Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генноинженерные мутанты белка оболочки РНК-содержащего бактериофага fr

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генноинженерные мутанты белка оболочки РНК-содержащего бактериофага fr"

ТАРТУСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ПУШКО ПЕТР МЕЧИСЛАВОВИЧ

УДК 577.1:547.9(>3.3.

ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЕ МУТАНТЫ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ РНК - СОДЕРЖАЩЕГО БАКТЕРИОФАГА Ь

03.00.03. — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тарту —1990

Работа.выполнена в Институте органического синтеза Латвийской академии наук

Научные руководители:

Академик Латвийской АН, член-корр. АН СССР, доктор химических наук, профессор Э. Я. ГРЕН

доктор биологических наук П. П. ПУМПЕН

Официальные оппоненты: академик Эстонской АН,

доктор биологических наук Р. Л.-Э. ВИЛЛЕМС кандидат биологических наук К. В. САСНАУСКАС

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР

Защита состоится 20 декабря 1990 года в 13.00 часов на заседании Специализированного совета К. 069.02.07. Тартуского университета по адресу: 202400 Эстония, г. Тарту, ул. Юликооли, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Тартуского университета по адресу: 202400 Эстония, г. Тарту, ул. Струве, 1.

Автореферат разослан ,, { 1 " ^ '1990 года.

Ученый секретарь Специализированного совета К. 069.02.07

кандидат медицинских наук

Л. С. УУСКЮЛА

Актуальность теш

Одним из новых направлений создания диагностических и профилактических • препаратов сегодня является конструирование капсидных структур с заданными антигенными и иммуногенными свойствами. Это осуществляется посредством экспонирования чужеродных иммунологических эпитопов на поверхности вирусных капсидных частиц, образующихся в результате самосборки мономеров белка оболочки. В настоящее время в роли капсидных белков -носителей чужеродных эпитопов - используют HBsAg [Delpeyroux et al.,1986] и HBcAg [Borisova et al.,1989] вируса гепатита В, белок оболочки вируса табачной мозаики [Haynes et al.,1986] и другие капсидные белки. Совершенно новый объект, как универсальный носитель эпитопов, представляет собой белок оболочки (БО) FHK-содержащих бактериофагов В. coll, который образует икосаэдрический капсид фагов, состоящий из 180 одинаковых субъединиц.

Целью настоящей работы ставилось изучение возможностей использования капсидного белка РНК-содержащих бактериофагов в качестве носителя чужеродных эпитопов. Для достижения этой цели был проведен сравнительный анализ первичных и вторичных структур БО РНК-содержащих бактериофагов Е. coll, а также, на его основе -экспериментальный генно-инженерный мутагенез БО бактериофага fr на предмет выявления его участков, пригодных для внедрения чужеродных последовательностей.

Научная новизна работы заключается в том, что предложен новый объект для белковой инженерии вирусных капсидных структур - БО РНК-содержащих бактериофагов В. coll. В частности, на примере БО фага fr из 1-й серологической группы фагов показано, что он может быть использован в качестве носителя для внедрения в него чужеродных последовательностей, включая и вирусные иммунологические эпитопы. Впервые показана возможность создания как полноразмерных фагоподобных частиц, несущих чужеродные последовательности, так и интермедиатных структур самосборки, образующихся в результате ассоциации рекомбинантных мономеров в мультимерные частицы нескольких классов (от димеров до цельных капсидоподобных частиц, состоящих из 180 субъединиц).

Практическая значимость работы.

1. Сконструирован пакет новых векторов, предназначенных для клонирования чужеродных последовательностей, в том числе и вирусных иммунологических эпитопов, по N- и С-концам БО fr, а также для экспрессионного картирования клонированных эпитопов.

2. Получены штаммы-продуценты белков, представляющих собой БО fr, в который внедрены активные иммунологические эпитопы, пригодные для практического использования: участки preS вируса гепатита В человека (HBV), оболочечного бежа gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLY), трансмембранного белка gp41 вируса иммунодефицита человека (HIV). Сконструированные рекомбинантные плазмиды, кодирующие соответствующие белки, защищены авторскими свидетельствами.

Плазмида pFR8-1-33 (вектор для внедрения по С-концу), использована В.М.Берзинем (ИОС ЛАН) для конструирования штамма-продуцента рекомбинантного БО fr, несущего активный центр а-атрио-натрийуретического фактора человека (a-AKF). клонированный в С-конце БО fr.

Плазмиды рРНЗб и pPR42 использованы Р.Ульрихом (Университет Гумбольдта, Берлин) для конструирования банка клонов, содержащих различные участки трансмембранного бежа gp41 HIV-1. клонированные в аминотерминальную область БО fr.

Структура работы. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвященный генноинженерному изучению вирусных капсидных структур и экспонированию на них чужеродных иммунологических эпитопов), материаж и методы, результаты и обсуждение, выводы. Материал работы иллюстрирован А? рисунками. Сгшсок литературы включает /сл" источников.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-й конференции молодых ученых, Рига, 1987; VII Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание физиологически активных веществ", Рига, 1987; Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1988, 1990; Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии", Тарту-Кяэрику, 1988; I и II научных конференциях Рига-Берлин "Молекулярная биология HBV, HIV и BLV", Рига, 1987 и Берлин, 1989; 2

20-й конф. ФЕБО, Будапешт, 1990; VII биохимической конференции Прибалтийских республик, Каунас, 1990, VIII международном съезде вирусологов, Берлин, 1990.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БО ФАГОВ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУШ

РНК-содержащие бактериофаги Е. coli на основании особенностей структуры генома и по иммунологическим свойствам своих капсидных белков подразделяют на два класса - А, к которому относят фаги 1-й (MS2, Г2, R1T, ir) и 2-й (GA) серологических групп, и В, состоящий из представителей III (Qß) и IV (SP) серологических груш. Поскольку известны первичные структуры геномов для представителей всех четырех серологических групп , открываются широкие возможности для сравнительного анализа их капсидных белков. Это предполагает:

1) выравнивание известных первичных структур БО по максимальной гомологии с последующим выявлением среди них наиболее вариабельных (предположительно экспонированных на поверхности) и наиболее консервативных участков;

2) анализ профилей гидрофильности различных БО с целью выявления наиболее гидрофильных и наиболее гидрофобных участков (последние, возможно, участвуют во взаимодействиях внутри мономеров БО, либо между отдельными мономерами);

3) сравнение вторичных структур, предсказанных при помощи компьютерных программ на основе различных алгоритмов, с целью выявления доменов БО, общих для всех рассматриваемых фагов.

I. Анализ вариабельности БО различных фагов

Оптимальное выравнивание аминокислотных последовательностей БО позволяет выявить как консервативные, так и наиболее вариабельные участки структур БО (рис. I). Наиболее протяженными из вариабельных районов являются участки 31-42 а.к. и 58-83 а.к. (нумерация аминокислотных остатков приводится по БО fr). Вариабельными являются также N- и С-концевые последовательности БО, хотя непосредственно концевые аминокислоты (А на N-конце и Y на С-конце) проявляют высокую степень консервативности. Среди наиболее консервативных участков выделяются 8-30 а.к., причем тетрапептид NGVA (27-30 а.к. fr) встречается у всех БО, а также участок 43-58

J5A ¿В ЛС JSD , ^l Г

0РРРРС|ЬЬЩ]0РРРРФ6Ф;;--ВВЁ}ЗР—тфББбфрроРРСЙ'-ВвввввВЕ^ррф

«í»

с нннннннннннннн

|3эарас£

«¿B

HHHHHHHHH ЭРРО

I

! I I i i 11: i

1 feb'11

PjsNFA-

SNFA-tfVSNA-' VSNA-rgvnpt|ng4/£

pgvnptÍngva

EWISSNSRSDA'

EWISSNSRSOA _

EWLSNNSRSQAYR

EWLSNNSRSQAYR

SUSOAGAVPALI

SLSEAGAVPALI

I

mis: i i i : i i i

«60 dYTIKVEVPKVA : YTVKVEVPKVA : YTIKLEVPKIV :YAIKLEVPKIV í'JYKVOVKlONF ÍKNFKVQIKLQNF

70,«

riQTVGGVEL' □ VOGGVEL' QVVNGVEL' QVVNGVEL' ACTANGSCtiFjSVTRi TACTRDA-CCÍFPVTR:

I I t

MIMII i : I m I ¡ II

м м i м i м м м м ii м м i: i м i ti м м ii м :

M Lt II M М I II М М I М I 100 МММ 110 I M I !

* 90 * '

I 120 I M M M

TIPIFPÍrjNSDCEj ¡VKAMPGLL^DGNF TIPVFP(r|NDDC^ jVk'fijpPGÍfPiaGNF TIPIFAATDDVT ¡TIF' IFAATDDVT1 DVTFSFTDYSfflDEEF^yRT TgSFTSYEQDEEFjíiir

:vgnf i Ifkvgnf 1 ,spll[i .dplivdH

AANSGI AANSG1 SSOSGF SSDSGF DQLNF A DNLNF'A

Рис.

I. Вариабельность БО РНК-содержащих фагов различных серологических групп. В верхней части представлена схема вторичной структуры БО фага МБ2 (Уа^агй ег а1., 19901, а также с^пень изменчивости каждого аминокислотного остатка среди различных БО. Наиболее консервативные аминокислоты выделены. (*)- аминокислотные замены в БО Гг по сравнению с БО МБ2.

.¿»¿С

М

$1

XR

MS2PPPPPPB&EBB fh аааддсввввв ирзлоаооавв-ввв ga "орардва-ввв

гттп гтта гттп гтта

¡ввббь—ннннн—hhhhhhhhhoopopd tbbbbfr—тттнн—нннннннннарароа

if-bbbbbüpottttoi

-трннннннарооаоЭаа-вввВЕ:атттооо1

os ороорао-тторрараарББввЬттторттоароарорропотттоафвввЕ jpttto-odi

sp QQQODOO-gaaoqcqqqopbbbhtttqqttqoqooqqqqoootttqqqbbbqe dotttq-qoi

Ьаотттоо!

'ТТТТООТТТВВВ—BBBHHHHOOl TBBBBBBOOBBB-BBHHHHHQQI ^НННННННННННННН—HHHHHHHTTI IHHHHHHHHODQH—HHHHHHHHOI

bbbbbbhoottpooottttottdpotttti bbbbbbboqtttoodtt-tottoootttti

сa

IHHHHHHHHHHHHHI

i^ooacj^

1ИННННННН 3000

ihhhhhhhhhh»- гттоаатттоооооооо-ihhhhhhhhhhhэттотттоооооооооа-1иннннннннн1- 3ttotttooqooooooqo

tttttttoqüoooo itttt ooooüdoqcfi

íhhhhhyrttod-odüttotto-^ннньботввво-оооттотто-

нннннисввбв;

oohhí&bb-bbebqqt 00Н(^ВЭБ-ВВЕЬ00ТТ1ВВВ8В--В

нн вв-вввввввэвввввввввеввввввввввфнннннифввввввв&фттт-'

НнннннннннЦвввввввЕроатт-т'

[гтттт]вввбНнннннвввввввввввв-ввнннннннн^ввв1^интЯн^еЯн [гттттрввдвЁ^нвввввввввввввв-нннннннннннннннннннннневввввБ!

□□□ойввввв-ееввввй юооорввввв-ввввввд _

юоаота&ввв-вввв&боататттннинннннннввввввнттто-внооттнннннь^ юаоатаэвва-ввввБЬоототтнннйнннннннЕввввввввоо-ооооттн^

(нн мннннуато в в в в в вв в в в в в в-

ВБВааОВВВВВВВВВВВВВВ-¡hh^sbbbbbtahhhfe&bbttdhbbbbooodttbb

|вввввтсзннневвнттонввввоаооттвв

вввввввввввввв[гтттттт|вввбв'вввв8ввввн

:bbbbefhhhhhh6bb8tttttf^bb3p^bbbbbbbe|

йнннннннннннннннннннн РиннннннннннннннннниЕ"

—bbbb6bbb

-00000—HHHHHODOOaOOaHHBB-BBBSbB^OODO^bBbBBBBBBBBBBBBBBBBa-HHHHHHHHHHHI ■00000—НННННОООООРООННЭВ-ВБВВВБрОООООддВББ&ВВВВВВВВВВВВВВВЩ-НННННННННН! ' ■ —Q—ОННННННОРОООННННН-ННННННННННННННЦЭВВВВВВВВВВВВВВВВВВ^ННИННННННН] IQO—ННННННОООООННННН~НННННННННННННННИННМН|ВВБВВВВВВВВЕ|00-ООООННННННН|

£вввв0В§0000000000000ОOOHHHHHHI [ввввввдооооооннно-оооаввннннн»

[аооооооас^ннннннннннннфвввввБСоооо-OaOOOOÜOOOQHHHHHHHHHHHHHHBBBSBBEpOCOO-'

HhfiiüiB&oooo-oqogi ннввввввеЬоооо-оннв!

IHHHHHHHHHHHpOQQQQ IHI-|OOOOO-

.вваднннннннннннннНоооооооо [нфоооо-

..... ....... воооо юооооооо

воооо loaoooooa

IHMH НННББВБВБЖНННК 1ННННННВВВВВВЕ4ЧНИНЙ

OOdHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH- 00-

ооанннннннннннннннннннннн- oa-

Рис. 2. Рассчетные вторичные структуры БО РНК-фагов различных серологических групп. А - расчет по Финкельштейну и Птицыну Е19751, В - по Гарнье-Осгуторпу-Робсону [19?* 1, С -по Аргосу 119 88 1. Выделены участки, совпадающие со вторичной структурой MS2 [Valegard et al., 19901.

im^immim 1ь

40 100

а.к. (дипептид RK также встречается у всех БО). Достаточно консервативным является также участок, в котором предположительно располагается нейтрализующий эпитоп, хотя восемь из 17 аминокислотных замен, отличающих БО fr от БО MS2 (оба фгга принадлежат к 1-й серологической группе) локализуются именно в этом участке (97-125 а.к.).

2. Анализ вторичных структур

Вторичные структуры БО фагов различных серологических групп рассчитывались по алгоритмам А.В.Финкелылтейна, а также Аргоса и Гарнье-Осгуторпа-Робсона (GOR) (рис. 2). Оказалось, что несмотря на существенные отличия в первичной структуре, совершенно очевидны сходства предсказанных вторичных структур БО фагов различных серологических груш. Также как консервативные аминокислотные последовательности, это свидетельствует о единых для всех РНК-содержащих бактериофагов принципах построения оболочки. У всех БО с высокой степенью уверенности предсказывается С-концевой а-спирэльный домен, а также N-концевой домен, состоящий из двух

ß-слоев, разделенных небольшим неструктурированным участком (который совпадает с первым пиком гидрофильности, рис. 3). Наибольшая вариабельность рассчетных структур наблюдается в районе 68-90 а.к.

3. Анализ профилей гидрофильности Б0

На рис. 3 приведены профили гидрофильности Б0 фагов различных серологических групп, определенные с помощью алгоритма Хоппа-Вудса. Б0 фагов класса А имеют три хорошо выраженных максимума гидрофильности: в районах 12-14, 35-40 и 53-58 а.к. Участок 35-40 совпадает с одним из наиболее вариабельных участков БО фагов различных серологических групп (рис. I). В районе 53-58 а.к., где находятся заряженные аминокислоты (третий пик гидрофильности), в том числе и консервативный дипепептид Ж, предположительно происходит связывание БО с фаговой РНК.

ВЫБОР УЧАСТКОВ БО РНК-ФАГОВ ДЛЯ ГЕННОИНЖЕНЕРНОГО МУТАГЕНЕЗА

В результате сравнительного анализа БО РНК-фагов всех четырех серологических групп для генноинженерного мутагенеза были выбраны N- и с-концевые участки БО, район 51-й а.к., а также участок предполагаемого нейтрализующего эпитопа в районе 96 - 115 а.к. Перечисленные участки предположительно экспонированы на поверхности фаговых частиц, либо участвуют во взаимодействиях между мономерами и представляют интерес как с точки зрения поверхностного экспонирования чужеродных эпитопов, так и с точки зрения изучения закономерностей самосборки мономеров. Так, ранее была экспериментально показана необходимость С-концевого Y для эффективной самосборки фаговых оболочек. С-концевой Y весьма консервативен: встречается у всех фагов, первичная последовательность БО которых известна (рис. I). N-концевой А также консервативен у БО различных фагов, хотя в целом N-концевая область достаточно вариабельна. Согласно расчетным предсказаниям вторичных структур, как N-, так и с-концевые аминокислоты у БО всех фагов располагаются в неструктурированных районах (рис. 2) и могут иметь, по-видимому, высокую степень конформационной подвижности.

Для генноинженерного мутагенеза использовался также участок 51-й а.к., находящийся в районе максимума гидрофильности (рис.3).

Особый интерес с точки зрения экспонирования чужеродных эпитопов

на поверхности капсидных частиц представляет участок С-концевых а-спиралей, которые предсказываются различными рассчетными методами (рис. 2). С этим районом перекрывается участок 88-108 а.к. М32, для которого ранее было установлено, что антитела к нему обладают фагонейтрализующим действием. Очевидно, это объясняется поверхностной локализацией данного района на капсидной частице. Анализ вариабельности Б0 показал, что участок а-спиралей достаточно консервативен среди фагов различных серологических групп, однако более 50% аминокислотных замен, отличающих фаг Гг от МБ2, локализуются именно в этом районе (рис. I). Таким образом, предполагаемая поверхностная локализация С-концввого а-спиральнсго домена делает его перспективным для внедрения чужеродных последсвательностей, хотя профиль гидрофильности этого участка сдвинут в гидрофобную область, что характерно для а-спиралей, вовлеченных во взаимодействие с другими структурными доменами.

ОБЩАЯ СХЕМА МУТАГЕНЕЗА Б0 ФАГА fr

В качестве объекта для генно-инженерного мутагенеза был избран БО фага fr, ген которого был клонирован и экспрессирован в Е. colt ранее [Козловская и др.,1986].

В соответствующих участках клонированного гена БО fr имеются сайты рестрикции, позволяющие проводить обширный мутагенез БО (рис. 4). Во 2-й аминокислоте гена БО располагается сайт AsuII, в 126-й -сайт Aval. Область а-спиралей ограничена сайтами Nrvl (96 а.к.) и Dra I (112 а.к.). В 115 а.к. локализуется сайт BsiIIII. Для инсерционного мутагенеза использовали также сайт EcoICRI, локализующийся в 51 а.к. Плазмиды, кодирующие полученные мутантные гены, секвенировались дидезокситерминаторным методом на плазмидных матрицах с помощью специально синтезированных праймеров PI и Р2 .

—I— -100

Asyl I

JL_

EcoICRI

—I-

100

Dre I BstEl I

" Ii Г

I

200

300

393

Рис.4. Сайты рестрикции, которые использовались для генноинженерного мутагенеза БО Гг- Обозначены также участки прикрепления праймеров Р1 и Р2 для секвенирования полученных мутатнтных генов.

pi

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ МУТАНТНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ

Для изучения свойств рекомбинантных белков использовали два типа антител против ВО fr. Антитела анти-;Сг-моно, полученные иммунизацией кроликов денатурированным ВО, использовались для определения уровня синтеза рекомбинантного бежа в ДСН-лизатах при помощи титрования в радиальной иммунодиффузии по Охтерлони с параллельным титрованием ВО фага (растворенного в 1% ДСН с конечной концентрацией I мг/мл). Способность рекомбинантного белка образовывать мультимерные структуры в результате самосборки мономеров тестировалась в лизоцимных лизатах иммунодиффузией по Охтерлони при помощи антител анти-|г-мульти, полученных иммунизацией кроликов очищенным нативным фагом. Для анализа мультимерных структур использовалась также электронная микроскопия (любезно проводимая В. Осе, Институт микробиологии, Рига), позволяющая изучать полноразмерные фагоподобные частицы и достаточно крупные интермедиатные структуры самосборки. Димерные образования фиксирбвались при помощи гель-хроматографических методов, а также с помощью ковалентной сшивки глутаровым альдегидом, с последующим электрофорезом в полиакриламидном ДСН-содержащем геле и иммуноблоттингом с антителами анти-1г-моно.

ИНСЕРЩОННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ВО ir С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЛИНКЕРОВ

На первом этапе экспериментального мутагенеза для вставок по избранным участкам были синтезированы короткие олигонуклеотиды (с любезной помощью Э. Станкевич, Институт органического синтеза, Рига), кодирующие в случае встраивания одной копии от 3 до 5 новых аминокислот и несущие сайты узнавания нескольких рестриктаз, удобные для дальнейших этапов конструирования. Преимущество олигонуклеотидов для мутагенеза заключается прежде всего в разнообразии вводимых мутаций вследствие встраивания олигонуклеотидных линкеров в различных ориентациях, а также по причине встраивания нескольких копий полилинкера. Более того, число различных последовательностей возрастает в результате перестроек рекомбинантных плазмид ln vivo. С помощью указанных линкеров было получено большое число инсерционных мутантов БО, структура и самосборочные свойства которых схематически показаны на рис. 5. •

25

_l_

50

75

SISIAS

SERSISIS

SKRSISKRSISIS

Ьелок оболочки fr

100 _L_

125

r S51

I

RDLD

RISIS

RISMISI

1 : 512

I : 4

RDIDLDLDL SLBLLDLLDLLDL

1 Г 2В

I 2

96

I

V* EI*

GYRYP*

DRYHRYP

DRYHRIPS

I : 16

112 1

SR

RSR

DIDI

DIDID

SRRSRSRS

2126 T

GIYIDN

X 2048

I 8

та*

Рис. 5. Инсерционный мутагенез БО 1г с помощью олигонуклеотидных линкеров. Показаны структуры мутантных белков (* - терминационные варианты) и титры с анти-1г-моно и aнти-ír-мyльти антителами (в рамках вверху и внизу, соответственно).

Оказалось, что наиболее неблагоприятными местами для внедрения чужеродных последовательностей являются 96-я и 112-я а.к. (а-спиральный домен), так как любые мутации в указанных участках приводят к исчезновению мутантных белков в Е. coli. Аналогичная картина наблюдается у мутантов по С-концу с одновременной делецией карбокситермннального Y. В тех же случаях, когда концевой Y сохраняется, вставки чужеродных аминокислот в БО fr позволяют его мономерам образовывать полноразмерные капсидные частицы.

Зафиксированы фагоподобные структуры и для мутантов, содержащих 5 дополнительных аминокислот, внедренных в 51 а.к. БО fr. Однако для мутантов, содержащих более протяженные аминокислотные вставки, наблюдалась тенденция к снижению уровня продукции.

Наиболее интересным участком оказался аминотерминальный конец БО fr, способный включать вставки различной длины и аминокислотного состава без нарушения самосборочных свойств мономеров, что было впоследствии использовано для внедрения во 2-ю аминокислоту БО fr иммунологических эпитопов.

ДЕЛЕЦИОННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И МУТАГЕНЕЗ ЗАМЕЩЕНИЯ ПРЕДПОЛАГАЕМОГО НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА БО fr

С целью дальнейшего изучения С-концевого а-спирального домена был сконструирован специальный вектор (рис. 6), содержащий в этой

¡frill Oral Eco91l

TTCGCGACGAACGACGACTGTGCCTTMTCGTTMGGCATTGCAAGGCACCTTTAAAACTGGTAAC

F 95

ATHDDCALIVRALQGTF 100 105 110

Я T G N 115

pFR^S

Hrul Hpal HlndHI Aapr 18 Kjnl Cral Eco91I

TTCGCGACTMCGACGACTGCGCGTTAACTGTTAAAGCTraGCAGGGTACCTTTAAAACTGGTAAC FATNDDCALT*VKALQGTFKTGN pFR 120 95 100 105 110 115

Рис.6. Конструирование вектора pFR120.

области дополнительные сайты рестрикции. Новый вектор pFRl20 был сконструирован при помощи замещения участка гена БО fr между сайтами Nrul и Dral (соответствующего участку между 96-й и 112-й аминокислотами БО) на синтетический олигонуклеотид длиной 50 п.н., кодирующий те же аминокислоты (за исключением аминокислотной замены 1Ю4 -» ТЮ4) и содержащий за счет вырожденности кода дополнительные сайты рестрикции.

С использованием вектора pFR120 были получены делеционные мутанты БО fr, содержащие делеции различной длины в С-концевом a-спиральном домене БО fr (рис. 7). Были получены также различные мутанты замещения, в которых те или иные участки а-спирального домена БО fr замещались другими последовательностями, в том числе и последовательностями БО фага GA из 2-й серологической группы (рис. 8). Несмотря на чрезвычайно малые изменения, вносимые в некоторых случаях, мутантные белки в лизатах практически не обнаруживались. Более того, оказалось, что точковая мутация БО fr в 104 а.к. 1-»Т (вектор pFR120) оказывает крайне неблагоприятное влияние как на уровень продукции, так и на самосборочные свойства БО. Электронномикроскопическое изучение мутантного белка выявило присутствие в препарате, наряду с капсидоподобными частицами диаметром около 25 нм, структуры меньшего диаметра, очевидно, представляющие собой интермедиатные структуры сборки капсидоподобной частицы (рис. 10).

Таким образом, независимо от характера вносимых изменений, практически все мутантные белки, несущие мутации в районе a-спирального домена, обладают сниженным уровнем продукции в Е. colt. Наиболее вероятным объяснением этого экспериментального факта является, по-видимому, быстрый протеолиз мутантных белков, о чем косвенно свидетельствуют данные иммуноблоттинга и электрофореза:

Ипц Нра1 ШпШИ Аэрт\в Ккц Сга1 Есо9П И/е1 ДиЦ

тгс{соАстисо*сс1(Ж1мсот1истсттшостсс4с5ст*Ь1^тАст{стАлссбА*ттссАЛС»осс*тсасАОСс*>йоооошст*о глтнвосл1.т'укА1.с1Стекта1/Р1Атл1лл115а1г 95 100 106 110 115 120 125 129

КПП (ИраП ГШпсИШ АЗ[Л 18 1»-а1 ЕС09Н И/Э1 АиЯ

ТТС^ОАСТИСОАООАСЮОСССТ^ *АОСТТТСОАС$аТА5сТ^ААААСт5сТААССгААТТОСААСАОССАГСОС4(;ОСибтСОООАЛТОТАО

Г Л Т И О И с А I АЬЯСТРКТСИ Р1АТА1ААИВС1У

95

100

(104 - 106)

110

115

120

125

129

КПП Нро1 ШпЛШ Март 18)

ПС$ССАИиССАССАМ0ССССТ$ААСТСт1АаСТТТССАс4

95 100 105 110

Есо'Л1 К/е I ХИН

*стаас с^ааттссаасасссатсссасссла^тссссаатстас

120 125 129

( 96 - III )

(III - 115)

1со911 к/е1 /|иа1

*СГ»АСс{ААГГССА»САСССАТСССА0С(1и{тССССАЛ1С1АС

скрхлглхллкасгг

115 120 125 129

Нра1 ШиЯП изряш Крп1 Есо9П (К/еП Мин)

-тсасситстло э а 1 у

129

гигип

ттс5 р

95

«ги| . - ... ... ....... . .. - ............

ГГс2сСАСГААССАССАЯ,СССССГ?ААСТОтААССГТТССАс5<;ТА{сТт|ААААС^1;ТАА|;с$ААГГ ?АТН1>ВСА1Т*У-КА1. 9 Г, Т Г Н Т п Н р I 95 100 105 110 115

(119 - 125)

рИ 120

Рис. 7. Делеционный мутагенез предполагаемой собственной антигенной детерминанты БО Показаны структура рекомбинантных генов, а также структура и уровень продукции (по данным иммуноблоттинга) мутантных белков.

(Нгии НШШ ттсссссстасссассасттсассстаатттстааассттт рса ,20_3 РЛАТ0ВГТУ15КА -

95 100 105

ттссттасаааттассстсаастсотссстасссааасттт

РГННГПЕУГСБЯА Р120"9

95 100 105

Лги1 ЕсоЮ ЕсоШ И1шЯ11

ттссссаЗааттстссссстсолаасаЬтогтааассггг рн1у 6

РЛН11ЛУЕЯУ1*Л -

95 100 105

£ лзрпа *р>1 й-а! Есо911

(ктА^СТС^АААСТТССТААС & С Т Р К Г С н 110 115

НШ1Ш ЛзрТ 18 к£п1 ога1 еоо9ц исссссстасссассасттсассстаатттстааасстттссассстасстттааасттсст рда 6.16

95 100 105 110 115

(кгии шпспш ЛзрГ 18 яотi Есо9П

ттсстаоттссстсаастсстссатассссасстгтссасмта{мт?ааасттсат р(,д 6.18

руикуяБУУОБйдьастркус -

95 100 105 110 115

ЕсоН1 Яса I

ттссааттсасаоттас!астваасаааатстассасатссасасстаостаттссссатсстаас рнау „

ргргугггв^уррроус/^вя* -

95 100 105 111 115

Рис. 8. Мутагенез замещения предполагаемой собственной антигенной детерминанты БО 1г. А- замещение участка 95-105 аминокислот, Б-замещение 110-115 аминокислот, В- двойное замещение участков 95-105 и 110-105 аминокислот, Г- полное замещение участка 95-115 аминокислот. Показаны структуры рекомбинантных генов, а также структуры и уровень продукции (по данным иммуноблоттинга) мутантных белков.

для мутантных белков характерно появление легких зон, являющихся, очевидно, промежуточным продуктом протеолиза. Полученные данные свидетельствуют о важном вкладе обеих С-концевых а-спиралей в формирование и поддержание мультимерной капсидоподобной структуры. Совершенно очевидно, что важная роль этого участка делает невозможным его использование для экспонирования чужеродных иммунологических эпитопов.

ВСТАВКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ЭПИГОНОВ В М-КОНЕЦ ВО Гг

Мнсерционный мутагенез с помощью линкеров позволил установить, что перспективным местом для внедрения эпитопов может служить 2-я аминокислота ВО 1г . Для расширения возможностей клонирования в И-конец в Asv.II сайт (2-я а.к. ВО 1г) была встроена полилинкерная последовательность из плазмиды рИС19. Отобранные клоны, содержащие полилинкер в обеих ориентациях, позволяют клонировать в ы-конец ВО чужеродные последовательности, имеющие практически любые фазы трансляции.

I.Векторы для экспрессионного картирования иммунологических эпитопов

Сайты рестриктаз в клонированных полилинкерах предоставляют широкие возможности для экспрессионного картирования клонированных иммунологических эпитопов с использованием экзонуклеаз Ва131 или ЕгоШ. В последнем случае используется свойство Ёхо111 расщеплять двухцепочечную ДНК, начиная с 5'-конца цепей, и неспособность ее инициировать расщепление в том случае, если 5'-конец защищен выступающим 3''-концом [Неп11ш11,1984]. Получение двух банков делеционных вариантов фрагмента, клонированного в оба варианта плазмид, показано на рис.9. Однако, в тех случаях, когда фрагмент клонируется в середину полилинкера так, что пары сайтов рестриктаз, образующих 5'- и 3'- выступающие концы, остаются с обеих

3'-конец А-Оелка

•«•к.-;; SO. ГГ.

В

А Е Sc К Хт В XbSaP 5[

\7, I.T.7.? v I I *

AD„ [-*; полилинкер^'

SpPSaXb BXmKSc Е А Т I I 7 77 Т I V '

^ полилинке р ^

AD,

■Р2

С +"Р2.

Рис.9. Экспрессионное картирование иммунологических эпитопов, клонированных в N-конец BO fr- А- структура плазмиды для экспрессии гена ВО fr, В- пара плазмид, содержащих полилинкер из pUC19, клонированный по 2-й аминокислоте в обеих ориентациях, С- картирование с помощью ступенчатых делеций,производимых Его ill. AD1- АБп - антигенные детерминанты; A-4sull, E-Ecori, so-Saoi, к-Я

Sa-Sacl, P-PstI, Sp-Sphi.

-Kpnl, Xm-Xmal, B-BamHI, Xb-№al,

сторон фрагмента, получение двух банков возможно с использованием одной из полилинкер-содержащих плазмид.

2. Клонирование эпитопа белка оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота

Б качестве одной из иммунологически активных последовательностей, клонированных по 2-й а.к. БО fr, использовался фрагмент 55-103 а.к. из белка gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV), который содержит вирус-нейтрализующий эпитоп (78-92 а.к.), а также эпитоп узнавания и связывания моноклональных антител МАК 14 (57-67 а.к.), любезно предоставленных нам X. Сиаккоу (Берлин). Соответствующий фрагмент ДНК внедрялся по сайту EcoRV в линкер, клонированный ранее в isull сайт (плазмида pFR7-71). Оказалось, однако, что уровень продукции данного белка в Е. coll крайне низок, так как соответствующий белок не обнаруживался в иммунодиффузии с антителами анти-Гг-моно, а также в иммуноблоттинге с МАК 14, и только слабая зона соответствующего молекулярного веса обнаруживается в иммуноблоттинге с антителами анти-Гг-моно. Для того, чтобы повысить уровень продукции рекомбинантного бежа, размер чужеродной вставки был сокращен за счет делеции участка ДНК между сайтами Есо781 и 4suii. Эта делеция, находящаяся в фазе трансляции БО fr, приводит к удалению участка gp51, содержащего вирус-нейтрализующий эпитоп и образованию рекомбинантного белка, содержащего 55-64 а.к. gp51. Такой рекомбинантный белок (плазмида PFR15-7) эффективно продуцируется в Е coll и, что особенно интересно, реагирует с МАК 14. Таким образом была уточнена локализация сайта связывания моноклснальных антител МАК 14: иммунологический эпитоп картируется аминокислотами 57-64.

3. Клонирование эпитопа участка preS1 вируса гепатита В

В качестве другого иммунологического эпитопа, клонированного в N-конец БО fr, использовался фрагмент preS1 HBV субтипа ayw, содержащий эпитоп моноклональных антител MA 18/7, любезно предоставленных нам проф. В.Х. Герлихом. В качестве источника фрагмента ДНК использовалась плазмида рНВ320, • содержащая клонированный геном вируса HBV субтипа ayw, первичная нуклеотидная последовательность которого была определена нами ранее. Сначала был сконструирован рекомбинантный белок, содержащий участок 20-69 а.к. из области preS1 (плазмида pFRU4). С целью получения более

короткой вставки, содержащей к тому же активный иммунологический эпитоп МА 18/7, плазмиду pFR144 расщепляли рестриктазой £со1471 и обрабатывали экзонуклеазой Ва.131. Из полученного банка клонов были отобраны рекомбинантные бежи, содержащие 22 а.к. (плазмида pFR3-7) и 4 а.к. (плазмида pFRl 1) из preS1, причем в обоих случаях с сохранением эпитопа узнавания моноклональных антител МА 18/7.

4. Структура рекомбинантных белков

4.1. Димерные структуры рекомбинантных белков на основе БО fr

Иммунологический анализ показал, что рекомбинантный БО, содержащий II а.к. с эпитопом MAKI4 (pFR15-7), а также БО, содержащий 22 а.к. с эпитопом МА 18/7 (pFR3-7), образуют линии преципитации с анти-Гг-мульти антителами, отличающиеся, однако, от линий приципитации, образуемых капсидными частицами нативного БО. Это свидетельствует о мультимерном строении образующегося рекомбинантного продукта, хотя несомненно, что структура его сильно отличается от мультимерной структуры нативных частиц.

Рекомбинантный белок, содержащий 22 а.к. из preS1 с эпитопом МА 18/7, изучался далее с целью установления структуры рекомбинантного продукта in vivo. Для этого клетки Е. coli, содержащие плазмиду pFR3-7, кодирующую рекомбинантный белок, лизировали замораживанием-оттаиванием в присутствии лизоцима, супернатант, содержащий растворимые бежи, в том числе и рекомбинантный, фракционироваж сульфатом аммония. Сконцентрированный белок смешиваж с хроматографическими маркерами молекулярного веса и наносили на колонну с сефадексом G100. Фракции анажзироваж при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН. Анажз фракций показал, что рекомбинантный белок элюируется в интервале между яичным альбумином (45 кД) и трипсиногеном (24 кД). Поскольку молекулярный вес мономера химерного бежа составляет около 16 кД, то это свидетельствует о том, что белок существует в клетках в виде димерной структуры. Этот вывод был подтвержден следующим экспериментом. Рекомбинантный белок, дважды очищенный на колонне с сефадексом G100, инкубироваж при комнатной температуре в присутствии 2,5% глутарового альдегида. Инкубационную смесь анажзирозали при помощи ПААГ-ДСН, при этом продукт, реагирующий в иммуноблоте как с МА 18/7, так и с анти-Гг-моно антителами, обнаруживался в районе 30-35 кД. Таким образом, вставка 22 аминокислот из preS1 области во 2-ю аминокислоту БО fr приводит к утрате способности рекомбинантных мономеров образовывать

капсидоподобные частицы, но не предотвращает образования димеров БО.

Рис.10. Электронная микроскопия капсидов, которые образует А)- натив-ный фаг, В)- нативный БО fr, С)- БО с мутацией Ц04 -» ТЮ4 (pFR120), D) - БО с внедренным по 2-й аминокислоте линкерным пентапэптидом (pFR 7-71), Е) - БО с внедренным по 2-й аминокислоте линкерным додекапепти-дом (pFR36), F) - БО с внедренным по 2-й аминокислоте эпитопом из учас-ка preS1 HBV (pFR11). Увеличение 400 ОООх . Электронные микрофотографш любезно выполнены В. Осе.

ИА 18/7 Эйти-Ir-MOHO

д8 pFR11 pPR11

Л8

qo

Piic.II. А - Иммунодиффузия клеточных лизатов с анти-fi—мульти антителами, В - иммуноблоттинг клеточного лизата, содержащего капсидные частицы с внедренным эпитопом из участка preS1 HBV(pFR11)

4.2. Полноразиерные химерные капсидные структуры на основе БО fr

Изучение свойств другого рэкомбинантного белка (плазмида pPRi1), несущего более короткую чужеродную последовательность с эпитопом МА 18/7, клонированную в N-конец БО fr, позволило установить, что такие рекомбинантные мономеры сохраняют самосборочные свойства и в результате взаимной ассоциации образуют капсидные частицы, по своим иммунологическим и электронномикроскопическим свойствам сходные с частицами, которые образует нативный БО fr (рис. 10, II). Изучение антигенности рекомбинантных капсидов методом иммуноблоттинга позволило установить, что химерные белки обладают антигенностью БО fr, а также антигенностью эпитопа preS1 (рис. II).

Полученные рекомбинантные частицы, несущие антигенные свойства БО fr и внедренного в его аминотерминальную часть эпитопа моноклональных антител MA 18/7, являются первым примером конструирования химерных капсидных структур с заданными антигенными свойствами на основе БО РНК-содержащих бактериофагов Е. colt.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создание первых рекомбинантных капсидов, несущих заданные антигенные свойства, на основе БО РНК-содержащего фага Тт, совпало по времени с опубликованием учеными Уппсальского университета трехмерной структуры другого фага из первой серологической группы -МБ2 [Уа1а£5агс1 et а!., 1990]. Несмотря на отличия аминокислотных последовательностей БО № и МБ2, из сравнения вариабельности, гидрофильности и рассчетных вторичных структур БО различных фагов следует, что их трехмерные структуры должны быть построены по схожим принципам. Оказалось, что в области предполагаемого нейтрализующего эпитопа, где у БО Гг предсказывается а-спиральный

домен, БО МБ2 иммет две а-спирали, не только экспонированные на поверхности частицы МБ2, но и вовлеченные во взаимодействие между субъединицами БО, что подтверждает сделанный на основе экспериментального мутагенеза вывод о невозможности использования этого участка для экспонирования чужеродных эпитогов. В то же время Ы-терминальная последовательность БО Ш2 локализуется на поверхности фаговой частицы, что делает ы-конец БО РНК-фагов, перспективным участком для внедрения чужеродных эпитопов, как экспериментально доказано в настоящей работе внедрением короткого эпитопа ргеБ1 во 2-ю.аминокислоту БО £г с сохранением самосборочных свойств последнего.

ВЫВОДЫ

1. Проделан теоретический анализ БО РНК-фагов Е. со11 на предмет поиска участков БО, пригодных для конструирования на их основе мультимерных частиц с прогнозируемыми антигенными, иммуногенными и самосборочными свойствами.

2. В результате внедрения синтетических олигонуклеотидных линкеров проведен скрининг последовательности БО гг с целью поиска участков Гг, устойчивых к внедрению чужеродных последовательностей без утраты самосборочных свойств мутантных мономеров БО. Установлено, что мутации по и- и С-концам, а также 51-й а.к. БО 1г не приводят к утрате самосборочных свойств мономеров БО, в результате взаимодействия которых образуются полноразмерные фагоподобные частицы.

3. Проведено внедрение в Ы-конец БО Гг иммунологических эпитопов белка оболочки йр51 ВГУ и белка рге31 НВУ. Экспериментально доказано образование полноразмерных капсидных структур с антигенностыо внедренного эпитопа ргеБ1, а также димерных структур БО 1г с внедренными длинными иммунологическими последовательностями ргеБ1 и gp51.

4. Сконструирован пакет векторов для экспрессионного картирования эпитопов, клонированных в составе БО Лг. Проведено экспериментальное картирование эпитопа связывания моноклональных антител МАК 14 белка §р51 ВЬУ: эпитоп картирован аминокислотами с 57-й по 64-ю.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

I. П.М. Пушко, Т.М. Козловская, Д.Э. Дрейлиня, П.П. Пумпен.

Применение дидезоксисеквенирования ДНК для прямого отбора

рекомбинантных клонов. - Препринт Института органического синтеза ЛАН. Рига, 1987.

2. G. Borisova, M. Bundule, Е. Grinstein, D. Dreillna, A. Dreimane, J. Kalis, T. Kozlovskaya, V. Loseva, V. Ose, P. Pumpen, P. Pushko, D. Snikere, E. Stankevica, V. Tsibinogin, E.J. Gren. Recombinant capsid structures for exposure of protein antigenic epitopes. -Mol. Gen. (Life Sei. Adv.), 1987, No. 6, p. 169-174.

3. T.M. Козловская, П.M. Пушко, Э.И. Станкевич, А.Я. Дреймане, Д.Я. Сникер, Э.Э Гринштейн, Д.Э. Дрейлиня, А.Э. Веиня, В.П. Осе, П.П. Пушен, Э.Я. Грен. Генноинженерные мутанты бежа оболочки РНК-содержащего бактериофага fr. - Молекулярная биология, 1988, т. 22, с. 731-740.

4. П.М. Пушко, Д.Э. Дрейлиня, А.Э. Чурксте, И.В. Соминская, А.Я. Бреде. Рекомбинантные антигены на основе бежа оболочки бактериофага fr. - В кн.: Всесоюзная конференция "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии". Тарту, 1989, с. 102-105.

5. Соминская И.В., Пушко П.М., Козловская Т.М., Дрейлиня Д.Э., Озолс Ю.А., Пумпен П.П., Грен Э.Я. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFRpSI 144, кодирующая сжтый белок оболочки бактериофага fr и участка preS1 вируса гепатита В, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia coll - продуцент сжтого бежа оболочки бактериофага fr и участка preS1 вируса гепатита В. - Авт. свидетельство СССР, положительное решение.

6. Соминская Й.В., Пушко П.М., Козловская Т.М., Дрейлиня Д.Э., Озолс Ю.А., Пумпен П.П., Грен Э.Я. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFRpSI-90, кодирующая сжтый белок оболочки бактериофага fr и участка preS1 вируса гепатита В, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia colt - продуцент сжтого бежа оболочки бактериофага fr и участка preS1 вируса гепатита В. - Авт. свидетельство СССР, положительное решение.

7. Р. Ульрих, X. Сиаккоу, К. Платцер, 3. Розенталь, Х.А. Розенталь, Т.М. Козловская, И.В. Соминская, Д.Э. Дрейлина, Ю.А. Озолс, П.М. Пушко, П.П.Пумпен, Э.Я. Грен. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFRBLVsF6, кодирующая сжтый белок оболочки бактериофага fr и белок оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia 'colt -продуцент сжтого бежа оболочки бактериофага fr и бежа оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. - Авт. свидетельство СССР, положительное решение.

8. Р. Ульрих, X. Сиаккоу, К. Платцер, 3. Розенталь, Х.А. Розенталь, Т.М. Козловская, И.В. Соминская, Д.Э. Дрейлша, А.Я. Бреде, Ю.А. Озолс, П.М. Пушко, П.П.Пушен, Э.Я. Грен. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFRBLV-Рб, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага fr и белок оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia coll -продуцент слитого бежа оболочки бактериофага fr и бежа оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. - Авт. свидетельство СССР, положительное решение.

9. Пушко П.М., Козловская Т.М., Соминская И.В., Дрейлиня Д.Э., Бреде А.Я., Осе В.П., Пумпен П.П., Грен Э.Я. Белок оболочки РНК-фага fr в качестве носителя чужеродных антигенных детерминант. - В кн.: Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Пущкно, 1990, с. 66-67.

Ю- P.M. Pushko, Т.М. Kozlovskaya, I.V. Somlnskaya, A. Brede, P. Pumpen, E.J. Gren. RNA-phage fr coat protein (fr CP) as a carrier for surface exposure of foreign antigenic determinants. - In: "Abstracts of the Vlllth International Congress of Virology". Berlin, 1990, p. 348.

11. Pushko, P.M., Kozlovskaya, T.M., Somlnskaya, I.V., Dreilina, D., Pumpen, P., Gren, E.J. A new approach for expressional mapping of linear antigenic determinants. - In: "Abstracts/-of the 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies". Budapest, 1990, p. 37.

12. П. Пушко, Т. Козловская, И. Соминская, А. Бреде, Д. Дрейлиня, А. Дишлер, В. Осе, П. Пумпен, Э. Грен. Генно-инженерное изучение антигенной организации химерных Оежов, полученных на основе бежа оболочки бактериофага fr. - Экспериментальная биология, 1990, т.2,

с. 135.

Подписано в печать 13.11.90. Тираж 150 экз. Зак. № 341. Бесплатно. Отпечатгло на Экспериментальном заводе Института органического синтеза Латвийской академии наук; 226065 Рига,

ул. Крустпилс, 53.