Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование промоторов фага лямбда в генотехнике

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование промоторов фага лямбда в генотехнике"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМ.д.и.ИВАНОВСКОГО

ТРОЯНОВСКАЯ Ирина Николаевна

УДК 578.812

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ФАГА ЛЯМБДА В ГЕКОТЕХНИКЕ.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Работа выполнена в Институте бежа АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук Н.И.Матвиенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.В.Месянжинов

доктор медицинских наук, профессор Б.Н.Ильяшенко

Ведущая организация: Научный центр молекулярной диагностики Министерства здравоохранения СССР

Защита состоится "(р '& ^ддх г> в ^/ час_ на заседании Специализированного ученого Совета Д.001.20.01. при Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР по адресу: 123098, Москва, ул.Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.

„

Автореферат разослан " ^ " " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета

,канд. мед. наук. А.М.Жуковский

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Фаг лямбда является в настоящее время одним из основных объектов, с помощью которого решаются актуальные задачи и разрабатываются новые методы молекулярной биологии, генетики и генной инженерии.

Значительный интерес представляет создание векторных систем с использованием регуляторных элеметов фага лямбда для увеличения уровня экспрессии чужеродных генов в клетках Escherichia coll. Несмотря на то, что создано большое количество векторов на основе фага лямбда и десятки векторных плазмид с ранними промоторами фага поиск новых вариантов использования регуляторных элементов, например конструирование векторных систем с наиболее сильным промотором поздних генов фага лямбда pR', значительно расширит наши возможности при решении задач по получению штаммов-суперпродуцентов с регулируемой экспрессией самых разнообразных белков в E.coli.

Наиболее существенным моментом при конструировании новых векторных систем является не только выбор наиболее сильного промотора, но, главным образом, хорошо регулируемого промотора; только при этом условии возможно достичь высокого уровня экспрессии чужеродных генов. Всем этим условиям отвечают ранние промоторы фага лямбда Р-^, PR и промотор поздних генов PR, Цель работы.

Цель работы заключалась во-первых, в конструировании экспрессионных векторов, содержащих промоторы фага лямбда PR' и Р-^; во-вторых, в конструировании In vIyo и In vitro дефектных профагов, которые синтезируют продукт гена а, необходимого для активации PR' промотора фага лямбда; в-третьих, в создании рекомбинантной плазмиды, содержащей ген репрессора cl фага X. Научная новизна.

Ранние промоторы фага X используются в генной инженерии для получения суперпродуцентов чужеродных белков в E.coli. В качестве штамма-хозяина в таких случаях используются штаммы, содержащие дефектные профаги.

Сконструированы: In vivo - лизоген с дефектным профагом 4 HBI0I (X), имеющий в своем составе область иммунитета фага X, ген Q и делецию поздних, генов; In vitro -дефектный профвг X ( MluI Km1* ), дополнительно несущий маркер

резистентности к канамицину.

В бинарной векторной системе впервые показано, что промотор Рд, на плазмиде может быть трансактивирован продуктом гена Q, который синтезируется сконструированными In vivo и In vitro дефектными профагами. При этом наблюдается десятикратное увеличение синтеза р-галактозидазы, ген которой находится под контролем промотора PR,.

Сконструирован ряд векторов для экспрессии генов под контролем самого сильного промотора фага X PR, - pIPB2, pIPR4, pIPR5.

Для регулирования транскрипции с ранних промоторов фага X сконструирована рекомбинантная плазмида на основе термочувствительного решшкона, содержащая ген cits и совместимая с плазмидой pBR322 и ее производными. В такой системе наблюдается увеличение синтеза фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli под ранним промотором фага X до 30% от клеточного бежа, что в 6 раз превышает исходный уровень, когда в качестве хозяина использовался штамм E.coli с дефектным профагом А,.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Результаты работы были представлены на 16-ой конференции Федерации Европейских биохимических обществ ( Москва, 1984 ); на Международном симпозиуме "Gene manipulation and expression" ( Becliyne, 1984 ) ; на 8-ом объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР ( Рига, 1986 ). Структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 156 страницах, содержит 6 таблиц и 35 рисунков.

Список цитируемой литературы включает 147 наименований.

В обзоре литературы проанализированы имеющиеся сведения о системе регуляторных элементов фага лямбда и использовании их при конструировании векторов для экспрессии клонированных генов в E.coli.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Результаты исследования.

1. Получение делеционных мутантов профага X.

Мутанты профага X с делениями и замещениями находят широкое применение для исследования регуляции экспрессии фаговых генов, механизмов незаконной рекомбинации, а также как компоненты бинарных систем хозяин-вектор, в которых экспрессия чужеродного гена на рекомбинантной плазмиде с ранних промоторов PL и PR фага А. регулируется термолабильным репрессором дефектного профага.

При засеве штамма HBIOK Xgt-XC) на хлоратный агар при анаэробных условиях роста выделено 300 мутантов резистентных к хлорату. Из этих мутантов 28 не давали зон лизиса при накалывании на газон клеток HBI0I ни при 32°С, ни при 42°.

Чтобы выявить размеры делений, из исходного штамма HBI0I ( \gt~XG ) и 15 дефектных лизогенов выделена ДНК, расщеплена рестриктазой EcoRI, фрагменты разделены электрофорезом в агарозном геле и перенесены на нитроцеллюлозные фильтры, на которых проведена гибридизация с меченой "ник-трансляцией" ДНК фага ACI857s7 ( рис.1 ).

Для более полной характеристики дефектных профагов ДНК нескольких лизогенов ( 4,9,10,185,194,223 ) была фрагментирована другими рестриктазами Mlul и EcoRV, и проведена "блотинг"-гибридизация фрагментов с "ник-транслированной" ДНК A.cI857s7 ( рис. I ).

2. Конструирование векторных плазмид с промотором PR1.

Общая схема конструирования векторных плазмид с Рд, промотором показана на рисунке 2. Донором фрагмента, несущего PR, промотор, являлась ДНК фага AcI857s7. ДНК фага расщепляли рестриктазой EcoRI, затем полученные фрагменты разделяли электорофорезом, а фрагменты Е и С выделяли препаративно. На следующем этапе Е и С фрагменты расщепляли рестриктазой HindiII и один ( 831 п.н. ) из полученных 4-х фрагментов содержал Р^, промотор. Полученные четыре фрагмента использовали в лигазной реакции с фрагмента;,и плазмиды рЕН322 после расцепления рестриктазами EcoRI и HindiII. Эту лигазнув смесь использовали для трансформации рещшпентннх клеток Е. coll БЕЗ. Отбор рэкомбинантов вели по

О в г д е к з

а бв гд еж з и

абвгдежзи

24192205-

; к Я я ; С < С

576553764613, 45973873 . 3744_ 3595332428842674-

1921 — 1679-

738655, 650-

. — —

: -

I

Рис Л. Гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах меченой ДНК фага X с185?й7 с фрагментами ДНК дефектных лизогенов, расщепленных рестриктазой: I - ЕсоН: а - ДНК Л с1857з7; б - НВ101 (\gt-A-C); в - з - ДНК мутантов 1,2,4,9,10,12; 2 - М1и1: а - ДНК НВ101; б - ДНК X с1857б7; в - ДНК НВЮ1 (\gt-\C), г - и - ДНК мутантов 223,194,185,109,4; 3 - ЕсоИУ: а - ДНК НВ101; б - ДНК X с1857б7; в - ДНК НВ101 0£1;-ЛС); г - и - ДНК мутантов 4,10,9,185,194,223. Слева указаны размеры фрагментов в. п.н.

фенотипу Арг и Tcs. Из отдельных колоний с таким фенотипом выделяли плазмидную ДНК и с помощью рестрикционного анализа ( использовали рестриктазы EcoRI и ШлИИ ) была отобрана плазмида, содержащая фрагмент размером 831 п.н. с промотором Рн, ( обозначена как pIPRI ).

С целью уменьшения длины и увеличения числа копий плазмида был делегирован фрагмент ( PvuII-HtndlU ) pIPRI размером 2036 п.н.

При интеграции чужеродного фрагмента в уникальный сайт рестриктазы EcoRI плазмида pIPR2 инициация его транскрипции происходит с промотора pR1. С целью улучшения свойств вектора были сконструированы его производные ( рис.г ), обозначенные как pIPR4 и pIPR5. Они несут полилинкер ( с сайтами для рестриктаз HincUII, BamfQ, Bglll и Clal ) из плазмида wx, который встраивали в двух ориентациях .

3. Экспрессия р-галактозидазы с промоторов Р^ и Рд,.

С целью исследования регулируемой экспрессии йод контролем промотора Рд > в плазмидный вектор pIPR2 встраивали последовательность ДНК, кодирующую р-галактозидазу. Схема конструирования вектора pIPR3 показана на рис. г.

Для изучения эффективности экспрессии гена р-галактозидазы с промотора Р^ была сконструирована рекомбинантная плазмида pIPR6. Активность р-галактозидазы определяли как описано в работе Миллера по скорости гидролиза о-нитрофенил-р-й-галактопиранозида. Результаты этих

экспериментов свидетельствуют о том, что в ходе индукции при 42°С уровень р-галактозидазной активности увеличивается более чем в 10 раз в случае промотора PR(, а эффективность промотора Рн, в два раза больше, чем промотора Р^.

4. Трансактивация промотора PR1.

При создании штаммов-суперпродуцентов, часто возникает потребность проверить экспрессию клонированных генов в различных итаммах E.coll, на различном генетическом фоне, поскольку хорошо известно, что могут быть штаммовые различия в экспрессии клонированных генов.

В связи с этим возникла' задача по конструированию плазмида на основе фага X, которая была бы способна

Рис.2. Схема конструирования векторных плазмид: I - р1РЩ и р1РИ2 с промотором Рн, фага лямбда; 2 - р1Рй4 и р1РН5; 3 - р1РИЗ геном 1асг под контролем промотора Рн, фага лямбда.

интегрировать в хромосому бактериальной клетки с образованием дефектного лизогена. Такой дефектный профаг при индукции способен трансактивировать промотор PR, на совместимой плазмиде 4.1 Получение дефектного лизогена.

Рестриктаза MluI расщепляет ДНК фага Я в семи точках только в области поздних генов. Поэтому было решено получить дефектный лизоген, вырезав 1л vitro участки поздних генов меаду первым с координатой 458 нутслеотидов и последним с координатой 22220 нуклеотидов сайтами для рестриктазы MluI.

Из рис.3 видно, что при индукции количество фаговой ДНК в клетке резко увеличивается.

4.2. Получение векторной плазмиды на основе фага X с резистентностью к канамицину.

Рестриктаза Sali расщепляет один из генов системы общей фаговой рекомбинации, ген redß; второй сайт для этой рестриктазы расположен в гене kill. Поэтому было решено удалить центральный фрагмент Sali и заменить его на фрагмент 'ДНК с геном резистентности к канамицину из плазмиды pUC4K.

Наличие хорошего селективного маркера, каким является резистентность к канамицину - немаловажное преимущество сконструированной плазмида-фага. Ее можно легко передавать различным штаммам E.coll.

4.3. Трансактивация промотора PR, на плазмиде при индукции дефектного профага.

Чтобы проверить способность дефектного профага трансактивировать промотор PRI, в клетки с профагом ЯМ1и1 Ктг-2 вводили плазмиду, содержащую промотор PR,, конструирование которой ( p!PR4 ) описано ранее. Функционирование промотора Pp. в этой плазмиде проверяли в опытах по транскрипции In vitro с использованием [ 7- Р 1-АТР ( рис.4 ).

В плазмиде pIPR4 промотор Р^. расположен перед геном резистентности к ампициллину, поэтому можно ожидать, что в случае трансактивации промотора PR1 на плазмиде при индукции профага синтез ß-лактамазы в клетках будет резко возрастать. Действительно, по данным SDS-электрофореза клеточных белков после индукции резко возрастает синтез белка с молекулярой массой, соответствующей молекулярной массе ß-лактамазы. Иодометрический метод анализа активности ß-лактамазы показал, что при индукции синтез ß-лактамазы возрастает более чем в три раза.

2 419 2 205

1 268 У56

Рис.3. Радиоавтограф "блот-гибридизации" фрагментов ДНК дефектного лизогена E.coli HBIOI (X Mlul) с меченой ДНК. I - 3 -клетки выращены при 28°С; расщепление: I -MluI+FvuII; 2 - PvuII; 3 - Mlul; 4-6 клетки выращивались при 37° в течение I часа, после индукции при 43°С - 10 мин; расщепление: 4 - MluI+PvuII; 5 - PvuII; 6

- Mlul; 7 - 9 - контроль; расщепление ДНК XcI857s7 рестриктазами: 7 - MluI+PvuII; 8

- PvuII; 9 - Mlul. Справа указаны размеры фрагментов ДНК фага X при расщеплении рестриктазой Mlul.

Рис.4. Транскрипты с плазмидных и фаговой ДНК, меченые ( т-32Р 1 - АТФ. 3 - рШ4; 2 - рВИ322; I - Ас1857э7. Стрелкой показано положение бБ РНК. Электрофоретическое разделение в 5% полиакриламидном геле.

5. Плазмида на основе температурно-чувствительного репликона для регулирования экспрессии клонированных генов под контролем промоторов PL и PR фага X.

Для конструирования плазмиды с геном cl фага X ДНК фага A,cI857s7 расщепляли рестриктазой EcoRI, и фрагмент ДНК с координатами концов 3I747-39I68, содержащий ген репрессора, выделяли препаративным электрофорезом в агарозном геле. После этого изолированный фрагмент последовательно расщепляли рестриктазами BglII и Pstl. Полученную смесь фрагментов ДНК фага X " сшивали " с векторной плазмидой, расщепленной рестрикт-азами BamHI и Patl.

Из восьми клонов,. обладающих иммунитетом к фагу X, резистентностью к хлорамфениколу и к канамицину при 30°С, но не при 43°с, и чувствительных к ампициллину при обеих температурах, были выделены плазмида. Одна из этих плазмид обозначена pH5G4I5-cIts и была использована в дальнейшей работе.

Для проверки способности плазмиды pHSG4I5-cIts осуществлять регуляцию генов под контролем промоторов Р^ и PR на совместимых плазмидах в клетки была введена дополнительно плазмида pCJ55, кодирующая фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli.

Денситометрирование геля показало, что при максимальной индукции ( рис. 5 колонка 14 ) фрагмент Кленова составляет около 30% всего растворимого бежа клетки, в то время как при использовании исходного штамма с дефектным профагом фрагмент Кленова составляет около Ь% растворимого клеточного бежа.

6. Особенности экспрессии клонированных генов под контролем тандема промоторов Р^ и Рд, фага X.

В созданной нами системе было лйказано, что продукт гена О, кодируемый профагом с геном термолабильного репрессора, может трансактивировать промотор Р^, на плазмиде при индукции профага. Однако, поскольку белок более активен в с1а-положении, можно предполагать, что совмещение гена 0 и промотора Р^, на одной плазмиде приведет к более эффективной экспрессии генов под контролем промотора Р^,.

Для сравнения уровня экспрессии под контролем промотора Рь и блока Р^-О-Рдг ЗаиЗА1-фрагмент ДНК фага А, с координатами 43735-44893, содержащий ген Ц и промотор Рд,, нарабатывали

Ч 2 3 4 Б е 7 8 9 10 II 12 13 14

гит W «я f-i pi У* t"f. '>"' Ь '•

IfHHjji У Ц У У* ^ -

\ <м| к»**

! «¡Р*

f У* Ш *>* im •

гизжж] н

,^ г»- «»

\ фр^ГМЗНТ.

. КлваЬва;

Рис.5. Электрофореграмма белков клеточного лизата. Стрелкой показано положение фрагмента Кленова. I - 7 - клетки E.coll 4830 (pCJ55). I - 30°С ( без индукции ); 2 - 37°С, I час; 3 - 37°С, 2 часа; 4 - 37°С, 3 часа; 5 - 43°С, I час; 6 - 43°С, 2 час; 7 - 43°С, 3 часа. 8 - 14 - клетки E.coll DH2 ( pHSG4I5-cIts, рСJ55). 8 - 30°С ( без индукции ); 9 - 37°С. I час; 10 - 37°С, 2 часа; II - 37°С, 3 часа; 12 - 43°С, I час; 13 - 43°С, 2 часа; 14 - 43°С, 3 часа.

12 3 i Ь 6

•*"f' Щ t. Ж9 «а : Ш4

' 'ГГ* V г - «у-» , * ;§§/f§;:j§;

■ «в" шЩ

, фрегдант "клвнова

iS'

р-лактамаза

с

«ДО ш

0

1

Рис.7. Экспрессия фрагмента Кленова и р-лактамазы в индуцированных и неиндуцированных клетках. Сравнение уровня индукции белков в клетках с плазмидами рС J55, pCJ55-Q-PR,-R, pCJ55-Q-PR,-L. 1,2 -E.coll (рСJ55); 3,4 - E.coli . (pCJ55-Q-PR,-R); 5,6 - E.coli (pCJ55-Q-PR,-I); 1,3,5 - без индукции; 2,4,6 - с индукцией.

препаративным электрофорезом и встраивали в ВатШ-сайт плазмида pCJ55, расположенный мевду промотором Р^ и геном фрагмента Кленова ( рис. 6 ).

Для трансформации использовали штамм E.coll DH2 с плазмидой pHSG4I5-cIts. Клоны, содержащие рекомбинантные ДНК с геном Q, идентифицировали методом " гибридизаций колоний " с " ник-транслированным " EcoRI-фрагментом ДНК фага X с координатами 39168-44972, наработанным препаративным электрофорезом в агарозном геле.

Оказалось, что после теплового шока с последующим переносом термоиндуцированной культуры на 37°С в клетках, содержащих плазмиду с промотором Pj_ блоком Q-PR> в прямой ориентации, действительно происходит индукция синтеза фрагмента Кленова. В противоположность этому, как и следовало ожидать, если блок Q-Рд. интегрирован в обратной ориентации, заметной индукции синтеза не происходит. Однако уровень синтеза фрагмента Кленова под контролем блока Р^-О-Рд. существенно ниже, чем под контролем одного промотора Рт ( рис. 7 ).

а В Ъ г

R Н и н

Рис.6. Схемы использованных плазмид. PL, PR, PRi - левый ранний, правый ранний и правый поздний промоторы фага X соответственно; cits, N, Q - гены фага X; Н - HtndHI; В -BamHI; X - Xhol; R - EcoRI; дуговые стрелки указывают направление транскрипции; ог1 - участок начала репликации; 6S -конститутивно транскрибируемая РНК с промотора PR1; а -плазмида pHSG4I5~cIts - 7,1 т.П.н.; б - плазмида pCJ55 - 8,1 т.П.Н.; В - pCJ55-Q-PR,-R - 9.3 Т.П.Н.; Г - pCJ55-Q-PR.-l - 9,3 Т.П.н.

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Делении поздних генов профага X.

Для получения делеционных мутантов профага X мы использовали лизогенный штамм recA" E.coll и стандартный метод - поиск делеционных вариантов профага среди мутантов, устойчивых к хлорату в анаэробных условиях. Однако проведенные эксперименты показали, что все 15 исследованных мутантов имеют левый и правый участки прикрепления к бактериальной хромосоме. Из этого можно сделать заключение, что мутации, приводящие к устойчивости к хлоратам и делении в тандемном профаге, произошли независимо.

Если возникновение делеций в тандемном профаге и устойчивости к хлоратам - независимые события, то обращает на себя внимание следующий факт. Возникновение делеций в тандемном профаге в штамме. гесА~ весьма вероятное событие. Дефект профага наблюдается примерно в 10% случаев ( 28 из 300 ). Следовательно, тандемный профаг можно рекомендовать в качестве источника легко обнаруживаемых делеционных вариантов профага.

2. Возможные аспекты применения вектора X Mlul Kmr.

Промотор PR, на плазмиде может быть трансактивирован при индукции дефектного лизогена E.coll HBIOI ( Ы ), что приводит к резкому усилению синтеза ß-галактозидазы под его контролем. Однако наши данные находились в противоречии с другими работами Echols, Burt, в которых возможность эффективной трансактивации отрицалась. При использовании другого дефектного профага X Mlul Kmr мы показали эффективную экспрессию за счет трансактивации и р-лактамазного гена. Возможно, различные результаты объясняются различным количеством синтезируемого в клетке белка Q. При низких уровнях синтеза белка Q трансактивация не наблюдается, при увеличении количества белка Q наступает резкая трансактивация, поскольку белок Q функционирует в клетке как мультимер.

Какова бы ни была причина указанных различий, нами ■ продемонстрировано, что система хозяин-вектор с использованием явления трансактивации промотора PR1 может быть с успехом использована для суперпродукции белков клонированных генов.

Дефектный профаг, сконструированный In vitro, обладает рядом преимуществ перед использованным нами ранее: он несет легко контролируемый селективный маркер; клетки не убиваются

при индукции; ДНК фага может быть выделена из клетки в виде плазмиды.

Последнее обстоятельство позволяет рассматривать полученную конструкцию как вектор типа lorie поскольку в нем имеется точка начала репликации от фага X, и как космиду, поскольку сохранился сайт cos.

Так как в этой плазмиде имеются уникальные сайты для рестриктаз MluI.Narl и Xbal, можно предполагать, что она может быть с успехом использована как для составления банков генов при использовании- фрагментов ДНК, полученных при действии этих рестриктаз, так и для эффективной экспрессии клонированных генов в уникальные сайты за счет cls-активации промотора PR,. Особую ценность вектор может представлять при клонировании генов, контролирующих синтез токсичных для клетки продуктов, поскольку клонированный ген до индукции будет представлен в клетке единичной копией в составе интегрированного в хромосому бактерии дефектного профага.

3. Плазмидный вектор для регулирования транскрипции с ранних промоторов фага А..

Векторы с ранними промоторами фага X PL и Р^ широко используются для суперпродукции клонированных генов, в большинстве случаев эти промоторы регулируются за счет термоиндукции дефектного профага, содержащегося в штаммах E.coll 4830 и HFI. Однако часто возникает потребность проверить экспрессию чужеродных генов в различных штаммах E.coll на различном генетическом фоне, поскольку хорошо известно, что могут быть штадаовые различия в экспрессии клонированных генов. Наиболее перспективный подход состоит в конструировании плазмвд, содержащих ген репрессора, которые были бы совместимы с векторной плазмидой. Желательно, чтобы при этом в плазмиде с геном репрессора не было лишних генетических элементов фага X. Нами была сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая единственный полный ген фага X, ген термочувствительного репрессора cits. Плазмида pHSG4I5 имеет участок начала репликации от плазмиды pSCIOI и поэтому совместима в клетке с плазмидой pBR322, наиболее широко используемым плазмидным вектором, и ее производными. Вследствие термочувствительности репликации этой плазмиды при повышении температуры до 42°С происходит не только инактивация термочувствительного репрессора, закодированного нашей

рекомбинантной плазмидой, но и исчезновение из термоиндуцированных клеток самой плазмиды.

Если сравнивать уровень синтеза фрагмента Кленова в исходном штамме E.coli 4830 (pCJ55) и в штамме DH2, содержащим сконструированную нами плазмиду pHSG4I5-cIts совместно с плазмидой рСJ55, то в нашей системе индукция фрагмента Кленова идет в шесть раз эффективнее.

Очевидно, что сконструированная плазмида pHSG4I5-cIts является хорошей альтернативой широко используемым дефектным лизогенам в плане регулирования экспрессии клонированных генов с ранних промоторов фага X - Р^ и PR. Важным преимуществом сконструированной плазмиды является то, что спектр резистентностей к антибиотикам ( резистентность к хлорамфениколу и канамицину ) не перекрывается со спектром резистентностей плазмиды pBR322 и ее производных. Поэтому легко может быть осуществлено селективное давление на одновременное присутствие обеих плазмид в клетке.

4. Особенности экспрессии клонированных генов под контролем тандема промоторов PR и PL фага X.

Впервые система хозяин-вектор с промотором PR, и терморегулируемой экспрессией бежа Q была создана нами, и было показано, что продукт гена Q, кодируемый профагом с геном термолабильного реперссора, может трансактивировать промотор PR, на плазмиде при индукции профага. Однако, поскольку белок более активен в сis-положении, мояио, предполагать, что совмещение гена Q и промотора PR, на одной плазмиде приведет к более эффективной экспрессии генов под контролем промотора pR,.

Нами показано, что ранний промотор Р^ обеспечивает более высокую эффективность экспрессии клонированного гена, чем блок PL-Q-PR1. Возможно, что уменьшение обусловлено тем, что в искуственно созданной конструкции происходит интерференция транскрипции с промоторов Р^ и PR,. Чтобы проверить это предположение, мы провели эксперимент по кратковременному включению промотора PL за счет краткой термоиндукции при 43°С с после дующим переносом на 30°С (рис.8). В случае плазмиды pCJ55, как и следовало окидать, наблюдается кратковременная стимуляция синтеза фрагмента Кленова; к 19 часам после индукции белковая полоса, соответствующая' фрагменту Кленова, почти полностью исчезает. В противоподоиюсть этому, синтез фрагмента Кленова в клетках с плазмидой, содзр;;:ацей блок P^-Q-P^,,

медленно нарастает и достигает максимума к 19 часам инкубации при 30°с.

Эти данные свидетельствуют в пользу гипотезы транскрипционной интерференции. Следует отметить, что если транскрипционная интерференция действительно имеет место, то она является характеристикой данной пары промоторов.

19

Рис.8. Влияние кратковременного включения промотора Р^ на белковый синтез в клетках с плазмидами р№5 и рЫ55-0-Рн1-Н. Цифры над колонками - время инкубации при 30°С после теплового импульса (в часах); а - плазмида рС№; б - плазмида рС^Б-О-Рп.-И.

выводы

1. Ранние промоторы фага X широко используются в генной инженерии для получения суперпродуцентов чужеродных белков в E.coll. В качестве штамма-хозяина в таких случаях обычно используются штаммы, содержащие дефектные профаги.

Сконструированы: In vivo - лизоген с дефектным профагом 4 HBI0I (А.), имеющий в своем составе область иммунитета фага X, ген Q и делецию поздних генов; in vitro - дефектный профаг А. ( MluI Kmr ), дополнительно несущий маркер резистентности к канамицину.

2. В бинарной векторной системе впервые показано, что промотор Рд,.на плазмиде может быть трансактивирован продуктом гена Q, который синтезируется сконструированными in vivo и In vitro дефектными профагами. При этом наблюдается десятикратное увеличение синтеза р-галактозидазы, ген которой находится под контролем промотора PRI.

3. Сконструирован ряд векторов для экспрессии генов под контролем самого сильного промотора фага X PR, - pIPR2, pIPR4, pIPR5.

4. Для регулирования транскрипции с ранних промоторов фага X сконструирована рекомбинантная плазмида на основе термочувствительного репликона, содержащая ген cits и совместимая с плазмидой pBR322 и еь производными. В такой системе наблюдается увеличение синтеза фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coll под ранним промотором фага X до 30% от клеточного белка, что в 6 раз превышает исходный уровень, когда в качестве хозяина использовался штамм E.coll с дефектным профагом X.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная. Делеции тандемного профага X в гесА" штаммах E.coll. - Тезисы докладов 16-ой конференции Федерации Европейских биохимических обществ, Москва, 1984, с.409.

2. N.I.Matvlenko, I.N.TroyanovjBkaya, I.A.Zheleznaya. The host-vector system with the PR1 promoter of phage X. -International symp. on the Gene Manipulation and Expression.

Slmpozlum book, Bechyne, 1984, p.50,

3. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная, О.Б.Ярчук. Делении поздних генов профага X. - Молекулярная биология, 1985, т.19, с.1457-1465.

4. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная, О.Б.Ярчук. Эффективность экспрессии (З-галактозидазы под контролем различных промоторов. - Тезисы докладов 8-го объединенного симпозиума биохим. обществ СССР-ГДР, Рига, 1986, с.181.

5. N.I.Matvlenko, I.N.Troyanovskaya, L.A.Zheleznaya. The host-vector system with the PR, promoter oí phage X. ' -Gene Manipulation and Expression, Kent, 1985, p.225-239.

6. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная, Д.В.Стяпонавичуте. Трансактивация промотора PR, фага X. -Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1988, N8, с.12-17.

7. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная, Д.В.Стяпонавичуте. Особенности экспрессии клонированных генов под контролем промоторов PL и PR фага X. - Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989, N2, с.26-29.

8. Н.И.Матвиенко, И.Н.Трояновская, Л.А.Железная, Д.В.Стяпонавичуте. Плазмида на основе температурно-чувстви-тельного репликона для регулирования экспрессии клонированных генов с промоторов Р^ и Р^ фага X. - Биотехнология, 1990, N2, с.7-9.

2.1.91 г. Зак.ЗНЬР Тир. 125 экз. Уч.-изд.л.- 1,0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ

i