Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов, кодирующих иммуногенные эпитопы вируса ящура

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов, кодирующих иммуногенные эпитопы вируса ящура"

российская академия тле

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БЙООРГАШЧЕСКОИ ХИМИИ имени М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

НЕКРАСОВА Оксана Васильевна

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ИММУНОГЕННЫЕ ЭПИТОШ ВИРУСА ЯЩУРА

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии ¡м.М.Ц.Шемякина РАН

Научный руководитель -кандидат химических наук В.Г.Коробко

Официальные оппоненты -доктор химических наук О.Г.Чахмахчева доктор биологических наук С.В.Машко

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии Pâli

Залита состоится 4 ноября 1992г. в 10 час. на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН по адресу; II787I, Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться ь библиотеке Институ-. та биоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН

Автореферат разослан^c^ctJM^AJi992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ИБХ РАН

кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус ящура является возбудителем широкораспространенного заболевания парнокопытных животных. Из 7 серо-типов вируса ящура, относящегося к семейству пикорнавирусов, для европейской территории характерны серотипы А, О и С. В настоящее время предотвращение эпидемий ящура в странах с высокоразвитым кп-вотноводством основано на проведении карантинных мероприятий, а также иммунизации сельскохозяйственных животных убитой вирусной вакциной. Однако применение такой вакцины сопряжено с опасностью культивирования вирусов, нестабильностью полученного препарата, а гакже возникновением вспышек заболевания вследствие неполной инактивации вирусных частиц.

Другим несомненно перспективным путем является создание искусственной вакцины. Установлено, что основные антигенные сайты, участвующие в нейтрализации вируса, имеют конформавдонную природу; троявлэнив их свойств во многом определяется целостностью вирусного капсида. Белок оболочки УР1, содержащий главше антигенные детерминанты вируса, в изолированном виде является слабым иммупоге-юм, что ограничивает его применение в качестве субъединичной вак- ' хины. Более эффективным является использование для вакцинации ко-эотких пептидов, представляющих собой поверхностные антигены виру-га. В результате изучения лабораторного штамма с^К было определено юложешта главной антигенной детерминанты вируса, соответствующее' шриабельному участку 141-160 белка УР1, а также С-концевого имму-югенного эпитопа в константной области гоо-213 этого белка. Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последователь-' [остям 141-160 и 200-213 белка .УР1, конъюгнрованные с белком-носи-'елем, при иммунизации индуцировали образование виру,снэйтрализув-щх антител. Объединение вариабельного п константного иммуногенных

эпитопов в составе одного пептидного фрагмента, имитирующего пространственную структуру основного конформационного сайта вируса,

/

привело к значительному усилению иммунного ответа. Таким образом, синтетические пептида являются эффективным инструментом изучения антигенных эпитопов вируса. В то же время, при современном уровне развития пептидного синтеза промышленная наработка больших количеств пептида для практического применения в качестве вакцины вряд ли экономически целесообразна.

Использование технологии рекомбинантных ДНК для продукции им-муногенных пептидов обладает рядом преимуществ. Появляется возможность направленного воспроизводимого соединения антигенного участка с молекулой белка-носителя путем биосинтеза единой аминокислотной последовательности. Экспрессия рекомбинантних генов в бактериальной или животной клетке упрощает наработку' и выделение имму-нологически активных белков. Включение генов гибридных белков в состав генома непатогенных вирусов открывает возможность для создания "живых" вакцин против вируса ящура.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось получение и клонирование в плазмидных векторах фрагментов ДНК, кодирующих иммуноген-ные апитош вируса ящура серотипов А.гг и 0194; создание рекомбинантних плазмид, детерминирующих биосинтез иммуногенннх эпитопов вируса в составе гибридных белков; изучение иммунологических свойств полученных гибридных белков, i также возможности их использования в качестве вакцины против ящура.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы химико-ферментатившм синтезом или с помощью • полиморазной цепной реакции получены двухцепочечные ДНК, кодирующие основные иммуногенные эплтош вируса ящура серотипов А22 и 0194. Ка основе полученных генэквивалентов антигенных детерминант

сконструирован ряд искусственных генов, кодирующих с- и н-концевые гибрида фактора некроза опухолей человека я антигенных детерминант вируса ящура штаммов Ag2 и 0194 (схематически представлены на рис.1). Получены штаммы Escherichia coli, эффективно экспрессируп-щие гибридные гены под контролем тандема ранних промоторов А2 и A3

аЗ

а2

а2

а2

tnf

а1

а2

аЗ

'kl

аЗ ' а2

ОЗ1' 1 Ъ 1

ь 1 аЗ ' 02'

(Ъ)2 1 | аЗ 02

со -л л аЗ 02

аЗ 1 о2 1

аЗ ' ь ' —-1

p7F)iD Р1

рветго Р2

р9Ж0 рз

Р10ИШ Р4

pFffl)150 Р5

pFKD151 Рб

PFHD152 Р7

pFMD153 Р0

PFMD131 Р9

pFMD13£? РЮ

PFMD133 Р11 б в

Рйси. Схема гибридных генов in/ с гензквивалентами антигенных детерминант вируса ящура штаммов А22 и 0194 (а). Указаны наименования плазмид (б), содержащих искусственные гены, и кодируемых ими белков (в). а1, а2, аЗ - генэквивалентн антигенных детерминант, соответствующие участкам 131-152, 131-160, 200-213 аминокислотной последовательности vp1 штамма А22; Ь - гензквивалент участка 130160 vp1 0194

бактериофага Т7. Методом иммуноблоттинга показано, что гибридные балки с антигенными детерминантами специфически взаимодействуют с политональными сыворотками против соответствующих вирусов ящура.

Разработана методика выделения гибридных белков из бактериальной массы В.coll. Совместно с научно-исследовательским ящурным институтом (г. Владимир) исследованы иммуногегаше свойства некоторых гибридных белков с С-концевым расположением антигешшх детерминант. В опытах на бксперкмвитальних животных (морские свинки) и на овцах показано, что искусственные белки инициируют образование вируснейтрализующих антител и обеспечивают эффективную защиту животных от вирусной инфекции. При этом в случае гибридного белка ?6, содержащего антигенные детерминанты серотипов и 0194, экспериментальные животные были защищены от инфекции вирусами обоих соротипов. Полученные результаты свидетельствуют о возможности практического использования гибридных белков в качестве вакцины против вируса ящура.

.Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции но биотехнолопш (Куба,1989 г.), на конкурсе молодых ученых ШЗХ РАН (1989 г.), на Y конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" Шущино, 1992 г.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Синтез олигонуклеотидных дуплексов, кодирующих участки антигешшх детерминант вируса ящура штамма2

К началу настоящей работы не было точно установлено положение главной антигенной детерминанты вируса ящура подтипа А£2 на последовательности поверхностного белка VPI. Поэтому мы выбрали два во-змо.кных варианта структуры антигенного участка по аналогии с имевшимися данными для штамма о^ и ферментативным синтезом получили два двухцепочечннх фрагмента ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности 131-152 /сегмент а)/ и 131-160 /сегмент а2/ белка VP1 вируса ящура Ар2. Оба сегмента фланкироваш сайтами реетриктаз

131 140

AspProAsnGlyThrGly!LysT.yг^erAlaGl.YGlyM6tGlyArgAгft•GlyAspLeuGlг^&Гo-

1 а 111 п

аАтсстААсаотАСсастАААТАстстастсотсс,ТАтаосссатАаАасАСАтстлаААСот-ОАТТаССАТССССАТТТАТаАСАСаАССАСОЛТАССССаСАТСТССТСТАСАТСТТССА-

ВатнГ к'рп I ц и V

сегмент а1

.ецА1аА1аРгоСу8С1уТегТег АзрРгоАвпС1уТЬгй1у1|уеТ.ут5вгА1аа1уа1г~

71 1 а

тоастестссттстоаттААТА оАтсстААСостАссоатАААТАСтстастсатаат-

АССаАСаАОаААСАССААТТАТТССА ПАТТСССАТСОССАТТТАТОАОАССАСОАСОА-

и VII ' Н1пШ11 ВатД1 Крп! II

е101уАгкАгк01уАЕрЪеи01иРгоЬеиА1аА1аАгяУа1А1аА1аС1п1еиРгоТ11г1'ег

III „ IV VIII п И

ТСОаССаТАСАСаАСАТСТАСААССТСТСаСТОСТСОАСТТССТССТСАОСТТССОАСТТА АСССаССАТСТССТСТАСАТСТТаСАОАССаАСОАСОТСААСОАСаАОТСаААаОСТОААТТСаА

и V и X ШгШП

сегмент а2

АврРтоСувСувАгйП1в1уз01пЬ.уз11е11еА1аРгоА1аЬув011гЬеи1|еи-

XI п XIII

ОАТССТТСТТОТАОАСАСАААСАОААААТСАТТОСАССТОСААААСААСТТТТО-ОААСААСАТСТСТаТТТСТСГТТТАОТААСаТаСАСОТТТТСТТОААААС-

ВапН! XII и XIV

РгоРго5егРгоАвп01у

ССТССТТСТССТААСССТАС СОАЯСААСАОСАТТСС

ЯрпГ

сегмент аЗ

I

ис.2. Нуклеотидные последовательности синтетических двухцепочеч-ых ДНК /сегменты а1-аЗ/ и кодируемые ими аминокислотные последо-ательности антигешшх детерминант белка 7Р1 вируса ящура штамма 22. Дугами обозначены места соединения синтетических олигонуклэо-идов в лигазных сшивках ,

- б -

BcenHI и Htnálll, причем рядом с сайтом ВоиН1 для удобства последующего клонирования расположен сайт рестриктазы Крт. СцельЬ получения составной антигенной детерминанты, включающей участок главной антигенной детерминанты и универсального для А и 0 серотипов вируса С-концевого антигенного участка VP1, мы синтезировали двух-цепсчечный фрагмент (сегмент аЗ), кодирующий последовательность гоо-213 белка VP1. Наличие у сегмента аЗ сайтов рестриктаз Ваши и Kpnl позволяет клонировать этот сегмент внутри сегментов а/ и а? с образованием ДНК, кодирующих составные антигенные, детерминанты.

Для получения дуплексов а1-аЗ в группе химии генов фосфитами-дным методом били синтезированы 14 олигонуклеотидов Ебличшой от 13 до 43 нуклеотидных звеньев (рис.2). В случае синтеза дуплекса al олигонуклеотиды II, III, V и VI 5'-фосфорилироьали с помощью полиьуклеотидкинази в присутствии t]АТР низкой активности, затем отжигали и лигировали со смесью концевих шфосфоршшрованных олигонуклеотидов I и vil. После разделения продуктов лигирования в пластине \ъ% ПААГ, фрагмент ДНК, соответствующий по длине сегменту ai, элюировали из полосы геля. Аналогичным образом синтезировали сегмент аЗ.

Лигазнве сшивки олигонуклеотидов, составляющих дуплекс а2, проводили в два этапа. ПерЕЫЙ этап заключался в синтезе верхней цепи дуплекса. Для этого б'-фосфорилированные олигонуклеотиды III, IV, VIII и IX лигировали с I,5-кратным избытком нефосфорштрован-ного концевого олнгонуклаотида I в присутствии нефосфорилированных олигонуклеотидов и, у и х низшей цепи. Продукты лигирования отделяли от не вступивших в реакцию олигонуклеотидов хроматографией на сефадексе G-50. Аналогичным образом на втором этапе синтеза проводили лигазиую сшивку олигонуклеотидов нижней цепи II, v и X.

2. Конструирование искусственных генов, кодирующих гибридные белки с антигенными детерминантами вируса ящура подтипа А^

На начальном этапе работы в качестве вектора для клонирований синтетических дуплексов а1 и а2 по сайтам рестриктаз Вамп и Hlndlli мы использовали плазмиду piFT2/l (рис.з). кодирующую синтез гибрида лейкоцитарного интерферона с^ человека и фактора некроза опухолей. Этот белок продуцируется в клетках E.coll под контролем промотора гена Till фага М13 и синтетической последовательности Шайна-Дальгарно /sd/. Полученные в результате клонирования плазмиды pFMD7 и рИГО8 кодируют гибридные белки, в которых аминокислотная последовательность с^-интерферона соединена с участком главной антигенной детерминанты вируса ящура штамма А22.

В результате вставки дуплексов а1 и а2 в плазмидах pFMD7 и pFMD8 образовался уникалышй сайт рестриктазы Kpni, который был использован для клонирования синтетического дуплекса аЗ, кодирующего константный участок 200-21 з белка VP1, по сайтам Всшт и Kpni. Таким образом, были получены еще две плазмиды pFKD9 и pFMDiо, направляющих биосинтез гибридов а^-интерферона н составных антигенных детерминант вируса ящура штамма А22- Структуру рекомбк-нантных плазмид pFMD7-pFMD1О подтверждали анализом нуклеотидаой последовательности между сайтами рестриктаз SomHI и //inaill. Присоединений синтетических генов антигенных детерминант к гену ifn по Встш-сайту приводит к появлешпо спейсера Авр-Рго в гибридном' белке мевду белком-носителем и антигенными детерминантами. Наличие кислотолабильной связи Аср-Pro позволяет в случае необходимости . отщеплять пептиды антигенных детерминант от белка-носитэля с помощью кислотного гидролиза.

Следует отметить, что в плазмидах pFKD7-pFMDlо,экспрессия гибридных генов контролируется довольно слабым промотором гена viii

- а -

í SamHI+HúidE 2. Сегмент а'i +ЛНК-лигдза

1. BamHhHindll

2. Сегмент аЗ

+лнк-лигаза

Ват ИI I

//¿»dlü

SamHl Kjbnl

Mndm

Ьат HI

HitidM

l BamHI+Hcndm 2. Сегмент a.2 JX HK ~ a и газа

'Pv'" BamWl

Kpn I

HcndM

l.&amHl+Kpnl 2.Сегмент аЗ Д.НК-ЛЦГАЗА

SamHl Kpnl

WindiU

ore

orí

Рис.3. Схема конструирования плазмид pFMD7-pFMDlO. l/n -ген лейкоцитарного Og-интерферона .человека, Ыа - ген р-лактамазы, Pyjjj-промотор VIII гена бактериофага М13, ai, a?, аЗ - генэквиваленты антигешшх детершшант

бактериофага M13. поэтому уровень биосинтеза гибридных белков в клетках бактерий, несущих эти плазмиды, невелик. '

На следующем этапе мы проводили конструирование плазмид, кодирующих белки, в которых простые и составные антигенные детерминанты соединены с аминокислотной последовательностью фактора некроза опухолей человека (tnf). Выбор tnf в качестве носителя обусловлен несколькими причинами. Во-первых, этот белок является слабым иммуногеном. В связи с этим можно предположить, что при иммунизации животного часть молекулы гибридного белка, содержащая антигенную детерминанту вируса ящура, будет обладать большей иммуно-генной активностью, чем аминокислотная последовательность тир. Во-вторых, являясь цитокшюм, фактор некроза опухолей активирует различные клетки иммунной системы, что, возможно, при вакцинации приведет к повышению уровня иммунного ответа. Наконец, дашше рентге-ноструктурного анализа тот дают основание предполагать, что присоединенные к его n- или с-концу антигенные детерминанты будут находиться на поверхности белковой глобулы.

В качестве вектора мы использовали получешую ранее в группа химии генов плазмиду ртэтээн, эффективно экспрессирукцую в клетках E.coll мутантный ген tnf, в котором" в результате олигонуклео-тид-направленного мутагенеза в 3'-концевой части гена образовались уникальные сайты рестриктаз Ваши и BglII. Высокий уровень экспрессии гена tnf в этой плазмиде обеспечивается наличием тандема' сильных промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, а также синтетическим участком инициации трансляции.

Клонирование Ba№I/Hln<iilZ фрагментов, содержащих reim антигенных детерминант в илазмидах.pFMW-pFMDiO, проводили по ßglll и Hindill сайтам плазмиды pTN?3314. На рис.4 представлена схема конструирования плазмида рЮРШ), аналогично были получены плазмиды

а^гм^Ншт

ЗсгтН! Крп I

pFMDÍO

^ 'j-Hínám

3a*iHi+mdm

ь

//¿лоШ

Рис.4- Схема конструирования плазмиды рЮРига. гп/ - ген фактора некроза опухолей человека, Рд2'РЛЗ - промоторы бактериофага Т7

P7PMD-P9PMD. Плазмиды р7РШ) и pQPiíD содержат гибридные гены tnf и единичных антигенных детерминант, в то время, как плазмиды p9FMD и р1 Oi'MD содержат гены tnf и составных антигенных детерминант. Схема кодируемых этими генами С-концевых гибридных белков показана на рис.1 (Р1-Р4). Для экспрессии гибридных генов мы использовали дефектный по Ъа-протеиназе штамм E.coll SG 20050. Клетки E.coll SG 20050, содержащие перечисленные выше плазмиды, способны к биосинтезу значительных количеств гибридного бежа, как показывает йш-электрофорез суммарного клеточного белка (рис.5а). Продукты экспрессии гибридных генов идентифицировали, используя метод имму-

нантную плазмиду (p7FMD-piOFMD), разрушали ультразвуком, затем нерастворимые клеточные компоненты, в том числе "тельца включения", отделяли центрифугированием и суспендировали в растворе 8 М моче-вшш. При этом гибридный белок полностью растворялся, а оставшиеся в нерастворимой форме примеси удаляли с помощью высокоскоростного центрифугирования. Ранатурацию гибридного белка проводили, удаляя мочевину диализом. Выход очищенного гибридного белка составлял ~50 мг на 1 л культуры клеток. Полученные таким образом рекомби-нантные белки р1-р4 использовали для иммунизации экспериментальных животных. Испытание гибридных белков, продуцируемых в клетках Ь'.соИ sg 20050 с плазмидами р7ршьр1 ofkd проводили в НИИЯИ (г. Владимир). Было обнаружено, что однократная иммунизация морских свинок каждым из гибридных белков обеспечивала выработку ви-руснейтрализующих антител, а также защиту от вирусной инфекции. Для белков рз и р4, содержащих составные антигенные детерминанты, была определена величина н>50, то есть доза белка, обеспечивающая Ъ0% защиту животного от инфекции. Для белка РЗ, кодируемого плаз-мидой рЭРМБ, эта величша составила юб мкг, а для белка Р4 -37 мкг. Полученные данные свидетельствуют о большей эффективности иммунизации белком, имеющим в составной антигенной детерминанте участок 131-160 VP1. Гибридный белок Р4, кодируемый плазмидой piOPMD, был также использован для иммунизации овец. При этом Р4 индуцировал образование вируснейтралпзующих антител и оказывал за--щитное действие в отношении заражения вирусом, ящура А22. В настоящее время проводятся углубленные испытания болка р4 в полевых условиях на крупном рогатом скоте.

3. Конструирование искусственных генов, кодирующих гибридные белки с антигешюй детерюшантой вируса яшура подтипа 0194

Положительные результата, полученные при иммунизации животных гибридным белком фактора некроза опухолей и составной антигенной детерминанты штамма А22, послужили основанием для создания аналогичного по структуре гибридного белка, содержащего составную антигенную детерминанту вируса ящура шташа 0194. На начальном этапе мы сконструировали плазмвду pFMDiSO, которая кодировала белок Р5, аналогичный белку Р4,- но с предполагаемой антигенной детершшантой из последовательности VP1 вируса ящура 0194.

ВаМП

5'-CACACGGATCCTTTACAACGGAAACTGCAAGTA (XVII) Kpnl

s'-CACACGGfTACCCTACAACGGAAACTGCAAGI'A (XV)

130 140

TyrAsnGlnAsnCysLyBTyrValAspGlyProValThrAsnThi'ArgGly-

5'...... TACAACGGAAACTGCAAGTACGTTGATGGCCCGGTGACCAATACAAGAGGT-

ATGTTGCCTTTGACGTTCATGCAAOrACCGGGCGAC!rGGTTATGrrOTCOA-

150 160

AspLeuGIuValbeuAlaGlnbysAlaAlaArgThrLeuPro

GACCTCCAAGTACTGGCCCAOAAGGCGGCGAGAACGCTGCCO

CTGGAGGTTCArGACCGGGTCTTCCGCCGCTCTTGCGACGGG......5'

(XVI) CCGCCGCTCTTGCGACGGGATTCGAACCAAO-5'

Hintan

(XVIII) CCGCTCTTGGGACGGGGGTGTAGAGOAAG-5'

BglU

Рис.6. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК плазмиды pBR VP1-0194, кодирующего предполагаемую антигенную детерминанту вируса ящура серотипа 0194, и синтетических олигонуклеотидных прайме ров (XV-XVIII) для амплификации

Искомый фрагмент ДНК (сегмент Ъ), кодирующий аминокислотную последовательность 130-160 белка оболочки VP1, получили при помощи полимеразной цепной реакции (PCR). При этом в качестве матрицы использовали плазмиду рвн VP1-0194 (любезно предоставленную Н.А.Пе-ревозчиковой, НИИЯИ, г. Владимир), содержащую фрагмент гена VP1. Реакцию цепной полимеризации проводили с помощью Год ДНК-полимерз-зы в присутствии двух олигонуклеотидных праймеров XV и XVI, части чно комплементарных фрагменту ДНК и содержащих для удобства последующего клонирования сайты узнавания рестриктаз Kpnl и Htnülll (рис.6). Для подтверждения структуры амплифицированного тупоконечного фрагмента его подвергли промежуточному клонированию по S'mai--сайту плазмиды pBS+, после чего целевой фрагмент вырезали рестри-ктазами Kpnl и Hinälll и реклонировали по тем же сайтам в плазмиду рЮРЖ) (рис.7). В результате получили плазмиду ррМБ150, кодирующую гибридный белок Р5, в котором последовательность фактора некроза опухолей слита через константную антигеш1ую детерминанту с предполагаемым иммунодоминантным эпитопом штамма 0194.

Значительный интбрес представляет конструировашт таких гибридных белков, которые содержали бы в составе одной молекулы антигенные ' эпитопы различных штаммов вируса ящура и могли быть использованы в качестве поливалентной субъединичной вакцины. С этой це- > лью мы решили использовать ушжалышй для плазмиды рЮРМК сайт ре-стрпктазы Вотш и клонировать по этому сайту ген предполагаемой антигенной детерминанты штамма 0194.

Необходимый для этого фрагмент ДНК был получен при помощи полимеразной цепной реакци как описано выше (рис.6) с использованием олигонуклеотидннх прайме ров XVII и xvin. Амплифицировашшй фрагмент расщепляли рестриктазами Ваши и BgZii и получешую ДНК клонировали в плазмиду piOFMD по сайту Barni (рис.7). Наличие сайтов

Рис.7. Схема конструирования плазмид рРЖ>150-153. Ь - генэквива-лент главной антигешюй детершшантн вируса ящура подтипа 0194, п - число клонированных фрагментов, равное 1, 2 и 3

Вшит и Bglll на концах клонируемого фрагмента в значительной степени облегчало скрининг клонов с желаемой ориентацией вставки. При этом в процессе анализа были обнаружены клоны с рекомбшюнтными ДНК, содержащими ВойШУВ^Ш фрагмент в виде мономера, димера, триыера в нужной ориентации (плазмидц р?М"0151, рР1ГО152, рР1Л)153, соответственно). Структуру полученных плазмиц рРМВ151-153 подтвер-

ждали определением по методу Сэнгера нуклеотидной последовательности з'-концевой части рекомбинантного гена гп/, содержащей гены антигенных детерминант.

Исследование экспрессии искусственных генов, кодирующих гибридные белки Р5-Р8 с антигенной детерминантой штамма 0194, с помощью электрофореза в БСв-ПААГ показало, что все содержащие их плаз-

Лг\ъ\ч\5\ь Л2\ЗЩ5\6 /1 Z\5\4\5\b\ _/[г| зШб

" «fr Ч0Ч* ~ I

«в ' <3? ®3гт Чв» «га «а» «9® •Г

я* у • .•.

а $ 6 г

Рис.8..Электрофорез(а) и иммуноблоты с поликлональными антителами к TNF (б) и к вирусу ящура подтипа А22 (в) и 0194 (г) лизатов E.COll SO 20050 С плазмвдами рТНР3314(1), рЮИШ(2), рИГО150(3)> pFffi)151U), рРШ)152(5), pP«D153(6) .

миды (pPMDi50-рПГО151) обеспечивают высокий уровень биосинтеза, причем он.заметно снижается в случае олигоморных детерминант (рис.8а). Анализ гибридных белков, кодируемых плазмидами рРШ)150-PFMD153, методом иммуноблоттинга показал (рис.86,в,г), что все они, как и ожидалось, взаимодействуют с поликлональными антисыворотками против фактора некроза опухолей и против целого вируса

штамма 0194. Интересно отметить, что из всех белков только белок Р5, кодируемый плазмидой PFMD150, не взаимодействовал с антителами против вируса штамма Agg. По всей видимости, эти белки не проявляют перекрестной серологической реакции, что свидетельствует о том, что специфичность взаимодействия этих белков с антителами против штаммов А и 0 серотипов, скорее всего, определяется природой вариабельного антигенного эпитопа.

Мы провели предварительное изучение иммунологических свойств белков Р5 и Р6. В опытах на морских свинках было обнаружено, чтс^ оба рекомбинантных белка индуцируют после иммунизации образование у животных вируснейтрализующих антител, причем белок Р6, кодируемый плазмидой PPMD15U защищал морских свинок от инфекции как подтипом Аг2, так и подтипом 0194. Таким образом, показана принципиальная возможность получения на основе гибрдных белков рекомбинантной субъединичной вакцины против двух серотипов вируса ящура.

4. Конструирование искусственных генов, кодирующих Н-концевые гибриды антигенных детерминант вируса ящура и фактора некроза опухолей человека

Как уже отмечалось ранее, все гибридные белки с антигенными детерминантами в С-концевой части фактора некроза опухолей .образовывали в клетках бактерий нерастворимые агрегаты. С одной стороны, это обстоятельство значительно упрощало выделение рекомбинантных белков в индивидуальном виде. С другой стороны, нерастворимость гибридных белков затрудняла получение стандартных препаратов, используемых для иммунизации, так как разные партии могли содержать различное количество примесей, например, таких как бактериальный эндотоксин.

ArßValAlaAlaGIrLLeuProThx-AspProIleAsp tcgacíttgctgctcagcttccgactgatcctatcgata

Рис.9. Схема койструйрования плазмида рГМИ131

В связи с этим значительный интерес представляло получение и изучение биохимических и иммунологических свойств гибридных белков, в которых•пептиды антигенных детерминант вируса ящура предшествовали амнокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека. В качестве первой попытки мы решили "переставить" в гибридном белке Р4 антигенные детерминанты с с-конца THF на Н-конец и получить белковую конструкцию Р9 (риси).

На первом этапе конструирования гибридного гена, кодирующего белок F9, мы заменили Xhoi/Hlnilll фрагмент в плазмиде рЮРШ) на синтетический дуплекс (рис.9). Этот дуплекс кодирует С-концевую часть вирусной антигенной детерминанты без терминирующего кодона и содержит для соединения с геном фактора некроза опухолей сайт рес-триктазы Clal. В качестве вектора для дальнейшего клонирования гена составной антигенной детерминанты в N-конец гена фактора некроза опухолей была выбрана плазмида рТПР31Д. Встраивание Bamül-Clal фрагмента плазмида pioi'bfDi в плазмиду pTNF3iA было осуществлено по сайту OlaI, расположенному перед геном in/, с помощью синтетического линкера, содержащего ATG-кодон для инициации трансляции гибридного белка Р9 (рис.9). Полученная в результате рекомбинантная плазмида ррнш 31, структуру которой подтверждали секвенированием по методу Сэнгера, кодирует гибридный белок Р9, в котором составная антигенная детерминанта вируса ящура А22 соединена через дипе-птидный спейсер Asp-Pro с N-концом фактора некроза опухолей человека .

Получение плазмида рРШ)131 с геном, кодирующим м-концевой гибрид антигенных детерминант вируса ящура с TNF, открыло новые воз-мокности конструирования потенциально иммуногенных гибридных молекул на основе фактора некроза опухолей. В этой связи представляет определенный интерес конструирование гибридных белков, в которых

антигенные детерминанты фланкируют аминокислотную последователь ность ТОТ.

В связи с этим мы получили сначала искусственный ген, кодиру-пций гибридный белок фактора некроза опухолей с м- и с-концевым расположением составных антигенных детерминант вируса ящура А22 путем простой рекомбинации мевду плазмидами рЮРЩ) и ргшлэч по сайтам рестриктаз РзИ и Ва4ВП, как показано на рис.ю. В резуль-

тате Сила получена плазмида рРШ)132, кодирующая белек Р10 (рис.1). Затем, заменив Cïai-фрагмент в плазмиде pFHDi3i на соответствующий фрагмент плаг^дц pFHDiSO, получили рекомбинантную плазмиду РПШ133 (рис.Ю), кодирующую белок Р11, в котором антигенная дете-ряшанта подтипа &гг присоединена к N-концу, а детерминанта подтипа 0194 присоедашена к с-концу фактора некроза опухолей человека.

Мы исследовали экспрессию гибридных генов, кодирующих белки Р9-Р11. Анализ суммарных балков клеток бактерий, содержащих плаз-миды рР1П)131 -pFMDi33, электрофорезом в SDS-ПААГ показал, что полу-чешше плазмлднне конструкции обеспечивают эффективный биосинтез гибридных белков. При этом оказалось, что белок Р9, в отличие от белков Р10 и Р11 подвергался частичной деградации в клетках E.coli xi-Blue и оставался кнтактшм в дефицитном по Ьа-протеазе штампе E.coli 20050 (рис.11 а). Дальнейший анализ показал, что гибридные

• *» ® i": '..-iA'-i ! wxffifflSaSasiKSájabtírs

А2\Ъ\Ч\5\6\7\3\3

<SB«3

J\¿\5\4\5\6\m9

<Э о . ет <»- - -

© «9

7\8\9

SSt

Рис.11. Электрофорез (а) и иммуноблоты с поликлоналышми антителами к TNT (б) и к вирусу ящура подтива А22 (в) и 0194 (г) лизатов E.coli SG 20050 с плазмидами рТ1№31Д (1), рЮРНВ (2,7), PFMD131 (3), pFlíDi32 (4,8), pFMDi33 (S), а также лизатов XL-Blue с плазми-дами pFMDI31 (5) И pFffî)1 32 (б)

белки РЮ и Р11 образуют в клетках бактерий нерастворимые агрегаты, тогда как белок Р9 локализован в цитоплазме в растворимом состоянии, чем, по-видимому, и объясняется его чувствительность к протеазам в штамме E.coll xx-Blue.

Анализ рекомбинантных белков Р9-Р11 методом иммуноблоттинга (рис.116,в,г) показал, что все они взаимодействуют с поликлональными антителами против фактора неккроза опухолей человека и вируса ящура подтипа А22- В то же время только белок Р11, кодируемый пла-змидой pïMDI33, взаимодействует с антисывороткой против штамма 0194 вируса ящура. Эти результаты подтверждают сделанный ранее вывод о тем, что специфичность взаимодействия гибридных белков с антителами против вируса ящура определяется природой вариабельной антигенной детерминанты.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в E.coll искусственных ДНК, кодирующих антигенные детерминанты белка оболочки VP1 вируса ящура подтипа А22.

2. На основе искусственных генов сконструирован ряд рекомбинантных ДНК, кодирующих N- и с-концевые гибриды фактора некроза i опухолей человека и антигенных детерминант вируса ящура штамма А22> Получеш штамма Е.соН - эффективные продуценты гибридных белков.

3. С помощью цепной полимеразной реакции получен и клонирован фрагмент ДНК, кодирующий предполагаемую антигенную детерминанту вируса ящура штамма 0194. Сконструирован ряд рекомбинантных плаз-мид, содержащих reim, кодирующие гибриды фактора некроза опухолей человека и предполагаемой антигенной детерминанты вируса ящура

подтипа 0194, а также гибридные белки с антигенными детерминантами двух серотипов вируса ящура - Агг и 0194.

4. Разработан метод Еыделения гибридных белков из биомассы E.coll. Полученные гибридные белки охарактеризованы инмунохимичес-ки с помощью блоттшга с поликлональными антисыворотками против рекомбинантного фактора некроза опухолей человека, а также против вируса ящура серотипов А22 и 0194.

5. Исследованы иммуногенные свойства полученных гибридных белков в опытах на морских свинках и овцах. Установлено, что С-концевые гибрида фактора некроза опухолей и антигенных детерминант инициируют образование вируснейтраяизующих антител и защиту от вирусной инфекции. Впервые показано, что гибридный белок, содержащий иммуногешше эпитопы двух штаммов вируса (А22 и 0194) защищает экспериментальных животных от заражения вирусом обоих серотипов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В

СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Коробко В.Г., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Микульскис A.B., [Филиппов О.ТГ|, Добрынин В.Н. Синтез, клонирование и экспрессия искусственных генов, кодирующих антигенные детерминанты вируса ящура подтипа Ag^/EHoopr. химия, 1991, т.17, с.461-469.

2. Коробко В.Г..Филиппов С.А., Добрынин В.Н., Болдырева Е.Ф., Микульскис A.B., Некрасова О.В., Ивапющанков В.Н., Бурдов А.Н., Дрягалин H.H., Чепуркин A.B. Рекомбинантная плазмидная ДНК plOFMD, кодирующая гибридный белок Р204-АзрРгоСузСуа-УР1 (200-213 )РгоРго-ЕегРго(131-160) и штамм бактерий E.coll - продуцент этого белка// Авторское свид. №1724691.

3. КороОко В.Г., Добрынин В.Н., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Микульскис A.B., Иванщенков В.Н., Бурдов А.Н., Лрягал1Ш H.H., Че-пуркин A.B. Рекомбинантная шшзмидная ДНК P9FMD, кодирущая гибридный ПОЛИП9ПТИД р199-АврРгоСувСуз-УР1(200-213)-ProProSerPro-VP1 (131-152)-ProOyBGly и шташ бактерий £.соХ( - продуцент этого белка//3аявка .№4840285/13, полок, реш. от 19 дек.1990 г.

4. Коробко В.Г., Некрасова О.В., Болдырева Е.Ф., Филиппов С.А., Микульскис A.B., Добрынин В.Н. Подходы к получению рекомбинантной противоящурной вакцины// Тез.докл. v конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии". - Путдино, 1992, с.БЗ.

Зак.608р.Тир.70.Тип."Знание"