Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

SegE - новая сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "SegE - новая сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза бактериофага Т4"

на правах рукописи

КАДЫРОВ ФАРИД АРТУРОВИЧ

- НОВАЯ САЙТСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭНДОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗА БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пушино-1996

Работа выполнена в лаборатории генетической энзимологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

В.М. Крюков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Я.И. Бурьянов; кандидат биологических наук A.C. Солонин

Ведущее учреждение: Институт Молекулярной

Биологии РАН им. В.А.Энгельгардта

Защита диссертации состоится "¿2 " UOfSpiL J996 г. в W час. на заседании Специализированного совета Д.002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан -Xt OK-TSiSpft 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

В.М. Вагабов

[. Сразу после обнаружения и описания семейства Т-четных

бактериофагов (Demerec, Fano, 1945) использование этих вирусов в качестве модельных объектов привело к открытиям, которые легли в основу современной биологии (Delbrück, Bailey, 1946; Hershey, Chase, 1952; Luria, Human, 1952; Benzer, 1961; Crick et al., 1968; Okazaki et al., 1968). Следует отметить, что фаг Т4 был первым прокариотическим организмом, у которого был идентифицирован интрон группы I (Chu et al., 1984). В настоящее время интроны группы I обнаружены во всех трех царствах живого мира и большинство из них содержат гены специфических эндонуклеаз, обеспечивающих перемещение интронной ДНК в безинтронный ген (Lambowitz, Beifort, 1993). Существуют косвенные данные, позволяющие предполагать, что именно гены сайтспецифических эндонуклеаз могли быть эволюционными предшественниками мобильных интронов группы I. Способность к мобильности эндонуклеазной ДНК интеинов показана экспериментально (Gimble, ГЬогпег, 1992). Однако, расположенные в межгенных областях гены "мобильных эндонуклеаз" до настоящего времени обнаружены не были. Ранее в нашей таборатории Калиманом и соавт. (Kaliman et al., 1990) определена последовательность ЦНК в области генов hoc и uvsW фага Т4, которая содержит открытую рамку :читывания (ОРС205), обозначенную hoc.2. Этот ген, названный позднее wgE, входит i семейство генов segA, В, С, D, Е бактериофага Т4. Предполагаемые белки Seg шляются близкими по размеру основными белками длиной от 198 до 229 шинокислотных остатков. Последовательности первых 90-100 аминокислотных >статков на N-конце этих белков имеют высокую степень подобия и в этой же области сходится последовательность ..Y-10 a.o.-YIG, которую можно рассматривать как ^сколько вырожденный вариант структурного мотива GIY-10 a.o.-YIG, характерного шя эндонуклеазы I-7>vI, кодируемой мобильным интроном id фага Т4, и других je.TKOB интронов группы I, присутствующих в митохондриях Neurospora crassa, 0odospora anserina и Sacchàromyces doiiglasii (Sharma et al., 1992). Все это позволило 1редположить, что пять выявленных гомологичных генов фага Т4 кодируют :пецифические эндонуклеазы и предложить для них общее название seg (similar to Tidonucleases of group I introns). Шарма и соавт. (Sharma et al., 1992, Sharma and linton, 1994) показали, что белок SegA действительно является Mg-зависимой ндонуклеазой, специфически расщепляющей определенные участки ДНК.

)ункциональной активностей белка SegE фага Т4. В связи с этим были определены ледующие задачи йследования: 1) провести клонирование и экспрессию гена ^Е; 2) ыделить и очистить белок SegE и охарактеризовать его ферментативную активность; ) при обнаружении реципиентных фагов, в геномах которых отсутствует ОРС segE, ровести эксперименты по изучению мобильности этого гена.

[. Цель работы - изучение энзиматической и

Научная новизна работы. Впервые выделенный и изученный продукт гена íegE фага Т4 является сайтспецифической эндонуклеазой, аналогичной по ряду свойств интрон-кодируемой нуклеазе I-Te vi. Показано, что ген segE фага Т4 является "мобильным эндонуклеазным геном", высокая частота переноса которого из донорных плазмид в геномы реципиентных бактериофагов абсолютно зависит от сайтспецифической эндонуклеазной активности SegE. Впервые представлены доказательства способности генов сайтспецифических эндонуклеаз внеинтронной и внеинтеиновой локализации к высокоэффективному переносу из донорного end* (endonuclease*) аллеля в реципиентный end: аллель.

Практическое значение работы. Данные о мобильности гена segE фага Т4 и сконструированные в данной работе плазмиды могут быть использованы для изучения механизмов сайт-специфической рекомбинации и создания новых систем направленного переноса и замещения генов. Штамм-продуцент эндонуклеазы SegE может быть использован для получения препаративных количеств этого белка.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции, посвященной памяти акад. A.A. Баева (Москва, 1996 г.), а также на международной конференции "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" (Cold Spring Harbor, USA, 1996 г.) и на заседаниях Ученого Совета ИБФМ РАН, посвященных подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 1994 г., 1995 г.).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 4 статьях и 3 тезисах.

Струтура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 132 источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Экспрессия гена segE

Выделению и характеристике различных белков обычно предшествует конструирование штаммов-продуцентов этих белков, которое в первую очередь основано на клонировании соответствующих генов в составе трансляционных векторов. Для создания продуцента белка SegE мы использовали трансляционный вектор рЕТ-За, в котором транскрипция направляется с промотора гена 10 фага Т7. ДНК гена segE амплифицировали в ПЦР при помощи олигонуклеотидных праймеров ] и 2 (см. раздел диссертации 2.1.3) и клонировали в векторе рЕТ-За по сайтам NdeI и BamHl. Полученной плазмидой, обозначенной psEET-За (рис.1), трансформировали клетки Е. coli BL21. Сравнительное изучение выращенных в идентичных условиях культур исходной и трансформированной E.coli BL21 показало, что количество живых

клеток в штамме ВЬ21/рзЕЕТ-За составляет только 10% по сравнению с контрольным штаммом. Таким образом, даже незначительный уровень экспрессии гена segE, возможный в отсутствии индукции, достаточен для гибели 90% популяции клеток.

RB30 (RB51)

hoc

Т4

РЧ*

их

А

1

uvsW

hoc.l Th

AsegE

3

Б А

I I

3_С

hoc

T4-

EcoRI Ps(I 4. I

hoc.l

Pi segE

uvsW

3 1 Xbiil 2 5 4 PstI6 -»I a I

pET-3»

pBR325

pBR325

pUC19

pUC19

pUC19

tag

pSEET-3a

pVTX

pVT123

pEW19

psET219

pAA19

Рис.1. Фрагмент генетической карты области генов hoc- uvsW фагов Т4, RB30 и RB51 с указанием положения сайтов эндонуклеаз рестрикции, сайтов "А" и "Б" эндонуклеазы SegE, поздних промоторов фагов и праймеров для ПЦР(1-6). В нижней части рисунка представлены рекомбинантные плазмиды с фрагментами ДНК фага Т4 (утолщенной линией), использованные в данной работе

Результаты экспрессии гена scgE в E.coli BL21/psEET-3a с использованием бактериофага лямбда СЕ6 в качестве источника РНК-полимеразы фага Т7 представлены на рис.2. Для анализа отбирали аликвоты бактериальной культуры и белки клеточных лизатов разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970). Появление видимых количеств нового белка наблюдали через 1,5-2 ч после индукции. Аналогичные результаты были получены и при селективном мечении белка SegE 3!5-метионином.

2. Очистка эндонуклеазы SegE

Предварительный анализ эндонуклеазной активности в бесклеточных экстрактах показал, что инкубация ДНК фагов лямбда и Т4 с экстрактом клеток E.coli BL21/psEET-3a приводит к сайт-специфическому гидролизу ДНК (рис.3). В

бесклеточном экстракте контрольного штамма ВЬ21/рЕТ-За аналогичная эндонуклеазная активность отсутствовала. Сайт-специфическая эндонуклеазная активность соочищалась с SegE и максимальной активностью обладала фракция белка, полученная на конечной стадии очистки.

1 ^ 1

67 к Да 43 кДа

30 к Да

20 кЛа Н кД..

Рис.2. Экспрессия грна segЕ ш vivo. Электрофоретическое разделение в 10-20%-ном ПААГ в присутствии 0,1% ДЦС-Na белков клеток E.coli В121, содержащих плазмиды psEET-3a (2) или рЕТ-За (3) и инфицированных фагом лямбда СЕ6. I -эндонуклеаза SegE, очищенная хроматографией на фосфоцеллюлозе, фенилсефарозе и ДЕАЕ-сефарозе. 4 - маркеры молекулярных масс

На рис.2 приведены результаты электрофоретического анализа фракции белка, очищенного последовательной хроматографией на фосфоцеллюлозе, фенилсефарозе и ДЕАЕ-сефарозе. Основная полоса в этой фракции соответствует по подвижности белку SegE бесклеточного экстракта. Все это свидетельствует о том, что продукт гена segE является сайтспецифической эндонуклеазой, для активности которой не требуются дополнительные белковые факторы.

3. Биохимическая характеризация свойств эндонуклеазы SegE

Предполагается, что эндонуклеазы Seg способны инициировать "мобильность" собственных генов по механизму, аналогичному процессу хоминга интронов (Sharma et al., 1992). Поскольку данная форма конверсии генов требует наличия двухцепочечного разрыва вблизи перемещаемого гена, мы провели поиск подобных участков расщепления для эндонуклеазы SegE и картировали два сайта (рис.4). Основной участок расщепления, расположен в 5'-области гена uvíW. Минорный

участок, находящийся в З'-области гена обнаруживается только при

использовании больших количеств фермента или замене ионов на ионы Мп2+. В дальнейшем мы обозначаем эти сайты ДНК фага Т4 как "А" и "Б", соответственно (рис.1).

1С 11 12

г

i : ;

Г

i' /,

.....1 L.

Рис.З. Анализ специфической эпдонуклеазной активности в бесклеточных экстрактах E.coli. 2 м:<г ДНК фагов инкубировали 20 мин при 30°С в 20 мкл стандартного буфера с 0,5 мкг тотального белка E.coli B121/psEET-3a (2,5,8,11) и В121/рЕТ-За (1,4,7,10). 1-6 - ДНК фага лямбда; 7-12 - г люкозилированная ДНК фага Т4; 1,2,7,8 - ЮмМ MgClr, 4,5,10,11 - 10 мМ МпСЬ; 3,6,9,12 - контрольная ДНК. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК провод1ШИ в 0,7% -ном агарозном геле

На рис.4 представлены данные по изучению некоторых ферментативных свойств SegЕ, показавшие, что белок SegЕ является Mg-зависимой сайтспецифической эндонуклеазой. Ионы Са2+ не способны заменить ионов Mg2t в реакционном буфере. Активность фермента не стимулируется АТР. Замена ионов Mg2+ на Мп2+ или использование большего количества фермента в реакционной смеси снижают специфичность расщепления. Данные по изучению влияния количества фермента и времени инкубации на специфичность расщепления 1 мкг субстратной ДНК представлены на рис.5. Использование 1 ед. акт. SegE приводит к гидролизу ДНК только по сайту "А" фага Т4, причем длительность инкубации практически не влияет па специфичность гидролиза. Увеличение количества фермента сопровождается появлением дополнительных участков растепления ДНК и приводит к значительной фрагментации векторной части плазмиды. Полученные результаты показывают, что в зависимости от условий реакции SegE, также как и родственная эндонуклеаза SegA

б

(Sharma and Hinton, 1994), способна расщеплять различные по предпочтительности участки ДНК. Возможность специфического гидролиза ДНК по сайту "А" позволила, после предварительного мечения "Р участка &oRI, получить количественные данные о влиянии некоторых условий реакции на эффективность процесса. Изменение температуры от 25°С до 37°С не влияет значительно на степень расщепления, активность фермента максимальна при 30°С. Эндонуклеаза не требует присутствия моновалентных катионов, увеличение концентрации NaCl приводит к ингибированию фермента. Оптимум рН соответствует 7,5-8,5 с максимумом при физиологическом значении рН 8,0.

а

Smal Xbal Б д Psti

pucis -!-1-!-рНР19

I 306— :

S97

О

597 и

306 п и

X 3 4 5 6 7 » УК)

Рис.4. Зависимость эндонуклеазной активности SegE от состава реакционной смеси. В качестве субстрата использовали расщепленную по участку Xbal плазмиду рНР19, содержащую Smal-Pstl- фрагмент ДНК фага Т4. а - Схема плазмиды рНР19. б -Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза 2 мкг ДНК в 6%-ном ПААГ. Время реакции: 1,5-10 - 20 мин; 2-10 мин. 1,2 и 5-10 - 5 ед. акт. и 1 ед. акт. SegE, соответственно. 1,2,10 - 10 мМ MgCU; 5 - без MgCh; 6 - 10 мМ МпСЬ; 7 - 10 мМ СаСЬ; 8 - 10 мМ MgCh+lMM ATP; 9 - 1мМ ATP; 3 - маркерная ДНК pBR322/tfpaII; 4 -исходная ДНК

Фрагменты ДНК фага Т4 - &р1-£соШ (651 п.н.) и Л>1-//асШ (330 п.н.), содержащие сайты "А" и "Б", переклонировали в противоположных ориентации из плазмиды рНР19 в векторах М13т/>18, М13т/>19 с образованием фагов М5Ш8(19) и М5Н18(19), соответственно. Одноцепочечную ДНК полученных рекомбинантных фагов использовали для определения точек разрезания и сравнительного изучения минимальной последовательности ДНК, формирующей сайт узнавания эндонуклеазы SegU, по методу Венцлау и соавт. ^еп21а\у е1 а1., 1989).

а

НтсНИ

^ р5(?19

ЕсоЖ А

.:- 387 -1-272-

риС19- !-

659

б

1234567891011

Рис.5. Влияние концентрации фермента и времени инкубации на специфичность расщепления. В качестве субстрата использовали расщепленную по участкам ¿соЯ! и ШпсПМ плазмиду рЗЕШ, содержащую &р1-£соМ фрагмент ДНК фага Т4. а - схема плазмиды р5Ш9. 6 - Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК в 6%-ном ПААГ. Расщепление 1 мкг ДНК проводили в стандартных условиях в присутствии 10 ед. акт. (/), 5 ед. акт. (2), 2,5 ед. акт. (3), 1 ед. акт. (4) фермента в течение 20 мин. и 1 ед. акт. фермента (6-11) в течении 60, 40, 30, 20, 10, 1 мин., соответственно. 5 - исходная ДНК

Эндонуклеаза SegЕ расщепляет ДНК с формированием З'-выступающих липких концов, состоящих из двух нуклеотидов (рис.6). В этом отношении Л^Е аналогична интрон-кодируемым эндонуклеазам 1-7Ы, 1-ТЫ1 бактериофага Т4, в то время как

эндонуклеазы дрожжей и архебактерий, принадлежащие к семейству ферментов ЬАСЫ-ОАОО, образуют липкие концы из четырех нуклеотидов на З'-конце (Lambowitz, Ве^ой, 1993). Разрыв фосфодиэфирной связи происходит с образованием 5'-концевой фосфатной группы, что следует из опытов по эффективному лигированию ДНК, расщепленной ферментом.

Сайт А

верхняя цепь нижняя цепь

о 1 (; а т с 1 I с т л о 1 о

Рис.6. Определение точек разрезания эндонуклеазы SegE в сайте "А". Представлены участки секвенирующих гелей; в качестве матриц использованы одноцепочечные ДНК фагов MSR 18(19). О - образцы достроенной в отсутствие дидезоксинуклеозидтрифосфатов двухцепочечной ДНК фагов mSR18(19), не обработанные SegE и 1 - гвдролизованные SegE. Стрелками указаны точки разрезания

Важно отметить, что в условиях более жесткого гидролиза, использованных, например, при установлении границ нуклеотидной последовательности, узнаваемой ферментом, проявляется способность SegE расщеплять каждую цепь ДНК и вблизи преимущественного места разрыва на расстоянии от одного до нескольких нуклеотидов. Подобная неоднозначность точек расщепления отмечена и для сайтспецифических эндонуклеаз \-Tevl и SegA фага Т4 (ВеП-РеёсгБсп е1 а!., 1990; ЗЬагта, НшЮп, 1994).

На рис.7 суммирована полученная в настоящей работе информация о структуре узнаваемых и гидролизуемых эндонуклеазой SegE участков ДНК и их консенсусной последовательности. Минимальная последовательность сайта "А" расположена в положении от -2 до +17 по отношению к центру двухцепочечного разрыва и составляет 19 нуклеотидных остатков. Для сайта "Б" применение метода Венцлау и соавт. ^епг1а\у й а!., 1989) дает менее однозначное положение правой границы

узнаваемой последовательности, которое может быть расширено до позиции +19, что, возможно, связано с необходимостью расширения минимальной длины ДНК, необходимой для эффективного связывания с менее предпочтительным сайтом. Секвеннрование участков ДНК, соответствующих сайту "А", у родственных бактериофагу Т4 фагов 11В30 и ЯВ51 выявило наличие трех нуклеотидных замен внутри узнаваемой последовательности в позициях -2, +2 и +10 (рис.7), не приводящих к потери способности SegE эффективно расщеплять ДНК в этих сайтах. Из этого следует, что нуклеотидные остатки в отмеченных положениях не являются абсолютно существенными для узнавания сайта ферментом.

+1

+10

+17

Консенсус:

5' -ш тзАтннвсагакккишш з' - кктотлкнссгаттшзм

Сайт Б

фаг Т4 : 5 ' -ТТАСАТССТТТТСТССАСТ*Г 3 ' -ААТСТАЯ<ЗА7_ААСА<РСТ£А

Сайты Л

фаг ИВЗО: С Т йААС

фаз? РВ51: С Т СААА

фаг Т4 : 5 '-ТАТАСАТЛААТССТаЗС' 3 ' -ЛТАТСТЛААТТАССАССОЛ

:Т Г1

Олигонуклеотиды:

т,1 ЪЪСаАТТТААТССТССС1

ЪЪСТАААТТАОЗАСССА

Ы. И2

Т СТАТТАССАТвААССА' ААСАТААТССТАСТТССТ.

* *

ССТТТТАС-31 'АЙССААААТС-5'

■ТСС

А А С

Л А С

С АСАТАТСССААСТгвЗД| АСТСТАТАСССГТСАССС

т тс

ТМАССААТ-З' ,ССТвСТТА-5'

Ингибированив

АОАТАТСССААСТ<ЗС(гЛТ«ЗАСС^ АСТСТАТАСССТТСАССС^АССТССЪ!

АСАТАЮССААСТС АСТСТАТАСССТТСЗАСС

\ccjtt

+

Рис.7. Нуклеотидная последовательность, необходимая для узнавания эндонуклеазой SegE. Представлены фрагменты ДНК фага Т4 с разрывами в местах гидролиза SegE, содержащие сайт "А" и "Б". Для сайта "А" приведены нуклеотидные замены (только в верхней цепи) в соответствующих последовательностях ДНК фагов 11В30 н 11В51. Внизу приведена структура синтетических олигонуклеотидов - аналогов продуктов гидролиза SegE по сайту "А", с указанием их ингибирующего влияния на реакцию расщепления ДНК. Нуклеотидные остатки, определяющие сайт узнавания, заключены в рамку. * - отмечены нуклеотиды, участие которых в формировании сайта узнавания неоднозначно

Ранее было обнаружено, что даже в жестких условиях не удается достигнуть полного расщепления ДНК эндонуклеазой SegE в сайте "А" фага Т4 (рис.4,5). Вероятнее всего это связано с ингибированнем нуклеазной активности SegE конечными продуктами реакции. Взаимодействие фермента с одним из продуктов реакции гидролиза показано для эндонуклеаз Ь&'е! и Р1-Л'се1 (Регпп е1 а1., 1993,

Gimble, Stephens, 1995). С целью подтверждения указанного предположения были проведены эксперименты по ингибированию процесса гидролиза олигонуклеотидами, моделирующими продукты реакции, структура которых представлена на рис.7. Данные таких опытов свидетельствуют о существенном ингибирующем эффекте только олигонуклеотида R1, содержащего полный сайт узнавания фермента. Для олигонуклеотидов L1 и R2 этот эффект не наблюдается даже при использовании их пятидесятикратного избытка по отношению к субстрату, что полностью согласуется с установленной в настоящей работе структурой и расположением (относительно двухцепочечного разрыва) минимального участка ДНК, необходимого для продуктивного взаимодействия с эндоиуклеазой SegЕ. Следует особо отметить, что отсутствие двух пар нуклеотидов на правом конце у R2 приводит к полной потере его способности взаимодействовать с ферментом.

Представленные выше результаты показывают, что эндонуклеаза SegE, помимо некоторой гомологии аминокислотной последовательности, имеет достаточно много общих ферментативных свойств с I-7evI фага Т4 (Bryk et al., 1995). Оба фермента узнают и гидролизуют протяженные высоковырожденные последовательности ДНК, образуют при гидролизе по два 3'- выступающих нуклеотида, сайты узнавания асимметричны и расположены на одной половине молекулы ДНК по отношению к точкам гидролиза. Способность SegE эффективно расщеплять глюкозилированную ДНК фага Т4 свидетельствуют в пользу того, что белок также взаимодействует с ДНК преимущественно в малой бороздке. Все это позволяет с достаточно болцщой долей вероятности предположить, что эндонуклеазы I-7evI и SegE обладают сходной пространственной организацией функциональных доменов и используют аналогичные механизмы узнавания и гидролиза ДНК.

4. Неравномерное распространение гена segE в геномах семейства Т-четных бактериофагов

При изучении распространения гена segE в геномах семейства Т-четных бактериофагов использовали метод ПЦР-анализа ДНК одиночной негативной колонии фага. Основой для таких экспериментов служили литературные данные о неравномерности распределения интронов (Quirk et al., 1989) и некоторых генов seg (Sharma et al., 1992; Sharma, Hinton, 1994) в семействе Т-четных фагов. В ПЦР-анализе с праймерами 3 и 4 было обнаружено, что с ДНК бактериофагов RB30 и RB51 амплифицировались фрагменты ДНК длиной 317 п.н., а не длиной 933 п.н. как это было в случае фагов Т2, Т4, Т6, RB5 и RB69 . Фрагменты ДНК фагов RB30 и RB51 длиной 317 п.н. были клонированы в плазмиде pUC19, и первичная последовательность клонированной ДНК была определена. Анализ первичной последовательности ДНК доказал, что геномы фагов RB30 и RB51 не содержат гена

segE. В анализируемой последовательности этих фагов отсутствует вся ОРС segE, включая предполагаемый рибосом-связывающий сайт, но выявлены 5'-концевые последовательности генов Иос. 1 и 1га\У и два поздних промотора. Следует отметить, что последовательности ДНК области Иос. Ьиу-гШ фагов ЯВЗО и ЯВ51 имеют 84% гомологии с соответствующей последовательностью ДНК фага Т4 (КаПтап е1 а1., 1990).

Рис.8. Влияние интактности гена .н'^'Е на эффективность его переноса с плазмиды в геном фага ЯВЗО. Анализ фагового потомства, полученного рзазмножением на чашках Петри фага ИВЗО в бактериях штаммов ВЬ21/рУТ123 или В1_21/р\'ТХ , на присутствие гена -ге^Е. Слева - фотографии фагового урожая на чашках Петри. Справа - авторадиограмма гибридизации ДНК фагов, перенесенных с чашек на нейлоновый фильтр, с 33Р-меченой ДНК гена segE.

5. Высокая частота переноса гена из донорных плазмид в геномы

реципиентных бактериофагов

Способность гена выступать в роли мобильного элемента была изучена в экспериментах по его переносу с донорных плазмид в геномы реципиентных фагов. В качестве доноров гена segE использовались плазмиды рУТ123 (Калимаи и др., 1988) и

pVTX, содержащие нативный и мутантный геи segE, соответственно (рис.1). Схема эксперимента аналогична модели, ранее использованной для доказательства мобильности интронов группы I в Т-четных фагах (Quirk et al., 1989). Клетки E.coli BL21 были трансформированы донорными плазмидами pVT123 и pVTX. Плазмидосо держащие бактерии штаммов BL21/pVT123 и BL21/pVTX инфицировали фагом RB30 или фагом RB51, и инфицированные культуры инкубировали в слое мягкого агара на чашках Петри. Фаговый урожай экстрагировали из мягкого агара и высевали на бесплазмидные бактерии штамма BL21 с образованием единичных негативных колоний бактериофага (левая часть рис.8 - "общий выход фага RB30"). Фаговые негативные колонии переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с 3.3Р-меченой пробой ДНК гена icgE (правая часть рис.8 - "фаг RB30.K'^H+").

Представленные данные показывают, что ген iegE способен выступать в роли мобильного элемента (рис.8, Таблица I). Высокая частота переноса этого гена с плазмиды в геном фагов RB30 и RB51 абсолютно зависит от присутствия интактной ОРС segE в доноре, т. к. эффективное образование фаговых частиц, которые дают положительный ответ при гибридизации, наблюдается в случае размножения фагов RB30 и RB51 в бактериях донорного штамма BL21/pVT123 и составляют 15% и 32% от общего выхода фагового потомства. Эти значения в среднем на два порядка выше появления аналогичных фаговых частиц, размноженных в BL21/pVTX, клетки которого не способны осуществлять синтез функционально-активной эндонуклеазы SegE. Полученные значения частот переноса гена segE хорошо согласуются со значениями частот переноса мобильных интронов td и surtY фага Т4, которые варьируют в диапазоне от 18% до 85% (Quirk et al., 1989).

Таблица I. Частота переноса гена segE с донорных плазмид в геномы реципиентных фагов.

Плазмида - донор гена segE Частота переноса segE

Название Генотип Фаг RB30segE Фаг RB5IsegE

pVT123 segE + 15% 32%

pVTX segE- 0,2% <0,2%

pEW19 scgE + 72% 70%

psET219 segE + 0,3% 3,2%

рДА19 segE + <0,05% <0,05%

Примечание: Частота переноса гена segE оценивалась в % , расчитанных по следующей формуле: П (%) = 100 х количество рекомбинантных фагов/общее количество фагов.

6. Ген переносится в область ДНК, расположенную между генами Нос. 1 и т\>ЛУ, и в процесс его переноса вовлечено расщепление ДНК в сайте "А"

Потомство фага ЯВЗО, размноженное в бактериях ВЬ21/рУТ123, было проанализировано на присутствие ОРС зе£Е методом ПЦР-анализа ДНК одиночной негативной колонии фага при помощи праймеров 3 и 4. Как можно видеть из рис.9, амплифнцированные фрагменты ДНК негативных фаговых колоний, которые дают положительный сигнал при гибридизации с "Р-меченой пробой ДНК segE фага Т4 (рис.8), имеют одинаковую подвижность в агарозном геле с

амплифицированным в тех же условиях фрагментом ДНК фага Т4.

123456789

——" *1 *-

Рис.9. ПЦР-анализ ДНК фагов на присутствие гена segE. В качестве матриц в ПЦР с праймерами 3 и 4 (рис.1) использовались ДНК негативных колоний фагов, которые дают отрицательный (2) и положительные (3-6) сигналы при гибридизации (рис.8), а также ЯВЗО (7) и Т4 (8). 1 н 9 - маркерные ДНК (гидролизаты ДНК плазмиды рП1ис5Спр1 IIКБ+ рестриктазой НаеIII и фага лямбда рестриктазами £соЯ1 и ШпЛII). Электрофоретическое разделение ДНК в 1%-ной агарозе.

Указанные данные показывают, что ОРС segE встраивается в межгенное пространство Лос. 1-!го\У фага 11В30, а не в какие-либо другие области фагового генома. Для полного подтверждения этсТго вывода было проведено секвенирование ПЦР-продуктов, амплифицированных с геномов трех рекомбинантных фагов (рис.9), которое выявило их полную гомологию между собой и с соответствующей последовательностью ДНК фага Т4. Это подтвердило встраивание гена segE по типу хоминга нитронов. Кроме того, отсутствие в анализируемых структурах ранее идентифицированных различий свидетельствуют о высоком уровне двусторонней

(»конверсии 5'- и 3'- концевых флангов, расположенных на расстоянии немногим больше 100 п.н. от участка инсерции .segE. Эффективная соконверсия фланкирующих экзонов описана ранее и при хоминге интрона td фага Т4 (Bell-Pedersen et al., 1989).

Известно, что хоминг иницируется расщеплением ДНК интрон-кодируемой нуклеазой в или вблизи сайта инсерции интрона (Lambowitz, Beifort, 1993). Вследствие этого нами были проведены эксперименты по выявлению сайта гидролиза SegE вблизи области инсерции собственного гена. Определение точек гидролиза эндонуклеазы SegE в обеих цепях ДНК области генов hoc.l-uvsW фагов RB30 и RB51 по методу Венцлау и соавт. (Wenzlaw et al., 1989) показало, что фермент катализирует введение двухцепочечных разрывов ДНК только в сайте "А", расположенном на расстоянии 130 п.н. от участка инсерции гена segE (рис. 1,7). Из этого следует вывод, что мобильность гена segE инициируется двухцепочечным разрывом ДНК фагов RB30 и RB51 в сайте "А", и расстояние в 130 п.н. между участками гидролиза ДНК и инсерции гена значительно не сказывается на эффективности процесса. Принципиальное отличие между мобильностью подавляющего большинства интронов группы I и ОРС segE заключается в том, что инсерция последнего не сопровождается нарушением сайта гидролиза и появлением устойчивости ДНК к эндонуклеазе SegE. Отсутствие устойчивости ДНК обеих аллелей к расщеплению SegE может приводить при их скрещивании не только к эффективному процессу приобретения segE, но и к его потере. Однако, было выявлено, что частота потери гена segE бактериофагом Т4 при его размножении в штаммах E.coli, содержащих рекомбинантные плазмиды с с фрагментами ДНК области генов hocA-uvsW фага RB30, не превышает 0,2%. Изучение эффективности расщепления эндонуклеазой SegE сайтов "А" фагов RB30 и Т4 показало, что фермент предпочтительно расщепляет сайт "А" фага RB30. Вероятно это и обуславливает высокую частоту приобретения гена íegE, а не его потери.

7. Последовательности ДНК, гомологичные у донорных плазмид и реципиентных фагов, необходимы для эффективного переноса гена segE

С целью изучения роли последовательностей ДНК, гомологичных у донорного и реципиентного аллелей, в процессе высокоэффективного переноса гена segE были сконструированы рекомбинантные плазмиды pEW19, psET219 и рДА19 на основе вектора pUC19, которые в отличие от плазмиды pVT123 содержали более укороченные фрагменты ДНК области генов hoc.l-segE-uvsW фага Т4 (рис.1). 5'-концы всех клонированных фрагментов расположены на расстоянии 115 п.н. от ATG триплета ОРС segE. З'-концы фрагментов плазмид pEW19, psET219 и рДА19 находятся на расстояниях 1065 п.н., 200 п.н. и 107 п.н. от конца ОРС segE, соответственно. Необходимо отметить, что клонированные в плазмидах pEW19 и

psET219 фрагменты ДНК на расстоянии 929 п.н. и 74 п.н от своих З'-концов, соответственно, содержат последовательность сайта"А", а в плазмиде рДА19 сайт "А" отсутствует и делеция дополнительно захватывает еще 22 п.н. Данные опытов по изучению частоты переноса гена segE с донорных плазмид pEW19, psET219 и рДА19 в геномы реципиентных фагов RB30 и RB51 представлены в Таблице I. Высокоэффективная частота переноса ОРС jegE, составляющая примерно 70%, получена при развитии реципиентных фагов в бактериях BL21/pEW19. Это значение в 2-4 раза выше частоты переноса ¿egE с плазмиды pVT123. Повышение частоты переноса segE, по-видимому, вызвано более эффективной способностью плазмиды pEW19 (4,5 т.п.н.), вследствие ее значительно меньшего размера в сравнении с pVTl 23(7,5 т.п.н.), интегрировать в результате репарации двухцепочечного разрыва в геном фага Т4 с образованием кроссинговерного продукта рекомбинации. При использовании плазмид psET219 и рДА19 частота переноса segE резко снижена. Таким образом, для эффективного переноса гена л?#Е необходимо присутствие более протяженной области гомологии ДНК между донором и реципиентом на З'-конце от этого гена. Кроме того, это еще раз дополнительно указывает на зависимость переноса segE от разрыва ДНК в сайте "А". Роль гомологичных последовательностей экзонов в процессе мобильности нитронов Id и sunY фага Т4 была отмечена в работе Квирк и соавт. (Quirk et al., 1989): при уменьшении гомологии ДНК между интроном и донором с 821 п.н. до 28 п.н. частота переноса нитрона ¿илY снижалась в 2000 раз.

Данное исследование представляет первое экспериментальное доказательство способности генов внеинтронной и внеинтеиновой локализации, кодирующих сайтспецифические эндонуклеазы, к высокоэффективному переносу из донорного end*(endonuclease+) аллеля в реципиентный end' аллель. Этот новый пример конверсии генов в прокариотических организмах может рассматриваться в качестве подтверждения гипотезы о том, что ОРС сайтспецифических эндонуклеаз были эволюционными предшественниками мобильных нитронов группы I. Можно ожидать, что сайтспецифическая мобильность в гомологичные области является общим свойством генов seg и подобных им ОРС в других организмах. Необходимыми условиями этого являются: а) гомология последовательностей между донорным и рециписнтным аллелем; б) наличие сайта гидролиза вблизи перемещаемого гена.

выводы

1. Показано, что продукт гена segE фага Т4 является \^-зависимой сайтспецифической эндодезоксирибонуклеазой. Сконструирован штамм-продуцент этого фермента и разработан метод его очистки.

2. Фермент способен расщеплять как ДНК плазмид и фага лямбда, так и глюкозшшрованную оксимешщитозинсодержащую ДНК фага Т4. Некоторые сайты высоко предпочтительны для гидролиза SegE, но увеличение концентрации фермента или замена ионов на ионы Мп2+ приводит к появлению дополнительных участков расщепления ДНК.

3. Эндонуклеаза SegE расщепляет двухцепочечную ДНК с образованием 3'-выступающих концов, состоящих из двух нуклеотидов. Минимальная последовательность ДНК, необходимая для гидролиза, асимметрична и расположена в положении от -2 до +17(+19) по отношению к центру сайта гидролиза. Сайт узнавания SegE высоковырожден, и не позволяет однозначно предсказать наличие сайта гидролиза по первичной структуре ДНК.

4. Изучено распространение гена segE в геномах ИВ- и Т-четных бактериофагов. Обнаружено, что у бактериофагов ЯВЗО и 1Ш51 этот ген отсутствует, но сохранены высокогомологичные фагу Т4 фланкирующие последовательности ДНК. Указанные данные позволили предположить, что ген segE является мобильным генетическим элементом.

5. Разработаны условия и зафиксирован высокоэффективный перенос гена ле^Е из донорных плазмид в геномы реципиентных бактериофагов КВЗО и ЯВ51. Этот процесс абсолютно зависит от сайтспецифической эндонуклеазной активности и гомологии ДНК между доноршлм и реципиентным аллелями. Таким образом впервые экспериментально показана способность гена сайтспецифической эндонуклеазы, имеющего внеинтронную и внеинтеиновую локализацию, выступать в роли мобильного генетического элемента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кадыров Ф.А., Крюков В.М., Шляпников М.Г., Баев A.A. SegE - новая сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза бактериофага Т4 // Доклады РАН. 1994. Т. 339. С. 404-406.

2. Кадыров Ф.А., Крюков В.М. "Мобильность" гена segE фага Т4: высокая частота переноса гена segE с плазмиды в геном фага зависит от интактности гена // Доклады РАН. 1996. Т. 346. С. 700-704.

3. Кадыров Ф.А., Калиман А.В., Крюков В.М. Эндонуклеаза SegE фага Т4. I. Клонирование, экспрессия и биохимическая характеризация эндонуклеазной активности//Молекулярная биология. 1996. Т. 30. С. 1096-1106.

4. Крюков В.М., Шляпников М.Г., Кадыров Ф.А. Эндонуклеаза SegE фага Т4. И. Определение и характеризация сайта узнавания // Молекулярная биология. 1996. Т. 30. С. A.VD-f - 1315

5. Кадыров Ф.А., Крюков В.М. Высокая частота переноса гена segE фага Т4 в геномы родственных фагов зависит от активности сайтспецифической эндонуклеазы, кодируемой этим геном // Тезисы международной конференции, посвященной памяти акад. А.А. Баева. Москва. 1996. С. 119.

6. Kadyrov F.A., Kryukov V.M. Endonuclease-encoding DNA of phage segE gene as mobile element II Abstracts of the "Molecu.ar genetics of bacteria & phages" meeting. Cold .. ng Harbor. USA. 1996. P. "

7. Kadyrov F.A., Shlyapnikov M.G., Kryukov V.M. SegB, SegD and SegE proteins of phag» T4 are endonucleases related to proteins encoded by group I introns // Abstracts of the "Molecular genetics of bacteria & phages" meeting. Cold Spring Harbor. USA. 1996. P. 59.

11.09.95 г. Зак.7212Р. Тир. 130 экз. Усл.печ.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в 0НТИ "ТНЦ РАН