Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля образования делеций по коротким прямым повторам у дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического контроля образования делеций по коротким прямым повторам у дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE"

Санкт-Петербургский государственный университет

'. ГЗ СП

На правах рукописи

О з ФЕО №

Дегтярева Наталья Петровна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ ДЕЛЕЦИИ ПО КОРОТКИМ ПРЯМЫМ ПОВТОРАМ У ДРОЖЖЕЙ ССНАЯОМУСЕЭ СЕИЕУШЛЕ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник.

кандидат биологических наук Д,А.Горденин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К.В. Квитко

доктор биологических наук Т.Р. Сойдла

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХ.

Защита состоится ±5—1997 г. в .час. на заседании

Диссертационного совета Д 062Г57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, кафедра генетики и селекции, ауд_№ 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан ".

" 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ЛА. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Перестройки генетического материала - важный биологический процесс, приводящий к созданию новых геномов в эволюции и являющийся этапом ряда механизмов клеточной дифференцировки. Оптимальный уровень перестроек является важным адаптивным признаком вида: поддержание такого уровня, с одной стороны, обеспечивает внутривидовое разнообразие, необходимое для существования вица, а с другой стороны предотвращает возможные негативные дня организма последствия перестроек.

Источником перестроек в геноме могут служить короткие повторы -диспергированные и тандемныс. Такие неспецифичные повторяющиеся последовательности встречаются как в геноме прокариота, так и эукариота. Тандемные короткие повторы (длина повторяющихся элементов от 2 до 40 п.о.) обнаружены в геноме человека примерно в 1000 локусов (Charlesworth et ai., 1994). Диспергированные короткие повторы - это случайно совпадающие короткие участки ДНК. Например, повторы 6 п.о., 5 п.о., 4 п.о. во фрагменте ДНК размером 100 п.о. в среднем встречаются два, пять и девятнадцать раз соответственно (Moore et al., 1984). Перестройки с участием столь многочисленных коротких повторов могут служить источником материала, используемого для эволюционного преобразования генома. В то же время на сегодняшний день является доказанным, что перестройки с участием коротких повторов приводят к развитию у человека тяжелых наследственных заболеваний и рака (Krawzcak and Cooper, 1991; Sutherland and Richards, 1995; Fishei and Kolodner, 1995). Настоящая работа посвящена изучению генетического контроля образования перестроек с участием коротких диспергированных повторов, в геноме эукариошческого организма - дрожжей Saccharomyces cerevisiae. При изучении образования делений по коротким повторам, фланкирующим модельные инсерции в гене LYS2, нами было обнаружено, .что на перестройки по коротким диспергированным повторам влияют мутации в генах, продукты которых участвуют в репликации и рекомбинационной репарации ДНК.

Задачи работы. Задачи исследования определены следующим образом:

1) Конструирование удобной модельной системы для изучения образования дикций по коротким диспергированным повторам;

2) Изучение влияния мутаций в различньсх генах аппарата репликации на стабильность коротких прямых повторов;

3) Изучение эффекта генов системы эксцизионной, мутагенной и рекомбинационной репарации на образование делеций по коротким прямым повторам.

Научная новизна полученных результатов. Для изучения генетического контроля образования делеций по коротким диспергированным повторам были

использованы инссрции, фланкированные коротыши (6-9 п.о.) прямыми повторами. Между прямыми короткими повторами были расположены либо случайные последовательности ДНК, либо квазипалиндромы, способные образовывать вторичную структуру. Кроме того, мы сконструировали специальную систему дня селекции протяженных делеций по коротким повторам. Используя эти модельные системы, мы доказали, что уровень перестроек с участием коротких повторов повышается у штаммов, несущих мутацию pol3-t в гене для ДНК-полимеразы 8, вне зависимости от того, возможно ли образование вторичной структуры типа шпильки на участке ДНК между повторами. Этот результат - единственное пока свидетельство важной роли активности ДНК-полимераз, не связанной с корректорской функцией, в индукции перестроек - делеций по коротким повторам у эукарнота. Другие компоненты аппарата репликации, как нам удалось обнаружить, тоже влияют на стабильность коротких диспергированных повторов. Помимо эффекта мутации pol3-t на деяеции квазипалиндромных инсерций влияет мутация ро130-52 в гене для ядерного антигена пролиферирующих клеток дрожжей (PCNA). Одна из функций этого белка - обеспечение процессивного синтеза ДНК во время репликации двумя ДНК-полимеразами; кроме того, показано, что этот фермент взаимодействует с белками репарации ДНК. Мутация роВО-52 затрагивает именно репликативную активность PCNA (Ayyagari et al., 1995) и одновременно, как было продемонстрировано в нашей работе, приводит к дестабилизации квазипалиндромных инсерций, фланкированных короткими прямыми повторами.

Мы показали, что в образовании протяженных делеций непалиндромных инсерций у мутантов pol3-t, участвуют все проверенные нами гены рекомбинационной репарации - RAD50, RADS1, RADS2, RADS4, RAD55, RAD57. Скорее всего, мы обнаружили новое свойство продуктов рекомбинационных генов, которые, по последним данным, образуют в клетке сложный комплекс. Это свойство - взаимодействие репликативного аппарата и продуктов рекомбинационных генов, которое прошляется в сниженииpol3-t - стимулируемых частот делеций у мутантов по перечисленным генам рекомбинационной репарации. Такое влияние на образование делеций, является новым свойством, характерным для всех упомянутых генов рекомбинационной репарации.

Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в работе данные свидетельствуют о том, что увеличение уровня перестроек с участием коротких диспергированных повторов может быть вызвано изменением функционирования некоторых компонентов аппарата репликации и мутациями в ряде генов системы рекомбинационной репарации. Обнаруженные закономерности имеют большое значение дня понимания механизмов дестабилизации коротких повторов, в том числе и тандемных в микросателлитной ДНК, а также механизмов взаимодействия таких важнейших процессов метаболизма ДНК, как рекомбинация и репликация. Результаты, представленные в работе, следует учитывать при анализе

структуры и эволюции прокариотических и эукарнотических геномов, реконструкции механизмов возникновения раковых и наследственных заболеваний, конструировании рекомбинантных молекул и манипуляциях с искусственными хромосомами.

Материалы и экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе могут быть использованы для чтения лекций по курсам "Мутационный процесс", "Молекулярные механизмы рекомбинации", "Структура и функции ДНК" на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета и в других научных и образовательных институтах, изучающих проблемы стабильности генома, молекулярные механизмы рекомбинации и репликации.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993), 1 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) (Саратов, 1994), конференциях "Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting" (Seattle, USA, 1994; Madison, USA, 1996), "Genetic Recombination and Genome Rearrangements" (Snowmass Village, USA, 1995), "Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination" (Taos, USA, 1996), на семинарах лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГ'У.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 6 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит га введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка литературы, содержащего 127 ссылки на научные публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы дрожжей. В работе были использованы гаплоидные штаммы дрожжей, перечисленные в таблице 1. Эти штаммы являются производными штамма pol3-t-DM (Gordenin et al., 1991). Все они (за исключением Lys+-POL+-DM и Lys+-pol3-t-DM) содержат инсерции в гене LYS2 в одном и том же сайте (см. рис.1), и использовались для измерения частот реверсий соответствующих инсерции, Инсерции InsH, InsG, представляют собой небольшие квазипалиндромы -инвертированные повторы, разделенные спенсером; размер инвертированных повторов InsH - 69 п.о., спейсера- 9 п.о.; длина инвертированных повторов InsG - 33 п.о., спейсера - 8 п.о.; в квазипалиндроме InsF инвертированные повторы длиной 32 п.о. находятся на расстоянии 55 п.о. друг от друга. Все квазипалшщромные инсерции фланкированы одинаковыми прямыми повторами длиной 9 п.о. (5'-CGTCAGGGC-3').

Штаммы дрожжей, используемые в работе

Название Генотип

KIO-POL+-DM MATaг \ys2-imH игаЗ-х 1еи2-2 trpl-Al

K10-pol3-t-DM MA Та lys2-imH игаЗ-х Ш2-2 trpl-Al poB-t

Kl 4- POL+-DM MA Та lys2-insG итаЗ-х leu2-2 trpl-Al

K14-pol3-t-DM MA Та lys2-insG vra3-x leu2-2 trpl-Al pol3-t

K25-POL+-DM MA Та ¡ys2-insD ura3-x leu2-2 trpl-Al

K25-pol3-t-DM MATa !ys2-insD ura3-x lev2-2 trpl-Alpol3-t

K27-POL+-DM . MA Та lys2-insE ura3-x leu2-2 trpl-Al

K27-pol3-t-DM MA Та lys2-insE ura3-x leu2-2 trpl-Al pol3-t

Lys+-POL+-DM MATa игаЗ-х ku2-2 trpl-Al

Lys+-pol3-t-DM MATa ura3-x leu2-2 trpl-Al pol3-t

Инсерции InsD и InsE - это вставки 31 и 61 и.о., они не содержат инвертированных повторов и фланкированы прямыми повторами датой 7 п.о. (5'-CGTCAGG-3') и 6 п.о. (5'-CGTCAG-3') соответственно. Инсерции insH, InsG, InsD и InsE инактивируют ген LYS2. Используемые штаммы несут точковые мутации итаЗ-х и 1еи2-2, а также делецию trpl-Al, что позволило получать на их основе изогенные мутантные штаммы методом одношагового замещения. Штаммы Lys+-POL+-DM и Lys+-pol3-t-DM использовались для получения в гене LYS2 инсерций InsLD и InsLE, позволяющих селектировать протяженные делеции (см. раздел "Результаты и обсуждение").

Плазмиды- Плазмиды р92, р94, р93 и р95 - это центром ерные векторы длиной примерно 10.1 т.п.о. Содержат бактериальный ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, последовательность дрожжевой центромеры и последовательность ARS-элемента, дрожжевой ген URA3, последовательность гена LYS2 с инсерциями InsD (р92 и р94) и InsE (р93 и р94) в обеих ориентациях (Tran et al., 1995). Плазм ид а pBL230 - вектор длиной 5.9 т.п.о. содержит полноразмерный ген РОЬЗО, кодирующий дрожжевой вдерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA). Плазмвда сконструирована на основе вектора pRS314, содержащего последовательности гена TRPI, CEN6, ARSH4. Серия плазмид pBL230-x, где х-номер соответствующей мутации в гене РОЬЗО, сконструирована на основе плазмиды pBL230 методами сайт-направленного мутагенеза и случайного PCR-мутагенеза (Ayygari et al., 1995). Плазмиды pDUI, pNKY83, L962, pDEL2l, p2A5, radlBATRPl, pSTLII, pÄSlBlast, pSM51, pSM31 использовались для получения мутантов по репарации и репликации ДНК методом одношагового замещения (см. диссертационную работу). В работе были получены плазмиды pLD и pLE, сконструированные при помощи олигонуклеотидного мутагенеза на основе

9 и.о.

InsH

ч * г

9 9

8п.о.

InsG

ЗЗп.о.

55 п.о.

InsE

InsD

24 п.о.

Y7

EcoRÎ Xhol BamHI Hindlll .... -j-j-Ж-J-1---- • ■

LYS2 ----- ^

Рис 1. Модельные ннссрции в-гсле LYS2.

Все инсерции локализованы в одном сайте, обозначенном черным треугольником. Для всех инсерций обозначена длина фланкирующих коротких повторов. Для квазипалинцромкых инсерций обозначена дайна инвертированных повторов и спейсера между ними, для непатлндромных инсерций - расстояние между прямыми повторами. Пунктирной стрелкой обозначено направление транскрипции гена LYS2.

плазмш р92 и р93 соответственно. Плазмцды pLD и pLE использовались для получения методом конверсионного переноса инсерций InsLD и InsLE в хромосомной копии гена LYS2 (см. рис-2), позволяющих селектировать протяженные делеции по коротким повторам.

Культивирование дрожжей и бактерий, приготовление сред, генетические и молекулярно-бнологические манипуляции проводили согласно стандартным методикам (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986; Sambrook et al., 1989). Оригинальные и редко примешемые методы приведены в диссертационной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная система для изучения делеций по коротким прямым повторам. В нашей работе мы изучали образование делеций по коротким прямым повторам, фланкирующим квазипаливдромные и непалиндромные инсерции. Для этого мы использовали систему модельных квазипалиндромных и непалицдромных инсерций в гене ЬУ32 (рис. 1). Было доказано, что реверсии квазипалиндромных инсерций 1пяО и 1ткН происходят! за счет точного вырезания вставки и одного го прямых повторов. Это означало, что на полной среде без лизина селективно отбираются ревертанты, возникшие в результате делеций по коротким прямым повторам. Таким образом, изучение генетического контроля стабильности квазипалиндромных инсерций сводилось к сравнению частот реверсий у штаммов дикого типа и у изогенных мутантов. Частоты реверсий составляли для 1п5С: (0,5±0,005)х1(И; 1шН: (0,3*0,02)х1(И. Непалиндромные инсерции ревертировали с частотами: 1п80-(0,8±0,1)хШ-8; 1пзЕ-(0,7^0,1)хЮ-8. Однако, реверсии непалщщромных инсерций 1пхО и ЬвЕ происходили за счет различных событий. Инсерции ГгеБ - за счет полных делеций 31 и.о., микроделеций 1 п. о. и микровставок 2 п.о.; инсерции 1шЕ - за счет полных делеций 61 и.о. неполных делеций (делеция ЗJ п. о. внутри инсерции 11кЕ), делеций 16 и.о., 7 и.о., микроделеций 1 п.о. и микровставок 2 п.о. Это затрудняло изучение генетического анализа образования делеций, так как требовало анализа последовательности ДНК ревертантов. Кроме того, анализ нуклеотидных последовательностей Ьуэ^-ревертантов штаммов дикого типа и изогенных мутантов показал, что генетический контроль образования протяженных делеций и делеций 1 п.о. различен (см. ниже). Мы усовершенствовали систему, чтобы селективно отбирать только протяженные (31 п.о. и 61 п.о.) делеции. Для этого инсерции 1изВ и 1хкЕ были модифицированы таким образом, что неполные протяженные делеции и микроделеции не могли привести к появлению Ьу8+-ревертантов (рис.2). Инсерции ЬкЫ) и 1пзЬЕ сконструированы при помощи сайт-направленного олигонуклеотцдного мутагенеза в составе плазмидных аллелей 1уз2-шЬО и />>б'2-ЬиЬЕ плаз мвд р1ЛЭ и рЬЕ соответственно. Они представляют собой модифицированные вставки ГгкО и 1шЕ, в которых все три рамки считывания гена 2Л'&2 блокированы стап-кодонами внутри инсерции. Протяженные делеции, элиминирующие все три сгоп-кодона могут приводить к возникновению ревертантов. Очевидно, что делеции 1 п.о. или вставки 2 п.о., возникшие ниже по течению от первого стоп-кодона (это стоп-кодон в фазе рамки считывания гена ЬК&2), не приведут к образованию Ьу5+-ревертантов, т.к. элонгация полипептидной цепи прекратится на первом стоп-кодоне.

1шЬ0

31

Ш

ТАСЛ5ТТТ1^^5Т01ТТ0СССЛеаТС?С^ТА6с1АсТАСтСТДТ>АСДСТСДССетС^СССССАД5ВАТСЛДедЛССТССАТ

АС Т 1ХШ

1шЬЕ

_ЬвЬЕ IV"

^ I

I ^ _2_ 2 I ш

АС т

1ХЬа1 1Ъре1 Рис. 2. Структура инсерции 1пя1ЛЭ и ЬкЬЕ.

Жирным шрифтом выделены стоп-кодоны дая всех грех рамок считывания в гене £ Под последовательностями Ьв1,0 и ЬмЬЕ указаны соответствующие нуклеотиды в последовательностях и ТпьЕ и сайты рестрикции, отличающие 1ш1Л>(1.Е) от 1пеЕКЕ). ад - с-топ-кодон ТОА, возникший в рамке считывания гена £У52 в результате инсерции последовательностей иЬиЕ. Подчеркнуты короткие прямые повторы, фланкирующие вставки 1о$1Х) и 1тЬЕ.

Делении I п.о. и вставки 2 и.о. выше по течению от второго стоп-кодона будут изменять фазу рамки считывания, что могло бы привести к возникновению ревертангов, однако, второй стоп-кодон блокирует элонгацию иолипептвдной цепи в такой "новой" фазе синтеза полипептвда. Третья фаза рамки считывания тоже блокирована стоп-кодоном (третьим). Таким образом, реверсии к прототрофности по лизину у штаммов с инсерциями 1гк1Х) и 1геЬЕ возможны за счет протяженных делеций или сложных событий. Частоты реверсий 1га1ЛЗ и 1шЬЕ сравнимы с вычисленными на основании анализа нухлеотидных последовательностей частотами делений 31 п.о. и 61 п.о. среди ревертантов соответствующего генотипа. Селективный отбор только одного типа событий - делеций 31 п.о. и 61 п.о. -позволяет уже в качественном тесте оценить влияние того или иного гена на образование делеций по коротким прямым повторам, не требуя трудоемкого анализа нуклеотидных последовательностей Ьуз+-ревертантов. Мы воспользовались этим преимуществом и обнаружили влияние целой группы генов - генов системы рекомбинационной репарации - на стабильность прямых повторов у ро13-г мутантов (см. ниже). Используя штаммы с инсерциями 1шЬО и ЬвЬЕ, можно в дальнейшем вести поиск неизвестных генов, влияющих на образование делеций у дрожжей.

Роль компонентов аппарата репликации в индукции перестроек с участием коротких прямых повторов. Мутация ро13-1 в гене РОЬЗ, кодирующем ДНК-полимеразу 8 увеличивает частоту делеций по повторам, фланкирующим как квазипалиндром ные, так и непалиндромные инсерции (таблицы 2 и 3).

Таблица 2.

Влияние мутантных ДНК полимераз 6 и е на образование делеций по коротким прямым повторам, фланкирующим кв аз «палиндромы.

Частота реверсий х 10"6

Генотип Гнев 1шН

20° 25° 20° 25°

Р01,2* РОЬЗ* 0.5 0.4 0.2 0.3

(0.3-0.6) (0.2-0.8) (0.1-0.4) (0.1-0.6)

РОИ* ро!3-1 1.6 3.7 3.5 11

(1.2-2.4) (1.6-5.1) (2.1-9.4) (9.4-14.0)

ро12РОЬЗ* 0.8 0.5 0.14 0.2

(0.21-1.4) (0.48-0.7) (0.07-0.23) (0.12-0.5)

ро12 ро!3 1.3 0.7 0.7 0.9

(0,8-2.5) (0.3-2.3) (0.3-1.3) (0.2-1.5)

Приведены медианные частоты реверсий, определенные во флуктуационных тестах для 12-18 культур, и 95% доверительные интервалы (в скобках).

и

Мутацияро12'1 в гене P0L2, кодирующем ДНК-полимеразу в, не влияет на частоты делеций квазпалнцдромных ннсерций, но снижает ро/З-мшдущфованные делеции. Однако, если полные делеции 31 п.о. и 61 п. о. непаляндромных инсерций InsD и InsE образуются в 155 и 460 pas чаще, то частота делеций палшщромных инсерций InsG и InsH увеличивается только в 9 и 37 раз соответственно по сравнению со штаммами дикого типа. Таким образом, мутация po!3-t сильнее влияет на стабильность непалицдромных, чем квазипалиццромных ннсерций. При этом, чем больше размер вставки, тем существеннее увеличение частот реверсий у pol3-t мутантов: индукция частот реверсий InsE больше, чем у InsD; InsH больше, чем InsG. Важно отметить, что мутация pol3-t не влияет на образование микроделеций (мутаций сдвига рамки считывания), т.е. генетический контроль образования протяженных делеций и микроделеций отличается.

Таблица 3.

Влияние мутации ро13-г в тене ДНК-полимер азы 5 на образование делеций по коротким повторам, фланкирующим нелалиндромные инеерции.

Инсерцня Тип событий, приводящих к реверсии Частота реверсий к Lys+ х Ю-8

POL+ pol3-t

InsD Делеции 31 п.о. (деления всей инеерции) 0.22 [8] 34 [60]

Делеции 1 п.о., вставки 2 п.о. 0.48 [17] 0[0J

Общая (суммарная) частота реверсий 0.7 (0.5-0.8) 34 (27-71)

InsLD Делеции 31 п.о. (делеция всей инеерции) 0.2 (0.1-0.4) 43 (38-66)

InsE Делеции 61 п.о. (делеция всей инеерции) 0.02 [1] 9.2 [88]

Делеции 16, 31 п.о. (неполная делеция) 0 [01 4.2 [40]

Делеций 1 п.о., 7 п.о., вставки 2 п.о." 0.38 [18] 0.6 [6]

Общая (суммарная) частота реверсий 0.4 (0.3-0.5) 14 (4.7-28)

InsLE Делецииб! п.о. (делеция всей инеерции) «0.1* 11(8-15)

Приведены медианные частоты реверсий, определенные во флуктуационных тестах для 12-18 культур, выращенных при 25°С, и 95% доверительные интервалы (в круглых скобках) - для общих (суммарных) частот реверсий инсерций Е, IX), ЦВ. Частоты конкретных типов событий Ис, приводящих к реверсии, вычислены по формуле: Е-^К, (Н; / N0), где Ио - общая (суммарная) частота реверсий, N0 - общее количество ревертантов данного генотипа, для которых проведен физический анализ, N0 - количество ревертантов, возникших в результате конкретного типа событий. В квадратных скобках приведено количество ревертантов, образовавшихся в результате делеций данного типа. * - не приведены доверительные интервалы из-за низких частот реверсий, для штаммов РОЬ+ - только частоты делеций I п.о.

Увеличение частот делеций по повторам, фланкирующим как квазипалицдромные, так и непаливдромные инеерции у ро/.?-/-мутаптов свидетельствует в пользу гипотезы репликативного проскальзывания для

объяснения образования делений по коротким повторам. Согласно этой гипотезе во время репликации участков ДНК, содержащих прямые повторы, после синтеза первого повтора 3'- конец вновь синтезированной нити мигрирует на другой повтор, и синтез ДНК продолжается, в результате чего участок между повторами и один из повторов остается неотреплицированным. Если в случае квазипалицяромиых инсерций эффект мутации ро13-1 можно было бы свести к "облегчению" образования вторичных структур, которые затем удаляются специализированными ферментами, то следовало бы признать, что делении иепалиццромных инсерций возникают по другому механизму. Мы предполагаем, что мутация pol3-t таким образом изменяет информацию ДНК-полимеразы S, что: 1) происходит частая диссоциация с матрицей, после чего свободный З'-конец вновь синтезируемой нити подхватывается новой молекулой ДНК-полимеразы S, которая может продолжить синтез с любого участка ДНК матрицы, гомологичного свободному З'-концу; 2) и/или в результате изменения информации ДНК-полимеразы S свободный З'-конец вновь синтезированной нити становится более доступен гипотетическому фактору, обеспечивающему поиск гомологии и/или взаимодействие гомологичных участков. Поскольку синтез ДНК осуществляется сложным репликативным комплексом, в котором различные компоненты взаимодействуют между собой, серьезное повреждение ДНК-полимеразы е в репликативном комплексе может значительно изменить третичную структуру реппикативнаго хояоэнзима. Тогда предполагаемая информация ДНК-полимеразы 8 у двойного мутанта ро!3-1 ро12-1 изменится так, что свободный З'-конец вновь синтезированной нити уже не будет доступен факторам, обеспечивающим поиск гомологии. Это приведет к снижению частот делеций.

Изучение влияния другого компонента аппарата репликации - дрожжевого ядерного ангигена пролиферирующих клеток (PCNA - proliferating cell nuclei antigen) - на уровень перестроек с участием коротких повторов показало, что мутацияро130-52 в гене РОЬЗО, кодирующем PCNA, на порядок повышает частоты делеций квазипалиндромных инсерций и не влияет на делеции непалиндромной инсерции iiisI.E (см. таблицу 4). Наиболее подробно охарактеризованной у дрожжей функцией данного белка является его свойство обеспечивать процессивность синтеза ДНК при взаимодействии с ДНК-полииеразами 5 и е. В то же время показано, что продукт гена РОЬЗО участвует в процессе репарации ДНК (Ayyagari et al., 1995). Мутация pol30-S2 затрагивает именно регишкатавную функцию белка: по-видимому, приводит к снижению процессивности ДНК-полимераз из-за изменения конформации PCNA. Таким образом, в нашей работе мы впервые показали, что компоненты аппарата репликации увеличивают уровень перестроек с участием коротких, диспегироваиных повторов.

Влияние мутаций в гене РОЬЗО на образование делеций по коротким прямым повторам, фланкирующим квазипалицдромные и непалицдромную инсерции.

Инсерция Плаз мнца Частота реверсий к Ьув+ хЮ-7

рвизо-о 1.9 (1.15-3.20)

рВЬ230-52 18.9 (12.48-49.72)

рВЬ230-89 4.2 (2.65-5.99)

1п.чО рвизо-о 2.5 (1.52-4.04)

рВЬ230-52 18.3(13.78-23.27)

рВЬ230-89 4.7 (3.58-5.79)

ТпяЬЕ рВ1,230-0 0.04 (0.002-0.2)

рВЕ230-52 0.05 (0.009-0.2)

рВ1.230-89 0.01 (0.001-0.06)

Приведены медианные частоты реверсий, определенные во флугггуационных тестах для 12-18 культур, выращенных при 25°С, и 95% доверительные интервалы (в скобках).

Влияние генов рекомбцнационной репарации на перестройки с участием коротких повторов. В нашей работе мы попытались выявить возможное влияние генов эксцизионной, мутагенной и рекомбцнационной репарации на перестройки по коротким повторам. Не было обнаружено влияние ни одной го проверенных мутаций на делении квазипалиндромных и непалицдромных инсерции у штаммов дикого типа за исключением слабого акпшутаторното эффекта мутации тай50 на протяженные делеции 31 п.о. инсерции (см. диссертационную ряботу). В условиях дестабилизации коротких повторов у ро)3-1- мутантов был выявлен эффект генов 11АВ50 и ЕАБ52 (3-4 кратное снижение частот делеций) для квазипалиндромной инсерции 1гаН. У двойных мутантов роВ-1 гш!50 и ро13-1га<152 делеции инсерции 1гвО происходили примерно с такой же частотой, что и у штаммов дикого типа (см. таблицу 5).

Обнаружив у ^о/3-/-мутантов эффект генов рекомбцнационной репарации ЯЛ И50 и ЕЛ Г) 52 на делеции квазипалиндромной инсерции 11КН, фланкированной короткими повторами, мы проверили возможность влияния этик и крупа генов рекомбцнационной репарации на стабильность коротких прямых повторов, фланкирующих непалиндрошше инсерции. Для этого была использована сконструированная нами модельная система для селекции протяженных делеций 31 п.о. (11в1ЛЭ) и 61 п.о. (1пяЬЕ). Из-за низких частот реверсий не было возможности проверить эффект этих генов у штаммов дикого типа, поэтому измерялись частоты делеций на фоне мутации ро13-Ь (см. таблицу 6). Мутации во всех генах системы рекомбинационной репарации достоверно снижают частоты делеций у ро13-1-мутангов (в отличие от мутаций в генах эксцизионной и мутагенной репарации -гасЧ и гас! 18 соответственно).

Влияние генов рекомбииационной репарации ВЛБ50, КА1)52 на делеции квазипалиндромных инсерций.

Частота реверсий к Ьу5+ хЮ-6

Генотип 1к>0 ЬБН

20° 25° 20« 25°

РОДИЛО* 0.5 0.4 0.2 0.3

(0.3-0.6) (0.2-0.8) (0.1-0.4) (0.1-0.6)

РОи тай50 0.5 1.0 0.3 0.6

(0.2-0.9) (0.2-1.5) (0.02-0.5) (0.2-0.8)

РОЬ+ таё52 0.3 0.9 0.6 0.2

(0.1-0.4) (0.5-1.6) (0.5-0.8) (0.16-0.34)

роВ-1 ЛАВ+ 1.6 3.7 3.5 И

(1.2-2.4) (1.6-5.1) (2.1-9.4) (9.4-14.0)

ро!3-1 та<150 0.4 2.5 0.8 2.6

(0.3-1.7) (1.8-5.8) (0.5-2.3) (0.8-6.0)

ро13-1 та(152 1.1 1.5 1.6 3.4

(0.3-3.0) (0.8-5.4) (1.3-3.5) (0.3-6.1)

Приведены медианные частоты реверсий, определенные во флуктуационных тестах для 12-18 культур, выращенных при 20° и 25°С, и 95% доверительные интервалы (в скобках).

Таблица 6.

Влияние генов рекомбииационной репарации на образование делеций по коротким прямым повторам у мутантов ро!3-г.

Генотип Ч астота делеций х 10

Делеции 31 п.о. (ТпзЬО) Делеции 61 п.о. (1шЬЕ)

ро!3- г 42.1 (33.11-49.55) 20.0 (12.58-26.28)

та<150 ро!3-1 12.8(10.33-16.20) 4.5 (3.00-6.90)

тай51 ро13-1 13.7(11.97-21.43) 6.8(5.85-8.09)

тай52 ро13-1 12.4(9.12-18.84) 2.8 (2.10-3.80)

гаЛ54 ро!3-1 15.4(11.66-17.16) 4.7 (3.81-5.69)

та<!55ро13-г 15.0(11.51-18.64) 5.9 (4.95-6.08)

та<157 ро!3-[ 14.5 (11.61-17.93) 5.2 (4.10-6.42)

тай1 ро13-с 30.3 (22.48-42.95) 23.9 (19.06-29.63)

гас!18 ро13-1 39.8 (37.04-52.21) 22.4(18.06-25.30)

Приведены медианные частоты реверсий, определенные во фяуюуационных тестах для 20-60 культур, и 95% доверительные интервалы (в скобках).

Вероятно, эффект генов, продукты которых задействованы в гомологичной рекомбинации, не обусловлен тем, что они обеспечивают гомологичную рекомбинацию по коротким прямым повторам. Во-первых, длина коротких повторов значительно меньше минимальной длины повторов, необходимой дня эффективной гомологичной рекомбинации. Во-вторых, если у мутантов rad52 существенно снижаются частоты гомологичной рекомбинации, что соответствует ее влиянию на образование делеций по коротким повторам, то мутация rad50 только незначительно снижает, а в некоторых случаях и увеличивает частоты спонтанной гомологичной рекомбинации (Haynes & Kunz, 1981), что не соответствует эффекту этой мутации на образование делеций по коротким повторам. Возможно, что продукты генов системы рекомбинационной репарации непосредственно вовлечены в репликацию. Альтернативное объяснение может сводиться к следующему. Если образование делеций происходит в результате репликатнвного проскальзывания по коротким повторам, то участие факторов, обеспечивающих поиск и быстрое комплементарное взаимодействие участков, гомологичных свободному З'-концу вновь ситезУ1руемой ДНК, будет стимулировать образование делеций. Согласно недавно полученным данным (Rothstein et al., 1996) продукт гена RAD52 увеличивает скорость отжига олигонуклеотвдных праймеров in vitro в 3500 раз. Из этого следует, что продукты генов системы рекомбинационной репарации могут обеспечивать поиск и отжиг свободного 3'-конца вновь синтезируемой нити вниз или вверх по течению репликации. Мутация pol3-t, изменяя, по нашему предположению, конформацшо ДНК-полимеразы 5 таким образом, что свободный однонитевой конец синтезирующейся нити ДНК становится более доступен продукту гена RAD52, приводит к тому, что поиск и отжиг происходит более эффективно. Другие гены рекомбинационной репарации могут взаимодействовать с продуктом гена RADS2, поэтому, может быть, что в проскальзывании участвует комплекс белков, и мутация в одном из генов влияет на функцию всего комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Мутация роВ-t в гене ДНК-полимеразы 8 увеличивает в 10-500 раз частоты образования делеций по коротким прямым повторам, фланкирующим кваэипаливдромные и непаливдромные инсерции.

2. Мутация ро130-52 в гене ядерного антигена пролиферирующих клеток дрожжей (PCNA) увеличивает частоту делеций квазипалиндромных инсерций, фланкированных короткими прямыми повторами.

3. Мутации в генах системы рекомбинационной репарации - RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RADS7 - снижают частоты jpo/5-Г-стимулируемых делеций непашвдромных инсерций.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горденин Д.А., Дегтярева Н.П., Колотева Н.Н., Лобачев К.С., Малкова АЛ. Инвертированные повторы молекул ДНК индуцируют структурную нестабильность генома у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. И Тезисы доклада на X! симпозиуме "Структура н функции клеточного дара" (Санкт-Петербург, 1921 октября 1993г.)// Цитология,т.35,№10, с. 64-65,1993.

2. Горденин Д.А., Лобачев К.С., Чан-Туан Хиеп, Дегтярева Н.П., М.А.Резник. Длинные инвертированные повторы в ДНК стимулируют возникновение делеций и эктопическую рекомбинацию у дрожжей. // Материалы 1 съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), (Саратов, 20-25 декабря 1994г.) // Генетика, т.ЗО, приложение, с. 35, 1994.

3. Gordenin, D.A., Lobachev, K.S., Degtyareva, N.P., Malkova, A.L., Perkins, E., Resnick, M.A. Inverted DNA repeats: a source of eucariotic genomic instability. // Molecular and Cellular Biology, Vol. 13:5315-5322, 1993.

4. Ттап H., Degtyareva N., Koloteva N., Sugino A., Masumoto H., Gordenin D.A., Resnick M.A. Replication slippage between distant short repeats in Saccharomyces cerevisiae depends on the direction of replication and RADSO and RAD52 genes.// Molecular and Cellular Biology, Vol. 15: 5607-5617, 1995.

5. Degtyareva N., Tran H., Resnick M.A. and Gordenin D.A. Interaction between DSB repair and DNA polymerase delta genes affects formation of repeat-associated

V deletions in yeast .// Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August 6-11,1996 (Abstract).

6. Tran H., Gordenin D.A., Degtyareva N., Resnick M.A. The impact of replication, inverted repeats and mismatch repair on recombination between highly diverged DNAs in yeast.// Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August 6-11,1996 (Abstract).

7. Tran H., N. Degtyareva, D. Zasheva D.Gordenin and M. Resnick. Deletions involving small direct repeats: the role of replication, distance and the RAD50 and RAD52 genes.// Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 16-21,1994 (Abstract).

8. GordeninD., Tran H., Degtyareva N., Koloteva N., andM. Resnick. Genetic factors affecting replication slippage between distant short repeats in yeast.// J. Cel. Bioch., Suppl. 21 A, 1995 (Keystone symposium "Repair and Processing of DNA Damage", TaosNM, March 10-14, p. 307, 1995), (Abstract).

9. Tran H., Gordenin D., Degtyareva N. and M.Resnick. The barirer to recombination between highly diverged DNAs is lowered by long inverted repeates.// FASEB Summer Research Conference "Genetic recombination and Genome Rearrangements". Snowinass Village Co, August 1995 (Abstract).