Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Длинные инвертированные повторы бактериального транспозона Tn5 стимулируют гомологичную рекомбинацию у дрожжей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Длинные инвертированные повторы бактериального транспозона Tn5 стимулируют гомологичную рекомбинацию у дрожжей"

Министерство науки, высшей школы и технической политики Российской Федерации. Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи УДК 547. 962.32

ЫАЛКОВА Анна Леонидовна.

ДЛИННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ ПОВТОРЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ТРАНСПОЗОНА Тп5 СТИЫУЛИРУЮГ ГОМОЛОГИЧНУЮ РЕКОМБИНАЦИЮ У ДРОШЕЯ

03.00.15 - генетика

■ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского университета

Научный руководитель: старший научный сотрудник,

кандидат биологических наук Д. А. ГОРДЕНИН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. А. ЛАНЦОВ

доктор биологических наук Т. Р. СОЙДПА

Ведущее учреждение: Всероссийский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН.

Защита состоится *'_" _1993 г. в _час. на

заседании Специализированного совета Д 063.57. 21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности • "Генетика" при Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург, Университетская наб. . 7/9 ауд. N ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке •Санкт-Петербургского государственного университета. Автореферат разослан "_"_1392 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Л. А. МАМОН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе многих перестроек наследственного материала лежит генетическая рекомбинация. Наиболее распространена гомологичная рекомбинация, которая происходит регулярно в жизненном цигаге большинства организмов. Рекомбинационные процессы находятся под контролем генов,' кодирующих рекомбинационные белки, и локальных структур ДНК, участвующих в _ рекомбинации. Хорошо известно стимулирующее влияиие длинных инвертированных повторов на незаконную рекомбинации у бактерий и дрожжей (делеции палиндромов, точное и неточное вырезание Тп5 и Тг.10). Длинные инвертированные повторы (ДИП) весьма распространены в геномах высших эукариотических организмов, и поэтому могут быть значительным источником геношш перестроек. Настоящая работа посвящена изучению индукции гомологичной рекомбинации длинными инвертированными последовательностями. Нами была использована инсерция бактериального гранспоэона Тп5 в ген LYS2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Согласно нашим данным о генетическом контроле вырезания бактериального транспозона Тп5 у дрожжей, мы высказываем предположение CGordenin et al. , 19923, что в районе инсерция Тп5 может образовываться вторичная структура ДНК, которая с высокой частотой может вызывать торможение репликации.

Задачи работы. В задачу нашей работы входило выяснить, оказывает ли инсерция Гп5 эффект на' митотическую гомологичную рекомбинацию в гене 1Л32. Кроме того, мы планировали изучить влияние мутаций в генах, контролирующих синтез ДНК-псшшераз и репарацию ДНК у дрожжей, на гомологичную рекомбинацию с участием содержащей инсерцию Тп5 аллели LYS2. .

Научная новизна. Мы провели изучение аффекта инвертированных повторов бактериального транспозона Тп5 на гомологичную рекомбинацию в митозе у дрожлей и исследовали генетический контроль гомологичной рекомбинации с участием мутантной аллели LYS2, содержащей инсерцию Тп5. В результате мы впервые продемонстрировали, что

последовательность ДНК, включавшая длинные инвертированные повторы Тп5, повышает частоту митотичеекой внутригенной рекомбинации у дролией (является' "горячей,

точкой" рекомбинации);

- инсерции с ДЙП Тп5 конвертируют к последовательности "дикого типа" чаще других исследованных нами мутаций lys2;

- мутация в гене P0L2, контролирующем синтез дрожжевой ДНК-полимеразы £ , избирательно повышает частоту Тп5-зависимой рекомбинации.

Теоретическая и практическая ценность работы. Перечисленные факты и закономерности обнаружены нами впервые. Они имеют большое значение для понимания механизмов инициации гомологичной рекомбинации у дрожжей и других эукариотических организмов. Они позволяют делать предположения о:

- потенциальной рекомбиногенности районов эукариотических геномов, включающих ДИП-,

- о роли репликации в инициации различных рекомбинационных процессов.

Пйлученные данные могут быть использованы при создании моделей некоторых обшегенетических явлений, таких как "горячие точки" мейотической рекомбинации, рекомбиногенез при нарушении функций ДНК-полшераз. Полученные в диссертации данные имеют значение для работы с дрожжевыми искусственными хромосомами, содержащими ДНК- человеческого генома, обогащенную длинными повторами, в том числе и инвертированными. Результаты, полученные в диссертации, могут Сыть применены в учреждениях, изучавших рекомбинационные перестройки, стабильность хромосом и генетический контроль процессов рекомбинации, репарации и репликации у дрожжей и других организмов. Например, в Институте цитологии РАН, Институте молекулярной генетики РАН, Институте молекулярной биологии РАН, Санкт-Петербургском Институте ядерной .физики РАН, ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, на кафедре генетики Московского государственного университета.

Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов"(14зсква, 1990), на конференции "Genetic recorrtoination and genome rearrangements" (Vermont, USA, July, 1091), на VI съезде ВОГИС им. H. И, Вавилова (Минск, 1992) и на

семинаре Отдела генетики БИШИ и кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Структура ¡1иг;£&ртяиии. Диссертация изложена на страницах, она включает рисунков, таблиц, список литературы из наименований. Работа состоит из введения, обзора литературных данных, главы "Материалы и методы", экспериментальной части, состоящей из трех глав, в которых изложены результаты, и главы" "Обсуждение", выводов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исходных использованы штаммы дрожжей ЗассГаготусез сегеу1з1ае:

2А-1В32 МАТа игаЗ 1еи2-2 и-р1-д

Р01+ -ЕМ МАГ« 1у52-Тп5-13 игаЗ 2еи2-2

Ьгр1-.д

ро1Л-0М МАГ* 1уз2-Тп5-13 игаЗ 1еи2-2

1гр1-га ро1!Н

ий-Р01.+ -0М МАТ«» 1уг2-Тп5( №АЗ) игаЗ 1еи2-2

Ьгр1-л

1пзЕ-ГО1^-0М МАТ* 1уз2- 1пзЕ игаЗ 1еи2-2 Ьгр1 -А

1пзП-Р01.+ -0М МАТс* 1уз2- 1ГеО игаЗ 1еи2-2

В работе использовали двухмаркерную челночную плазмиду рШ2 с различными мутантными аллелями гена Плазмида

содержит дрожжевые гены ЬУ32' (в составе фрагмента дрожжевой ДНК длиной 6,9 т.п. о.) и 1_Еи2 (в составе фрагмента длиной 2,2 т. п. о.). Шазмида несет ориджин репликации 2 мкм плазмиды дрожжей в составе малого Есой фрагмента Б- формы и фрагмент бактериальной плазмиди рВ(?322, содержащей бактериальный ориджин репликации и ген тетрациклин-резистентности. О помощью конверсионного переноса с плазмиды на хромосому на основе штамма 2А-0632 был получен итамм ОА, содержащий мутацию 1уз2-8 в хромосомной аллели гена ЬУБ2. Также с помощью конверсионного переноса с плазмиды на хромосому на основе штаммов иуз^-гоС -ОМ

и Lys+ -pol3t-DM были получены штаммы, содержащие в хромосомной

аллели LYS2 мутации lys2-ill и -DM, pol3t-DM, DA, insE-DM, изогенных штаммов, несущих контролирующих репарацию или изогенных штаммов проводили

POL*-

1уг2-АСЕ2. На основе штаммов 1уз2-111-0М были созданы серии мутации в одном из генов, репликацию ДНК. Создание серий методом "одношаговой замены"

хромосомных аллелей соответствующих генов мутантными аллелями генов, контролирующих репарацию или репликацию ДНК, находящимися в составе рестрикционных фрагментов плазмвдной ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Схема эксперимента. Работа посвящена определению эффекта длинных инвертированных повторов Тп5 на гомологичную митотичес-кую рекомбинацию у дрожжей. Бактериальный транспозон Тп5 длиной 5818 п. о. состоит из уникальной части, которая фланкирована длинными инвертированными повторами ДНК длиной 1535 п. о. каждый. Находясь в составе "хозяйского" генома, последовательность транспозона фланкирована короткими прямыми повторами "хозяйской" ДВД-"мишвни" длиной 9 п. о. каждый. Одно из свойств транспозона - его способность к точной зксцизии.из состава генома (при этом делегируется вся последовательность Тп5 и одного из повторов "мишени"). Как предполагают CEgner, Berg, 1981; Sordenln et al., 19923, эксцизия происходит в процессе репликации иа "отстающей" цепи ДНК в результате миграции 3'-конца но-восинтезируемой нити с одного повтора, фланкирующего последовательность транспозона, на другой.

Наш была использована инсерция Тп5 в ген LYS2 дрокией Saccharomyoes cerevislae. Инсерция приводит к нарушению функции гена и к ауксотрофности по лизину штаммов, содержащих такую инсерцмо. В нашей работе CQordenm et al., 1992] была покааана возможность точной эксцизии Тп5 из генома дрожжей, которая приводит к полному восстановлению функции гена LYS2 и происходит с Частотой 0,02x10"*..

Ш изучили гомологичную рекомбинацию с участием различных

мутаятних аллелей LYS2, в том числе содержащих дол Гп5. Рекомбинанты отбирали по восстановлению прототрофности по лизину в митотическом потомстве диплоидов, обе аллели LYS2 которых были нарушены мутациями. Рекомбинанты Lys* в митотическом потомстве диплоидов, содержащих ДИП Тп5, появлялись с частотой > 5х10"<' , значительно превышающей частоту появления ревертантов Lys* в результате экецизии 7п5.

В диссертации также приведены данные, подтверждающие конверсионную природу большинства возникавших в наших опытах ревертантов.

Для определения эффекта инвертированных повторов Тп5 на гомологичную митотическую рекомбинацию мы использовали диплоиды, содержание инсерцию Тп5 (или Tn5(URA3)- модифицированная иисерция транспозона, которая содержит только ДИП Tn5, а центральная часть заменена на дрожжевой ген URA3) в гетероаллельной комбинации с различными мутациями lys2 (рис.1). В качестве контролей без ЛИП использовали диплоиды, содержащие вместо Тп5 мутации, локализованные в том же сайте - insE -инсерция 61 п. о. и insD - инсерция 31 п. о. Эти инсерции возникли в результате неточного вырезания последовательности Tn5(URA3) из LYS2. Они не содержат инвертированных повторов и редко (с частотой <1о"*) ревертируют к фенотипу Lys*. Помимо мутаций, расположенных в том же сайте, мы сравнивали рекомбинационные свойства Тп5 со свойствами других мутаций, в том числе расположенной на расстоянии 94 п. о. от сайта инсерции мутации 1ys2-111 (точковая мутация) и инсерции дрожжевого гена ADE2 в Xhol сайт LYS2 (находится на расстоянии 161 п.о. от сайта инсерции Тп5). Другая аллель lys2 (обозначена "х") несла одну из нижеперечисленных мутаций: точковые мутации, делецию около 2,5 т. п. о. (lys2-25), инсерцию Tyl-элемента около 5,6 т. п. о. (lys2-32). Сравнение рекомбинации в диплоидах, содержащих Тп5, и диплоидах с "контрольными" комбинациями мутаций, не содержащих ДШ1, проводили по двум параметрам: частота гетероаллельной рекомбинации и соотношение классов рекомбинантов. Соотношение классов рекомбинантов определяли в выборке независимо возникших рекомбинантов Lys*'в потомстве диплоидов, выясняя, за счет какого из трех возможных событий возник каждый рекомбинант: конверсии мутации "А", конверсии "х" или реципрокной рекомбинации на участке между ними.

\JiS2 Д: X:

<4*- 1уз2-Тп5-13 1уз2-8

(инсерция 5818 п. о. , 1У52-10 1 точковые

ЛИП - 1535 п. о.) 1уз2-9 1 мутации

1уз2-Тп5(1Л?АЗ) 1уз2-5 [

о-К- (инсерция 4166 п. о., ДИП - 1535 п. о.) 1уз2-33

1уа2-1л5Ё 1уз2-25 — делеция

(инсерция 61 п. о. , 2,5 т. п. о.

нет ДИП)

\ysZ- шэО 1уэ2-32 — инсерция

(инсерция 31 п. о., Ту1-

нет ДИП) 5,6 Т. П. о. ;

1уз2-111 длин. прям.

(точковая мутация) повторы-

1уз2-АСЕ2 330 п. о.

(инсерция 3750 п. о.)

й

Отбор внутригенных рекомбинантов ¡.уз Определение частоты рекомбинации.

1

/Митотическая гомозиготизация., Идентификация типа событий.

-Д-

рис 1. Схема эксперимента

Идентифигсацию типа события проводили, отбирая в митотическом потомстве каждого из Lys+ -рекомбинантов варианты митотической гомозиготизации "скрытой" в гетерозиготе аллели и скрещивая их с тестерами. Отбор гомозигот Lys" проводили на специальной среде с «t-аминоадипиновой кислотой, селектирующей мутанты lys2. На основе штаммов о комбинациями аллелей lys2-Tn5/lys2-8 и lys2-insE/lys2-8 (контроль без ДИП) были получены серий изогенных диплоидов, каждый из которых содержал в гомозиготе мутантную аллель одного из генов, контролирующих репарацию или репликацию ДНК у дрожжей. Изучение эффекта Тп5 на митотическую рекомбинацию на фоне разных мутаций по репликации или репарации позволило нам делать предположения о генетическом контроле рекомбинации с участием Тп5. Изложенный экспериментальный подход позволил нам установить ряд фактов, касавдхся эффеота инвертированных повторов Тп5 на гомологичную рекомбинацию.

Инвертированные повтори Тп5 увеличивают частоту

внутригенной митотической рекомбинации у_лрожхрй. Частоты

рекомбинации в гетероаллелях, содержащих инсерцию Тп5 (или Tn5(URA3),B 5-18 раз превышают соответствующие значения частот в гетероаллелях без ЛИЛ (таблица 1). Достоверное повышение частоты рекомбинации в присутствии последовательности Тп5 наблюдается как в штаммах с аллелью POL3 "дикого типа", так и в гомозиготах по мутации pol3t (при 30"С - температуре, при которой мутация pol3t повышает частоты вырезания Тп5, мутирования. потерь хромосом, и при 20 °С - температура, при которой мутантные признаки pol3t не наблюдают [Gördenin et al., 19911). Данные таблицы 2 позволяют оценить эффект Гп5((Я?АЗ) на рекомбинацию в диплоидах с различными мутациями lys2. В качестве контролей без ДИП использованы изогенные диплоиды с инсершей insE вместо Tn5(URA3). Для всех вариантов гетероаллелей частота рекомбинации в диплоидах с Гп5(URA3) достоверно превышает частоту рекомбинации в дипломах без ДИП Тп5. Это означает, что рекомбиногенной структурой Тп5 являются его ДИП, гак гак центральная часть Тп5 полностью заменена в Tn5(URA3).

_Инсерпии. содержащие длинные инвергиЬованнне повторы Тп5. конвертируют к последовательности "дикого типа" чате других мутаций Iys2. Рекомбинанты Lys* , возникше в митотическом потомстве диплоидов с инсерцией Tn5(URA3), анализировали по

-10-

Таблица 1

Эффект Тп5 на межхромосомную митотическую рекомбинацию

Комбинация аллелей ¿У52 ■ ^ Частота рекомбинации х 10

. к 20 » Ро1 20е 30°

. Т^-13 о-х— 8 44,5 (34,2-70,3) 64,3 (29,7-98,9) 29,5 (18,9-33.5) 406,9 (222,6-410,4)

Тп^ШАЗ) о-х- 8 56,0 (50,0-68,0) 44,0 (31,6-98,9) - -

о1"? О-X— 8 5 5 (3,0-8,9) 8.4 (4,7-17,7) 5,1 (3,4-10,4) 60,0 (18,4-61,8)

0-X— 8 3,1 (2,1-3,8) 8.9 (3.5-10,0) 4,6 (4.2-12,9) 36.3 (17,5-71,4)

А^г О-X- 8 6,1 (3,0-7,5) 7,9 (3.3-9,6) 4.8 (2.8-6,1) 19,3 (10,8-27,1)

Приведены значения частот• рекомбинации на клеточную генерацию, определенные во флуктуационном тесте с использованием 10-16 независимых культур, и 957. доверительные интервалы (в скобках).

способности к росту на среде без урацила (таблица 2). Во всох гетероаллелях большинство рекомбинантов обладало фенотипом Lys* lira" , то есть, по-видимому, возникло вследствие конверсии Tn5(URA3). В гетероаллелях, содержащих Тп5 в комбинации с мутациями lys2-10 (точковая) и lys2-25 (делеция), большинство рекомбинантов [.уз'содер.тало в гетерозиготе мутации. 1уз2-10 или lys2-25, соответственно (таблица 3) и наиболее вероятно возникло в результате конверсии Тп5. Преимущественную конверсию Тп5 наблюдали и в кашах P0L3, и в гомозиготах по мутации роХЭ-t. Превышение числа конверсия Тп5 над числом конверсия другой мутации было б-ти - 18-ти-кратным. Доля ревертантов, возникших в результате конверсии мутации lys2-10 (или lys2-25), била достоверно меньше (fj,.<0,001) в диплоидах, содержащих Тп5, чем в соответствующих диплоидах без Тп5. Подобным свойством -чаще всех или большинства других мутаций конвертировать к последовательности "дикого типа" - не обладала ни одна из исследованных нами мутаций 1уз2, кроме инсерции Тп5.

Генетический контроль- гомологичной рекомбинации с участием, мутантной аллели, содержащей инсерцию Гп5. Мы сравнили частоты рекомбинации в гетероаллелях lys2-Tn5/lys2-8 и lys2-insE/lys2-8 в диплоидах, мутантных по различным генам, контролирующим репарацию или репликацию ДНК. и в диплоидах "дикого типа", (таблица 4). Нами не было noitasano достоверного эффекта мутаций radl, rad6 и radl8 на рекомбинацию с участием Тпб. Эффект мутаций radSO и rad52 в генах, контролирующих рекомбинационную репарацию у дрожжей, обсувдается в диссертации. Мутация po13t (в гене,контролирующем синтез ДНК-полимеразысГ) повышает частоту рекомбинации и в гетероаллели, содержащей Тп5, и в гётероаллели без ДШ Тпб. Мутация ро12-1 в гене, контролирующем синтез дрожжевой ДНК-полимераэы £,, обладает специфическим эффектом на Тп5-зависимую рекомбинацию. Эта мутация повышает частоту рекомбинации только в гетероаллели, включающей инсерцию Тпб. Большинство Lys*- рекомбинантов, отобранных в разных изогениых гетероаллельных диплоидах lys2-Tn5/lys2-8, возникло в результате конверсии Тпб (данные приведены в диссертации).

Гипотеза о причинах рекомбиногенности ДШ Мы предполагаем, что рекомбиногеиный эффект Тп5 на митотическую рекомбинацию

Таблица 2

Анализ митотической рекомбинации мутаций lys2 с инсерадей Tn5 (URA3)

Аллель LYS2 Рекомбинация с:

Tn5 (URAS) insE

частотах! Cf фенотип рекомбинантов частотахЮ"

Ura" Ura*

lys2-10 13,0 (8.5-18,9) 110 7 .2.0 (1,2-3,1)

lys2-9 23,2 (11,6-55,2) 117 11 2.6 (1,7-5,1)

lys2-33 7.5 (5.4-10,7) 81 32 2 2 (2,0-3.5)

lys2-8 44.0 (31,6-48.2) 65 35 8,4 (4,7-17,7)

lys2-5 28,2 (9.5-39,2) 91 34 5,6 (5,0-6,6)

lys2-25 9.0 (4.6-10,5) 104 11 0,8 (0,05-1,9)

lys2-32 16 2 (9.4-16,0) 106 16 4.0 (2,4-5.5)

Приведены значения частоты рекомбинации на клеточную генерацию, определенные Во флуктуационном тесте с использованием 10-20 независимых культур и 957. доверительные интервалы (в скобках). Все соотношения lira': Ura* достоверно (Р«, <0,0/ ) отличаются от 1:1.

Таблица 3

Преимущественная конверсия Тп5 в митотической внутригенной рекомбинации

Комбинация аллелей Генотип рекомбинантов

Р01.+

а/+ +/Ь а/+ +/Ь

10 —*-а -2__ь Тп5-13 178 24 216 12

10 —*-а -X— Ь 18 72 48 76 27

25 -А- а -*- ь Тп5-13 89 7 100 15

25 -Л- а —*- ь 10 142 55 89 97

Таблида 4

Митотическая рекомбинация у мутантов по репарации и репликации да

Частота рекомб. х104 в гетероаллелях ЬУБ2

• 1пзЕ п V? Тп5-13 111

РАО, ИХ генотип

8 3 8

Р01? Шг 8.4 (4,7-17,7) 64,3 (20.7-98,9) 15 9 (8,7-20,1)

гай1 6,7 (5.8-14,8) 29,0 (15,1-30,0) 14,1 (11,7-19,3)

гайб 44,1 (35,4-59,2) 91,4 (63,9-156,4) 36,4 (31,8-46,7)

гас118 20,5 (14,7-21,9) 48,5 (25,2-122,5) 19.8 (12,1-39,4)

гас!50 42 9 (33,7-49.8) 192,7 (71,5-287,3) 54,3 (30,0-82,5)

ро12 10.6 (5.7-14.2) 322,7 (180,0-324,0) 9,8 (6.3-10,6)

гай52 0.31 . (0,19-0.44) <0,01 0,15 (0,12-0,23)

ро131 50,0 (18,4-61,8) 406,9 (223.6-410,5) 32,0 (26,2-33,8)

Приведены значения частоты рекомбинации на клеточную генерацию, определенные во флуктуационном тссте с использованием 10-20 независимых культур, и 95Х доверительные интервала (в скоб! оО.

обусловлен особыми свойствами последовательностей ДНК, содержащих инвертированные повторы. Таким свойством может быть способность к образованию вторичной структуры ДНК в результате спаривания инвертированных повторов между собой. Наиболее вероятно это будет происходить в однонигевых участках ДНК, которые могут образовываться при репликации. Мы предполагаем, что у мутантов pol Ж. возникают! большие районы однонитевой ДНК, что приводит к повышению частоты образования таких структур, и следовательно,к увеличению вероятности различных связанных с Тп5 рекомбинацконных процессов. Вторичная структура ДНК может быть препятствием для прохождения репликации ДНК, вызывать ее торможение. Как предполагает ряд авторов, репликация может быть продолжена в результате "проскальзывания", переносящего 3'-конец новосинтезируемой нити к комплементарной последовательности ДНК, расположенной с другой стороны от "тормозящей" репликацию вторичной структуры. Это приведет к исчезновению (вырезанию) всей последовательности транспозона и одного из двух фланкирующих повторов .ДНК-"мишени" (рис.2, вариантВ). Ранее ми показали, что мутация ро12 блокирует Еырезание Tn5 [Gördenin et al. , 1992].

Mu предполагаем, что другим вариантом "обхода" репликацией вторичной структуры ДНК может быть временное переключение. синтеза ДНК на матрицу гомологичной последовательности или другая форма гомологичной рекомбинации, что приводит к конверсии Тп5 (рис.2, вариант А). Мы предполагаем, что этот вариант реализуется чаще, если блокировано вырезание Тп5. С этим предположением согласуются регистрируемые эффекты мутации ро12: блок вырезания Тп5 и индукция Тп5-зависимой гомологичной рекомбинации, наблюдаемая в наших опытах.

Надвигаемая нами гипотеза предполагает, что при торможении репликации может произойти- переключение с синтеза ДНК на гомологичную рекомбинацию. Общегенетическое значение

возможности такого переключения, например, для объяснения природы "горячих точек" и возможных пусковых механизмов мейотической рекомбинации, для понимания роли репликации в инициации различных рекомбинационных процессов обсуждается в диссертации. Наш работа дает основания предполагать, что в результате своей рекомбиногенности ДИП могут являться

■SB.

POLS

/ \

РЕКОМБИНАЦИЯ С ГОМОЛОГОМ ВЫРЕЗАНИЕ

Рисунок 2. Возможные последствия торможения репликации вторичной структурой, образуемой длинными инвертированными повторами тпэ.

Изображена вторичная структура - "стебель-петля", образованная ДИП при рзшшкации. Рост цепи ДНК на 3>-конце (односторонняя стрелка) останавливается в основании "стебля" на коротком (9 п.о.) повторе "мишени" 1пъ (толстые линии).

а - "свободннй" 3' -конец инициирует рекомбинацию с гомологичной последовательностью ДНК|

в - 3'-конец "проскальзывает", спаривается с другим повтором "мишени" и служит "затравкой" для продолжения репликации.

потенциальным дестабилизирующим фактором геномов высших зукариот, содержащих большое количество длинных прямых и инвертированных повторов.

ВЫВОДЫ

1. Длинные инвертированные повторы бактериального траиспоэона Тп5 увеличивают частоту митотической гомологичной рекомбинации в окружающей Тп5 последовательности ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.. Инсерция Тп5,содержащая длинные инвертированные повторы, конвертирует к последовательности "дикого типа" чаще точковых мутаций, делеций и инсерций в дрожжевом гене LYS2.

3. Мутация в структурном гене -ДНК-полшераэы ¿-ро12-1, блокируют*« вырезание Тп5, стимулирует гомологичную рекомбинацию с участием содержащей инсерцию Тг.5 аллели дрожжевого гена LYS2.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИЙ ОПУБЛИКОВАНЫ ПЕЧАТНЫЕ РАБОТЫ

Горденин Д, А.. Просцявичус Ю. й., Малкова А. Л. Маркер-эффект инсерций бактериального транспозона Тп5 при внутригенной рекомбинации у дрожжей.

УИ Ьсесооздай симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 20-23 марта 1990 : Тез. докл., М. , АН СССР,

1990, стр. 214-215.

Gordenin D. А., Proscyavichus Y. Y. , Malkova A. L. , Trofimova M.V., Petersen A. Yeast mutants with increased bacterial transposon Tn5 excision.// Yeast. -1991. -v. 7. -p. 37-50.

Gordenin D.A. , Malkova A.L., Petersen A., Kulikov V.N. , Pavlov Y. I., Perkins E., Resnlck M. A. Transposon Tn5 excision in yeast: the influence of DNA polymerase<*, and repair genes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. -v. 89. -p. 3785-3789.

Gordenin D, A., Malkova A. L. , Pavlov Y. I., Perkins E.. ResnickMA. Transposon Tn5' excision and conversion in yeast; the influence of DNA polyimrase oi , cf , & and repair genes. In: FASEB Summer Research Conference "Genetic Recombination and Genome Rearrangements", July 28 - August z,

1991, Snxtons River, Vermont, USA, p. 52.

t>