Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства эндонуклеазы SegB бактериофага Т4 и ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Свойства эндонуклеазы SegB бактериофага Т4 и ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами"
На правах рукописи
БРОК-ВОЛЧАНСКАЯ ВЕРА СЕРГЕЕВНА
СВОЙСТВА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 8е§В БАКТЕРИОФАГА Т4 И ЕЕ РОЛЬ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ ОБМЕНЕ МЕЖДУ Т-ЧЕТНЫМИ БАКТЕРИОФАГАМИ
Специальность 03 00 03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ООЗ1ТОЭЬ4
Пущино-2008
003170954
Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г К Скрябина Российской Академии Наук
Научный руководитель:
кандидат химических наук Михаил Григорьевич Шляпников
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ольга Николаевна Озолинь
кандидат биологических наук Владимир Николаевич Ксензенко
Ведущая организация: Филиал Института биоорганической
химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова
Защита диссертации состоится 5 июня 2008 г в 16 30 ч на заседании диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская 3
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г Пущино
Автореферат разослан ______ 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук /ПС^л^^/ Т И Смолихина
Актуальность проблемы. Хоминг-эндонуклеазы являются сайт-специфическими ДНК-гидролизующими ферментами, которые кодируются открытыми рамками считывания (ОРС), расположенными внутри нитронов, интеинов, а также свободностоящими генами, и встречаются как у эу- и прокариот, так и у вирусов (Stoddard et al, 2005). Как правило, они являются несущественными "эгоистичными" генами и обеспечивают репликативное перемещение собственного нуклеазного гена и фланкирующих его последовательностей в безнуклеазный аллель Это явление получило название хоминг, от англ homing— "возвращение домой"
Актуальность изучения хоминг-эндонуклеаз обусловлена тем, что получаемые знания расширяют наши представления о фундаментальных молекулярных процессах, таких как механизмы узнавания и катализа ДНК, рекомбинации, ДНК-белковые взаимодействия, регуляция экспрессии генов Изучение этих ферментов также интересно с точки зрения познания эволюционных механизмов, поскольку считается, что хоминг-эндонуклеазы являются одним из эффективных инструментов эволюции фагов (Edgell et al, 2000) Кроме того, установление структурно-функционального родства среди представителей этого класса ферментов, также как и получение интегрированных знаний о появлении, эволюции или потери генов нуклеаз, внесет вклад в наши общие представления о развитии живого мира. В частности, вызывает интерес - почему в сравнительно небольшом геноме бактериофага Т4 (166 тпн) присутствует по крайней мере 14 потенциальных "эгоистичных" генов хоминг-эндонуклеаз, в то время как в родственных ему Т-четных фагах они встречаются редко7
Уникальная способность хоминг-эндонуклеаз узнавать протяженные (до 40 п н), вырожденные последовательности (Beifort et al, 1997) находит свое применение для решения практических задач при работе с ДНК Хоминг-эндонуклеазы используют для манипулирования как про-, так и эукариотическими геномами, в частности, для картирования геномов и клонирования, изучения репарации двухцепочечных разрывов в различных биологических системах, а также для направленного мутагенеза Следует, однако, отметить, что созданные к настоящему времени системы для направленного введения мутаций с участием хоминг-эндонуклеаз являются или трудоемкими, или их применение ограничено узким кругом бактерий (Posfai et al, 1999, Herring et al, 2003, Kang et al, 2004) Кроме того, хоминг-эндонуклеазы удобны для экспериментов редизайна и последующей селекции создаваемых in vitro нуклеаз с заданной специфичностью
Цель работы. Цель данной работы заключалась в изучении свойств эндонуклеазы SegB бактериофага Т4, ее роли в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами, а также возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas
Основные задачи исследования.
- проанализировать структуру кластеров генов тРНК у Т-четных бактериофагов с целью поиска сайта гидролиза SegB,
- получить очищенный препарат SegB и охарактеризовать биохимические свойства белка,
- установить предпочтительный сайт гидролиза SegB и охарактеризовать особенности взаимодействия фермента с ДНК,
- изучить возможную роль SegB в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами в области генов тРНК;
- проанализировать частоту встречаемости сайтов SegB в геномах бактерий Е coli и Р aeruginosa, а также способность эндонуклеаз SegB и SegD узнавать искусственно введенные собственные сайты в геноме Р aeruginosa,
- изучить способность эндонуклеаз SegB и SegD стимулировать рекомбинацию в бактериях рода Pseudomonas и разработать на их основе систему направленного внесения мутаций в геном этих бактерий
Научная новизна. Полученные в настоящей работе данные о свойствах хоминг-эндонуклеазы SegB расширяют наши знания о хоминг-эндонуклеазах, принадлежащих к мало изученному GIY-YIG-семейству.
При поиске сайта гидролиза SegB была определена структура ранее не изученного кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L В отличие от Т4, у этих фагов отсутствует ген segB и фланкирующие его гены тРНК, которые замещены генами, кодирующими тРНКМй, тРНКТуг, тРНК^" и изоакцепторную тРНКА'8 Кроме того, у бактериофага T2L найдены две ОРС trna 1 и trna 2 неизвестной функции
Охарактеризован новый фермент - хоминг-эндонуклеаза SegB, которая является Mg^-зависимой сайт-специфической эндонуклеазой и обладает ярко выраженной иерархией в узнавании сайтов Предпочтительный сайт узнавания обнаружен в гене TPHKAsn фага T2L, а менее предпочтительные - во всех остальных генах тРНК T2L Показано, что сайт узнавания SegB является протяженным (27 пн), асимметричным и вырожденным Существенным элементом узнавания SegB является последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент Т»|/С-ветви тРНК, а последовательность CCR позиционирует точку разрыва. На основе полученных результатов о характере взаимодействия SegB с субстратом, а также анализа аминокислотной последовательности (база данных Pfam, Sitbon and Pietrokovski, 2003), было выдвинуто предположение, что структурная организация белка, а также характер узнавания и гидролиза ДНК, укладывается в модель, предложенную для I-Tevl. По-видимому, также как и I-Tevl, SegB состоит из N-концевого каталитического и С-концевого ДНК-связывающего доменов В пользу того, что домены связаны между собой гибким линкером, свидетельствует способность SegB смещать основную точку разрыва относительно нахождения CCR. По-видимому, фермент узнает ДНК по малой бороздке, тк природные модификации ДНК Т-четных фагов (гликозилирование и оксиметилирование) не влияют на специфичность и эффективность гидролиза SegB Установлено, что ген segB фага Т4 является "мобильным эндонуклеазным геном", который обеспечивает генетический обмен между фагами Т4 и T2L в процессе генной конверсии Предложен способ регуляции экспрессии гена segB на уровне трансляции, которая объясняет механизм защиты фага Т4 от кодируемых им эндонуклеаз с вырожденным сайтом узнавания
Научно-практическая ценность. Данные о сайте узнавания и о двухдоменной организации SegB могут быть полезны при создании новых
4
эндонуклеаз с заданной специфичностью SegB также можно использовать для получения больших фрагментов ДНК, например, с целью их последующего клонирования Разработана эффективная система SegD-индуцируемого направленного мутагенеза m vivo в бактериях рода Pseudomonas, которая существенно упрощает процедуру получения мутантов и может быть применена при исследовании функций генов этих бактерий, а также при конструировании штаммов с заданными свойствами Полученные в работе результаты могут послужить основой дня дальнейшего развития созданной системы и ее адаптации для других бактерий Высоко специфичная эндонуклеаза SegD может бьпъ использована для работы с прокариотическими геномами, в частности для внесения делеций в хромосому Pseudomonas
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "Pseudomonas 2007" (Seattle, 2007), "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" (Madison, 2007), "9th Symposium on BAGEC09" (Wernigerode, 2007), 12-ой международной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 2005), а также 6-ой Путинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2002) и ежегодной сессии Ученого совета ИБФМ РАН, посвященной подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 2001, 2003, 2005)
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 2-х статьях
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Диссертация изложена на 162 страницах, материал иллюстрирован 39 рисунками и 9 таблицами Библиография включает 312 ссылок.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SegB БАКТЕРИОФАГА Т4
Определение структуры кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L. Как
правило, предпочтительные сайты гидролиза для хоминг-эндонуклеаз обнаруживаются в гомологичных аллелях родственных им фагов, не содержащих кодирующие их ОРС (Kadyrov et al, 1996, Belle et al, 2002, Liu et al., 2003) Поскольку ген segB располагается в кластере генов тРНК фага Т4, то для поиска сайта гидролиза SegB были определены и проанализированы нуклеотидные последовательности в области генов тРНК фагов T2L, RB1 и RB3 (EMBL асс по AJ880101, AJ884577, AJ884578), а также построены их генетические карты (рис 1). Область генов тРНК фагов T2L, RB1 и RB3 высоко гомологична таковой фага Т4 за исключением отсутствия гена segB и фланкирующих его генов тРНК, которые замещены на "блок" из четырех генов, кодирующих тРНКМй, тРНКТуг, тРНК^" и изоакцепторную тРНК^8, а также гомологичную PHKII В фаге T2L также обнаружены две ОРС trna 1 и trna 2 неизвестной функции Поскольку в
исследуемых фагах отсутствует ген segB, было сделано предположение, что в области генов тРНК фагов T2L, RB1 и RB3 содержатся сайты гидролиза для SegB
bGln leu Gly ProSerllhr Ile _segB к Arg II I e S
14 гЛ P**S f—N [-Л г*r-N I \ f—p-^if—» I-\
L i i . i . y v i" 1 1 /
I I * "
i Gin Leu Gly Pro Sert tma 1 Met TyrAsnTArg trna 2 II I e S
T2L H^K^QOO—i-У^М^к^фч-)шп-□
_98%__5 2 97%
RBI, RB3
L- Gin leu Gly Fro Ser^Thr MatTyr Aan^Arg il i
97% 96%
1 T п я
Рис. 1. Структура кластеров генов тРНК фагов RBI, RB3, T2L и Т4
Горизонтальными серыми стрелками (гены тРНК) и прямоугольниками (гены гпа\ и rnall) обозначены гомологичные Т4 гены фагов RBI, RB3 и T2L, заштрихованными стрелками (гены тРНК) или прямоугольниками (гены rnal и rnall) обозначены гены, отсутствующие в Т4 или кодирующие изоакцепторные тРНК Предсказанная аминокислотная специфичность кодируемых тРНК указана над соответствующими генами ОРС обозначены горизонтальными белыми стрелками Вертикальными стрелками обозначено положение сайтов расщепления Предпочтительный сайт расщепления в гене tPHKAs° обозначен жирной стрелкой Положение праймеров указано горизонтальными стрелками над и под последовательностями генов тРНК Область гомологии ДНК фагов RBI, RB3, T2L с Т4 подчеркнута серыми линиями с указанием степени гомологии между ними в процентах
Ген segB кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу. Чтобы охарактеризовать свойства SegB был получен очищенный препарат этого белка Для этого, учитывая данные о токсичности известных сайт-специфических эндонуклеаз, ген segB (GenBank асс no Z69338) был клонирован под контролем Т7/ас-промотора и экспрессирован в наиболее подходящей для этого системе промотор/РНК-полимераза фага Т7 (Studier and Moffart, 1986) Очищенный препарат SegB получен последовательной хроматографией на фосфоцеллюлозе, Ni-NTA агарозе, гидроксилаппатите и Mono-S Молекулярная масса SegB, содержащего на N-конце кодируемую вектором последовательность из 20 аминокислот, составляет 28,3 кДа (рис 2, А) Тестирование эндонуклеазной активности полученного препарата белка проводили на ПЦР-фрагменте фага RB1, содержащего кластер генов тРНК Показано, что SegB обладает сайт-специфической эндонуклеазной активностью (рис 2, Б) SegB расщепляет ДНК с образованием 5'-Р и З'-ОН концов, что было подтверждено в экспериментах по лигированию продуктов гидролиза SegB с Т4 ДНК-лигазой.
При изучении основных биохимических особенностей белка было определено, что эндонуклеазная активность SegB стимулируется двухвалентными катионами в порядке уменьшения в ряду Mn +>Mg2+>Ca +>Zn2+=0, где ионы Zn2+ являются каталитически неактивными (рис 3) Оптимальная концентрация катионов Mg2+ находится в диапазоне 9-15 мМ Ионы Zn2+, по-видимому, конкурируют с ионами Mg2+ за активный центр, поскольку они ингибируют М§2+-зависимую эндонуклеазную активность фермента Стандартными условиями, которые были
использованы для анализа активности SegB, являлись: 10 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 0,02% тритон Х-100, 0,1 мг/мл БСА, 1 мМ ДТТ, 30 °С.
SegB
21,5-
1071-
717-
354-
2
Рис. 2. А. Продукция и очистка
SegB. Электрофоретическое разделение в 15% денатурирующем ПААГ экстрактов клеток BL21(DE3)/pLysE, трансформированных вектором рЕТ15Ь и плазмидой pSBET-15b, содержащей ген segB, после 4 ч индукции; SegB - очищенный препарат белка (0,7 мг). Слева приведены маркеры молекулярных масс. Б. Тестирование сайт-специфической эндонуклеазной активности SegB. Гидролиз ПЦР-фрагмента, амплифицированного с праймерами 1 и 2 и содержащего кластер генов тРНК фага RB1. Расположение праймеров см. на рис. 1.
п.и. 3786 -
2 "V у <v> <v <v / С? с? $
Рис. 3. Влияние двухвалентных катионов на активность SegB. В качестве субстрата использовали линеаризованную по ЕсоЗП плазмиду pURBlsB, содержащую кластер генов тРНК фага RB1. -Ме2+ - реакция в отсутствии двухвалентных катионов. Конечная концентрация катионов в реакционной смеси составляет 10 мМ. К - плазмида pURBlsB, не обработанная SegB.
Предпочтительный сайт расщепления SegB находится в последовательности гена тРНК4™. Для некоторых эндонуклеаз из семейства GIY-YIG известно, что они обладают ярко выраженной иерархией сайтов узнавания, что проявляется в более эффективном расщеплении одних сайтов по сравнению с другими (Bryk et al., 1993; Kadyrov et al., 1997). Чтобы идентифицировать предпочтительный сайт узнавания для SegB ПЦР-фрагменты, содержащие кластер геНов тРНК фагов Т4 и T2L, обрабатывали SegB. При этом количество участков гидролиза зависело от соотношения фермент/субстрат в реакционной смеси. Наиболее эффективно расщеплялся фрагмент фага T2L, и с помощью картирования было установлено, что гидролиз этого фрагмента происходил в области гена тРНК (рис. 4, проба 5; рис. 1). Вторые по предпочтительности сайты были картированы в области генов TPHKSer фагов Т4 и T2L (рис. 4, пробы 9 и 10; рис. 1). Наименее предпочтительные сайты гидролиза находились на расстоянии приблизительно 90 п.н. друг от друга и проявлялись только при увеличении количества SegB (рис. 4, проба 10). Данное расстояние совпадает со средним размером генов тРНК. Поэтому было сделано предположение, что SegB узнает некую регулярно встречающуюся в генах тРНК последовательность.
SegB
(ед. ) : М
п.н. |
2000 - ■Ш 9 т
1500 - ш
1000 - т
800- »
600 - »
400 - •
200 - в
"H в
СМ
В Ь
к, ■
^ f I
■■ » ^ ? * I , • # *'■ *
Рис. 4. Сравнительный гидролиз SegB ПЦР-фрагментов кластеров генов тРНК фагов T2L и Т4. Т4 и T2L"
- ПЦР-фрагменты фагов Т4 и T2L амплифицированные с праймерами 1 и 2 и содержащие кластер генов тРНК фагов Т4 и T2L, соответственно; T2Lb - ПЦР-<1241 фрагмент фага T2L, амплифицированный с праймерами 1 и 5 и содержащий участок кластера генов тРНК без "*710 tPHKás". Треугольниками показаны 590 продукты расщепления T2La в тРНКД5П 460 (1241 и 710 п.н.) и T2Lb в TPHKSer (590 и 460 п.н.). М - маркеры длин фрагментов ДНК. Расположение праймеров см. на рис. 1.
1234567 89 1011
верхняя цепь
-SegB +SegB 12GATCGATC
ж
нижняя цепь +SegB -SegB
GATCGATC21
taog 3'
» Y
5' tataGGTTCGAATCCTATCACGTCCGCC
3' atatCCAAGCTTAGGATAGTGCAGGCGGTTTatgc 5'
Л Д §
Рис.
гидролиза и границ сайта SegB в гене тРНК " фага
5. Определение точек и границ сайта узнавания T2L. А.
Представлены радиоавтограммы участков секвенирующих гелей для верхней и нижней цепей ДНК. Пробы 1 и 2 -продукты реакции элонгации меченного праймера до и после инкубации с SegB, соответственно. G, А, Т и С - продукты секвенирующих реакций, полученные в присутствии соответствующих
терминаторов, до и после инкубации с SegB. Слева и справа представлены фрагменты последовательностей верхней и нижней цепей, соответственно, в которых положение точек разрывов ДНК в верхней и нижней цепи указано черными и белыми стрелками, соответственно; мажорные точки разрыва обведены. Результаты анализа обобщены в части Б, в которой минимальная последовательность, необходимая для гидролиза, выделена заглавными буквами.
SegB узнает консервативную последовательность гена тРНК, кодирующую Т\|/С-ветвь. Чтобы охарактеризовать узнаваемую SegB последовательность были определены границы сайта узнавания фермента в области гена тРНКАь" фага T2L, а также локализованы точки гидролиза SegB в менее предпочтительных сайтах (рис. 5 и 6). Показано, что предпочтительный сайт SegB полностью располагается на 3'-конце гена tPHKas" и является протяженной
последовательностью длиной 27 п.н. При гидролизе фермент вносит 3 разных по эффективности двухцепочечных разрыва с образованием 3'-выступающих концов длиной 2 н.о. При этом мажорный разрыв расположен асимметрично относительно сайта узнавания на его 3'-конце (рис. 5, Б). Установлено, что наблюдаемые нами регулярные разрывы (рис. 4) действительно находятся на 3'-концах генов тРНК фага T2L (рис. 6).
ген: тРНК»1" тРНК"" тРНК"» тРНК'"
-a i» А х и х ¿ 5 Жж.f г ! -К ta А X U L Z У э /С с т т с т с G С 1 А -L ü А Г V/ X ¿ V * 9 i-- Э I с 1 с G S*» с А® т т -Е G А Т С 12 К ~ ÉÉ 9 m j" Ж 'Ж ш Ш
5* « * с , ШШШ. А Ш Ш 1 с 1 с ;А® !А® ■'1 Ш * »* шшшшш А т" \т 3' » m %
А®
В
А
(Г3
6 \А 3'
тРНК тРНК""
-EGATC12 5' -Е G А Т С 1 2 5' -EGA
Г JT . Igj. J% щг.
и
с-
\ 1 щ.
г •
ш ш
» ж
\т
3'
Рис. 6. Определение точек разрывов, вносимых SegB в последовательности генов тРНК фага T2L. Представлены радиоавгограммы участков секвенирующих гелей для верхней цепи каждого гена тРНК. Олигонуклеотидные праймеры, специфичные к каждому из генов тРНК, после отжига достраивали Секвеназой (-Е), инкубировали с SegB (1) и обрабатывали фрагментом Кленова (2) для определения точек разрывов во второй цепи. В качестве маркеров длин фрагментов ДНК использовали продукты секвенирующих реакций (G, А, Т и С), полученных с соответствующими праймерами. Справа от каждой радиоавтограммы представлена последовательность, окружающая сайты расщепления; положение точек разрывов ДНК в верхней и нижней цепях указано черными и белыми стрелками, соответственно; мажорные точки разрыва обведены.
Для выявления консервативных остатков в последовательности сайта узнавания SegB было проведено выравнивание последовательностей, окружающих основные разрывы в каждом гене тРНК, с предпочительным сайтом узнавания SegB в гене tPHKAs" фага T2L и выведен консенсус сайта узнавания (рис. 7). Сайт узнавания SegB является вырожденным. На 5'-конце присутствует последовательность RGTTCRANTCC, которая, по-видимому, является основным элементом узнавания и содержит в себе RGTTCRA, кодирующую консервативный элемент Т*|/С-ветви тРНК. Средняя часть сайта является наиболее вырожденной, а на 3'-конце в большинстве генов тРНК находится последовательность CCAR,
непосредственно за которой следует мажорный разрыв. При отсутствии последовательности ССА предпочтительная точка гидролиза смещается по направлению к 5'-границе сайта узнавания. Последовательности наиболее предпочтительных сайтов узнавания SegB в генах тРНКЛет и тРНК&г отличаются пятью нуклеотидами: G6, А16, Gl 8, А26 и А27. Возможно, что все или некоторые из них важны для эффективного узнавания субстрата SegB.
Рис. 7. Выравнивание
нуклеотидных последовательностей
сайтов узнавания SegB в различных генах тРНК фагов Т4 и T2L. Выравнивание проводили с помощью программы ClustalW v.l.7. Темно-серым цветом выделены нуклеотиды, встречающиеся во всех последовательностях; светло-серым -встречающиеся не менее чем в 70% случаев. Треугольниками указаны основные точки гидролиза SegB. В предпочтительном сайте SegB в гене тРНКАзп обведены нуклеотиды, отличающие его от менее предпочтительного сайта в гене TPHKSer T2L.
Природные модификации ДНК Т-четных фагов не влияют на специфичность и эффективность гидролиза SegB. Известно, что природная ДНК Т-четных фагов вместо цитозина содержит гликозил-5-гидроксиметил-цитозин (Revel, 1983), громоздкие боковые группы которого направлены в большой желобок. Кроме того, Т2 и Т4 отличаются по характеру и степени гликозилирования (Lehman and Pratt, 1960). Для проверки возможного влияния этих модификаций на эндонуклеазную активность исследуемого фермента ДНК фагов T2L и Т4, содержащих в ДНК гликозил-5-гидроксиметил-цитозин, а также Т4290 и Т4а/с7, которые содержат 5-гидроксиметилцитозин и цитозин, соответственно, была гидролизована SegB. Оказалось, что все исследуемые ДНК расщепляются со сходной эффективностью и специфичностью (рис. 8, А). С помощью Саузерн-анализа с 2Р-меченной пробой, комплементарной области генов тРНК фагов T2L (рис. 8, Б) и Т4, было показано, что SegB расщепляет природную ДНК фага T2L предпочтительно в тРНКМп, а Т4 - в гене TPHKSer.
Поскольку модификации ДНК Т-четных фагов не влияют на эффективность и специфичность гидролиза, можно предположить, что SegB узнает ДНК преимущественно по малому желобку. В целом, характер взаимодействия SegB с ДНК-субстратом, по-видимому, укладывается в модель, предложенную для I-Tevl (Derbyshire et al., 1997). Подобно I-TevI, каталитический N-концевой домен SegB содержит GlY-YIG-мотив и связан с узнающим С-концевым доменом также гибким линкером, что подтверждает способность SegB смещать основную точку разрыва относительно CCR. У обоих ферментов на С-конце белка содержится мотив "NUMOD 3", ответственный за связывание с минорным желобком ДНК (Sitbon and Pietrokovski, 2003). Вследствие вырожденности сайта гидролиза SegB можно предположить, что, как и I-Tevl, SegB образует специфичные множественные
15 20 25 •actgcctcgaccaat
cacttctcgcaccaÍa
8 St
tcattatccgctccaat
.cccagggccaccaaa .TCACTCCCCACCAAT (tat с •atcgcctccsecagt
!tatcgcct|§gta||tt 'ttattcc|ai^otga 'tgtatggagaÍttgga
консенсус GGTTCRANTCCNNNNNNNNCCNCCANY
контакты с основаниями на всей протяженности ДНК-субстрата, обеспечивая его толерантность к отдельным нуклеотидным заменам в сайте узнавания.
Рис. 8. Влияние модификаций цнтозина ДНК Т-четных фагов на эндонуклеазную активность SegB. А. ДНК фагов T2L, Т4В, Т4290 и Т4alc7 была гидролизована SegB при стандартных условиях с последующим разделением продуктов ДНК в 1% агарозном геле с помощью пульс-электрофореза. Б. Представлена радиоавтограмма агарозного геля, содержащего продукты гидролиза SegB (1 ед.) Smil-фрагментов ДНК фага T2L. Саузерн-блот-анализ проводили с 32Р-меченым зондом, комплементарным области генов тРНК фага T2L. В. Рестрикционная карта области генов тРНК фага T2L, построенная на основе анализа данных, поедставленных в части Б.
SegB инициирует хоминг собственной ОРС при скрещивании Т4 и T2L.
Чтобы изучить возможную роль SegB в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами в области генов тРНК была проверена способность SegB инициировать хоминг собственного гена. С этой целью были проведены скрещивания T2L с различными вариантами Т4. В частности, были использованы фаги В20 (вариант Т4 с amber-мутацией в гене 14) и B20AsegB (В20, который содержит делецию в гене segB длиной 237 и.о.). Скрещивания проводили на su+штамме Е. coli, а затем проверяли наследование потомством гена segB, а также а/я&ег-мутации, которая служила независимым генетическим маркером одного из родительских генотипов в потомстве. При наличии полноразмерного гена segB в геноме В20 более 99% потомства содержало segB, тогда как нарушение ОРС segB приводило к снижению ее доли в потомстве до 63%. В то же время, характер наследования гена 14 не зависел от интактности гена segB: доля awèer-мутации в обоих скрещиваниях составляла около 65% (табл. 1 А Б).
Таким образом, при скрещивании Т4 и T2L SegB инициирует хоминг собственного гена, что сопровождается исключением кластера генов тРНК фага T2L с замещением негомологичной Т4 области длиной -1250 п.н. (табл. 1 в' г). Эти результаты подтверждают идею Белле, что явление исключения большинства генетических маркеров T2L, наблюдаемое в смешанных инфекциях с Т4, является совместным результатом действия хоминг-эндонуклеаз фага Т4 (Belle et al., 2002). Возможно, что одним из объяснений наличия 14 "эгоистичных" генов хоминг-эндонуклеаз в сравнительно небольшом геноме фага Т4 (166 т.п.н.) является приобретение фагом Т4 эволюционного преимущества перед родственными фагами. Кроме того, обладая вырожденными сайтами узнавания, эти нуклеазы могут
Табл. 1. Наследование генов 14, segB, trna.1 и trna.2, потомством смешанных инфекций В20 в T2L.
Скрещивание БДоля потомства, содержащая amber-мутацию в 14 гене, % АДоля потомства, содержащая ОРС segB, % вДоля потомства, содержащая ОРС trna 1, % гДоля потомства, содержащая ОРС trna 2, %
B20x T2L 65,1 ± 1,6 99,6 0,4 0,4
B20AsegB x T2L 65,5 ±0,6 63 - -
А - проанализировано 600 фаговых бляшек, полученных в двух независимых экспериментах Процент потомства, содержащий amber-мушцио, рассчитан как отношение разницы между общим количеством потомства (растущим на Sul штамме) и потомством дикого типа (растущим на Sup° штамме) к общему количеству клонов, умноженное на 100 Б, В, Г - с помощью Саузерн-гибридизации проанализировано 467 фаговых бляшек, полученных в двух независимых экспериментах Процент потомства, содержащий OFC генов, рассчитан как отношение количества фаговых бляшек, дающих положительный сигнал при гибридизации зонда с соответствующим геном, к общему количеству проанализированных фаговых бляшек, умноженное на 100
расщеплять не только предпочтительные сайты узнавания, располагающиеся, как правило, в родственных фагах, но и в собственную ДНК Т4, содержащую гены этих ферментов Очевидно, что фаг Т4 должен жестко регулировать экспрессию потенциально токсичных для него генов В случае SegB мы не смогли обнаружить его эндонуклеазную активность в клеточных экстрактах Т4-инфицированных клетках Е coli, в то время как эндонуклеазная активность других Seg-бвлков (SegC и SegD) детектировалась (данные не приведены) По-видимому, SegB синтезируется в небольших количествах и при коинфекции Т4 и T2L его количества достаточно лишь для внесения разрыва в последовательность предпочтительного сайга и инициирования генетического обмена между фагами
Учитывая анализ структуры ДНК непосредственно перед ОРС segB, а также литературные данные по транскрипции области генов тРНК, было предположено, что наибольший вклад в регуляцию экспрессии segB вносит регуляция на уровне трансляции. Один из возможных механизмов заключается в закрытии области инициации трансляции ОРС segB стабильной шпилькой, которая может образовываться на ее 5'-конце Как последовательность Шайна-Дальгарно, так и инициирующий кодон segB находятся в стебле шпильки Ингибигорный эффект шпильки на трансляцию был показан для интрон-кодируемых хоминг-эндонуклеаз I-Tevl, I-TevII и I-TevIII фага Т4 (Gott et al, 1988) Другим возможным механизмом может являться уменьшение эффективности трансляции мРНК segB вследствие ее сайт-специфического расщепления между последним и стоп-кодонами с помощью РНКазы F (PC) хозяина во время процессинга первичного транскрипта при созревании тРНК*18 (Schmidt and Apirion, 1983) Это может, с одной стороны, способствовать деградации мРНК и, с другой стороны, приводить к синтезу неактивного белка Снижение уровня экспрессии гена вследствие процессинга первичного транскрипга было показано для хоминг-эндонуклеазы МоЬЕ фага Aehl (Gibb and Endgell, 2007)
II. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ SegB ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ВВЕДЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНОМ БАКТЕРИИ РОДА Pseudomonas
Эндонуклеаза SegB не способна узнавать in vitro предпочтительные сайты в геноме Р. aeruginosa. Первоначально была изучена частота встречаемости сайтов узнавания SegB в геномах Е. coli и Р. aeruginosa. Показано, что в Е. coli и Р. aeruginosa сайты гидролиза встречаются приблизительно через каждые 100 и 50 т.п.н., соответственно. Чтобы изучить способность SegB узнавать предпочтительные сайты по сравнению с другими потенциальными сайтами гидролиза в геном Р. aeruginosa были введены два сайта гидролиза SegB на расстоянии 439 т.п.н. друг от друга (рис. 9, А). Для сравнения была использована эндонуклеаза SegD, которая, по данным Колосова П. М., имеет менее вырожденный по сравнению с SegB сайт узнавания (неопубликованные данные). В качестве сайтов гидролиза для эндонуклеазы SegB был использован предпочтительный сайт узнавания SegB, находящийся в гене tPHKAs" фага T2L, а для эндонуклеазы SegD - сайт в области генов 23-24 фага T2L, определенный Колосовым П. М. с соавт. (неопубликованные данные). При гидролизе геномных ДНК полученных штаммов РАОВ2 и PAOD2 эндонуклеазами SegB и SegD, соответственно, в случае SegB появление специфического фрагмента не наблюдалось, в то время как из геномной ДНК PAOD2 выщеплялся ожидаемый специфичный фрагмент ДНК размером 439 т.п.н. (рис. 9, Б, пробы 6 и 13).
Таким образом, в отличие от SegD, эндонуклеаза SegB не способна in vitro эффективно узнавать последовательности предпочтительного сайта расщепления в составе генома Р. aeruginosa.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Рис. 9. Анализ способности SegB и SegD узнавать искусственно введенные сайты в составе генома PAOl P. aeruginosa. А. Схема расположения сайтов гидролиза SegB и SegD в хромосоме штамма РА01. Б. Анализ специфичности SegB и SegD при гидролизе геномных ДНК штаммов PAOl (1), С600 (2), PAOD2 (3) и РАОВ2 (4). Разделение фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле с помощью пульс-электрофореза. М - конкатемеры фага X; I-Ceul (5 ед.), I-Scel (5 ед.), SegD (2 ед.) и SegB (I ед.).
Система SegD-индуцированного направленного мутагенеза в P. aeruginosa. Классический способ получения мутантов основывается на гомологичной рекомбинации между мутантным аллелем гена, расположенным на плазмиде, и диким аллелем в хромосоме Но, в ряде случаев, он оказывается неэффективным вследствие невысокого уровня гомологичной рекомбинации, низкой частоты двойных обменов, или зависимости используемого при этом метода негативной селекции sacB/сахароза от штамма, ориентации гена-мишени и гена sacB в геноме Известно, что присутствие двухцепочечных разрывов в ДНК увеличивает уровень гомологичной рекомбинации от 10 до 1000. Этот факт был использован при разработке системы направленного мутагенеза, названной нами Seg-индуцируемый направленный мутагенез Данная система основана на внесении эндонуклеазой SegB или SegD двухцепочечных разрывов по флангам мутантного гена, расположенного на плазмиде, в результате чего предполагалось повысить частоту двойных обменов между плазмидой и хромосомой
Для проведения Seg-индуцированного направленного мутагенеза были сконструированы специальные штаммы РАОsegB{D) Для этого в геном штамма PAOl Р aeruginosa за счет сайт-специфической интеграции с использованием интеграционной системы фага фСТХ (Hoang et al, 2000) в а//В-сайт, расположенный в хромосоме бактерии в гене TPHKSer, были введены гены segB(D) под контролем Т7/<зопромотора и конститутивно экспрессирующийся ген lacl для регулирования экспрессии этих генов Также были сконструированы вектора pUT7sBl(Dl)Ap, отличительной особенностью которых является наличие в них сайтов SegB(D), фланкирующих полилинкер В качестве модельного гена был использован ген phzS из бактерии Р aeruginosa, который участвует в синтезе феназинов Мутация в этом гене фенотипически проявляется в изменении природного сине-зеленого цвета колоний на красный Мутантный ген phzS" Тс, нарушенный встраиванием тетраци клиновой (Тс) кассеты, был клонирован в полилинкер векторов pUT7sBl(Dl)Ap. Полученные плазмиды pUTSBl(Dl) были использованы для тестирования системы Seg-индуцированного мутагенеза
Схема экспериментов состояла в скрещивании штамма S17-1 Е coh, содержащего плазмиду pUTSBl(Dl), со штаммом PAOsegB(D) Р aeruginosa на агаре с ИПТГ и последующей селекции клеток По нашим представлениям, после введения pUTSBl(Dl) в клетки РАОsegB(D) в присутствии индуктора ИПТГ происходит последовательная транскрипция генов Т7 РНК-полимеразы (TlRNApol) и segB(D) Появившийся в клетках белок SegB(D) вносит двухцепочечные разрывы в собственные сайты по флангам phzS Тс, расположенного на плазмиде, и стимулирует частоты двойных обменов между phzS .Тс на плазмиде и phzS в хромосоме (рис 10, Л+П) В случае же одиночного обмена будет происходить встраивание всей плазмиды в хромосому с образованием меродиплоида При этом порядок расположения мутантного и дикого аллеля генов phzS в хромосоме меродиплоидов может быть различным (рис 10, JI и П)
При проведении экспериментов рекомбинанты отбирали по устойчивости к Тс, что гарантировало присутствие мутантного аллеля гена phzS в хромосоме Чтобы определить долю собственно мутантов и меродиплоидов Тс-усгойчивые клоны анализировали на наличие плазмидных маркеров по чувствительности к карбиницилину (СЬ) и устойчивости к сахарозе (Sue) Оказалось, что в присутствии
эндонуклеаз в клетке повышается эффективность образования мутантов по
гену ркгБ до 100%, тогда как в штамме дикого типа РА01 она не превышает 28% (табл. 2). Накопление красного пигмента в клетках подтвердило, что полученные клоны действительно содержат мутацию в гене рИгБ, в то время как меродиплоиды
РАО segB(D) Тс', СЪ*, Sue1 PhzS+
pOTSBl(Dl)
PAOsegB(D) [phzS: : Tc]
Tc', Cb1, Sue"
PhzS+
T7 lac
PAOsegB(D) [phzS: : Tc] lad fsegB(D)
Tc*, Cbr, Sue* —ff—
PhzS *
S phzS::Tc
4 9~Д^¡¡вЕЗ^Ш-//-
phzS::Tc
Tllac
л+п PAOsegB(D) (phzS: :Tc) lad psegB(D)
Te',Suc*,Cb" — II—<1 W-
PhzS"
Рис. 10. Схема направленного внесения мутации в ген phzS штаммов VXOsegßiD) P. aeruginosa. JI и П - варианты меродиплоидов с различным порядком расположения генов, которые образуются в результате одиночного обмена между phzSw Тс на плазмиде и phzS в хромосоме, при котором рекомбиногенным является левый (JI) или правый (П) фланг гена phzS. Л+П - образование мутанта в результате двойного обмена между phzSr.Tc и phzS. Устойчивость или чувствительность к антибиотикам (Тс и СЬ) или сахарозе (Sue) обозначена верхним индексом г или s, соответственно. S - положение сайтов гидролиза SegB(D); TIRNApol - ген Т7 РНК-полимеразы. Горизонтальными стрелками над и под последовательностями генов указано положение праймеров.
Табл. 2. Эффективность образования phzS-мутантов в P. aeruginosa при наличии SegB(D)-cafiTOB в донорной плазмиде.
ИПТГ, мкМ PA01(pfeÄ:Tc), % PAOsegB(phzS::Tc), % PAOsegD(phzS::Tc), %
0 19 7 13
20 - 45 100
40 - 92 100
100 28 100 100
Штаммы РА01 и ?AOsegB(D) скрещивали с 817-1, трансформированным плазмидой р1ГГ8В1 в случае РА01 и \'ЛOsegB. или рУТ8Ш в случае РАОsegD. Каждый вариант скрещивания проводили в 2 - 3 повторах и в каждом случае анализировали 50 - 100 колоний. PA()\(ph~S:■.'^ c) и ?AOsegB(D)(phzS::^c) - рекомбинантные клоны, в которых прошел двойной обмен.
сохраняли сине-зеленую окраску
Таким образом, при экспрессии генов segB{D) в клетках происходит эффективное образование мутантов Это может быть обусловлено тем, что эндонуклеазы стимулируют частоты двойных обменов внесением разрывов по флангам мутантного аллеля гена phzS в составе плазмиды, или тем, что образуемые меродиплоиды являются нежизнеспособными, поскольку в их хромосомах присутствует ген T7RNApol, что приводит к постоянной экспрессии потенциально токсичных эндонуклеазных seg-генов. Чтобы определить какое из этих двух предположений верно было проверено влияние экспрессии SegB и SegD на частоту двойных обменов в отсутствии SegB(D)-cafiTOB в донорной плазмиде Оказалось, что в отсутствии SegB-сайтов в донорной плазмиде при экспрессии SegB, частота двойных обменов повышается как минимум в три раза, до 98% В случае же SegD она не увеличивалась по сравнению с штаммом дикого типа (табл 3) Другими словами, в отличие от SegD, экспрессия эндонуклеазы SegB в клетках псевдомонад оказывает на них некоторое токсичное действие, по-видимому, вследствие высокой частоты встречаемости сайтов узнавания SegB в геномах этих бактерий. Таким образом, в случае SegD наблюдаемое повышение частот двойных обменов в предыдущем эксперименте обусловлено внесением SegD разрывов в донорную плазмиду В результате, разработанную систему SegD-индуцированного направленного мутагенеза можно эффективно использовать для получения мутантов в Р aeruginosa за счет повышения частот двойных обменов
Табл. 3. Эффективность образования /?Лг£-мутантов в P. aeruginosa в отсутствии SegB(D)-caÜTOB в донорной плазмиде.
ИПТГ, мкМ РАОsegBiphzS Тс), % РАОsegD(phzS Тс), %
0 39 27
20 - 29
100 98 -
Штамм РАО segB(D), содержащий ген segB(D), скрещивали с S17-1, трансформированным плазмидой pUTSDl(Bl), несущей сайты гидролиза эндонуклеазы SegD (В) Каждый вариант скрещивания проводили в 2 повторах и в каждом случае анализировали 50 колоний РАОsegB(D)(phzS Тс) - рекомбинантные клоны, в которых прошел двойной обмен
Эндонуклеаза SegD повышает частоты внутрихромосомной рекомбинации в Р. aeruginosa. Практический интерес представляло изучение способности эндонуклеаз SegB и SegD стимулировать внутрихромосомную рекомбинацию, поскольку это можно было бы использовать для безмаркерного замещения генов в хромосоме или внесения делеций в геном Для экспериментов были отобраны меродиплоиды ?AOsegB(D)[phzS-Tc] в хромосоме которых, помимо гена segB(D), содержатся гены phzS и phzS Тс, между которыми находится фланкированная двумя сайтами для SegB(D) последовательность плазмиды pUTSBl(Dl), содержащая, в том числе, ген T7RNApol По нашим представлениям, в присутствии индуктора ИПТГ будет происходить последовательная транскрипция генов T7RNApol и segB(D) Появившийся в клетках белок SegB(D) будет вносить двухцепочечные разрывы в собственные SegB(D)-cafiTbi и, таким образом,
стимулировать внутрихромосомную рекомбинацию между гомологичными последовательностями phzS и phzS Тс Рекомбинационное событие, инициированное на левом и правом флангах генов phzS и phzS Тс, будет приводить к разрешению меродиплоида к дикому или мутантному генотипам, соответственно (рис 11, JI иП)
Перед проведением экспериментов с помощью ПЦР (расположение праймеров см. рис. 10) был установлен порядок расположения генов phzS и phzS..Тс в геномах РАОsegB(D)\phzS Тс] Все проверенные клоны имели одинаковый порядок расположения генов, как изображено на рис. 11.
Для разрешения меродиплоидов отдельные клоны инкубировали в жидкой среде в присутствии ИПТГ Затем клетки отбирали на LB-среде и далее анализировали на наличие плазмидных маркеров по чувствительности к СЬ и Тс, а также при помощи ПЦР В случае SegB мы не наблюдали расщепления меродиплоидов (табл 4), что свидетельствует о неспособности SegB узнавать т vivo
РЮшвдВ (D) [phzS Тс] Tc*,Cb*,Suc' PbzS*
РАО» »gB(D) Л Suc',Tc',Cb' PhzS+
П1*С 1ас1ГялдВ(Р)
phzS S
S phxS Тс
.а1—
л)( ИПТГ I ХП
Т71«о
PAOsagS(D) (phlS Те) Лмо! Г*ядВ(Р) fbzS То
П Tc',Suc\Cb' —t—
PhzS" *«'
Рис. 11. Схема направленного внесения делеций в хромосому штаммов РАОsegB(D)\phzS.'.Tc\ P. aeruginosa за счет внутрихромосомной рекомбинации, инициируемой эндонуклеазами ScgB(D). JI и П обозначают возможные варианты расположения генов после гомологичной рекомбинации, при которой рекомбиногенным является левый (Л) или правый (П) фланг гена phzS или phzS Тс, соответственно Устойчивость или чувствительность к антибиотикам (Тс и СЬ) или сахарозе (Sue) обозначена верхним индексом г или s, соответственно S - положение сайтов гидролиза SegB(D) Горизонтальными стрелками над и под генами указано положение праймеров
Табл. 4. Частота разрешения меродиплоидов PAOseg£(ß)|pAz£"Tc] в присутствии SegB(D)
ИПТГ, мМ ч PAOse gBlphzS Tel, % PAOsegD\phzS Tc], %
РАО segB \phzS Tel FAOsegB PAOsegfi (phzS Tc) PAOsegD fphzS Tel PAOsegD PAOsegD (phzS Tc)
0 1,5 100 0 0 98 1 1
23 - - - 98 2 0
0,02 12 - - - 25 68 7
23 - - - 9 75 16
0,2 1,5 100 0 0 67 27 6
3 - - - 44 52 4
0,5 1,5 - - - 73 20 7
1 1,5 - - - 33 52 15
РАОsegB(D) и РАОsegB(D)(phzS Тс) - клетки, в которых произошла реверсия к дикому или мутантному генотипу, соответственно 17
собственные сайты в составе геномной ДНК и согласуется с полученными ранее данными т vitro В случае SegD мы наблюдали расщепление меродиплоидов к дикому и мутантному генотипам с эффективностью до 91% (инкубация клеток при 0,02 мМ ИПТГ в течение 23 ч), тогда как в контрольных экспериментах эффективное расщепление меродиплоидов отсутствовало При этом уровень рекомбинации находится в прямо пропорциональной зависимости от концентрации ИПТГ или времени инкубации Отмечено, что частота реверсий к дикому типу значительно выше, чем к мутантному. Молекулярный механизм этого процесса не вполне ясен, но возможно, что данное явление связано с процессами репликации и репарации ДНК
Таким образом, при генерации SegD двухцепочечных разрывов в хромосоме происходит стимуляция внутрихромосомной гомологичной рекомбинации в Р aeruginosa между phzS Тс и phzS
Поскольку сайты узнавания хоминг-эндонуклеаз являются вырожденными существует вероятность, что при экспрессии этих ферментов в клетках может происходить расщепление по альтернативным сайтам Хорошо известно, что появление большого количества двухцепочечных разрывов в хромосоме индуцирует SOS-ответ и может привести к накоплению нежелательных мутаций в геноме Частота возникновения спонтанных мутаций была оценена по появлению мутантов, устойчивых к рифампицину. В клетках РАОsegD\phzS Тс], индуцированных 0,02 мМ ИПТГ в течение 23 ч, частота возникновения спонтанных мутаций не увеличивалась по сравнению с штаммом дикого типа РА01, что является одним из подтверждений специфичного действия SegD на хромосому Р aeruginosa
Система SegD-индуцированного направленного мутагенеза эффективна в бактериях P.JJuorescens. Чтобы проверить универсальность системы SegD-индуцированного направленного мутагенеза она была протестирована в штамме Q8rl-96 Р fluorescens В качестве модельных генов были выбраны гены оф, orf6, hisH и orfi из ssh-локусов 53-1,53-2, 85 и 127, соответственно, а также ген thrC из ssh-локуса 61 Предположительно, локусы ssh 53 и 85 являются частью кластера генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе полисахаридов клеточной мембраны, ген orfi из ssh 127 кодирует ре1уляторный белок из LysR-семейства, а ген thrC - треонинсинтазу. Последовательность каждого из генов была нарушена встраиванием канамициновой кассеты и клонирована в вектор для мутагенеза pUT7sDlAp В целом, схема экспериментов не отличалась от используемой в Р aeruginosa за исключением того, что сайт-специфическая интеграция генов segD и lacl была проведена с помощью транспозона mini-Tn7£2Gm (Koch et al, 2001) Данный транспозон специфично встраивается в нейтральную межгенную область, находящуюся непосредственно за геном глюкозамин-6-фосфат синтазы (GlmS) Использование этого транспозона позволяет провести удаление генов segD и lacl из хромосомы по FRT-сайтам с помощью FLP-рекомбиназы после мутагенеза, что дополнительно снижает риски появления в хромосоме ненаправленных мутаций
Анализ клонов после скрещиваний проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных как к гену-мишени, так и к генам, находящимся на плазмиде В природном штамме Q8rl-96 не было отобрано ни
одного мутанта по выбранным генам из взЬ-локусов (табл 5), что можно объяснить низкой частотой двойных обменов в Р Аиогеэсепя В то же время, в скрещиваниях с штаммом С}8г1-96-segD, содержащим ген segD, мутанты были получены во всех случаях, за исключением локуса з$Ь61, в который мутацию ввести не удалось несмотря на несколько попыток, вероятно, вследствие его значимости для жизнеспособности С?8г1-96 Эффективность мутагенеза в различных локусах отличается и варьирует от 28% до 92% Такой разброс в значениях можно объяснить, например, отличающимся уровнем гомологичной рекомбинации в различных локусах В скрещиваниях с штаммом Q8rl-96-segD даже в отсутствии ИПТГ наблюдалось образование мутантов с частотой 11-17%, что можно объяснить "подтеканием" Т7/ас-промотора перед геном йеёЭ.
Табл 5. Эффективность образования взЬ-мутантов в штаммах 08г1-96 и <28 г 1-96-segD Р. Аиотеясепь.
ИПТГ, мкМ (28г1-96, % 08г1-96-.?е£Д %
851185 эвЬ 127 881153-1 851153-2 вБЬ 85 8811 127 вэЬ 53-1 БвИ 53-2
0 0 0 0 0 14 16 17 11
100 - - - - 69 88 28 32
200 - - - 89 47 22 9
500 - - - - 92 58 21 9
Клетки штамма С>8г1-96 или Q8rl-96-segD скрещивали с 817-1, трансформированным плазмидой рЦТ7зШ-85, риТ7зБ1-127, рЬГПэО 1-53-1 или рЦТ75Б1-53-2, несущей мутантный ген из локусов 85, 127, 53-1 или 53-2, соответственно, и сайты гидролиза SegD Указано количество рекомбинантных клонов, в которых прошел двойной обмен Каждый вариант скрещивания проводили в 2 повторах и в каждом случае анализировали 50 колоний
Чтобы проверить оказывает ли SegD возможный токсичный эффект на клетки Р Аиогеясепя было проведено фенотипическое сравнение штамма дикого типа и БвИ-мутантов по ряду параметров, таких как морфология, кинетика роста, способность расти на различных источниках углерода, продукция 2,4-диацетилфлороглюцинола, сидерофоров и экзопротеазы Отличий по указанным параметрам между штаммами не наблюдалось, поэтому был сделан вывод, что SegD не оказывает на клетки Р /\uorescens токсичного действия Таким образом, система направленного SegD-индyциpoвaннoгo направленного мутагенеза была успешно использована для введения мутаций в 4 гена Р Аиогеэсет без повышения уровня мутагенеза в других генах
Учитывая полученные результаты можно предложить использовать сайт-специфичную хоминг-эндонуклеазу SegD для работы с прокариотическими и, в перспективе, с эукариотическими геномами.
выводы
S Установлена структура кластера генов тРНК фагов T2L, RB1 и RB3 В отличие от Т4 у этих фагов segB и фланкирующие его гены тРНК замещены генами, кодирующими тРНКМе', тРНКТуг, tPHKAs" и изоакцепторную тРНК^8 У бактериофага T2L также обнаружены две ОРС неизвестной функции S Показано, что SegB является Mg2+-3aBHCHMoft сайт-специфической эндонуклеазой Фермент проявляет наибольшую активность при pH 8-9 и температурном оптимуме 30-35°С. Активность SegB зависит от присутствия двухвалентных катионов и уменьшается в ряду Mn2+>Mg2+>Ca2+>Zn2+=0 Ионы Na+ и К+ингибируют общую активность фермента S Сайт узнавания SegB является протяженным (27 п.н), асимметричным и вырожденным Предпочтительный сайт узнавания обнаружен в гене тРНК^" фага T2L, а менее предпочтительные - во всех остальных генах тРНК T2L Существенным элементом узнавания SegB является последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент ТуС-ветви тРНК, а последовательность CCR позиционирует точку разрыва. SegB вносит двухцепочечные разрывы в ДНК с образованием З'-выступающих концов длиной два н о
S SegB эффективно гидролизует модифицированную ДНК Т-четных фагов, что свидетельствует о том, что основное узнавание ДНК ферментом происходит по малой бороздке.
S SegB инициирует нереципрокгный генетический обмен между фагами Т4 и T2L, что сопровождается практически полным исключением области генов тРНК фага T2L длиной -1250 п н
Показано, что как т vitro, так и т vivo, эндонуклеаза SegB не способна узнавать собственные предпочтительные сайты в геноме Pseudomonas, а также повышать уровень двойных обменов между плазмидой и хромосомой S Разработана эффективная система для направленного внесения мутаций в хромосому бактерий Pseudomonas с использованием эндонуклеазы SegD SegD специфично узнает искусственно введенные сайты в хромосоме Pseudomonas и стимулирует внутрихромосомную гомологичную рекомбинацию.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1) Brok-Volchanskava V S. Kadyrov F А, Sivognvov D E, Kolosov P. M, Sokolov A. S., Shlyapnikov M. G., Kryukov V. M, Granovsky I. E 2008. Phage T4 SegB protein is a homing endonuclease required for the preferred inheritance of T4 tRNA region occuring in co-infection with a related phage. Nucleic Acids Res, 6,2094-105.
2) Брок-Волчанская В С 2007. Хоминг-эндонуклеаза SegB бактериофага Т4: биохимические свойства. "Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им Ю А. Овчинникова", Т 3, №3, стр. 33-39
Тезисы докладов
1) Mavrodi D V, Brok-Volchanskava V S. Mavrodi О V, Thomashow L S 2007 Role of ssh 53,61,85, and 127 loci in root colonization by Pseudomonas fluorescens Q8R1-96. Proceedings of "Pseudomonas 2007", p 89, Seattle, USA
2) Brok-Volchanskava V. Kadyrov F, Sivognvov D, Kolosov P, Sokolov A, Shlyapnikov M., Kryukov V , Granovsky I 2007. Phage T4 SegB protein is a homing endonuclease required for the preferred inheritance of T4 tRNA region occuring in co-infection with a related phage. Proceedings of "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", p 165, Madison, USA.
3) Brok-Volchanskava V S. Mavrodi D V, Mavrodi О. V., Thomashow L 2007 Role of ssh53, 61, 85, and 127 loci in root colonization by Pseudomonas fluorescens Q8rl-96. Proceedings of "9th Symposium on BAGEC09", p 89-90, Wermgerode, Germany
4) Холыпева В С. Колосов П. М, Сивогривое Д Е, Шляпников М Г, Грановский И Э 2005. Система направленного введения мутаций в бактерии рода Pseudomonas. Труды "XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: Ломоносов - 2005", стр 241, Москва, Россия
5) Сивогривое Д Е, Холыпева В С. Кадыров Ф А, Колосов П М, Шляпников М. Г, Крюков В. М, Грановский И Э 2005 Хоминг-эндонуклеаза SegB бактериофага Т4 узнает консервативный элемент последовательности гена тРНК. Труды "XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2005", стр. 195, Москва, Россия
6) Холыпева В С. Колосов П М, Телегин М А, Шляпников М. Г, Грановский И Э 2002 Хоминг-эндонуклеаза SegB бактериофага Т4: биохимические свойства. Труды "6ой Пущинской школы-конференции молодых ученых: Биология - наука XXI века", стр 343, Пущино, Россия
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брок-Волчанская, Вера Сергеевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Классы сайт-специфических дезоксирибонуклеаз.
1.2. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов.
1.3. ОРС хоминг-эндонуклеаз1 являются мобильными генетическими элементами.
1.4. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4.
1.4.1. Семейство бактериофагов Т4-типа на примере бактериофага Т4.
1.4.1.1. Классификация фагов Т4-типа. Исключение фагом Т4 близкородственных фагов.
1.4.1.2. Особенности структуры ДНК бактериофага Т4.
1.4.1.3. Особенности развития бактериофага Т4.
1.4.2. Кодируемые интронами хоминг-эндонуклеазы фага Т4.
1.4.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 внеинтронной локализации.
1.4.4. Транскрипция кластера генов тРНК бактериофага Т4.
1.4.5. Регуляция экспрессии генов хоминг-эндонуклеаз фага>Т4.
1.5. Практическое применение хоминг-эндонуклеаз.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Штаммы бактерий и бактериофаги.
2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды.
2.1.3. Праймеры.
2.1.4. Среды, основные буферы и растворы.
2.1.5. Материалы и реактивы.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации.
2.2.2. Получение геномной ДНК.
2.2.3. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация.
2.2.4. Получение электрокомпетентных клеток Pseudomonas и электропорация.
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК.
2.2.7. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК.
2.2.8. Анализ рекомбинантных клонов.
2.2.9. Электрофоретическое разделение ДНК.
2.2.10. Электрофорез белков в ПААГ.
2.2.11. Экспрессия ОРС segB.
2.2.12. Очистка эндонуклеазы SegB и определение концентрации белка.
2.2.13. Определение эндонуклеазной активности SegB in vitro.
2.2.14. Определение точек расщепления и границ сайта узнавания SegB.
2.2.15. Конструирование бактериофага B20AsegB.
2.2.16.' Получение Т-четных бактериофагов и титрование.
2.2.17. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным ультрацентрифугированием в градиенте CsCl.
2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства.
2.2.19. ДНК-ДНК гибридизация (гибридизация по Саузерну).
2.2.28. Программное обеспечение.
2.2.29. Конъюгативный перенос плазмид.
2.2.30. Введение ОРС segB и segD в хромосому штамма РА01 Р. aeruginosa и segD в хромосому штамма Q8rl-96 P. fluorescens.
2.2.31. Экспрессия генов segB и segD в клетках штаммов РАО segB и РАО segD
Р. aeruginosa.
2.2.32. Внесение делеций в хромосому штаммов PAOsegB[phzS::Тс] и FAOsegD\phzSwTc] Р. aeruginosa.
2.2.33. Измерение частоты возникновения спонтанных мутаций в штаммах РА01 и PAOsegD\phzS::Tc] Р. aeruginosa.
2.2.34. Фенотипический анализ штамма Q8rl-96 Р. fluorescens и полученных на его основе мутантов.
2.2.34.1. Приготовление культуры и ее тестирование.
2.2.34.2. Проведение морфологического сравнения колоний.
2.2.34.3. Анализ способности клеток использовать в качестве источников углерода различные соединения.
2.2.34.4. Измерение кинетических параметров роста.
2.2.34.5. Анализ способности продуцировать сидерофоры и экзопротеазу.
2.2.34.6. Анализ способности продуцировать 2,4-диацетилфлороглюцинол.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Поиск сайта гидролиза для эндонуклеазы SegB в популяции Т-четных бактериофагов.
3.2. Определение структуры кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L.
3.3. Ген segB кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу.
3.4. Биохимические особенности эндонуклеазы SegB.
3.5. Предпочтительный сайт расщепления SegB находится в последовательности гена xPHKAsn Тчетных фагов.
3.6. Определение точек гидролиза и границ сайта узнавания SegB в области гена трнказп фага^ь.
3.7. Определение точек расщепления эндонуклеазой SegB в последовательностях отдельных генов тРНК фага T2L и реконструирование сайтов узнавания.
3.8. Анализ специфичности SegB на гликозилированной ДНК фагов Т4 и T2L.
3.9. Эндонуклеаза SegB инициирует нереципрокный генетический обмен между бактериофагами Т4 и Т2.
ЗЛО. Изучение возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas.
3.10.1. Специфичность SegB при гидролизе геномной ДНК бактерий Р. aeruginosa и Е. coli.
3.10.2. Разработка системы направленного мутагенеза с использованием, хоминг-эндонуклеазы SegB или SegD и тестирование ее в штамме РА
Р. aeruginosa.
3.10.3. Внесение делеции в геном Р. aeruginosa штаммов J*AOsegB[phzS::Тс] и PAOsegDlphzS: :Тс] за счет внутрихромосомной рекомбинации, инициируемой эндонуклеазами SegB или SegD.
3.11. Тестирование системы Seg-индуцированного направленного мутагенеза с использованием эндонуклеазы SegD в штамме Q8rl-96 P. fluorescens.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства эндонуклеазы SegB бактериофага Т4 и ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами"
Хоминг-эндонуклеазы являются сайт-специфическими дезоксирибонуклеазами, особенность которых заключается в способности этих ферментов узнавать протяженные (от 12 до 40 п.н.), вырожденные и асимметричные последовательности. На основе присутствия в структуре хоминг-эндонуклеаз определенных консервативных аминокислотных мотивов их разделяют на четыре семейства: LAGLIDADG, His-Cys, GIY-YIG и H-N-H (Belfort and Roberts, 1997; Stoddard, 2005), наиболее изученными из которых являются первые два семейства.
Гены, кодирующие хоминг-эндонуклеазы, как правило, являются несущественными "эгоистичными" генами и кодируются открытыми рамками считывания (ОРС), находящимися внутри интронов, интеинов, а также в межгенных областях, и найдены как у эукариот (в основном грибов) и прокариот, так и у архей и вирусов (Stoddard, 2005). Основная функция этих генов заключается в обеспечении распространения тех элементов, в которых они находятся, или собственных ОРС, в случае свободностоящих генов. Впервые этот феномен был открыт при изучении интрона й) митохондриального гена 21S рРНК Saccharomyces cerevisiae (Dujon, 1980). При смешивании а> - и й) +-штаммов наблюдалась нереципроктная конверсия (о ' в œ + (Coen et al., 1970). Позже было установлено, что для конверсии необходим двухцепочечный разрыв в о) -аллеле, который вносится эндонуклеазой I-Scel, кодируемой ео +-аллелем (Jacquier and Dujon, 1985; Macreadie et al., 1985; Zinn and Butow, 1985; Colleaux et al., 1986). Рекомбинационно-зависимая репарация двухцепочечного разрыва происходит с использованием интрон-содрежащей цепи в качестве матрицы. В результате, интрон встраивается в свой собственный сайт инсерции — сайт хоминга, что приводит к его доминантному наследованию. Этот процесс был назван хомингом (от англ. homing -"возвращение домой"), а инициирующие его ферменты - хоминг-эндонуклеазами. В дальнейшем, для большинства интронов I группы была показано, что их перемещение зависит от экспрессии генов, кодирующих хоминг-эндонуклеазы (Lambowitz and Belfort, 1993; Loizos et al., 1994). Известны примеры (I-Hmul и I-HmuII), когда хоминг инициируется внесением одно-, а не двухцепочечного разрыва в ДНК, однако точный механизм этого процесса пока не установлен (Landthaler et al., 2004).
Лишь для некоторых эндонуклеазных генов отмечено, что кодируемые ими ферменты, помимо хоминга, задействованы и в других молекулярно-биологических процессах. Например, НО-эндонуклеаза участвует в переключении типа спаривания у дрожжей, а интронкодируемая матураза I-Anil, схожая с хоминг-эндонуклеазами, участвует в сплайсинге интрона (Weiffenbach and Haber, 1985; Geese et al., 2003).
Наибольшее количество генов, кодирующих хоминг-эндонуклеазы, обнаружено в геномах бактериофагов (Edgell et al., 2000). Так, у бактериофага Т5 среди 162 предполагаемых ОРС, по крайней мере, 9 кодируют хоминг-эндонуклеазы (асс. no AY543070), а у фага Т4 из 289 — 14 (Miller et al., 2003). Из хоминг-эндонуклеаз, кодируемых фагом Т5, в настоящее время охарактеризовано только три фермента: F-Tfll, F-TflII и F-TflIV, относящихся к H-N-H-семейству (Акуленко и др., 2004). Из 14 генов фага Т4 два были обнаружены в самосплайсирующихся интронах I группы. Эти ОРС кодируют функционально активные сайт-специфические эндонуклеазы I-TevI и I-TevII, относящиеся к GIY-YIG-семейству. Остальные 12 являются свободностоящими генами, кодирующими группу Seg-белков (А, В, С, D, Е, F и G) и предполагаемых МоЬ-белков (А, В, С, D и Е), относящихся к GIY-YIG- и H-N-H-семейству, соответственно (Sharma et al., 1992; Miller et al., 2003). Mob-белки в настоящее время не изучены, а наиболее изученными Seg-белками являются SegA, SegE, SegF <- и SegG (Sharma and Hinton, 1994, Kadyrov et al., 1996a; Belle et al., 2002; Liu et al., 2003).
В1 настоящее время* продолжается обсуждение факта, наличия^ такого .количества "эгоистичных" генов в геноме фагов в связи с их возможной функциональной ролью. В частности, Белле с соавт. было высказано предположение, что явление исключения большинства генетических маркеров T2L, наблюдаемое в смешанных инфекциях с Т4, является совместным результатом действия хоминг-эндонуклеаз фага Т4 (Belle et al., 2002). Возможно, что одним из объяснений наличия 14 "эгоистичных" генов хоминг-эндонуклеаз в сравнительно небольшом геноме фага Т4 (166 т.п.н.) является приобретение фагом Т4 эволюционного преимущества перед родственными фагами.
Настоящая работа посвящена изучению хоминг-эндонуклеазы SegB бактериофага Т4. Ген segB располагается в несущественной для развития-фага Т4 области генов тРНК между I и II подкластерами (Fukada and Abelson, 1980). Предположение о том, что ген segB бактериофага Т4 кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу было высказано в работе Шарма с соавт. (Sharma et al., 1992). Кадыровым и Крюковым из нашей лаборатории было установлено, что ОРС segB имеет длину 666 п.н. (GenBank, асс. no Z69338).
Цель и задачи исследованиия.
Цель данной работы заключалась в изучении свойств; эндонуклеазы SegB: бактериофага Т4, ее роли в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами, а также возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas.
В соответствии^ с целью работы были поставлены следующие задачи: проанализировать структуру кластеров генов тРНК у Т-четных бактериофагов с целью поиска сайта гидролиза SegB;
- получить очищенный препарат SegB и? охарактеризовать биохимические свойства белка;
- установить предпочтительный сайт гидролиза SegB и охарактеризовать особенности взаимодействия фермента с ДНК;
- изучить возможную роль SegB в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами в области генов тРНК;
- проанализировать частоту встречаемости сайтов SegB в геномах бактерий Е. coli и Р. aeruginosa, а также способность эндонуклеаз SegB и SegD узнавать искусственно введенные собственные сайты в геноме Р. aeruginosa-,
- изучить, способность эндонуклеаз SegB и SegD стимулировать рекомбинацию в бактериях рода Pseudomonas и разработать на их основе систему направленного внесения мутаций в геном этих бактерий.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института-биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН.
Научная новизна работы.
Полученные в настоящей работе данные о свойствах хоминг-эндонуклеазы SegB расширяют наши знания о хоминг-эндонуклеазах, принадлежащих к мало изученному GIY-YIG-семейству.
При поиске сайта гидролиза SegBföbma определена структура ранее не изученного кластера генов тРНК фагов RBl, RB3 и T2L. В отличие от Т4, у этих фагов отсутствует ген segB и- фланкирующие его гены тРНК, которые замещены генами, кодирующими тРНКМс1, тРНКТуг, тРНК^" и изоакцепторную тРШСЧ Кроме того, у бактериофага T2L найдены две ОРС trna.l и trna.2 неизвестной функции.
Охарактеризован новый фермент — хоминг-эндонуклеаза SegB, которая является Mg -зависимой сайт-специфической эндонуклеазой и обладает ярко выраженной иерархией в узнавании сайтов. Предпочтительный сайт узнавания обнаружен в гене xPHKAsn ф^ T2Lj а менее предпочтительные — во всех остальных генах тРНК T2L. Показано, что сайт узнавания SegB является протяженным (27 п.н.), асимметричным и вырожденным. Существенным элементом узнавания SegB- является- последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент Tvj/C-ветви тРНК, а последовательность CCR позиционирует точку разрыва.
На основе полученных результатов о характере взаимодействия SegB с субстратом, а также анализа аминокислотной последовательности (база данных Pfam; Sitbon and Pietrokovski, 2003), было выдвинуто предположение, что структурная организация белка, а также характер узнавания и гидролиза ДНК, укладывается в модель, предложенную для I-Tevl. По-видимому, также как и I-Tevl, SegB состоит из N-концевого каталитического и С-концевого ДНК-связывающего доменов. В пользу того, что домены связаны между собой гибким линкером, свидетельствует способность SegB смещать основную точку разрыва относительно нахождения CCR.
По-видимому, фермент узнает ДНК по малой бороздке, т.к. природные модификации ДНК Т-четных фагов (гликозилирование и оксиметилирование) не влияют на специфичность и эффективность гидролиза SegB.
Установлено, что ген segB фага Т4 является "мобильным эндонуклеазным геном", который обеспечивает генетический обмен между фагами Т4 и T2L в процессе генной конверсии.
Предложен способ регуляции экспрессии гена segB на уровне трансляции, которая объясняет механизм защиты фага Т4 от кодируемых им эндонуклеаз с вырожденным сайтом узнавания.
Научно-практическое значение работы.
Данные о сайте узнавания и о двухдоменной организации SegB могут быть полезны при создании новых эндонуклеаз с заданной специфичностью.
SegB также можно использовать для получения больших фрагментов ДНК, например, с целью их последующего клонирования.
Разработана эффективная система SegD-индуцируемого направленного мутагенеза in vivo в бактериях рода Pseudomonas, которая существенно упрощает процедуру получения мутантов и может быть применена при исследовании функций генов этих бактерий, а также при конструировании штаммов с заданными свойствами.
Полученные в работе результаты могут послужить основой для дальнейшего развития созданной системы и ее адаптации для других бактерий.
Высоко специфичная эндонуклеаза SegD может быть использована для работы с прокариотическими геномами, в частности для внесения делеций в хромосому Pseudomonas.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Брок-Волчанская, Вера Сергеевна
выводы
S Установлена структура кластера генов тРНК фагов T2L, RB1 и RB3. В отличие от Т4 у этих фагов segB и фланкирующие его гены тРНК замещены генами, кодирующими тРНК , тРНКТуг, тРНК^" и изоакцепторную тРНК^8. У бактериофага T2L также обнаружены две ОРС неизвестной функции.
S Показано, что SegB является Mg2"1 -зависимой сайт-специфической эндонуклеазой. Фермент проявляет наибольшую активность при pH 8-9 и температурном о оптимуме 30-35 С. Активность SegB зависит от присутствия двухвалентных катионов и уменьшается в ряду Mn2+>Mg2+>Ca2+>Zn2+=0. Ионы Na+ и К+ ингибируют общую активность фермента.
S Сайт узнавания SegB является протяженным (27 п.н.), асимметричным и вырожденным. Предпочтительный сайт узнавания обнаружен в гене xPHKAsn фага
T2L, а менее предпочтительные - во всех остальных генах тРНК T2L. Существенным элементом узнавания SegB является последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент Тц/С-ветви тРНК, а последовательность CCR позиционирует точку, разрыва. SegB вносит двухцепочечные разрывы в ДНК с образованием 3'-выступающих концов длиной два н.о.
S SegB эффективно гидролизует модифицированную ДНК Т-четных фагов, что свидетельствует о том, что основное узнавание ДНК ферментом происходит по малой бороздке.
S SegB инициирует нереципроктный генетический обмен между фагами Т4 и T2L, что сопровождается практически полным исключением области генов тРНК фага T2L длиной ~1250 п.н.
S Показано, что как in vitro, так и in vivo, эндонуклеаза SegB не способна узнавать собственные предпочтительные сайты в геноме Pseudomonas, а также повышать уровень двойных обменов между плазмидой и хромосомой.
S Разработана эффективная система для направленного внесения мутаций в хромосому бактерий Pseudomonas с использованием эндонуклеазы SegD. SegD специфично узнает искусственно введенные сайты в хромосоме Pseudomonas и стимулирует внутрихромосомную гомологичную рекомбинацию.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данной работе были изучены основные биохимические свойства хоминг-эндонуклеазы SegB бактериофага Т4, ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами, а также возможность использования эндонуклеазы SegB для направленного введения мутаций в гены бактерий P. aeruginosa и P. fluorescens.
Анализ базы данных Pfam на наличие в SegB консервативных доменов, а также полученные в этой работе экспериментальные данные об узнавании и расщеплении этим ферментом ДНК, позволяют предположить, что структурная организация SegB, также как и характер взаимодействия белка с ДНК-субстратом, укладывается в модель, предложенную для эндонуклеазы I-Tevl. В частности, для I-TevI показано, что он состоит из N-концевого каталитического и С-концевого ДНК-связывающего доменов, связанных гибким линкером (Derbyshire, et al., 1997). Как и у I-Tevl, на N-конце SegB находится вырожденный GIY-YIG-мотив (Sharma et al., 1992). ДНК-связывающий домен I-Tevl состоит из трех субдоменов, и образует множественные специфические контакты с основаниями на всем протяжении ДНК-субстрата (Van Roey et al., 2001). Именно это свойство обеспечивает толерантность фермента к отдельным нуклеотидным заменам в сайте узнавания. Вырожденность сайта узнавания и проявление предпочтительности в выборе сайта гидролиза позволяют предположить, что SegB также имеет несколько модулей, участвующих в узнавании ДНК. В пользу этого предположения также свидетельствует обнаружение в предполагаемом ДНК-связывающем домене SegB мотива "NUMOD 3" (157 - 170 а. о.), имеющегося также и у I-Tevl (Sitbon and Pietrokovski, 2003). Наличие гибкого линкера между N-концевым и С-концевым доменами SegB можно предположить исходя из способности фермента вносить в ДНК-субстрат несколько точек разрывов, положение которых может значительно варьировать и коррелирует с наличием на З'-границе сайта последовательности CCR и ее положением относительно основного элемента узнавания, расположенного на 5'-границе сайта. Также как I-Tevl и I-TevII, основное "специфическое" узнавание ДНК SegB осуществляет, по-видимому, по малой бороздке.
Установлено, что наиболее консервативной в структуре сайта узнавания SegB является последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент Tvj/C-стебля тРНК. Расположение сайта узнавания в генах тРНК может способствовать высокоэффективному распространению гена segB, как среди близкородственных, так и отдаленных видов.
Как было показано в этой работе, при скрещивании Т4 и T2L эндонуклеаза SegB инициирует высокоэффективный хоминг собственного гена в кластер генов тРНК T2L, что сопровождается исключением кластера генов тРНК фага T2L с замещением негомологичной Т4 области длиной ~1250 п.н. Являясь одной из 14 полноразмерных ОРС хоминг-эндонуклеаз, кодируемых фагом Т4, SegB, по-видидмому, вносит вклад в обеспечение явления частичного исключения маркеров Т2 фагом Т4.
На основе полученных в данной работе результатов предложена модель регуляции экспрессии segB на уровне трансляции, которая объясняет механизм защиты фага Т4 от кодируемых им эндонуклеаз с вырожденным сайтом узнавания.
Другая часть данной работы была посвящена изучению возможности использования эндонуклеаз SegB и SegD для направленного внесения мутаций в геном бактерий. Эндонуклеаза SegB, вследствие наличия альтернативных участков расщепления для этого фермента в геноме бактерий, не является подходящим инструментом для внесения направленных изменений в геномы. В отличие от SegB, эндонуклеаза SegD способна специфично гидролизовать искусственно введенные сайты узнавания в хромосоме P. aeruginosa. Внесение SegD разрывов в хромосому приводит к повышению уровня гомологичной рекомбинации в клетке, стимулируя образование делеций. Также установлено, что при низком уровне синтеза эндонуклеазы SegD в клетках Pseudomonas действие этого фермента строго специфично и не сопровождается появлением нежелательных мутаций в других генах.
В результате было разработано два высоко эффективных способа получения мутантов с использованием системы SegD-индуцированного направленного мутагенеза.
1) Способ прямого введения мутаций: Е. coli, несущая плазмиду с SegD-сайтами, фланкирующими мутантный ген, скрещивается на среде с ИПТГ с бактерией Pseudomonas, содержащей в хромосоме ген segD; затем клетки высеваются на селективную среду и среди выросших рекомбинантов проводится отбор мутантов по отсутствию антибиотикоустойчивости, определяемой вектором для мутагнеза. Данный способ существенно упрощает процедуру скринирования колоний и, более того, позволяет получать мутанты в тех случаях, когда классическая система мутагенеза неэффективна.
2) Способ введения мутаций через разрешение меродиплоидов: Е. coli, несущая плазмиду с SegD-сайтами, фланкирующими мутантный ген, скрещивается с бактерией Pseudomonas, содержащей в хромосоме ген segD, и на селективной среде отбираются меродиплоиды; затем полученные меродиплоиды выращиваются в жидкой среде в присутствии ИПТГ, высеваются до отдельных колоний на агаризованной среде и проводится отбор мутантов, как описано выше. Данный способ позволяет вносить в хромосому делеции и проводить безмаркерное замещение гена.
Разработанная эффективная система SegD-индуцированного направленного внесения мутаций в хромосому может быть использована, по крайней мере, в бактериях рода Pseudomonas, а также адаптирована для более широкого круга бактерий. Высоко специфичная эндонуклеаза SegD может быть использована для манипуляций с прокариотическими и, в перспективе, с эукариотическими геномами.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брок-Волчанская, Вера Сергеевна, Пущино
1. Ackermann, H.-W. and Krisch, H.M. (1997) A catalogue of T4-type bacteriophages Arch. Virol., 1997. 142, 2329-45.
2. Adams, M.H. (1952) Classification of bacterial viruses: characteristics of the T5 species and of the T2, C16 species. J Bacterid. 64(3):387-96.
3. Argast, G.M., Stephens, K.M., Emond, M.J. and Monnat, R.J.Jr. (1998) I-Ppol and I-Crel homing site sequence degeneracy determined by random mutagenesis and sequential in vitro enrichment. J. Mol. Biol., 280, 345-53.
4. Artiguenave, F., Vilagines, R. and Danglot, C. (1997) High-efficiency transposon mutagenesis by electroporation of a Pseudomonas fluorescens strain. FEMS Microbiol. Lett., 153,363-9.
5. Asselbergs, F.A. and Rival, S. (1996) Creation of a novel, versatile multiple cloning site cut by four rare-cutting homing endonucleases. Biotechniques, 20, 558-62.
6. Baudin, A., Ozier-Kalogeropoulos, O., Denouel, A., Lacroute, F. and Cullin, C. (1993) A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res., 21, 3329-30.
7. Belfort, M. and Roberts, R. (1997) Homing endonucleases: keeping the house in order. Nucleic Acids Res., 25, 3379-88.
8. Belle, A., Landthaler, M. and Shub, D.A. (2002) Intronless homing: site-specific endonuclease SegF of bacteriophage T4 mediates localized marker exclusion analogous to homing endonucleases of group I introns. Genes Dev., 16, 351-62.
9. Bell-Pedersen, D., Quirk, S.M., Aubrey, M. and Belfort, M. (1989) A site-specific endonuclease and co-conversion of flanking exons associated with the mobile td intron of phage T4. Gene, 82,119-26.
10. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J.K. and Carroll, D. (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science, 300, 764.
11. Bibikova, M., Carroll, D., Segal, D.J., Trautman, J.K., Smith, J., Kim, Y.G. and Chandrasegaran S. (2001) Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol. Cell. Biol., 21,289-97.
12. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K.G. and Carroll, D. (2002) Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics, 161, 1169-75.
13. Birgisdottir, A.B. and Johansen, S.D. (2005) Reverse splicing of a mobile twin-ribozyme group I intron into the natural small subunit rRNA insertion site. Biochem. Soc. Trans., 33,482-4.
14. Bloch, C.A., Rode, C.K., Obreque, V.H. and Mahillon, J. (1996) Purification of Escherichia coli chromosomal segments without cloning. Biochem. Biophys. Res. Commun.,223,104-11.
15. Blomfield, I.C., Vaughn, V., Rest, R.F. and Eisenstein, B.I. (1991) Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSClOl replicón. Mol. Microbiol., 5,1447-57.
16. Bourdeau, V., Steinberg, S.V., Ferbeyre, G., Emond, R., Cermakian, N. and Cedergren, R. (1998) Amber suppression in Escherichia coli by unusual mitochondria-like transfer RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1375-80.
17. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-54.
18. Brenneman, M., Gimble, F.S. and Wilson, J.H. (1996) Stimulation of intrachromosomal homologous recombination in human cells by electroporation with site-specific endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3608-12.
19. Brenner, S, Barnett, L. Genetic and chemical studies on the head protein of bacteriophages T2 and T4. Brookhaven Symp Biol. 1959 Nov;12:86-94.
20. Broida, J. and Abelson, J. (1985) Sequence organization and control of transcription in the bacteriophage T4 tRNA region. J. Mol. Biol., 185, 545-63.
21. Bryk, M., Belisle, M., Mueller, J.E. and Belfort, M. (1995) Selection of a remote cleavage site by I-tevI, the td intron-encoded endonuclease. J. Mol. Biol., 247, 197-210.
22. Bryk, M., Quirk, S.M., Mueller, J.E., Loizos, N., Lawrence, C. and Belfort, M. (1993) The td intron endonuclease I-TevI makes extensive sequence-tolerant contacts across the minor groove of its DNA target EMBO J., 12,2141-9. k
23. Calladine, C.R. and Drew, H.R. (1996) A useful role for "static" models in elucidating the behaviour of DNA in solution. J. Mol. Biol., 257,479-85.
24. Carlson, K. and Miller, E.S. (1994). Experiments in T4 genetics. In Karam, J.D. (ed.), Molecular biology of bacteriophage T4. ASM Press, Washington DC, pp. 427-34.
25. Carroll, D. (2004) Using nucleases to stimulate homologous recombination. Methods Mol. Biol., 262, 195-207.
26. Chandrasegaran, S. and Smith, J. (1999) Chimeric restriction enzymes: what is next? Biol. Chem., 380, 841-8.
27. Chevalier, B., Sussman, D., Otis, C., Noel, A.J., Turmel, M., Lemieux, C., Stephens, K., Monnat, R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (2004) Metal-dependent DNA cleavage mechanism of the I-Crel LAGLIDADG homing endonuclease. Biochemistry, 43,14015-26.
28. Chevalier, B., Turmel, M., Lemieux, C., Monnat RJ.Jr. and Stoddard, p.L. (2003) Flexible DNA target site recognition by divergent homing endonuclease isoschizomers I-Crel and I-Msol. J. Mol. Biol., 329,253-9.
29. Chevalier, B.S. and Stoddard, B.L. (2001b) Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res., 29, 3757-74.
30. Chevalier, B.S., Monnat, RJ.Jr. and Stoddard, B.L. (2001a) The homing endonuclease I-Crel uses three metals, one of which is shared between the two active sites. Nat. Struct. Biol., 8,312-6.
31. Christ, F., Schoettler, S., Wende, W., Steuer, S., Pingoud, A. and Pingoud, V. (1999) The monomelic homing endonuclease Pl-Scel has two catalytic centres for cleavage of the two strands of its DNA substrate. EMBO J., 18, 6908-16.
32. Chu, F.K., Maley, F., Wang, A.M., Pedersen-Lane, J. and Maley, G. (1991) Purification and substrate specificity of a T4 phage intron-encoded endonuclease. Nucleic Acids Research, 19, 6863-9.
33. Coen, D., Deutsch, J., Netter, P., Petrochilo, E. and Slonimski, P.P. (1970) Mitochondrial genetics. I. Methodology and phenomenology. Symp. Soc. Exp. Biol., 24, 449-96.
34. Corbin, B.D., McLean, R.J. and Aron, G.M. (2001) Bacteriophage T4 multiplication in a glucose-limited Escherichia coli biofilm. Can. J. Microbiol., 47, 680-4.
35. Cowan, J.A. (1998) Metal Activation of Enzymes in Nucleic Acid Biochemistry. Chem. Rev., 98, 1067-88.
36. Cowan, J.A. (2002). Structural and catalytic chemistry of magnesium-dependent enzymes. Biometals., 15,225-35.
37. Cowie, D.B., Avery, R.J. and Champe, S.P. (1971) DNA homology among the T-even bacteriophages. Virology, 45, 30-7.
38. Dabert, P. and Smith, G.R. (1997) Gene replacement with linear DNA fragments in wildtype Escherichia coli: enhancement by Chi sites. Genetics, 145, 877-89.
39. Dalgaard, J.Z., Baneijee, M. and Curcio, M.J. (1996) A novel Tyl-mediated fragmentation method for native and artificial yeast chromosomes reveals that the mouse steel gene is ahotspot for Tyl integration. Genetics, 143, 673-83.
40. Dalgaard, J.Z., Garrett, R.A. and Belfort, M. (1994) Purification and characterization of two forms of I-Dmol, a thermophilic site-specific endonuclease encoded by an archaeal intron. J. Biol. Chem., 269, 28885-92.
41. Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-5.
42. Dean, A.B., Stanger, M.J., Dansereau, J.T., Van Roey, P., Derbyshire, V. and Belfort, M. (2002) Zinc finger as distance determinant in the flexible linker of intron endonuclease I-Tevl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 8554-61.
43. Delahodde, A., Goguel, V., Becam, A.M., Creusot, F., Perea, J., Banroques, J. and Jacq, C. (1989) Site-specific DNA endonuclease and RNA maturase activities of two homologous intron-encoded proteins from yeast mitochondria. Cell, 56, 431-441.
44. Delbriik, M. (1945) Interference between bacterial viruses, III. The mutual exclusion effect and the depressor effect. J. Bacterid, 50,151-170.
45. Demerec, M. and Fano, U. (1945) Bacteriophages resistant mutants in E. coli. Genetics, 30, 119.
46. Depping, R., Lohaus, C., Meyer, H.E. and Ruger, W. (2005) The mono-ADP-ribosyltransferases Alt and ModB of bacteriophage T4: target proteins identified. Biochem. Biophys. Res. Commun., 335, 1217-23.
47. Derbyshire, V., Kowalski, J.C., Dansereau, J.T., Hauer, C.R. and Belfort, M. (1997) Two-domain structure of the td intron-encoded endonuclease I-TevI correlates with the two-domain configuration of the homing site. J. Mol. Biol., 265, 494-506.
48. Desai, S.M. and Weiss, S.B. (1977) Study of the transfer RNAs coded by T2, T4, and T6 bacteriophages. J. Biol. Chem., 252, 4935-41.
49. Desplats, C. and Krisch, H.M. (2003) The diversity and evolution of the T4-type bacteriophages. Res. Microbiol., 154,259-67.
50. Desplats, C., Dez, C., Tetart, F., Eleaume, H. and Krisch, H.M. (2002) Snapshot of the pseuso T-even phage RB49. J. Bacterid., 184,2789-804.
51. Dobzhansky, T. (1951) Genetics and the Origin of Species. Third edition. Columbia Univ. Press, New York.
52. Donoho, G., Jasin, M. and Berg, P. (1998) Analysis of gene targeting and intrachromosomal homologous recombination stimulated by genomic double-strand breaks in mouse embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 1998 Jul;18(7):4070-8.
53. Drouin, M., Lucas, P., Otis, C., Lemieux, C. and Tunnel, M. (2000) Biochemical characterization of I-Cmoel reveals that this H-N-H homing endonuclease shares functional similarities with H-N-H colicins. Nucleic Acids Res., 28,4566-72.
54. Duan, X., Gimble, F.S. and Quiocho, F.A. (1997) Crystal structure of Pl-Scel, a homing endonuclease with protein splicing activity. Cell, 89, 555-64.
55. Dujon, B. (1980) Sequence of the intron and flanking exons of the mitochondrial 21S rRNA gene of yeast strains having different alleles at the omega and rib-1 loci. Cell, 20, 185-97.
56. Durrenberger, F. and Rochaix, J.D. (1993) Characterization of the cleavage site and the recognition sequence of the I-Crel DNA endonuclease encoded by the chloroplast ribosomal intron of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Gen. Genet., 236, 409-14.
57. Eddy, S.R. and Gold, L. (1991) The phage T4 nrdB intron: a deletion mutant of a version found in the wild. Genes & Develop., 5,1032-1041.
58. Edgar, R.S. and Wood, W.B. (1966) Morphogenesis of bacteriophage T4 in extracts of mutant-infected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 498-505.
59. Edgell, D.R. and Shub, D.A. (2001) Related homing endonucleases I-Bmol and I-TevI use different strategies to cleave homologous recognition sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 7898-903.
60. Edgell, D.R., Belfort, M. and Shub, D.A. (2000) Barriers to intron promiscuity in bacteria. J. Bacteriol., 182, 5281-9.
61. Edgell, D.R., Stanger, M.J. and Belfort, M. (2003) Importance of a single base pair for discrimination between intron-containing and intronless alleles by endonuclease I-Bmol. Curr. Biol., 13,973-8.
62. Edgell, D.R., Stanger, M.J. and Belfort, M. (2004) Coincidence of cleavage sites of intron endonuclease I-TevI and critical sequences of the host thymidylate synthase gene. J. Mol. Biol., 343, 1231-41.
63. El Hassan, M.A. and Calladine, C.R. (1996) Propeller-twisting of base-pairs and the conformational mobility of dinucleotide steps in DNA. J. Mol. Biol., 259, 95-103.
64. Favre, D. and Viret, J.F. (1996) Versatile cosmid vectors for facilitated analysis and subcloning of the insert. Gene, 178,43-9.
65. Feng, H., Dong, L. and Cao, W. (2006) Catalytic mechanism of endonuclease v: a catalytic and regulatory two-metal model. Biochemistry, 45, 10251-9.
66. Flick, K.E., Jurica, M.S., Monnat, R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (1998) DNA binding and cleavage by the nuclear intron-encoded homing endonuclease I-Ppol. Nature, 394, 96101.
67. Flynn, J.L. and Ohman, D.E. (1988) Use of a gene replacement cosmid vector for cloning alginate conversion genes from mucoid and nonmucoid Pseudomonas aeruginosa strains: algS controls expression of algT. J. Bacteriol., 170, 3228-36.
68. Fukada, K. and Abelson, J. (1980) DNA sequence of a T4 transfer RNA gene cluster. J. Mol. Biol., 139,377-91.
69. Galburt, E.A. and Stoddard, B.L. (2002) Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucl eases. Biochemistry, 41,13851-60.
70. Galburt, E.A., Chevalier, B., Tang, W., Jurica, M.S., Flick, K.E., Monnat, RJ.Jr. and Stoddard, B.L. (1999) A novel endonuclease mechanism directly visualized for I-Ppol. Nat. Struct. Biol., 6,1096-9.
71. Gary, T.P., Colowick, N.E. and Mosig, G. (1998) A species barrier between bacteriophages T2 and T4: exclusion, join-copy and join-cut-copy recombination and mutagenesis in the dCTPase genes. Genetics, 148, 1461-73.
72. Gay, P., Le Coq, D., Steinmetz, M., Berkelman, T. and Kado, C.I. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 1985 Nov; 164(2):918-21.
73. Geese, W.J., Kwon, Y.K., Wen, X. and Waring, R.B. (2003) In vitro analysis of the relationship between endonuclease and maturase activities in the bi-functional group I intron-encoded protein, l-Ani\. Eur. J. Biochem., 270, 1543-54.
74. George, J.W. and Kreuzer, K.N. (1996) Repair of double-strand breaks in bacteriophage T4 by a mechanism that involves extensive DNA replication. Genetics, 143, 1507-20.
75. Gibb, E.A. and Edgell, D.R. (2007) Multiple controls regulate the expression of mobE, an HNH homing endonuclease gene embedded within a ribonucleotide reductase gene of phage Aehl. J. Bacteriol., 189,4648-61.
76. Gimble, F.S. and Stephens, B.W. (1995) Substitutions in conserved dodecapeptide motifs that uncouple the DNA binding and DNA cleavage activities of Pl-Scel endonuclease. J. Biol. Chem., 270,5849-56.
77. Gimble, F.S. and Thorner, J. (1992) Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 357, 301-6.
78. Gimble, F.S. and Wang, J. (1996) Substrate recognition and induced DNA distortion by the Pl-Scel endonuclease, an enzyme generated by protein splicing. J. Mol. Biol., 263, 163-80.
79. Goff, C.G. and Weber, K. A T4-induced RNA polymerase a-subunit modification. (1970) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 35, 101-108.
80. Gogarten, J.P. and Hilario, E. (2006) Inteins, introns, and homing endonucleases: recent revelations about the life cycle of parasitic genetic elements. BMC Evol. Biol., 6, 94.
81. Goodrich-Blair, H. and Shub, D.A. (1996) Beyond homing: competition between intron endonucleases confers a selective advantage on flanking genetic markers. Cell, 84, 21121. '
82. Goryshin, I.Y., Jendrisak, J., Hoffinan, L.M., Meis, R. and Reznikoff, W.S. (2000) Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nat. Biotechnol., 18, 97-100.
83. Gott, J.M., Zeeh, A., Bell-Pedersen, D., Ehrenman, K., Belfort, M. and Shub, D.A. (1988) Genes within genes: independent expression of phage T4 intron open reading frames and the genes in which they reside. Genes Dev., 2,1791-9.
84. Guhan, N. and Muniyappa, K. (2003) Structural and functional characteristics of homing endonucleases. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 38,199-248.
85. Guild, N., Gayle, M., Sweeney, R., Hollingsworth, T., Modeer, T. and Gold, L. (1988) Transcriptional activation of bacteriophage T4 middle promoters by the motA protein. J. Mol. Biol., 199,241-58.
86. Guthrie, C. and McClain, W.H. (1973) Conditionally lethal mutants of bacteriophage T4 defective in production of a transfer RNA. J. Mol. Biol., 81,137-55.
87. Hall, R.M. and Collis, C.M. (1995) Mobile gene cassettes and integrons: capture and spread of genes by site-specific recombination. Mol. Microbiol., 15, 593-600.
88. Hamilton, C.M., Aldea, M., Washburn, B.K., Babitzke, P. and Kushner, S.R. (1989) New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacterid., 171,4617-22.
89. Hastings, P.J. (1992) Mechanism and control of recombination in fungi. Mutat. Res., 284, 97-110.
90. Haugen, P., Wikmark, O.G., Vader, A., Coucheron, D.H., Sjerttem, E. and Johansen, S.D. (2005) The recent transfer of a homing endonuclease gene. Nucleic Acids Res., 33, 273441.
91. Hayashi, I., Kawai, G. and Watanabe, K. (1997) Expression of bovine mitochondrial tRNASer GCU derivatives in Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 25, 3503-7.
92. He, Z., Crist, M., Yen, H., Duan, X., Quiocho, F.A. and Gimble, F.S. (1998) Amino acid residues in both the protein splicing and endonuclease domains of the PI-Scel intein mediate DNA binding. J. Biol. Chem., 273,4607-15.
93. Heath, P.J., Stephens, K.M., Monnat, RJJr. and Stoddard, B.L. (1997) The structure of I-Crel, a group I intron-encoded homing endonuclease. Nat. Struct. Biol., 4, 468-76.
94. Heitman, J., Zinder, N.D. and Model, P. (1989) Repair of the Escherichia coli chromosome after in vivo scission by the EcoRI endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2281-5.
95. Herman, R.E., Haas, N. and Snustad, D.P. (1984) Identification of the bacteriophage T4 unf (= aid) gene product, a protein involved in the shutoff of host transcription. Genetics, 108, 305-17.
96. Hinton, D.M. (1991) Transcription from a bacteriophage T4 middle promoter using T4 motA protein and phage-modified RNA polymerase. J. Biol. Chem., 266, 18034-44.
97. Hoang, T.T., Kutchma, A.J., Becher, A. and'Schweizer, H.P. (2000) Integration-proficient plasmids for Pseudomonas aeruginosa: site-specific integration and use for engineering of reporter and expression strains. Plasmid, 43, 59-72.
98. Hu, D., Crist, M., Duan, X., Quiocho, F.A. and Gimble, F.S. (2000) Probing the • structure of the PI-Scel-DNA complex by affinity cleavage and affinity photocross-linking. J. Biol. Chem., 275, 2705-12.
99. Hunter, C.A. (1993) Sequence-dependent DNA structure. The role of base stacking interactions. J Mol Biol., 230,1025-54.
100. Hunter, C.A. (1996) Sequence-dependent DNA structure. Bioessays., 18, 157-62.
101. Ichiyanagi, K., Ishino, Y., Ariyoshi, M., Komori, K. and Morikawa, K. (2000) Crystal structure of an archaeal intein-encoded homing endonuclease Pl-Pfiil. J. Mol. Biol., 300, 889-901.
102. Jacquier, A. and Dujon, B. (1985) An intron-encoded protein is active in a gene conversion process that spreads an intron into a mitochondrial gene. Cell, 41, 383-94.
103. Jasin, M. (1996) Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet., 12, 224-8.
104. Jasin, M. and Schimmel, P. (1984) Deletion of an essential gene in Escherichia coli by site-specific recombination with linear DNA fragments. J. Bacterid., 159, 783-6.
105. Jendrisak, J., Young, R.A. and Engel, J.D. (1987) Cloning cDNA into lambda gtlO and lambda gtl 1. Methods Enzymol., 152, 359-71.
106. Johansen, S., Embley, T.M. and Willassen, N.P. (1993) A family of nuclear homing endonucleases. Nucleic Acids Res. 21, 4405.
107. Johnson, R.D. and Jasin, M. (2001) Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem. Soc. Trans., 29, 196-201.
108. Jost, B.H., Homchampa, P., Strugnell, R.A. and Adler, B. (1997) The sacB gene cannot be used as a counter-selectable marker in Pasteurella multocida. Mol. Biotechnol., 8,189-91.
109. Kadyrov, F.A., Kaliman, A.V. and Kryukov V.M. (1996a) Endonuclease SegE of phage T4. I. Cloning, expression and biochemical characterisation of endonuclease activity. Molecular Biology, 30, 654-660.
110. Kadyrov, F.A., Kaliman, A.V. and Kryukov, V.M. (1996b) Endonuclease SegE of phage T4.II. Recognition site. Molecular Biology, 30, 786-791.
111. Kadyrov, F.A., Kriukov, V.M., Shliapnikov, M.G. and Baev, A.A. (1994) SegE -a new site-specific endodeoxyribonuclease from bacteriophage T4. Dokl. Akad. Nauk, 339,404-406.
112. Kadyrov, F.A., Shlyapnikov, M.G. and Kryukov, V.M. (1997) A phage T4 site-specific endonuclease, SegE, is resposible for a non-reciprocal genetic exchange between T-even-related phages. FEBS Letters, 415, 75-80.
113. Kang, Y., Durfee, T., Glasner, J.D., Qiu, Y., Frisch, D., Winterberg, K.M. and Blattner, F.R. (2004) Systematic mutagenesis of the Escherichia coli genome. J Bacteriol., 186, 4921-30. Erratum in: J Bacteriol. (2004) 186, 8548.
114. Karberg, M., Guo, H., Zhong, J., Coon, R., Perutka, J. and Lambowitz, A.M. (2001) Group II introns as controllable gene targeting vectors for genetic manipulation of bacteria. Nat. Biotechnol., 19, 1162-7.
115. Kikuchi, Y. and Nash, H.A. (1979) Nicking-closing activity associated with bacteriophage lambda int gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3760-4.
116. Kim, J.S. and Davidson, N. (1974) Electron microscope heteroduplex study of sequence relations of T2, T4, and T6 bacteriophage DNAs. Virology, 57, 93-111.
117. Koch, B., Jensen, L.E. and Nybroe, O. (2001) A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. J. Microbiol. Methods, 45,187-95.
118. Konez, C., Kiss, A. and Venetianer, P. (1978) Biochemical characterisation of the restriction-modification system of Bacillus sphaericus. Eur. J. Biochem., 98, 523-9.
119. Kornberg, A. and Baker, T.A. (1991) DNA Replication. 2nd ed. New York. W.H. Freeman and comp., 379-832.
120. Kunisawa, T. (1999) Bacteriophage transfer RNA's and their significance in enhancing translational efficiency. Res. Commun. Biochem. Cell Mol. Biol., 3, 147-155.
121. Kunisawa, T., Kanaya, S. and Kutter, E. (1998) Comparison of synonymous codon distribution patterns of bacteriophage and host genomes. DNA Res., 5, 319-26.
122. Kutter, E., Gachechiladze, K., Poglazov, A., Marusich, E., Shneider, M., Aronsson, P., Napuli, A., Porter, D. and Mesyanzhinov, V. (1995) Evolution of T4-related phages. Virus Genes, 11, 285-97.
123. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-5.
124. Lambowitz, A.M. and Belfort, M. (1993) Introns as mobile genetic elements. Annu. Rev. Biochem., 62, 587-622.
125. Landthaler, M., Begley, U., Lau, N.C. and Shub, D.A. (2002) Two self-splicing group I introns in the ribonucleotide reductase large subunit gene of Staphylococcus aureus phage Twort. Nucleic Acids Res., 30, 1935-43.
126. Landthaler, M., Lau, N.C. and Shub, D.A. (2004) Group I intron homing in Bacillus phages SP01 and SP82: a gene conversion event initiated by a nicking homing endonuclease. J. Bacteriol., 186,4307-14.
127. Lehman, I.R. and Pratt, E.A. (1960) On the structure of the glucosylated hydroxymethylcytosine nucleotides of coliphages T2, T4, and T6. J. Biol. Chem., 235, 3254-9.
128. Leslie, A.G., Arnott, S., Chandrasekaran, R. and Ratliff, R.L. (1980) Polymorphism of DNA double helices. J. Mol. Biol., 143,49-72.
129. Liang, F., Han, M., Romanienko, PJ. and Jasin, M. (1998) Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5172-7.
130. Liang, F., Romanienko, P.J., Weaver, D.T., Jeggo, P.A. and Jasin, M. (1996) Chromosomal double-strand break repair in Ku80-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8929-33.
131. Liebig, H.D. and Ruger, W. (1989) Bacteriophage T4 early promoter regions. Consensus sequences of promoters and ribosome-binding sites. J. Mol. Biol., 208, 51736.
132. Lin, F.L., Sperle, K. and Sternberg, N. (1984) Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role for DNA ends in the recombination process. Mol. Cell. Biol., 4,1020-34.
133. Lin, Y., Lukacsovich, T. and Waldman, A.S. (1999) Multiple pathways for repair of DNA double-strand breaks in mammalian chromosomes. Mol. Cell Biol., 19, 8353-60.
134. Link, A.J., Phillips, D. and Church, G.M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol., 179, 6228-37.
135. Liu, Q., Belle, A., Shub, D.A., Belfort, M. and Edgell, D.R. (2003) SegG endonuclease promotes marker exclusion and mediates co-conversion from a distant cleavage site. J. Mol. Biol., 334, 13-23.
136. Liu, S.L. and Sanderson, K.E. (1996) Highly plastic chromosomal organization in Salmonella typhi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10303-8.
137. Loizos, N., Silva, G.H. and Belfort, M. (1996) Intron-encoded endonuclease I-TevII binds across the minor groove and induces two distinct conformational changes in its DNA substrate. J. Mol. Biol., 255,412-24.
138. Loizos, N., Tillier, E.R. and Belfort, M. (1994) Evolution of mobile group I introns: recognition of intron sequences by an intron-encoded endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11983-7.
139. Luke, K., Radek, A., Liu, X„ Campbell, J., Uzan, M., Haselkorn, R. and Kogan, Y. (2002) Microarray analysis of gene expression during bacteriophage T4 infection. Virology, 299,182-91.
140. Lykke-Andersen, J., Garrett, R.A. and Kjems, J. (1997) Mapping metal ions at the catalytic centres of two intron-encoded endonucleases. EMBO J., 16, 3272-81.
141. Macreadie, I.G., Scott, R.M., Zinn, A.R. and Butow, R.A. (1985) Transposition of an intron in yeast mitochondria requires a protein encoded by that intron. Cell; 41, 395402.
142. Mahillon, J., Rode, C.K., Leonard, C. and Bloch, C.A. (1997) New ultrarare restriction site-carrying transposons for bacterial genomics. Gene, 187, 273-9.
143. Malkova, A., Ivanov, E.L. and Haber, J.E. (1996) Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7131-6.
144. Mavrodi, D.V., Bonsall, R.F., Delaney, S.M., Soule, M.J., Phillips, G. and
145. Thomashow, L.S. (2001) Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin andphenazine-l-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAOl. J. Bacteriol., 183, 6454-65.
146. McGill, C., Shafer, B. and Strathern, J. (1989) Coconversion of flanking sequences with homothallic switching. Cell, 57,459-67.
147. Miller, E.S. and Jozwik, C.E. (1990) Sequence analysis of conserved regA and variable orf43.1 genes in T4-like bacteriophages, J. Bacteriol., 172, 5180-5186.
148. Miller, E.S., Kutter, E., Mosig, G., Arisaka, F., Kunisawa, T. and Ruger W. (2003) Bacteriophage T4 genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67, 86-156.
149. Minton, K.W. (1994) DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Mol. Microbiol., 13, 9-15.
150. Monod, C., Repoila, F., Kutateladze, M., Tétart, F. and Krisch, H.M. (1997) The genome of the Pseudo T-even bacteriophage, a diverse group that resembles T4. J. Mol. Biol., 267,237-249.
151. Monteilhet, C., Perrin, A., Thierry, A., Colleaux, L. and Dujon, B. (1990) Purification and characterization of the in vitro activity of I-Scel, a novel, and highly specific endonuclease encoded by a group I intron. Nucleic Acids Res., 18, 1407-13.
152. Moore, J.K. and Haber, J.E. (1996) Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand breaks. Nature, 383, 644-6.
153. Morgan, R.D., Calvet, C., Demeter, M., Agra, R. and Kong, H. (2000) Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol. Chem., 381, 1123-5.
154. Mosig, G. (1994a) Homologous recombination. Molecular biology of bacteriophage T4 (ed. J.Karam). ASM Press. Washington. DC., p. 54-82.
155. Mosig, G., Colowick, N.E. and Pietz, B.C. (1998) Several new bacteriophage T4 genes, mapped by sequencing deletion endpoints between genes 56 (dCTPase) and dda (a DNA-dependent ATPase-helicase) modulate transcription. Gene, 223,143-55.
156. Moure, C.M., Gimble, F.S. and Quiocho, F.A. (2002) Crystal structure of the intein homing endonuclease PI-SceI bound to its recognition sequence. Nat. Struct. Biol., 9, 764-70.
157. Moure, C.M., Gimble, F.S. and Quiocho, F.A. (2003) The crystal structure of the gene targeting homing endonuclease I-Scel reveals the origins of its target site specificity. J. Mol. Biol., 334, 685-95.
158. Mueller, J.E., Clyman, J., Huang, Y.J., Parker, M.M. and Belfort, M. (1996) Intron mobility in phage T4 occurs in the context of recombination-dependent DNA replication by way of multiple pathways. Genes Dev., 10, 351-64.
159. Mueller, J.E., Smith, D., Bryk, M. and Belfort, M. (1995) Intron-encoded endonuclease I-TevI binds as a monomer to effect sequential cleavage via conformational changes in the td homing site. EMBO J., 14, 5724-35
160. Muramatsu, T., Nishikawa, K., Nemoto, F., Kuchino, Y., Nishimura, S., Miyazawa, T. and Yokoyama, S. (1988) Codon and amino-acid specificities of a transfer RNA are both converted by a single post-transcriptional modification. Nature, 336, 17981.
161. Murphy, K.C. (1998) Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J Bacteriol., 180,2063-71.
162. Murphy, K.C., Campellone, K.G. and Poteete, A.R. (2000) PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene, 246, 321-30.
163. Muscarella, D.E., Ellison, E.L., Ruoff, B.M. and Vogt, V.M. (1990) Characterization of I-Ppo, an intron-encoded endonuclease that mediates homing of a group I intron in the ribosomal DNA of Physarum polycephalum. Mol. Cell Biol., 10, 3386-96.
164. Nelson, H.C., Finch, J.T., Luisi, B.F. and Klug, A. (1987) The structure of an oligo(dA)oligo(dT) tract and its biological implications. Nature, 330,221-6.
165. Nelson, H.H., Sweetser, D.B. and Nickoloff, J.A. (1996) Effects of terminal nonhomology and homeology on double-strand-break-induced gene conversion tract directionality. Mol. Cell Biol., 16,2951-7.
166. Nishigaki, K., Kaneko, Y„ Wakuda, H., Husimi, Y. and Tanaka, T. (1985) Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res., 13, 5747-60.
167. Okker, R.J. (1981) Partial exclusion of bacteriophage T2 by bacteriophage T4: induction of early enzymes by excluded T2. J. Gen. Virol., 56, 267-74.
168. Okker, R.J., Pees, E. and Bom, V. (1981) Partial exclusion of bacteriophage T2 by bacteriophage T4: an exclusion-resistant mutation in gene 56 of T2. J. Gen. Virol., 1981, 53, 13-9.
169. Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W. and Rothstein, R.J. (1981) Yeast transformation: a model system for the study of recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6354-8.
170. Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W. and Rothstein, R.J. (1983) Genetic applications of yeast transformation with linear and gapped plasmids. Methods Enzymol., 101, 22845.
171. Orsini, G. and Brody, E.N. (1988) Phage T4 DNA codes for two distinct 10-kDa proteins which strongly bind to RNA polymerase. Virology, 162, 397-405.
172. Orsini, G., Ouhammouch, M., Le Caer, J.-P. and Brody, E.N. (1993) The asiA gene of bacteriophage T4 codes for the anti-sigma 70 protein. J. Bacteriol., 175, 85-93.
173. Paddock, G.V. and Abelson, J. (1975a) Nucleotide sequence determination of bacteriophage T4 species I ribonucleic acid. J. Biol. Chem., 250,4185-206.
174. Paddock, G.V. and Abelson, J. (1975b) Nucleotide sequence determination of bacteriophage T2 and T6 species I ribonucleic acids. J. Biol. Chem., 250, 4207-19.
175. Paques, F. and Duchateau, P. (2007) Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr. Gene Ther., 7, 49-66.
176. Parker, M.M., Belisle, M. and Belfort, M. (1999) Intron homing with limited exon homology. Illegitimate double-strand-break repair in intron acquisition by phage T4. Genetics, 153,1513-23.
177. Parker, M.M., Court, D.A., Preiter, K. and Belfort, M. (1996) Homology requirements for double-strand break-mediated recombination in a phage lambda-td intron model system. Genetics, 143,1057-68.
178. Pees, E and De Groot, B. (1970) Partial exclusion of genes of bacteriophage T2 with T4 glucosylated DNA in crosses with bacteriophage T4. Genetica, 41, 541-50.
179. Perez-Rueda, E., Gralla, J.D. and Collado-Vides, J. (1998) Genomic position analyses and the transcription machinery. J. Mol. Biol., 275,165-70.
180. Perrin, A., Buckle, M. and Dujon, B. (1993) Asymmetrical recognition and activity of the I-Scel endonuclease on its site and on intron-exon junctions. EMBO J., 12, 2939-47.
181. Polisky, В., Greene, P., Garfin, D.E., McCarthy, B.J., Goodman, H.M., and Boyer, H.W. (1975) Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3310-4.
182. Porteus, M.H. and Baltimore, D. (2003) Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science, 300, 763.
183. Posfai, G., Kolisnychenko, V., Bereczki, Z. and Blattner, F.R. (1999) Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res., 27, 4409-15.
184. Puchta, H., Dujon, B. and Hohn, B. (1996) Two different but related mechanisms are used in plants for the repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5055-60.
185. Pulitzer, J.F., Colombo, M. and Ciaramella, M. (1985) New control elements of bacteriophage T4 pre-replicative transcription. J. Mol. Biol., 182, 249-63.
186. Quandt, J. and Hynes, M.F. (1993) Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in gram-negative bacteria. Gene, 127,15-21.
187. Quirk, S.M., Bell-Pedersen, D. and Belfort, M. (1989) Intron mobility in the T-even phages: high frequency inheritance of group I introns promoted by intron open reading frames. Cell, 56, 455-65.
188. Raaijmakers, J.M. and Weller, D.M. (1998) Natural plant protection by 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas spp. in take-all decline soils. Mol. Plant-Microbe Interact., 11, 144-52.
189. Reckmann, B. and Krauss, G. (1987) The cleavage of single-stranded DNA by the isoschizomeric restriction endonuclease Hhal and Cfol. Biochim Biophys Acta., 908, 90-6.
190. Reiter, W.D., Palm, P. and Yeats, S. (1989) Transfer RNA genes frequently serve as integration sites for prokaryotic genetic elements. Nucleic Acids Res., 17, 1907-14.
191. Repoila, F., Tetart, F., Bouet, J.-Y. and Krisch, H.M. (1994) Genomic polymorphism in the T-even bacteriophages. EMBO J., 13,4181-92.
192. Revel, H.R. (1983) DNA modification: glucosylation. In Mathews, C.K., Kutter, E.M., Mosig,G. and Begret, P.B. (eds), Bacteriophage T4, American Society for Microbiology, Washington DC., pp. 156-165.
193. Robbins, J.B., Stapleton, M., Stanger, M.J., Smith, D., Dansereau, J.T., Derbyshire, V. and Belfort, M. (2007) Homing endonuclease I-TevIII: dimerization as a means to a double-strand break. Nucleic Acids Res. 35, 1589-600.
194. Roberts, R.J. and Macelis, D. (1993) REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic Acids Res., 21, 3125-37.
195. Rouet, P., Smih, F. and Jasin, M. (1994a) Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6064-8.
196. Rouet, P., Smih, F. and Jasin, M. (1994b) Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol. Cell Biol., 14, 8096-106.
197. Russel, R.L. and Huskey, R.J. (1974) Partial exclusion between T-even bacteriophages: an incipient genetic isolation mechanism. Genetics, 78, 989-1014.
198. Russell, R.L. (1974) Comparative genetics of the T-even bacteriophages. Genetics, 78,967-88.
199. Sacherer, P., De' fago, G. and Haas, D. (1994) Extracellular protease and phospholipase C are controlled by the global regulatory gene gacA in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHAO. FEMS Microbiol. Lett., 116,115-60.
200. Sadowski, P.D. (1993) Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. FASEB J., 7, 760-7.
201. Salgado, H., Santos, A'., Garza-Ramos, U., van Helden, J., Diaz, E. and Collado-Vides, J. (1999). RegulonDB (version 2.0): a database on transcriptional regulation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 27, 59-60.
202. Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
203. Sandegren, L. and Sjoberg, B.M. (2004) Distribution, sequence homology, and homing of group I introns among T-even-like bacteriophages: evidence for recent transfer of old introns. J. Biol. Chem., 279,22218-27.
204. Sargent, R.G., Brenneman, M.A. and Wilson, J.H. (1997) Repair of site-specific double-strand breaks in a mammalian chromosome by homologous and illegitimate recombination. Mol. Cell Biol., 17,267-77.
205. Sargueil, B., Hatat, D., Delahodde, A. and Jacq, C. (1990) In vivo and in vitro analyses of an intron-encoded DNA endonuclease from yeast mitochondria. Recognition site by site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res., 18, 5659-65.
206. Saves, I., Morlot, C., Thion, L., Rolland, J.L., Dietrich, J. and Masson, J.M. (2002) Investigating the endonuclease activity of four Pyrococcus abyssi inteins. Nucleic Acids Res., 30,4158-65.
207. Saves, I., Ozanne, V., Dietrich, J. and Masson, J.M. (2000) Inteins of Thermococcus fumicolans DNA polymerase are endonucleases with distinct enzymatic behaviors. J. Biol. Chem., 275,2335-41.
208. Schildkraut, CL, Wierzchowski, K.L., Marmur, J, GREEN DM, DOTY P. A study of the base sequence homology among the T series of bacteriophages. Virology. 1962 Sep; 18:43-55.
209. Schottler, S., Wende, W., Pingoud, V. and Pingoud, A. (2000) Identification of Asp218 and Asp326 as the principal Mg2+ binding ligands of the homing endonuclease Pl-Scel. Biochemistry, 39, 15895-900.
210. Schwarz, H., Riede, I., Sonntag, I. and Henning, U. (1983) Degrees of relatedness of T-even type E. coli phages using different of the same receptors and topology of serologically cross-reacting sites. EMBO J., 2,375-80.
211. Schweizer, H.P. (1992) Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColEl-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Mol. Microbiol., 6, 1195-204.
212. Segal, D.J. and Carroll, D. (1995) Endonuclease-induced, targeted homologous extrachromosomal recombination in Xenopus oocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 80610. Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3632.
213. Selick, H.E., Stormo, G.D., Dyson, R.L. and Alberts, B.M. (1993) Analysis of five presumptive protein-coding sequences clustered between theprimosome genes, 41 and 61, of bacteriophages T4, T2, and T6. J. Virol., 7, 2305-16. •
214. Sharma, M. and Hinton, D.M. (1994) Purification and characterization of the SegA protein of bacteriophage T4, an endonuclease related to proteins encoded by group I introns. J. Bacteriol., 176, 6439-48.
215. Sharma, M., Ellis, R.L. and Hinton D.M. (1992) Identification of a family of bacteriophage T4 genes encoding proteins similar to those present in group-I introns of fungi and phages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6658-62.
216. Sharma, M., Marshall, P. and Hinton, D.M. (1999) Binding of the bacteriophage T4 transcriptional activator, MotA, to T4 middle promoter DNA: evidence for both major and minor groove contacts. J. Mol. Biol., 290, 905-15.
217. Shcherbakov, V., Granovsky, I., Plugina, L., Shcherbakova, T., Sizova, S., Pyatkov, K., Shlyapnikov, M. and Shubina, O. (2002) Focused genetic recombination of bacteriophage t4 initiated by double-strand breaks. Genetics, 162, 543-56.
218. Shen, B.W., Landthaler, M., Shub, D.A. and Stoddard, B.L. (2004) DNA binding and cleavage by the HNH homing endonuclease l-Hmul. J. Mol. Biol., 342, 43-56.
219. Sieber, P., Lindemann, A., Boehm, M., Seidel, G., Herzing, U., van der Heusen, P., Muller, R., Ruger, W., Jaenicke, R. and Rosch, P. (1998) Overexpression and structural characterization of the phage T4 protein DsbA. Biol. Chem., 379, 51-8.
220. Sikder, D. and Nagaraja, V. (2000). Determination of the recognition sequence of Mycobacterium smegmatis topoisomerase I on mycobacterial genomic sequences. Nucleic Acids Res., 28, 1830-7.
221. Silva, G.H., Dalgaard, J.Z., Belfort, M. and Van Roey, P. (1999) Crystal structure of the thermostable archaeal intron-encoded endonuclease I-Dmol. J. Mol. Biol., 286, 1123-36.
222. Simon, R., Priefer, U. and Puhler, A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram-negative bacteria. Biotechnology, 1, 784-91.
223. Singer, B.S., Gold, L., Gauss, P. and Doherty, D.H. (1982) Determination of the amount of homology required for recombination in bacteriophage T4. Cell, 31,25-33.
224. Sitbon, E. and Pietrokovski, S. (2003) New types of conserved sequence domains in DNA-binding regions of homing endonucleases. Trends Biochem. Sci., 28,473-7. Review.
225. Smih, F., Rouet, P., Romanienko, P.J. and Jasin, M. (1995) Double-strand breaks at the target locus stimulate gene targeting in embiyonic stem cells. Nucleic Acids Res., 23, 5012-9.
226. Smith, M.C. and Thorpe, H.M. (2002) Diversity in the serine recombinases. Mol. Microbiol., 44, 299-307. Review.
227. Snustad, D.P., Haas, N. and Oppenheimer, D.G. (1986) The bacteriophage regulatory protein gp alc/unf binds to DNA in the absense of RNA-polymerase. J. Virol., 60, 1145-7.
228. Snyder, L. and Jorissen, L. (1986) Molecular proof that bacteriophage T4 ale and unf genes are the same gene. J. Bacteriol., 168, 833-8.
229. Sommer, N., Salniene, V., Gineikiene, E., Nivinskas, R. and Ruger, W. (2000) T4 early promoter strength probed in vivo with unribosylated and ADP-ribosylated Escherichia coli RNA polymerase: a mutation analysis. Microbiology, 146, 2643-53.
230. Stevens, A. (1972) New small polypeptides associated with DNA-dependent RNA polymerase of Escherichia coli after infection with bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 603-7.
231. Stoddard, B.L. (2005) Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys., 38,49-95.
232. Stohr, B.A. and Kreuzer, K.N. (2002) Coordination of DNA ends during double-strand-break repair in bacteriophage T4. Genetics, 162,1019-30.
233. Streisinger, G. (1956) The genetic control of host range and serological specificity in bacteriophages T2 and T4. Virology, 2, 377-87.
234. Streisinger, G., Edgar, R.S. and Denhardt, G.H. (1964) Chromosome structure in phage T4.1. Circularity of the linkage map. Proc. Natl. Sci. USA, 51,775-9.
235. Streisinger, G., Emrich, J. and Stahl, M.M. (1967) Chromosome structure in phage T4. III. Terminal redundancy and length determination. Proc. Natl. Sci. USA, 57, 292-5.
236. Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 RNApolymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189, 113-30.
237. Studier, W., Rosenberg, A., Dunn, J. and Dubendorff, J. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Meth. Enzymology, 185, 60-89.
238. Szostac, J.W., Orr-Weaver, T.L., Rothstein, R.J. and Stahl, F.W. (1983) The double strand-break repair model for recombination. Cell, 33,25-35.
239. Tao, L., LeBlanc, D.J. and Ferretti, J.J. (1992) Novel streptococcal-integration shuttle vectors for gene cloning and inactivation. Gene, 120, 105-10.
240. Taylor, L.A. and Rose, R.E. (1988) A Correction in the Nucleotide Sequence of the Tn903 Kanamycin Resistance Determinant in pUC4K. Nucleic Acids Res., 16, 358.
241. Teng, S.C., Kim, B. and Gabriel, A. (1996) Retrotransposon reverse-transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. Nature, 383, 641-4.
242. Tetart, F., Desplats, C., Kutateladze, M., Monod, C., Ackermann, H.W. and Krisch, H.M. (2001) Phylogeny of the major head and tail genes of the wideranging T4-type bacteriophages. J. Bacteriol., 183, 358-6.
243. Thaler, D.S., Stahl, M.M. and Stahl, F.W. (1987) Tests of double-strand-break repair model for re<i-mediated recombination of phage lambda and plasmid lambda dv. Genetics, 116, 501-15.
244. Thierry, A., Perrin, A., Boyer, J., Fairhead, C., Dujon, B., Frey, B. and Schmitz, G. (1991) Cleavage of yeast and bacteriophage T7 genomes at a single site using the rare cutter endonuclease I-Scel. Nucleic Acids Res., 19,189-90.
245. Tiemann, B., Depping, R. and Ruger, W. (1999) Overexpression, purification, and partial characterization of ADP-ribosyltransferases modA and modB of bacteriophage T4. Gene Expr., 8, 187-96.
246. Tinker-Kulberg, R.L., Fu, T.J., Geiduschek, E.P. and Kassavetis, G.A. (1996) A direct interaction between a DNA-tracking protein and a promoter recognition protein: implications for searching DNA sequence. EMBO J., 15, 5032—5039.
247. Toda, T. and Itaya, M. (1995) I-Ceul recognition sites in the rrn opérons of the Bacillus subtilis 168 chromosome: inherent landmarks for genome analysis. Microbiology, 141, 1937-45. .
248. Tunnel, M., Otis, C., Côté, V. and Lemieux, C. (1997) Evolutionarily conserved and functionally important residues in the I-Ceul homing'endonuclease. Nucleic Acids Res., 25, 2610-9.
249. Van de Putte, P. and Goosen, N. (1992) DNA inversions in phages and bacteria. Trends Genet., 8, 457-62. Review.
250. Van Roey, P., Meehan, L., Kowalski, J.C., Belfort, M. and Derbyshire, V. (2002) Catalytic domain structure and hypothesis for function of GIY-YIG intron endonuclease I-Tevl. Nat. Struct. Biol., 9, 806-11.
251. Van Roey, P., Waddling, C.A., Fox, K.M., Belfort, M. and Derbyshire, V. (2001) Intertwined structure of the DNA-binding domain of intron endonuclease I-Tevl with its substrate. EMBO J., 20, 3631-7.
252. Vetter, D. and Sadowski, P.D. (1974) Point mutants in the D2a region of bacteriophage T4 tail to induce T4 endonuclease IV. J. Virol., 14,207-13.
253. Vieira J. and Messing J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with syntetic universal primers. Gene, 19, 25968.
254. Vipond, I.B., Baldwin, G.S. and Halford, S.E. (1995). Divalent metal ions at the active sites of the EcoRV and EcoRI restriction endonucleases. Biochemistry, 34, 697704.
255. Warner, H.R. (1971) Partial suppression of bacteriophage T4 ligase mutations by T4 endonuclease II deficiency: role of host DNA ligase. J. Virol., 7, 534-6.
256. Warren, R.A.J. (1980) Modified bases in bacteriophages DNAs. Ann. Rev. Microbiol., 34, 137-58.
257. Weiffenbach, B. and Haber, J.E. (1985) Homothallic switching of Saccharomyces cerevisiae mating type genes by using a donor containing a large internal deletion. Mol. Cell Biol., 5, 2154-8.
258. Wende, W., Grindl, W., Christ, F., Pingoud, A. and Pingoud, V. (1996) Binding, bending and cleavage of DNA substrates by the homing endonuclease Pl-Scel. Nucleic Acids Res., 24, 4123-32.
259. Wendland, J. (2003) PCR-based methods facilitate targeted gene manipulations and cloning procedures. Curr Genet., 44, 115-23.
260. Wenzlau, J.M., Saldanha, R.J., Butow, R.A. and Perlman, P.S. (1989) A latent intron-encoded maturase is also an endonuclease needed for intron mobility. Cell, 56, 421-30.
261. Wernette, C., Saldanha, R., Smith, D., Ming, D„ Perlman, P.S. and Butow, R.A. (1992) Complex recognition site for the group I intron-encoded endonuclease I-SceII. Mol. Cell Biol., 12,716-23.
262. Wilkens, K., Tiemann, B., Bazan, F. and Ruger, W. (1997) ADP-ribosylation and early transcription regulation by bacteriophage T4. Adv Exp Med Biol., 419, 71-82.
263. Williams, K.P. (2002) Integration sites for genetic elements in prokaryotic tRNA and tmRNA genes: sublocation preference of integrase subfamilies. Nucleic Acids Res., 30, 866-75.
264. Williams, K.P., Kassavetis, G.A., Esch, F.S. and Geiduschek, E.P. (1987) Identification of the gene encoding an RNA polymerase-binding protein of bacteriophage T4. J. Virol., 61, 597-9.
265. Wilson, G.G., Tanyashin, V.I. and Murray, N.E. (1977) Molecular cloning of fragments of bacteriophage T4 DNA. Mol. Gen. Genet., 156, 203-14.
266. Wilson, J.H. (1973) Function of the bacteriophage T4 transfer RNA's. J. Mol. Biol., 74, 753-7.
267. Wilson, J.H., Kim, J.S. and Abelson, J.N. (1972) Bacteriophage T4 transfer RNA. 3. Clustering of the genes for the T4 transfer RNA's. J. Mol. Biol., 71, 547-56.
268. Wittmayer, P.K. and Raines, R.T. (1996) Substrate binding and turnover by the highly specific I-Ppol endonuclease. Biochemistry, 35,1076-83.
269. Wong, K. and Geiduschek, E.P. (1998) Activator-sigma interaction: A hydrophobic segment mediates the interaction of a sigma family promoter recognition protein with a sliding clamp transcription activator. J. Mol. Biol., 284, 195-203.
270. Wood, W.B. (1966) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli: bacterial mutations affecting the restriction and modification of DNA. J. Mol. Biol., 16, 118-33.
271. Wood, W.B. and Revel, H.R. (1976) The genome of bacteriophage T4. Bacteriological Rev., 40, 847-68.
272. Wu, S.S. and Kaiser, D. (1996) Markerless deletions of pil genes in Myxococcus xanthus generated by counterselection with the Bacillus subtilis sacB gene. J. Bacteriol., 178,5817-21.
273. Wyatt, G.R. and Cohen, S.S. (1952) A new pyrimidine base from bacteriophage nucleic acids. Nature, 170, 1072-3.
274. Wyatt, G.R. and Cohen, S.S. (1953) The bases of the nucleic acids of some bacterial and animal viruses: the occurence of 5-hydroxymethylcytosine. Biochem. J., 55, 774-82.
275. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33,103-119.
276. Yu, D., Ellis, H.M., Lee, E.C., Jenkins, N.A., Copeland, N.G. and Court, D.L. (2000) An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5978-83.
277. Zhao, L., Bonocora, R.P., Shub, D.A. and Stoddard, B.L. (2007) The restriction fold turns to the dark side: a bacterial homing endonuclease with a PD-(D/E)-XK motif. EMBO J., 26,2432-42.
278. Zimmerly, S., Guo, H., Eskes, R., Yang, J., Perlman, P.S. and Lambowitz, A.M. (1995) A group II intron RNA is a catalytic component of a DNA endonuclease involved in intron mobility. Cell, 83, 529-38.
279. Zinn, A.R. and Butow, R.A. (1985) Nonreciprocal exchange between alleles of the yeast mitochondrial 21S rRNA gene: kinetics and the involvement of a double-strand break. Cell, 40, 887-95.
280. Zuker, M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-15.
281. Абдурашитов M.A., Беличенко О.А., Шевченко A.B., Дегтярев С.Х. (1996) N.As/SE сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Молекулярная Биология. 30, 1261-7.
282. Акуленко Н.В., Ивашина Т.В., Шалойко JI.A., Шляпников М.Г., Ксензенко, В.Н. (2004) Новые сайт-специфические эндонуклеазы F-Tfll, F-TflII и F-TflIV, кодируемые бактериофагом Т5. Молек. Биол., 38, 632-41.
283. Железная, JI.A., Перевязова, Т.А., Альжанова Д.В., Матвиенко Н.И. (2001) Сайт-специфическая никаза из bacillus species штамм d6. Биохимия. 66, 989-93.
284. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В. А. (1986) Клонирование и секвенирование гена г ее А из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, 22,2721-27.
285. Кадыров Ф.А. SegE новая сайт-специфическая эндодезоксирибонуклеаза бактериофага Т4. Кандидатская диссертация. Пущино, 1996.
286. Колосов П.М. Эндонуклеаза SegD бактериофага Т4: выделение и биохимические свойства. Магистерская диссертация. Пущино, 2001.91. БЛАГОДАРНОСТИ
287. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.х.н. Шляпникову М. Г. (ИБФМ РАН, Пущино) за плодотворное руководство, а также понимание и поддержку в сложных ситуациях, возникающих при выполнении данной работы.
288. Существенная помощь при изучении способности эндонуклеазы SegB гидролизовать ДНК Т-четных фагов, а также изучении способности SegD стимулировать внутрихромосомную рекомбинацию была оказана Сивогривовым Д. Е. (ИБФМ РАН, Пущино).
289. Очень признательна Лаптевой Ю. С., Соколову А. С., Михайловой Г. 3., Филипповой В. В., Калинину А. Е., а также моей семье за соучастие и постоянную моральную поддержку, оказанную мне в процессе выполнения данной работы.
-
Брок-Волчанская, Вера Сергеевна
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2008
-
ВАК 03.00.03
- ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗА БАКТЕРИОФАГА Т5 (2.7.4.13): ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА
- Бактериофаг АР22, лизирующий клинические штаммы Acinetobacter baumannii: выделение и изучение молекулярно-биологических свойств
- Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК
- Выделение бактериофагов из бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b и SR65 и их детекция методами электрофизического анализа
- Характеристика систем рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteria-ceae и рода Pseudomonas
