Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие хоминг-эндонуклеазы SegC бактериофага Т4 в генетической рекомбинации у Т-четных бактериофагов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие хоминг-эндонуклеазы SegC бактериофага Т4 в генетической рекомбинации у Т-четных бактериофагов"

УЧАСТИЕ ХОМИНГ-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SegC БАКТЕРИОФАГА Т4 В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕКОМБ1ШАЦ1ПГУ Т-ЧЕТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

00345330(

003459387

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Виктор Прохорович Щербаков

доктор биологических наук Людмила Алексеевна Железная

кандидат биологических наук Владимир Николаевич Ксензенко

Ведущая организация: Филиал Института биоорганической

химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Защита диссертации состоится 22 января 2009 г. в ^_на заседании

диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Автореферат разосла

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т. И. Смолихина

Актуальность проблемы. Хоминг-эндонуклеазы являются особым классом сайт-специфических эндодсзоксирибонуклсаз. Первоначально, открытые рамки считывания (ОРС) хоминг-эндонуклеаз были обнаружены в митохондриальных геномах дрожжей в составе мобильных интронов группы I, которые способны перемещаться в безинтронный аллель (явление получило название хоминг, от англ. homing - возвращение домой). Как оказалось, мобильность интронов группы I обусловлена кодируемыми ими сайт-специфическими эндонуклеазами, которые способны дифференцированно узнавать безинтронный аллель и вносить в него разрыв. Репарация поврежденной молекулы осуществляется по интактной ДНК интрон-содержащего аллеля, что приводит к генной конверсии — замещению безинтронного аллеля интрон-содержащим. В настоящее время известно, что, в дополнение к интронам, хоминг-эндонуклеазы также кодируются интеинами и свободностоящими генами, и распространены во всех биологических царствах.

Интерес к хоминг-эндонуклеазам обусловлен их структурно-функциональными особенностями. Отличительной чертой хоминг-эндонуклеаз является способность узнавать протяженные (от 12 до 40 п.н.) вырожденные последовательности за счет образования большого числа специфических и неспецифических контактов с ДНК по всей длине сайта узнавания. Как следствие, практически каждая хоминг-эндонуклеаза узнает уникальную последовательность ДНК. Структурные и биохимические исследования этих ферментов не только расширяют границы наших представлений о природе ДНК-белковых взаимодействий, но и служат основой для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Не менее интересны хоминг-эндонуклеазы с точки зрения познания эволюционных механизмов. Как правило, эти ферменты с высокой эффективностью инициируют генетический обмен между близкородственными видами, и, таким образом, участвуют в горизонтальном переносе генетической информации. Бактериофаги, в частности Т-четные, являются удобной моделью для изучения роли хоминг-эндонуклеаз в эволюции. Так, сравнительно небольшой геном фага Т4 (около 169 т.п.н.) содержит, по меньшей мере, 14 генов хоминг-эндонуклеаз, тогда как в родственных ему Т-четных фагах они встречаются редко. Считается, что хоминг-эндонуклеазы ответственны за так называемое явление исключения

маркеров - преимущественное наследование маркеров Т4 при скрещивании фагов Т4 и Т2. При этом потомство, унаследовавшее маркеры Т2, является практически полностью рекомбинантным. По-видимому, хоминг-эндонуклеазы могут являться существенным фактором эволюции фагов.

Хоминг-эндонуклеазы могут выступать в роли не только объекта, но и инструмента исследований. В частности, они могут использоваться для изучения механизмов репарации двунитевых разрывов (ЦНР) ДНК. ДНР в ДНК могут возникать случайно под действием повреждающих агентов, а также программироваться клеткой (например, при перестройке иммуноглобулиновых генов, переключении типа спаривания у дрожжей, хоминге, мейотической рекомбинации). Неспособность репарировать ДНР приводит к нестабильности генома или гибели клетки. Основной путь репарации ДНР основывается на гомологичной рекомбинации. В классической молекулярной генетике исследования рекомбинации базировались на анализе совокупности случайных рекомбинационных событий. Использование модельной системы с детерминированной точкой ДНР в ДНК значительно упрощает анализ и интерпретацию результатов генетических экспериментов. Использование хоминг-эвдонуклеаз позволяет создать такую систему за счет способности этих ферментов узнавать протяженные редко встречаемые последовательности ДНК.

Бактериофаг Т4 представляет собой удобную модель для изучения рекомбинации. Т4, классический объект молекулярной биологии и генетики, является одним из наиболее изученных организмов. У этого фага имеется собственный репликационный и рекомбинационный аппарат, который охарактеризован биохимически. В высокой степени развита генетика Т4. Кроме того, Т4 имеет собственные хоминг-эндонуклеазы, а значит его геном адаптирован к их действию.

Цель работы. Основная цель данной работы заключалась в изучении способности эндонуклеазы Бе£С инициировать генетический обмен между Т-четными бактериофагами, а также в разработке на основе эндонуклеазы SegC экспериментальной модели для изучения механизмов репарации двуннтевого разрыва у фага Т4.

Основные задачи исследования:

1. Проанализировать область генов 5-6 у Т-четиых бактериофагов с целью поиска сайта гидролиза ScgC;

2. Получить препарат SegC и охарактеризовать его нуклеазную активность;

3. Локализовать предпочтительный сайт гидролиза SegC;

4. Изучить способность SegC инициировать генетический обмен между Т-четными бактериофагами в области генов 5-6;

5. Создать на основе эндонуклеазы SegC и системы генетического анализа рекомбинации в rll-локусе Т4 модель для изучения рекомбинации, инициируемой ДНР;

6. Проанализировать в модельной системе зависимость частоты рекомбинации от расстояния от ДНР; сравнить рекомбинацию слева и справа от ДНР.

Научная новизна. В данной работе описана новая сайт-специфическая эндонуклеаза SegC, относящаяся к GIY-YIG-семейству хоминг-эндонуклеаз. Фермент способен гидролизовать как немодифицироваиную ДНК, так и природную ДНК Т-четных фагов, содержащую гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина. Предпочтительный сайт гидролиза SegC обнаружен в области генов 5-6 фага T2L, в котором отсутствует ген segC. Показано, что SegC расщепляет ДНК T2L непосредственно в сайте инсерции собственного гена, что ранее считалось особенностью, присущей исключительно интрон-кодируемым эндонуклеазам. Установлено, что SegC в скрещиваниях Т4 и T2L инициирует генетический обмен между этими фагами в области генов 5-6, что сопровождается генной конверсией в этой области - замещением безнуклеазного аллеля T2L на íggC-содержащий аллель Т4. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что именно хоминг-эндонуклеазы ответственны за явление исключения маркеров, наблюдаемое в скрещиваниях Т4 и T2L.

Создана модельная система для изучения рекомбинации, инициируемой ДНР в rll-локусе фага Т4. Положение разрыва определяется эндонуклеазой SegC, сайт которой помещен в начало гена rlIB. Анализ рекомбинации слева и справа от точки разрыва показал равную и симметричную инициацию

рекомбинации каждым концом разорванной хромосомы. Исследована зависимость частоты рекомбинации от расстояния на участке, расположенном на расстоянии 12 - 2100 п.н. от ДНР в сериях двух- и трехфакторных скрещиваний. Полученные результаты подтверждают основные предсказания SPC (splice/patch coupling) модели рекомбинации.

Научно-практическая ценность. Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти практическое применение. Описанная в данном исследовании эндонуклеаза SegC может быть использована для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Разработанная модель рекомбинации в rll-локусе может использоваться для изучения механизмов репарации ДНР.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Evergreen International Phage Biology Meeting» (Olympia, USA, 2001 и 1998), «Molecular Genetics of Bacteria and Phages» (Cold Spring Harbor, USA, 1998), 3-ей Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 1998).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3-х статьях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Диссертация

изложена на_страницах, материал иллюстрирован_рисунками и_

таблицами. Библиография включает_ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. СВОЙСТВА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SegC БАКТЕРИОФАГА Т4

Анализ области генов 5-6 у Т4-родственных бактериофагов. Как правило, предпочтительные сайты гидролиза хоминг-эндонуклеаз обнаруживаются в гомологичных аллелях родственных им фагов, не содержащих кодирующие их ОРС. Ген segC фага Т4 располагается между генами 5 и 6 (рис. 1). Поэтому,

1

j_l_kb_ 2

Рис. 1. Генетические карты области генов 5—6 бактериофагов Т4 и T2L.

Горизонтальными серыми стрелками обозначены ОРС. Положение праймеров 1 и 2, использованных для ПЦР-анализа Т-четных бактериофагов, обозначено горизонтальными стрелками. Вертикальная стрелка указывает положение сайта гидролиза эндонуклеазы SegC.

для поиска сайта гидролиза предполагаемой эндонуклеазы SegC был проведен анализ этой области у бактериофагов T2L, RBI, RB2, RB3, RB6, RB7 и RB8. Анализ проводился при помощи ПЦР с праймерами 1 и 2 (рис. 1). Праймеры для ПЦР были составлены по последовательности Т4, поскольку для семейства

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2. ПЦР-анализ области генов 5-6 родственных Т-четным бактериофагов. Фрагменты ДНК фагов были амплифицированы с парой праймеров 1 и 2 (рис. 1) и разделены электрофорезом в 1% агарозном геле. Размеры фрагментов приведены в левой части рисунка.

Т4-четных фагов характерна высокая гомология ДНК. В результате анализа (рис. 2) было установлено, что все исследованные фаги, в сравнении с Т4, содержали в области генов 5-6 делецию, размер которой (-600 п.н.) коррелировал с размером ОРС segC (594 п.н.). Это позволило предположить, что у этих фагов ОРС segC отсутствует. Для проверки этого предположения была определена нуклеотидная последовательность данной области классического Т-четного бактериофага T2L (GenBank асс. no AF448490). Анализ последовательности подтвердил, что ОРС segC у фага T2L отсутствует (рис. 1), при этом гомология последовательностей Т4 и T2L по флангам ОРС segC составляет около 98%.

Ген segC кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу. Для того, чтобы протестировать SegC на наличие эндонуклеазной активности необходимо было получить препарат этого белка. Для этого, ОРС segC (GenBank асс. no Z69339) была клонирована под контроль Т7/ас-промотора и экспрессирована в системе промотор/РНК-полимераза фага Т7 в Е. coli. Ввиду высокой токсичности продукта, в качестве источника Т7 РНК-полимеразы использовали фаг X СЕ6, и экспрессию индуцировали тепловым шоком. В условиях индукции в клетках, содержащих ОРС segC, синтезировался белок, электрофоретическая подвижность которого соответствовала молекулярному весу около 27 кДа (рис. 3), что несколько выше, чем расчетный (22,2 кДа). Аномальная подвижность SegC, по-видимому, обусловлена его положительным зарядом, т.к. предсказанная из аминокислотного состава и'»электрическая точка белка составляет 10,3. Анализ клеточных фракций показал, что SegC накапливался преимущественно в виде телец включения. Поэтому препарат белка для дальнейшей работы получали ренатурацией из 7М мочевины (рис. 3).

Рис. 3. Супернродукция и очистка белка SegC фага Т4. Белки разделяли в 14% ПААГ в денатурирующих условиях. На дорожках 1 и 2 представлены лизаты клеток Е. coli BL21, трансформированных, соответственно, плазмидой рЕТ-11с (вектор) или pETSC-llc (содержит ОРС SegC), и выращенных в течение 2 ч. после индукции. 3 и 4 -соответственно, растворимая и нерастворимая фракции 20 —Ц Щ белков индуцированных клеток Е. coli BL21/pETSC-

;•» С i., lie. 5-препарат белка SegC, полученный

/ 2 " * ренатурацией из 7М мочевины. Стрелками обозначены

' ■' маркеры молекулярных масс.

Как уже упоминалось выше, предпочтительный сайт гидролиза хоминг-эндонуклеаз, как правило, обнаруживается в безнуклеазном аллеле родственного организма. Тем не менее, для ряда других Scg-нуклеаз Т4 (в частности, для SegB, SegD и SegE) было показано, что они способны, хоть и с меньшей эффективностью, вносить разрыв в ДНК кодирующего их фага в непосредственной близости от собственного гена. Поэтому, тестирование полученного препарата SegC на наличие эндонуклеазной активности проводили на ПЦР-фрагментах фагов Т4 и T2L, содержащих область генов 5-6.

Рис 4. Обнаружение сайт-специфической эндонуклеазной активности у белка SegC. Определение эндонуклеазной активности проводили, как описано в главе «Материалы и методы». В качестве субстрата использовали ПЦР-фрагменты фагов Т4 и T2L. которые были получены с использованием пары праймеров 1 и 2. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле.

Результаты экдонуклеазного теста (рис. 4) показали, что SegC вносит специфический разрыв в фрагмент фага T2L, т.е. является сайт-специфической эндонуклеазой. При этом SegC не способен эффективно гидролизовать фрагмент ДНК Т4 в исследуемой области.

Анализ зависимости активности от двухвалентных катионов показал, что SegC активен в присутствии Mg2+ и, в большей степени, Мп2+, тогда как катионы Са2+ стимулируют эндонуклеазную активность значительно слабее (рис. 5). Необходимо отметить, что наличие катионов Мп2+ в реакционной смеси приводило к появлению дополнительных участков расщепления ДНК.

Рис. 5. Зависимость эндонуклеазной активности SegC от двухвалентных катионов. ДНК плазмиды pUT2L (содержит фрагмент области генов 5-6 T2L), линеаризованную эндонуклеазой

рестрикции Я/иеПП (5), инкубировали с SegC без двухвалентных катионов (1) или в присутствии 10 мМ MgCi2 (2), CaC¡2 (3), МпСЬ (4). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле.

Т.П. II.

г- ^

0.9 -

3 4 5

Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС. На следующем этапе работы было определено положение точек разрыва, вносимого SegC в T2L ДНК. В результате было установлено, что как и другие фаговые хоминг-эндонуклеазы, SegC гидролизует ДНК с образованием 3'-выступающих концов длиной 2 н.о. (рис. 6).

Рис. 6. Определение точек разрыва эндонуклеазы SegC в области генов 5-6

фага T2L. А. Представлены радиоавтограммы участков «секвенирую-щих» гелей. На дорожках, обозначенных «-» и «+», представлены продукты реакции элонгации меченного праймера до и после инкубации с SegC, соответственно. G, А, Т и С - продукты секвенирующих реакций, полученные в присутствии соответствующих терминаторов. Справа представлены фрагменты последовательностей верхней и нижней цепей, где стрелками указано положение точек разрывов ДНК. Б. Представлена последовательность ДНК в области сайта гидролиза SegC. Точки разрыва в верхней и нижней цепях указаны стрелками.

Примечательным оказалось положение точек разрыва - непосредственно в потенциальном сайте инсерции ОРС segC (рис. 1). Практически все охарактеризованные эндонуклеазы группы Seg, а они кодируются «свободностоящими» генами, вносят разрыв в безнуклеазный аллель родственного фага на расстоянии от нескольких десятков до сотен п.н. от сайта инсерции собственного гена. При этом соответствующий участок собственного генома, как правило, содержит нуклеотидные замены, существенно снижающие эффективность гидролиза этих последовательностей in vitro. Очевидно, это является своеобразным механизмом защиты собственного генома от нежелательных разрывов. В тоже время, сайты узнавания и гидролиза фаговых интрон-кодируемых нуклеаз, обнаруженные в безинтронных аллелях, захватывают точку соединения двух экзонов. Таким образом, инсерция интрона приводит к «прерыванию» сайта узнавания. Как следствие, интрон-кодируемые хоминг-эндонуклеазы, в отличие от Seg-эндонуклеаз, практически не способны гидролизовать собственную ДНК в области инсерции интрона. Эндонуклеаза SegC нарушает наблюдаемую корреляцию между положением сайта гидролиза и локализацией нуклеазной ОРС. По-видимому, совпадение

10

5' -CTATGTGTMGAGAGG- 3 3' -САТАСАСАтаСТСТСС- 5'

или несовпадение сайтов гидролиза и инсерции является всего лишь результатом случайного эволюционного события, и никак не связано с генетическим окружением нуклеазного гена.

ScgC активен на модифицированной ДНК Т-чстных фагов. Известно,

что природная ДНК Т-чепгых фагов вместо канонических остатков цитозина

содержит гликозил-5-гидроксиметил-цитозин, громоздкие боковые группы

которого направлены в большой желобок. Кроме того, Т2 и Т4 отличаются но

характеру и степени гликозилирования. Для проверки возможного влияния

этих модификаций на эндонуклеазную активность SegC ДНК фагов T2L и Т4,

была проанализирована его активность на ДНК фагов Т4, T2L, а также

рекомбинантного фага Т42. Последний является производным Т4, в котором

собственная область между генами J и 6 замещена на гомологичную из T2L, и,

таким образом, у данного фага вместо гена segC находится сайт гидролиза

кодируемой им эндонуклеазы. Геномные ДНК фагов были гидролизованы

эндонуклеазой рестрикции Smil, которая нечувствительна к природной

модификации ДНК Т-четных фагов, поскольку не имеет остатков цитозина в

последовательности сайта узнавания (5'-АТТТАААТ-3'). S/иЯ-гидролизаты

обрабатывали эндонуклеазой SegC и разделяли при помощи гель-электрофореза

в инверсионных полях. Картина гидролиза Smil ДНК фагов Т4 и Т42

соответствовала предсказанному расположению сайтов в геноме, согласно

которому у Т4 межгенная область 5-6 находится на фрагменте длиной 10044

п.н., тогда как у Т42 он замещен фрагментом длиной 9480 п.н. (рис. 7). После

инкубации с SegC, видимых изменений в картине гидролиза Т4 не

наблюдалось, тогда как в случае Т42 фрагмент, содержащий межгенную

область 5-6, специфически расщеплялся на два, размеры которых

соответствовали расчетным - 5042 и 4438 п.н. Фрагмент ДНК фага T2L,

последовательность которого была определена в данной работе, не содержит

сайтов Smil. Поскольку нуклеотидная последовательность всего генома T2L не

установлена, рассчитать размеры фрагментов геномной ДНК T2L,

образующихся при гидролизе Smil, не представлялось возможным. Как видно

из рисунка 7, общая картина гидролиза ДНК T2L эндонуклеазой Smil

значительно отличается от Т4. Несмотря на это, инкубация с SegC приводила к

расщеплению фрагмента близкого по размеру к расщепляемому Т42-

фрагменту, кроме того, продукты гидролиза также имели сходный размер.

Дополнительно, при помощи гибридизации с ДНК-зондом к области генов 5-6,

11

а также в экспериментах по удлинению праймера на природной ДНК T2L было подтверждено, что наблюдаемый сайт гидролиза SegC в геномной ДНК T2L находится в области генов 5-6 и соответствует обнаруженному ранее (данные

Рис. 7. Анализ активности эндонуклеазы SegC на геномных ДНК фагов Т4В, Т42 и T2L, содержащих гликознлированные остатки гндроксиметилцитозина.

ДНК бактериофагов предварительно была гидролизована Smil, а затем обработана SegC. Продукты гидролиза разделены при помощи электрофореза в инверсионных полях в 1% агарозном геле. Треугольниками отмечены 5>пЛ-фрагменты, которые содержат область генов 5-6; ромбами отмечены продукты гидролиза этих фрагментов эндонуклеазой SegC. Положение ДНК-маркеров отмечено стрелками в левой части рисунка, размеры маркеров приведены в т.п.н.

Поскольку модификации ДНК Т-четных фагов не влияют на специфичность гидролиза, можно предположить, что SegC узнает ДНК преимущественно по малому желобку, как это было показано для другой хоминг-эндонуклеазы Т4, [-Теvi.

SegC инициирует хоминг собственного гена при скрещивании Т4 и T2L. Прежде чем исследовать способность эндонуклеазы SegC инициировать генетический обмен между Т4 и T2L, сопровождающийся хомингом собственного гена, мы проанализировали экспрессию гена segC при развитии Т4. Для этого экстракты клеток £ coli, инфицированные Т4 или полученным в ходе этой работы фагом T4segCA (содержит делецию в ОРС segC, приводящую к сдвигу рамки считывания) были протестированы на наличие специфической активности эндонуклеазы SegC. В качестве маркеров длин фрагментов использовали продукты гидролиза in vitro субстрата полученным ранее препаратом SegC. Результаты анализа (рис. 8) свидетельствуют, что сайт-специфическая нуклеазная активность, соответствующая активности эндонуклеазы SegC in vitro, наблюдалась только в экстрактах Т4-инфицированных клеток, тогда как отсутствовала в клетках, зараженных фагом с мутацией в гене segC. Эти данные свидетельствуют о том, что ген segC экспрессируется в ходе Т4-инфекции.

Рис. 8. Активность эндонуклеазы SegC в экстрактах клеток Е. coli, инфицированных фагом Т4.

1,5 мкг ПЦР-фрагмента ДНК фага T2L (1), полученного с парой праймеров 1-2 (рис. 1), инкубировали с 1 ми-экстракта клеток Е. coli BL21, инфицированных фагом Т4 (3) либо T4segC& (4), в стандартных условиях в течение 60 мин при 25°С. Продукты реакции разделяли электрофоретически в 5% ПААГ. В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК, образуемые при гидролизе этого фрагмента очищенным препаратом SegC (2).

Данные об экспрессии гена segC в ходе Т4-инфекции, а также о способности SegC гидролизовать модифицированную ДНК Т-четных фагов создали предпосылки для изучения характера наследования segC в скрещиваниях Т4 и T2L. При скрещивании T2L с Т4 дикого типа (таблица 1) около 99% потомства содержало ген segC, тогда как мутация в этом гене (скрещивание T4segCA и T2L) проявлялась в снижении его доли в потомстве до 72% (данные не приведены). Очевидно, что ген segC преимущественно наследуется в потомстве скрещивания Т4 и T2L. Снижение доли segC в потомстве скрещивания TAsegCA и T2L до 72%, а не до ожидаемых 50% (соответствует соотношению родителей в скрещивании) может быть объяснено исключением маркеров, описанным для этих фагов. Известно, что потомство скрещивания Т4 и T2L наследует преимущественно генетические детерминанты Т4. Некоторые маркеры T2L практически полностью исчезают в потомстве, доля маркеров T2L, наследуемых с максимальной эффективностью, не превышает -30%. Это согласуется с характером наследования мутантного гена segC. Чтобы полностью исключить влияние множественного воздействия детерминант Т4 на T2L, наследование гена segC было проанализировано в модельных скрещиваниях, в которых фаг T2L был заменен на Т42. Характер наследования segC в таких скрещиваниях был таким же, как и для Т4 х T2L, а именно, почти 100% потомства содержало ген segC. В случае же смешанной инфекции фагами TAsegCA и Т42, доля гена segC в потомстве незначительно отклонялась от 50% (табл. 1).

Поскольку гибридизационный анализ, который мы использовали для оценки доли segC в потомстве, не позволял нам отслеживать T2L маркер, мы проанализировали 48 негативных колоний фагов при помощи ПЦР с праймерами 1 и 2 к области генов 5-6. В 47 случаях синтезировался фрагмент ДНК, соответствующий Т4, и только в 1 случае - T2L (данные не приводятся).

13

Ни в одном из проанализированных вариантов не наблюдался синтез одновременно двух фрагментов ДНК, соответствовавших как 'Г4 так и Т2Ь, что подтверждает исключение маркера Т2Ь в потомстве скрещивания Т4 и Т2Ь.

Табл. 1. Наследование гена потомством скрещиваиня фагов Т4 н Т2

Скрещивания Доля потомства, гибридизующегося с ДНК-зондом к гену segC, %

Т4 х T2L > 99.5 ± 0.4

Т4 х Т42 > 99.5 ± 0.4

T4segCA х Т42 60.3 + 4.4

Соотношение родительских фагов составляло 1:1. Представлены данные 4-х независимых экспериментов ± стандартное отклоиеше.

Для того, чтобы оценить, не отражается ли эффективное внесение разрыва в ДНК одного из фагов при скрещивании на его выход, мы проследили наследование гена 14, удаленного от точки разрыва на ~7 т.п.н. Предварительно мы убедились, что в отсутствие предпочтительного разрыва в одном из родителей шпбег-мутация в гене 14 наследуется пропорционально доле родительских фагов (табл. 2, скрещивание Т4а/яВ20 х Т4segC). Как показал анализ, в скрещиваниях Т4а/яВ20 и Т42 доля потомства, содержащего amber-мутацию, также не увеличивалась и сохранялась на уровне 50% (табл. 2). Таким образом можно заключить, что при скрещивании Т4 с T2L эндонуклеаза SegC инициирует нереципрокный генетический обмен в области генов 5-6, сопровождающийся хомингом собственного гена.

Табл. 2. Наследование гена 14 потомством скрещивапия фагов Т4а/пВ20 и Т42

Скрещивапия Доля потомства, не содержащая атЬег-мутацию, %

Т4атВ20 х T4segCA 55.9 ±3.6

T4amB20 х Т42* 47.4 ±5.2

Соотношение родительских фагов составляло 1:1. Представлены данные 5-ти независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Доля потомства дикого типа рассчитана как отношение разности титров фагов на пермиссивном (В40) и непермессивном (ВЕ) штаммах Е. coli к титру на пермиссивном штамме (В40).

*- характер наследования гена segC в данном скрещивании был таким же, как и в случае скрещивания Т4 и Т42 (данные не приведены).

II. РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ И АНАЛИЗ SegC-ИНИЦИИРУЕМОЙ РЕКОМБИНАЦИИ В г//-Л ОКУ CE Т4

Создание модели рекомбинации, основанной на внесении SegC сайт-специфического двунитевого разрыва в rll-локус. Для создания модели рекомбинации с детерминированной точкой ДНР были получены фаги Т4 etsl и Т4 insZ. Фаг Т4 etsl является производным T4segCA, который в начале гена rllB (2298 п.н. от начала г II А или 108 п.н. от начала гена rlIB) содержит фрагмент ДНК размером 66 п.н. из области генов 5-6 фага T2L с сайтом гидролиза SegC [назван endonuclease /argct sequence (ete)]. Фаг T4 insZ отличается от Т4 els J тем, что он вместо eis содержит в том же положении фрагмент гена lacZ такого же размера [нейтральная вставка insZ, 66 п.н.]. Обе вставки, etsl и insZ, имеют г/У-фенотигг. Для проверки рекомбиногенной активности системы segC/etsl, фаги Т4 etsl и Т4 insZ были скрещены на различном íígC-фоне с двойными гЯ-мутантами атН72 Ь25 и с одиночными мутантами атН72 и Ь25 (схема расположения мутаций приведена на рис. 9).

-350 1093 1546 1951 2001 2143 2195 2229 2265 2298 2380 2751 =3060 N35 а2 N23 атНВ129 106 N21 А'504 Х511 375 еЫ ос31 N12 Ь26 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 аб атН72 аЗ UV200 атНВ84 С6 490 UV375 UV357 N24 FC47 N17 Ь25 «200 466 1140 1871 2000 2048 2168 2220 2248 2286 2317 2559 2901

^ ген rlIA_^^_ген rllB_^

Рис. 9. Схема расположения /■//-мутаций, использованных в этой работе.

Указаны положения мутаций (п.н.) от начала гена rlIA.

Фаговое потомство высевали на штаммы Е. coli ВВ и 594(Х) для определения общего потомства и рекомбинантов дикого типа, соответственно. Как свидетельствуют результаты (таблица 3), во всех случаях, когда внесение ДНР не ожидалось ввиду отсутствия эндонуклеазы SegC или ее сайта расщепления, или и того и другого, наблюдались низкие частоты рекомбинантов. Однако в тех случаях, когда ожидались ДНР, частоты рекомбинантов существенно возрастали: >10 раз в двухфакторных скрещиваниях и в -70 раз в трехфакторных. Поскольку ДНР в etsl значительно повышает частоты одиночных обменов слева и справа от etsl ( см. скрещивания

Н72 x etsl и etsl x Ь25) вероятность их совпадения также возрастает. Действительно, после коррекции наблюдаемых частот двойных обменов на вероятность совпадения двух рекомбинационных событий (табл. 3), эффект увеличения частоты рекомбинантрв при ДНР в трехфакторных скрещиваниях становится более чем 200-кратным.

Для проверки эффективности расщепления etsl, Т4 дикого типа (w/) скрестили на К coli ВВ с Т4 etsl или Т4 insZ с множественностью инфекции 5 для каждого родителя. Фаговое потомство высевали на К coli В, на котором бляшки r-типа и дикого типа различаются. В скрещиваниях etsl х wt г-бляшки составляли <3% общего потомства (2,52 ± 0,31 % для 4-х независимых определений). Проверка нескольких случайно выбранных r-бляшек показала,

Табл. 3. Частоты г/Т^-рекомбипаитов в скрещиваниях г//-мутаптов на различном it'gC-фоне

Скрещивание Частоты рекомбинантов (R ± SD)', % Отношение segC*/segC (Я + Д), % Отношение segC^lsegC

segC segC sezC* segCT

Н72 Ь25 х etsl 14,1 ±0,2 0Д0 ± 0,04 70,5 25,0 0,11 227,3

Н72 Ъ25 х insZ 0,14 ±0,01 0,24 ±0,05 0,58 0,10 0,15 0,67

Ь25 х etsl 21,8 ±1,8 1,60 ±0,14 13,6

Ь25 х insZ 0,79 ±0,07 1,61 ±0,11 0,49

Н72 х etsl 43,0 ±3,3 3,90 ±0,38 11,0

Н72 х insZ 3,77 ±0,22 4,02 ±0,31 0,94

segC* - один из партнеров несет аллель ¡е^ дикого типа. segC - оба партнера содержат мутантный аллель segC.

Л + А это частота рекомбикантов /?, скорректированная на случайное совпадение двух независимых рекомбинационных событий, как объяснено в материалах и методах. 'Приведено среднее значение из четырех определений ± стандартное отклонение.

что они генетически и функционально являются они не рекомбинировали с оригинальной и проявляли высокую рекомбинационную активность с другими /-//-мутантами. Таким образом, ~5 % etsl аллелей выживали, но поскольку е£у/ имеет г//-фенотип, ее неполное расщепление не препятствовало рекомбинационному анализу. В скрещиваниях х доля бляшек с г-фенотипом составляла примерно половину от общего потомства (0,47 ± 0,06 для 3-х независимых определений).

Можно заключить, что созданная модель позволяет проводить исследование рекомбинации, инициируемой ДНР.

Зависимость ДНР-инициируемой рекомбинации от расстояния. Для

анализа зависимости частоты рекомбинации от расстояния была проведена серия скрещиваний: FC47 * /, etsl * i и amNl 16 etsl * i (см. рис. 10). Маркеры i (rlIB и rlIA точковые мутации, расположенные слева от etsl, все фаги с мутацией - segC*) были одинаковыми во всех трех сериях. Серии FC47 х /' (рис. 10А) демонстрируют зависимость от расстояния, характерную для «обычной» рекомбинации (в отсутствие etsl) между /-//-мутантами в той же самой области хромосомы, где планируется наблюдать ДНР-индуцируемую рекомбинацию. В этих скрещиваниях наблюдается двухфазная зависимость частоты от расстояния, характерная для рекомбинации, проходящей через образование пэтчей и сплайсов (от англ. patch и splice, см. ниже и рис. 11). Точка пересечения прямых 1 и 2 (-700 п.н.) соответствует средней длине пэтча. Разрыв на прямой 1 соответствует границе между генами rlIA и rlIB. В межгенных скрещиваниях определенный вклад в измеряемую величину рекомбинантов rit вносят концевые гетерозиготы.

Рис 10. Зависимость частоты г//*-рекомбинантов от расстояния в

двухфакгорных скрещиваниях РС47 х / (А) и е£$/ * / (В), и в трехфакгорных скрещиваниях атЫПб х / (С). Приведены данные из Таблицы 5. Фазы зависимости отмечены на графиках цифрами. Соответствующие линии регрессии получены методом наименьших квадратов.

В серии скрещиваний ей/ х I наблюдаются четыре фазы зависимости частоты от расстояния (рис 2В). Первая фаза, расстояние от 0 до -90 п.н., демонстрирует быстрое увеличение частоты при увеличении расстояния от точки разрыва. Затем, на отрезке до -350 п.н. частота сохраняется постоянной примерно на уровне 25% (вторая фаза, «промежуточное плато»). В третьей фазе частоты вновь начинают увеличиваться, достигая величины -44% на расстоянии >1000 п.н. Дальнейшее увеличение расстояния до 2100 п.н.

0 500 1000 1500 2000 0 500 1000 1500 2000 Расстояние, п.н.

0 500 1000 1SOO 2000

приводит только к незначительному увеличению частоты (четвертая фаза, «финальное плато»).

Удовлетворительная интерпретация обнаруженной зависимости частоты рекомбинации от расстояния может быть получена в рамках модели SPC (рис. 11). Фаза 1 отражает процесс З'-резекции. Чем ближе аллель С находится к ДНР, тем выше вероятность того, что он будет удален 3'—>5'-экзонуклсазой ДНК-полимеразы и таким образом попадет в зону 1, т.е. тем ниже вероятность образования рекомбинанта.

На участке 90-350 п.н. от ДНР частоты рекомбинации практически не зависят от расстояния, давая промежуточное плато при частоте рекомбинантов в двухфакторных скрещиваниях около 25%, в хорошем соответствии с предсказаниями модели для зоны 2. Эта зона соответствует области однонитевой миграции ветви (одна рекомбинантная нить из четырех дочерних нитей ДНК). Таким образом, минимальная длина 5'-нити, удаляемой 5'—>3'-экзонуклеазой (5'-резекции), равна около 350 п.о. Последующая переходная фаза может отражать распределение длины 5'-резекции.

Конечное плато в частотах рекомбинации (около 45%), обнаруживаемое в двухфакторных скрещиваниях, предположительно соответствует зонам 3 и 4. Переход от однонитевой к двунитевой миграции ветви хорошо объясняет эту фазу. Переход к двунитевой миграции означает образование чстырехнитевого комплекса (структуры Холлидея), разрешение которого дает две родительские и две рекомбинантные нити как в гетеродуплексной области (зона 3), так и за пределами гетеродуплексной области (в зоне 4).

Зависимость частоты рекомбинантов, возникающих за счет двойных

обменов, от расстояния была исследована в трехфакторных скрещиваниях

amNllô etsl * i (рис. 2С). Удаленный от etsl маркер amNl 16 представляет

собой ятябег-мутацию в гене 39 (кодирует субъединицу топоизомеразы II),

расположенную на расстоянии >4000 п.н. слева от etsl. В этих скрещиваниях

рекомбинанты возникают только за счет двойных обменов. Таким образом,

можно измерять частоты рекомбинантов, образуемых за счет пэтчей. Первые

три фазы зависимости частоты от расстояния в данной серии скрещиваний

подобны тем, что наблюдаются в двухфакторной серии, и имеют те же

границы: 0 - -90 п.н., ~90 - 350 п.н. и 350 - 750 п.н., соответственно. Затем

частоты рекомбинантов падают, и для наиболее удаленных от etsl /-маркеров

аЗ, а2 и N35 они ниже, чем для расположенных на более близком расстоянии.

Согласно SPC-модели, ожидаемые частоты в трехфакторных скрещиваниях для

18

фаз 1 - 3 должны быть в ~2 раза меньше, чем в 2-х факторных. Тем не менее, полученные частоты рекомбинантов существенно ниже. Чем это может быть

etsl

I SegC endonuclease + 5'-eionuclease

1 joint formation (gp32, uvsY, UvsX)

N_

^ ss-brancb migration (gp59, gp41) ±1_

7е

| З'-exonuclease (gp43)

„ V.

"s_1

I ds-branch migration (UvsW)

_________ V-

Л_r

1 DNA synthesis (replisome) and junction resolution (gp49)

I.I I i

1

z4 | z3 | z2 zl zl z2 | z3 z4

Рис. 11. ЯРС-модель репарации ДНР у бактериофага Т4. Полые линии обозначают цепи ДНК фага Т4 е1$1 (¡е%СА), вставка егя! обозначена тонкими линиями; сплошные линии обозначают цепи ДНК фага Т4 яе^С*. З'-ОН концы цепей ДНК обозначены стрелками. Вертикальными столбиками отмечено положение вставки ей/. В зависимости от способа разрешения 2-х структур Холлидея возможно образование 4-х вариантов рекомбинантов. (приведен только один). Вертикальными линиями разделены различные зоны (г) в потомстве хромосом: г\ соответствует области, удаляемой 3'—>5' экзонуклеазой ДНК-полимеразы (отсутствие рекомбинантов); г2 соответствует участку ДНК, удаляемому 5'—»3' экзонуклеазой (за вычетом г\) (25% рекомбинантов); 73 определяется длиной двухцепочечной миграции ветви (50% рекомбинантов); тА является областью, фланкирующей границы последовательностей ДНК, вовлеченных в ДНР-инициируемый процессинг (50% рекомбинантов).

обусловлено? В данной экспериментальной модели очень высоки частоты рекомбинантов, в том числе возникающих в результате двойных обменов. Это предполагает существенный вклад множественных независимых рекомбинационных событий в наблюдаемые частоты. Действительно, после коррекции на совпадение 2-х независимых событий, частоты рекомбинантов близки к предсказаниям SPC-модели (диссертация, таблица 5).

Сравнение рекомбинации справа и слева от ДНР. Для того, чтобы сравнить рекомбинацию слева и справа от etsl были выполнены симметричные серии скрещиваний amNI 16 etsl * i и атН17 etsl х /, в которых маркер i располагался слева или справа от etsl, соответственно. Маркер атН17 представляет собой ятйег-мутацию в гене 52 (кодирует субъединицу топоизомеразы II), расположенную >4000 п.н. справа от etsl. Пары левых и правых /-маркеров выбирались приблизительно на одинаковых расстояниях от etsl. Фаговый урожай высевали на штамм Е. coli CR63 для определения общего титра потомства. Для определения титра рекомбинантов фаги высевали на штаммы Е. coli CR63(^,) и 594(^). На штамме CR63(A.h) amber-мутации amNI 16 и атН17 супрессируются, и, скрещивания фактически становятся двухфакторными. Как видно из данных, представленных на рисунке 12, серии частот слева и справа от etsl проявляли сходную зависимость от расстояния, как в двухфакторных (рис. IIA), так и в трехфакторных скрещиваниях (рис. 11В). Таким образом, левая и правая половины разорванной молекулы имеют примерно равные возможности инициировать рекомбинацию.

Расстояние, п.н.

Рис. 12. Сравнение рекомбинации слева и справа от двухцепочечного разрыва в двухфакторных (А) и трехфакторных (В) скрещиваниях. Приведены данные из таблицы 6 (см. диссертацию).

выводы

1. Определена структура области генов 5-6 фага T2L. В сравнении с Т4, у данного фага отсутствует ген segC, при этом гомология фланкирующих последовательностей составляет -98%.

2. Показано, что SegC является сайт-специфической эндонуклеазой. Фермент гидролизует ДНК с образованием З'-выступающих концов длиной два и.о. SegC сохраняет специфичность при гидролизе природной ДНК Т-четных фагов, содержащих гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина.

3. Сайт гидролиза SegC в области генов 5-6 фага T2L совпадает с сайтом инсерции собственной ОРС. При этом, SegC не способен эффективно гидролизовать in vitro ДНК Т4 вблизи собственного гена.

4. В скрещиваниях Т4 и T2L экспрессия гена segC обуславливает нереципрокный генетический обмен между этими фагами в области генов 5-6, что сопровождается хомингом гена segC.

5. На основе эндонуклеазы SegC и ее сайта гидролиза создана и апробирована модель для изучения рекомбинации, стимулируемой двунитевыми разрывами.

6. Определены частоты рекомбинации на участке до -2100 п.н. от точки разрыва. В двухфакторных скрещиваниях продемонстрировано наличие 4-х фаз рекомбинации. Установлено, что оба конца разорванной молекулы ДНК с близкой эффективностью способны инициировать рекомбинацию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В. П. Щербаков, С. Т. Сизова, Т.С. Щербакова, И. Э. Грановский. К. Ю. Попадьин. Измерение in vivo точности репарации двунитевых разрывов ДНК у бактериофага Т4. Генетика, 2008, Том 44, №9, стр. 1178-1183.

2. Shcherbakov V.P., Shcherbakova Т., Plugina L., Sizova S., Kudryashova E., Granovskv I. Genetic recombination induced by DNA double-strand break in bacteriophage T4: Nature of the left/right bias. DNA Repair (Amst). 2008, Jun, 1;7(6):890-901.

3. Shcherbakov, Victor, Igor Granovsky, Lidiya Plugina, Tamara Shcherbakova, Svetlana Sizova, Konstantin Pyatkov, Michael Shlyapnikov and Olga Shubina. Focused genetic recombination of bacteriophage T4 initiated by double-strand breaks. Genetics, 2002 Vol. 162 (2) pp. 543-556.

4. Victor Shcherbakov, Igor Granovskv. Lidiya Plugina, Tamara Shcherbakova, Svetlana Sizova. The pattern of DNA recombination during repair of site-specific double-stranded breaks in normal T4 infection as evidenced from recombinational data. 2001 Evergreen International Phage Biology Meeting. Evergreen State College, Olympia, WA., August 8-13, p. 36

5. Igor E. Granovskv, Farid A. Kadyrov, Konstantin I. Pyatkov, Michael G. Shlyapnikov, Vladimir A. Ivanov and Valentin M. Kryukov. Role of the T4 segC gene in genetic exchange between T-even bacteriophages. Molecular Genctics of bacteria & phages. Cold Spiring Harbor, New York, August 25-August 30, 1998, p. 14

6. Igor E. Granovskv. Farid A. Kadyrov, Konstantin I. Pyatkov, Michael G. Shlyapnikov, Vladimir A. Ivanov and Valentin M. Kryukov. Genetic exchange between T4 and T2 requiring a site-specific endonuclease encoded by the T4 segC gene. 12th Evergreen International Phage Biology Meeting. Evergreen State College, Olympia, WA., July 16-20, 1998, p. 2

| &т7. Грановский И. Э., Кадыров Ф.А., Пятков К.И., Шляпников М.Г., Крюков В.М, Иванов В.А. Эпдонуклеаза SegC фага Т4 и ее участие в генетическом обмене между бактериофагами Т4 и Т2. III Пущинская конференция молодых ученых. Пущино, апрель 27 - 30,1998 г., стр. 50.

Подписано в печать:

19.12.2008

Заказ № 1427 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грановский, Игорь Эдуардович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Семейство Т-четные бактериофаги.

1.1.1. Классификация бактериофагов Т4-типа.8'

1.1.2. Классические Т-четные бактериофаги.

1.1.3. Явление частичного исключения маркеров у Т-четных фагов.

1.2. Бактериофаг Т4.

1.2.1. Особенности структуры и развития бактериофага Т4.

1.2.2. Рекомбинация у бактериофага Т4. SPC-модель рекомбинации.

1.3. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов.

1.3.1. Общая характеристика хоминг-эндонуклеаз.

1.3.2. Характеристика отдельных семейств хоминг-эндонуклеаз.

1.3.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4.

1.3.4. Молекулярные механизмы хоминга.'.

1.3.5. Использование хоминг-эндонуклеаз в научных и практических целях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2. Материалы.

2.1.1. Среды, основные буферы и растворы.

2.1.2. Материалы и реактивы.

2.1.3. Штаммы бактерий и бактериофаги.

2.1.4. Олигонуклеотиды.

2.1.5. Плазмидные вектора.

2.3. Методы исследования.

2.2.1. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация.

2.2.2. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации.

2.2.3. Получение Т-четных бактериофагов.~.

2.2.4. Получение фага ?i.CE6.

2.2.5. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным центрифугированием в градиенте CsCl.

2.1.6. Получение геномной ДНК бактериофагов и бактерий.

2.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК.

2.2.8. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК.

2.2.9. Анализ рекомбинантных клонов.

2.2.10. Электрофорез ДНК.

2.2.11. ДНК-ДНК гибридизация (по Саузерну).

2.2.12. Электрофорез белков и определение концентрации белка.

2.2.13. Экспрессия гена segC и получение препарата белка SegC.

2.2.14. Получение экстрактов клеток Е. coli, инфицированных фагом Т4.

2.2.15. Определение эндонуклеазной активности SegC.

2.2.16. Определение точек расщепления SegC.

2.2.17. Получение рекомбинатных бактериофагов.

2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЕН segC ФАГА Т4 КОДИРУЕТ ХОМИНГ-ЭНДОНУКЛЕАЗУ.

3.1. Анализ области генов 5 - 6 у Т-четных бактериофагов.

3.2. Ген segC кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу.

3.3. Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС.

3.4. SegC активен на модифицированной ДНК Т-четных фагов.

3.5. Эндонуклеаза SegC инициирует хоминг собственного гена при скрещивании Т4 и T2L.

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ И АНАЛИЗ SegC-ИНИЦИИРУЕМОЙ РЕКОМБИНАЦИИ В rll- ЛОКУСЕ Т4.

3.6. Создание модели рекомбинации, основанной на внесении SegC сайт-специфического двунитевого разрыва в гЯ-локус.

3.7. Зависимость ДНР-инициируемой рекомбинации от расстояния.

3.8. Сравнение рекомбинации справа и слева от ДНР.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Ген segC фага Т4 кодирует хоминг-эндонуклеазу.

SegC-инициируемая рекомбинация в rll-локусе Т4.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие хоминг-эндонуклеазы SegC бактериофага Т4 в генетической рекомбинации у Т-четных бактериофагов"

Хоминг-эндонуклеазы являются особым классом сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз. Первоначально, открытые рамки считывания (ОРС) хоминг-эндонуклеаз были обнаружены в митохондриальных геномах дрожжей в составе мобильных интронов группы I, которые способны перемещаться в безинтронный аллель (явление получило название хоминг, от англ. homing — возвращение домой). Как оказалось, мобильность интронов группы I обусловлена кодируемыми ими сайт-специфическими эндонуклеазами, которые способны дифференцированно узнавать безинтронный аллель и вносить в него разрыв. Репарация поврежденной» молекулы осуществляется по интактной ДНК интрон-содержащего аллеля, что приводит к генной конверсии - замещению безинтронного аллеля интрон-содержащим. В настоящее время известно, что, в дополнение к интронам, хоминг-эндонуклеазы также кодируются интеинами и свободностоящими генами, и распространены- во всех биологических царствах.

Интерес к хоминг-эндонуклеазам обусловлен их структурно-функциональными особенностями. Отличительной чертой хоминг-эндонуклеаз является способность узнавать протяженные (от 12 до 40 п.н.) вырожденные последовательности за счет г' образования большого числа специфических и неспецифических контактов с ДНК по всей длине сайта узнавания. Как следствие, практически каждая, хоминг-эндонуклеаза узнает уникальную последовательность ДНК. Структурные и биохимические исследования этих ферментов не только расширяют границы наших представлений о природе ДНК-белковых взаимодействий, но и служат основой для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Не менее интересны хоминг-эндонуклеазы с точки зрения познания эволюционных механизмов. Как правило, эти ферменты с высокой эффективностью инициируют генетический обмен между близкородственными видами, и, таким образом, участвуют в горизонтальном переносе генетической информации. Бактериофаги, в частности Т-четные, являются удобной моделью для изучения роли хоминг-эндонуклеаз в эволюции. Так, сравнительно небольшой геном фага Т4 (около 169 т.п.н.) содержит, по меньшей мере, 14 генов хоминг-эндонуклеаз, тогда как в родственных ему Т-четных фагах они встречаются редко. Считается, что хоминг-эндонуклеазы ответственны за так называемое явление исключения маркеров — преимущественное наследование маркеров Т4 при скрещивании фагов Т4 и Т2. При этом потомство, унаследовавшее маркеры Т2, является практически полностью рекомбинантным. По-видимому, хоминг-эндонуклеазы могут являться существенным фактором эволюции фагов.

Хоминг-эндонуклеазы могут выступать в роли не только объекта, но и инструмента исследований. В частности, они могут использоваться для изучения механизмов репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. ДНР в ДНК могут возникать случайно под действием повреждающих агентов, а также программироваться клеткой (например, при перестройке иммуноглобулиновых генов, переключении1 типа спаривания: у дрожжей, хоминге, мейотической рекомбинации). Неспособность репарировать ДНР'приводит к нестабильности генома или гибели клетки. Основной путь репарации ДНР основывается на гомологичной рекомбинации. В классической молекулярной генетике исследования рекомбинации базировались на анализе совокупности случайных рекомбинационных событий. Использование модельной системы с детерминированной точкой ДНР в ДНК значительно упрощает анализ и интерпретацию результатов генетических экспериментов. Использование хоминг-эндонуклеаз позволяет создать такую систему за счет способности этих ферментов узнавать протяженные редко встречаемые последовательности ДНК.

Бактериофаг Т4 представляет собой удобную модель, для изучения, рекомбинации. Т4, классический объект молекулярной биологии и генетики; является одним из наиболее изученных организмов. У этого фага имеется собственный репликационный ■ и рекомбинационный аппарат, который охарактеризован,биохимически. В высокой степени развита генетика. Т4. Кроме того, Т4 имеет собственные хоминг-эндонуклеазы, а значит его геном адаптирован к их действию.

Цели и задачи исследования.

Основная цель данной работы заключалась в изучении способности эндонуклеазы 8е§С инициировать, генетический обмен между Т-четными. бактериофагами, а также в разработке на основе эндонуклеазы 8е§С экспериментальной модели для. изучения механизмов репарации двунитевого разрыва у фага Т4.

В соответствии с целью работы были поставлены'следующие задачи:

1. Проанализировать область генов 5-6 у Т-четных бактериофагов с целью поиска сайта гидролиза 8е§С;

2. Получить препарат 8е§С и охарактеризовать его нуклеазную активность;

3. Локализовать предпочтительный сайт гидролиза SegC;

4. Изучить, способность 8е§С инициировать генетический обмен между Т-четными бактериофагами в области генов 5-6;

5. Создать на основе эндонуклеазы SegC и системы генетического анализа рекомбинации в rll-локусе Т4 модель для изучения рекомбинации, инициируемой ДНР;

6. Проанализировать в модельной системе зависимость частоты рекомбинации. от расстояния от ДНР; сравнить рекомбинацию слева и справа от ДЫР:

Научная новизна работы.

В данной работе описана новая сайт-специфическая эндонуклеаза SegC, относящаяся к GIY-YIG-семейству хоминг-эндонуклеаз. Фермент способен гидролизовать как ^модифицированную ДНК, так и природную ДНК Т-четных фагов, содержащую гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина. Предпочтительный сайт гидролиза SegC обнаружен в области генов 5 — 6 фага T2L, в котором отсутствует ген segC. Показано, что SegC расщепляет ДНК T2L непосредственно в сайте инсерции собственного гена, что ранее считалось особенностью, присущей исключительно интрон-кодируемым эндонуклеазам. Установлено, что SegC в скрещиваниях Т4 и T2L инициирует генетический обмен между этими фагами в области генов 5-6, что сопровождается генной конверсией в этой области - замещением безнуклеазного аллеля T2L на jegC-содержащий аллель Т4. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что именно хоминг-эндонуклеазы ответственны за явление исключения1 маркеров, наблюдаемое в скрещиваниях Т4 и T2L.

Создана модельная система для изучения рекомбинации, инициируемой- ДНР в rll-локусе фага Т4. Положение разрыва определяется эндонуклеазой SegC, сайт которой-помещен в начало гена rllB. Анализ рекомбинации слева и справа от точки разрыва показал равную и симметричную инициацию рекомбинации каждым концом разорванной хромосомы. Исследована зависимость частоты рекомбинации от расстояния на участке, расположенном на расстоянии 12 - 2100 п.н. от ДНР в сериях двух- и трехфакторных скрещиваний. Полученные результаты подтверждают основные предсказания SPC (splice/patch coupling) модели рекомбинации. Научно-практическая ценность.

Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти практическое применение. Описанная в данном исследовании эндонуклеаза SegC может быть использована для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Разработанная модель рекомбинации в rll-локусе может использоваться для изучения механизмов репарации ДНР.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Грановский, Игорь Эдуардович

ВЫВОДЫ

1. Определена структура области генов 5 — 6 фага T2L. В сравнении с Т4, у данного фага отсутствует ген segC, при этом гомология фланкирующих последовательностей составляет ~98%.

2. Показано, что SegC является сайт-специфической эндонуклеазой. Фермент гидролизует ДНК с образованием 3'-выступающих концов длиной два н.о. SegC сохраняет специфичность при гидролизе природной ДНК Т-четных фагов, содержащих гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина.

3. Сайт гидролиза SegC в области генов 5-6 фага T2L совпадает с сайтом инсерции собственной ОРС. При этом, SegC не способен эффективно гидролизовать in vitro ДНК Т4 вблизи собственного гена.

4. В скрещиваниях Т4 и T2L экспрессия гена segC обуславливает нереципрокный генетический обмен между этими фагами в области генов 5 — 6, что сопровождается хомингом гена segC.

5. На основе эндонуклеазы SegC и ее сайта гидролиза создана и апробирована модель для изучения рекомбинации, стимулируемой двунитевыми разрывами.

6. Определены частоты рекомбинации на участке до —2100 п.н. от точки разрыва. В двухфакторных скрещиваниях продемонстрировано наличие 4-х фаз рекомбинации. Установлено, что оба конца разорванной молекулы ДНК с близкой эффективностью способны инициировать рекомбинацию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грановский, Игорь Эдуардович, Пущино

1. Ackermann, H.-W. and Krisch, H.M. (1997) A catalogue of T4-type bacteriophages. Arch. Virol., 1997. 142, 2329-45.

2. Argast, G.M., Stephens, K.M., Emond, M.J. and Monnat, R.J.Jr. (1998) I-Ppol and I-Crel homing site sequence degeneracy determined by random mutagenesis and sequential in vitro enrichment. J. Mol. Biol., 280, 345-53.

3. Asselbergs, F.A. and Rival, S. (1996) Creation of a novel, versatile multiple cloning site cut by four rare-cutting homing endonucleases. Biotechniques, 20, 558-62.

4. Belfort, M. (1990) Phage T4 introns: self-splicing and mobility. Annual Review of Genetics, 24, 363-85.

5. Belfort, M. and Perlman, P.S. (1995) Mechanisms of intron mobility. J Biol Chem., 270, 30237-40.

6. Belfort, M. and Roberts, R. (1997) Homing endonucleases: keeping the house . in order. Nucleic Acids Res., 25, 3379-88.

7. Belle, A., Landthaler, M. and Shub, D.A. (2002) Intronless homing: site-specific endonuclease SegF of bacteriophage T4 mediates localized marker exclusion analogous to homing endonucleases of group I introns. Genes Dev., 16, 351-62.

8. Bell-Pedersen, D., Quirk, S.M., Aubrey, M. and Belfort, M. (1989) A site-specific endonuclease and co-conversion of flanking exons associated with the mobile td intron of phage T4. Gene, 82, 119-26.

9. Bell-Pedersen, D., Quirk, S.M., Bryk, M. and Belfort, M. (1991) I-TevI, the endonuclease encoded by the mobile td intron, recognizes binding and cleavage domains on its DNA target. Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 7719-23.

10. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J.K. and Carroll, D. (2003) Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science, 300, 764.

11. Bibikova, M., Carroll, D., Segal, D.J., Trautman, J.K., Smith, J., Kim, Y.G. and Chandrasegaran S. (2001) Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol. Cell. Biol., 21, 289-97.

12. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K.G. and Carroll, D. (2002) Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics, 161, 1169-75.

13. Bloch, C.A., Rode, C.K., Obreque, V.H. and Mahillon, J. (1996) Purification" of Escherichia coli chromosomal segments without cloning. Biochem. Biophys. Res. Commun., 223, 104-11.

14. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-54.

15. Brenneman, M., Gimble, F.S. and Wilson, J.H. (1996) Stimulation of intrachromosomal homologous recombination in human cells by electroporation with site-specific endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3608-12.

16. Bryk, M., Belisle, M., Mueller, J.E. and Belfort, M. (1995) Selection of a remote cleavage site by I-tevI, the td intron-encoded endonuclease. J. Mol. Biol., 247, 197-210.

17. Bryk, M., Quirk, S.M., Mueller, J.E., Loizos, N., Lawrence, C. and Belfort, M. (1993) The td intron endonuclease I-TevI makes extensive sequence-tolerant contacts across the minor groove of its DNA target. EMBO J., 12, 2141-9.

18. Bujnicki J.M., Radlinska M. and Rychlewski L. (2001) Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed. Trends Biochem. Sci., 26, 9-11.

19. Caprara M. G., and Warning R.B. (2005). In: Belfort M., Derbyshire V., Stoddard B.L. and Wood D.W. (eds). Homing Endonucleases and Inteins. Springer-Verlag, pp. 103-16.

20. Carlson K. and Miller, E.S. (1994). Experiments in T4 genetics. In Karam, J.D. (ed.), Molecular biology of bacteriophage T4. ASM Press, Washington DC, pp. 427-34.

21. Carroll, D. (2004) Using nucleases to stimulate homologous recombination. Methods Mol. Biol., 262,195-207.

22. Chandrasegaran S. and Smith, J. (1999) Chimeric restriction enzymes: what is next? Biol. Chem., 380, 841-8.

23. Chevalier B.S., Kortemme T., Chadsey M.S., Baker D., Monnat R.J. and Stoddard B.L. (2002) Design, activity, and structure of a highly specific artificial endonuclease. Mol Cell, 10, 895-905.

24. Chevalier, B;, Turmel, M., Lemieux, C., Monnat R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (2003) . Flexible DNA target site recognition, by divergent homing endonuclease isoschizomers

25. Crel and I-Msol. J. Mol; Biol:, 329, 253-9.

26. Chevalier, B.S. and Stoddard, B.L. (2001b) Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res.,. 29, 3757-74.

27. Christ, F., Schoettler, S., Wende, W., Steuer, S., Pingoud, A. and-Pingoud, V. (1999) The monomelic homing endonuclease PI-SceI has two catalytic centres for cleavage of the two strands of its DNA substrate. EMBO J., 18, 6908-16. v ;

28. Chu, F.K., Maley, F., Wang, A.M., Pedersen-Lane, J. and Maley, G. (1991) Purification and substrate specificity of a T4 phage intron-encoded endonuclease. Nucleic Acids Research, 19, 6863-9.

29. Cowie, D.B., Avery, R.J. and Champe, S.P. (1971) DNA homology among the T-even bacteriophages. Virology, 45, 30-7.

30. Dalgaard, J.Z., Banerjee, M. and Curcio, M.J. (1996) A novel Tyl-mediated fragmentation method for native and artificial yeast chromosomes reveals that the mouse steel gene is a hotspot for Tyl integration. Genetics, 143, 673-83.

31. Dean, A.B.,'Stanger, M.J., Dänsereau, J.T., Van Roey, P., Derbyshire, V and Beifort, M. (2002) Zinc finger as distance determinant in the flexible linker of intron endonuclease I-TevI: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99, 8554-61.

32. Delbrück, M. (1945) Interference between bacterial viruses, III. The mutual exclusion effect and the depressor effect. J. Bacteriol, 50,151-170.

33. Demerec, M. and Fano, U. (1945) Bacteriophages resistant mutants in E. coli. Genetics, 30, 119.

34. Derbyshire, V., Kowalski, J.C., Dansereau, J.T., Hauer, C.R. and Belfort, M. (1997) Two-domain structure of the td intron-encoded endonuclease I-TevI correlates with the two-domain configuration of the homing site. J. Mol. Biol., 265, 494-506.

35. Desplats, C. and Krisch, H.M. (2003) The diversity and evolution of the T4-type bacteriophages. Res. Microbiol., 154, 259-67.

36. Desplats, C., Dez, C., Tetart, F., Eleaume, H. and Krisch, H.M. (2002) Snapshot of the pseuso T-even phage RB49. J. Bacterid., 184, 2789-804.

37. Dobzhansky, T. (1951) Genetics and the Origin of Species. Third edition. Columbia Univ. Press, New York.

38. Donoho, G., Jasin, M. and Berg, P. (1998) Analysis of gene targeting and intrachromosomal homologous recombination stimulated by genomic double-strand breaks in mouse embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 1998 Jul;18(7):4070-8.

39. Drouin, M., Lucas, P., Otis, C., Lemieux, C. and Turmel, M. (2000) Biochemical characterization of I-Cmoel reveals that this H-N-H homing endonuclease shares functional similarities with H-N-H colicins. Nucleic Acids Res., 28,4566-72.

40. Dujon, B. (1980) Sequence of the intron and flanking exons of the mitochondrial 21S rRNA gene of yeast strains having different alleles at the omega and rib-1 loci. Cell, 20, 185-97.

41. Eddy, S.R. and Gold, L. (1991) The phage T4 nrdB intron: a deletion mutant of a version found in the wild. Genes & Develop., 5, 1032-1041.

42. Edgell, D.R. and Shub, D.A. (2001) Related homing endonucleases I-Bmol and I-TevI use different strategies to cleave homologous recognition sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 7898-903.

43. Edgell, D.R., Belfort, M. and Shub, D.A. (2000) Barriers to intron promiscuity in bacteria. J. Bacteriol., 182, 5281-9.

44. Edgell, D.R,, Stanger, M.J. and Belfort, M. (2003) Importance of a single base pair for discrimination between intron-containing and intronless alleles by endonuclease I-Bmol. Curr. Biol., 13, 973-8.

45. Edgell, D.R., Stanger, M.J. and Belfort, M. (2004) Coincidence of cleavage sites of intron endonuclease I-TevI and critical sequences of the host thymidylate synthase gene. J. Mol. Biol., 343,1231-41.

46. El Hassan, M.A. and Calladine, C.R. (1996) Propeller-twisting of base-pairs and the conformational mobility of dinucleotide steps in DNA. J. Mol. Biol., 259, 95-103.

47. Favre, D. and Viret, J.F. (1996) Versatile cosmid vectors for facilitated analysis and subcloning of the insert. Gene, 178, 43-9.

48. Flick, K.E., Jurica, M.S., Monnat, R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (1998) DNA binding and cleavage by the nuclear intron-encoded homing endonuclease I-Ppol. Nature, 394, 96101.

49. Formosa, T., and B. M. Alberts, (1986a) Purification and characterization of the T4 bacteriophage uvsX protein. J. Biol. Chem., 261, 6107-18.

50. Formosa, T., and B. M. Alberts, (1986b) DNA synthesis dependent on genetic recombination: characterization of a reaction catalyzed by purified T4 proteins. Cell, 47, 793-806.

51. Galburt, E.A., Chevalier, B., Tang, W., Jurica, M.S., Flick, K.E., Monnat, R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (1999) A novel endonuclease mechanism directly visualized for I-Ppol. Nat. Struct. Biol., 6, 1096-9.

52. Galburt E.A. and Jurica M.S. (2005) In: Belfort M., Derbyshire V., Stoddard B.L. and Wood D.W. (eds). Homing Endonucleases and Inteins. Springer-Verlag, 86-102.

53. Gary, T.P., Colowick, N.E. and Mosig, G. (1998) A species barrier between bacteriophages T2 and T4: exclusion, join-copy and join-cut-copy recombination and mutagenesis in the dCTPase genes. Genetics, 148, 1461-73.

54. George, J.W. and Kreuzer, K.N. (1996) Repair of double-strand breaks in bacteriophage T4 by a mechanism that involves extensive DNA replication. Genetics, 143, 1507-20.

55. Gimble, F.S. and Wang, J. (1996) Substrate recognition and induced DNA distortion by the Pl-Scel endonuclease, an enzyme generated by protein splicing. J. Mol. Biol., 263, 163-80.

56. Goodrich-Blair, H. and Shub, D.A. (1996) Beyond homing: competition between intron endonucleases confers a selective advantage on flanking genetic markers. Cell, 84, 21121.

57. Gorbalenya A.E. (1994) Self-splicing group I and group II introns encode homologous (putative) DNA endonucleases of a new family. Protein Sci., 3, 1117-20.

58. Gott, J.M., Zeeh, A., Bell-Pedersen, D., Ehrenman, K., Belfort, M. and Shub, D.A. (1988) Genes within genes: independent expression of phage T4 intron open reading frames and the genes in which they reside. Genes Dev., 2, 1791-9.

59. Griffith, J., and Formosa T. (1985) The uvsX protein of bacteriophage T4 arranges single-strand and double-strand DNA into T4 DNA polymerase and T4 accessory proteins 44/62 and 45. J. Biol. Chem., 260,4484-91.

60. Haber, J.H. (1992) Mating-type gene switching in Saccharomyces cerevisiae. Trends Genet, 8, 446-52.

61. Harris, L.D., and Griffith, J. (1987) Visualization of the homologous pairing of DNA catalyzed by the bacteriophage T4 UvsX protein. J. Biol. Chem., 262, 9285-92-1'

62. Hastings, P.J. (1992) Mechanism and control of recombination in fungi. Mutat. Res., 284, 97-110.

63. He, Z., Crist, M., Yen, H„ Duan, X., Quiocho, F.A. and Gimble, F.S. (1998) Amino acid residues in both the protein splicing and endonuclease domains of the Pl-Scel intein mediate DNA binding. J. Biol. Chem., 273, 4607-15. <

64. Heath J.D., Perkins J.D., Sharma B, and Weinstock G.M. (1992) NotI genomic cleavage map of Escherichia coli K-12 MG1655. J. Bacterid., 174, 558-67.

65. Heath, P.J., Stephens, K.M., Monnat, R.J.Jr. and Stoddard, B.L. (1997) The structure of I-Crel, a group I intron-encoded homing endonuclease. Nat. Struct. Biol., 4, 468-76.

66. Hinton, D. M. and Nossal, N.G. (1986) Cloning of bacteriophage T4 uvsX gene and purification and characterization of the T4 UvsX recombination protein. J. Biol. Chem., 261, 5663-73.

67. Huang Y.J., Parker M.M. and Belfort M. (1999) Role of exonucleolytic degradation in group I intron homing in phage T4. Genetics, 153, 1501-12.

68. Hunter, C.A. (1993) Sequence-dependent DNA structure. The role of base stacking interactions. J Mol Biol., 230,1025-54.

69. Hunter, C.A. (1996) Sequence-dependent DNA structure. Bioessays., 18, 157-62.

70. Jasin, M. (1996) Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases. Trends Genet., 12, 224-8.

71. Johansen, S., Embley, T.M. and Willassen, N.P. (1993) A family of nuclear homing endonucleases. Nucleic Acids Res. 21, 4405.

72. Johnson, R.D. and Jasin, M. (2001) Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem. Soc. Trans., 29, 196-201.

73. Jurica M.S., Monnat J.R., R. J. and Stoddard B.L. (1998). DNA recognition and cleavage by the LAGLIDADG homing endonuclease. I-Crel. Molecular Cell, 2, 469-76.

74. Kadyrov, F.A., Kaliman, A.V. and Kryukov V.M. (1996a) Endonuclease SegE of phage T4. I. Cloning, expression and biochemical characterisation of endonuclease activity. Molecular Biology, 30, 654-660.

75. Kadyrov, F.A., Kaliman, A.V. and Kryukov, V.M. (1996b) Endonuclease SegE of phage T4.II. Recognition site. Molecular Biology, 30, 786-791.

76. Kadyrov, F.A., Shlyapnikov, M.G. and Kryukov, V.M. (1997) A phage T4 site-specific endonuclease, SegE, is resposible for a non-reciprocal genetic exchange between T-even-related phages. FEBS Letters, 415, 75-80.

77. Karles-Kinch, K., George, J.W. and Kreuzer, K.N. (1997) Bacteriophage T4 UvsW protein is a helicase involved in recombination, repair and regulation of DNA replication origins. EMBO J., 16, 4142-51.

78. Kim, J.S. and Davidson, N. (1974) Electron microscope heteroduplex study of sequence relations of T2, T4, and T6 bacteriophage DNAs. Virology, 57, 93-111.

79. Kostriken, R., Strathern, J.N., Klar, A.J., Hicks, J.B. and Heffron, F. (1983) A site-specific endonuclease essential for mating-type switching in Saccharomyces cerevisiae. Cell, 35, 167-74.

80. Kreuzer, K.N. (2000) Recombination-dependent DNA replication in phage T4. Trends in Biochemical Sciences, 25, 165-73.

81. Kuhlmann U.C., Moore G.R., James R., Kleanthous C. and Hemmings A.M. (1999) Structural parsimony in endonuclease active sites: should the number of homing endonuclease families be redefined? FEBS Lett., 463, 1-2.

82. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-5.

83. Lambowitz, A.M. and Belfort, M. (1993) Introns as mobile genetic elements. Annu. Rev. Biochem., 62, 587-622.

84. Lehman, I.R. and Pratt, E.A. (1960) On the structure of the glucosylated hydroxymethylcytosine nucleotides of coliphages T2, T4, and T6. J. Biol. Chem., 235, 3254-9.

85. Lennox, E.C., Levinthal C. and Smith F. (1953) The effect of finite input in reducing recombinant frequency. Genetics, 38, 508-11.

86. Leslie, A.G., Arnott, S., Chandrasekaran, R. and Ratliff, R.L. (1980) Polymorphism of DNA double helices. J. Mol. Biol., 143,49-72.

87. Liang, F., Han, M., Romanienko, P.J. and Jasin, M. (1998) Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5172-7.

88. Liang, F., Romanienko, P.J., Weaver, D.T., Jeggo, P.A. and Jasin, M. (1996) Chromosomal double-strand break repair in Ku80-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8929-33.

89. Lin, Y., Lukacsovich, T. and Waldman, A.S. (1999) Multiple pathways for repair of DNA double-strand breaks in mammalian chromosomes. Mol. Cell Biol., 19, 8353-60.

90. Liu, Q., Belle, A., Shub, D.A., Belfort, M. and Edgell, D.R. (2003) SegG endonuclease promotes marker exclusion and mediates co-conversion from a distant cleavage site. J. Mol. Biol., 334, 13-23.

91. Liu, S.L. and Sanderson, K.E. (1996) Highly plastic chromosomal organization in Salmonella typhi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,10303-8.

92. Loizos, N., Silva, G.H. and Belfort, M. (1996) Intron-encoded endonuclease I-TevII binds across the minor groove and induces two distinct conformational changes in its DNA substrate. J. Mol. Biol., 255,412-24.

93. Luke, K., Radek, A., Liu, X., Campbell, J., Uzan, M., Haselkorn, R. and Kogan, Y. (2002) Microarray analysis of gene expression during bacteriophage T4 infection. Virology, 299,182-91.

94. Mahillon, J., Rode, C.K., Leonard, C. and Bloch, C.A. (1997) New ultrarare restriction site-carrying transposons for bacterial genomics. Gene, 187, 273-9.

95. Malkova, A., Ivanov, E.L. and Haber, J.E. (1996) Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7131-6.

96. McGill, C., Shafer, B. and Strathern, J. (1989) Coconversion of flanking sequences with homothallic switching. Cell, 57, 459-67.

97. Mehta P. Katta K. and Krishnaswamy S. (2004) HNH family subclassification leads to identification of commonality in the His-Me endonuclease superfamily. Protein Sci., 13, 295-300.

98. Michel F. and Dujon B. (1986) Genetic exchanges between bacteriophage T4 and filamentous fungi? Cell, 46, 323.

99. Miller E.S., Kutter E., Mosig G., Arisaka F., Kunisawa T. and Ruger W. (2003) Bacteriophage T4 genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67, 86-156.

100. Mizuuchi, K., Kemper, B., Hays, J. and Weisberg, R.A. (1982) T4 endonuclease VII cleaves Holliday structures. Cell, 29, 357-65.

101. Moore, J.K. and Haber, J.E. (1996) Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand breaks. Nature, 383, 644-6.

102. Mosig, G. (1994) Homologous recombination. Molecular biology of bacteriophage T4 (ed. J.Karam). ASM Press. Washington. DC., p. 54-82.

103. Mosig, G. (1998) Recombination and recombination -dependent DNA replication in bacteriophage T4. Annu. Rev. Genet., 32, 379-413

104. Mosig, G., Gewin, J., Luder, A., Colowick, N. and Vo, D. (2001) Two recombination-dependent DNA replication pathways of bacteriophage T4, and their roles in mutagenesis and horizontal gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A., 98, 8306-11.

105. Moure, C.M., Gimble, F.S. and Quiocho, F.A. (2002) Crystal structure of the intein homing endonuclease Pl-Scel bound to its recognition sequence. Nat. Struct. Biol., 9,764-70.

106. Moure, C.M., Gimble, F.S. and Quiocho, F.A. (2003) The crystal structure of the gene targeting homing endonuclease I-Scel reveals the origins of its target site specificity. J. Mol. Biol., 334, 685-95.

107. Mueller, J.E., Clyman, J., Huang, Y.J., Parker, M.M. and Belfort, M. (1996a) Intron mobility in phage T4 occurs in the context of recombination-dependent DNA replication by way of multiple pathways. Genes Dev., 10,351-64.

108. Mueller J.E., Smith D. and Belfort M. (1996b) Exon coconversion biases accompanying intron homing: battle of the nucleases. Genes Dev., 10, 2158-66.

109. Mueller, J.E., Smith, D., Bryk, M. and Belfort, M. (1995) Intron-encoded endonuclease I-TevI binds as a monomer to effect sequential cleavage via conformational changes in the td homing site. EMBO J., 14, 5724-35

110. Nelson, H.C., Finch, J.T., Luisi, B.F. and Klug, A. (1987) The structure of an oligo(dA)oligo(dT) tract and its biological implications. Nature, 330, 221-6.

111. Nelson, H.H., Sweetser, D.B. and Nickoloff, J.A. (1996) Effects of terminal nonhomology and homology on double-strand-break-induced gene conversion tract directionality. Mol. Cell Biol., 16, 2951-7.

112. Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W. and Rothstein, R.J. (1981) Yeast transformation: a model system for the study of recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6354-8.

113. Orr-Weaver, T.L., Szostak, J.W. and Rothstein, R.J. (1983) Genetic applications of yeast transformation with linear and gapped plasmids. Methods Enzymol., 101, 22845.

114. Paques, F. and Duchateau, P. (2007) Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr. Gene Ther., 7, 49-66.

115. Paques, F., Haber, J.E. (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, 349404.

116. Parker, M.M., Belisle, M. and Belfort, M. (1999) Intron homing with limited exon homology. Illegitimate double-strand-break repair in intron acquisition by phage T4. Genetics, 153,1513-23.

117. Pees E. (1970) Bacteriophage T4 mutants unable to exclude gene 56 of T2 from the progeny of crosses. Mutation Res., 9, 346-8.

118. Pees E. and de Groot B. (1970) Partial exclusion of genes of bacteriophage T2 with T4-glucosylated DNA in crosses with bacteriophage T4. Genetica, 41, 541-50.

119. Pees E. and de Groot B. (1975) Mutants of bacteriophage T4 unable to exclude T2 from the progeny of crosses. Virology, 67, 94-106.

120. Perlman P.S. and Butow R.(1989) Mobile introns and intron-encoded proteins. Science, 246,1106-9.

121. Porteus, M.H. and Baltimore, D. (2003) Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science, 300, 763.

122. Posfai, G., Kolisnychenko, V., Bereczki, Z. and Blattner, F.R. (1999) Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res., 27, 4409-15.

123. Puchta, H., Dujon, B. and Hohn, B. (1996) Two different but related mechanisms are used in plants for the repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5055-60.

124. Pyatkov K.I., Arkhipova I.R., Malkova N.V., Finnegan D.J. and Evgen'ev M.B. (2004) Reverse transcriptase and endonuclease activities encoded by Penelope-like retroelements. Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 14719-24.

125. Quirk, S.M., Bell-Pedersen, D. and Belfort, M. (1989) Intron mobility in the T-even phages: high frequency inheritance of group I introns promoted by intron open reading frames. Cell, 56,455-65.

126. Resnick, M.A. (1976) The repair of double-strand breaks in DNA; a model involving recombination. J Theor Biol., 59, 97-106.

127. Robbins, J.B., Stapleton, M., Stanger, M.J., Smith, D., Dansereau, J.T., Derbyshire, V. and Belfort, M. (2007) Homing endonuclease I-TevIII: dimerization as a means to a double-strand break. Nucleic Acids Res. 35, 1589-600.

128. Rouet, P., Smih, F. and Jasin, M. (1994a) Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6064-8.

129. Rouet, P., Smih, F. and Jasin, M. (1994b) Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol. Cell Biol., 14, 8096-106.

130. Russell, R.L. and Huskey, R.J. (1974) Partial exclusion between T-even bacteriophages: an incipient genetic isolation mechanism. Genetics, 78, 989-1014.

131. Russell, R.L. (1974) Comparative genetics of the T-even bacteriophages. Genetics, 78,967-88.

132. Salinas, F., and Kodadek, T. (1995) Phage T4 homologous strand exchange: a DNA helicase, not the strand transferase, drives polar branch migration. Cell, 82, 111-9.

133. Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

134. Sandegren, L. and Sjoberg, B.M. (2004) Distribution, sequence homology, and homing of group I introns among T-even-like bacteriophages: evidence for recent transfer of old introns. J. Biol. Chem., 279, 22218-27.

135. Segal, D.J. and Carroll, D. (1995) Endonuclease-induced, targeted homologous extrachromosomal recombination in Xenopus oocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 80610. Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3632.

136. Sharma, M. and Hinton, D.M. (1994) Purification and characterization of the SegA protein of bacteriophage T4, an endonuclease related to proteins encoded by group I introns. J. Bacteriol., 176, 6439-48.

137. Sharma, M., Ellis, R.L. and Hinton D.M. (1992) Identification of a family of bacteriophage T4 genes encoding proteins similar to those present in group I introns of fungi and phages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6658-62.

138. Shcherbakov, V.P., Plugina, L.A. and Grebenshchikova, S.M. (1994) Recombination anomaly at the interface between bacteriophage T4 rllA and rllB genes Dok. Akad. Nauk., 334, 669-70.

139. Shcherbakov, V.P., Plugina, L.A. and Nesheva, M.A. (1992) Genetic Recombination in Bacteriophage T4: Single-Burst Analysis of Cosegregants and Evidence! n Favor of a Splice/Patch Coupling Model. Genetics, 131, 769-71.

140. Shen, B.W., Landthaler, M., Shub, D.A. and Stoddard, B.L. (2004) DNA binding and cleavage by the HNH homing endonuclease l-Hmul. J. Mol. Biol., 342, 43-56.

141. Shinohara, A. and T. Ogawa. (1995) Homologous recombination and the roles of double-strand breaks. Trends Biochem. Sci., 20, 387-91.

142. Shub, D.A., Goodrich-Blair, H. and Eddy, S.R. (1994). Amino acid sequence motif of group I intron endonucleases is conserved in open reading frames of group II introns. Trends Biochem Sci., 19, 402-4.

143. Shinedling, S., Singer, B.C., Gayle, M., Pribnow, D., Jarvis, E. et al. (1987) Sequences and studies of bacteriophage T4 r//mutants. J. Mol. Biol., 195,471-80.

144. Singer, B.S., Gold, L., Gauss, P. and Doherty, D.H. (1982) Determination of the amount of homology required for recombination in bacteriophage T4. Cell, 31,25-33.

145. Smih, F., Rouet, P., Romanienko, P.J. and Jasin, M. (1995) Double-strand breaks at the target locus stimulate gene targeting in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res., 23, 5012-9.

146. Snustad, D.P., Haas, N. and Oppenheimer, D.G. (1986) The bacteriophage regulatory protein gp alc/unf binds to DNA in the absense of RNA-polymerase. J. Virol., 60,1145-7.

147. Spiegel P.C., Chevalier B., Sussman D., Turmel M., Lemieux C. and Stoddard B.L. (2006) The structure of I-Ceul homing endonuclease: Evolving asymmetric DNA recognition from a symmetric protein scaffold. Structure, 14, 869-80.

148. Stahl, F.W. (1979) Special sites in generalized recombination. Ann. Rev. Genet., 13, 7-24.

149. Stoddard, B.L. (2005) Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys., 38,49-95.

150. Stohr, B.A. and Kreuzer, K.N. (2002) Coordination of DNA ends during double-strand-break repair in bacteriophage T4. Genetics, 162, 1019-30.

151. Streisinger, G., Edgar, R.S. and Denhardt, G.H. (1964) Chromosome structure in phage T4.1. Circularity of the linkage map. Proc. Natl. Sci. USA, 51, 775-9.

152. Streisinger, G., Emrich, J. and Stahl, M.M. (1967) Chromosome structure in phage T4. III. Terminal redundancy and length determination. Proc. Natl. Sci. USA, 57, 292-5.

153. Streisinger G. and Weigle J. (1956) Properties of bacteriophage T2 and T4 with unusual inheritance. PNAS, 1956, 42, 504-10.

154. Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189, 113-30.

155. Szostac, J.W., Orr-Weaver, T.L., Rothstein, R.J. and Stahl, F.W. (1983) The double strand-break repair model for recombination. Cell, 33,25-35.

156. Teng, S.C., Kim, B. and Gabriel, A. (1996) Retrotransposon reverse-transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. Nature, 383, 641-4.

157. Tetart, F., Desplats, C., Kutateladze ,M., Monod, C., Ackermann, H.W. and Krisch, H.M. (2001) Phylogeny of the major head and tail genes of the wide-ranging T4-type bacteriophages. J Bacteriol., 2001, 183, 358-66.

158. Thaler, D.S., Stahl, M.M. and Stahl, F.W. (1987) Tests of double-strand-break repair model for red-mediated recombination of phage A, and plasmid Xdv. Genetics, 116, 501-15.

159. Toda, T. and Itaya, M. (1995) I-Ceul recognition sites in the rrn operons of the Bacillus subtilis 168 chromosome: inherent landmarks for genome analysis. Microbiology, 141, 1937-45.

160. Toompuu O.G. and Shcherbakov V.P. (1980) Genetic recombination: formal implications of a crossed strand-exchange between two homologous DNA molecules. J. Theor. Biol., 82, 497-520.

161. Turmel, M., Otis, C., Côté, V. and Lemieux, C. (1997) Evolutionarily conserved and functionally important residues in the I-Ceul homing endonuclease. Nucleic Acids Res., 25, 2610-9.

162. Van Roey, P., Meehan, L., Kowalski, J.C., Belfort, M. and Derbyshire, V. (2002) Catalytic domain structure and hypothesis for function of GIY-YIG intron endonuclease I-Tevl. Nat. Struct. Biol., 9, 806-11.

163. Van Roey, P., Waddling, C.A., Fox, K.M., Belfort, M. and Derbyshire, V. (2001) Intertwined structure of the DNA-binding domain of intron endonuclease I-Tevl with its substrate. EMBO J., 20, 3631-7.

164. Vetter, D. and Sadowski, P.D. (1974) Point mutants in the D2a region of bacteriophage T4 tail to induce T4 endonuclease IV. J. Virol., 14, 207-13.

165. Vieira J. and Messing J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-68.

166. Wang, J., Kim, H.-H., Yuan, X. and Herrin, D.L. (1997). Purification, biochemical characterization and protein-DNA interactions of the I-Crel endonuclease produced in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 25, 3767-76.

167. Warner, H.R. (1971) Partial suppression of bacteriophage T4 ligase mutations by T4 endonuclease II deficiency: role of host DNA ligase. J. Virol., 7,534-6.

168. Warren, R.A.J. (1980) Modified bases in bacteriophages DNAs. Ann. Rev. Microbiol., 34, 137-58.

169. Wende, W., Grindl, W., Christ, F., Pingoud, A. and Pingoud, V. (1996) Binding, bending and cleavage of DNA substrates by the homing endonuclease Pl-Scel. Nucleic Acids Res., 24,4123-32.

170. Wyatt, G.R. and Cohen, S.S. (1952) A new pyrimidine base from bacteriophage nucleic acids. Nature, 170, 1072-3.

171. Yonesaki, Т., and Minogawa T. (1985) T4 phage gene uvsX product catalyzes homologous DNA pairing. EMBO J., 4, 3321-7.

172. Yonesaki, Т., and Minogawa T. (1989) Synergistic action of three recombination gene products of bacteriophage T4, UvsX, UvsY, and gene 32 proteins. J. Biol. Chem., 264, 7814-20.

173. Yonesaki, Т., Rio, Y., Minogawa, T. and Takashi, H. (1985) Purification and some of the functions of the products of the bacteriophage T4 recombination genes uvsX and uvsY. Eur. J. Biochem., 148, 127-34.

174. Zinn, A.R. and Butow, R.A. (1985) Nonreciprocal exchange between alleles of the yeast mitochondrial 21S rRNA gene: kinetics and the involvement of a double-strand break. Cell, 40, 887-95.

175. Акуленко H.B., Ивашина T.B., Шалойко Л.А., Шляпников М.Г., Ксензенко, В.Н. (2004) Новые сайт-специфические эндонуклеазы F-Tfll, F-TflII и F-TflIV, кодируемые бактериофагом Т5. Молек. Биол., 38, 632-41.

176. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, 22, 2721-27.1. БЛАГОДАРНОСТИ

177. Выражаю глубокую признательность моему руководителю Щербакову В. П. за плодотворное сотрудничество и поддержку. Особую благодарность выражаю Кадырову