Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурной нестабильности генома дрожжей Saccharomyces cerevisiae, индуцированной инвертированными повторами

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурной нестабильности генома дрожжей Saccharomyces cerevisiae, индуцированной инвертированными повторами"

1 7 ОКТ

пгг Л П

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

Лобачеп Кирилл Станиславович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ Б А ССНА ЛОМ УСЕБ СЕЯЕУ181АЕ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ИНВЕРТИРОВАННЫМИ ПОВТОРАМИ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Д.А.Горденин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.А. Ланцов

доктор биологических наук Т.Р. Сойдла

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

" Иолъ/'^ 1996 г. в Ж-

Защита состоится _1996 г. в ^ час, на заседании

Диссертационного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности "Генетика" в Санкт-Петербургском государственном университете ( 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, кафедра генетики и селекции, ауд.№ 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан ^

»¿гич^г^

,, 2! » Тм/л 1996 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повторяющиеся последовательности ДНК в геноме про- и эукарнота создают основу для структурной изменчивости наследственного материала. Генетическая рекомбинация между повторами ДНК, расположенными в эктопической позиции, приводит к хромосомным перестройкам -делениям, трансяокаииям, инверсиям, дупликациям, и тем самым обеспечивает онтогенетическое и эволюционное преобразование генома. Поиск и изучение свойств "горячих точек" хромосомных аберраций представляется важным для понимания механизмов клеточной дифференциации и видообразования, прогнозирования и диагностики наследственных и раковых заболеваний.

"Горячие точки" возникновения делений в геноме про- и эукариот характеризуются наличием инвертированных повторов (ЕгНсЬ й а1. 1989, МеиШ, 1989). Свойство инвертированных повторов стимулировать делеции связывают с их способностью к комплементарному спариванию и формированию вторичной структуры типа "шпильки", репликативное проскальзывание по коротким прямым повторам в основании которой приводит к образованию деяеций. У дрожжей длинные инвертированные повторы (ДИП) стимулируют не только делеции бактериального транспозона Тп5 (точное и неточное вырезание), но и митотическую гомологичную рекомбинацию, в последовательности, прилежащей к ДИП (Оогс1ешп И а1. 1993). Насыщенность генома высших эукариог повторяющимися последовательностями, значительная часть которых находится в инвертированной ориентации, делает изучение свойства ДИП индуцировать гомологичную рекомбинацию особенно важным для понимания механизмов инициации хромосомных перестроек . Мы предполагаем, что способность ДИП индуцировать эктопическую рекомбинацию в дрожжевом геноме может свидетельствовать о потенциальной структурной нестабильности участков генома высших эукариот, содержащих инвертированные повторы. Настоящая работа посвящена изучению влияния инвертированных повторов на эктопическую -межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию у дрожжей 5. сешкше и определению структурных параметров рекомбиногенных инвертированных повторов.

Задачи работы.

1. Изучение влияния длинных инвертированных повторов транспозона Тп5 и инвертированных иЯАЗ-повторов на эктопическую - межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию у дрожжей 5. сегеУ151ае.

2. Изучение влияния длины инвертированных повторов и спейсера между ними на способность инвертированных повторов стимулировать делении и эктопическую рекомбинацию.

3. Изучение роли репликации в индукции делеций и эктопической рекомбинации длинными инвертированными повторами.

Научная новизна полученных результатов. При исследовании реком-бинационных свойств длинных инвертированных повторов в геноме дрожжей мы впервые показали:

1. Длинные инвфтированные повторы стимулируют эктопическую - межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию. При этом происходит индукция как конверсии, так и кроссинговера, приводящего к транслокациям и протяженным делениям.

2. Индукция эктопической рекомбинации не зависит от последовательности инвертированных повторов: инвертированные повторы, сконструированные из последовательностей гена ТЖАЗ, также как и инвертированные повторы транс-позона Тп5 - "горячая точка" эктопической рекомбинации.

3. С уменьшением длины инвертированных повторов и с увеличением расстояния между ними уменьшается частота делеций инвертированных повторов и частота ДИП-индуцированной эктопической рекомбинации.

4. Ориджин репликации, помещенный между инвертированными повторами, приводит к снижению частоты делеций инвертированных повторов и ДИП-индуцированной рекомбинации, что свидетельствует в пользу репликативного механизма нестабильности инвертированных повторов.

Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в диссертационной работе результаты свидетельствуют о потенциальной нестабильности участков эукариотического генома, содержащих инвертированные повторы. Обнаруженные нами закономерности следует, учитывать при анализе структуры и эволюции геномов, содержащих большое число повторов; выявлении механизмов клеточной дифференциации; анализе наследственных и раковых заболеваний у человека, вызванных хромосомными аберрациями; конструировании рекомбинантных молекул и манипуляциях с искусственными хромосомами. Кроме того, полученные в нашей работе данные, свидетельствующие о взаимодействии участков ДНК, способных формировать вторичные, структуры, процессов репликации и рекомбинации в контроле стабильности дрожжевого генома могут быть использованы для построения рекомбийационных моделей и выяснения механизмов инициации рекомбинации в эукариотической клетке.

Материалы и экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы для чтения лекций по курсам "Молекулярные механизмы рекомбинации" , "Структура и функция ДНК'', "Цитогенетика", "Мутационный процесс" на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета и в других научных и образовательных институтах, изучающих проблему стабильности генома, молекулярные механизмы рекомбинации и репликации.

Апробация работы, Результаты работы были представлены на симпозиуме "Структура и функций клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993), 1 съезде Вштловского общества iеиетнков и селекционеров (ВОГИС) (Саратов, ¡994), конференциях "Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting" (Seattle, USA, 1994; Madison, USA, 1996), "Genetic Recombination and Genome Rearrangements" (Snowmass Village, USA, 1995), "Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination" (Taos, USA, 1996), на семинарах лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ и лаборатории молекулярной генетики Национального института здоровья окружающей среды (США).

Объем и структура диссертации-Диссертация изложена на 155 страницах и содержит 33 рисунка и 23 таблицы. Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка литературы, содержащего !43 ссылки на научные публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей В работе были использованы следующие гаплоидные штаммы дрожжей:

МАТа lys2::Tn5-I3 ura3-x teu2-2 trpl-Al МАТа lys2::Tn5-I3 ura3-x lcu2-2 tip/-41 po!3-t МАТа lys2::insE ura3-x Ieu2-2 trp 1-ДI МАТа Iys2:rinsE ura3-x leu2-2 trp f-Д 1 pol3-t МАТа lys2::ura3-ir-ADE2 ura3-A !eu2-2 t'rpl-Al ade2-A МАТа lys2::ura3-dr-ADE2 игаЗ-Д !eu2-2 trpl-Д! ade2-A MATa lys2::ura3-solo-ADE2 игаЗ-Д 1еи2-2 trpl-Al ade2-A

Штамм POL+-DM содержит инерцию бактериального транспозона Тп5 в BamHl-Xhol районе гена LYS2, фланкированную прямыми повторами

POL+-DM

pol3-t-DM

K27-POL+-DM

K27-pol3-t-DM

Т105

IR28

IS27

длиной 9 п.о. Инвертированные повторы Tn5 - IS50 - имеют длину 1535 п.о. и находятся на расстоянии 2750 п.о. друг от друга. Штамм K27-POL+-DM содержит в гене LYS2 инсерцию длиной 61п.о., локализованную в той же точке, что и транспозон Тп5. Кроме того, штаммы POL+-DM и K27-POL+-DM несут точко-вые мутации 1еи2-2 и игаЗ-х, что позволяет использовать их в качестве реципиентов для интеграции плазмид, содержащих гены LEU2 и URA3, в III и V хромосому (Рис. 1.А). Эти штаммы были использованы для интеграции мутантных копий гена LYS2 и для последующего изучения влияния длинных инвертированных повторов транспозона Тп5 на эктопическую рекомбинацию, (см. раздел "Экспериментальная система"). Штаммы pol3-t-DM и K27-pol3-t-DM изогенны штаммам POL+-DM и K27-POL+-DM соответственно и содержат мутацию в гене POL3, кодирующим ДНК-полимеразу 8 дрожжей.

Штаммы Т105, IR28, IS27 несут инсерции мутантных копий гена URA3 - ura3-Nco (1, 2 т.п.о.) и гена ADE2 (2,2 т.п.о.) в Xhol сайте гена LYS2; при этом штамм Т105 содержит инвертированные повторы игаЗ-Nco, разделенные геном ADE2, штамм IR.28 -прямые повторы игаЗ-Nco и ген ADE2 между ними, штамм IS27 - одиночную инсерцию игаЗ-nco и гена ADE2. Наличие точковой мутации 1еи2-2 в этих штаммах позволяет интегрировать в III-хромосому плазмиды, содержащие маркерный ген LEU2. (Рис. 1.В) Штаммы Т105, IR28, IS27 были использованы для интеграции аллели Iys2-del3' и для последующего изучения влияния длинных инвертированных повторов гена URA3 на эктопическую рекомбинацию (см. раздел "Экспериментальная система").

Плазмиды. Интегративные плазмиды p34L28, p34L3, p34L5 сконструированы на основе плазмиды pFL34 (Bonneaud et al., 1991) и содержат мутантные аллели гена LYS2: lys2-8, Iys2-del5', Iys2-del3' соответственно; дрожжевой ген URA3; бактериальный ориджин репликации; ген ампицшшн-резистентносги. Для интеграции использовали следующие мутантные аллели гена LYS2: lys2-8 -точковая мутация в 5' районе гена LYS2, локализованная на расстоянии 600-800 п.о. от сайта инсерции транспозона Tn5; Iys2-del5' -5' концевая делеция гена LYS2 до сайта Xhol; Iys2-del3'- 3' концевая делеция гена LYS2 до сайта BamHl (Рис. 2Л). Интегративные плазмиды p26L28 и p26L5 несут мутантные аллели lys2-8, Iys2-del3' соответственно и являются производными плазмиды pFL26, маркированной дрожжевым геном LEU2 (Bonneaud et ai., 1991) (Рис. 2.B). Плазмиды p34L28, p34L3, p34L5 и p26L28, p26L5 были использованы для интеграции мутантных аллелей гена LYS2 в штаммы POL+-DM, K27-PÖL+-DM, pol3-t-DM, K27-pol3-t-DM.

А

1S50 1534 ц.и- 2750 п.в. 1S30 1534 П.Н.

Тп 5 «й--—-С» «¡3°

insE

9пд 9 пл.

35 а а

6 п а. 6 п.н. сайтивсера

EcoRI xhot Ваш HI НпкШ

lys2

=0>--О

v

игаЗ-х

— — — — — )( |> — -Ф ш

1еи2-2

В

Инвертированные повторы игаЗ-Nco

ura-3-Nco LI т.пм. АТ)Е2 2.2 г.и,к ипЗ-Nco 1Л т.п.н.

„ 4 п.н. 4 n н. Прямые повторы игаЗ-Nco

игаЗ-Nco 1.1 т.п.н. ADE2 2-2 т.п.н. uni3-Noo 1.1 т.п.н.

-К-

Одиночная

последовательность 4 п.н. 4п.м.

ura3-Nco

ur»3-Noo 1.1 т.п.и. ADE2 2.2 т.п.н.

4 п.н.

4 п.н.

сайт инсерции

г инсерци!

»I- -Фп

Xbol BemHl Hind III

lys2

leu2-2

Рис.1, Структура сайтов для интеграции плазмид, несущих мутантные аллели гена LYS2, в штаммах, использованных в работе.

А - Штаммы для изучения влияния длинных инвертированных повторов транспозона Тп5 на эктопическую рекомбинацию. Показаны структура и локализация инсерций транспозона Tn5, insE в BamHl-Xhol районе гена LYS2 и сайты интеграции плазмид в хромосомы III и V (локусы LEU2 и URA3)

В - Штаммы для изучения влияния длинных инвертированных повторов игаЗ-Nco на эктопическую рекомбинацию. Показаны структура и локализация инсерций инвертированных повторов, прямых повторов и одиночной инсерции игаЗ-Nco в Xhol сайте гена LYS2 и сайт интеграции плазмиды p26L5 в хромосому III (локус LEU2).

II

А

ort

'URA3

PFL34

ЗТЯ&пя.

Amp'v

X 1

Xhol ВшаШ ИшСП

lys2-8 —I—I

p34L28

p34L5

< p26L28

BunHl Xbol ErolUHbdlll

lys2-8 1—1-

-H p26L5

ВжшШ EaoRJ Xhol ВшяЮ

Iys2-del3'

I—I—

Ва&Ш Xhol BeoRI Banlfl

Iys2-del3'

Xbol BanHI НщШ1ХЬ>1

Iys2-del5'

p34L3

Рис.2. Плазмиды, использованные для интеграции мутантных аллелей гена LYS2, в штаммы-реципиенты

А - Плазмиды p34L28, p34L5, p34L3 для интеграции аллелей Iys2-8, Iys2-del3', lys2-del5' соответственно в хромосомы II и V штаммов-реципиентов. В - Плазмиды p26L28 и p26L5 для интеграции аллелей lys2-8 и Iys2-del3' в хромосомы II и III штаммов-реципиентов.

Плазмида p26L5, кроме того, была использована для интеграции аллели lys2-de!3' в штаммы Т105, IR28, IS27 (см. раздел "Экспериментальная система"). В работе также были получены серии плазмид:

- плазмиды, содержащие инвертированные повторы IS50 длиной 185, 323, 485, 745, 1115, 1515 п.о. и разделенные спейсером длиной 1,2 т.п.о. (дрожжевой ген URA3)

- плазмиды с варьирующей длиной спейсерного участка: 1,2; 3,5; 5,0; 8,4 т.п.о. между инвертированными повторами транспозона Тп5 (1515 п.о.).

- плазмиды с модифицированным транспозоном Тп5, спейсерная область которого содержит функциональную или мутзнтную ARS 1 последовательность.

Конструирование и структура этих плазмид подробно описаны в диссертационной работе.

Генетические и молекулярно-биологические методики. культивирование дрожжей и бактерий . приготовление сред проводили согласно руководствам

Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986; Sambrook et al., 1989. Оригинальные и редко применяемые методы приведены в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная система. Для изучения влияния длинных инвертированных повторов (ДИГТ) на эктопическую рекомбинацию мы использовали гомологичные последовательности мутантных аллелей гена LYS2, локализованные в одной и той же хромосоме - при изучении внутрихромосомной рекомбинации, или в негомолопгпшх хромосомах - при изучении межхромосомной рекомбинации. При этом, одна из аллелей lys2 содержала инсерцию длинных инвертированных повторов (транспозона Тп5 или инвертированных 1ЖАЗ-повторов), которая приводила к инактивации функции гена LYS2. Другая аллель lys2, локализованная в эктопической позиции, была представлена одной из мутантных аллелей lys2-8, Iys2-del3' или Iys2-del5'. Частоту эктопической рекомбинации определяли как частоту возникновения прототрофных по лизину клонов в мито-тическом потомстве штаммов, содержащих такие гетероаллельные комбинации. Эффект длинных инвертированных повторов на эктопическую рекомбинацию оценивали, сравнивая частоты появления Lys+ рекомбинантов у штаммов, несущих инвертированные повторы в одной из копий гена LYS2' и конгрольных штаммов, у которых вместо инсерции инвертированных повторов в гене LYS2 находилаа?.инсерция без ДИП.

Интеграцию мутантных аллелей гена LYS2 в эктопическую позицию проводили следующим образом. Щтаммы POL+-DM с инсерцией транспозона Тп5 в гене LYS2, и штамм K27-POL+-DM, содержащий "контрольную" инсер-, цию insE, трансформировали интегративныии плазмидами p34L28, p34L3, p34L5 (Рис. 2.А). Так как эти плазмиды имеют две последовательности гомологичные генам LYS2 и URA3, возможны два варианта интеграции в результате одиночного обмена при .гомологичной рекомбинации между плазмйдной' и хромосомной ДНК. Если кросеинговер произойдет между последовательностями lys2 плазмидй и хромосомы, то lys2-noBTopbi окажутся в -одной хромосоме (хромосоме II), разделенные последовательностью плазмиды и маркерным геном URA3 (Рис. З.А). Такие трансформанты были отобраны для изучения внутри' хромосомной рекомбинации между повторами LYS2.

Если кроссинговер между плазмидой и хромосомой произойдет в последовательности гена URA3, тодваггбвтора гена LYS2 окажутся локализованными в разных хромосомах: 1у$2-аллель, содержащая инсерцию, - в хромосоме П;

интегрируемая 1у$2-аллель - в хромосоме V. Такие трансформанты были использованы для изучения эктопической рекомбинации между хромосомами II и V (Рис. 4.В). Аналогичным образом в результате кроссинговера в последовательности гена ЬЕШ в хромосому V штаммов Р01/ЧЭМ и К27-РОЬ+-ЮМ были интегрированы аллели 1ув2-8 и 1уз2-<1е13' в составе плазмид р26Ь28 и р26Ь5.

А

UHA3

II»

IjílíIbS

ига 3-х

В

<Tj

V. URA3 У

v^H

иг« 3-1

-Й-.—

II •-

lyii:Tnj

II»-

il

lyjZiTiS

lytí-8

VO^M^Nwvt/w1 Tirt 3-1

внутрихромосомная рекомбинация

П

JL

=С«лл

Ъ/ПЛчЬ

межхромосомная рекомбинация

Рис.3. Схема интеграции плазмид, несущих мутантаые аллели гена LYS2, в эктопическую позицию. В качестве примера показана интеграция плазмиды p34L28 в штамм, содержащий инсерцию ДИП транспозона Тп5.

А -Интеграция в хромосому II. Кроссинговер между плазмидной и хромосомной копиями гена LYS2 приводит к интеграции аллели Iys2-8 в хромосому И, что позволяет изучать внутрихромосомную рекомбинацию с участием ДИП. В - Интеграция в хромосому V. Кроссинговер между плазмидной и хромосомной копиями гена URA3 приводит к интеграции аллели lys2-8 в хромосому V, что позволяет изучать межхромосомную рекомбинацию с участием ДИП.

Для изучения влияния длинных инвертированных повторов URA3 на эктопическую рекомбинацию в штаммы Т105 (инсерция инвертированных повторов игаЗ-Nco в гене LYS2) и контрольные штаммы IR28 (инсерция прямых повторов игаЗ-Nco), 1827(оданочная инсерция игаЗ-Nco) была интегрирована аллель Iys2-del3\ что позволило получить 1уз2-гетероаллели, либо расположенные в одной хромосоме (хромосоме II) и разделенные маркерным геном LEU2, либо в разных хромосомах (хромосомах II и V).

Мы изучали рекомбиногенный эффект инвертированных повторов в штаммах с аллелью гена POL3 дикого типа (РОЬ+-штаммов) и у температуро-чувствтительных мутантов pol3-t.

С помощью экспериментальной системы, описанной выше, нам удалось показать, что длинные инвертированные повторы - "горячая точка" хромосомных перестроек у дрожжей и выяснить ряд закономерностей, связанных с рекомбиногеиным эффектом ДИП.

Длинные инвертированные повторы стимулируют эктопическую -межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию. Длинные инвертированные повторы гранспозона Тп5, локализованные в хромосоме II. индуцируют эктопическую рекомбинацию между хромосомами И и V в последовательности гена LYS2 (Таблица 1). Частоты рекомбинации в гетероаллелях с Тп5 в 2-10 раз выше частот рекомбинации в гетероаллелях с insE как в штаммах POL+, так и в штаммах pol3-t.

Таблица 1

Эффект длинных инвертированных повторов Тп5 на межхромосомную эктопическую рекомбинацию

POL генотип lys2-гетеро-аллель Iys2-Tn5 (xpc. II ) lys2-insE (xpc. II )

частота рекомбинации xlO"7 кроссин-говер,% частота рекомбинации xlO-7 крогсин-говер,%

POL+ Iys2-del5' (xpc.V) 9.4 (8.6-13.2) 5.1 [6/117]* 2.3 (1.1-2.9) 4.8 [4/83;

Iys2-del3' (xpc.V) 21.7 (13.7-50.5) 5.0 [6/1191 3.6 (2.4-4.0) 1 1.7 l_i!3/!]Jl

lys2-8 (xpc.V) 22.7 (19.9-26.0) 7.3 [7/961 11.1 (9.7-12.2) 13.2 П 3/98)

pol3-t Iys2-del5' (xpc.V) 91.7 (82.9-109.6) 7.8 [9/116] 8.6 (6.6-12.8) 6.4 [9/139]

Iys2-del3' (xpc.V) 104.4 (92.7-122.9) 7.6 [10/120] 12.1 (11.4-20.0) 12.i fl 3/991

lys2-8 (xpc.V) 343 (192.4-399.8) 7.6 [9/1181 60.0 (47.6-68.2) 12.8 Г15/П81

Приведены медианные значения частот рекомбинации на клеточную генерацию среди 12-18 независимых культур и 95% доверительные интервалы (в круглых скобках) *-В квадратных скобках указано число кроссоверных Ьув* рекомбинантов по отношению к общему числу проанализированных Ьув^ рекомбинантов

Процент кроссоверных Ьу8+-рекомбинантов варьирует в пределах от 5 до 13 процентов для разных гегероаллелей и сильно не изменяется в зависимости от

того, содержат рекомбшшрующие 1у$2-повторы инсерцшо ДИП или инсерцию ¡пвЕ. Однако, частоты рекомбинации в гетероаллелях с Тп5 достоверно выше частот рекомбинации в гетероаллелях с пкЕ. Этот факт указывает на то, что длинные инвертированные повторы, по-видимому, оказывают влияние на стадию инициации рекомбинации и стимулируют как конверсию, так и кроссинго-вер. Результатом кроссинговера являются транслокации между хромосомами II и V. Эффект ДИП Тп5 на межхромосомную рекомбинацию не зависит от локализации рекомбинирующих последовательностей гена - ДИП Тп5 индуцируют также рекомбинацию между 1уз2-повторами, расположенными в хромосомах П и III (данные приведены в диссертационной работе).

Рекомбиногенный эффект ДИП на межхромосомную рекомбинацию не зависит от нуклеотидной последовательности инвертированных повторов. Инвертированные повторы игаЗ-Ысо стимулируют рекомбинацию между хромосомами II и Ш в 8-9 раза в штаммах с аллелью гена РОЬЗ дикого типа и в 23-24 раза у мутантов ро13-1 (Таблица 2).

Таблица 2

Эффект инвертированных ХЖАЗ-повторов на эктопическую межхромосомную

рекомбинацию

РОЬ генотип 1уБ2-гетероаллель 1уэ2-с1е13' (хрс. III)

частота рекомбинации хЮ*7

РОЫ- 1уз2::ига31г-АОЕ2 (хрс. II) 4.7 (3.9-6.4)

1у82::игаЗёг-АОЕ2 (хрс. II) 0.6 (0.4-0.8)

1у52::ига35о1о-АВЕ2 (хрс. П) 0.5 (0.4-0.7)

ро13ч 1у52::ига31г-АОЕ2 (хрс. II) 74.4(6.5-96.1)

1у82::игаЗ<1г-АОЕ2 (хрс. II) 3.1 (1.9-4.5)

1 у 52::ига 3 во! о-АО Е2 (хрс. II) 3.2 (2.5-5.3)

!

~; Приведены медианные значения частот рекомбинации на клеточную генерацию среди 12-18 независимых культур, и 95% доверительные интервалы (в скобках)

Мы также обнаружили, что инвертированные повторы транспозона Тп5 и инвертированные повторы, сконструированные из последовательностей гена ЦКАЗ, стимулируют при внутрихромосомной рекомбинации как конверсию, так и кроссинговер, который приводит к протяженным делециям (данные приведены в диссертационной работе).

Полученные экспериментальные данные демонстрируют, что длинные инвертированные повторы стимулируют эктопическую - внурихромосомную и межхромосомную - рекомбинацию и тем самым вызывают структурную неста-

билъность генома дрожжей. Специфический эффект мутации ро134 на ДИП-индуцированную рекомбинацию предполагает участие аппарата репликации в инициации хромосомных перестроек. Как было показано ранее, мутация ро!3-1 индуцирует перестройки генома дрожжей с участием длинных инвертированных повторов Тп5 и в результате другого механизма - делеций по коротким прямым повторам, расположенным в основании ДИП (ОопЗепт е! а!., 1989). Это свидетельствуют о возможном едином механизме инициации различных ДИП-зависимых перестроек генетического материала и позволяет предложить следующую модель нестабильности инвертированных повторов (Оогёегип а. а!., 1993). Длинные инвертированные повторы могут комплементарно спариваться и формировать вторичную структуру типа "шпильки", которая служит препятствием для синтеза ДНК. Наиболее вероятно формирование вторичной структуры при синтезе отстающей нити, где присутствуют протяженные участки одно-нитевой ДНК и может быть облегчено взаимодействие инвертированных повторов. Продолжение синтеза ДНК возможно за счет миграции З'-конца вновь синтезированной нити с одного прямого повтора на другой в основании вторичной структуры, что приводит к вырезанию инвертировавнных повторов. Альтернативный вариант продолжения репликации после торможения в основании "шпильки" - переключение синтеза ДНК на матрицу гомолога, что приводит к инициации гомологичной рекомбинации (Рис. 4.)

А

В

О

ЛИП

о

ДИП

лип

...52

ЬЭ-^

«-

3'

Рис.4. Модель инициации хромосомных перестроек инвертированными повторами. А - Образование делеций в результате репликатнвного проскальзывания по коротким прямым повторам в основании ДИП.

В - Инициация гомологичной рекомбинации в результате торможения репликации в основании вторичной структуры.

Данная модель хорошо согласуется с экспериментальными данными о влиянии мутации pol3-t на частоту вырезания транспозона Тп5 и ДИП-индуцированной рекомбинации. Как предполагают по одной из моделей репликации ДНК у дрожжей, ДНК-полимераза 8, кодируемая геном POL3, ответственна за синтез отстающей нити ДНК. Мутация pol3-t может приводить к нарушению синтеза отстающей нити и образованию протяженных участков однонитевой ДНК, в которых чаще происходит формирование вторичной структуры. Это, в свою очередь, ведет к более частой инициации репликативного проскальзывания в основании ДИП и ДИП-индуцированной гомологичной рекомбинации.

Мы получили ряд экспериментальных данных, которые свидетельствуют в пользу предложенной модели нестабильности инвертированных повторов.

Ориджин репликации, помешенный между инвертированными повторами. приводит к снижению частоты делений инвертированных повторов и ДИП-индуцированной рекомбинации. Согласно репликативной модели вырезания и рекомбиногенного действия инвертированных повторов формирование вторичной структуры типа "шпильки" возможно если оба инвертированных повтора окажутся в одном участке однонитевой ДНК в ходе репликации. Мы предположили, что если репликация будет инициироваться между инвертированными повторами, тогда комплементарное взаимодействие между ними будет затруднено, так как в этом случае инвертированные повторы реплицируются в разных направлениях и находятся в разных участках однонитевой ДНК. Следовательно, инвертированные повторы, которые содержат ориджин репликации в спейсерном участке, должны реже вырезаться и менее эффективно стимулировать гомологичную рекомбинацию. Это предположение было проверено нами экспериментально. Для этого мы заменили центральную часть транспозона Тп5 на фрагмент ДНК, содержащий дрожжевой ген TRP1 и ARS1 последовательность. В качестве контроля между инвертированными повторами Тп5 был клонирован такой же фрагмент ДНК, но с мутацией в коре ARS элемента, нарушающей его функцию. Мы наблюдали приблизительно 5-кратное снижение частоты вырезания инвертированных повторов транспозона Тп5, спейсерный участок которых содержит ориджин репликации, в штаммах pol3-t (Таблица 3).

Ориджин репликации между инвертированными повторами также влиял и на способность Тп5 стимулировать внутрихромосомную и межхромосомную рекомбинацию. Частоты внутрихромосомной и межхромосомной эктопической рекомбинации в гетероаллеяях с Тп5, несущим ARS1 последовательность между инвертированными повторами, были достоверно ниже частот ре-

комбинации в гетероаллелях с Тп5, центральная часть которого содержит ииак-тивированный ARS элемент (данные приведены в диссертационной работе).

Таблица 3.

Эффект ориджина репликации, помещенного между длинными инвертированными повторами, на вырезание транспозона Тп5

Спейсер между инвертированными повторами транспозона Тп5 Частота вырезания xl О"7

TRP1ARS- 4.4 (3.5-5.4)

TRP1ARS+ 0.9 (0.7-1.2)

Приведены медианные значения частот рекомбинации на клегочную генерацию среди 12-18 независимых культур и 95% доверительные интервалы (в скобках)

Индукция делений и эктопической рекомбинации инвертированными повторами зависит от длины инвертированных повторов и расстояния между ними. Из репликационной модели, предложенной для объяснения нестабильности инвертированных повторов, следует, что формирование вторичной структуры - определяющая стадия в механизме инициации перестроек инвертт:рован-ными повторами. Мы предположили, что с уменьшением длины инвертированных повторов и с увеличением спейсера между ними должны уменьшаться вероятность формирования и (или) стабильность вторичной структуры и следовательно, уменьшаться частота делеций и рекомбинации, индуцированной инвертированными повторами. Для того, чтобы проверить эту гипотезу, мы модифицировали исходную инсерцию транспозона Тп5 и получили серии штаммов, содержащих в гене LYS2 инсерции инвертированных повторов со следующими структурными параметрами:

- инсерции инвертированных повторов длиной 185, 323, 485, 745, ! 115, 1515 п.о. и разделенные спейсером длиной 1,2 т.п.о. (дрожжевой ген URA3);

- инсерции с варьирующей длиной спейсерного участка: 1,2; 3,5; 5,0; 8,4 т.п.о. между инвертированными повторами транспозона Тп5 (1515 п.о.)

При постепенном уменьшении длины инвертированных повторов с 1515 п.о. до 185 п.о. наблюдается монотонное снижение частоты делеций инвертированных повторов в штаммах, несущих мутацию poI3-t (Рис. 6.А). К такому же эффекту приводит увеличение расстояния от 1,2 до 8,4 т.п.о. между инвертированными повторами длиной 1515 п.о. - частота делеций инвертированных повторов постепенно уменьшается до 15-кратного снижения. (Рис. 6.В).

«в «в л» « за

длина инвертированных чозторов (и.о.)

расстояние мешу мнвертировандои повторами IS50 (т.п.о.)

Рис.5. Зависимость частот делеций инвертированных повторов от их структурных параметров

А - Эффект длины инвертированных повторов В - Эффект расстояния между инвертированными повторами

1515 1195 705 485 323 «5

длина инвертированных повторов (п.о.)

мшфомптим ршнАюи/а

ИХ.» (хю ') -Ь- мртрпроаоааим рмнбтцра

Ра.Цк1(Л

-В- шшфмщмш» рюкйтщя

роШ {* И*)

-и- мучжроиюмтрмабтцп роШ

расстояние ыежду инвертирование« повторами IS50 (т.п.о.)

«икроиосагепрявнбжащ

pat (* ют) -ir~ иурщшоспшяретабишця pa* txio<) шкфошхмшраоибяа«« ро£Н(хЮ^

»утрюрокгаиаярмибжаци! poWlxW"1)

Рис.7 Влияние структурных параметров инвестированных повторов на их рекомбино-генные свойства. Приведены данные для рекомбинации между повторами гена ЬУБ2, один из которых содержит инсерцию инвертированных повторов, другой - представлен аллелью 1уз2-с1е13' в эктопической позиции.

А - Эффект длины инвертированных повторов на межхромосомную и внутрихромо-сомную рекомбинацию

В - Эффект расстояния между инвертированными повторами на межхромосомную и внутрихромосомную рекомбинацию

Кроме того, мы показали, что с уменьшением длины инвертированных повторов и с увеличением спейсера между ними уменьшается частота эктопической - внутрихромосомной и межхромосомной - рекомбинации, индуцированной инвертированными повторами, как в штаммах РОЬ+, так и у мутантов роВ4 (Рис. 7.А,В). Корреляция между изменением структурных параметров ДИП и динамикой ДИП-индуцированного рекомбиногенеза свидетельствуют о взаимодействии инвертированных повторов при инициации перестроек ДНК и хорошо согласуется с гипотезой о репликативной природе нестабильности инвертированных повторов.

ВЫВОДЫ

1. Длинные инвертированные повторы стимулируют эктопическую - межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию

2. Длинные инвертированные повторы индуцируют хромосомные перестройки - делеции и транслокации

3. Индукция эктопической рекомбинации не зависит от нуклеотидной последовательности инвертированных повторов

4. Свойство длинных инвертированных повторов стимулировать делении и рекомбинацию зависит от длины инвертированных повторов и расстояния между ними

5. Ориджин репликации, помещенный между инвертированными повторами, приводит к снижению частоты делеций ДИП и ДИП-индуцированной рекомбинации

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горденин Д.А., Дегтярева Н.П., Колотева Н.Н., Лобачев К.С., Малкова А.Л. Инвертированные повторы молекул ДНК индуцируют структурную нестабильность генома у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Тезисы доклада на XI симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 19-21 октября 1993г.) // Цитология, т.35, №10, с. 64-65,1993

2. Горденин Д.А., Лобачев К.С., Чан-Туан Хиеп, Дегтярева Н.П., М.А.Резник. Длинные инвертированные повторы в ДНК стимулируют возникновение делений и эктопическую рекомбинацию у дрожжей. // Материалы 1 съезда Ва-виловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), (Саратов, 20-25 декабря 1994г.) // Генетика, т.ЗО, приложение, с. 35, 1994

3. Gordenin, D.A., Lobachev, K.S., Degtyareva, N.P., Malkova, A.L., Perkins, E., Resnick, M.A. Inverted DNA repeats: a source of eucariotic genomic instability. // Molecular and Cellular Biology, Vol 13:5315-5322, 1993

4. Lobachev, K.S., Tran, H., Gordenin, DA. Resnick, MA. Replicative mechanism for deletions and recombination stimulated by DNA long inverted repeates in yeast // Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 16-21,1994 (Abstract).

5. Gordenin, D.A., Lobachev, K.S., Tran, H., Shor, B.M., Taylor, W., Resnick, MA. Structural requirements for long inverted repeat stimulated genetic instability in yeast. // FASEB Summer Research Conference "Genetic recombination and Genome Rearrangements", Snowmass Village Co, August 1995 (Abstract).

6. Gordenin, D.A., Lobachev, K.S., Tran, H., Shor, B.M., Taylor, W„ Resnick, M.A. Deletions and ectopic recombination stimulated by long inverted repeats in yeast. // Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology "Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination", Taos, New Mexico, February 10-16, 1996 (Abstract).

7. Gordenin, D.A., Lobachev, K.S., Tran, H., Keen, D., Shor, В., Resnick, M. Deletions and ectopic recombination stimulated by long inverted repeats in yeast. II II Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August 6-11, 1996 (Abstract).