Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства мотива В РНК-полимеразы бактериофага Т 7

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Русакова, Екатерина Евгеньевна, Москва

61 ■ 93-2/-У

Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

На правах рук«

РУСАКОВА ЕКАТЕРИНА ЕВГЕНЬЕВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МОТИВА В РНК-ПОЛИМЕР АЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т7

03.00.03 - Молекулярная биология

Научные руководители: Член-корреспондент РАН,

д.х.н. .профессор С. Н. Кочетков

к.х.н. В.Л Туницкая

Москва -1999

1 2,

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИИ..................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.

с

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Т7 РНКГТ...............................................7

1.2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА Т7 РНКП...............................................9

1.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ЦИКЛ Т7 РНК ПО ЛИМЕ РАЗЫ

1.3.1. Взаимодействие Т7 РНК полимеразы с промотором................................11

1.3.2. Инициация и ранние стадии транскрипции................................................24

1.3.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК............................................33

1.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Т7 РНКП С ШТР И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА.................................................................................36

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1.

СРЕДЫ...................................................................................................................49

2.2. ШТАММЫ Е.СОИ, ПЛАЗМИДЫ И БАКТЕРИОФАГ......................................49

2.3. МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ................................................51

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ САЙТА ИНИЦИАЦИИ В 17 РНКП С ПОМОЩЬЮ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ..........................................................................65

3.2. УДЛИНЕНИЕ ДНК-ПРАЙМЕРА С ПОМОЩЬЮ

МУТАНТА TYR639PHE,-SER641 ALA..............................................................74

3.3 САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ JB МОТИВЕ В.................................33

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................90

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................31

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

rNTP - рибонукпеозидтрифосфат

dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

п.о. - пара оснований

н.п. - нуклеотидная пара

оцДНК - одноцепочечная ДНК

Да - дальтон

SOS - додецилсульфат натрия

ЗДТА - этилендиаминотетраацетат натрия

РНКП - РНК-полимераза

Т7 РНКП - РНК-полимераза бактериофага Т7

ПААГ - полиакриламидный гель

м.в. - молекулярный вес

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

MPE-Fe (I!) - метидиумпропил ЭДТА Fe (!!)

ДНКаза ! - ДНК нуклеаза !

ТХУ - трихлоруксусная кислота

Трис - трисоксиметиламинометан

ПЭГ - полиэтиленгшколь

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДТТ - дитиотрейтол

MOPS - 3-[М-морфолино]пропансульфоновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Одним из фундаментальных процессов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки является транскрипция -"переписывание" закодированной в, ДНК генетической информации, в РНК. Транскрипция осуществляется специальными ферментами, ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, использующими рибонуклеозидтрифосфаты (гМТР) в качестве субстратов и ДНК в качестве матрицы, на которой строится вновь синтезируемая цепь РНК.

Несмотря на то, что транскрипция изучается в течение нескольких десятилетий и накоплен огромный экспериментальный материал, многие аспекты этого процесса остаются невыясненными. В частности, механизмы действия. РНК-полимераз сформулированы лишь в самом общем виде. Это обстоятельство вызвано, в первую очередь, ограниченностью информации о третичной структуре этих ферментов, связанной с их большими молекулярными массами и сложным субъединичным составом.

& связи с этим весьма удобными, объектами для изучения различных стадий транскрипции являются РНК-полимеразы некоторых бактериофагов. Эти ферменты, как правило, состоят из одной субъединицы с м.в. около 100 кДа, обладают высокой специфичностью в отношении собственных промоторов и способны осуществлять полный цикл транскрипции от специфической инициации до специфической терминации в отсутствие дополнительных белковых факторов. Наиболее известным представителем фаговых РНК-полимераз является ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Т7 (Т7 РНКП), получившая чрезвычайно широкое распространение в

генноинженерных исследованиях в качестве инструмента для получения специфических транскриптов. В настоящее время существует ряд эффективных продуцентов Т7РНКП на основе клеток E.coli, что позволяет достаточно легко получать большие количества фермента.

В настоящей работе предпринята попытка методами аффиной модификации и сайт-специфического мутагенеза определить функциональную роль ряда аминокислотных остатков в мотиве В, одном из консервативных мотивов а бактериальных и фаговых ДНК- и РНК-полимеразах.

•т

/

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СТРУКТУРА И СВОЙСТВА РНК-ПОЛИМЕРАЗЬ! БАКТЕРИОФАГА Т7.

1.1 Физико-химические свойства 11 РНКП

Т7 РНКП, являющаяся продукте^ гена 1 бактериофага Т7 была впервые выделена из клеток Е.соП, инфицированных бактериофагом Т7 в 1969 году [ 1 ]. В настоящее время источником выделения фермента являются клетки Е.соП, несущие плазмидные векторы зкспрессии гена 1. Уровень синтеза Т7 РНКП в продуцентах такого рода достигает 60-70% тотального клеточного белка [ 2,3 ]. Подвижность Т7 РНКП по данным .электрофореза в SDS-ПААГ соответствует белку с м.в. 107-110 кДа. Коэффициент седиментации активной Т7 РНКП составляет 5,9-6,3 S, что отвечает мономерной форме белка с м.в. около ЮОкДа. [ 1,4]

В 1981 г. была установлена нуклеотидная последовательность гена 1 фага Т7 и определена аминокислотная последовательность Т7 РНКП [5,6]. Полипептидная цепь состоит из 883 остатков и м.в. фермента равен 98,092 Да. Расхождения в значениях м.в., полученных из анализа первичной структуры и по данным электрофореза, объясняются либо ошибочным определением м.в. белков-маркеров, либо аномальной злектрофоретической подвижностью Т7 РНКП в SDS-ПААГ, связанной со структурными особенностями фермента. Подобная аномальная подвижность описана, в частности, для а-субъединицы РНК-полимеразы Е.соП [ 7 ].

Коэффициент молярной зкстинкции Т7 РНКП составляет 7,4 л/(моль х см) [4 ]. В спектре кругового дихроизма Т7 РНКП наблюдаются минимумы при 222 нм ([0]гТ|=-7,9х10 град х см / дмоль) и 208 нм ([О] =-7,55x10 град х см / дмоль) и максимум при 193 нм ([0]т=1,2хЮ град к ем /дмоль) [8]. Спектр КД не менялся под воздействием высоких концентраций соли, глицерина, -8Н и хелатирующих агентов.

В работе [9] было показано, что молекула Т7 РНКП содержит прочно связанный ион двухвалентного цинка, существенный для каталитической активности, а добавление хлористого цинка повышает активность фермента. Однако по другим, более поздним данным, ион цинка не влияет на каталитическую активность. По данным работы Кинга и соавторов [10], добавление в реакционную смесь 5мМ ЭДТА не влияло на активность 11 РНКП, в то время как ион цинка ингибировал фермент при концентрациях >10мМ. Известно, однако, что многие другие зависимые от матрицы нукпеотидилтранферазы также содержат 1п2+.

Данные работы [ 11 ] показывают, что фермент легко расщепляется протеазой связанной с мембраной клеток Е.соН, с образованием двух стабильных полипептидных фрагментов ( с молекулярной массой примерно 80 и 20 кДа). Расщепление происходит преимущественно между аминокислотными остатками !_уз-172 и Агд-173. Более подробно свойства протеолизованной формы Т7-полимеразы были исследованы в работах [12,13]. Оказалось, что молекула фермента в результате протеолиза распадается на два фрагмента, имеющие м.в.=75000 и 20000 соответственно. Протеолитически расщепленный фермент сохраняет РНК-полимеразную активность, однако его удельная активность уменьшается примерно в 3,5 раза. Транскрипты, синтезируемые

протеолизованным ферментом, заметно короче, чем при использовании нативного фермента. Также на ро1у(с!А) матрице протеолизованный фермент проявляет повышенную способность к терминации по сравнению с непротеолизованным ферментом. [12] Больший ( С-концевой ) фрагмент Т7 РНКП также частично сохраняет ферментативную активность. Однако длина транскрипта в зтом случае не превышает 6-8 звеньев [11,13 ].

1.2. Пространственная структура Т7 РНКП

Т7 РНКП является единственной РНК-полимеразой, для которой построена пространственная модель, учитывающая укладку полипептидной цепи. Первое сообщение о кристаллизации Т7 РНКП появилось в 1989 году [14], однако качество кристаллов, описанных в этой работе, было невысоким. Позднее была опубликована пространственная структура Т7 РНКП с разрешением 3,ЭА° [15] (рис.1). Такое разрешение не позволяет локализовать атомы боковых цепей аминокислотных остатков, однако позволяет определить положение Са-атомов и укладку полипептидной цепи.

Молекула Т7 РНКП имеет размеры 75x75x65 А° и характеризуется высоким содержанием а-спиралей. В структуре просматривается два домена -большой и малый (!Ч-концевой); большой домен, в свою очередь, разделен на 2 субдомена - центральный и С-концевой. Пространственная структура большого домена весьма схожа с известными структурами полимеризующих доменов односубъединичных ДНК-полимераз - ДНК-полимераз Е.соН (фрагмент Кленова) [ 16 ] и Т.адиаИсиз [ 16 ], обратной транскриптазы ВИЧ-1 [ 16 ] и эукариотической ДНК-полимеразы р [ 16 ] и по форме напоминает правую руку

человека с сформированными "ладонью", "пальцами" и "большим пальцем".(рис.1). Между этими структурными элементами расположена щель длиной 60 А°, шириной 15-25 А° и глубиной 25-40 А°. По аналогии с другими полимеразами предполагается, что здесь формируется центр связывания матрицы. Размеры щели допускают размещение в ней почти двух полных поворотов двуспиральной молекулы ДНК.

Рис.1 Кристаллическая структура Т7 РНКП [15].

Данное обстоятельство хорошо согласуется с данными футпринтинга ДНКазой I и метидиумпропил ЭДТА Яе (II) (МРЕ-Яе(Н) комплекса фермент-матрица, в соответствии с которыми Т7 РНКП защищает -20 п.н. ДНК-матрицы [17,18].

1.3. Транскрипционный цикл Т7 РНК полимеразы

1.3.1. Взаимодействие Т7 РНК полимеразы с промотором.

Транскрипционный цикл, осуществляемый РНК полимеразами, состоит в общем виде из ряда последовательных этапов: связывание с матрицей (промотором), инициация транскрипции, элонгация или собственно синтез РНК, терминация и сход полимеразы с матрицы. Как для бактериальных [19], так и для фаговых РНК полимераз каждый этап включает целую серию отдельных реакций [20]. Для описания общего механизма инициации транскрипции, осуществляемой РНК полимеразой Е.соИ, Страни и Крозерс [21], а также Бак и Макклюр [22] предложили многостадийную модель, которая в основных чертах применима и РНК полимеразам бактериофагов, в частности - Т7 РНКП. На первом этапе свободные РНК полимераза ( Р-) и промотор ( Р) ассоциируют с образованием специфического закрытого комплекса ( Р.Рс ). В закрытом комплексе происходит плавление определенного участка промотора с образованием инициационно компетентного открытого комплекса (Р.Ро). Открытый комплекс инициирует синтез первых нескольких звеньев цепи РНК (КР1 ) и, в конце концов, превращается в транскрипционно компетентный или элонгационный комплекс ( )(1):

4МТР

(1)

Хотя в настоящее время имеется много экспериментальных подтверждений данной схемы, детальное изучение каждого из этапов весьма затруднено. В основном это связано с тем, что Т7 РНКП осуществляет

транскрипционный цикл значительно быстрее, чем РНКП E.coli : скорость элонгации достигает 230 межнуклеотидных связей / сек [24] при 37° С, т.е. примерно в 10 раз быстрее, чем у бактериальных полимераз [19], что делает проблематичным экспериментальное выделение только одной из стадий.

Транскрипция гена 1, кодирующего Т7 РНКП, осуществляется РНК полимеразой хозяина - E.coli. Дальнейшая транскрипция генов бактериофага проводится Т7 РНКП с использованием т.н. поздних промоторов, специфичных исключительно для этого фермента [ 20 ]. Т7 РНКП не проявляет сродства даже к промоторам, присутствующим в геноме почти идентичного по структуре с Т7 бактериофага фага ТЗ [ 1, 20 ].

В геноме фага Т7 присутствует промоторы трех типов. Промоторы типа I, по-видимому, участвуют в инициации репликации фага, тогда как промоторы типа I! и !!! регулируют транскрипцию генов фаговых белков двух разных классов [25-28].

В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность бактериофага Т7 и определены структуры промоторов. Характерной чертой взаимодействия Т7 РНКП с промотором является относительно низкое значение константы диссоциации (10"7 М), что на 2-3 порядка ниже такового для бактериальных РНК полимераз [ 8 ]. Тем не менее, низкое сродство никак не сказывается на специфичности взаимодействия.

Т7-промоторы существенно отличаются от промоторов генома клетки-хозяина - E.coli. Размеры фаговых промоторов меньше, чем у последних. В целом для промоторов фага Т7 характерно обогащение А-Т-парами, и обнаруживается два участка, состоящих исключительно из этих оснований. Для промоторов фага Т7 характерна также консервативная последовательность

(консенсус) протяженностью в 23 п.н., занимающая положение от -17 до +6 (рис.2). Эксперименты Икеды и Ричардсона по футпринтингу комплекса Т7 РНКП - промотор с использованием метидиумпропил ЭДТА Ре(!1) (МРЕ Ре (II) [ 13,17 ], показали, что Т7 РНКП защищает на обеих цепях ДНК участок, находящийся приблизительно от -21 до -3.

-17 10 -5 +1

77 Т А А Т А С G А с Т С А С т А Т A G G G А G А

ТЗ А А Т Т А А С С с Т С А С т А А A G G G А G А

К11 А А Т Т А G G С с А С А с т А Т A G G G А G С

SP6 А Т Т Т А G G т G А С А с т А Т A G А А G А G

СВЯЗЫВАЮЩИЙ ИНИЦИАТОРНЫЙ

ДОМЕН ДОМЕН

Рис. 2 Консенсусные последовательности промоторов класса Ш бактериофагов Т7, ТЗ, К11 и SP6. Обведены идентичные участки. Подчеркнуты "триплеты специфичности" (см. в тексте)

Результаты группы Бургесса [ 29,30 ] принципиально не отличаются от ранее приведенных результатов. С той лишь разницей, что 5'-граница защищенной области располагалась ближе к месту старта РНК и зависела от типа промотора : (-20 ; -4) для консенсусного промотора класса Ш и (-17; -4) для того же промотора, но с измененной последовательностью в области (-22; -18). Следует учесть, что метидиумпропильная группа МРЕ Fe(!!) преимущественно интеркалирует и вносит разрывы в двойную цепь ДНК. В то же время показано, что при связывании с промотором РНК полимеразы расплетают некоторую часть последовательности около старта, что может привести к "ложной защите" одноцепочечного участка от МРЕ Fe(ll). Более поздние эксперименты Мюллера и соавт. [31] с использованием неинтеркалирующего агента Fe (II) ЭДТА,

образующего в растворе свободные гидроксильные радикалы, давали лучшее разрешение и выявили два дискретных участка, защищенных Т7 РНКП: (-17;-13), (-7;-1) на кодирующей цепи ДНК и (-14; -9) ,(-3; +2) на некодирующей.

Для понимания механизма связывания Т7 РНКП с промотором полезно выделить те структурные особенности , которые делают промотор легко "узнаваемым" полимеразой среди прочих последовательностей ДНК. Несмотря на высокую степень структурного сходства, все фаговые РНК полимеразы исключительно специфичны в отношении своих промоторов.

Многие авторы пытались ответить на вопрос: какие элементы промотора участвуют во взаимодействии с полимеразой. С этой целью в одной из наиболее ранних работ Остермана и Колемана было предпринято делеционное картирование [ 32]. Оказалось, что удаление нуклеотидной последовательности слева от позиции -22 не влияет на активность промотора, тогда как разрезание по сайту НтА (С/ АМТС), содержащемуся практически во всех Т7 промоторах, и, как следствие, удаление последовательности слева от -12 полностью промотор инактивирует. Интересно, что лигирование такого "укороченного" промотора с произвольной негомологичной последовательностью в некоторых случаях восстанавливало активность [32, 26] Из этого авторы сделали вывод о достаточности всего 12 п.о. (-11 - +1) для специфического узнавания. В ходе дальнейшего анализа оказалось, что в результате лигирования восстанавливались хотя и не все, но некоторые из консервативных пар оснований, наличие которых и определяло активность гибридных промоторов [30].

Мартин и Колеман [33] установили, что олигонуклеотиды, представляющие консенсусную промоторную последовательность вплоть до

позиций -17 или -19 и обеспечивающие синтез коротких пентануклеотидов, эффективно используются 17 РНКП в качестве промоторов с константами к С£й

л

= 50 мин и Кт=0,02мкМ. Укорочение промотора слева до -14, существенно ухудшает связывание (Кт=0,3 мкМ), практически не влияя на максимальную скорость транскрипции (к сгЛ=30мин"1). Сокращение промотора до -12 , полностью инактивирует промотор.

Аналогично был исследован и вклад отдельных цепей ДНК в специфическое узнавание промотора и инициацию транскрипции. Предполагалось, что те элементы промоторного узнавания, которые требуют специфичных черт двойной спирали, должны быть особо чувствительны к делетированию той или иной цепи ДНК. Если же полимераза "просто" узнает определенную последовательность на одной из цепей ( в расплавленном состоянии ), то такое взаимодействие должно быть чувствительно к изменениям конкретно в этой цепи. Оказалось, что в случае неактивного укороченного до -12 промотора, удлинение только кодирующей цепи до -17 не улучшало ни Кл, ни Кт. Восстановление же только некодирующей цепи