Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое изучение UvsX-независимого пути гомологичной рекомбинации у бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое изучение UvsX-независимого пути гомологичной рекомбинации у бактериофага Т4"

Санкт-Петербургский государственный университет

РГВ од

На правах рукописи

м

^ ь .1

ГРЕБЕНЩИКОВА СВЕТЛАНА МИХАЙЛОВНА

Генетическое тучение иуяХ-независимого пути гомологичной рекомбинации у бактериофага Т4

03.00.15-генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Институте химической физики в Черноголовке Российской

Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук В.ПЩербаков

Официальные оппоненты: д.б.н., В.Н.Рыбчин

д.б.н., профессор,В.В.Месяижинов

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится " " 1997 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Санкт-Петербургском Университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9. СПбГУ биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Автореферат разослан " (о " а Рлс^ЬЛ. 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ДА. Мамон.

Актуальность темы. Генетическая рекомбинация - универсальный биологический процесс, играющий важную роль во многих фундаментальных явлениях живой природы. Как путь перераспределения генетической информации, рекомбинация является эволюционным фактором, ответственным за распространение в популяции положительных признаков и выведения из нее отрицательных. Кроме того, в последние годы установлено участие рекомбинации в репликации ДНК, в репарации повреждений ДНК. в возникновении мутаций, установлена взаимосвязь рекомбинации и транскрипции. Такие явления, как амплификация, делеция и транспозиция генетического материала, способные оказывать влияние на регуляцию экспрессии генов и дифференцировку клеток, также идут с участием рекомбинации. Изучение генетической рекомбинации, таким образом, является не только одной из главных проблем генетики, но и важной проблемой биологии вообще.

Тесная взаимосвязь, выявленная между рекомбинацией и другими генетическими процессами, выдвигает на первый план еще один ее важный аспект. Генетическая рекомбинация - не только одна из основных проблем, изучаемых генетикой, но и основа метода генетического, или рекомбинационного анализа. Этот метод применим в широкой области проблем молекулярной генетики, от организации генетического материала до различных генетических процессов. Именно этот метод в свое время выделил генетику в самостоятельную научную дисциплину. Особенностью его является то, что в рекомбинационном анализе мы изучаем генетические процессы in vivo, в той комплексной форме, в которой они протекают в живой клетке. Это делает данный метод незаменимым и дополняющим биохимические методы, использующие системы in vitro.

Переход на физическую шкалу расстояний, знание физической структуры и локализации генетических маркеров, доступность другой биохимической и физико-химической информации, в том числе структурных особенностей ДНК и активностей рекомбинационных ферментов создает благоприятные предпосылки для создания современного рекомбинационного анализа, Очевидно, однако, что адекватная теория рекомбинации не может быть создана без глубокого знания самого процесса рекомбинации. Сфера применимости рекомбинационного анализа и точность интерпретации добываемых с его помощью данных прямо зависят от знания механизмов рекомбинации.

Цель работы. В данной работе, используя рекомбинацию rll-мутантов бактериофага Т4, мы сосредоточились на изучении распределения одиночных и двойных обменов по ДНК в нормальных скрещиваниях и в отсутствие ряда ферментов, участвующих в главном пути с целью сравнительной количественной рекомбинационной характеристики альтернативного (UvsX-независимого) пути рекомбиинации.

Специальному изучению подвергнута рекомбинационная аномалия, наблюдающаяся на границе генов-rllA и rllB фага Т4, проявляющаяся в том, что при переходе через границу между генами наблюдается скачкообразное возрастание частоты рекомбинации в двухфакторных скрещиваниях. Подробная количественная характеристика этой аномалии выполнена в норме и на фоне мутаций в ряде генов, влияющих на рекомбинацию: uvsX, 49,39.

Исследована коррекция несларенных участков в промежуточных продуктах рекомбинации в условиях отсутствия функции зндонуклеазы VII (продукта гена 49).

Научная новизна. Впервые методами рекомбинационного анализа продемонстрировано, что соотношение между двойными и одиночными обменами в скрещиваниях бактериофага Т4 согласуется с равновероятным возникновением сплайсов и пэтчей в процессе рекомбинации. Это равенство следует из модели сплайс/пэтч сопряжения.

Впервые дана подробная количественная характеристика альтернативного пути генетической рекомбинации у фага Т4 и получены убедительные свидетельства в пользу того, что ДНК-топоизомераза Т4 является ключевым ферментов альтернативного пути.

Впервые описана горячая точка рекомбинации вблизи межгенной rllA-rlIB области и продемонстрировано, что активность ее связана с альтернативным (топоизомеразо-зависимым) путем рекомбинации.

Впервые продемонстрировано участие зндонуклеазы Vil in vivo в коррекции несларенных участков ДНК, образующихся в процессе рекомбинации при попадании генетического маркера в гибридную область.

Практическая ценность работы. Новые подходы в рекомбинациошом анализе, разработанные в ходе данного исследования, и созданные коллекции множественных мутантов бактериофага Т4 могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов генетической рекомбинации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на трех международных симпозиумах по бактериофагу Т4 (Evergreen International Т4 Meeting, США, Олимпия), на Кейстоуновском симпозиуме 1996 года "Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recambination(CLLiA, Taoc), на семинаре отдела кинетики химических и биологических процессов ИХФЧ РАН, на семинаре лаборатории физиологической генетики Биологического института при С-ПГУ.

Публикации. Основное содержание работы изложено в тре>Г журнальных статьях и четырех тезисах докладов.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 6 таблиц и Приложение.

Материалы и методы исследования

В экспериментальном плане основное содержание работы - генетические исследования на фаге Т4 - получение мутантов и стандартные скрещивания между мутантами rll. При этом использовались стандартные питательные среды: L-бульон, Мясо-пептонный бульон, пептонный бульон, мясо-пептонный агар, пептонный агар, полужидкий агар Дрэйка

Стандартные скрещивания. Применялся метод, аналогичный описанному Чейз и Доерман (1958). Суточную культуру E.coli ВВ разбавляли в 100 раз L-бульоном и аэрировали при 37°. При концентрации клеток 1-108/мл суспензию охлаждали до 0°, клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в охлавденном бульоне до концентрации 4-108.мл. Суспензию хранили при 0° К 0.5 мл суспензии ВВ добавляли 0.1 мл 0.02М цианистого натрия выдерживали 1 минуту и прибавляли смесь фаговых родителей в объеме 0.5 мл (множественность каждого родителя пять). Зараженные клетки инкубировали 10 мин при 33°, разводили L-бульоном в 1000 раз и инкубировали при той же температуре еще 80 минут, после чего добавляли 0.3 мл хлороформа.

Штаммы фага Т4. Использованы rll-мутанты из различных источников: из коллекции С. Чеймпа, С. Бреннера, Д. Дрэйка, Б. Зингер, Н.И. Матвиенко и В.П. Щербакова. Последовательность мутаций в области rll показана на Рис. 1.

НЕ122 opUV357

Н72 al a3 UV200 HB84 CS r490 UV37S XS11 Г375 FC47 N17 N12 Ь24 Ь26 N35 а2 аА НВ129 г106 N21 Х504 гЗбО UV357 N24 odW N7UV1S9 Ь25

Ас19

<----------------ген гид-------------—> ^-------------------------ген rllB.................—>

Рис. 1. Карта мутаций rll фага Т4 (не в масштабе)

Штамм T4D дикого типа и амбер-мутанты по генам uvsX (S17), 49 (Е727) и 39 (N116) получены от К. Эбисузаки. Множественные мутанты S17 rll. S17 Е727, "S17 Е727 rll, N116 rll получены в ходе данной работы с использованием обычных методов фаговой генетики. Генотип всех использованных в работе множественных мутантов подтвержден в анализирующих скрещиваниях.

Результаты исследования и обсуждение

Количественная характеристика главного пути рекомбинации методами рекомбинационного анализа. Основной задачей данной работы было количественно охарактеризовать путь рекомбинации у фага Т4, действующий при блокировании главного пути. Однако такая характеристика имеет смысл только в сравнении с главным путем рекомбинации, который в этом отношении также до сих пор не был охарактеризован систематически. Хотя в рекомбинационном анализе могут применяться разные подходы, наиболее общим и универсальным является изучение зависимостей частоты рекомбинации от расстояния. Наш основной подход, который мы условно назвали методом проекции частот рекомбинации на физическую карту хромосомы, состоит в следующем. Любая из rll-мутаций, например Х504, может быть взята в качестве "реперного" маркера i, с которым мы скрещиваем другие (переменные) мутации j, находящиеся слева или справа от реперного. При этом в рекомбинацию последовательно вовлекаются все новые и новые сегменты хромосомы. Это - серии двухфакторных скрещиваний типа ¡J х lj. Чтобы иметь возможность сравнивать результаты двухфакторных и трехфакторных скрещиваний, мы используем серии трехфакторных скрещиваний типа ¡Jk х IjK, в которых реперным маркером служит мутация i, а переменными - центральные маркеры j. При этом маркер к выбирается достаточно далеким, чтобы исключить захват в гибридную область одновременно всех трех маркеров или маркеров j и к. Только при соблюдении этого условия (т.е. в отсутствие рекомбинационных помех со стороны маркера к)

возможно прямое количественное сопоставление двухфакторных и трехфакторных систем.

На Рис. 2 графически показаны теоретические зависимости частоты рекомбинации от физического расстояния в сериях двухфакторных и трехфакторных скрещиваний для простой модели, согласно которой рекомбинация идет через образование сплайсоа и пзтчей с постоянной длиной (при их равном соотношении), рекомбинационные события равномерно распределены вдоль " хромосомы, генетические маркеры никак не влияют на ход рекомбинации, рекомбинационные события независимы. Это линейные зависимости с точками перегиба на расстоянии: равном длине гибридной области (пэтча). Наклоны прямых характеризуют удельную скорость рекомбинации - частота на нуклеотид Наклон прямой первой фазы в двухфакторных скрещиваниях в 4 раза превышает таковой в трехфакторных По причине того, что в двухфакторных скрещиваниях рекомбинанты дикого типа возникают s четырех равновероятных случаях: попадание маркера I в пэтч или в сплайс и попадание маркера j в пэтч или сплайс, тогда как в трехфакторном скрещивании только попадание в пэтч центрального маркера j дает рекомбинант дикого типа.

На Рис. 3 показан пример измерения зависимости частоты рекомбинации от расстояния в двух сериях двухфакторных скрещиваний с реперными маркерами N35 и Х504 соответственно и переменными маркерами j, расположенными справа от N35 и от Х504, соответственно. Две серии дали практически совпадающие результаты. Зависимости отчетливо двухфазные, причем наклоны прямых для первой и второй фазы различаются приблизительно в два раза (Табл. 1), в очень хорошем соответствии с предсказаниями модели сплайс/пэтч-сопряжения (т.е. в соответствии с равенством частот сгшайсов и пэтчей). Сходные результаты дали серии скрещиваний с реперными маркерами UV375 и Х511 в скрещиваниях с леворасположенными маркерами j. Точка перехода двух фаз соответствует приблизительно 400 парам иуклеотидов, что находится в замечательном согласии с измерениями длины гибридной области в промежуточных продуктах рекомбинации, проделанными с применением других методов (Berger, 1965; Toompuu and Shcherbakov, 19S0).

Рекомбинационная аномалия вблизи межгенной rllA-rllB области. На

Рис, 4 показаны результаты измерения зависимости частоты рекомбинации от расстояния в четырех сериях двухфакторных скрещиваний реперных маркеров

Рис. 2

30 т ХЯО ! > ч

20 ~

ОС

200 400 600

Расстояние (пн)

/

/

Рис. 3

1000 о

100 800 Расстояние (пн)

1200

5

Рис. 2. Теоретические зависимости частоты рекомбинации от физического расстояния

в сериях двух- и трехфакторных скрещиваний для модели, согласно которой

образуются сплайсы и пэтчи постоянной длины (при их равном соотношении).

Рис. 3. Зависимость частоты рекомбинации от расстояния в сериях двухфакторных

внугригенных скрещиваний с реперными маркерами N35 и Х504.

Рис. 4. Зависимости частоты рекомбинации от расстояния в сериях двухфаюгорных

межгенных скрещиваний с реперными маркерами осЬ31, РС47. N24 и Ц\/357

Таблица 1

Некоторые параметры зависимости частоты рекомбинации от расстояния в серия* двухфакторных скрещиваний мевду мутантами г!1

Маркеры I Маркеры О Наклон прямой 1 Наклон прямой 2 Наклон прямой 1 в трехфакторной серии соотношение наклонов

N35 справа 3.7 X Ю-5 1.6 х Ю-'

№200 справа 3.1 х 10'® 0.7 х Ю'5 0.23

Х504 справа 3.7 х 10'5 1.7 * 10'5 0.8 х Ю"5 0.22

ЦУ375 справа 3.3 х Ю-5 2.2 х 10'5

Х51) справа 4.0 х Ю-5 2.7 х 10'5

Ь25 слева 3.3 х 10"5 1.1 х 105 0.33

Ь25 слева 2.8 х 10 ® 0.8 х Ю-5 0.33

осЬ31 слева 3.0 х 10® 1.1 х Ю"5 0.37

ГС47 слева 3.4 х 10'5 1.7 х 10"® 1.1 х 10"® 0.33

N24 слева 3.9 х 10'5 2.3 х 10"5 0.9 « 10'5 0.23

ЦУ357 Среднее слева 4.0 х Ю-5 (347 ±0.13) х 10'® 1.5 х 10'5 (19б± 0.17 ) X 10'" [0.93 ± 0.06) х 10® 0.29 ± 0.02

осИ31, ГС47, N24 и Ц\/357 с маркерами ] в генах гНВ и гНА, расположенными слева от них. Существенно, что сегмент хромосомы, в котором регистрируется рекомбинация, включает в себя межгенную область. Положение графиков относительно оси X смещено таким образом, чтобы одинаковые маркеры ) имели одну и ту же абсциссу. Все четыре серии демонстрируют сходную зависимость. В начале, во внутригенных скрещиваниях (в пределах гена гПВ) мы наблюдаем линейные зависимости частота/расстояние, количественно близкие к тем, что получены в рассмотренных выше сериях. Однако при переходе через межгенную область происходит скачкообразное увеличение частоты рекомбинации (приблизительно на 6 х 10'3), а в последующей фазе зависимости имеют сложную форму, включая участки снижения частоты с увеличением расстояния.

Простейшее объяснение обнаруженной аномалии могло бы состоять в том, что в межгенной области или вблизи нее, в пределах 27 пн (между маркерами Х504 и г490) находится горячая точка рекомбинации (ГТР). Согласования результатов внутригенных и межгенных скрещиваний удается достигнуть, если предположить, что

7

рекомбинация е районе межгенной области представлена двумя компонентами: на главный путь рекомбинации, который хорошо описывается моделью сплайс\пэтч-сопряжения, накладывается дополнительная рекомбинация, имеющая локализованный характер.

Альтернативный путь рекомбинации.

Для характеристики альтернативного пути рекомбинации проводили серии скрещиваний между rll-мутантами, несущими дополнительные амбер-мутации в генах главного пути рекомбинации: S17 (uvsX), Е727 (ген 49), либо обе мутации (S17 Е727). На Рис. 5 сравниваются результаты серий двухфакторных скрещиваний с реперным маркером N24 на разных генетических фонах. Аналогичные данные были получены в сериях с релерными маркерами Х504, FC47, och31, Ь25. Некоторые параметры зависимостей частота/расстояние в двухфакторных скрещиваниях сведены в Табл.2.

В целом результаты демонстрируют приблизительно одинаковый эффект в разных сериях скрещиваний (т.е. при разных реперных маркерах и, следовательно, на разных участках гена rllB). Эффекты одиночной мутации S17 и двойной мутации S17 Е727 оказались в основным идентичными. Рекомбинация на фоне S17 (uvsX-) и на фоне S17 Е727 (uvsX- 49-), оцениваемая по уменьшению наклона линии регрессии (частота/расстояние) в среднем снижена приблизительно в 5 раз.

В Табл. 3 суммированы результаты серий трехфакторных скрещиваний с релерными маркерами Х504, N24, FC47, och31 и Ь25, которые, в совокупности с рассмотренными выше двухфакторными скрещиваниями, позволяют оценить соотношение между двойными и одиночными обменами в альтернативном пути рекомбинации. Наиболее выраженным эффектом выключения главного пути рекомбинации является сильное снижение частоты двойных обменов, гораздо более сильное, чем ингибирование рекомбинации в двухфакторных скрещиваниях, в которых измеряется суммарный вклад двойных и одиночных обменов.

Межгенные скрещивания (рекомбинация через ГТР). На Рис. 6 представлены результаты серий двухфакторных скрещиваний с реперным маркером N24 на разных генетических фонах в диапазоне расстояний, включающих в себя ГТР. Аналогичные серии скрещиваний были. выполнены с реперами FC47, och31 и Ь25. Основное наблюдение состоит в том, что во всех этих сериях выключение главного пути рекомбинации не приводит к уничтожению скачка частот рекомбинации на границе между генами rllA и rllB. Таким образом, скачок частот на границе генов определяется активностью альтернативного (UvsX-независимого) пути рекомбинации

N24 x j„

ooQoo normal »op.»9 St7 E727 »..».» A» ET27

/

Рис. 5

...А.....

O

а СИ

N24 x ;'„«

с.о.Р.ао 51/ 7 E727 ooqqo normal £727

20

Расстояние

во (пн)

юо

О 200 300

Расстояние

400

(пн)

4-1

3

о

120100-: 80-3

к-. i

О ]

х ' i ОС 40-а

20-:

NfJS

N24 х ,\а

/

Рис. 7

О

ОС

-tooooo Дп19

- o_D о a_a Х504

..... £727 Act9

Х504

у

У

2

Рис. 8 ✓ *

rt/o у

Os S 3 •

-a

: * •» г- r-f * Г. 4

л-«"' чтппгрптгттпмт ттпгрмним JI! чтптгттгттттттгттм i,

400 800 1200

Расстояние (пн)

40 60 ЭО 100 120 140

Расстояние (пн)

Рис. 5. Зависимость частоты рекомбинации от расстояния в сериях двухфакторных внутригенных скрещиваний с реперным маркером N24 в норме, на фоне мутаций Е727 (отсутствует эндонуклеаза VII) и S17 Е727 (отсутствуют белок uvsX и эндонуклеаза VII) Рис. 6. Зависимость частоты рекомбинации от расстояния в сериях двухфакторных межгенных скрещиваний с реперным маркером N24 в норме и на фоне мутаций Е727 (отсутствует эндонуклеаза VII) и S17 Е727 (отсутствуют белок uvsX и эндонуклеаза VII). Рис. 7. Зависимость частоты рекомбинации от расстояния в серии скрещиваний N24 х j на фоне мутации N116 (39-, отсутствие функции топоизомеразы). Рис. 8. Зависимости частоты рекомбинации от расстояния в четырех сериях двухфакторных скрещиваний с реперными маркерами Ас 19 и Х504 соответственно в норме (прямые 1 и 2) и в отсутствие эндонуклеазы VII (прямые 3 и 4).

6

Таблица 2

Параметры зависимостей частота/расстояние в двухфакгорных анутригенных скрещиваниях rll-

иутантов фага Т4 на разных генетических фонах

Серия скрадива-ний Генетический фон Уравнение линейной регрессии Корреляция с расстоянием Ингибирование рекомбинации

Х504хь + (дикий тип) fl = (2.83 + 0.370) х Ю * 0,97

S17(uvsX) R = (0.00 + 0.08D) х 10'* 0.97 а 4.7 раза

Е727 (49') Я = (-0.4 + 0.1 SD) х 10'4 0.97 в 2.5 раза

N24 xfc + (дикий ТИП) R = (1.97 + 0.39D) х 10"' 0.96

£727 (49") R = (3.30 + 0.08D) х 10'4 0.90 в 4.9 раза

S17 Е727 (UVS5T49 ) R = (1.87 + 0.07D) х 10"' 0.95 в 5.6 раза

N116 (39') Я = (0.76 + 1.12D) х 10"4 0.98 в 0.35 раза

FC47 х Ь + (дикий тип) R = (4.60 + 0.34D) > 10"4 0.97

Е727 (49) R = (4.85+ 0.110) х Ю-4 0.92 в 3.1 раза

S17 (uvsX") R = (2.80 + 0.05D) х Ю"4 0.94 в 7.4 раза

och31 х jb + (дикий тип) R = (2.79 + 0.30D) х 1С4 0.98

S17 (uvsX") R - (3.41 + 0.07D) х (О-4 0.82 в 4.8 раза

S17 Е727 (uvsX"49*) R = (2.08 + 0.07D) х Ю-4 0.69 в 4.3 раза

Ь25хь + (дикий тип) R - (4.90 + 0.28D) х I0'4 0.99

S17(iws>C) R = (-2.46 + 0.060) х 10'4 1.0 в 4.4 раза

S17 Е727 (uvsX'49 ) R = (-0.16 + 0.05D) х 10" 0.98 в 5 2 раза

Примечание: R - частота рекомбинантов rll+; D - физическое расстояние в парах

нуклеотидов.

ДНК-топоизомераза - ключевой фермент альтернативного пути рекомбинации. Приведенные выше данные, характеризующие альтернативный путь рекомбинации, показывают, что эта рекомбинация сильно отличается от рекомбинации по главному пути не только в количественном, но и в качественном отношении. В альтернативном пути рекомбинацмонные события ведут преимущественно к одиночным обменам и дают очень мало даойных обменов, тогда как главный путь характеризуется равновероятным образованием сплайсов и пзтчей и, следовательно, одиночный и двойной обмен - это равновероятные исходы рекомбинационного события. Скачок частоты рекомбинации на границе между генами г1(А и г11В практически не изменяется у мутантов с заблокированным главным путем рекомбинации, при этом, как вообще в альтернативном пути, образуются преимущественно одиночные обмены.

Таблица 3

Параметры аависимостей частота/расстояние в трехфакторных скрещиваниях Ш-мутзнтов фага Т4 на

разных генетических фонах

Серия скрещиваний Генетический фон Уравнение линейной регрессии Корреляция с рассто-янием Иигибирование рекомбинации Ruk/HJ

Х504 Ь26 Xfc + (дикий тип) R «10.10 + 0.08D) * 10"* ' -' 0.88 0.22

S17IUVSX") R = (0.04 + 0.008D) ж Ю-* 0.97 в 10 раз 0.10

N24 N35 + (дикий тип) R = (1.72 + 0.090) х КГ4 0.92 0.23

Е727149') R = (0.64 + 0.020)» 10"* 0.91 в 4.5 раза 0.25

S17E727 (INSX*49~) R = (0.63 + 0.004D)x t0~* 0.60 в 22.5 раза 0.06

FC4 7N35 *ib + (дикий тип) R = (1.00 + 0.11D) х 10"* 0.99 0.32

S17(uvsX") R = (0.92 + 0 004D) * 10"4 0.24 в 27.5 раза 0.06

Е727 (49) R = (2.47 + 0.015D)* 10 * 0.75 в 7.3 раза 0.14

och31 N35 *Ь + (дикий тип) H = (0.04 +0.11D) x 10"* 0.8t 0.37

S17E727 (UVST49) ñ = (-0.84 + 0.020) x Ю"4 0.84 в 5.5 раза 0.29

Ь25 N35 xfc + (дикий ТИП) R = (2.44 + 0.080) * 10Г4 0.97 0.29

517 (iwsX") R = (0.60 + 0.0060)* 10"4 0.94 в 13 раз 0.09

S17E727 (uvsX"49"> R = (0.36 + 0.006D) * 10*4 0.95 »13 раз 0.11

Примечание: R - частота рекомбинантов ПН-; D - физическое расстояние i-j в парах

нуклеотидов. Ингибиро ванне рекомбинации на том или ином генетическом фоне оценивалось по снижению наклона линии регрессии. Отношение Ruk/Ru характеризует соотноше; ше между двойными и одиночными обменами; при равенстве пэтчей и сплайсов это отношение должно быть равным 0.25

Судя по тому, что альтернативный путь осуществляется в отсутствие двух главных компонентов главного пути - белка UvsX (инициирование рекомбинации) и эндонуклеазы VJJ (последний этап рекомбинации - линеаризация промежуточных разветвленных структур ДНК), очевидно, что он не нуждается в специфических ферментах главного пути. Далее, отсутствие потребности в эндонуклеазе VII, удаляющей разветвления на ДНК, заставляет думать, что рекомбинация по альтернативному пути не связана с образованием разветвленных промежуточных ДНК-структур. Хорошим кандидатом для осуществления такой рекомбинации является ДНК-топоизомераза Т4. Это топоизомераза типа II, осуществляющая релаксацию сверхспирализованных молекул ДНК путем переноса двойной спирали ДНК через временный двунитевой разрыв. In vitro этот фермент способен в одиночку

осуществить рекомбинацию двух молекул ДНК в отсутствие существенной гомологии, и ему приписывается роль в незаконной рекомбинации [Chiba et al. 1989]. Однако in vivo, в комплексе и во взаимодействии с другими компонентами, топоизомераза могла бы осуществлять и гомологичную рекомбинацию. Если действительно альтернативный путь нуждается в топоизомеразе как ключевом ферменте, множественные мутанты по топоизомеразе и генам главного пути рекомбинации должны быть летальными (рекомбинация является совершенно необходимым процессом в жизненном цикле фага Т4).

Мы получили двойной мутант S17 N116 и тройной мутант S17 Е727 N116 (мутация N116 - это амбер-мутация в гене 39, кодирующем одну из субъединиц фаговой топоизомеразы). Эти множественные мутанты оказались полностью летальными при заражении несупрессорных штаммов Е. coli, хотя одиночные мутанты S17, N116 и двойной мутант S17 Е727 довольно хорошо размножаются в непермиссивных условиях. Этот факт говорит в пользу того, что топоизомераза является необходимым компонентом альтернативного пути рекомбинации.

Рекомбинация в отсутствие топоизомеразы. На Рис. 7 представлены результаты серии скрещиваний N24 х j на фоне мутации N116 (39- , отсутствие функции топоизомеразы). Мутанты N116 имеют отчетливый гиперрек фенотип -наклоны первой и второй фаз зависимости частота/расстояние почти в 3 раза превышают таковые в нормальных скрещиваниях; соотношение между наклонами первой и второй фаз равно 2 - в соответствии с равенством сплайсов и пэтчей. Для нас в данном случае наиболее существенно то, что при переходе через границу между генами rllA и rllB скачок в частоте рекомбинантоа практически отсутствует. Это наиболее веский довод в пользу того, что рекомбинация, зависимая от ГТР, абсолютно нуждается в топоизомеразной функции. Это также и серьезный довод в пользу того, что топоизомераза Т4 является ключевым ферментом альтернативного (UvsX-независимого) пути рекомбинации.

Коррекция неспаренных участков. Наш подход состоял в сравнении рекомбинации двух маркеров, Ас19 и Х504. Эти маркеры занимают одно и то же положение на хромосоме, но Х504 (мутация типа замены основания) не корректируемый маркер, тогда как Ас19 (вставка двух пар нуклеотидов) - хорошо корректируемый маркер. Каждый из них принимал участие в скрещивании с одним и тем же набором маркеров, о которых известно, что сами они не корректируются. Для

рекомбинации в трехфакторной системе в качестве одного из родителей был использован двойной мутант N35-FC47.

На графиках Рис, 8 представлены зависимости частоты рекомбинантов дикого типа от физического расстояния между маркерами, полученные в четырех сериях двухфакторных скрещиваний с реперными маркерами Ас 19 и Х504 соответственно в норме (прямые 1 и 2) и в отсутствие функциональной эндонуклеазы VII (прямые 3 и 4). Из графиков следует, что в нормальных скрещиваниях маркеры сильно отличаются по своей корректируемое™: частоты рекомбинантов для Х504 совпадают с базовой для всех исследованных расстояний, а соответствующие частоты рекомбинации для Ас19 больше базовой в среднем на 2.9' 10"э, что и есть вклад коррекции неспаренного участка Ас19/+- в общую частоту рекомбинации [Shcherbakov and Plugina 1991].Те же серии скрещиваний, выполненные с мутантами rll, несущими дополнительную мутацию Е727 в гене 49 дали результаты, отличающиеся от нормальных данных в двух отношениях: 1) Общая интенсивность рекомбинации, оцениваемая по наклону линии регрессии, снизилась в 2.5 раза; 2) исчезла разница между хорошо корректируемым маркером Ас19 и некорректируемым маркером Х504. Отсутствие рекембинационных различий между Ас19 и Х5С4 проще всего объяснить тем, что зндонуклеаза VII необходима для коррекции неспаренных участков. Результаты двух трехфакторных скрещиваний, в которых центральными маркерами служили соответственно Х504 и Ас19, дали результаты, согласующиеся с таковыми двухфакторных скрещиваний.

выводы

1. Методом проекции частот рекомбинации на физическую карту хромосомы исследовано распределение рекомбинационных событий дающих одиночные обмены, и событий, дающих двойные обмены, вдоль области rll бактериофага Т4. Охарактеризованы главный и алыгернатавный' (иузХ-незааисимый) пути генетической рекомбинации у бактериофага Т4.

2. Результаты внутригенных скрещиваний на нормальном генетическом фоне (главный путь рекомбинации) в целом согласуются с моделью сплайс/пэтч сопряжения, предсказывающей равенство двойных и одиночных обменов, однако целый ряд отклонений от указанной модели говорит о множественности путей рекомбинации у Т4 и, в частности, о наличии механизмов рекомбинации, действующих локально.

3. В межгенных (rila х rllB) скрещиваниях обнаружено скачкообразное увеличение частоты рекомбинации при переходе через межгенную область (горячая точка рекомбинации, ГТР). Рекомбинационно активной является также начальная часть гена rllB.

4. Альтернативный путь, исследованный на фоне мутаций в генах uvsX (гесА-подобный белок), и 49 (эндонуклеаза VII), характеризуется сильно пониженной интенсивностью процесса рекомбинации, причем в ходе этой рекомбинации образуются исключительно одиночные обмены.

5. Альтернативный путь рекомбинации и активность ГТР на границе генов, критически зависят от функции фаговой ДНК-топоизомеразы, причем рекомбинация через ГТР не зависит от функций UvsX и эндонуклеазы VII и представляет собой почти исключительно одиночные обмены. Делается заключение, что ГТР на границе между генами rllA и rllB отражает действие альтернативного пути рекомбинации. Это показывает также, что альтернативный путь рекомбинации активен и в условиях uvsXH-, так что нормальная рекомбинация отражает суммарный вклад uvsX-зависимого, uvsX-независимого путей, и, по-видимому, других рекомбинационных механизмов.

6. Эндонуклеаза VII фага Т4 непосредственно участвует в коррекции неспаренных участков в промежуточных продуктах рекомбинации.

Публикации по гене диссертации.

1. Shcherbakov V.P., Plugina L.A., Grebenshchikova S.M, Nesheva M.A., Participation of endonuclease VII of T4 bacteriophage in «combinational mismatch repair, Abstracts of the IX Evergreen International T4 Meeting, August 1991 .P.11.

2. Shcherbakov V.P., Plugina L.A. Grebenshchikova S.M. Recombination anomaly within the intercistronic rllA-rllB devide Abstracts of the X Evergreen International T4 Meeting, August 1993. P.11.

3. Shcherbakov V.P., Plugina L.A., Grebenshchikova S.M., Terent'yeva S.A., Shcherbakova T.S., Sizova S.T. 1996 KEYSTONE SYMPOSIA conference on Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination. February 1S96, Taos.

4. Shcherbakov V.P., Grebenshchikova S.M., Shcherbakova T.S. Plugina LA., Sizova S.T. UvsX-independent/endonuclease VII independent recombination pathway of T4 bacteriophage. Abstracts of the XI Evergreen International T4 Meeting, August 1996.P. 15.

5. Щербаков В.П., Гребенщикова С.М., Плугина Л.А., Механизм коррекции неспаренных участков в рекомбинации бактериофага Т4, ДАН 334 (1994) 4, 541542.

6. Щербаков В.П., Плугина Л.А., Гребенщикова С.М., Рекомбинационная аномалия на границе между генами rllA и rllB бактериофага Т4, ДАН 334 (1994) 5, 669-670

7. Гребенщикова С.М., Плугина Л.А., Щербаков В.П., Эндонуклеаза VII бактериофага Т4 в коррекции неспаренных участков, Генетика 30 (1994) 5, 622-626.