Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены термостабильного энтеротоксина грамотрицательных бактерий. Строение и применение в генотехнике

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гены термостабильного энтеротоксина грамотрицательных бактерий. Строение и применение в генотехнике"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЕЮОРГЛНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ¡¡ШШ1НА

На правах рукописи МИКУЛЬСКИС Алъвидас Владовэт

ГЕШ ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА

ГРАГгЮТРЩАТЕЛЬШ БАКТЕРИЙ. СТРОЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕНОТЕХ1ИКЕ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

дисеорташш па соисканло ученой стелога кандидата йяологшгеских наук

Москва - 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганичоской химии им. М.М.Шемякина РАН

Научный руководитель -кандидат зшмических наук В.Г.Коробко

Официальные опонанты -доктор химических наук Ю.А.Берлин

кандидат химических наук С.Г.Попов

Ведущая организация -Институт биологии гона РАН

Защита состоится 25 марта 1992 г. в 10°° часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии т. М. У. Шемякина РАН по адресу: 117871, Москва. В-437, ул. Миклухо-Маклая. 16/10 С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

Автореферат разослан.

г.

Ученый секретарь Специализированного совато КБХ ш. Ы.И.Шешшша РАН кандидат химических наук

В. А. Неснеяно;

г'-'" /

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем;. В1фус яадро вызывает высококон-тагисзное заболевание парнокопыишх сельскохозяйственных животных, наносящее значительный ущерб странам с внсокоразви-тим животноводством. В настоящее время в.качестве вакцины против инфекции используют инвктивировзшшП вирус. Хотя такая Еакцина достаточно эффективна, главным недостатком еэ применения является вспышки заболевания, вызванные неполностью шакгивировашгам вирусом. Поэтому представляется актуальным и важным развитие альтернативных методов получения вакцины против вируса ящура.

Недавно рядом исследователей было установлено, что короткие синтетические пептиды, включающие аминокислотные последовательности I4I-I6Q бежа оболочки VP1 вируса ящура штаммов 0tK и Агг, способны вызывать образовать значительного уровня влруснейтрализукхцих антител при иммунизации ими в виде конъюгатов с Оэлком-носителем. Наилучшие результата; были достигнуты при иммунизацш ЗВ-40-звенными пептида?,ш, состоящими из аминокислотных последовательностей 200-213 и I4I-I58 белка VP 1, соединенных трипептддннм линкером, в свободном состоянии или в виде конъюгатов. Однако, использование синтетических пептидов, состоящих из 38-40 звеньев, в качестве вакциш вряд ли экономически целесообразно при современном уровне развития пептидного синтеза.

Отмеченные трудности в создашш субъединичной вакцины можно преодолеть, используя для синтеза иммуногенного пептида технологию рекомбкнантнкх ДНК. Существует люкество эука-риотичоских и прокариотических систем, пригодных для решения поставленной задачи. Escherichia coli - наиболее простая в обращении и хорошо изученная бактерия, с успехом применяемая для биосинтеза рекомбшшнтных белков In vivo. Однако попытки прямой экспрессии генов пептидов в В.coli столкнулись с большими трудностями, одна из которых заключается в том, что продукт трансляции нестабилен и быстро деградирует под действием внутриклеточных протеаз. Для некоторых случаев эту проблему удалось решить путем биосинтеза пептидов in vivo как компонентов гибридных белков или в виде предшественника,

состоящего из соединенных между собоП нескольких копия самого пептида.

Наряду с этим подходом существует другая возможность экспрессии гонов пептидов в Б.cotí путем использования сигнальных последоватолыгостпя, няпрагшинцдх секрецию белковых продуктов в леринлагматичоское или мюклеточноо пространство- При этом целосообразно попытаться использовать существующий природные механизм» биосинтеза пептидов в К.coll и других родственных бактериях.

С этой точки арония большой интерес представляет изучение строения генов термостабидышх энтеротскошюв некоторых линий Escherichia coli (eat Л 1) и Yersinia ente^ocolIt lea (yaí). Полученная информация поможет понять механизм; синтеза относительно коротких пептидных токсинов в прокариотпчес-ких клетках. Возмоюю, нодобшй путь биосинтеза будет приемлемом для экспрессии генов некоторых чукеродашх пептидов (например, штигешшх детерминант вируса ящура) в Escherichia col I.

Изучение строения генов термостабидышх энтеротоксинов грамотрицотельных бактерий имеет большое значение также для медицины и веторшзрии. Диарея, вызванная энтеротоксигеншми штаммам! бактерий, широко распространена среди людей и животных.. Поэтому очень важно разработать эффективные средства тестирования, и типирования таких возбудителей болезни в клинических условиях. Подученные структуры гонов тэрмостабнль-шх энтеротоксинов помогут разработать комплекс ДНК-зондов, пригодных для решения данной задачи.

Цель работа. Настоящая работа посвящена изучению строения и экспрессии гонов термостабильннх энтеротоксинов Escherichia coli я Yersinia enterocoltt lea и исследованию возможности создания на их основе векторных систем для экспрессии в E.coll генов, кодирующих короткие пептиды, на примере ан-тигеннмх детерминант вируса ящур» подтипа Арг. Составной частью работи является изучение возможности использования фрагментов клонированных, генов в качестве ДНК-зондов для тестирования и типировашя природных штаммов энтеротоксиген-ных бактерий с помощью гибридизации колоний in situ для разработки эффективных систем их тестирования и типирования.

10 20 30 40 50

---------т----.-----г---------г-----.----1-----.----т

eatAl АТОАЛААЛаСТАСТСТТаССААТТТТТАТТГСТОТАТ'ГЛГСТаТССССТС Yat ATOAAGAAGATAGMTrri;n'CTTOTi;mATOCTGTOTTCATTTGGAGC А

STI MetLyuLysLeuMutleuAlallel'hel] eSurYalLeuSerPheProSer YST Metlyfil^aXleValihoValLeuViilLftuMotLeuSerSopPhoGlyAla

60 70 60 90 100

C3tA1 TTTTAGTCAG'IVMGTGAATCAOTTGACTCTTOAJAAGAGAAAATTACAT Yat ATTOGGCCAAGAAAOAGTTTCAGGGOAGITGAGTGATGCATTATCGAOAO

STI PheSeiClt^'.a'ThrtlaSerLeuAupaji-Serlo'aGluLyallt'ThrLeu YST PheGlyGlnGluThrValSerGIyClnPheSerAtipAlaLeuSert'hrPro

110 120 130 140 150

----- _---------- _----т----,---------.----T----.-----T

eatAl TAGAGAOTAAAAAGTGTGATGTTGTAAAAAAOAAOAGTGAAAAAAAATCA Ydt CAATAACCGtJTGAGGGATACAAGCAAGCiTGTGATCC'rCCGCTGCCACCA

V TC

sti g1 uthrlytjlyecyyahpvalval lybabnaknsergluxyuijyaser yst 11 eThrA iaG l uu l yly rly в GlnA laCy sAepProProLeuProPro Val Ser

160 170 180 190 200

---------+-----.----f----.----+----.----+----.----+

eatAl GAAAATATGAACAACACAT'ITTACTGCTGTGAJG'ITTGTTGTAATOCTGC Yat GCCGAAGTCAGTAG'fGA'L'TGGGATTGOTGCGATGTATGTTGCAACGCAGO

т т С

sti GliiAtinMetAanAanThrPheTyrCyoayBGluIeuCyeCyeABnProAla yst AlaGluValSerSerAspTrpAepCysCyBAapValCyBCysAeaProAla

210 220

eatAl ctgtgctggatgttattaa

Yet GTGTCGTCGCTGCTAO

sti CyeAlaGlyCyeTyrTer YST CyoAlaGlyCyoTer

Рис.2.11уклоотид1ше последовательности структурах гонов тер-мостабилышх антерогоксинов E.coll (eatAl) и Y.enterocoliti-са (¡/яг), н кодируемое ими аминокислотные последовательности белков-ггродшоствемшков S'PI и YST. Жирним шрифтом видолени последовательности секротнруемих токсшюв. Показаны отличия в структуре гена yat и кодируемого им белка по сравнению с опубликованной ранее (I.Dellor et al, 1990)

Структурно ген estAí выделяли из гслазмидо pSPSTI и мутаге-■шзировали с помощью полишразной цепной реакции с использованием нрайшров CATCGAATCGATATCAAAAACCTAATG'H'GGC (VIII) л GTCTATGAAGCT'IAATAACA'fCCAOCACAGGC (IX). Полученный после амплификации фрагмент ДНК для генерации "липких" концов гидро-лизовали смесью рестриктаз ClaL ¡i HinüIIl и клонировали в шгазмиду рТКГЗЗ!4, как показано на рпс.З. В результате получили рекомОш!антную плазмиду pA23STl, детермшшрущую конститутивную экспрессию гена тормосгэбильного энтеротоксина E.coli.

Для изучения экспрессии гена eatAI нлазмидой pA23STI трансформировали компетентные клетки В. coil SG2005Ü i Ion'). .Наличие термостасильного энтеротоксшш в культуралыгой жидкости проверяла! при помоет игалуно-дот-слоттинги с поликла-нальшш антителами к синтетическому шптиду (рис.6), а также по биологической активности на мышах-сосунках. Получошшо результат свидетельствует о высоком уровне экспрессии тш eatAI, что делаог перспективным использование сконструированного нами штамма для препаративного выделения энтеротоксшш.

Следует отметить, что аналогичные напитки клонировать выделенный наш ген у at в ллазмиду рТМУ3314 .не увенчались успехом. Причиной этого может бить либо токсичность продукта гена ysf, либо накопление непроцессировашюго продукта в мембране E.coli из-за различий в механизмах созревания этого токсина.

3. Конструирование плазмпд для экспрессии в Е.соИ гена составной антигенной детерминант» вируса ящура посредством .слияния его с генами термостабилыщх зптеротоксинов E.coli и Y.enterocoUtlca

Ранее в груше химии генов ШЗХ км. М.М.Шемякина РАН хи-мико-фермвнтвтившм способом бил синтезирован ген составной антигенной детерминанты вируса ящура (¡rnd), кодирующей пептид, состоящий из аминокислотных последовательностей 200-213 и I3I-I60 капсидного белка VP1 вируса атамма k¿z , соединен-1шх коротким пептидным линкером; гго-Рго-Бег-?гс. Сиктеткче-

Рис.3.Схема конструирования рекомбинанткой плазмида pA23STI

скпй гея frnd Сил затеи ели т с геном лейкоцитарного а2-интер-ферона человека (t/u), в результате чего Сила получена плазмида pPMDIU, в которой гибридный ген tfn-fmü зкспресспрувтся под контролем промотора гена VIII (FVTII) бактериофага М13. Эту плазшду ш использовали как источник гоноквпвзлоита антигенных детерминант вируса ящура.

На нервом этапе для прямой экспрессии генов антигенных детерминант в E.coli мы решили использовать механизмы öiro-аштеза тормостабилышх эитеротоксинов, которые включают специфическое отщепление пептида от прздаестозшика поело трапелокацяп через внутренний кембргну бокгорф, Поэтому :,ш предприняли конструирование гибридных гонов, б которнх reim ерр и урр, кодирующие пре-про-последоБатольности токсинов из E.coli и Y.enterocolitica.Oujai слиты с гепзкипзалонтом я:;;ур-

пол антигенной детерминанта (fmd). Конструирование гибрид-1шх генов проводили при помощи двухстадийной полимеразной Цбгшой реакции с использованием олмгонуклеотидиих затравок

(X)-(XII), как показано на рис.4.

GTGAAAAAAA/rCAGAAAATGATCCTTGTTGTAGАСАСЛА (X)

_i '__

epp fml

CTCGCCAAGCTTAAGTCGGAA (XI)

GCTGAGGGATACAAGCAAGCATGTTGTAGACACAAACAGAAAA (XII)

__i i___

UPP №

Для этого сначала при помощи полимеразной цепной реакция амплп.рпцировали фрагмент Д!Щ, кодирующий составную антигенную детерминанту вирус:) ящура {fmd). При этом в качестве матрицы использовали ДШ плэзмндц pFMDIO, а качестве затравки - синтетические елигонуклеотиды (X) и (XI). Лолученшй таким образом двухцепочечниЯ фрагмент Fl, в котором порше 20 пар основания ни 5' конце нирекриваытся с 3'-концевой последовательностью ерр, бил использован для повторной амплификации в присутствии плазмпды pSrSTI и праймеров (VIII) и

(XI). Продукт шлимеразной цепной реакции обработали избытком рестриктаз Gtal и Í/Oidlll, в результате чего получили двухцепочечный фрагмент EF1, содержащий гибридный ген ерр-fmú, фланкированный необходимыми для дальнейшего клонирования сайтами эцдонуклеаз рестрикции Clal и HlndUl.

Аналогичным образом двухстадийной гюлимеразной цепной реакцией бия получен двухценочечный фрагмент ДНК YI'2, содержащий гибридный ген ypp-fmd (рис.4).

1'ш первом этапе для конститутивной экспрессии получон-шх гибридных генов ерр-fmd и ypp-fmd, ми питались использовать вектор pTIJF3314. Клонирование проводили по сайтам рест-риктаз Clal и HlndUl аналогично тому, как это было сделано в случав est AI (рис.3). В качестве реципиентов использовали клетки E.coli UBI Ol (Reef) и E.coll MJ1 (Ree/). При этом оказалось, что в случае клеток E.coll НВ101 не било получено ни одного клона, содержащего искомый гибридный ген, в то время как использование штамма Е.сolí MJ1 (Нес/) дало несколько десятков колоний. Однако, прямое определение нуклео-

Рис. 4. Схема консгрунроващя рекомСштнтних плазмид pLEF и pLYF

тидаой последовательности ДНК фрагментов EF1 или YF2, зонированных в плазмиду pTNF3314 но сайтам ростриктаз Clal и Hlnälll, показало, что все двадцать исследованных рекомби-нантных плазмид содержали функционально наактивные гибридные гени с точечными мутациями. Полученные результаты приводят к предположению, что кодируемые гибридными генами epp-fmä и ypp-fmd белковые продукты являются при конститутивном биосинтезе токсичными для использованных штаммов E.coll.

Для проверки этого предположения мы предприняли клонирование фрагментов EF1 и YF2 в плазмиду pSKTNF, которая содержит lac-промотор, синтетический участок инициации трансляции и подходящие для клонирования сяйты рострштаз Clal и HlndlII (рис.4). Таким образом, были получены рекомбинантные плазмнда pLEF и pIYF, в которых экспрессия гибридных генов epp^fvui и ypp-fmd находится под контролем lac-промотора.

Для изучения экспрессии генов epp-fmd и ypp-fmd в качестве реципиента использовали клетки E.coll SG20050. Уровень биосинтеза гибридных белков определяли при помощи ELISA и иммуно-дот-блоттинга с поликлоналыюй кроличьей антиснворот-кой против целого вируса ящура подтипа &гг. При этом оказалось, что ни один из использованных методов не дал полоки-тельного результата при анализе суммарного клеточного белка бактерий, содержащих плазмида pLEF и pLYF. В то ке время с помощью иммуно-дот-блоттинга было зафиксировано наличие антигенной детерминанты вируса ящура только в культуралыюй жидкости клеток E.coli SG20050, содержащих плазмиду pLEF. Следует, однако, отметить, что в этом случае отношение сигнал/фон было маленькое,что свидетельствует о невысоком уровне экспрессии гибридного гена epp-fmd в E.coli (рис.6).

На следующем этапе наших исследований мы сконструировали два других гибридных гона epp-find-stl и ypp-fmd-stl, которые отличаются от двух предыдущих гибридных генов тем, что на 3'-конце дополнительно содержится ген stl, кодирующий последовательность зрелого токсина STI E.coll. Целесообразность получения таких конструкций была обусловлена следующими причинами. Во-первых,'гибридный белок, состоящий из составной антигенной детерминанты вируса ящура и энтеротоксина E.coll, может оказаться эффективной вакциной как против ви-

Рис. 5. Схема конструирования рокомбинантшх плазмид pLEFST и pLYïST

руса ящура, так и против бактериальных возбудителей диареи. Во-вторых, в литературе появились дашше о важной роли С-концевой части предшественника тершстабильного. энтеротокси-на SÎ7 Z.col I в секреты зрелого токсина а среду. Таким образом, можно было предполокитъ, что кодируемые гибридными генами epp-fmd-stl и ypp-fmd-atl белки будут правильно про-цессироватъся и секретироваться во внеклеточное пространство.

TTGCTGCÏCAGCTTCCGACTATGAACAACACATTTTAOTGC (XIII )

_____I 1__

Jul atI

Слияние гибридных генов epp-10fmd и урр-Юрж! с кодирующей последовательностью att зрелого токсина проводили, как и раньше, при ломовд дьухетадиЛной полим"разной цепной реакции, как указано на рис.5. Сначала получили двухцешочочный фрагмент ДНК S1, содержащий ген at t амплификацией плазмиди pSPSTI в ггрисутствии олигонуклеотидных праймеров (XIII) и (IX). Дальнейшие конструирование проводили,, используя те же процедуры,что и при получении плазмид pLEF и pLYP. В результате били получены рекомбшантпие плазмиди pLEî'ST и pLYÏSÎ, в которых экспрессия гибридных генов ej/p-fml-att и ypp-fmd-att находится под контролем lac-промотора транскрипции.

Экспрессию гибридных генов epp-ßnd-ntl и ypp-jmd-atl в метках E.coll SG20050 исследовали с помощью иммунохимиче-скнх методов. При этом использовали не только онтисыворотку против вируса явдра, но и поликлональние кроличьи антитела, полученные против синтетического термостабильного энтероток-сшга STI E.coll. Результаты анализа суммарного бежа клеток или культуралыюй кидкости бактерий, содержащих шшзмиду pIYFST, не дали положительного ответа ни с одним из антител. В случав плазмида pLEFST, содержащей гибридный ген epp-fmd-stl, иммуно-дот-блоттингом (рис.6) н твердофазным методом .ELISA было зафиксировано наличие продуктов икспроссии 'гена epp-fmd-atl в культуральной кидкости и внутри клеток. Однако, уровень экспрессии, как и в предыдущих опцтах, бил невысокий, поэтому детальный анализ рекомбгаантшх балков с помощь» SDS-ялектрофореза сказался невозможным. Вследствие SToro весьма затруднительно' сделать вывод о структуре про-

Рис.6. Иммуно-дот-блот-■20 тинг с поликлоналышми антителами против синтетического термоста-Сильного энтеротоксинв В.coll (I) и вируса ящура (2). Нанесены (мкл) супернатанты клеток Е.соИ SC20050, не •-I .содержащих плазмид (1а, 2а) и содержащих плаз-миды pA23STI (16), pLEFST (1в,26) И pLEF (2в)

дуктов экспрессии гибридного гена epp-fmdstl. В то зке время, учитывая четкое взаимодействие секретируемих продуктов в иммунс-дот-блоттанге с антителами против токсина, а такие наличие биологической активности на мышах-сосунках, мокно предположить, что имеет место отщепление пептидного токсина от гибридного белка. Что касается присутствия последователь-кости алтигошгой детерминанты, то окончательный вывод сделать затруднительно из-за высокого фона при проведении тгчу-ноанализа.

На следующем этапе исследования с целью оптимизации экспрессии гибридных генов epp-fmrt, ypp-fnri, epp>-fmd-3tt и ypp-fKxl-ät I ми решили использовать более сильны!* промотор транскрипции, а именно, tос-промотор. В качество вектора для клонирования упомянутых генов была использована гогазмида рКК223-3. Замену промотора осуществляли простой рекомбинацией, как показано на рис.7. В результате были получены реком-бинан'пше плазмкда pTEF, pTYF, p/TEFST и pTYÍST, в которых экспрессия генов epp-fmd, ypp-fmd, epp-fnei-at I, ypp-fmd-atl находится под контролем íас-промотора транскрипции.

Экспрессию гибридных генов epp-fmd, ypp~fnd,epp-fmd-3t i и ypp-fmd-stl изучали в штатах E.coli XL—1 Blue и JM101, обеспечивающих индуцируемый Сиосинтез гибридных белков. Наиболее четкие результаты получены при использовании штамма

20 15 ■ 10

& ; ЛЬ,

* G

&

ф о

б в

JL:

б в

5

ßeeUI

Ша dlH

, w hind hi

ЯеавЛ

ШайШ

ЛсоК1

ШайШ

F! - fm'J Ш -W □ - □ - «i

l'iïc. 7. Схема KoacrpyiipoBcunifi рвкодсЬшаытшх ядвзшщ p№?. pîïf, pTEFST и pTYTSÎ

Таблица 1. Анализ экспрессии галоп epp-fiui, урp-fimi, epp-fwi-stl и ypp-prrt-et( в клетках E.coli JMI01 при помощи твердофазного метода ELISA с антителами против цолого вируса ящура подтипа Аэ,

Ллазми-да Индукция IP'i'G Тип образца Разбавление образца

1:1 1:Ю4 1 :Ю5

pl'EP + t * * K.K. к .ж. кл.оГ" КЛ. б . 0.723* 0.564 1. .¡38 1 .400 0.72! 0.226 о.з8 а 0.221

pTYF + + к.ж. к.ж. КЛ.б. 1UI.Ö. 0.742 0.632 1.654 1 .520 0.507 0.49Ö 0.448 0.224

pTEFST + + к.ж. к.ж. КЛ.б. КЛ.б. 0.732 0.664 1 .в! б 1 .702 1 .137 0.496 1 .179 0.368

pTYFST + 1С.к. к.к. 0.782 0.5!6 ; -

' - АЙ90'

*» ■ культуральная жидкость, й«* - суммарный клеточний белок

Е.соН ЛМ101. Результата анализа при помощи твердофазного метода ЕИ5А с поликлоналышми антителами против целого вируса ящура подтипа кгг представлена в таблице 1. Видно, что все штамми способны при индукции синтезировать продукт, вза--имодайствумций с антителами против вируса ящура. Следует от-

-"Ч

HiailU Bi

Рис. 8. Физическая карта плазмида pTTQ8. Указаны сайты узнавания ростриктаз. iacrQ- мутантиий ген Zac-penpeccöpa

метить, что мы столкнулись со значительными трудностями при культивировании, так как штаммы E.coll, содержащие плазмида' pTEF, pTYF и pTEPST при продолжительной индукщш IPTG подвергались частичному лизису, а в случае плазмиды pTYFST наблюдался полный лизис культуры.

Чтобы преодолеть возникшие трудности и иметь возможность осуществлять контролируемую экспрессию гибридных генов независимо от генотипа штаммов E.coll, мы переклонировали эти гены по сайтам EcoRI и tfindlll в вектор рТТШ (рис.8). В результате были получены рекомбинышше плазмиды pTQEF, pTQYF, pTQEFSF и pTQYFST, которые содержат помимо гибридных генов ген ропрессора loci4, причем транскрипция гибридных генов как и в плазмиде рЮС223-3 контролируется iac-промото-ром.

Для изучеш!я экспрессии рекомбштнпшх генов плазмидами pTQKF, pTQYF, pTQEPST и pTQYFST трансформировали клетки E.coll 1IB101. Через 3 и 17 час. после индукщш IPTG отбирали образцы культуральной жидкости и анализировали при помощи твердофазного метода ELISA с антителами против вируса ящура. Полученные результаты (табл.2) свидетельствуют о наличии в культуральной жидкости пептидных продуктов, в состав которых входит антигенная детерминанта вируса ящура, хотя уровень биосинтеза рекомбиланпшх пептидов оставался все еще недостаточным для их детекции при помощи SDS-электрофореза.

Таблице 2. Алализ экспрессии генов epp-fmcl, ypp-fml, epp-fml-atl и ypp-fmd-atl в клетках E.coll HD101 при помощи твердофазного метода ELISA с антителами против целого вируса яацгра подтипа А

Плазмида Индукция IPTG Продолжительность индукции (час.)

3 17

pTQEF + 0.575 0.316 0.401 0.198

pTQY? 0.708 0.253 0.403 0.320

pTQEFST + 0.513 0.325 0.757 0.173

pTQVTST + 0.582 0.390 0.366 0.354

4.Конструирование плазмиди для экспрессии в E.coll. гена составной аитигешюй детерминанты В1фуса ящура путем его слияния с искусствошшм геном ТкС-связывающего фрагмента

Можно было предположить, что невысоки!! уровень биосинтеза ящурной антигенной детерминанты в составе пептидов с прз-про-послодовательностями термостабильшн гнтеротоксинов обусловлен осоОешюстями структуры антигенной детерминанты, приводящими после транспорто в периплазматическое пространство к нарушению клеточного гомеостаэа. Для проверки этого предположения мы решили использовать широко апробированную ранее систему экспресс™ генов коротких пептидов на основе

структурных элементов болкл А из S.auretia.

С этой целью в качество вектора для клонирования мы использовали сконструированную в лаборатории белковой инженерии ИБХ им. М.М.Шемякина Pili плазмиду pUCL.?. Эта плэзмидя содержит синтетический ген (оора), кодирующий сигналима налтид и тандем двух IgG-сияанв-эших домоиов бежа А, и удобные для клонирования сойти рестриктаз. Схема конструировать рекомбтшнтной плазмиды рЬРЛР, содержащей гибридный ген aopa~/md, показана на рис.9. Мы исследовали экспрессию гибридного гона eapa-fiKi в разнил штаммах Е.соН. Наилучшие результаты были получены в штамме Е.соН ИВ! 01, в котором гибридный белок синтезируется конститутивно.

Для характеристики рекомбинантних белков мы использовали метод иммуноблоттинго с поликлоналыюЯ антисывороткой против вируса яадра. Оказалось, что этим методом гибридный белок детектируется как в цитоплазме, ток и в периплазме клеток (рис.ЮЛ). Следует отметить, что гибридный белок подвергается частичная деградации в клетках Е.соН. Мы предприняли выделение рекомбянантных белков из всех клеточных фракций и культуралыюй яэдкости с поуощью аффшшой хроматографии на колонке с TgG-сефзрозой. Очтцошгао таким образом препараты анализировали с помощью алекгрофореза в SDS-IUAT (рис.JOB). Подученные результаты свидетельствуют о том, что гибридный белок синтезируется в клетках Е.соН в виде нестабильного, бистро доградируллпго предшественника, продукты процессинга которого накапливаются в виде трех белков в пе-риплазыатичоском пространство и в культуралыюй жидкости. Количественное игределешо белка по Ярздфорду показало, что 60Z рекомбшшптннх боксов счкретнрумся т? культурчльнуп иид-кость, тох'да как остальная часть рокогдбиноитных болков сосредоточена в основном в пориплазматическом пространстве бактерии.

Свойства и состав рокомбинэнтшх белков, кодируемых гибридным геном аэра-fmd окончательно не изучены. В то иэ время полученные результата дают основание для вывода о принципиальной возможности экснроссш гена антигенной детерминанты вируса ящура в Е.соН с использованием секреторных элементов.

Вш dill

' ficoUl

J^JBiUl + JSceUI

BceBl

SamUl+XScoRl

in I I III ili.Vll «1.1. iri. __i

fmd

Рис.9. Схема конструирования рекомбияантноП илазмидц pLPAP

- 29

21

; Саха»

б в г д е

Рис.10. (А) Мммуноблоттинг с поли-клоналышми антителами против вируса ящура подтипа А22 суммарного клеточного болкэ (а) и белков периплазмы (б) E.coll НВ101, содержащих плазмиду pLPAF. (В) Разделение в SDS-полиакрил-амидном г'эле очищенных ракомби-6.5 нангных белков, выделенных аффинной хроматографией на IgG-сефарозэ из клеток (в), периплазматическоп фракции (д) и культуралыюй жидкости (е). Указана молекулярная масса (кД) белковых маркеров (г)

12

5. Тестирование и типировакие щлфодшх штзмшв бактерий-возбудителей диареи

Значительную проблему в медицинской и ветеринарной микробиологии представляет идентификация энтеротоксигешшх бактерий. В связи с этим мы исследовали возможность использования клошровашшх наш генов для тонирования штаммов бактерий - возбудителей диареи гибридизацией in 3ltu. При этом в качестве зондов использовали полученные полимеразной цепной реакцией в присутствии а-згР-дезоксинуклеозид-6'-тр»1осфатов ДНК-копии генов eatAl и yat, a также смесь 5'~'5гР-мечвН!шх олигонуклеотидов (III) и (IV). В качество матрицы в реакции PCR использовали ДНК плазмид pSPSTI и pSKFYST, а для обеспечения однонаправленного копирования один из нуклеотидшх праймеров брали в 100-кратном избытке. Всего нами было проверено 75 штаммов E.coll, 18 штаммов Y.enlcrocollttea, 25 штаммов К.pneumoniae, 3 штамма S.marees)cena и 13 лабора.ор-шх штаммов E.coll, содержащих плазмиди из К.pneumoniae и S.mareeасепз.

Полученные результаты частично представлены но рис.11. Из них следует, что наименее специфичным зондом является смесь олигонуклеотидов (III) и (IV). ДНК-зонд, полученный копированием гена eatAl, гибридазовался с колониями энтеро-токсигеншх штаммов E.coll и некоторых отаммоь К.pneumoniae и S.marceacena, а также лабораторных штаммов E.coll, содержащих плазмида из К.рпеш.оп1ае и S.тагсезсепз. В то же время никаких полоштелышх сигналов не было получено при гибридизации этим зондом колония штаммов Y.enterocollt tea. Обратная картина наблюдалась при использовании второго (yat) ДНК-зонда, полученного амплификацией гона yat, который специфически гибридазовался только с энтеротоксигешшш штаммами Y.enterocolltlea. Таким образом, полученные нами ДНК-зонда могут быть использованы не только для тестирования некоторых видев внтеротоксигеншх бактерий, но также и для их тилиро-вания. Что касаэтся олигонуклеотидных зондов, то они могут быть использована для выявления энтеротоксигешшх штаммов разных видов бактерий.

а/©ф\ /CD CDCD\ /CDCDCDCX>\ Са)СШСи)(3> ■\<S> CID COD <Ж> \СШ CSD d> / \cs> у7 Ч. г^сэ та _«v. ■;> —^ CitB^J

С • * V d ^f4« ocf •. ^¡¿K^*»^^¿iljJ ' * ** .' /

Рис. II. Результаты гибридизации in situ на нитроцеллюлозных фильтрах штатов Y.enterocolittca (I-I5), штаммов E.coll, содержащих плазииды из S.marce3ceri3 (16) и К.pneumoniae (17,18), л природных штаммов E.coll (19-21). (а)- схема расположения колоний бактерий на мембранных фильтрах; автограф фильтра после гибридизации со смесью олигонуклеотидних зондов (III) и (IV) (Ъ), с ДНК-зондом, комплементарным кодирующей часта гона estAI (с), с ДНК-зондом, комплементарным кодирующей части гена у3t (d)

а и в о д ы

1. Осуществлено клонирование генов термостабильного энтеро-токсина (eotAlj из природного токсигениого штамма E.coll SA162. Впервые установлена хромосомная локализация гена eatAI. Определена первичная структура участка хромосомы E.coll, содержащего ген estAt. Показано расположение гена est AI в составе транспозона Тп1681. На основе клонированного гена создан штамм E.coll - продуцент термостабильного энтеротокскна.

2. При помощи полимеразной цепной реакции амплификацией суммарной ДНК природного штамма Y.enterocolitlca 845 получен фрагмент, содержащий структурный ген термостабильного энтеротоксина ¡/ai. Установлена плазмидная локализация гена и определена его первичная структура. Впервые показано суще-ствовЕШШ аллельного варианта гена yat.

'3. Сконструирован ряд роксмбинантных плазвдгц для конститутивной и индуцируемой экспрессии гена, кодирующего антигенную детерминанту вируса ящура штамма , в составе гибрида с сигнальным пептидом и про-последоввтельностыо термостабильных знтеротоксинов E.coll и Y.enterocolitlca. С помощью иммунохимического анализа показано, что некоторые плазмиднне конструкции обеспечивают секрецию антигенной детерминанты в культуральную жидкость.

4. Сконструирована рекомбинантная плазмида, детерминирующая биосинтез антигенной детерминанты вируса ящура в составе гибрида с тандемом двух IgG-связывающнх доменов бежа Л из З.аигеиз. Показано, что более 60Х рэкомбкнантного белка секретеруется в культуральную кидкость, тогда как остальной белок локализован в периплазме бактерий.

5. С помощью полимеразной цепной реакции на основе клонированных генов eat Al и у at получены радиоактивные зонды для гибридазациошюго анализа. Показано, что полученные зонды могут быть использованы для тестирования и тширования природных штаммов энтеротоксигенных бактерий.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУЕЛИНОВАШ В садущюс РАБОТАХ: ..

1. В.Г.Коробко, Е.Ф.Болдырева» О.В.Некрасова, А.В.Ыикуль-скис, ГС.А.Фйштов!, В.Н.Добрынин. Синтез, клонирование и экспрессия искусственных генов, кодирующих антигенные детерминанты вируса ящура подтипа Ag2. //Биоорган- химия. 1991. Т.17. А 4. С. 461-469.

2. А.В.Микульскнс, Т.И.Доморадская, I С.А.Филиппов!, В.И.Добрынин, В.Г.Коробко. Клонирование и экспрессия гена термо-стабилыюго знтэротоксипа Eschertchta coli. //Ниоорген. химия. 1992. ТЛ8. А I. С. 63-70.

3. Т.И.Доморадская, Ю.В.Езэячук, В.Л.Нотин, А.В.Микульскнс, В.Г.Коробко. Определение те расстабильного и тормолабилыюго энторотоксинов S.coll генетическими, биологическими и имму-носерологическши методами. // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. 1992. В печати.

МШ Зак. «I 1/74 тяр.ТОО пкз. 19.02.92