Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование кДНК копии транслируемой области генома вируса ящура А22

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование кДНК копии транслируемой области генома вируса ящура А22"

p J* {рЕРОССЩ^КШ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ

2 2 FEB 1993

На правах- рукописи ■ УДК 578. 835: 616. 988. 4

АМИНЕВ Алексей Георгиевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ кДНК КОПИИ ТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ ГЕНОМА ВИРУСА ЯЩУРА А22

03.00.06 "Вирусология"

Авторефе'р'ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных.

• НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: ,

- [ИВАБЩЕНКОВ В. Н] - доктор ветеринарных наук,

профессор;

- ПЕРЕВОЗЧИКОВА Е А. - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: •

- МАТВИЕНКО Николай Иванович доктор биологических наук, профессор ( Институт Белка РАН, Дущино, Московской области)

- БЫКОВА Лина Александровна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных, г. Владимир)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной , вирусологии и микробиологи! г. Покров Владимирской обл.

Защита состоится "/^"марта 1993 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 120.60.01.по защите диссертации, на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу:' 600900, г. Владимир, п. Юрьевец, ВНИ-ИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных. .

Автореферат разослан /'м^рта-1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета - Узюмов а Л.

Актуальность темы: вирус яшура вызывает тяжелое заболевание парнокопытных животных, которое наносит большой экономический ущерб. Прогресс в изучении структуры и функций генома, а т.аноке отдельных белков вируса открывает новые пути к получению эффективных профилактических и диагностических препаратов.

Анализ литературных данных по изучению связи структуры и функция, а также направленного мутагенеза генома различных представителей пикорнавирусов показал, что -эти исследования значительно . затруднены без создания кДНК копии генома. Конструирование кДНК копий РНК некоторых пикорнавирусов ( полиовируса, вируса Коксага и других) позволило вводить, мутации в строго определенные области генетического материала, осуществлять внутри-.и меггиповке рекомбинации по заданным сайтам, получить мутанты и рекомбинанты, перспективные для использования в качестве вакцинных штаммов (С1агке В. Е. е. а , 1987; КоЬага II е. а. , 1985). Создание кДКК копии генома вируса раскрывает широчайшие возможности по изучению механизмов аттенуацш :: вирулентности, особенностей процессинга полипрстеина, функций отдельных белков и районов РНК нетранслируемой области и их роль^в репликации вируса Эти исследования является основой для создания нового поколения синтетических вакцин. , Используя инфекционные кДНК копни генома"возьашю создать аттенукрованные птаммы вируса с очень низкой степенью реверсии. На основе кДНК копии генома полиовируса созданы аттентированные штаммы,несущие антигенные свойства нескольких типов одного вируса • дновременно и даже вирусов, принадлежащих к различным, семействам (С!-1Г1зЮс1ои1ои а е. а ,1990). Проведение работ по конструированию кДНК копии генома позволяет наработать любой вирусный белок и получить на него специфические сыворотки.

« 8а последние годы • опубликованы работы по изучению связи структуры и функций генома, отдельных белков и особенностей процессинга полипротеина с использованием кДНК

копии транслируемой области РНК. вируса яшура штаммов OjK, Л,о и A,z (Clarke В. Е. е. а. ,1988; Ryan М. D.е. а. , 1989; Vakharia V. N. е. а., 1987). Многими Исследователями сделаны попытки создания вакцинных препаратов путем экспрессии всей транслируемой'области генома.с образованием вирусоподобных частиц в различных эукариотических системах: клетках насекомых в составе 6aKyjiaBiipyca(Roosicn J. е. а,1990); в клетках эукармат в составе вируса осповакцины ' под контролем р7,5 или Г? промоторов (Belsham G. е. а ,1990). Получение полноразмерных кДНК копий генома вируса ящура затруднено из-за наличия в вкрионной РНК длинной поли(С) последовательности , однако у сходного по структуре вируса энцефа-ло?л;с!кардита мыиэй эту трудность удалось преодолеть (Duke G. V. е. а. ,19G9). Б 1990 году создана инфекционная кДНК копия • генома вируса- яшура типа ОтК, в которой укороченный по-лл(С) участок содержу 32 цитидиновых основании (Zibert А. е. а, 1990).

Цель и заррчн исследования: Основной целью работы •явилось создание кДКК копии транслируемой области генома вируса ящура Агг. Для.достижения поставленной цели необходимо было решть следующие задачи:

- проанализировать банк клонов Е.coli с плазмидами, .содержащими фрагменты кДБК вируса ящура и отобрать плазмиды с длинными перекрьшающишся фрагментами-;

- дополнительно синтезировать и клонировать недостающие фрагменты кДЖ, а также определить их первичную структуру;

- сконструировать кДНК копию транслируемой. облает*

генома;

- проверить правильность сборки кДНК копии секвениро-ванием участков лигированяя, а также в системе транскрипции и трансляции in vitro;

- показать возможность использования кДНК копии длз 'соЕерненствоЕания средств диагностики и профилактики.

- 4 -

Научная нозязна л практическая значимость:

В результате анализа банка клонов Е. col i с кДНК фрагментами генома вируса ящура" отобраны 4 плазмиды, содержащие кДНК, - которые перекрывают 75% генома и частично определена их первичная структура.

Создан банк рекомбкнантных плазмид с кДКК фрагментами, кодирующими 5'-нетранслируемую область L-фрагмента генома вируса яшура и определена их первичная структура.

Сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая кДНК копию транслируемой области (850-8350Н.) генома вируса ящура ' под контролем SP6 промотора, а также аналогичная кДНК копия с деледией в гене лидерной лротеазы. В реакции транскрипции in vitro с кДНК копий синтезированы РНК транскрипты. В"реакции.трансляции in vitro в бескле-гочной системе с РНК транскриптов кДНК копий синтезированы вирусные белки, соответствующие по молекулярному весу структурным и неструктурным белкам вируса ящура, " а также описанным в литературе. Это свидетельствует о правильности сборки кДНК копии. !

Сконструированы рекомбинантнш плазмиды с генами, всех структурных белков и геном YPt под контролем SP6 и Т7 промоторов и отработан метод получения высокомеченных РНК зондов. , .

Созданы, система экспрессии всех структурных белков с в-галактозидазой, протеазы 2с и РНК полимеразы 3d вируса ащур&.. Отработана методика получения, определены свойства и показана возможность использования этих белков для разработки на их основе защитных и диагностических препаратов.

Апробация результатов исследований:

ЬЬтериалы диссертации доложены на:

- Всесоюзной научной конференции по проблемам ветери-нгфной вирусологии ( г. Ел?цимир 1988г. БНИШ);

- Всесоюзной конференции молодых учёных по ветеринарной вирусологии С г.Суздаль 1990г.);

- 5 - •

- ученом совете БНИЯИ в 1989 - 1992 годах;

- годичном, собрании Отделения ветеринарной медицины ВАСХНИЛ (г. J/осква апрель 1991 г.);

- Международной конференции по ящуру ( г. Суздаль октябрь 1991г.).

Нуа_';к"г.ц;;н научна згсследовмпо"!: основные положения диссертации отражены в 6 печатных публикациях.

Структура. и обгам g-'ceptratyss: Диссертация содержит слелукг;;!е разделы: введение, обзор литературы, материалы и и»тоды, результаты и.их обсуждение, выводы, список литерг.туры, вклйчзкцяй 164 ссылки на источники литературы. Рабата ¡¡аложкп на 152 страницах мазинолкешго текста, ил-л! • •тркроваяа £3 рисунками и 5 таблицами.

Колококия, гьвюсюаот ita aasgrrv:

- конструирование кДШ копки транслируемой области генома вируса ящура

- создание рекембкнангчшх плазмид кодирущих 5*-концевую область L-фрагмэнта генома вируса ящура

- получение бактерий Б.coli, продуцирующих хкчерныо белки вируса яшура : VP^ ,VP¿,VРэ,УР^-р-галактозид-.1за, про-теазу Ge - С-конех^ептида, РНК полимеразу 2d - С-кокец

¿^пептида;

- создание, реко.мбйнантных плазмид с генами VIJ¡ ,VP¿,VP5 и VP¿ иод контролем Spö" и Т7 промоторов для синтеза РШ зондов;

- конструирование плазмиды с кДШ копией транслируемой области renowa ьируса ящура , несущей делец-.го в области гена лкдерной прои-еази для экспрессии в составе вируса ос повакци н;;.

СОЗСЯЗЕШШВ ШЗДКОВШЛ

М.'Л'ШШШ И 1КТОДЯ.

В рчбо^е использовали штамм вируса ящура Агг_Ы 550. Для

трыгфорщцик использовали следуга-ие штаммы клеток Е. coli: j ¡.¡101,103.105,109; НВ101; TGI; СбОС; • JS5318; {'.•"ГГЛв; ¡32302; D400-1 Бактерии внращивали на ¿rape и в

среде LB, содержащей: 1Z триптон; 0.5Z дрожжевой экстракт; 2% NaCl. В работе использовали следующие плазмидьс pUC9,19; pUBS18,19; pUR291; pBR322; рАТ153; pGEMl,2; pMÜ8,19, а также банк рекомбинантных ллазмлд с кДНК вируса ящура А22.

Тралсфориация клеток Е. coli. Трансформацию вели, как описано у Хаяахана (1989) и по методике, утвержденной во ВНИЯИ. Уровень трансформации составлял 7*10? Грансфор-'

манты высевали на агар с ампициллином (50мкг/мл).

Выделение плззиид. Выделение" плазмидной ДНК проводили путем разрушения клеток Е.coli щелочным лизисом. От клеточных белков ДНК очищали экстракцией смесью фэнол-хлороформ. Удаление высокомолекулярной клеточной РНК и полисахаридов вели высаливанием ЗМ ацетатом натрия pH 7,0 при 0°С. Окончательно очищали препарат от тРНХ и солей хрома- . тографией на колонке с гелем CL-2B. При аналитическом выделении проб ДНК. их обрабатывали РНКазой А для расщепления клеточной РНК.

Гибридизация росоибнягштвых плазинд с omizonyiz-леотид/шш.» я геДта зопдаин. Детали метода описаны в руко- • водстеэ по. молекулярному-клонированию (Манлатис Т. с. соавт., 1984) и методике, утвержденной во ВШЯЙ.

Синтез н клоплровапие кД1П£. Синтез первой цепи кДНК вели обратной транскриптазой, как описано в.руководстве по молекулярному клонирований. (Маниатис Т. с соавт. ,1984) Реакционную смесь инкубировали 1 час при +420 и экстрагировали смесью фенол-хлороформ. Вторую цепь синтезировали по методу Гублера-лЬфмана (Gubler ,11. е. а. 1983) с использованием ШЖ полямеразы 1, ДНК лигазы и РНКазы Н.

Определение аервтной структуры. Анализ первичной структуры проводили по методу Максама-Гилберта с' модифика- ' циями(Махат А. М. е. а , 1977) и по методик, утвержденной во Е1&ЯИ. '

- 7 - -

Транскрипция in vitro РНК С кДНК>матриц.

Транскрипцию проводили ло Методу Элтона (Msiton D. А. е. а., 1984).

Трансляция in vitro РНК трапскрштгов. Трансляцию in vitro внрионной РНК и РНК транскриптов вели в лизагах *ретккулоцитов кролика по методу Оливера (Oliver С. L.,1984 ] и по методике, утвержденной во ВНИЯИ.

Наработка и вы делание вирусных белков, знсарсс-си^аштых s E.coli. Елэтки Е. coli с зкспрессирующей плаг «идой вцрзэдег&ли в литровой колбе в lOOiti LB -до плотности ОД.-Г!,;;,, добывлялн емуктср IPTQ и культивировали'4-6 часов. Суспензии клеток E.coli осаждали центрифугированием кг« б тыс.ц е течении 15 минут, затем ресуспэкдировали в бустере, сод^рхз^ы: 20 мМ грао-ГО! рЕЗ.О; 250ыМ NaCl; Ш lOtü! ЭДТА и обрабатывали ультразвуком.' Далее суспензий центрифугировали при 12тыс. g, промывали осадок 0,52 тритоном Х-100 и растворяли в соответствующих буферах для изучения физико-химических и биологических свойств.

результаты собственных исследовмбй.

Анализ банка '¡ионов £. coli, содер:лацих рекомбиканг н.Ь'ё плазыиды с кДНК фрагментами генош вируса ящур; Лозилизация кДНК фрагментов на геноме

Для анализа банка клонов E.coli с кДНК фрагментами ей руса ящура подбирали оптимальные условия гибридизации В результате гибридизацию вели на капроновых фильтрах следующих условиях : для кДНК зондов - в 50% формамиде пр +42?: в течении'12-15 часов; для ойигокуклеотидных зондов в годном растворе при +4£?С в течения 2-3 часов. ПразиЛь кость локализации фрагментов кДНК. подтверждали перекрестна дот-гибридизацией, тюзволяжцэй получать, по сравнению гкбрздинацязй in situ , болэе надежные и воспроизводи}.:!

результаты,, вследствие отсутствия в исследуемой пробе при, меси хромосомной ДНК Е. coli. Таким образом, были локализо-- ваны на геноме все имеющкся в банке фрагменты кДНК. В- области от ' 5' -конца до 2000н. генома не было найдена ни одного фрагмента кДКК. Большая часть полученных фрагментов кДНК расположена . ближе к 3'-концу генома. Это, вероятно, объясняется наличием жстких вторичных структур РНК.

Определение размера и отбор длинных лорекрывающпх-ся фрагментов кДНК и их секвенировакие

Анализ банка клонов Е. col i с кЩК фрагмента!,ги вируса ящура рестрикцией показал, что 10% ргкомбкнангных плаз-мид имеют кДНК вставки от 1000 до 2500п. н. , 20% -500-1000П. н., 70 % 7 100-500п. н.. Отобраны 4 длинных перекрывающихся кДНК фрагмента кодирующих око^э 75% генома вируса. Были выбраны плазмидн с. наиболее крупными вставглми: клон 5 - 2600П. н. , 38 - 2450п. н. , 92 - 2400п. н. , 120 -750п. н.. •

В итоге для сборки ДНК копии были отобраны 4 фраг-. мента, перекрыващие . геном от 2000 н. до полк(А) (8450н.), что составляет около 75% длины генома.

Для подтверждения правильности отбора', . концы и неко-, горке участки кДНК фрагментов были секвенированы. Отсутствие фрагментов в 5'-концевом районе генома не дает возможности конструировать кДНК' копии транслируемой области генома вируса ящура." Вследствие этого, необходимо провести дополнительное клонирование этого участка генома вируса - '

Синтез и клонирование 5'-концевой области генома

Традиционными методами не удалось клонировать недостающие районы генома вируса Затруднения, при клонированиям 5'-нетранслируемой области генома , вероятно, возникли

> • - -- 9 - .

вследствие особенностей вторичной структуры РНК, которая препятствует продвижении обратной тракскриптазы.

Необходимо было найти альтернативные подходы к клонированию кДНК этого участка генома. Для поиска новых путей для синтеза и клонирования кДНК 5*-нетранелируемой области, совместно с ВНИШ5 было проведено изучение первичной структуры этого района методой прямого секвенирования РНК Исходя из этих исследований была разработана новая стратегия синтеза и клонирования кДНК. ' "

С использованием термофильной ДНК полимеразы проведен синтез я клонирование недостающих транслируемой и

' 5'-нетрачелпруемой областей генома вируса ящура В резудьта-(" .то лучек;; с^/сокбжлктныг пдазмиды с кДНК фрагмента1,;)! от мОлн(С) "¡го гена VP^. Рестрикцгюянсе картирование выявило , что все Фрагменты из отобранных клоков ,располагаются в области or сайга Hindi II (1180н. )* до сайта BoirHl (1995н.) и имеют раэбор около 800п..н. , что соответствует расчетам. Только н едком клонэ 187 фрагмент кДНК. иыэд размер 1400п. н. ,при этом внутренний сайт HindiII сохранялся .вероятно, вследствие неполного гидролиза исходной кДНК рестриктазой Hindi II. Дальнейший анализ гибридизацией с олигонуклеотидаки 2, 3 к рестрикцией HindiII , Xbai рестриктазами подтвердил ,что фрагмент клона 18? располагается от сайта HindIII (61 Он.) до сайта"BairiHI" (199бн.). Так как этрт фрагмент был наиболее длинный , он был выбран для дальнейшей работы. Определение первичной структуры кДЖ клона 187 подтвердило правильность кодирования этой области, что позволяет перейти к сборке кДНК копии.

Разработка стратегии конструирования кДНК копии.

•Лигирование отобранных фрагментов кДНК

13 рееультате анализа коллекции кДНК фрагментов и до-шл5шгсльног^ клонирования для сборки кДНй-копии транслиру-соласти генома .отобрдкы следуют?® плззшды из клонов:

- •' - 10 -■ 187 с Фрагментом 850-E0Q0H. , 92 с фрагментом -1900-■430QH. , 5 ' с фрагментом 3200-б000н., 38 с фрагментом 5500-7900H. , ■ 120 с фрагментом 7Б50 -8350н. генома На основе анализа по локализации, перекрывавшихся фрагментов , их рестрикцшнного картирования и секвенирования была создана стратегия сборки этих фрагментов. (Рис. 1) Для дотирования кДНК фрагментов бы- ли выбраны следующее сайты: для фрагментов 120,33 -Pvull; 38,5 -Bell с частичным гидролизом 38; 5, 92 -Kpni с частичным гидролизом 92; 92,187 -Bamiïl. После промежуточного переклонирования, отобранных фрагментов кДНК, сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая кДЩ копию транелируе-" мой области генома от 1900н до 83Б0н. При окончательной сборке кДНК из этой плазмиды ( 1900-8350«. ) и из клона 187 (850-2000Н. ) обнаружена нестабильность рекомбинантных плаз-мид, содержащих кДНК фрагмент транслируемой области генома вируса ящура, что может быть связано с особенностями используемой \ для клонирования плазмиды (обратная ориентация транскрипции вирусной РКК и репликации самой плазмиды ), так ■ и со; свойствами самой вирус-специфической вставки. Исходя из этого было необходимо.изменить ориентацию вставки относи-телько направления репликации плазмиды. Поэтому сборку этих' фрагментов решено было провести сначала в плазмиде pUBS18, которая отличается от pUC9 ориентацией полилинкера относительно lac промотор и сайта инициации репликации плазмиды.

Таким образом, была получена плазмида с кДНК копией транслируемой области генома' (850-8350н. ) вируса ящура . Така© получена кДНК копия (850-8350Н. ) с делецией (447н. )вч области гена лидерной протеазы для экспрессии в составе ви-: руса осповакцины. Для проверки'правильности сборки кДНК ко-_пйи участки дотирования проверяли секвенированием по методу Макса>ла-Гилберта Однако, для полной проверки правильности . сборки необходимо было провести ее транскрипцию и трансляции in vitro. -

Ь/аЬ "Др4 0р2 УуЗ 1>р1 2А ЯК ЙС

17:

;ы 1'С па:?;

р(А>

2?-Г с 11

К-Крп1

ЗША-ВамК!

ве-вгш . К-КЬа1

К187

ВН1

к52

т~

1С

к

к

}«19О0-6ОО0> —|-)--——

Ы19©0-8350>

М850-б000> -г—-—~—<-

\

ПС

•1

I'

-Н

(): Ол 00-0350)

850 Ь

ВН1

I -.

К

К

Лш.

ве

Й 1)

8350

Рис, 1 Стратегия конструирования к ДНК копии транслируемой области геномй вируса ящура А • из пяти перекрывающихся фрагментов кДНК.

- 12 -

Переклонирование кДНК копии под контроль SPG промотора. Оптимизация условий транскрипции кДНК копии.

Получение и очистка РШ-тракскриптов кДНК кг л ли Полученные копии были переклонированы под контр - "ъ 5Гб промотора в Еектора pAiilö и рДШ9. В результате с1;,агкеит ДНК копии L-фрагмента заклонировалсл только з пл -.змилу рАШ9 и не было найдено ни одного клона с рзкомб;::"Штной плазмидой рАШ8. В рАШ9 направление репликации г. • -л^т-ы совпадает с возможной транскрипцией РНК вируса с ¡: л-Х копии, а в рАШ8 - нет. Отст результат подтверядае-г \ аде-» сдех-зйиое предположение о тем, что стабильность ; отазки кДКК копии L-фрэгмевта генома зависят от ее ориентации гт-нссктедыю репликации плезмиды. Аналогично провели «»ргклэ-нирование кДНК копии с делоцией в гене лидерной протеши. Оказалось, что данная кШВ копия стабильна в л»2ых :;.:азми-дзл в том числе и в pA!ü8,19 и pG~i,d,2.

Для подбора оптимальных условий транскрипции максимального количества полноразмерных РШЬтракскриптов к.ПНХ копни изменяли слэдуатае условия: концентрация трифос^тоз от 250 до 2000 ыкМ, концентрация ДИК матрицы отЮ до гсожг /мл, время реакции от 1 до 4 часов и температуру ст И5" до +45°С. Оптимальном являются следуклцо условия: 1мМ NTP, 2Ü мкг/мл ДНК матрицы при +37°С в течении З-часов. Сгнетку от невключившихся рибогрифосфзтов, • ДНК матрицц,- . но I-HK транскриптов и солей проводили'центрифугированием з градиенте концентрации сахарозы 5-25Z. В результате получен препарат высоксочищенной РНК L-фрагкента, .который мохет биггь использован для in vitro-трансдяции.

• • Конструирование ллазмпд для транскрипции зцеокомо-ченных .зондов и их транскрипция

Используя пол;юрзг>.:арную кД1Ш копию L-фрагмзнта ггис-ма вируса ящура нами были сиоютруиро ваш плазкиди для

транскрипции радиоактивных зондов на гены Щ - VPt-VP5" (2000 -3430н.) и YPt (3430-4200н. ) для гибридизации. С целый максимального включения метки в РНК подбирали оптимальные условия синтеза изменяя концентрацию немеченного нуклеотида и время реакции.' • Максимальное включение меченного нуклертида происходило при концентрации кекэченного UTP 25-40мкЫ (АТР - 40-80мкМ) в течении трех часов.

'Трансляция in vitro вируссвецифических белков с РНЯтранскриптов кДНК. копий

Для окончательной проверки правильности конструирования кДНЕ копий РНК транскрипты были транслированы in vitro в лизатах 'ретикулоцитов. кролика Б результате работы продемонстрирована, способность РШ-транскриптоЕ кДНК копии транслируемой области генома вируса ящура (850-8350Н.) к трансляции in vitro в лизатах ретикулоцитов кролика ( с эффективностью в 10% от вирионной. РНК) вирусного полйпроте-ина, который процессируется на отдельные вирусные белки. Аналогичные результаты получены с кДНК копией,с делецией в гене дидерной протеааы. . Это свидетельствует с правильности сборки кДНН копий, что дает возможность использовать кДНК копию L-фрагмента генома для создания- инфекционной'кДНК копии, позволяющей эффективно изучать реп ликацша вируса на молекулярном уровне. Получение кДНК копи L-фрагмента генома елузтт основой для конструирования генн г инженерных вакцин; путем экспрессии всего генома или' любы генов в. эукариотических или вирус-векторах с образование вирусоподобных частиц. Б частности, кДНК копия с делецией гене лидерной протеааы дает возможность экспрессировать £ в составе вируоа осповакцины. : кДВК копия L- фрагмента пог воляет подробнее изучать' связь структуры и функций • отдел ных вирусных белков, а также их свойства.

/

-■14 -

Клонирование и экспрессия в Е.coli отдельных генов вируса яиура Конструирование плазмид экспрес-сирузоших гены всех структурных белков

Полученная кДНК копия транслируемой области генома вируса яшура дает возможность клонировать и зкспресси-ровать любой отдельный ген или группу генов для изучения связи структуры и функций каждого вирусного белка и их роли з репликации вируса.

Были получены клоны Е. coli штамма JM109 с плазмидами, содергалими гены структурных белкоз под контролем лактозко-го (lac) промотора -pUR291-VI^ VP? VRjVP, и термс<регулкруемого промотора - pCE119-VP} ЩУР^Щ. Электрофорезом в МАГ выявлено присутствие экспрессированньа белков з варианте с PUR2917P с молекулярной массой 180кД, что соответствует расчетам; Однако, не удалссь на£1И зкспресспрованкого белка з варианте с рС5119.

3 результате "ЗА гыяв-теяо, что балок р-гагакгсгядаза со всеми структурными белками болээ активе;!, чем з-газакто-зидазаУр1. Зто свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения полученной наш конструкции, особенностей зк-спрессии и антигенных свойств белка

Конструирование плазмщ, экслрессирухднх гены РЕК полимэразы и Зс протеазц вируса яшура

Лспозгьзуя кДНК копию транслируемой области геног';ч созданы плазшеды, экспрессирутсте .следующие химерные белки: протеазу Зс и РНК полимеразу 3d. Для конструирования .пользовали плазмиду pUCl9 с геком^лептада^галактоз;?,глзы под контролем lac промотора Электрофорезом SDS-ПЛАГ шявлзно присутствие зкспрессировагных белков' имеющих моде:гул"р<,ьг.. вес соответствующий расчетному. Химерные белки состояли: первый - из 15а к. поятида , 194а. к. протеазы Зс и 1 а. к.

полкмэразы 3d; второй - из12а. г.. пептида к 400а к. РНК по- • лишразы. Белка 3d Есегда зкепрессировалось несколько больше по количеству,чем Зс, что , вероятно , обусловлено присутствием эффективного терминирующего кодона вируса яиу- '

' ра.

Для максимального выхода химерных бельков при их наработке были- подобраны оптимальные условия культивирования клеток и наработки белгса. Бое экспрессированные белки были активны е ИФ4 с сыворотками ЮТ, переболевших ящуром.типа"""7 Агг

Полученные нами препараты бельков Зс протеазы и РНК полимеразы 3d могут быть использованы для диагностики переболевших и вакцинированных етвогкых. Специфические сыворотки на зти белки могут быть использованы для преципитации соответствующих белков из.суммарных белков , полученных в реакции трансляции in vitro с РНК различных типов и вариан-. тов вируса явура, для выявления отличий этих 'вариантов вируса ящура в изозлектрофокусйровакии и секвенировании. Это необходимо для изучения роли разных белков вируса в аттену-. ации, репликации, а также изучении структуры и функций соответствующих белков. Специфические сыворотки могут использоваться для аффинной хроматографии соответствующих КВ.ТНЕНЫХ, белков для научения их свойств.

• ISEOgH

1. ■ Проведен анализ банка клонов Е. coli с кДНК фрагментами вируса ящура Показано, что 10% рекоыбинантных плазмид имеют г Вставки ' кДНК 1000-2500п. н., 20% -' -

. 500-1000л. н. ,. ?0Х - 100-5Шл. н.. Отобраны 4 длинных перек-" рывакзяхея, фрагмента кДНК, кодирующие около 75% генома

2. С использованием метода синтеаа кДНК термофильной ДНК -долимеразой, полученыч плазмиды с фрагментами' кДНК 5'-концевой области генома ( 618-2000н.) вируса ящура

3. Разработана стратегия и осуществлена сборка кДНК конки транслируемой области генома (850-8350В.) вируса ящу-

pa, которая предназначена для изучения структуры, функций генома и отдельных белков, для конструирования инфекционной полноразмерной кДНК копии, а также для экспрессии всей транслируемой области в эукариотических системах с образованием вирусоподобных частиц.

4. Правильность сборки кДКК копии подтверждена сеюзе-нированием участков лигирования и транскрипцией in v, t-.ro. В результате получены РНК-транскрипты размером около 80С0н.

5. Проведена трансляция in vitro РНК-транск;;илтса кДНК копии з лизатах ретикулоцптоз кролшса. Показан-- способность РЖ транскриптов к синтезу вирусного полипро геина, который процессируется до отдельных вирусных белков. что гака подтверждает правильность сборки кДНК копии.

5. Получена плазшда, содержался кдЕК всей транслируемой области генома (850-835QH.) с делецией з гене зидерпол протеазы (1273-1720н.), которая предназначена для ¡глученп" сексыбикантного вируса ссговакиташ; и плазшда зкспр£< ci:py»>-вая в Е. coli все структурные бэлкл вируса яс.ура , .-даср.чэ предназначены для совершенствования средств га^ггы и профилактики п™/ра.

7. Используя :<ЕКй ногою, подучены плаз?иди зкспресс;:-русгие в Е. coli химерные белки: протеагзу ?л и РНК полинеразу вируса яаура . Отработаны оптимальнее условиг наработки, знделения и определены свойства этих белков. Полученные белки предназначены для соаоргенетвоьания што-дов диагностики. ■

'3. Сконструирована ллазмиды с генами: V?¿, 73 ,У?Ъ и VP, под контроле:-,'; SP6 и Т7 промоторов, с которых' транскрибируются высоксмэчакные РНК зонды для использования в молекулярной гибридизации.

тиггичЕОСЖ прздлс.шзза.

Полученная кДКГ. копия предназначена: - для изучения структуры и функций вирусного гегюма я

отдельных белков,

- для получения вакцинных препаратов путем экспрессии всей'транслируемой области или ее части в эукариотических системах с образованием вирусоподобных частиц,

для получения отдельных генов или их фрагментов с целью'экспрессии,

,- для конструирования полноразмерной инфекционной кДНК .копии генома вируса ящура v

кДНК копия транслируемой области генома с делецией в .гене лкдерной протеазы.предназначена для экспрессии в составе вируса осповакцины.

Экспрессированьый химерный белок ^-галактозидаза-об-ласть всех структурных белков предназначен для изучения _ иммуногенных свойств с целью получения защитных препаратов. 4 ■ - -

Неструктурные белки протеаза Зс и РНК полимераза 3d, полученные генно-инженерным способом, предназначены для разработки методов диагностики переболевших и вакцинированных животных, а такжэ для получения специфической сыворотки.

Плазмиды с кДНК копией, генами всех структурных белков и геном VPf под контролем SP6 или Т7 промотороЕ предназначены для получения высокомеченньк РНК зондов на отдельные гены или их фрагменты. •

Сконструированы и проверены кДНК копии транслируеюй области генома вируса ящура и кДНК копия с делецией в ■ . гене лкдерной протеазы.

В результате исследований разработаны и утверждены директором БНИЯИ следующие методики: .

1, "Методика очистки и секвенирования синтетических олигонуклеотидов, " 3.04.1-990. .' ':•...

2, "Методика анализа банка рекомбинантных клоное Е.соИ гибридизацией in situ и'дот-гибридизацией' синтетическими олигонуклеотидами, *\4-12.1990.

3, "Методика упрощенной трансформации Е, col i рекомби-

- 18 -

нантными ялазмидами, 4.12.1990

4. "Методика хранения бактериальных клеток, бактериофагов, плазмид и клонов Е. coli с кдНК вируса яиура, 4. 12. 1990.

5. "Модифицированный метод Ыаксама-Гилберта дли определения первичной структуры фрагментов кДНК 4.12.3 Г-ЭО.

6. "Методика транскрипции in vitro транслируемо:4 части генома вируса ящура " 3. 04.199В.

ошеек ояубликсвлтппи работ

1. Лрыпш Б. В. , Дминев Л. Г. , Андреев ЕГ. , Иерогозчи-кова IL Л. , Иванюценков В. Н. Конструирование кДНК кодирующей область структурных белков вируса ящура A2î. //Акт. ггпр. вег. вирусол. , Кяадгмлр, 1988, Ч.2., с. 4-5.

2. Дркгии В. В. , Аминев Д. Г. , Андреев Е Г. Ногекуляр-K-je ¡шокирование 5'-конца генома вируса ящура А^с использованием термоетс6:12ьиой ДНК полпм-зра-оы.//Акт. пробл. вет. вирусол. , Владимир, 1990, с Л 0-11.

0. Амннен А. Г. , Дрыгин Е 3. , Цзрбакоз А. Е , Порегоз-чикова il А. Конструирование плазмиды, пкспрессирующей все структурные белки вируса яаура //Акт. вопр. вет. виру-сол. , Владимир, 1990, с. 13-14.

4. Аминеß А. Г. , Андреев Е Г. , Дрыгин R R , Перевозчи-кова Е А. Конструирование кДШ копии кодирующей части генома вируса яаура AZJ. //Акт. вопр. вег. вирусол., Бл^пимир, 1990, ' с. 14-15. ■

5. • Аминев А. Г. , Дрыгин Е Е , Андреев R Г., Перевозчиков а H.A. Конструирование кДНК копии L фрагмента генона вируса ящура Ага./К повой стратегии борьбы с ящуром., Владимир, 1991, с. 14Й-143.

'6. Аминов А. Г. , Дрыгин В. Е , Щербаков А. В. , Перевозчиков а iL А. , Бурдов A. IL Конструирование кДЖ копии транслируемой области генома вируса ящура Агг.// Доклад« Е4С.Х-

1993, Ш.