1995.- № 2.-С.33-36.

8. Lomakina N.F., Rybakov S.S., Drygin V.V., Gusev A.A. Detection of foot-and-mouth disease virus by PCR amplification of 3D gene fragment // XXV World Veterinary Congress: Abstracts. 3-9 Sept., 1995, Yokohama, Japan.-Japan, 1995,- P.210.

9. EMBL Data Base: Foot and mouth disease virus 3D gene. Accession Number: X85493, 1995.

Отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и научной информации ВНИИЗЖ. Тираж 100 экз., 5 мая 1996 г.