Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и функции генома вируса и разработка новых средств диагностики и профилактики ящура
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Структура и функции генома вируса и разработка новых средств диагностики и профилактики ящура"
Р Г Б ОД
- Ч гигг
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ
На правах рукописи УДК 578.935.2:577.21:615.371:619:616:076
ПЕРЕВОЗЧИКОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА И РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА
03.00.06-"Вирусология"
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Покров-1995
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ).
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
- САФОНОВ Георгий Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН (ПЗБ, г.Покров, Владимирской обл.);
- КУЗНЕЦОВА Светлана Владимировна, доктор биологических наук,
старший научный сотрудник (ВНИиТИБП, г.Щелково)
- ОРЛЯНКИН Борис Григорьевич, доктор ветеринарных наук, профессор
(ВИЭВ, г.Москва)
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (г.Москва)
л
/Р
■ Защита диссертации состоится 27 октября 1995 года ву ¿/часов на заседании диссертационного совета Д 120.61.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (601120, г.Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан
^ 1995 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук
Г.П. Федоров
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность темы. Ящур - острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, для которого характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению.
Широкий спектр восприимчивых животных, множество иммунологических типов и подтипов возбудителя, разнообразие путей выделения и распространения, способность длительное время сохраняться как во внешней среде, так и в организме животных - все это определяет необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя с целью совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств диагностики вируса и специфической профилактики этого особо опасного заболевания сельскохозяйственных животных.
В связи с изменением стратегии борьбы с ящуром все большее значение приобретает необходимость дальнейшего совершенствования методов диагностики с целью повышения специфичности методов прямого выявления и идентификации- вируса или его структурных компонентов непосредственно в патматериалах от больных животных.
С развитием методов молекулярной биологии и генной инженерии все шире используются для индикации возбудителя и диагностики заболевания такие методы как полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование и сравнительный компьютерный анализ установленных структур генома изолятов с ранее определенными для типирования выделенного вируса, установления возможного источника инфекции, а также изучения природы и эволюции возбудителя.
Характерным признаком этих методов является то, что в их основе лежит изучение особенностей структуры генома вируса и продуктов его
экспрессии - вирусных белков. Возможность применения этих методов определяется степенью изученности вируса и прежде всего наличием данных о нуклеотидной последовательности генома и генетической карты кодируемых им белков.
Сравнение установленных первичных структур жизненно-важных генов и кодируемых ими белков для вирусов, отличающихся по биологическим свойствам, дает основание для заключений о роли отдельных участков генома в проявлении тех или иных свойств вируса и также открывает возможность получать путем направленного мутагенеза генома или рекомбинации /л vitгa штаммы с ослабленной или полностью устраненной вирулентностью, обеспечивающие одновременную защиту как против различных типов одного вируса, так и против возбудителей, относящихся к различным таксономическим группам. -
- В последние годы особое внимание уделяется исследованиям молекулярной структуры белковой оболочки вируса, функции вирусных полипептидов, эпитопной структуры иммуногенных полипептидов, а также возможности направленного воздействия на геном возбудителя с использованием технологии рекомбинантных ДНК для изучения локализации и свойств антигенных детерминант, связи структуры и функции генома вируса с целью создания нового поколения эффективных и безопасных синтетических антигенов для использования в диагностикумах и разработки на их основе вакцин.
Перечисленные обстоятельства явились основополагающими при определении выбора темы диссертационной работы. 1.2. Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилось исследование первичной структуры генома ВЯ отечественных производственных штаммов с целью изучения молекулярной природы
возбудителя и разработки новых средств диагностики и профилактики ящура с использованием технологии рекомбинантных ДНК.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задами:
-молекулярным клонированием получить рекомбинантные плазмид-ные ДНК, содержащие кДНК фрагменты геномов ВЯ разных типов, провести анализ и создать банк клонов E.coli с фрагментами вирусспецифических кДНК.
-установить первичную структуру генов Vp1 отечественных производственных штаммов разных типов ВЯ Азия 1- 48 и A22 550, О, 194, О) 1618, С) 65/67 и некоторых полевых изолятов.
-определить полную первичную структуру генома ВЯ А22 550; -провести сравнительный анализ установленных последовательностей с известными последовательностями других штаммов ВЯ; -
-изучить возможность использования данных по первичной структуре антигеннозначимых областей генома в сочетании с методами технологии рекомбинантных ДНК для разработки новых более эффективных средств выявления и идентификации ВЯ;
-сконструировать рекомбинантную плазмиду, содержащую транслируемую область генома ВЯ;
-разработать методы направленного мутагенеза для изучения структуры и функции генома, используя технологию рекомбинантных ДНК;
-исследовать возможности получения генно-инженерных конструкций, способных экспрессировать антигеннозначимые участки генома ВЯ разных серотипов в бактериальных клетках;
-изучить возможность использования экспрессированных в бактериальных системах вирусспецифических белков в качестве защитных * препаратов.
1.3. Научная новизна и теоретическое значение. В результате молекулярного клонирования создан и изучен с использованием методов молекулярной гибридизации, рестрикционного анализа и секвенирования банк рекомбинантных плазмид, содержащих кДНК фрагменты генома производственных штаммов ВЯ типов Аг2, О), Ci и Азия-1 и полевых изолятов типа О.
Впервые определена полная первичная структура генома ВЯ штамма Ад 550, которая депонирована в ЕМВ1 банке нуклеотидных последовательностей геномов вирусов, и кДНК фрагментов генов Vp1 отечественных производственных штаммов этого вируса типов О,, Ct и Азия-1, а.также гена Vp1 эпизоотических изолятов О, 1445 и Oi 1492.
Полученные данные о первичной структуре генома производственных штаммов могут быть использованы для анализа связи структуры и функции, генома при проведении фундаментальных исследований, в дифференциальной диагностике для анализе полевых изолятов методом секвенирования с использованием ПЦР, а также для получения синтетических вакцин путем генно-инженерного и химического синтеза пептидов.
Разработана стратегия и осуществлена сборка ДНК-копии всей транслируемой области генома ВЯ А22 550, правильность сборки которой подтверждена секвенированием участков лигирования, а также в реакциях транскрипции и трансляции in vitro.
Разработан метод сегмент-направленной модификации гена Vp1 ВЯ с помощью репликативной формы (РФ) РНК, гибридизованной с кДНК гена
Ур1 и воздействия химического мутагена, позволяющий получать варианты, отличающиеся по антигенным свойствам.
Создан вектор для структурно-функционального изучения методом кассетного мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена Ур1 ВЯ А22.
Созданы- плазмиды, содержащие кДНК гена Ур1 ВЯ разных типов, его фрагменты разной длины или их тандемные повторы, а также всю область структурных белков, экслрессирующие в клетках Е.соН вирусспецифические белки, слитые с различными белками-носителями.
Впервые показана секреция клетками В.зиЫШз гибридного белка, содержащего антигенную детерминанту ВЯ Азия-1 48, что существенно упрощает очистку экспрессированного вирусспецифического белка.
Впервые сконструированы плазмиды, экслрессирующие в клетках Е.соН гибридные белки, содержащие в комплексе антигенные детерминанты ВЯ разных типов (А,О,С и Азия-1).
Оптимизированы условия наработки, выделения и очистки из бактериальной биомассы рекомбинантных белков и изучены их основные свойства. Показано, что очищенные гибридные белки, содержащие белок \/р1, его фрагменты или их тандемные повторы, индуцируют у лабораторных и естественно-восприимчивых животных при введении в определенных дозах в составе вакцинного препарата выработку типоспецифических нейтрализующих антител в количествах, обеспечивающих защиту от контрольного заражения ВЯ соответстующего типа, что является основой для разработки синтетических противоящурных вакцин на основе микробиологического синтеза. 1.4. Практическая значимость. Созданный и охарактеризованный банк рекомбинантных плазмид используется для получения кДНК-зондов на
различные участки генома с целью анализа и отбора ДНК-фрагментов при молекулярном клонировании генома ВЯ других типов и вариантов, а также для выявления вирусной РНК в образцах патматериалов методом молекулярной гибридизации.
Предложенный метод избирательного молекулярного клонирования и секвенирования амлифицированных в полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК фрагментов гена Vp1 ВЯ разных типов используется для выявления и идентификации ВЯ в патматериалах от больных животных.
Клонированные фрагменты области всех структурных белков или гена Vp1 в плазмидах под контролем SP6 промотора используются для получения в системах транскрипции /л viiro меченых зондов для диагностики ящура методом молекулярной гибридизации.
. Полученные препараты экспрессированных в E.coli белков Зс протеазы и 3d РНК-полимеразы используются для диагностики ящура от других инфекций и анализа сывороток с целью дифференциации переболевших и вакцинированных животных.
Полученная ДНК-копия транслируемой области генома используется для конструирования полноразмерной инфекционной ДНК-копии генома ВЯ.
Экспрессированные в бактериальных клетках гибридные белки, содержащие белок Vp1 ВЯ разных типов, их фрагменты или тандемные повторы, используются в качестве антигена для разработки безвирусных диагностикумов и синтетических моно- и поливалентных противоящурных вакцин.
В процессе выполнения научных исследований разработан комплекс из 30 методик по молекулярному клонированию, оценке и использованию клонированных фрагментов и продуктов их экспрессии.
Предложенные методики используются в исследованиях, проводимых с вирусом ящура, и могут быть применены в работе с другими вирусами.
1.5. На защиту выносятся следующие положения:
-определение полных первичных структур генома ВЯ штамма А22 550, генов Vp1 и кодируемых ими белков производственных штаммов Oi 194, О, 1618, Азия-1 48, С, 65/67, полевых изолятов О, 1445, О, 1492, использованных для анализа связи структуры и функции генома возбудителя, в дифференциальной диагностике для анализа полевых изолятов методом секвенирования, а также для получения синтетических вакцин путем генно-инженерного и химического синтеза;
-создание молекулярным клонированием генома ВЯ производственных штаммов Ан 550, Ot 194, О, 1618, Азия-1 48, С, 65/67, полевых изолятов О, 1445, О) 1492 банка рекомбинантных плазмид, охарактеризованного методом молекулярной гибридизации, рестрикционного анализа и секвенированием;
-разработка методов сегмент-направленной модификации генома ВЯ с использованием репликативной формы РНК, гибридизованной с кДНК гена Vp1, и модификации химическим мутагеном, а также сайт' специфического мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена Vp1 с созданием вектора для кассетного мутагенеза;
-разработка методов диагностики ящура на основе избирательного молекулярного клонирования и прямого секвенирования с использованием полимеразной цепной реакции гена основного антигенного белка Vp1 для выявления и идентификации полевых изолятов ВЯ, а также использования экспрессированных в E.coli неструктурных
белков протеазы Зс и РНК-полимеразы 3d в качестве антигенов для серологической дифференциации ящура от других инфекций и выявления переболевших животных;
-создание синтетических моно- и поливалентных противоящурных препаратов конструированием рекомбинантных плазмид, зкспрессирующих в клетках E.coli и B.subtilis гибридные белки, содержащие вирусспецифический полипептид структурной области, белка Vp1 ВЯ разных типов, его фрагменты или их повторы в разных сочетаниях в составе различных белков-носителей, которые индуцируют у естественно-восприимчивых животных выработку вируснейтрализующих антител, обеспечивающих защиту от контрольного заражения ВЯ соответствующего типа.
1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИИЗЖ (1983-1995 г.), на симпозиумах и конференциях: проводимых во ВНИИЗЖ(г. Владимир 1983, 1986, 1987, 1988, 1990, 1995г.) и ВНИИВВиМ (г.Покров 1992г.). На Всероссийских (Всесоюзных) конференциях: Москва, 1991 г,, Пущино- на-Оке, 1991 г., Владимир, 1995г.
На международных совещаниях и конференциях: Научно-координационные совещания стран СЭВ (Чехословакия, 1986 г., ГДР, 1988 г., Болгария, 1988 г. Международные конференции (СССР, 1991 г., Австрия, 1994 г., Япония, 1995 г.).
1.7. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 8 статей во Всероссийских журналах, 15 - в материалах международных конференций и симпозиумов.
1.8. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 406 страницах, включает: введение (15 стр.), обзор литературы (84 стр.), результаты собственных исследований и их обсуждение (234 стр.), заключение (10 стр.), выводы и приложения, где представлены дополнительные документы, подтверждающие научную и практическую значимость отдельных этапов работы.
Список использованной литературы включает 502 источника, в том числе 64 на русском языке. Представленный экспериментальный материал иллюстрирован 72 рисунками и 17 таблицами.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
.2.1. Материалы и методы
В работе были использованы производственные штаммы вируса ящура А22 550, О, 194, Ot 1618, Азия-1 48 и С, 65/67 и полевые изоляты О, 1445, О) 1492, выделенные в Московской области в 1987-1988 г. и любезно предоставленные сотрудником ВНИИЗЖк.в.н. Шажко Ж.А.
В качестве индикаторного ВЯ при изучении иммуногенности вакцинных препаратов на морских свинках использовали адаптированные к ним штаммы 0( 194 и А22 550, прошедшие 191 пассаж на морских свинках.
В качества индикаторного ВЯ при изучении иммуногенности вакцинных препаратов на овцах использовали адаптированные к ним штаммы ВЯ А22 550 и Азия1 48, прошедшие ряд перемежающихся пассажей на мышах и овцах по специально разработанной схеме.
Для конструирования рекомбинантных плазмид использовали плаз-мидные ДНК pBR 322, pUC 7, 8, 9, 10, 18 и 19, рКК 223 и ДНК фага М13 тр 8, 9, 18, 19 фирмы "Pharmacia"; плазмиды pUR 290, pUR 291 и pUR 292, pSK 95, pZtet 3, pTK 208, pP 7,5 К получены из ВНИИ МБ (г.Новосибирск); рТМ 261, рСВ 20, pRT2 78, pRN 23, pRN 15, pRN 34, pRT 5 получены из ВНИИ генетики (г.Москва). Плазмиды pTNF-314 и pWFMD и клетки E.coli SG20050 из ИБХ РАН им. М.М.Шемякина-Ю.А.Овчинникова (г.Москва).
Для трансформации использовали штаммы E.coli TG-1, RZ 1032 и B.subtilis BG2036, полученные из ВНИИ генетики ( г. Москва). Штаммы E.coli ВМН71-18, JM103, JM109, С 600, JS 5318, ТК 1045 МН 3000, полученные из коллекции ВНИИ МБ (г.Новосибирск). Бактерии выращивали на среде Луриа-Бертрана (LB).
Для приготовления буферных растворов при проведении работ по выделению нуклеиновых кислот, ферментативных реакций при молекулярном клонировании фрагментов генома ВЯ и всех работ по технологии рекомбинантных ДНК, анализу и секвенированию генома использовали химические реактивы фирм "Serva", "Sigma", "Fluka", "Merck", а также отечественные реактивы марки не ниже о.с.ч.
Радионуклиды (у-32Р)АТР, (a-32P)dNTP - фирмьГИзотоп" (г.Обнинск).
В работе использовали следующие ферменты: РНК-зависимую ДНК-полимеразу вируса миелобластоза птиц и РНК-азин из плаценты человека производства Омутнинского химического завода (г.Омутнинск);
• ДНК- полимеразу фага Т4, ДНК-полимеразу 1(фрагмент Кленова), полинуклеотидкиназу фага Т4, терминальную трансферазу, Taq- и Tth-полимеразу, а также эндонуклеазы рестрикции фирм "Serva", "Pharmacia", "Boechringer", "Promega", НПО "Вектор" (г.Новосибирск), НПО "Фермент" (г.Вильнюс), Институт белка (г.Пущино).
2.1.1. Концентрирование культурального вируса из вируссодержащего материала и 10% суспензию лапинизированного ВЯ осуществляли двукратным осаждением ПЭГ 6000 и очищали хлороформом, а затем центрифугированием в градиенте цезия-сахарозы по K.Strohmaier et al.(1978). 10% суспензию лапинизированного вируса, приготовленного на 0,02 М фосфатном буферном растворе (рН 7,5), предварительно очищали от клеточных белков хлороформом (30% по объему) и центрифугированием при 17000 g в течение 20 минут в центрифуге "Beckman" J2-21.
2.1.2. РНК ВЯ получали из высокоочищенной вирусной суспензии фенольно-детергентным методом (H.Bachrach,1960) с нашими модификациями.
Выделение полноразмерной РНК проводили в градиенте плотности сахарозы 10-30% на буферном растворе STE при pH 7,4 в центрифуге Sorvall при 68000 g в течение 12 часов при 10°С.
2.1.3. Синтез комплементарной ДНК на вирионной РНК проводили по методу, описанному Т. Маниатисом с соавторами(1984). Синтез второй цепи осуществляли как описано V.Gubler & B.Hoffman(1983).
2.1.4. Клонирование кДНК осуществляли в соответствии с методикой, предложенной Уотсон К. и Джексон Д. (1988), с некоторыми модификациями. В качестве векторов использовались плазмидные ДНК pBR 322, pSK 95, pUC 18, pUS 19 .
2.1.5. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом (H.Birnboim & Doly, 1979). От клеточных белков ДНК отделяли экстракцией смесью фенол-хлороформ. Окончательно очищали препарат от тРНК и солей хромотографией на колонке с сефарозой CL-2B. При аналитическом выделении большого количества проб ДНК их обрабатывали РНКазой А для устранения клеточной РНК.
2.1.5. Трансформацию клеток E.coli проводили по Ханаан Д., 1988. Уровень трансформации составлял 7x106.
2.1.6. Гибридизацию рекомбинантных плазмид с олигонуклеотидными зондами проводили как описано в руководстве по молекулярному клонированию (Маниатис с сотр., 1984). Олигонуклеотиды метили (32Р)АТР полинуклеотидкиназой Т4, кДНК фрагменты метили (32P)dNTP ДНК-полимеразой в реакции ник-трансляции согласно инструкции к наборам фирмы "Amersham".
При проведении дот-гибридизации выделенные плазмиды наносили на фильтр в количестве 10-100 нг в 1 мкл, отжигали и вели гибридизацию по методу, описанному В.Harnes и S.Higgins(1985).
2.1.7. Олигонуклеотид-направленный, сайт-специфический мутагенез с фенотипической селекцией мутантов осуществляли методом T.Kunkel et al.(1985).
2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили двумя методами: по А.Махат и W.Gilbert (1977) в модификации А.Махат et al. (1980) и методом F.Sanger et al. (1977) в модификации R.Komeluk et al. ( 1985).
2.1.9. Амплификацию кДНК в цепной полимеразной реакции проводили по методу R.Saiky (1988) с химически синтезированными универсальными праймерами в автоматическом амплификаторе "Биотерм" (г. Голицино).
2.1.10. Транскрипцию in vitro проводили по методу D. Melton et al.(1984).
2.1.11. Трансляция in vitro вирионной РНК или РНК-транскриптов вели в лизатах ретикулоцитов кролика по методу C.OIIiver.(1984).
2.1.12. Анализ продуктов экспрессии осуществляли электрофорезом в ПААГ-ДСН различной концентрации по U.Laemmli (1970).
2.1.13. Проверку вирусспецифической антигенной активности рекомби-нантных белков, экспрессированных в E.coli, осуществляли с помощью иммуноблота. С этой целью белки после электрофореза в ПААГ-ДСН переносили на нитроцеллюлозные фильтры и проводили иммунофермент-ный анализ согласно методике, описанной H.Towbin et al. (1979) и I.Crowther et al. (I979).
2.1.14. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот, расчет олигонукпеотидов. Обработку информации по первичной структуре проводили с использованием пакетов прикладных пограмм DNASIS/PROSIS версия 3.00 1987г.( Hitachi software engineering Со.) И PC Gene, версия 5.15 1988 (Intelligenetics, Швейцария).
Для сравнения вновь установленных и имеющихся в банке последовательностей использовали программу множественного выравнивания ALIGN, версия 1.01 1989 г. (Scientific and Educational Software, США) и пакет прикладных программ для сравнения последовательностей и предсказания филогенетических отношений SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1,0 ( N.J. Knowles, IFAH, Великобритания).
Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот (Zuker, 1986) с использованием энергетических правил Салсера (Salser, 1977).
Синтез олигонуклеотидов проведен Н-фосфонатным методом по R.Stromberg (1987).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Молекулярное клонирование генома
Молекулярное клонирование генома включает последовательный ряд этапов и состоит для РНК-содержащих вирусов из синтеза первой и второй цепи комплементарной ДНК (кДНК), встройки полученной ^ЦНК в клонирующие плазмиды, введения рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, а также отбора и анализа полученных клонов.
Синтезу кДНК предшествует этап очистки и концентрирования вируса и выделения вирионной РНК.
Вирус получали из вируссодержащей суспензии с исходным титром инфекционности 7,5-8,0 1дБОЕ/мл концентрированием двухкратным переосаждением 10% полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой
6000 и освобождали от примесных белков обработкой хлороформом. Полученный таким образом вирус очищали высокоскоростным центрифугированием в градиенте хлористого цезия-сахарозы с плотностью 1,5 и 1,04 г/см3, соответственно при 70 000д в течение 6 часов при 10°С.
Из очищенного и концентрированного ВЯ выделяли вирионную РНК трехкратной экстракцией фенолом вируса, предварительно обработанного протеиназой К (500 мкг/мл). Выход вирионной РНК составлял около 1 мг из 5 мг очищенного вируса, что достаточно для проведения работ по молекулярному клонированию генома этого возбудителя.
Отделение полноразмерной РНК проводили центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 10-30% при 68 000д в течение 12 часов (10°С), при этом выход к исходному препарату составлял в среднем около 30%.
Полученный таким образом препарат РНК контролировали по титру инфекционности, гомогенности при электрофорезе в агарозном геле, на активность в качестве матрицы для синтеза кДНК и использовали для синтеза комплементарной ДНК в системе обратной транскрипции.
При синтезе кДНК на матричной РНК подбирали условия, обеспечивающие максимальный выход кДНК, который в различных экспериментах составлял от 10 до 70 %. Полученные в результате синтеза в системе обратной транскрипции препараты использовали для молекулярного клонирования в плазмидах в виде РНК-кДНК, для синтеза второй цепи или для прямого секвенирования кДНК методом Максама-Гилберта.
Двуцепочечные кДНК очищали и фракционировали по размеру центрифугированием в градиенте сахарозы (5-25%) и фракции фрагментов, превышающих размер 4000 п.н. использовали для получения рекомбинантных плазмид и создания банка клонов, содержащих
вирусспецифические кДНК. Рекомбинантными плазмидами рВР?322 или рБК95 проводили трансформацию компетентных клеток Е.соП.
Было получено 3000 колоний, устойчивых к тетрациклину. Дальнейший отбор полученных, колоний показал, что 2000 из них оказались чувствительными к ампициллину. Анализ гибридизацией с радиоактивно меченной вирусной РНК позволил отобрать содержащие вирусспецифи-ческую кДНК (400 клонов). Молекулярной гибридизацией клонов с химически синтезированными олигонуклеотидами, соответствую-щими консервативным областям, фланкирующим ген \/Р1 с 1\1- и С-конца было выявлено 18 клонов Е.соН, содержащих ген \/Р1 ВЯ Ая или его фрагменты.
• Изучение полученного банка клонов показало, что большинство клонов содержало вставки размером около 1000 п.н., хотя в различных клонах размер вставки варьировали от 500 до 3000 п.н.
Низкая вероятность клонирования гена \/Р1 вследствие его удаленности от З'-конца вирусной РНК, а также длительность и трудоемкость общепринятого метода молекулярного клонирования и поиска нужных клонов обусловили необходимость усовершенствования метода с целью избирательного клонирования гена \/Р1 ВЯ с использованием синтетических праймеров при синтезе кДНК.
При выборе праймеров пользовались результатами исследований по определению и сравнению первичной структуры гена белка Ур1 различных типов, штаммов ВЯ, опубликованных к моменту проведения работ и предусмотривали в структуре праймеров последовательности определенных сайтов рестрикции, которые затем позволят переклонирование нужного фрагмента в зкспрессирующие плазмиды. Кроме того, рассчитанные и химически синтезированные олигонуклеотиды для синтеза кДНК гена Ур1 ВЯ разных типов использовались в качестве
зондов для поиска клонов Eco//', содержащих этот ген или его фрагменты при создании банка генов традиционным методом.
Для подтверждения универсальности разработанного подхода избирательного молекулярного клонирования гена Vp1 с использованием выбранных синтетических праймеров были использованы РНК ВЯ АггббО, Азия1-48, О, 194, О,. 1618, Ct 65/67, что позволило пополнить ранее созданный банк генов ВЯ А22 рекомбинантными клонами, содержащими кДНК гена Vp1 ВЯ производственных штаммов разных типов.
2.2.2. Определение первичной структуры гена Vp1 вируса ящура разных
типов*
Анализ первичной структуры гена Vp1 ВЯ А22 550 проводили секвенированием клона 7.3, содержащего вставку вирусспецифической кДНК длиной около 3 ООО п.н. и гибридизующийся с обоими праймерами, что свидетельствует о наличии гена Vp1.
С целью определения положения кДНК этого клона на геноме вируса была расшифрована первичная структура концов вставки и определена карта расщепления ее некоторыми рестрикгазами, на основании которой предложена стратегия секвенирования.
Была установлена нуклеотидная последовательность гена и выведена из нее аминокислотная последовательность белка Vp1 ВЯ Azl550.
При сопоставлении аминокислотной последовательности белка Vp1 ВЯ А22 550 с известными штаммами этого серотипа было показано,что он
* Определение нуклеотидной последовательности гена Vp1 ВЯ разных типов и полной структуры генома А22 выполнено совместно с сотрудниками ВНИИМБ (п.Кольцово, г.Новосибирск) д.б.н.Василенко С.К. и Петровым H.A. и кб.н.Сосновцевым C.B. и Онищенко А.М.
-с
Л22 550
A22/Iraq/24/67
A/VencesIau/Brazil/76a
A/VencesIau/Brazil/76b
A/Argentina/79
A24/Cruzeiro/BraziI/55
A12/119/Kent/UK/32
A10/HolIand/42
A5/S pain/86
A/Morocco/83
A27/Cundin./Colombia/76
Рис.1. Дендрограмма, отражающая степень гомологии белка Ур1 разных штаммов вируса ящура типа А
значительно отличается от всех ранее опубликованных структур (рис.1). Как следует из представленной дендрограммы внутритиповая вариабельность по белку Vp1 составляет более 13%, и даже наиболее близкий штамм А22 /Iraq / 64 имеет около 3% различий, что обусловлено наличием 17 нуклеотидных замен, из которых 5 приводят к замене аминокислот в положениях 1, 3, 79, 134 и 194, что можно обьяснить условиями культивирования штаммов в различных лабораториях.
В области основной антигенной детерминанты (131-171 а.о.) уровень гомологии составляет 60-70%, тогда как в районе С-концевой детерминанты (192-213 а.о.) не превышает 50%.
Последовательность гена Vp1 ВЯ Азия-1 48 была установлена методом прямого секвенирования с универсальных праймеров. Сравнительный анализ областей основной антигенной детерминанты белков Vp1
u
ВЯ различных серотипов показал отличие установленной первичной структуры этого района штамма Азия-1 48 от ряда опубликованных структур этого вируса.
Различия наблюдались и при сопоставлении последовательностей антигенных детерминант внутри серотипа Азия-1, а также при сравнении антигенных детерминант Азия-1 48 и ЭАТз Вес1/65. В целом, уровень сходства этих последовательностей составляет 77%.
При этом степень гомологии аминокислотных последовательностей \/р1 между серотипами Азия-1 и А12, О,, С, составляет 65, 70 и 70%, соответственно.
Определение первичной структуры части гена белка Ч/р1 ВЯ серотипа С было осуществлено в два этапа: прямое секвенирование и клонированного амплифицированного участка гена \/р1.
Сравнительное изучение установленной и опубликованных для штаммов этого типа вируса последовательностей показало, что ' нуклеотидные замены, за исключением района антигенной детерминанты, были равномерно распределены по анализируемому участку.
При наличии . одинаковой вариабельности нуклеотидной последовательности (82%) анализ аминокислотной структуры белков позволил установить их различную степень дивергенции, которая колебалась от 7 до 12% для штаммов разных типов.
Результаты структурного исследования дали возможность предположить близость штамма С, 65/67 С3 подтипу.
Для анализа первичной структуры производственных штаммов ВЯ типа О было отобрано 9 клонов, содержащих как полные ДНК-копии гена \/р1, так и различные участки этого гена ВЯ О) 194 и 4 клона, несущих полную копию гена белка Ур1 штамма О, 1618. Доминантная
С
О! 1618
ч
011445/Нопшск/ООСР/87 ОП94
Л 01Л-ячзапЫ8т11а1ап(1/65 I- ОТияшаггЬшзеп/Ссгтяпу/М
011492/ЯрославльЮОСР/88 СУМигсЬ>п/СОК/82
_ О! ЛОиЛючгсп/Ссгшаиу/бб
01/Сицхк/Вгаа1/58 01/ВРЗ/18«0/1Ш>7 02/ВгеяаЛЫу/46 01/1лтЬап))'/1Ыу
ОиСиегмМгйеШнп/б?
и 12 » в 6 4
ПрЧР'г •мпкклсполтм р«»чга|Г|
Рис.2. Дендрограмма, отражающая степень гомологии белка \/р1 разных штаммов вируса ящура типа О
последовательность нуклеотидов области гена Ур1 в обоих штаммах была установлена методом прямого секвенирования с использованием синтетических праймеров с суммарной РНК.
Сравнение установленной последовательности с другими представителями этого серотипа выявило, что в области, кодирующей белок \/р1, различия в последовательности нуклеотидов штаммов О1 194 и О1К составляют 20,6%, что сравнимо с различиями между представителями разных серотипов. Своеобразие установленной структуры прослеживается и на уровне аминокислотной последовательности белка \/р1 (рис.2). Из представленной дендрограммы, отражающей степень гомологии различных штаммов ВЯ типа О, видно, что отечественные производственные штаммы и изоляты этого типа возбудителя выделяются в самостоятельную группу, значительно отличающуюся (до 13% отличий)
по белку Vp1 от штаммов, выделенных в других региогах мира. При этом до 8% отличий наблюдается между штаммами в пределах группы, однако выделенные изоляты имеют большую гомологию с отечественными производственными штаммами и существенные отличия от производственных штаммов других стран. Вариабельность же опубликованных последовательностей нуклеотидов генов белков Vp1 трех других штаммов серотипа О (0,К, СЦ Camp, Oi BFS) не превышает 2%. Степень гомологии геномов вирусов Oi 194 и Oi 1618 между собой существенно выше, чем степень их. гомологии со штаммами группы 0(К. В то же время степень различий вирусов 0)1618 и 0,К того же порядка, что и Oi194 - О,К. Особенно велики различия в области основной антигенной детерминанты, где сосредоточена 1/3 всех различий.
Анализ первичной структуры 7 рекомбинантных фрагментовк ДНК ВЯ штамма О, 194 и доминантной последовательности, выявил существование 12 нуклеотидных замен, 5 из которых приводили к замене аминокислот. При этом в гене Vp1 0( 194 выявлено 8 минорных мутаций нуклеотидов, равномерно распределеных как по геному, так и между клонами кДНК, что говорит об их, случайном характере, вероятно, отражающем присущую данной вирусной популяции микрогетерогенность.Аналогичная работа, проведенная с кДНК клонами и суммарной РНК вируса ящура А22 550 не выявила гетерогенности в первичной структуре гена Vp1.
2.2.3. Определение первичной структуры гена Vp1 полевых изолятов вируса ящура методом прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов
Разработанная методика избирательного молекулярного клонирова-
ния гена Vp1 позволила проводить выявление и дифференциацию полевых изолятов ВЯ анализом первичной структуры антигеннозначимых участков гена Vp1, используя для прямого секвенирования продукты ПЦР, полученные с универсальными праймерами на РНК,' выделенной непосредственно из тканей инфицированных животных, исключая пассирование на клетках культур тканей.
Разработанным методом прямого секвенирования была расшифрована первичная структура всей области гена Vp1 изолята О) 1445.
Сравнение расшифрованных структур геномов вирусов Oi 1618 и О] 1445 выявило в гене белка Vp1 только одну нуклеотидную замену, которая приводила к замене аминокислоты аланин на валин в центре молекулы (110 а.о.) и возникновению в этом месте участка узнавания рестриктазой Крп1. Следовательно, полевой изолят О, 1445 по первичной структуре гена основного антигенного белка идентичен производственному штамму О) 1618 в пределах естественных клональных различий.
Для определения последовательности гена Vp1 эпизоотического варианта Ot 1492 было проведено избирательное молекулярное клонирование кДНК гена Vp1 этого вируса. Определенная первичная структура гена белка Vp1 штамма Ot 1492 при сравнительном анализе со структурами генов белка Vp1 других штаммов ВЯ типа О - О, 1618 , 0( 194, О, BFS и О, Camp обнаруживает 88% гомологии с последовательностями отечественных вакцинных штаммов О, 194 и Ot 1618 и 83% гомологии со штаммами Oi BFS и О, Camp. Более высокий уровень сходства позволил предполагать определенную близость этого изолята отечественным производственным штаммам. Однако считать их его прямыми предшественниками нельзя.
Аналогичный вывод может быть сделан и при сравнительном анализе аминокислотной последовательности белка Vp1 О, 1492. Структура этого белка штаммов 0( 1618 и О, 194 отличается от соответствующей структуры штамма Oi 1492 на 17 и 14 аминокислотных остатков. Следовательно, штамм Ot 1492 обладает нуклеотидной последовательностью гена Vp1, достаточно сильно отличающейся от наиболее близких штаммов Oi 194 и Ot 1618. Как следствие этого, белок Vp1 штамма О, 1492 сохраняет лишь 91-93% гомологии с белками Vp1 штаммов Ot 1618 и Of 194. При этом, по характеру отличий этот белок представляет собой некоторый промежуточный вариант, в котором аминокислотные различия производственных ' штаммов и изолятов чередуются друг с другом.
Выявление различной степени близости изолятов Oi 1445 и О, 1492 производственным штаммам продемонстрировало возможность использования исследования первичной структуры генов Vp1 ВЯ для идентификации эпизоотических вирусов, а также выявления возможного источника возникновения инфекции.
2.2.4. Определение и анализ полной первичной структуры генома вируса ящура А22 550
Работы по определению первичной структуры генома ВЯ штамма А22 550 были проведены на основе созданного и охарактеризованного банка рекомбинантных плазмид, содержащих вирусспецифические кДНК фрагменты.
Локализацию кДНК фрагментов проводили гибридизацией с радиоактивно меченными зондами и секвенированием концов фрагментов.
—г
-т-
—г
2 3 4
Ур4 Ур2 УрЗ Ур1
U LA IB 1С ID 2 \ 28 гс ЗА ц зс 3D
-Paly А
pBRFMl pBRFM2 pBRFM3
PBRFM4
pBRFMS pBRFMB PBRFW7 pBRFMa
PBRFM9 pBRFMIO pBRFU11 PBRFM12 PBRFM13 pBRFMH pBRFMIS
PBRFM16 PBRFU17 pBRFMta PBRFM1S
PBRFM20 PBRFM21 PBRFM22 PBRFM23
И Xb H NSaHXhH N Xny К SI К Xm BgXh Й* M N Xh SI M N S. Ca Xh SI
^J_I_I I II I I_I_I I.I_I I I I I I II_I t ,.l I .I_l_|
Ва - BamHI Bs-BsePI K- Kpnl Sa - Sail
Вд - ВдШ Н - Hind III N Ncol Sf-Sfal
ХЬ -Xbal Xh -Xhol Xm -Xmal
Рис.3. Локализация фрагментов кДНК генома вируса ящура штамма A2z 550 и сайтов рестриктаз, использованных для установления первичной структуры L- фрагмента генома
Рестрикционный анализ позволил определить стратегию и провести :еквенирование отобранных для этой цепи ппазмидных клонов. Большая 1асть первичной структуры была установлена по обеим цепям кДНК с |астичным перекрыванием клонированных последовательностей (рис.3).
Для определения первичной структуры РНК генома ВЯ штамма А^ 50 были проанализированы последовательности рекомбинантных >рагментов кДНК клонов pBRFM 1-23, перекрывающих РНК более чем на 3%. В связи с выявленным в процессе анализа банка отсутствием кДНК (рагментов, соответствующих примерно 600 н. с 5'-конца РНК структура
этого участка генома ВЯ была установлена прямым секвенированием кДНК, полученной на РНК-матрице с меченным 32 Р праймером.
Суммарная последовательность кДНК, соответствующая РНК генома ВЯ А22 550 депонирована в EMBL банке нуклеотидных последовательностей (X 74811 S-фрамент и X 74812 L- фрагмент).
Проведенный анализ первичной структуры генома ВЯ штамма А22 550 показал, что РНК-геном представлен двумя 5'- и З'-концевыми нетран-слируемыми районами, а также центральной белоккодирующей частью, которая содержит открытую рамку считывания длиною 7008 н., соответствующую полипротеину ВЯ. Фланкирующие ее нетранслируемые участки, составляют 86 н. на З'-конце и приблизительно 1240-1250 н. на 5'-конце.
5'-концевой нетранслируемый участок генома ВЯ штамма А22 550 содержит 371 н. S-фрагмента, поли-С-тракт, оцениваемый в 160 н., и последовательность длиною 712 н. к З'-концу от этого тракта до первого AUG кодона открытой рамки считывания полипротеина.
Анализ первичной структуры S-фрагмента генома ВЯ был также осуществлен с помощью прямого секвенирования кДНК и обнаружил достаточно высокий уровень гомологии с ранее описанными последовательностями, (14% различий для А22 550 и Am и 11 % - для А22550 и Ot BFS, что, вероятно, связано с его структурно-функциональной ролью.
Открытая рамка считывания генома А22 550 соответствует 2336 аминокислотным остаткам полипротеина и имеет 2 инициирующих кодона, разделенных 84 н. Инициирующие кодоны задают 2 формы лидерной протеазы-L с молекулярными весами 23,1 и 19,9 кДа.
Сопоставление первичных структур генов белков ВЯ и выведенных из них аминокислотных последовательностей позволило установить характер распределения замен для геномов штаммов Аю, А!2, О,К и А22.
Основное количество аминокислотных различий полипротеинов этих вирусов сосредоточено в районе белков капсида особенно в гене Vp1. Так уровень гомологии для полипротеина штаммов А10 и Аи составил 92,8%, в то время как последовательности белка Vp1 различались на 14,5%, а всего капсидного района на 10,7%.
З'-концевой нетранслируемый участок генома ВЯ штамма А22 550 составляет 86 н., включая UGA-кодон. В него входит вариабельный район из 20-25 н. после терминирующего крдона (для OiK в этом районе характерна делеция части последовательности) и относительно консервативная часть, примыкающая к поли(А)-последовательности.
Установленная первичная структура генома производственного штамма кп 550 может служить основой для изучения структуры и функции генома или отдельных генов и кодируемых ими белков, проведению работ по конструированию векторов, экспрессирующих капсидные белки для создания генно-инженерных аналогов инактивированной вакцины, и создание полноразмерной кДНК-копии генома ВЯ.
2.2.5. Сборка L-фрагмента генома вируса ящура А22
Созданный банк клонов E.coli с кДНК фрагментами генома ВЯ Агг и установление полной первичной структуры генома ВЯ А22 обеспечило возможность осуществления сборки L-фрагмента генома этого возбудителя.
В результате анализа методом молекулярной гибридизации с мечеными зондами и размеров встроенных кДНК, были отобраны плазмиды с наиболее крупными вставками клоны: 5 (2600 п.н.), 38 (2450 п.н.), 92 (2400 п.н.), 120 (750 п.н.), перекрывающие около 75% длины
Ь bbdtn Ъ
5 13 7
□ i—I УГ
U/b Vp4 Vp2 Vp3 Vpl
(.В в
jßHI к к
ьи»йо-«ооо>
к (5500-ВЭ50)
k (1900-8350)
¿3-
1 V
—Poly А
BHI К К Bg в B
в- Bell BHI-BamHI Р • Pvull
Вд -ваш K-Kpnl X-Xbal
Рис.4. Стратегия конструирования кДНК копии транслируемой области генома вируса ящура А22 550 из пяти перекрывающихся фрагментов кДНК и расположение химически синтезированных олигонук-леотидных (V) и кДНК зондов (L . 1) на геноме вируса ящура
генома (2000-8450 н.) (рис.4).
Отсутствие в банке фрагментов на 5'-концевую нетранслируемую область вызвало необходимость проведения избирательного клонирование этой области генома вируса с использованием химически синтезированного праймера, комплементарного области гена Vp4. Проблему влияния вторичной структуры РНК на синтез кДНК решили использованием Taq-полимерэзы при синтезе кДНК.
Рестрикционное картирование и анализ гибридизацией с синтетическими праймерами показали, что фрагмент клона 187 перекрывает
j
отсутствующую в банке область генома (618-2000 н.) и был использован для дальнейшей работы по сборке кДНК копии L-фрагмента генома ВЯ.
На основе анализа 5 отобранных перекрывающихся фрагментов была предложена стратегия сборки транслируемой области генома, включающая 7 этапов переклонирования вирусспецифических фрагментов кДНК. В результате многостадийного клонирования получена плазмида pUBS18, которая содержит кДНК, кодирующую всю транслируемую область (850-8350 н.) генома ВЯ Аа 550 и стабильную в течение 10 пассажей в клетках Е.соН.
Для выяснения возможного влияния лидерной протеазы на стабильность рекомбинантных плазмид в Е.соН и обеспечения условий экспрессии в составе вирусвекторов была сконструирована ДНК-копия транслируемой области генома вируса (850-8350 н.) с делецией в области гена L в 447 н., исключающей почти 3/4 этого гена с сохранением рамки считывания аминокислот.
Правильность сборки ДНК-копии транслируемой области генома была подтверждена в системах транскрипции и трансляции in vitro. Для осуществления транскрипции с ДНК-копии необходимо переклонировать ее под контроль SP6- или Т7-промоторов, плазмиды рАМ18, 19 или |
pGEMl, 2, подобрать оптимальные условия реакции с целью максимального выхода РНК-транскриптов и провести их очистку для трансляции белков в лизатах ретикулоцитов кроликов.
Синтезируемые в реакции трансляции in vitro белки анализировали j
электрофорезом в 10% ПААГ-ДСН. Данные радиоавтографии показали, что с РНК-транскриптов (7600 н.), полученных с кДНК-матрицы, синтезируется полипротеин (259 кД), который в результате процессинга :
расщепляется на белки, соответствущие по молекулярной массе белкам,
синтезированным на полноразмерной вирионной РНК, что свидетельствует о правильности сборки «ДНК копии.
Используя кДНК копию L-фрагмента генома ВЯ, были сконструированы плазмиды pGEM2(Vp1) и pGEM2(Vp1-4) для транскрипции зондов на ген Vp1 и гены всех структурных белков под контролем Т7 и SP6 промоторов, которые использовали для отбора методами дот- и in situ гибридизации экспрессирующих плазмид, содержащих соответствующие участки генома. При этом чувствительность гибридизации была на порядок выше, чем с ДНК зондами, полученными в реакции ник-трансляции, и составляла около 1 пгДНК.
Для конструирования плазмид, экспрессирующих гены неструктурных белков 3d РНК-лолимеразы и Зс протеазы ВЯ А22 использовали фрагменты кДНК генов Зс и 3d из плазмиды pUBS18-L, кодирующие основные антигенные области соответствующих белков, которые встраивали в плазмиду pUC19 после гена а-пептида (3-галактозидазы под контролем lac промотора. Очищенные химерные белки Зс и 3d были активны в ИФА с сыворотками КРС, переболевших ящуром и могут быть использованы для выявления переболевших животных, что перспективно в связи с новой политикой не применения вакцинации против ящура в Европе.
2.2.6. Разработка методов направленного мутагенеза гена основного антигенного белка Vp1 вируса ящура
2.2.6.1. Сегмент-направленный мутагенез генома вируса ящура с использованием РФ РНК
Предложена схема сегмент-направленного мутагенеза генома для вируссодержащих РНК, которая состоит в том, чтобы образовать
одноцепочечные участки на РФ РНК ВЯ в заданном гене, и обработать их мутагеном, который специфически взаимодействует с одноцепочечными участками нуклеиновой кислоты.
Было использовано две схемы для получения одноцепочечных участков на РФ РНК ВЯ. В первом варианте РФ РНК гибридизовали с кДНК на Vp1 ВЯ, полученным из плазмиды pFA618,.в результате чего могли образовываться различные гетерогенные структуры с одноцепочечными участками на "+" и "-" цепи РФ РНК. Во втором варианте проводили гибридизацию РФ РНК с одноцелочечным фагом М13, содержащим "+" цепь гена Vp1, в результате чего получали гибридные молекулы РФ РНК -ДНК М13 (+ Vp1), которые содержали одноцепочечный участок на "+" цепи РФ РНК.
В качестве мутагена, который реагирует с одноцепочечными участками, использовали о-метилгидроксиламин (ОМГА). После обработки мутагеном модифицированная вирусспецифическая РФ РНК трансфекцией вводилась в клетки монослойной культуры под агаровым покрытием, где после образования бляшек выделяли клоны ВЯ. Для отбора модифицированных клонов и их анализа была использована схема, которая включала в себя несколько этапов: сначала отбор по результатам реакции нейтрализации с использованием иммунной сыворотки, полученной на исходный вирус, затем в реакции сероредукции бляшек отбирались отличающиеся по свойствам клоны, которые изучались, используя реакцию нейтрализации с набором нейтрализующих моноклональных антител, полученных на очищенный цельный ВЯ А22 550 и любезно предоставленных сотрудником ВНИИЗЖ к.а:н. Глобенко Л.А., а также с антипептидными сыворотками, полученными на химически
синтезированные д.б.н. Рыбаковым С.С. пептиды из области основной антигенной детерминанты 136-159 и 142-155 гена \/р1 ВЯ этого штамма.
При использовании оптимальных режимов денатурации и гибридизации РФ РНК с гомологичным гену \/р1 рестрикционным фрагментом кДНК ВЯ было получено 15% гибридных молекул РФ РНК-ДНК.
Полученные в результате использования разработанного метода локализованного химического мутагенеза 8 клонов достоверно и в разной степени различались между собой и от исходного вируса в реакции сероредукции с реконвалесцентной сывороткой КРС и в реакции нейтрализации с использованием антипептидных сывороток и набора моноклональных антител. Выделенные модифицированные клоны сохраняли приобретенные свойства в течение 5 пассажей на клетках культур тканей СП, ВНК-21 и ПСГК-30 и могут быть использованы для изучения связи структуры и функции генома этого возбудителя.
2.2.6.2. Сайт-специфический мутагенез области основной антигенной детерминанты генома вируса ящура
Олигонуклеогид направленный сайт-специфический мутагенез заключается в индуцировании мутаций при помощи синтетического мутантного олигонуклеотида, комплементарного области мишени мутагенеза, который используется в качестве затравки в полимеразной реакции образования ■ мутантной нити на исходной матрице с биологической селекцией в урацил-репарационной системе.
Для проведения сайт-специфического олигонуклеотид-направлен-ного мутагенеза, фрагмент кДНК, содержащий ген полипептида Ур1 ВЯ А22
550, клонировали в фаге М13 шр8 по сайтам EcoR I и Hind III, расположенным в полилинкере.
Предложен метод сайт-специфического мутагенеза области основной антигенной детерминанты и осуществлена замена глицин-пролин в положении 140 а.о. гена белка Vp1 ВЯ Агг550.
Методом сайт-специфического мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена белка Vp1 формировали уникальные сайты рестрикции в следующих локусах: 130, 140, 150 и 160 а.о., для чего были использованы мутантные синтетические олигонуклеотиды (рис.5).
| CACGGGACGGGCAAGTACTCCGCAGGTGC CATGGGCAGACGGGGCGACCTAGAGCC I
CATGGTGCCCTGCCCGTTCATGAGGCGTCCACGGTAC CCGTCTGCCCCGCTGGATCTCGGAGT Kpnl | | Saul
Рестрикция Kpnl-SAUl I
Синтетические олигонуклеотиды
130 CACGGAAACTGCAAGTACGTTGACGGGCC 140 CATGGCCAATGTGAGAGGTGACCTGCC 150 CATGGTGCCTTTGACGTTCATGCAACTGCCCGGGTAC CGGTTACACTCTCCACTGGACGGAGT
Kpnl
ЛИГИРОВАНИЕ
ЛИГИРОВАНИЕ
HincII Apal
CACGGAAACTGCAAGTACGTTGACGGGCCCATGGCCAATGTGAGAGGTGACCTGCC CATGGTGCCTTTGACGTTCATGCAACTGCCCGGSTACCGGTTACACTCTCCACTGGACGGAGT
ЛИГИРОВАНИЕ
ЛИГИРОВАНИЕ
-Kpnl CACGGAAACTGCAAGTACGTTGACGGGCCCATGGCCAATGTGAGAGGTGACCTGCC
CATGGTGCCTTTGACGTTCATGCAACTGCCCGGGTACCGGTTACACTCTCCACTGGACGGAGT M13 mp8 VP1 ВЯ A22 1*550 (130-150 a.o.- C^ »194)
Рис.5. Схема кассетного мутагенеза с заменой фрагмента 130-150 а.о. гена белка Vp1 вируса ящура А22 550 на аналогичный синтетический штамма 0( 194
Поэтому анализ мутантов проводили рестрикцией соответствующими ферментами при выделении ДНК в аналитическом варианте.
Всего было проанализировано 36 клонов, 29 из которых содержали требуемые изменения. Анализ первичной структуры отобранных клонов, подтвердил создание кассет в области основной антигенной дерминанты гена белка Vp1.
Вектор для кассетного мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена белка Vp1 был использован для замены фрагмента 130-150 а.о. гена белка Vp1 ВЯ А22 550 на аналогичный синтетический ВЯ О, 194. Для удобства анализа антигенных гибридов, в структуру синтетического фрагмента антигенной детерминанты гена белка Vp1 ВЯ Oi 194 был введен сайт для рестриктазы Ара I, который и являлся маркером при отборе антигенных гибридов. Клоны, содержащие данный сайт, анализировали секвенирова-нием и подтвердили создание антигенного гибрида.
2.2.7. Конструирование и анализ различных векторных-, систем, экспрессирующих рекомбинантные белки вируса ящура
2.2.7.1 Экспрессия вирусспецифических белков в клетках E.coli
С использованием банка клонов и данных по первичной структуре , гена основного антигенного белка была создана серия экспрессирующих рекомбинантных плазмид, содержащих ген Vp1 ВЯ разных типов или его фрагменты в сочетании с генами различных белков-носителей (всего 25 конструкций).
По результатам сравнительного изучения электрофорезом в ПААГ с последующим анализом окрашенных белков на хромоскане, ИФА и
иммуноблотинга наиболее эффективной системой оказалась плазмида рРА 618 (8-213 а.о. ПП \/р1), экспрессиругащая вирусспецифический рекомбинантный белок р-галактозидаза с белком \/р1 (8-213 а.о.) в С-конце и обеспечивающая уровень синтеза белка, доходящий до 30% от общего клеточного белка. В дальнейших исследованиях эту плазмиду использовали в качестве модельной системы для отработки условий культивирования, схемы отбора наиболее эффективных систем, методов выделения, очистки и оценки экспрессированных гибридных вирусслецифических белков.
С целью определения оптимальных условий культивирования клеток Е.соИ, содержащих рекомбинантную плазмиду рРА 618, проводилось сравнение различных ростовых сред, изучалось влияние продолжительности времени культивирования на рост бактерий, определялась динамика синтеза гибридного белка и осуществлялся подбор штамма-продуцента.
Для разрушения клеток в работе использовали преимущественно механический способ обработки бактериальной биомассы ультразвуком. Из .испытанных методов выделения гибридного белка: высаливание сульфатом аммония, дифференциальное центрифугирование с растворением осадков в 6 М мочевине или 3% ДСН. 2-ой и 3-ий методы в равной степени эффективны, так как оба обеспечивают достаточно высокий выход гибридного белка (60-80%), что дает возможность выбирать метод выделения, исходя из предполагаемого способа очистки и целей дальнейшего использования.
Для дополнительной очистки полученных препаратов вирусспеци-фического гибридного белка применяли аффинную хроматографию, гель-фильтрацию и препаративный электрофорез. Все очищенные препараты
обладали вирусспецифической активностью в ИФА и использовались для последующего изучения иммуногенных свойств на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.*
При введении взрослым кроликам препарата |3-галактозидаза-\/р1 (8-213), полученного дифференциальным центрифугированием, в дозе от 250 до 700 мкг титр ВНА нарастал равномерно, достигая максимальной величины - 6 логг НД50/МЛ - только после четвертой иммунизации. Активность сывороток в ИФА колебалась от 1:128 до 1:1024, причем корреляция между титрами антител в ИФА и РН наблюдалась не всегда.
Для определения протективной активности этого гибридного белка на морских свинках его вводили с равным объемом неполного адьюванта Фрейнда (НАФ) животным в дозе 250 мкг. При заражении ВЯ спустя 10 дней после четвертой иммунизации защитный эффект был равен 20%.
Большая доза белка, кратность повторных введений и невысокий титр антител показали необходимость усовершенствования экспрессирующей системы, а также степени и способа очистки вирусспецифического белка.
В связи с этим изучался белок, экспрессированный с плазмиды рЮ РМО, полученной В.Г.Коробко (ИБХ РАН) и любезно предоставленной для испытаний на лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Плазмида р10Р1\Ю экспрессирует в клетках Е.соН штамм 3020050 гибридный белок, содержащий С-концевую (200-213) и основную (131-160) антигенные детерминанты белка \/р1 вируса ящура Ац в С-концевой части белка фактора некроза опухолей человека (ТМР), под контролем тандема ранних промоторов А2 и АЗ бактериофага ТТ.
' Испытания всех препаратов на животных проведены сотрудником ВНИИЗЖ кв.н. Чепуркиным АВ.
Препараты гибридного белка в виде очищенных дифференциальным центрифугированием бактериальных лизатов при однократном введении морским свинкам 250 мкг (вирусспецифический белок составляет 20%) индуцировал выработку нейтрализующих антител с титром до 6,5 log2 НДю/мл и обеспечивали при контрольном заражении вирусом ящура А22 защиту 50% животных (табл. 1).
На взрослых кроликах аналогичная доза препаратов вызывала у различных животных ответ от 4,5 до 6,5 log2 НД5о/мл.
Белок TNF-Vp1 (200-213)(131-160) при однократном введении морским свинкам в дозе 150 мкг обеспечивал 50%, а при двухкратном -100% защиту при контрольном заражении, тогда как двухкратное введение 250 мкг белка р-галактозидаза-Vpl (8-213) не обеспечивало защиту совсем и только четырехкратное введение позволило защитить всего 20% иммунизированных этим белком животных (табл.1).
Рассчитанная величина ИмД50 на морских свинках составляла 40 мкг гибридного белка TNF Vp1(200-213)(131-160).
Произведенный расчет ИмД50 для овец установил 0,6 мг этого гибридного белка, что составляет 120 мкг в пересчете на вирусспецифический антиген.
При двухкратном введении препарата TNF Vp1(200-213)(131-160) КРС в дозах 7,5 мг и 3,5 мг через 40 дней после повторного введения титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови составляли 3,858,5 log2 НД50/мл. При контрольном заражении КРС ВЯ А22 (10000 доз) только доза 7,5 мг обеспечивала защиту обоих животных. Введение дозы 3,5 мг протективного эффекта не обеспечивало, хотя сильно меняло клинику проявления ящура. Следовательно, более чем в десять раз большая доза по сравнению с опытами на овцах обеспечивала защиту от
Таблица 1
Изучение иммуногенности рекомбинантного белка вируса ящура А22 с различными белками-носителями на лабораторных животных
Препарат Доза (мкг) Кролики Кратность введения Титр BHA (log2) Доза (мкг) Морские Кратность введения свинк Титр BHA (iog2) И Защищено Заражено
р-галактозида-3a-Vp1(8-213) 500 500 500 1 2 4 1,0 2,2 3,5 250 250 2 4 <1,0 2,0 0/5 1/5
р-галактозида-эа-Vpl (1 36-157) 300 2 1,5
TNF-Vp1(200-213)( 131-160) 150 150 1 2 6,4 250 250 1 2 2,88 4,24 3/6 6/6
контроль - - <1,0 - - <1,0 0/6
контрольного заражения вирусом ящура Аг2 дважды иммунизированных рекомбинантным белком TNF- Vp1 (200-213)(131-160) КРС.
2.2.7.2. Клонирование и экспрессия гена Vp1 вируса ящура и его фрагментов в клетках B.subtills
Основным преимуществом этой системы является возможность использования регуляторных элементов генов бацилл не только для обеспечения синтеза продукта, но и для осуществления секреции продуктов чужеродных генов в культуральную среду, что позволяет значительно упростить выделение и очистку рекомбинантных белков.
Работа в этом направлении была начата с клонирования полного гена Vp1 в клетках B.subtilis в секреторный вектор pRT 278, любезно .предоставленный сотрудником ВНИИгенетики к.б.н. Сорокиным A.B. Однако, с помощью этого вектора не удалось осуществить нормальную секрецию белка Vp1.
Также не удалось обнаружить синтез Vp1 при использовании плазмиды pFMN/4, где должен был экспрессироваться гибридный белок а-амилаза-Vpl, что возможно обусловлено структурой белка Vp1, не совместимой с секреторной системой клеток В. subtilis.
В связи с этим была произведена встройка фрагментов антигенной детерминанты гена. Vp1 в белок а-амилазу, который эффективно секретируется в бациллах. Методом ПЦР были получены фрагмент ДНК, кодирующий 115-164 аминокислотных остатка белка Vp1 ВЯ А22 550, и фрагмент ДНК, кодирующий антигенную детерминанту белка Vp1 (138-158) ВЯ типа Азия1-48, фланкированные сайтами рестрикции BamH I и Bgl II и в результате серии промежуточных переклонирований получили плазмиды pRT20, 45, 19, экспрессирующие в клетках B.subtilis гены гибридного белка а-амилаза, содержащих антигенные детерминантами ВЯ в различных участках структурной части белка.
Гибридные белки, содержащие антигенные детерминанты Vp1 типа А22 (около 50 аминокислот) секретировались в 100-200 раз меньше, чем нативная а-амилаза. Встройка антигенной детерминанты Vp1 типа Азия 1 (30 а.о.) (pRT19), привела к сокращению накопления белка только в 15-20 раз (50-100 мкг/мл).
В непрямом варианте ИФА сыворотки кроликов, иммунизированных белком а-амилаза-\/р1(138-158)Азия1 в реакции с антигеном ВЯ Азия 1
проявляли вирусспецифическую активность, а в реакции нейтрализации титры антител составили 3,0 1од2 НД50/МЛ.
2.2.7.3. Конструирование тандемно-слитых антигенных детерминант вируса ящура разных типов и их экспрессия в составе гибридных белков
Конструирование тандемно-слитых антигенных детерминант ВЯ типов А22, О,, С1 и Азия-1 в разных сочетаниях в составе (3-галактозидазы было осуществлено в рекомбинантных плазмидных ДНК рВЯ029, рВЯАзб и рВР?РМ17 с использованием ПЦР для амплификации участков гена \/р1 ВЯ разных типов.
Все содержавшие антигенные детерминанты ВЯ продукты экспрессии специфически взаимодействовали с соответствующими сыворотками в ИФА и иммуноблотинге. Согласно данным этого анализа максимальная специфическая активность гибридных белков, кодируемых различными плазмидами, с сыворотками против ВЯ типа А достигала 1:256 (плазмида р1ЖРМ2.1), типа О - 1:16390 (плазмида риЯРМ2.2), типа С 1:1024 (плазмида р1ЖРМ2.2) и типа Азия-1 - 1:64 (плазмида р11Р1РМ4).
Однако, низкая активность в ИФА сывороток взрослых кроликов, иммунизированных многократно препаратами гибридного белка, свидетельствует о необходимости совершенствования созданной поливалентной конструкции с целью повышения иммуногенной активности экспрессированных вирусспецифических белков.
В связи с низкой активностью в ИФА сывороток взрослых кроликов, иммунизированных многократно препаратами гибридного белка, было проведено клонирование антигенных детерминант ВЯ типов А22, О) (114-
161 а.к.) и Азия 1 (134-161) в С-конец белка фактора некроза опухолей человека.
Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей антигенные детерминанты трех типов ВЯ осуществлялась в несколько этапов в экспрессирующую плазмиду рТ^ 314, любезно предоставленную к.х.н. Коробко В.Г.(ИБХ РАН), где антигенные детерминанты ВЯ разных типов экспрессируются в виде гибридного белка в С-конце белка фактора некроза опухолей человека (рис.6).
EcoRI
EcoRI Cla I
Ря!
таи
EcoRI
EcoRI Cla I
Xba[
Xbal
BamHI Bglll Hind III
РЯ1
EcoRI
Xbal
EcoRI
Xbal
150 160 170
Glu Val Tyr Phe,Gly lie Leu lie Asp Leu * (B) • • • GAG GTC TAC TTT GGG АТС CTT ATA GAT СТА TAA GCTT. . . . . -CTC CAG ATG AAA CCC TAG GAA TAT СТА GAT ATT CGAA. . .
Рис.6. Физическая карта плазмиды pTNF 314 (А), фрагменты структуры С-конца TNF (В) и карта рекомбинантной плазмиды pTNF 314 AD (А22 550-01 194-Азия-1 48) (С)
Выделенные дифференциальным центрифугированием гибридные белки имели соответствующую расчетной молекулярную массу при анализе электрофорезом в ПААГ-ДСН и проявляли типоспецифическую активность в ИФА.
При однократном введении поливалентного препарата TNF(A22, Оь Азйя-1х2) взрослым кроликам в дозе 0,9 мг гибридного белка, что составляет 225 мкг вирусспецифического наблюдалась индукция ВНА против всех трех типов ВЯ с титром антител на 68 день для Ан 4 log2 НД50/мл, для типа Ot - до 7,33 log2 НД50/мл и для Азия1 до 6,5 log2 НД50/МЛ. После второй иммунизации гибридным белком в дозе 2 мг титр ВНА для ВЯ типов А22 и Азия -1 возрос вдвое, тогда как для ВЯ типа Ot увеличился несколько меньше. Следует отметить примерно вдвое более высокий титр ВНА при введении препарата ТМР-(Азия-1х2) по сравнению с иммунизацией препаратом, содержащим одну антигенную детерминанту.
Были проведены испытания препарата гибридного белка ТЫР(Азия-1 х2) на естественно-восприимчивых к ящуру животных.
Расчет 50% защитной дозы для овец при контрольном заражении вирусом ( 10000 доз) показал, что она составляет 1мг для гибридного белка TNF(A3hh-1x2 ). Однако, эта величина почти в два раза превышает таковую, определенную нами ранее на овцах для гибридного белка TNF Ан(200-213) (131-160) и составляющую 0,6 мг.
Следовательно, установлена возможность синтеза в прокариотичес-ких (E.coli и B.sub(ilis) системах иммунногенного полипептида Vp1 отечественных штаммов ВЯ разных типов и его фрагментов в сочетании с различными белками-носителями.
Экспрессированные белки обладали антигенными и иммуногенными свойствами при введении лабораторным и естественно-восприимчивым
животным, однако, уровень иммуногенности был ниже существующих вакцин, приготовленных из цельных вирионов.
Для разработки высокоиммуногенных синтетических противоящур-ных вакцин необходимо решить целый ряд вопросов, и основной проблемой остается повышение иммуногенности антигенов.
Таким образом, полученные данные о первичной структуре генома ВЯ отечественных производственных штаммов и кодируемых им белков при использовании современных методов молекулярной биологии и рекомбинантных ДНК позволяют изучать структуру и функцию генома, природу возбудителя и разрабатывать новые более эффективные методы диагностики и профилактики ящура.
3. ВЫВОДЫ
3.1. В результате молекулярного клонирования создан и изучен с использованием методов молекулярной гибридизации, рестрикцион-ного анализа и секвенирования банк рекомбинантных плазмид, содержащих «ДНК фрагменты генома, в том числе гена основного ан^генного белка Vp1, производственных штаммов ВЯ АаббО, О, 194, С, 65/67, Азия-1 48 и полевых изолятов типа О.
3.2. Определена полная нуклеотидная последовательность генома ВЯ А22 550. Она представлена 371 н. S фрагмента и 7806 н. L-фрагмента, разделенными поли(С)-трактом длиной около 160 н.
Выведена аминокислотная последовательность полипротеина, соответствующая открытой рамке считывания длиной 7008 н., а также проведен сравнительный анализ установленной последовательности с геномами других штаммов ВЯ.
3.3. Определена первичная структура кДНК генов Vp1, отечественных производственных штаммов ВЯ 01 194, О, 1618, Азия-1 48 и части гена Vp1 ВЯ С, 65/67.
Показано, что уровни гомологии аминокислотных последовательностей белка Vp1 ВЯ Азия-1 48 с последовательностями аналогичных генов ВЯ типов А, О и С составляет 64, 71 и 69%, соответственно. Первичная структура антигеннозначимых районов белка Vp1 ВЯ штамма С, 65/67 имеет уровень различий аминокислотных последовательностей с белками Vp1 ВЯ типа С) и С3 соответственно 11-12 и 7-8%. Основной район вариабельности антигенного участка гена Vp1 ВЯ О, 194 представлен последовательностью, прилегающей к RGD-сайту.
Установлено, что штамм О, 194 представляет собой вирусную популяцию, различающуюся по гену Vp1. Для штамма А22 550 существование аналогичной гетерогенности не установлено.
3.4. Показана возможность использования метода избирательного молекулярного клонирования и секвенирования гена основного антигбнного белка Vp1 ВЯ непосредственно из патматериала, который может быть применен для выявления и диагностики полевых изолятов этого возбудителя.
-3.5. Определена первичная структура гена белка Vp1 полевых изолятов: О^ 1492 и Oi 1445 и проведен сравнительный анализ с аналогичными структурами производственных штаммов Oi 194 и Oi 1618. Белок Vp1 изолята О) 1492 отличался от производственных штаммов на 14 и 17 аминокислот, соответственно, тогда как изолят Oi 1445 имел близкую структуру (замена одной аминокислоты) с производственным штаммом О, 1618.
3.6. Разработана стратегия и осуществлена сборка кДНК транслируемой области (850-8350 н.) ВЯ штамма А22 550, правильность сборки которой подтверждена секвенированием участков лигирования, а также в системе транскрипции и трансляции in vitro.
3.7. Используя кДНК копию транслируемой области генома ВЯ, получены плазмиды, экспрессирующие в Е. coli протеазу Зс и РНК-полимеразу 3d, которые можно использовать для дифференциальной диагностики ящура от других инфекций и для анализа сывороток с целью выявления переболевших и вакцинированных животных.
3.8. Сконструированы плазмиды с геном Vp1, генами всех структурных белков и транслируемой областью генома под контролем SP6 и Т7 промоторов, позволяющие в системе in vitro получить высокомеченые РНК-зонды для использования в диагностике ящура методом молекулярной гибридизации.
3.9. Методом сайт-специфического мутагенеза гена Vp1 ВЯ А22 осуществлено 9 мутаций и сформировано 3 кассеты для направленного мутагенеза области основной антигенной детерминанты. Проведен кассетный мутагенез области основной антигенной детерминанты и осуществлена замена фрагмента 130-150 а.о. на аналогичный синтетический О) 194, что подтверждено секвенированием.
3.10. Разработан метод сегмент-направленной модификации РНК ВЯ с использованием РФ РНК, гибридизованной с кДНК гена Vp1 и модифицированной химическим мутагеном, позволяющий получить с эффективностью в 14% варианты вируса, отличающиеся от исходного вируса и между собой по антигенным свойствам.
3.11. Сконструированы рекомбинантные плазмиды (всего 25), содержащие ген белка Vp1 ВЯ разных типов, его фрагменты разной длины или их
тандемные повторы, экспрессирующие в бактериальных клетках вирусспецифический белок в составе различных гибридных белков.
3.12. Оптимизированы условия наработки, схема выделения, очистки и оценки антигена ВЯ, экспрессированного в E.coli, и изучены их основные свойства. Показано, что очищенные гибридные белки, содержащие белок Vp1, его фрагменты или их тандемные повторы, индуцируют у лабораторных и естественно-восприимчивых животных при введении в определенных дозах в составе вакцинного препарата выработку вируснейтрализующих антител в количествах, обеспечивающих защиту от контрольного заражения ВЯ соответствующего типа.
3.13. Впервые показана секреция клетками B.subtllis гибридного белка, содержащего антигенные детерминанты ВЯ, что существенно упрощает очистку экспрессированного вирусспецифического белка. Выделенный гибридный белок при введении взрослым кроликам индуцировал выработку вируснейтрализующих антител.
3.14. Сконструированы векторы, экспрессирующие поливалентные гибридные белки ß-галактозидаза - Азия 1-48 - А22 550 - О, 194 - С, 65/67 и TNF-A22 550-0i 194-Азия 1-48 х2, которые при введении лабораторным животным индуцировали выработку вируснейтрализующих антител одновременно против ВЯ всех использованных в препарате типов.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
4.1. Разработанный метод избирательного молекулярного клонирования и прямого секвенирования гена основного антигенного белка Vp1 ВЯ разных типов непосредственно из патматериала, а также установленная первичная структура этого гена отечественных производственных
штаммов применяются для выявления и идентификации полевых изолятов этого возбудителя с целью диагностики и выяснения возможного источника возникновения инфекции.
4.2. Выделенные из бактериальной массы экспрессированные вирусспецифические гибридные белки могут быть рекомендованы для создания синтетических противоящурных защитных препаратов для естественно-восприимчивых сельскохозяйственных животных.
4.3. Банк рекомбинантных плазмид, содержащих различные фрагменты генома ВЯ используются для получения кДНК зондов с целью получения зондов для анализа и отбора кДНК фрагментов при молекулярном клонировании генома ВЯ других типов и вариантов ВЯ, а также для выявления вирусной РНК в образцах патматериалов методом молекулярной гибридизации.
4.4. Экспрессированные в Е.соН гибридные белки Зс протеаза и 3с1 РНК-полимераза ВЯ применяются для дифференциальной диагностики ящура от других инфекций и анализа сывороток в ИФА с целью выявления вирусоносителей, переболевших и вакцинированных животных.
4.5. В процессе выполнения научных исследований разработаны и утверждены 30 методик по молекулярному клонированию, оценке и использованию клонированных фрагментов и продуктов их экспрессии, которые используются в работе с ВЯ и могут быть применены в работе с другими вирусами.
Список опубликованных по теме диссертации работ
1. Перевозчикова H.A., Нетесов C.B., Буторин A.C., Онищенко A.M., Фалина Г.М.Выделение и характеристика полноразмерной РНК вируса ящура.//Тез. докл. науч. конф.ВНИЯИ. Владимир. 1983.С45-50.
2. Михалусев В. И., Назарова Т. И., Перевозчикова Н. А. Поддержание и хранение бактериальных штаммов £ coli, содержащих кДНК ВЯ.//Акг. пробл. вет. вирусол.Владимир.1986. С.28-29.
3. Перевозчикова Н. А. Перспективы получения противоящурных вакцин на основе микробиологического синтеза. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1986. С. 59-61.
4. Перевозчикова Н. А., Фалина Г. М., Сатина Т. А., Перевозчиков В.А., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Выделение РНК вируса ящура. //Ветеринария, 1986. N 5. С. 31-34.
5. Бурдов А.Н., Перевозчикова Н. А., Фалина Г. М., Титов И.Н., Михалусев В.И., Иванющенков В.Н., Онищенко А.М., Василенко С.К., Бурдов А.Н. Синтез и клонирование комплементарной ДНК вируса ящура в Е. coli. //Ветеринария, 1986. N 7. С. 27-29.
6. Онищенко А. М„ Петров Н. А., Блинов В. М., Василенко С.К., Сандахчиев Л.С., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Первичная структура ДНК-копии гена белка VP1 ВЯ типа Аи- //Биоорг. химия. 1986. т. 2, N 3. С. 416-419.
7. Бурдов А. Н., Иванющенков В. Н., Рыбаков С. С., Перевозчикова H.A., Дрягалин H.H., Титов И.Н., Чепуркин A.B., Сатина Т.А., Павлов A.B., Михалусев В.И. Изучение иммуногенных свойств антигенов ВЯ, полученных микробиологическим и химическим синтезом. //Протокол научно-координ. совещания СЭВ по заданию 5.1.4. Усти на Лабе 1986. с. 25-32.
8. Сатина Т. А., Перевозчикова Н. А., Иванющенков В. Н. Использование аффинной хроматографии для выявления специфических антигенов ВЯ. //Акт.пробл.вет.вирусол. Владимир. 1986.С. 7-9.
9. Мудрак Н. С., Кожаева Г. И., Дрягалин H. Н., Иванющенков В.Н., Перевозчикова H.A. Использование жидкофазного варианта ЭЛИСА для выявления вирусспецифических противоящурных антител. //Тезисы докл. молод, спец. Акт. пробл. вет. вирусол. и микробиол. Владимир. 1987. С. 46-47.
10. Герасимов В. А., Плясунов И. В., Карпышев H. Н., Бабкин A.B., Синагатулина Н.К., Василенко С.К., Аминев А.Г., Титов И.Н.,Кожаева Г.И., Перевозчикова H.A. Иванющенков В.Н. Конструирование экспрссирующих векторов, содержащих полноразмерный ген VP1 ВЯ типа Ап- //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987.4.1. С. 61-62.
11. Онищенко А. М„ Мамаева Н. В., Петров Н. А., Калашникова Т.И., Гринев A.A., Карпышев Н.Н, Дегтярев С.Х., Василенко С.К., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Молекулярное клонирование и анализ первичной структуры гена белка VP1 ВЯ Ol 194. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч. 1. С. 63.
12. Перевозчикова Н. А. Достижения в использовании технологии рекомбинантных ДНК для изучения структуры и функции генома пикорнавирусов. II Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 6365.
13. Сатина Т. А., Окулова О. Н., Кожаева Г. W., Михалусев В.И., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Выделение и характеристика гибридного белка в-галактозидаза-VPI ВЯ, экспрессированного в E.coli. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 65-66.
14. Дрыгин В. В., Шушпанникова В. Г., Михалусев В. И., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Молекулярная гибридизация с использованием меченых кДНК и РНК зондов ВЯ.//Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 66-67.
15. Дрыгин В. В., Гуленкин В. М., Перевозчикова Н. А., Иванющенков В. Н. Изучение с помощью компьютерного анализа возможности образования вторичных структур в области гена VP1 ВЯ разных типов. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 68-69.
16. Дрыгин В. В., Гуленкин В. М., Перевозчикова Н. А., Иванющенков В. Н. Сравнительный анализ первичной структуры гена VP1 и кодируемого им белка ВЯ разных типов с использованием ЭВМ. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 69-70.
17. Титов И. Н., Михалусев В. И., Онищенко А. М., Дрыгин В.В., Аминев А.Г., .Кузьмин И.В., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Василенко С.К., Бурдов А.Н. Конструирование экспрессирующих векторов, содержащих различные фрагменты гена VP1 ВЯ. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. 4.1. С. 61-62.
18. Окулова О. Н„ Сатина Т. А., Чепуркин А. В., Кожаева Г.И., Дрягалин Н.Н, Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Изучение антигенной активности гибридного белка р-галактозидаза-VPI вируса ящура, экспрессированного в E.cali. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч.1. С. 71-72.
19. Кожаева Г. И., Мудрак Н. С., Сатина Т. А. Окулова О.Н., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Применение ЭЛИСА на нитроцеллюлозных фильтрах для выявления и изучения антигена ВЯ, экспрессированного в E.coli. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987.4.2. С. 52-54.
20. Онищенко А. М„ Петров Н. А., Василенко С. К., Петров H.A., Василенко С.К., Блинов В.М., Сиволобова Г.Ф., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н. Авторское свидетельство N 257731 от 1.06.1987.
21. Фалина Г.М., Михалусев В.И., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Молекулярное клонирование генома ВЯ Аа в виде РНК-ДНК гибрида.// Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1987. ч1. С. 72-73.
22. Титов И. Н., Перевозчикова Н. А., Иванющенков В. Н., Бурдов А.Н., Сатина Т.А., Михалусев В.И., Василенко С.К., Онищенко А.М., Герасимов В.А. Конструирование про- и эукариотических векторов с геном VP1 ВЯ. //Рабочее совещание по биотехнологии ГДР. Риме. 1988. СЭВ. С. 22-23.
23. Кожаева Г.И., Сатина Т.А., Молчанова А.И.,Глобенко Л.А., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Перевозчиков В.А. Применение ИФА для количественного определения 146S антигена ВЯ в исследуемых материалах. //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1988. 4.2. С. 21-22.
24. Дрыгин В.В., • Аминев А.Г., Андреев В.Г., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Конструирование кДНК, кодирующей область структурных белков ВЯ А22, путем лигирования фрагментов. //Акт. пробл. вет. вирусол.Владимир.1988.ч.1.С.4-5.
25. Гуленкин В.М., Дрыгин В.В., Луговской A.A., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Изучение гидрофильных антигенных амфипатичных и структурных участков белков VP1 вируса ящура А22 550 и О, 194 с помощью компьютерного анализа.//Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1988. 4.1. С. 10-11.
26. Окулова О.Н., Сатина Т.А., Кожаева Г.И.,Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Применение иммуноблотинга для выявления антигенов ВЯ, экспрессированных в бактериальных системах и тестирование моноклональных антител.// Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1988. ч.1. С. 14-15.
27. Сатина Т.А., Окулова О.Н., Кожаева Г.И., Гловенко Л.А., Давыдова Н.Л., Камалова Н.Е., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Шажко ЖА. Очистка и концентрирование моноклональных антител против ВЯ типов А22 и О). //Акт. пробл. вет. вирусол. Владимир. 1988. ч.1. С. 17-18.
28. Кузьмин И.В., Рыбаков С.С., Иванющенков В.Н., Быкова Л.А., Перевозчикова H.A., Фалина Г.М., Михалусев В.И., Дрыгин В. В., Бодин Б.Я., Гневашев В.М. Клонирование З'-концевой области генома вируса ящура А22.// Матер. Il-го симпоз. специалистов стран-чл. СЭВ по пробл."Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин/Болгария. София. 1988. С. 78-82.
29. Мудрак Н.С., Кожаева Г.И., Дрягалин H.H., Иванющенков В.Н., Перевозчикова H.A. Использование жидкофазного варианта ЭЛИСА для выявления вирусспецифических противоящурных антител.// Акт. пробл. вет. вирусол. и микробиол. Владимир. 1988. С. 53-55.
30. Сосновцев C.B., Онищенко А.М., Петров H.A., Мамаева Н.В., Калашникова Т.И., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н., Василенко С.К. Первичная структура гена белка VP1 ВЯ серотипа Азия 1. //Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. N.12. С. 44-46.
31. Онищенко А.М., Петров H.A., Мамаева Н.В./Калашникова Т.И., Гринев A.A., Сосновцев C.B., Дегтерев С.Х., Карпышев H.H., Перевозчикова Н. А., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н., Василенко С.К. Первичная структура гена белка VP1 вируса ящура серотипа О,, изолированного в СССР. // Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. 12. С. 44 - 46.
32. Аминев А.Г., Дрыгин В.В., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A. Конструирование плазмиды, экспрессирующей все структурные белки ВЯ А22- //Акт.вопр.вет.вирусол. Владимир. 1990. С. 13-14.
33. Аминев А.Г., Андреев В.Г., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A. Конструирование кДНК-копии кодирующей части генома вируса ящура А22. //Акт.вопр.вет.вирусол. Владимир. 1990.С. 14-15.
34. Сосновцев C.B., Онищенко А.М., Петров H.A., Калашникова Т. И., Мамаева Н.В., Василенко С.К., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Первичная структура транслируемой части генома ВЯ. Анализ аминокислотной последовательности. // Акт. вопр. вет. вирус. Владимир. 1990. С.12-13.
35. Мамаева Н. В., Сосневцев С. В., Василенко С. К., Дрыгин В. В., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Возможность типоспецифической идентификации ВЯ с помощью ПЦР.//Акг. вопр. вет. вирусол. Владимир. 1990. С. 11 - 12.
36. Аминев А.Г., Дрыгин В.В., Щербаков A.B., Мудрак Н.С., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Конструирование экспрессирующей плазмиды, содержащей область структурных белков ВЯ. //Акт. вопр. вет. вирусол. Владимир. 1990. С.11-12.
37. Андреев В.Г., Дрыгин В.В., Батченко Г.В., Аминев В.Г., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Клонирование генов VP1 ВЯ разных типов в фаге М13. /ГНаучн. основы технол. промышл. производства вет. биол. препаратов." Матер. Всес. конф. Москва. 1991. С. 255 - 256.
38. Андреев В.Г., Дрыгин В.В., Ломакин А.И., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Сайт-специфический мутагенез области основной антигенной детерминанты ВЯ Аы- /ГНаучн. основы технол. промыш. производства вет. биол. препаратов." Матер. Всес. конф. Москва. 1991. С. 257-258.
39. Перевозчикова H.A. Технология рекомбинантных ДНК в изучении молекулярной биологии вируса ящура ./Г К новой стратегии борьбы с ящуром." Междунар. конф. Владимир. 1991. С. 125-126
40. Дрыгин В. В., Щербаков А. В., Перевозчикова H.A. Изучение вариантов ВЯ Аа методом прямого секвенирования структурного гена VPI./ГК новой стратегии борьбы с ящуром." Междунар. конф. Владимир. 1991. С. 126- 127.
41. Аминев А. Г., Дрыгин В. В., Андреев В. Г., Перевозчикова H.A. Конструирование ДНК-копии L-фрагмента генома вируса ящура А^./ГК новой стратегии борьбы с ящуром. "Междунар. конф. Владимир. 1991. С.142-143.
42. Андреев В. Г., Дрыгин В. В., Перевозчикова Н. А. Создание методом сайт-специфического мутагенеза кассетного вектора для конструирования антигенно измененных вариантов вируса ящура. /ГК новой стратегии борьбы с ящуром."Междунар. конф. Владимир. 1991. С. 145 -146.
43. Сосновцев C.B., Онищенко A.M., Петров H.A., Калашникова Т. И., Мамаева H.A., Василенко С.К., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Клонирование и определение первичной структуры участков генома штамма А22 550 Азербайджан-65 вируса ящура./ГК новой стратегии борьбы с ящуром." Междунар. конф. Владимир. 1991. С. 127-128.
44. Сосновцев С. В., Калашникова Т. И., Мамаева Н. В., Беляев A.C., Дмитриев И.П., Василенко С.К., Дрыгин В.В., Онищенко A.M., Перевозчикова H.A., Рыбаков С.С. Получение рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих основную антигенную детерминанту ВЯ, слитую с поверхностным антигеном вируса гепатита В.//Тезисы докп.П Всесоюзн.конференции "Генная и клеточная инженерия". Пущино. 1991. С. 171.
45. Перевозчикова Н. А.. Технология рекомбинантных ДНК в изучении молекулярной биологии ВЯ. // Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром) Сборник научных трудов ВНИЯИ. ч.П. Владимир. 1992. С. 64 -76.
46. Дрыгин В. В., Аминев А. Г., Дудникова Е. К., Аянот П.К., Безбородова C.B., Перевозчикова H.A. Клонирование и экспрессия в E.coli гена РНК-полимеразы ВЯ А22. Н Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров. 1992. 1. С. 79.
47. Смирнова H.A., Гончарова М.И., Андреев В.Г., Перевозчикова H.A. Встройка основной антигенной детерминанты вируса ящура А22 в а-амилазу B.amiloliquefaciensJI Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров. 1992. 1. С. 174-175.
43. Смирнова H.A., Гончарова М.И., Перевозчикова H.A., Сорокин A.A. Секреция нейтральной протеазы с антигенной детерминантой ВЯ А гг.// Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров. 1992. С. 178.
49. Аминев А. Г., Дрыгин В. В., Щербаков А. В., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н. Конструирование ДНК-копии транслируемой области генома ВЯ. //Доклады РАСХН. 1993.1. С. 77-81.
50. Drygin V.V.,Scherbakov A.V., Perevozchikova N.A.,Gusev A.A. Amplification and sequencing of genomic segments of FMD virus using polimerase chain reaction. //Europ. Commiss. FMD. Vienna. Austria. 19-22 Sept 1994. Rome. 1994. 6p.
51. Drygin V.V., Sherbakov A.V.,Perevozchikova N.A., Gusev A.A. Preliminary molecular analysis of FMD virus isolates collected on territories of Rassia and the CIS in 1993-1994.// Europ. Commiss. FMD. Vienna. Austria. 19-22 Sept. 1994. Rome. 1994. 3p.
52. Андреев В.Г., Коробко В.Г., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих антигенные детерминанты различных типов ВЯ,- и изучение свойств гибридных белков.// Вестник РАСХН. 1995. N3. С. 55-58
53. Дрыгин В.В., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Использование метода секвенирования генома при изучении ВЯ.// Ветеринария. 1995. С.31-33
54. Грибанов О.Г., Фалина Г.М., Коробко В.Г., Смирнова H.A., Перевозчикова H.A., Сатина Т.А. Культивирование клеток E.coli, экспрессирующих гибридные белки с антигенными детерминантами ВЯ в ферментере АК-210.// Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных. Владимир. 1995. С. 47-51.
55. Коробко В.Г., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Сатина Т.А., Чепуркин A.B., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Окулова О.Н., Кожаева Г.И., Мудрак Н.С., Диев В.И., Толокнов A.C. Экспрессия в E.coli синтетических генов, кодирующих иммуногенные детерминанты ВЯ. Получение гибридных белков и изучение их свойств.// Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных. Владимир. 1995. С. 52-61.
56. Щербаков A.B., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Экспресс-метод идентификации полевых изолятов ВЯ. II Матер, конф. ВНИИЗЖ. Владимир. 1995.
57. Щербаков А.Г., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Определение первичной структуры капсидных белков вариантов ВЯ А22, отличающихся по биологическим свойствам II Матер, конф. ВНИИЗЖ. Владимир. 1995.
58. Aminev A., Mudrak N., Amineva S., Perevozchikova N.. Drygin V., Gusev A. Expression of FMDV 3c protease and RNA polymerase gene fragments in E.coli and use for diagnosis. World Veterinary Congress. 3-9 Sept., 1995. Yokohama, Japan. 1995. P.36
59. Smirnova N., Sherbakov A., Mudrak N., Perevozchikova N., Gusev A. Secretion of fusion protein containing FMDV type Azia-1 antigenic determinant into medium of Bacilli's cells. II World Veterinary Congress. 3-9 Sept 1995. Yokohama. Japan. 1995. P.210
60. Andreev V., Korobko V., Perevozchikova N., Chepurkin A., Toloknov A., Gusev A. Testing of TNF-linked fusion proteins containing antigenic determinants of various FMDV typs as vaccines.// World Veterinary Congress. 3-9 Sept.1995. Yokohama. Japan. 1995. P.36
ОТПЕЧАТАНО НА ПОЛИГРАФИЧЕСКОЙ БАЗЕ ОТДЕЛА ПАТЕНТНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И НАУЧНОЙ ИНФОРМАЦИИ ВНИИЗЖ ТИРАХ 75 экз.
-
Перевозчикова, Наталья Александровна
-
доктора биологических наук
-
Покров, 1995
-
ВАК 03.00.06
- Конструирование кДНК копии транслируемой области генома вируса ящура А22
- Биологические свойства эпизоотических штаммов вируса ящура типов А, О и Азия-1, выделенных в Республике Таджикистан в период с 2006 по 2012 гг.
- Устойчивость вируса ящура к воздействию физико-химических факторов
- Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура
- Оценка синтетических пептидов и вириона вируса ящура в радиоиммуноанализе
