Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционная и таксономическая генетика дрожжей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Наумова, Елена Сергеевна

Материалы и основные методы исследования. Объектами исследований служили коллекционные и изолированные нами штаммы дрожжей Saccharomyces, Kluyveromyces, Arlhroascus, Williopsis, Zygowilliopsis, Komagataea, Pichia/Hansenula, Galactomyees и Yarrowia. Изученные штаммы приводятся по тексту, в таблицах и рисунках. Происхождение штаммов можно найти на следующих сайтах коллекций в интернете: CBS, (bttp://www.cbs.knaw.nl), АГСС (http://www,lgcpromochem-atcc.corrO, NCYC (http://www.ncyc.co.uk), NRRL (http ://mrl.ncaur. usda.gov/), NBRC/ÍFO (http://www.nbrc.nite.go.jp), UCD (http.7/www,phaffcollection.org) и BKM (http://www.vkm.ru).

Дрожжи культивировали при 28°C на полной стандартной среде YPD, споруляцию индуцировали на ацетатной среде. Споры из асков изолировали с помощью стеклянной иглы микроманипулятора и желудочного сока виноградной улитки. Гомоталличные дрожжи Saccharomyces обычно скрещивали микроманипулятором методами «спора на спору» или «спора на гаплоидную клетку». Гибриды гетероталличных штаммов получали массовым скрещиванием гаплоидных клеток противоположного типа спаривания с последующим выделением зигот микроманипулятором. Ауксотрофные мутанты дрожжей-гаплонтов Kluyveromyces и Arthroascus скрещивали на агаризованной голодной 3%-мальтозной среде, а прототрофные гибриды отбирали на селективной минимальной среде. Ферментацию Сахаров определяли через сутки на рН-индикаторных средах. Все негативные штаммы проверяли в бродильных трубках Дургама (отсутствие брожения в течение 10 суток).

Амплификацию различных участков рДНК, ядерных и митохондриальных генов проводили непосредственно на дрожжевых клетках или с предварительной изоляцией ДНК по методике (Булат и Мироненко, 1990). Полимеразную цепную реакцию (ПНР) осуществляли на ДНК-амплификаторах "Герцик" (Россия) и "ТесЬле" (Великобритания). Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ-анализ), клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов проводили стандартными методами (Sambrook et а!., 1989).

Для выделения ингактной хромосомной ДНК использовали методику (Schwartz and Cantor, 1984) в нашей модификации. Разделения хромосомных ДНК для пульс-электрофореза осуществляли на аппаратах «Pharmacia» (Швеция) и CHEF-DR П1 (Bio-Rad, США). В качестве буфера использовали 0.5 х ТВЕ (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 10 мМ ЭДТА), который охлаждали до 14°С. Хромосомные ДНК переносили на нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, используя капиллярный или вакуумный методы. Для мечения ДНК применяли нерадиоактивную метку на основе UTP, меченного дигоксигенином (dig-11-Dutp) из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I" ("Roche", Германия). Гибридизацию и проявление гибридизациожшх сигналов проводили по инструкции фирмы-изготовителя ("Roche").

Изоферментный (аллозимный) электрофорез проводили на целлюлозо-ацетатных пластинках размером 76 х 76 мм (Helena Laboratories, США). Химическое окрашивание изоферментов осуществляли в темноте в реакционной агаризированной смеси согласно (Hebert and Beaton, 1993).

Определение содержания ДНК проводили с помощью щпометрического анализа по методике (Paulovich and Hartwell, 1995). Использовали цитометр "Becton-Dickinson FACScan analyzer".

Полученные нуклеотидные последовательности анализировали при номощи программы SeqMan package (DNAStar Inc., США). Множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программ CLUSTAL W и BioEdit (Thompson et ah, 1994; Hall, 1999). Филогенетический анализ исследуемых нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием алгоритма Neighbor-Joining из пакета программ PHYLIP 3.52 (Felseristein, 1993) или TREECON (van der Peer and de Wachter, 1994).

ГЛАВА I. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES

Понятие вида является одним из самых важных, но и сложных в биологии. Вид - это группа скрещивающихся между собой природных популяций, репродуктивно изолированных от таких же групп (Мауг, 1942). Биологическая концепция вида, разработанная на высших эукариотах, практически не применялась к низшим эукариотам. Только во второй половине прошлого столетия мигсологи обнаружили наличие репродуктивно изолированных популяций у некоторых аскомицетовых и базидиомицетовых грибов, которые представляют собой различные биологические виды (Perkins et al, 1979; Petersen, 1995).

Вид Saccharomyces cerevisiae был описан на пивных дрожжах в 1838 году (Меуеп, 1838). Более полное описание этих дрожжей было проведено Е. Hansen, (1883, 1888, 1908), который ввел технику чистых культур и дал пивным дрожжам верхового брожения название S. cerevisiae, а низового - S. carlsbergensis. В дальнейшем род Saccharomyces подвергался многочисленным ревизиям. Штаммы, различающиеся по способности сбраживать различные сахара, были описаны как отдельные таксономические виды. История этих ревизий подробно изложена в обзоре J. Bamett (1992). На основании различий по морфологическим и физиологическим свойствам род Saccharomyces был разделен на две группы: Saccharomyces sensu stricto и Saccharomyces sensu lato (van der Wait, 1970). В первую группу были объединены виды-диплонты, характеризующиеся активной ферментацией Сахаров, а во вторую отнесены виды, не близкородственные S. cerevisiae.

В многочисленных работах была продемонстрирована мутационная, комплементационная и комбинативная изменчивость биохимических признаков и их непригодность для видовой дифференциации дрожжей (Scheda and Yarrow, 1966, 1968; Наумов и Юркевич, 1970). В результате, все представители группы Saccharomyces sensu stricto были объединены в один вид Saccharomyces cerevisiae. В определителе дрожжей 1984 года дрожжи Saccharomyces sensu stricto представлены только одним видом S. cerevisiae, к синонимам которого отнесены более 80 видов (Yarrow, 1984).

Генетико-таксономические исследования дрожжей были начаты в лаборатории датского ученого О. Winge (Winge and Lausten, 1939). Способность к скрещиванию и оценка выживаемости аскоспор гибридов были предложены в качестве критерия дифференциации видов внутри рода Saccharomyces. Контролем служила выживаемость аскоспор родительских штаммов. Однако, многие природные и, в особенности, промышленные штаммы дрожжей имеют низкую выживаемость аскоспор из-за их полиплоидности, анеуплоидносги, присутствия рецессивных деталей, делеций, транслокаций и инверсий. Из-за неоднородности родительских спор их суммарная выборка не может характеризовать споры, взятые в скрещивание. Объективная оценка родства между штаммами возможна только при использовании в гибридологическом анализе специально созданных инбредных линий дрожжей с высокой выживаемостью аскоспор (Наумов, 1969). Использование последнего подхода позволило обосновать существование биологического вида S. cerevisiae и отнести к нему рад таксономических видов, первоначально описанных как S. aceti, S. capensis. S. gaditensis, S. hienipiensis, S. lindneri, S. mangini, S. norbensis, S. oleaceus, S. oleaginosas, S. oviformis, S. oxidans и S. hispánico (Наумов, 1979; Наумов и др., 1983). Гибридологический анализ других таксонов-синонимов S. cerevisiae установил биологические виды Ä paradoxus и S. bayanus (Наумов, 1979, 1986; Nauinov, 1987). Данные тотальной ДНК-ДНК реассоциации подтвердили генетическую классификацию дрожжей Saccharomyces sensu stricto и позволили дифференцировать гибридный таксон S. pastorianns (синоним S. carlsbergensis) (Vaughan Martini, 1989; Vaughan Martini and Kurtzman, 1985; Vaughan Martini and Martini, 1987). В определителе дрожжей (Barnett et al., 1990), род Saccharomyces включает 10 видов, представленных типовыми культурами и разделенными на три группы: Saccharomyces sensu stricto (S. cerevisiae с более, чем 130 синонимами, S. bayanus, S. paradoxus и S. pastorianus), Saccharomyces sensu lato (S. castellii, S. dairensis, S. exiguus, S. servazzii и S. unisporus) и S. kluyveri. По результатам ДНК-ДНК реассоциации еще один вид был включен в комплекс Saccharomyces sensu lato: S. transvaalensis (Vaughan-Martini andPollacci, 1996).

1.1. Генетическая идентификация дрожжей Saccharomyces На примере дрожжей Saccharomyces sensu stricto в нашей лаборатории разработаны генетические методы определения видовой принадлежности дрожжей. Протокол генетической идентификации дрожжей включает:

1) Создание высокофертильных инбредных линий родительских культур. В случае гомоталличных штаммов дрожжей такие линии создаются путем моноспорового клонирования, а для гетероталличных штаммов необходим подбор фертильных моноспоровых культур или внутритетрадные скрещивания.

2) Маркирование родительских линий индуцированными ауксотрофными мутациями или использование природных генетических маркеров (способностей ферментировать различные сахара).

3) Контроль мейоза у гибридов.

4) Генетический анализ гибридов: изучение жизнеспособности аскоспор и поведения контрольных маркеров.

Способность дрожжей к скрещиванию указывает на их принадлежность к одному роду, а жизнеспособность аскоспор - продуктов мейоза и регулярное мейотическое расщепление контрольных ауксотрофных и природных маркеров свидетельствуют о принадлежности штаммов к одному биологическому виду. Для гибридов различных видов одного рода характерна стерильность.

Мы использовали приведенную генетическую технологию для определения видовой принадлежности большого количества промышленных и природных штаммов, выделенных из различных источников в разных регионах мира, что позволило выяснить распространение биологических видов Saccharomyces sensu strict». Большинство штаммов, изолированных из антропогенных источников отнесено к биологическому виду S. cerevisiae; редкие природные изоляты которого обнаружены в Сибири, Японии и в Северной Америке. Специфической экологической нишей биологического вида S. bayanus является виноделие при низких температурах. Показано, что сбраживающие мелибиозу винные штаммы Saccharomyces, как правило, относятся к S. bayanus. Среди 45 винных МеГ-штаммов, изолированных в России, Молдавии, Словакии, Швейцарии, Франции, Италии и Испании, три штамма были идентифицированы как S. cerevisiae, а все остальные - как S. bayanus. Только семь природных, изолятоз, выделенных, соответственно, из ручейника в Испании, с поверхности гриба в Словакии, из дрозофилы в США (два штамма), из сокотечений граба в Венгрии и вяза на Дальнем Востоке России (два штамма) были определены как S. bayanus. В природе повсеместно встречается другой биологический вид - S. paradoxus, штаммы которого выделяются из источников, не связанных с деятельностью человека: сокотечения различных широколиственных деревьев, насекомые, неокультуренные почвы и др. Из 50 сокотечений различных видов дубов в Восточной Европе, на Кавказе, Дальнем Востоке и в Северной Америке нами были идентифицированы только дрожжи S. paradoxus и S. cerevisiae, соответственно 46 и 4 штамма.

1.2. Обнаружение новых видов Saccharomyces sensu stricto

Гибридологическим анализом выявлены три генетически изолированные популяции дрожжей-сахаромицетов (две в Японии и одна в Бразилии), штаммы которых образовывали стерильные гибриды между собой и с видовыми тестерами S. cerevisiae, S. bayanus и S. paradoxus (табл. 1). В то же время внутрипопуляционные скрещивания давали ферткльные гибриды с нормальным расщеплением контрольных маркеров. Таким образом, генетические данные свидетельствуют о видовом статусе изученных дрожжей. Мы провели секвенирование гена 18S рРНК у штаммов двух японских Saccharomyces spp. и бразильского Saccharomyces sp. н сравнили полученные результаты с литературными данными по известным видам Saccharomyces sensu stricto, а также по другим таксономически родственным дрожжам (James et al., 1994, 1996, 1997; Cai et al, 1998). Сравнительный анализ выявил большое сходство нуклеотидных последовательностей дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus, трех новых видов Saccharomyces и S. ш^пИатк что свидетельствует об их родстве. Идентичные последовательности генов 18S рРНК обнаружены у пар видов S. cerevisiae/S. paradoxus, S. bayanm/S. pastorianus и двух японских Saccharomyces spp., которые отличаются друг от друга единичными нуклеотидными заменами. Ген 18S рРНК бразильских изолятов UFRJ 50816 и UFRJ 50791 отличается одной заменой (позиция 191, согласно нумерации последовательности гена 18S рРНК дрожжей S. cerevisiae) от S. cerevisiae/S. paradoxus, двумя заменами (позиции 645 и 713) от японских Saccharomyces spp и гремя заменами (позиции 191, 645 и 713) от S. bayanus/S. pastorianus.

Таблица 1. Генетическая идентификация новых видов S. cariocanus (UFRJ 50816т, UFRJ 50791), S. kudriavievii (IFO 1802T, IFO 1803) и S. mikatae (IFO 1815T, IFO 1816) с видовыми тестерами^. cerevisiae (BKM Y-502), S. paradoxus (CBS 5829) и S. bayanus (MCYC 623)

Происхождение Число Жизнеспособ- Расщепление гибридов изолированных ность спор, % контрольных тетрад маркеров*

50816x502 40 0

50816x300 28 0

50816 X 5829 67 0

50816 X 50791 41 95 2 LYS : 2 lys (23)

1802x502 34 0

1802 X 300 40 0

1802x 5829 35 0

1802X1803 52 50 38 LYS : 44 lys

1815x502 29 0

1815x300 31 0

1815x5829 40 0

1815x1816 38 44 22 LYS: 19 lys

1815 X1802т 43 0

1815x50791 43 0

1802x50791 42 0

Приводятся данные тетрадного анализа и случайной выборки спор. В скобках дано количество проанализированных тетрад.

Анализ более вариабельных районов рДНК (внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2) позволил более детально изучить генетическое родство дрожжей Saccharomyces sensu stricto. Сравнительный анализ района ITS показал, что бразильский и два японских Saccharomyces spp. существенно отличаются друг от друга, а также or S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и S. pastorianus. Большие различия обнаружены по участку ITS1, чем по 1Т82. На основании генетического анализа и изучения последовательностей рДНК были описаны три новых для науки вида: 5. сапосапш (бразильские изоляты), 5. кийптгеуи и т1ка1ае (японские изоляты) (№игпоу еХа1., 2000Ь).

S. bayanus CBS424 S. bayanus CBS380T 5. bayanus CBS 1546 S. pastorianus CBS 1513 S. pastorianus CBS1503 S. pastorianus CBS 15381 S. bayanus NCYC 686 .V. bayanus CBS 395 S. bayanus MCYC var. bayanus var. uvarum

S. kudriavzevii IFO 1803 S. kudriavzevii IFO 1802T S. mikatae IFO 1816 S. mikatae IFO 18151 S. cerevisiae S288c S. cerevhiae CBS 1171T S. cari oc an us UFRJ 50791 S. cariocanus UFRJ 508161 j S. paradoxus CBS 432T 1S. paradoxus CBS

1-S. castellii CBS 4309'

Рис. 1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей района ITS 1 рДНК дрожжей Saccharomyces sensu stricto. Приводятся значения бутстрепа >70%. Шкала соответствует 20 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций.

На филогенетическом древе, построенном на основании сравнения нуклеотидных последовательностей района ITS1 рДНК, шесть биологических видов Saccharomyces sensu stricto и гибридный таксон 5. pastorianus сформировали отдельный кластер (рис. 1). Внутри кластера выделяются две группы видов. Первая образована S. cariocanus, S. paradoxus, S. cerevisiae, S. mikatae и S. kudriavzevii. О близком генетическом родстве первых трех видов также свидетельствуют данные полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами - УП-ПЦР. Основным свойством УП-ПЦР является видоснецифичность амплифицированной ДНК, т.е. сходство ПЦР-профилей организмов в пределах биологического вида (Булат и Мироненко, 1996; Bulat et al., 1998). Несмотря на ввдослецифичность УП-ПДР-паттернов, ПЦР-продукты S. cariocanus, S. paradoxus и S. cerevisiae давали гибридизационные сигналы при перекрестной дот-гибридизации (Naumova et а.1, 2003а). Однако интенсивность гибридизационных сигналов была значительно слабее, чем при внутривидовой дот-гибридизации. При перекрестной дот-гибридизации с участием ПЦР-продуктов 5. Ьауапт, 5. тгк^ае и 5*. кисЬ-гаугеуп гибридизационные сигналы полностью отсутствовали.

Таблица 1. Генетическая иденгификация разновидностей S. Ьауапт var. bayanus (CBS 380 и CBS 424) и S. bayanus var. warum (MCYC 623, IFI 369)

Происхождение Число Жизне- Расщепление гибрида изолиро- способ- контрольных маркеров* ванных ность аВ Ab AB ab тетрад спор (%)

S. bayanus var. bayanus х S. bayanus var. bayanus

424 (ade) x 380 (his) 41 64 2Р: 2N: 8Т

S. bayanus var. warum x S. bayanus var. uvarum

623 (ига) x 369 (URA) 25 96 2: 2 (14)

S. bayanus var. uvarwn x S. bayanus var. bayanus

623 (ига) X 380 (gal)

623 (fys) x 380 (his)

623 (lys) x 424 (ade)

623 (ига) x 424 (ade)

623 (ига) x 424 (me!)

S. bayanus var. bayanus x S. cerevisiae

380 (ftisr)x 502 (ade) 31 0 - - -

S. bayanus var. warum x S. cerevisiae

623 (wa) x 502 (ade) 75 0 - - - a и b - соответственно ауксотрофности первого (до знака скрещивания) и второго родителя; А и В - прототрофноста. 2P:2N:8T - соотношение количества тетрад родительского (Р), неродительского (N) дитипов и тетратипа (Т). В скобках приводится количество проанализированных тетрад.

Сравнительный анализ последовательностей района ITS1 рДНК показал, что наиболее дивергентным видом комплекса Saccharomyces sensu stricto является S. bayanus, который вместе с гибридным таксоном S. pastoriamis сформировал отдельную группу на филогенетическом древе (рис. 1). В свою очередь биологический вид S. bayanus является гетерогенным. Штаммы CBS 424, CBS 1546 и типовая культура CBS 380 (последние два штамма выделены в условиях пивоварения) по последовательностям ITS1 не отличаются от гибридных дрожжей S. pastorianus. Вторую подгруппу образовали штаммы, ранее относимые к таксономическому виду S. warum (CBS 395т, NCYC 686 и MCYC 623). Штаммы S. bayanus из двух подгрупп имеют высокий уровень ДНК-ДНК реассоциации (86-100%) (Vaughan-Martini and Kurtzman, 1985). В табл. 2 представлены результаты гибридологического анализа штаммов S. bayanus, отличающихся по последовательностям района ITS1 рДНК. Штаммы, имеющие идентичные последовательности образуют фертильные гибриды с выживаемостью аскоспор: 64% (CBS 380 х CBS 424) и 100% (MCYC 623 х ÍFI 369), что свидетельствует о близком родстве родительских штаммов. Пониженная выживаемость аскоспор (15-34%) гибридов штаммов CBS 380 и CBS 424 с MCYC 623 свидетельствуют о частичной генетической изоляции изученных штаммов. В то же время скрещивания с участием штаммов двух подгрупп и видового тестера S. cerevisiae ВКМ Y-502 давали полностью стерильные гибриды. Таким образом, результаты филогенетического анализа последовательностей района ITS! и генетические данные свидетельствуют о сложном составе вида S. bayanus и позволяют дифференцировать две разновидности: S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum.

1.3. Молекулярные кариотипы дрожжей Saccharomyces sensu stricto Разработка метода пульс-электрофореза интактных хромосомных ДНК создала принципиапьно новые основы для изучения организации геномов, эволюции и систематики зукариотических микроорганизмов. Электрофорез интактных хромосомных ДНК представляет своего рода «молекулярную кариологию» и в последние годы широко используется для сравнительного анализа различных дрожжей. Первые молехулярные кариотипы были получены в середине 80-х годов прошлого века для S. cerevisiae (Carle and Olson, 1984, 1985; Schwartz and Cantor, 1984). Сочетание молекулярного кариотипирования и последующей Саузерн-шбридизации хромосомной ДНК с картированными клонированными генами позволило определить у лабораторных штаммов S. cerevisiae соответствие всех 16 электрофоретических полос конкретным группам сцепления, ранее идентифицированным рекомбинационным анализом (Mortimer et al, 1992). Сравнение геномов биологических видов Saccharomyces sensu stricto мы проводили с помощью кариотипического анализа (рис. 2). Для идентификации отдельных хромосомных полос использовали кариотип стандартного штамма S. cerevisiae YNN 295, имеющего известные размеры и порядок хромосом (дорожка 1). По интенсивности свечения окрашенных бромистым этидием хромосомных полос судили о том, какие из них являются двойными. Установлено, что все изученные биологические виды обладают одинаковыми базовыми кариотипическими характеристиками, а именно гаплоидным числом хромосом равным 16 и предельными размерами хромосомных полос от 245 до 2200 т.п.н. В то же время индивидуальные размеры каждой хромосомы могут варьировать у разных видов. По своим кариотипам S. bayanus и S. cariocanus легко отличимы от S. paradoxus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. cerevisiae. Последние четыре вида имеют достаточно схожие кариотипы. С помощью молекулярного кариотипирования можно также дифференцировать разновидности S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var.

Рис. 2. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК дрожжей Saccharomyces sensu stricto. Дорожки: 1- S. cereyisiae YNN 295 (хромосомный стандарт). 5. cerevisiae: 2- CBS 1171T, 3 — BKM Y-502. S. bayanus: 4 -CBS 380r, 5 - MCYC 623. S. paradoxus: 6 - CBS 432T, 7 -CBS 5829. S. kudriavzevii: 8 -IF О 1802T, 9 - IF О 1803. S. mikatae: 10 - IFO 1815T, 11 -IFO 1816. S. cariocanus: 12 UFRJ 50791, 13-UFRJ 50816'. Нумерация и размеры хромосом (т.п.н,) приводятся по хромосомному стандарту YNN 295. Т- типовая культура.

XII, iV

XI, VII XVI

IX III VI

Рис. 3. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК дрожжей Saccharomyces bayanus. S. cerevisiae: 1 -YNN 295; S. bayanus var. bayanus: 2 - CBS 380T, 3 - CBS 378, 4 - CBS 1546, 5 - CBS 424, 6 - CBS 3008, 7 - CBS 1505,8 - CBS 425; S. bayanus var. warum: 9 -CBS 395, 10- CBS431, 11-CBS 1604, 12-MCYC623, 13-CBS 1146,14-D13-8A, 15 - SRC 55, 16 - SmI-5A, 17 -PJpll, 18 - IFI 362, 19 - NCAIM Y.00789. Нумерация хромосом и их размеры в т.п.н. приводятся по хромосомному стандарту YNN 295. Стрелка указывает хромосомную полосу размером 1300 т.п.н.

1 2 3 4 5 б warum (Наумова и др., 1991). На рис. 3 представлены молекулярные кариотипы 18 штаммов 5. bayanus различного происхождения. Все штаммы обладают, характерной для кариотипа S. bayanus, хромосомной полосой размером 1300 т.п.н. Кариотипический анализ выявил два типа паттернов у изученных дрожжей. Кариогип семи штаммов, включая типовую культуру вида S. bayanus (дорожки 2-8), характеризуется тремя и более хромосомными полосами в районе 245-370 т.п.н., тогда как у остальных штаммов имеется только две хромосомы этого размера (дорожки 9-19). Две разновидности дрожжей S. bayanus отличаются также по последовательностям межгенного спейсера 1GS2 рДНК (Nguyen et al., 1997, 2000).

С помощью молекулярных зондов S. cerevisiae было проведено детальное сравнение кариотипов шести видов Saccharomyces sensu stricto. Хромосомные ДНК штаммов, представленных на рис. 2, Саузерн-блотом были перенесены на нитроцеллюлозкую мембрану и гибридизованы с 27 молекулярными маркерами S. cerevisiae, картированными на всех 16 хромосомах: ÁDE1 (хромосома í-R), LYS2 (II-R), МАТа (III), LEU2 (III-L), TRP1 (IV-R), HO (IV-L), URA3 (V-L), ACT1 (VI-L), STE2 (VI-L), METIO (VI-R), TRP5 (VII-L), ARG4 (VIII-R), CUP1 (VIII-R), LYS1 (IX-R), SUC2 (IX-L), TRK1 (X-L), CEN10 (X), MET14 (XI-R), URA1 (XI-L), rDNA (XII), CEN13 (XIII), MET2 (XIV-L), CEN14 (XIV), HJS3 (XV-R), ADH1 (XV-L), MFal (XVI-L), CENI 6 (XVI). Саузерн-гибридизация подтвердила большое сходство кариотипов видов S, cerevisiae и S. paradoxus. Порядок и размеры всех 16 гомеологичных хромосом у этих видов одинаковые.

Рис. 4. Молекулярные кариотипы дрожжей S. cerevisiae (YNN 295), 5. mikatae (IFO 1815 и IF01816), S. bayanus (MCYC 623) и S. cariocanits (UFRJ 50816). Нумерация хромосом приводится по штамму YNN 295. Дублеты хромосом обозначены жирными линиями.

Римскими цифрами отмечены пары хромосом, между которыми произошли реципрокные транслокации,

Интенсивность гибридизационных сигналов у штаммов S. paradoxus варьировала в зависимости от используемого зонда. Такой же порядок и размеры гомеолошчных хромосом имеет вид S. kudriavzevii, однако интенсивность гибридизационных сигналов была значительно слабее, чем у штаммов S. paradoxus. Остальные три вида Sacchctromyces sensu stricto имеют неколинеарные кариотипы (рис. 4). У S. cariocanus выявлено четыре реципрокные транслокацаи, затрагивающие восемь хромосом: IX/XV, II/XVI, XI/IV и XII/XIV. Реципрокная транслокация, между хромосомами VI и VII, отмечена у обоих штаммов S. mikatae: IFO 1815 и IFO 1816. У первого штамма обнаружена дополнительная транслокация, затрагивающая также хромосому XVI. Три реципрокные транслокации выявлены у S. bayanus: между хромосомами XV и VIII, IV и II, X и VI. Причем, последняя реципрокная транслокация обнаружена только у разновидности S. bayanus var. uvarum. Недавно у штаммов S. bayanus var. uvarum обнаружена дополнительная не реципрокная транслокация, затрагивающая хромосомы V и VII (Fisher et al., 2000). Таким образом, только три хромосомы (I, III и XIII) имеют примерно одинаковые размеры у всех видов Saccharomyces sensu stricto. Известно, что в хромосоме Ш расположен локус типа спаривания и молчащие кассеты типов спаривания, последние локализованы в концевых районах хромосом.

1.4. Молекулярная дифференциация дрожжей Saccharomyces sensu lato

Виды Saccharomyces sensu stricto легко дифференцируются молекулярным кариотипированием от генетически не родственных дрожжей Saccharomyces sensu lato и S. kluyveri (Naurnov et al., 1995a; Naumova et al., 1996b).

Сравнительный анализ молекулярных кариотипов 48 штаммов таксономических видов S. dairensis, S. exiguus, S. castellii, S. transvaalensis, S, setvazzii и S. unisporus выявил значительный полиморфизм хромосомных ДНК. Молекулярные кариотипы некоторых штаммов представлены на рис. 5. Хромосомная ДНК различных штаммов разделялась на 7-16 электрофоретических полос. Согласно интенсивности свечения окрашенных бромистым этидием полос, некоторые из них содержат более одной хромосомы. Наиболее гомогенными по молекулярным кариотипам являются дрожжи S. castellii и S. unisporus. У штаммов этих видов незначительный полиморфизм отмечен только для хромосомных полос большого размера (от 1000 до 2000 т.п.н.). На основании молекулярных кариотипов 16 изученных штаммов S. exiguus были разделены на пять групп, различающихся по числу и размерам хромосомных полос, и, по-видимому, представляющих собой различные виды. Наиболее гетерогенными оказались дрожжи S. dairensis; каждый из пяти изученных штаммов имел уникальный кариотипический профиль.

Для- изучения генетического родства дрожжей с различными кариогипическими профилями было проведено секвенирование мигохондриального гена АТР9. Секвенированию были подвергнуты 32 штамма Saccharomyces sensu lato и пять штаммов Saccharomyces sensu stricto. На основании полученных и имеющихся в базах данных нуюхеотидных последовательностей было построено филогенетическое древо (рис. 6). Шесть биологических видов Saccharomyces sensu stricto и гибридный таксон S. pastorianus сформировали отдельный кластер со 100% статистической поддержкой. Филогенетический анализ подтвердил значительную гетерогенность таксономических видов Saccharomyces sensu lato. Только изоляты S. castellii имели идентичные последовательности гена ÁTP9, что хорошо согласуется с данными кариотипического анализа. Штаммы S. exiguus разделись на те же пять групп, что и на основании кариотипического анализа. По данным ДНК-ДНК реассоциадии на базе штаммов CBS 3019/CBS 5530 и CBS 6946/CBS 5648 были описаны новые виды, соответственно, S. spencerorum и S. bamettii (Vaughan-Martmi, 1995). Из пяти штаммов S. dairensis, имеющие различные последовательности гена АТР9, три были отнесены к новым видам: S. kunashirensis (CBS 7662), S. martiniae (CBS 6334) и Kazachstania vitícola (CBS 6463) (James et cd., 1997).

Проведенный С. Kurtzman и С. Robnett (1998) анализ домена D1/D2 26S рДШС у типовых культур всех известных на тот период видов аскомицетовых дрожжей позволил разделить их на одиннадцать кладов. Клад Saccharomyces наряду с дрожжами Saccharomyces sensu stricto и Saccharomyces sensu lato включил в себя также представителей родов Arxiozyma, Eremotheciwn, Hanseniaspora (анаморфа, Kloeckerä), Khtyveromyces, Torulaspora, Zygosaccharomyces и других. Недавно проведен комплексный мультигенный филогенетический анализ клада Saccharomyces, на основании которого 75 видов были разделены на 14 кластеров (Kurtzman and Robnett, 2003). Виды Saccharomyces sensu stricto сформировали на филогенетическом древе отдельный кластер, а представители Saccharomyces sensu lato и S. kluyveri распределились между четырьмя другими кластерами. На основании полученных данных была проведена ревизия таксономического рода Saccharomyces (Kurtzman, 2003). В составе рода Saccharomyces были оставлены только дрожжи комплекса Saccharomyces sensu stricto (S. bayanus, S. cariocanus, S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus и гибридный таксон S. pastorianus). Виды, ранее входившие в комплекс Saccharomyces sensu lato, распределились между родами Kazachstania {S. servazzii, S. unisporus, S. transvaalensis, S. martiniae, S. spencerorum, S. rosinii, S. kunashirensis, S. exiguus, S. barnettii) и Naumovia (S. castellii, S. dairenemis), a S. kluyveri был помещен в новый род Lachancea.

1.5. Разработка молекулярных методов идентификации дрожжей

Saccharomyces

Для изучения природного разнообразия дрожжей-сахаромицетов необходимо оперировать большим количеством штаммов известной видовой принадлежности. Биологические виды рода Saccharomyces имеют очень похожие морфологические и физиологические признаки и практически неразличимы на основании стандартных таксономических тестов. Однозначное определение их видовой принадлежности возможно только с помощью гибридологического анализа, ДНК-ДНК реассоциации и секвенирования района ITS 1 рДНК. Указанные методы требуют много времени, а последние два также значительных материальных затрат. Генетический анализ неприменим для исследования штаммов, которые не спорулируют или имеют нежизнеспособные аскоспоры. В этой связи стояла задача разработать молекулярные экспресс-методы, позволяющие проводить скрининг большого количества штаммов и достоверно определять их видовую принадлежность, а также дифференцировать индивидуальные штаммы в пределах одного вида.

Таблица 3. Рестрикгазный анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов некодирующих районов рДНК дрожжей Saccharomyces

Видовое название Размеры рестрисгазных фрагментов

5.8.S-ITS рДНК IGS2 рДНК

Eaelll Hpall AM

S. cerevisiae * 325+230+170+125 725+125 1130+

S. cariocanm 325+230+170+125 850 1130+

S. paradoxus 325+230+170+125 850 1130+

S. mikatae 495+230+125 850 1100+

S. kudriavzevii 495+230+125 725+125 1200+

S. bayanus 495+230+125 725+125 470+360+230+170+ var. bayanus

S. bayanus 495+230+125 725+125 610+520+ var. uvarum

S. pastorianus 495+230+125 725+125 470+360+230+170 +

IGS2 фрагмент дрожжей S. cerevisiae имеет также Banl-сайт рестрикции.

У 37 штаммов дрожжей Saccharomyces, видовая принадлежность которых была установлена генетическим анализом, проведена амплификация фрагмента рДНК, включающего S.8S рДНК и внутренние траскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 (5.88-1Т8-фрагмент). Показано, что с помощью рестриктазного анализа 5.88-1Т8-фрагментов эндонуклеазами НаеIII и Hpall можно отличить виды S, cerevisiae, S. paradoxus и S. mikatae от пар видов S. cariocanusiS. paradoxus и S. bayanus/S. kudrictvzevii (табл. 3). Рестрихтазный анализ ПДРамплифицированного межгенного спейсера 2 (1GS2) с помощью эндонуклеазы ^Ы дозволил дифференцировать S. bay amis от S. kudriavzevii, а также две разновидности S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. tcvarum. Неразличимые ПДРФ-анализом виды S. paradoxus и S. cariocanus можно отличить молекулярным кариотипированием (рис. 2, дорожки 6, 7 и 12,13).

Обнаружено полное соответствие молекулярной и генетической идентификации штаммов. Для подбора праймеров, позволяющих проводить молекулярное типирование (дактилоскопию) индивидуальных штаммов, было использовано 22 олигонуклеотида (Naumova et а!., 2000). Бьшо отобрано четыре RAPD-праймера (М13, ОРА-04, ОРА-09 и (GTG)S), дающих воспроизводимые ПЦР-профили с большим количеством четких полос и позволяющих дифференцировать шесть биологических видов. Наибольшая штаммовая вариация ПЦР-профилей отмечена с праймером (GTG)5. Этот молекулярный маркер, имеющий множественную локализацию в геноме дрожжей Saccharomyces (Lieckfeldt et al„ 1993), позволяет сравнивать большое количество полиморфных локусов. В дальнейших экспериментах использовали ПДРФ-анализ двух некодирующих участков рДНК для видовой идентификации штаммов, а для изучения внутривидового полиморфизма применяли ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)j.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Наумова, Елена Сергеевна

3.4. Заключение

По существу, все дрожжи Saccharomyces, прямо или косвенно связанные с деятельностью человека, являются культурными и, за небольшими исключениями, относятся к виду S. cerevisiae. Штаммы S. cerevisiae, изолированные из ферментадионых процессов в разных регионах мира характеризуются большим разнообразием физиологических свойств, полиморфизмом молекулярных кариотянов и вариабельностью последовательностей ITSl-района рДНК. Напротив, редкие природные изоляты S. cerevisiae очень похожи по молекулярным кариотипам и по ферментационым спектрам с дикими дрожжами S. paradoxus. Несмотря на значительную внутривидовую вариабельность генетических и фенотипических признаков штаммы S. cerevisiae различного происхождения, включая природные изоляты, образуют между собой фертильные гибриды с регулярным мейотичесхим расщеплением контрольных маркеров. Таким образом, можно говорить о существовании одной неструктурированной популяции дрожжей S. cerevisiae.

Холодоустойчивые дрожжи S. bayanus преобладают в ферментационных процессах, осуществляемых при низких температурах: белые сладкие вина, шампансхое, сидр и другие. Выделенные в условиях пивоварения дикие дрожжи S. bayanus var. bayanus характеризуются плохим спорообразованием, очень низкой выживаемостью аскоспор и, как правило, являются анеуплоидными. По-видимому, это связано с тем, что они не проходили полный жизненный цикл, в частности спорообразование, и таким образом накапливали генетический груз. По многим молекулярным маркерам дрожжи S. bayanus var. bayanus отличаются от S. bayanus var. uvarum. Феномен интрогрессии обнаружен между дрожжами S. cerevisiae и S. bayanus var. bayanus, но не встречается среди винных дрожжей iS. bayanus var. uvarum. Штаммы S. bayanus var. uvarum, как правило, хорошо спорулируют и имеют жизнеспособные аскоспоры. Так же как и S. cerevisiae, дрожжи S. bayanus var. uvarum не структурированы на отдельные популяции. Штаммы, изолированные в различных регионах мира из разных типов вин, генетически не изолированы и образуют между собой фертильные гибриды. Межвидовые гибриды S. cerevisiae и S. bayanus встречаются в условиях пивоварения и виноделия. Пивные дрожжи низового брожения S. pastorianus являются гибридами S. cerevisiae х S. bayanus var. bayanus, тогда как в условиях виноделия образуются гибриды S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum. Кроме того, в сидре обнаружен гибрид трех видов: S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum х S. kudriavzevii.

В отличие от S. cerevisiae и S. bayanus, дрожжи S. paradoxus не связаны с деятельностью человека и обитают исключительно в природных условиях. Хорошая спорулядия, высокая жизнеспособность аскоспор и внутривидовая гомогенность молекулярных жариотипов вида S. paradoxus может быть связана с его приуроченностью к природным местам обитания. Спорообразование диких дрожжей в природе приводит к элиминации мутантных аллелей и хромосомных перестроек. Происходит так называемое «обновление генома» -genome renewal (Mortimer et al., 1994), что способствует выживанию дрожжей в природных условиях. Вид S. paradoxus представлен, по крайней мере, четырьмя географическими популяциями: европейской, дальневосточной, североамериканской и гавайской. Указанные географические популяции имеют частичную репродуктивную изоляцию, а также отличаются по спектру изоферментов я по нуоеотидным последовательностям ITSl-района рДНК. Географические популяции S. paradoxus представляют собой ранние стадии аштопатрического видообразования.

ГЛАВА 4. ТАКСОГЕНЕТИКА НЕТРАДИЦИОННЫХ ДРОЖЖЕЙ

В последние годы генофонд дрожжей, используемых в фундаментальных исследованиях и прикладных разработках, постоянно расширяется. Все больше внимания уделяется нетрадиционным несахаромицетным дрожжам с уникальными свойствами. Многие нетрадиционные виды являются продуцентами разнообразных физиологически активных веществ и могут служить биологическими агентами, подавляющими развитие вредных грибов на растениях, зерне и пищевых продуктах, а также микозов. Полноценное использование указанных дрожжей невозможно без знания их физиолого-генетическкх характеристик и научно обоснованной классификации и идентификации. Генетические и молекулярные методы и подходы, разработанные нами на дрожжах Saccharomyces, были использованы для классификации и идентификации дрожжей мало исследованных родов: Arthroascus, Galactomyces, Kluyveromyces, Komagataea, Pichia/Hansen ula, Saccharotnycopsis, Williopsis, Zygowilliopsis и Yarrowia.

Род Pichia/Hansenula Hansen sensu Kurtzman 1998, крупнейший no численности, является одним из самых гетерогенных, а, следовательно, и мало обоснованных родов. Согласно проведенному нами молекулярному анализу, типовой вид рода P. membranaefaciens также гетерогенен и, очевидно, состоит из нескольких видов-двойников (Наумов и др., 1995). На основе генетического анализа и молекулярного кариотипирования показано, что таксон Н. polymorpha/P. angusta является комплексом, включающим три биологических вида-двойника (Naumov et al., 1997а). Генетический анализ коллекционных штаммов биоконтролирующих дрожжей Н. anómala выявил их гетерогенность (Naumov et al., 2001с). Большинство штаммов являются полиплоидными, вероятно тетраплоидными, о чем свидетельствует расщепление контрольных ауксотрофных маркеров. Как правило, изоляты Н. anómala являются гомоталличными с задержанной самодиплоидизацией; обнаружены редкие стабильные гетероталличные штаммы. Выявлен значительный полиморфизм кариотипов дрожжей Н. anómala по числу хромосом (от 9 до 12) и их размерам.

Обнаруженный полиморфизм не связан с происхождением штаммов (источником и местом выделения).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17

3130

2700

2200

1660

1050-*

Рис. 25. Молекулярные кариотипы дрожжей К. lactis. Хромосомные стандарты: 1 -S. cerevisiae YNN 295, 2 - Pichia canadensis YB-4662-VIA. К. Iactis var. lactis: 3 -CBS 683 , 4 - NRRL Y-l 140, 5 - NRRL Y-II 18; популяция "phaseolosporus": 6 -BKM У-1296; популяция "phaseoîosporus"; 7 - BKM У-1302; популяция "krassilnikovii": 8 - BKM У-831, 9 - BKM У-834, 10 - CBS 2896, 11 - CBS 2877, 12 -CECT i 122, 13 - Vor. 86, 14 - Est. 86. Kluyveromyces sp.: 15 - ДВЗО; популяция" 'vanudenii": 16 - BKM У-1535; K. marxianus: 17 - CBS 5669. Размеры хромосом указаны в г.п.н. В настоящее время вторым по значению объектом молекулярной генетики и биотехнологии эукариотических микроорганизмов после S. cerevisiae становятся дрожжи Kluyveromyces lactis. По существу эти усваивающие лактозу дрожжевые организмы можно назвать культурными, так как они ассоциированы с молочнокислыми продуктами. Проведенный нами гибридологический анализ и молекулярное кариогипирование показали сложный состав вида К. lactis, включающего наряду с культурными молочными, усваивающими лактозу (Lac+), дрожжами и дикие штаммы Lac" (Naurriov and Naumova, 2002). Последние дрожжи представлены частично генетически изолированными популяциями "krassilnikovii", "drosophilarum", "phaseolosporus" и "vanudenii". Межполуляционные гибриды были полустерильными (выживаемость аскоспор 0-24%), тогда как внутрипопуляционные гибриды были высокофертильными с выживаемостью аскоспор 97-100%. Североамериканские дрожжи "phaseolosporus" и "drosophilarum" очень сильно отличаются кариотипами как друг от друга, гак и от других штаммов (рис. 25, дорожки 6 и 7). Кроме того, уникальный кариотип имеют дрожжи "vanudenii" (рис. 25, дорожка 16). Дрожжи К. lactis var. lactis и "krassilnikovii" генетически не изолированы и имеют практически идентичные кариотипы (рис. 25, дорожки 3-5 и 8-14). Эти дрожжи имеют только экологическую изоляцию: дикие дрожжи "krassünikovii" не сбраживают лактозу и обитают в сокотечениях деревьев. Отсутствие генетической изоляции указывает на то, что культурные молочные дрожжи К. ¿actis var. lactis произошли от диких европейских дрожжей - популяции "krassilnikovii".

Благодаря специфическим ферментным активностям дрожжеподобные грибы Galactomyces играют важную роль в пищевой промышленности. С помощью ПЦР с иикросателлитными праймерами, электрофореза изоферментов и молекулярного кариотипирования были охарактеризованы 52 штамма Galactomyces (Naumova et al., 2001). Проведена молекулярная дифференциация шести таксонов этого рода, а в комплексе G. geotrichum обнаружено четыре вида-двойника.

Дрожжи, объединенные в таксономический род Saccharomycopsis sensu Kurtzman 1998, обладают уникальным свойством - хищничеством. Они способны проникать в клетки аскомицетовых и базидиомицетовых дрожжей и убивать их. На основании молекулярных и генетических данных нами проведена ревизия рода Saccharomycopsis и восстановлен род Arthroascus von Агх, объединяющий гибридизируемые виды A. schoenii, A. javanensis и А. fermentans (Naumov et al., 2003). Сравнительный анализ районов D1/D2 26S рДНК показал, что род Saccharomycopsis полифилетичен (рис. 26). Со 100% достоверностью выделяются четыре группы видов, которые не имеют между собой близкого генетического родства. Одна из этих групп объединяет виды Arthroascus, имеющих общую систему типов спаривания. Молекулярно-генетический анализ 28 штаммов Arthroascus, изолированных в разных регионах мира: Европе, Северной Америке, Дальневосточной Азии и Гавайских островах, позволил обнаружить два японских штамма IFO 10138 и UCD 67-278, представляющих собой, соответственно, новый вид A. babjevae sp. nov и новую разновидность A. fermentans var. arxii var. nov. (Naumov et al., 2006). Наши результаты показали, что A. schoenii является космополитным видом, тогда как A. javanensis представлен только типовым штаммом из Индонезии. Кластерный анализ выявил коррелляцию между микросателяитными ПЦР-профилями и географическим происхождением штаммов A. schoenii. Несмотря на молекулярную дифференциацию, штаммы A. schoenii, выделенные в различных регионах мира, образовывали фертильные гибриды с нормальной рекомбинацией контрольных маркеров. Кариотипический анализ видов S. crataegensis, S, vini, S. fibuligera, S. capsularis и S. malanga подтвердил гетерогенность рода Saccharomycopsis (Наумова и др., 1996а). Молекулярное кариотипирвоание и Саузерн-гибридизация с клонированными генами Yarrowia Hpolytica выявили значительную дивергенцию между видами Saccharomycopsis и фенотипически достаточно сходными дрожжами Y. Hpolytica (Naumova et al., 1993).

60

0.02

100

100

100

100

100 i

96 , A. schoenii UCD 71 -182 » A. schoenii UCD 72-139 A. schoenii UWO 80-91 A. schoenii С BS 6423 A. schoenii CBS 7223 (T) A. schoenii CBS 7425 A. schoenii CBS 6449 A. schoenii UWO 92-247.1

- A. bab/evae UCD 67-278*

- A.Javanensis CBS 2555 (T)

100 i A. fermentans CBS 7830 (T) A. fermentans var. arxii IFO 10138*

- Candida lassenensis CBS 8524 (T)

- S. fibuligera CBS 2521 (T)

- S.vini CBS 4110 (T)

-Candida sp. UWO 95-697.4

- Candida sp, UWO 91-124.1 S. selenospora CBS 2562 (T) S. malanga CBS 6267 (T) ■ S. capsularis CBS 2519 (T) S. crataegensis CBS 6447 (T) Candida amapae CBS 7872 (T)

Г. С

100 г— S. synnaedendra CBS 6161 (T)

S. microspora CBS 6393 (T) Candida sp. UWO 91-127.1

Рис. 26. Консенсусное древо, построенное на основании нуклеотидных последовательностей района D1/D2 рДНК 16 видов клада Saccharomycopsis. Звездочкой отмечены определенные нами последовательности. Т-типовая культура.

Роды Wiüiopsis, Zygowüliopsis и Komagataea включают природные изоляты, выделяемые преимущественно из почвы. Молекулярный анализ комплекса Williopsis sensu stricto подтвердил генетические данные о существовании шести видов-двойников: W. saturnus, W. bejerinckii, W. mrakii, W. sargentensis, W. suaveolens и W. subsufficiens (Наумова и др., 2001 ab, 2004; Naumova et al., 2004). Разработаны молекулярные методы идентификации этих видов. У дрожжей Komagataea pratensis обнаружены две географические популяции (Наумова и др., 2001а). Молекулярными методами показан сложный состав рода Zygowüliopsis (Токарева и др., 2001; Наумова и др., 2003b, 2006), ранее этот род был монотипным. Дифференцированы таксоны Z. californica var. californica, Z. californica var. dimmenae comb. nov., stat. nov. и Z. californica var. fukushimae comb. nov., stat. nov.

Многие современные роды дрожжей согласно (Kurtzman and Fell, 1998) гетерогенны и содержат комплексы генетически родственных видов, имеющих одинаковую систему типов спаривания, позволяющую им скрещиваться. Такие генетически родственные виды представляют собой генетические роды (Наумов, 1979). Генетически хорошо очерченные роды Arthroascus, Kluyveromyces, Williopsis, Zygowilliopsis, а также комплексы Galactomyces geotrichum и H. polymorpha включают близкородственные виды, обладающие общей системой типов спаривания и образующие отдельные кластеры на филогенетических деревьях, построенных на основании последовательностей рибосомальных генов.