Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces

Сухотина, Наталия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces"

М'

V и

.е 11

р \ На правах рукоп пси

Сухотина Наталия Николаевна

Геносистематика дрожжей рода Шиууеготусеэ

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003054431

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики, таксономии и экологии дрожжей (зав. лабораторией, доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов) в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП ГосНИИгенетика), г. Москва.

Научный руководитель:

Ведущая организация:

отдел эволюционной биохимии научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «в » марта 2007 г. в 14— на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Факс: (495) 315-05-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИгенетика.

Автореферат разослан « О » Февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Наумова Елена Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Лившиц Виталий Аркадьевич кандидат биологических наук Лысенко Анатолий Михайлович

кандидат биологических наук

Заиграева Г.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молочные дрожжи Kluyveromyces являются одним из основных объектов молекулярной генетики и широко используются в биотехнологии как продуценты ряда биологически активных веществ. Создан европейский клуб по молекулярной биологии дрожжей Kluyveromyces, ежегодно проводящий международные конференции. Полноценное использование этих дрожжей невозможно без знания их физиолого-генетических особенностей и научно обоснованной классификации и идентификации.

Систематическое положение дрожжей рода Kluyveromyces подвергалось многочисленным ревизиям: пересматривался их родовой и видовой статус. Первоначально описанные в роде Saccharomyces (Lodder и Kreger-van-Rij, 1952), эти дрожжи включали в состав различных родов: Zygosaccharomyces, Fabospora, Zygofabospora и др. После того как van der Walt изменил первоначальный диагноз полиспорового рода Kluyveromyces, в него были включены немногоспоровые дрожжи Saccharomyces marxianus и родственные виды (van der Walt, 1965). Генетический анализ и секвенирование рибосомальных генов выявили полифилию рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt (Наумов, 1986, 1987; Cai et al, 1996; Kurtzman, Robnett, 1998). Внутри этого гетерогенного рода была выделена группа, включающая гибридизируемые виды (К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii) и таксономически близкие дрожжи К. aestuarii и К. nonfermentas. На основании мультигенного филогенетического анализа была проведена ревизия клада Saccharomyces и консервация рода Kluyveromyces, в котором были оставлены только шесть указанных видов (Kurtzman, 2003). В этом составе Kluyveromyces фактически является переименованием рода Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov 2002.

Для создания научной классификации дрожжевых организмов и получения достоверных сведений об их эволюции необходимо, помимо фенотипических признаков, изучать молекулярные признаки генотипов. Последние являются предметом изучения геносистематики или макромолекулярной систематики (Антонов, 1967, 2005). Недавно проведенное секвенирование генома дрожжей К. lactis (Bussereau et al., 2006) заложило хорошую основу для изучения других видов этого рода. Однако молекулярные исследования проводятся на ограниченном количестве штаммов Kluyveromyces, в основном на типовых культурах и генетических линиях одного происхождения. Таким образом, изучается только ограниченная часть генофонда этих дрожжей, а их природное разнообразие остается не исследованным. Практически ничего не известно о популяционно-генетических

особенностях важных для науки и практики культивируемых дрожжей рода Kluyveromyces и их диких родственников.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции культурных и диких дрожжей рода Kluyveromyces на материале штаммов различного экологического и географического происхождения. В этой связи в работе решались следующие задачи:

1. Разработка экспресс-метода молекулярной идентификации видов рода Kluyveromyces и молекулярного типирования отдельных штаммов.

2. Сравнение геномов видов рода Kluyveromyces.

3. Изучение генетического внутривидового разнообразия молочных дрожжей К. ¡actis, К. marxianus и их диких родственников.

4. Сравнительный анализ геномов молочных и клинических штаммов Kluyveromyces.

5. Молекулярно-генетическое изучение природных популяций дрожжей К. dobzhanskii и К. wickerhamii.

Научная новизна и практическая значимость. На материале штаммов различного происхождения впервые проведено изучение природного разнообразия дрожжей рода Kluyveromyces. На основании полученных данных разработан экспресс-метод молекулярной дифференциации этих дрожжей с помощью рестриктазного анализа межгенного спейсера IGS2 рДНК. Для типирования отдельных штаммов предложено использовать ПЦР-анализ с праймерами (ATG)5, (GTG^, и ОРА-11. С помощью пульс-электрофореза интактных хромосомных ДНК получена информация о видовых особенностях геномов дрожжей Kluyveromyces. Установлено, что виды К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii имеют одинаковое гаплоидное число хромосом, равное восьми, а К. Iactis - равное шести. Предельные размеры хромосомных полос существенно различаются у четырех видов.

Выявлены недостатки существующей классификации дрожжей К. Iactis, а именно неправильное разделение на две разновидности К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum. Обнаружена гетерогенность разновидности К. lactis var. drosophilarum, у которой дифференцировано девять генетических популяций. Показано, что вид К marxianus также не является гомогенным и включает три дивергентные популяции: 1) собственно "marxianus" - природные космополитные дрожжи; 2) "fragilis" - молочные, также космополитные дрожжи; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке. Впервые установлено, что по многим молекулярным маркерам клинические изоляты К. lactis и К. marxianus не отличаются от штаммов этих видов, выделенных из молочных продуктов и, очевидно, происходят от них.

Впервые проведено изучение популяционной структуры природных дрожжей К. dobzhanskii. Показано, что этот вид включает, по крайней мере, три географические популяции (европейскую, североамериканскую и дальневосточную).

Создана большая коллекция охарактеризованных молекулярными методами штаммов К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii, которые могут быть использованы в фундаментальных исследованиях и прикладных разработках.

Место проведения работы. Отдельные эксперименты выполнены в секторе молекулярной биологии дрожжей в ГосНИИгенетика, а также в институте агрохимии и пищевых продуктов г. Валенсия (Испания) при поддержке гранта Европейского микробиологического общества для молодых ученых и аспирантов (FEMS FELLOWSHIP 2004-1).

Апробация работы и публикации. Основные положения работы были представлены на 1-м конгрессе Европейского микробиологического общества (2003, Любляна, Словения); 2-м Международном Конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (2003, Москва); 2-м, 3-м, 4-м Всероссийском Конгрессе по Медицинской Микологии (Москва, 2004, 2005, 2006) и на 22-й Международной Конференции по Генетике и Молекулярной Биологии Дрожжей (2005, Братислава, Словакия). Диссертационная работа была апробирована на заседании секции генетики микроорганизмов Ученого совета ГосНИИгенетика 19 октября 2006 года.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть и обсуждение, а также заключение и выводы. Материалы диссертации изложены на 153 страницах машинописного текста, содержат 38 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 188 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе было изучено 169 штаммов Kluyveromyces различного происхождения. Дрожжи получены из следующих коллекций: АТТС - American Type Culture Collection, Роквиль, США; ВКМ -Всероссийская Коллекция Микроорганизмов, Москва; CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Утрехт, Голландия; СЕСТ - Spanish Type Culture Collection, University of Valencia, Валенсия, Испания; NCYC - National Collection of Yeast Cultures, Норидж, Англия; NRRL - Northern Region Research Center, Пеория, Иллинойс, США; S - W.T. Starmer, Department of Biology, Syracuse University, Сиракузы, США; SM - J.P. Schmidt, Institut National Agronomique, Париж-Гриньон, Франция; UCD-FST - Herman J. Phaff Yeast

Culture Collection of the Department of Food Science and Technology, University of California, Дэвис, США; UCM - Украинская коллекция микроорганизмов, Институт Микробиологии и Вирусологии ПАН, Киев, Украина; UWO(PS) -Culture collection of the Departament of Biology, University of Western Ontario, Лондон, Онтарио, Канада; Gol - В.И. Голубев, ИБФМ РАН, Пущино. Остальные штаммы - из коллекции лаборатории молекулярной генетики, таксономии и экологии дрожжей ГосНИИгенетика, Москва.

ПЦР-аналш. Дрожжи культивировали на стандартной полной среде YPD при 28°С. Амплификацию различных участков рДНК, ядерных и митохондриальных генов проводили непосредственно на дрожжевых клетках или с предварительным выделением ДНК согласно методике (Булат, Мироненко, 1990). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на ДНК-амплификаторе"Терцик™" (Россия) и "Techne" (Великобритания). Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ-анализ) осуществляли с помощью эндонуклеаз Alul, Ban! и Hinfl ("Fermentas", Литва) в течение 12-16 часов при 37°С. Разделение фрагментов рестрикции проводили в 1.7%-ном или 2.5%-ном агарозном геле при 50-55 В в 0.5*ТВЕ буфере (45 мМ трис, 10 мМ ЭДТА, 45 мМ борная кислота, pH 8.0) в течение 3-4 часов. Для типирования индивидуальных штаммов использовали ПЦР с RAPD-праймером OPA-11 и микросателлитными праймерами (ATG)5 и (GTG)5.

Секвенирование. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора "GeneClean Kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США). Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли секвенированием по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе "Beckman-Coulter" (США).

Пульс-электрофорез хромосомных ДНК. Приготовление препаратов хромосомных ДНК проводили согласно методике (Наумова и др., 1993). Разделения хромосомных ДНК осуществляли на аппарате CHEF-DR III (BioRad, США). В качестве буфера использовали 0.5хТВЕ, охлажденный до 14°С.

Филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программы SeqMan package (DNAStar Inc., США). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программ CLUSTAL W и BioEdit version 5.0.9 (Hall, 1999). Филогенетический анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритмов Neighbor-Joining и UPGMA из пакетов компьютерных программ PHYLIP 3.52 (Felsenstein, 1993), MEGA 3 (Kumar et al., 2004) и TREECON (van der Peer, de Wächter, 1994). Индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, подсчитывали для 100 псевдореплик.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка молекулярных методов дифференциации видов рода Kluyveromyces

В современной систематике дрожжей наряду с традиционными фенотипическими тестами используется секвенирование домена D1/D2 26S рДНК размером около 600 п.н. (Kurztman, Robnett, 1998). Принято считать, что различия по 6 и более нуклеотидам (>1%) в районе D1/D2 26S рДНК свидетельствует о принадлежности штаммов к разным видам, тогда как конспецифичные штаммы обычно имеют идентичные последовательности или различаются 1-3 нуклеотидами.

Г-ВК

100

ВКПМ Y-1168 К. wickerhamii CBS 2104 К. dobzhanskii

J ВКМ Y-868 К. 1actis 96L CBS 712 К. marxianus

Г CBS ■ i

0.02

CBS 8778 К. nonfermentans CBS 4438 K. aestuarii CBS 3082 Lachancea kluyveri

72 100

"CBS 2104 K. dobzhanskii* "CBS 712 K. marxianus "BKM Y-868 K. ¡actis

"ВКПМ Y-1168

K. wickerhamii* — CBS 8778

K. nonfermentans*

0.02

CBS 4438 K. aestuarii* CBS 3082 Lachancea kluyveri

Рис. 1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК (А) и гена АСТ1 (В) типовых культур видов рода Kluyveromyces. Приводятся значения бутстрепа >50%. Шкала соответствует 20 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций. Звездочкой обозначены определенные нами последовательности, остальные - из базы данных ГенБанк.

С помощью секвенирования 131ЛЭ2 26Б рДНК можно дифференцировать виды К. йоЪгЬатЫх, К. ^гскегкати, К. аезШаги и К. поп/егтеЫаз (рис. 1А). Однако данный участок не обладает достаточной специфичностью для разделения видов К. тагх'шпт и К. \actis, 01 ^-последовательности которых различаются только одной нуклеотидной заменой. Более вариабельным участком рДНК является район 5.8й-1Т5, включающий ген 5.8Б и внутренние транскрибируемые спейсеры 1ТБ1 и 1Т82. По этому участку рДНК можно дифференцировать все шесть видов КШууеготусеэ. Так, практически неразличимые по последовательностям 01/02 26Б рДНК виды К. 1аст и К. тагх1апи& достоверно различаются по последовательностям 1ТБ1 и 1ТБ2: 22

нуклеотидные замены. Нами установлено, что виды рода Kluyveromyces также можно различить с помощью секвенирования ядерного гена АСТ1, кодирующего белок актин (рис. 1В). Этот участок является более вариабельным по сравнению с доменом D1/D2 26S рДНК: различия между видами Kluyveromyces составили от 40 до 100 нуклеотидов. Следует отметить, что филогенетические деревья, построенные на основании нуклеотидных последовательностей гена ACT1 и района D1/D2 26S рДНК имеют сходную топологию (рис. 1), На обоих деревьях дрожжи К. aestuarii и К. nonfermentas занимают наиболее отдаленное положение.

Для изучения Природного полиморфизма дрожжей Kluyveromyces необходимо оперировать большим количеством штаммов известной видовой принадлежности. Однако секвенирование является достаточно трудоемким и дорогостоящим методом и не подходит для массовой идентификации штаммов. Для этих целей более применим ПДРФ-анализ некодирующих участков рДНК, Нами установлено, что рестриктазным анализом 5,88-1Т5-фрагмёнта рДНК с использованием эндонуклеазы Hinfl можно дифференцировать виды К. aestuarii и К nonfermentas от группы гибридизируемых видов К. marxianus, К, ¡actis, К. dobzhanskii и Ä.'. wicker ham i i (рис, 2A). Тогда как рестриктазный анализ более вариабельного района рДНК - межгенного спейсера IGS2 эндонуклеазой A lid позволяет различить все 6 видов рода Kluyveromyces (рис. 2В). Последний метод был выбран нами для определения видовой принадлежности изученных штаммов Kluyveromyces.

400

300 200"" 100 80

М 1 2 34 56789 10

983 650

300 100

Рис. 2. ПДРФ-анализ амплифицированных 5.8S-ITS-фрагментов рДНК с помощью эндонуклеазы Hinfl (А) и межгенного спейсера IGS2 рДНК с помощью эндонуклеазы AM (В) штаммов Klyuveromyces. 1 -К. ¡actis ВКМ Y-868 (Т); 2 - К. marxianus CBS 712 (Т); 3 - К. wickerhamiiBKTlM Y-J }68 (Т>; 4 - К. dobzhanskii CBS 2 J 04 (I); К. aestuarii: 5 - CBS 4438 (T), 6 - CBS 7768, 7 - CBS 7775; К. nonfermentas: 8 - CBS 8778 (T); 9 -CBS 8779; 10 - CBS 8780; M - маркер молекулярных весов (п.н.) 100 bp DNA Ladder (А) и ДНК фага лямбда, расщепленная HindlWEco R] (В). Двойные фрагменты обозначены жирными линиями.

В настоящее время для изучения доступно ограниченное количество штаммов К аезШаги и К. поп/егтегйс®. В нашем распоряжении было только но три штамма каждого из этих видов. Поэтому мы сосредоточили свое внимание на изучении четырех гибрилизируемых видов рода Юиууеготусез: К. татлагШ, К. 1асШ, К. сЬЬгИапякп, К. \vickerhamii.

2. Внутривидовой полиморфизм дрожжей К. lactis Дифференциация молочных дрожжей К. lactis var. lactis и их ближайших диких родственников - европейской популяции "krassilnikovii".

Согласно существующей классификации (Sidenberg, Lachance, 1986; Kurtzman, 2003) вид К. lactis представлен двумя разновидностями. Молочные, усваивающие лактозу дрожжи, относятся к К. lactis var, lactis, а дикие штаммы Lac-фенотипа к К. lactis var. drosophilarum. С помощью ПДРФ-анализа не кодирующих участков рДНК, молекулярного ¡сари оти п иро ван и я и ПЦР-анализа с мижросатеялитными праймерами мы провели сравнение геномов молочных дрожжей К, ¡actis var. lactis и дики* дрожжей из европейской популяции "krassilnikovii".

700 S00

zoo Н

А М 12 3 4 i 6 7 S 9 10 II 1113 14131617 18JM

700 w« ut м „ M u 1ф » Jrl „

500

■ ' »* Шна

200

м 1 1 . 3 4 5 6 7 S 4 1011 12 1J 14 15 16 17 18 19 J0 2i 21 Ii 24 25 26 M

UMtitaH

Рис. 3. Рестриютазныи анализ амплифицированных фрагментов межгенного спейсера IGS2 рДНК штаммов К. lactis с помощью эндонуклеазы AhЛ. (А) К. lactis var. lacds: 1

- BKM Y-868, 2 - NRRL У-1140, 3 - NRRL Y-1118,4- В KM Y-762; "krassilnikovii": 5

- BKM Y-831, 6 - BKM Y-834, 7 - Est86, 8 - Vor86, 9 - UCM Y-329; "среднеазиатская": 10 - UCM Y-1891, 11 - UCM Y-1892, 12 - UCM Y-1893, 13 -"vanudenii" BKM Y-1535; 14- 158.01-1A; "восточная": 15-UCD 69-8, 16- UCD 67376, 17-DV30, 18 - UCD 72-212; (В) 1 - K. lactis Ш '.actis BKM Y-868; K. lactis var. drosophilarum: 2 - BKM Y-1302, 3 - UW079-169, 4 - UW079-26I, 5 - UW080-48, 6 -UW081-109, 7 - UW080-17, 8 - UW082-233, 9 - S8Ü-549.2, 10 - S80-554.2; "pseudovanudenii": 11 -UW079-127, 12 - UW079-I68. 13 -UW080-12, 14 - UW080-49, 15 - UW082-210: "новая": 16 - UW080-45, 17 - UW085-256.1, "водная": 18 -UCD 71-45, 19 -CBS 6076, 20-- CBS 6169, 21 - CBS 6371, 22 - CBS 6172, 23 - CBS 6191; "phaseolosporus": 24 - BKM Y-1296, 25 - UCD 51-272; 26 - UCD 61-200; M -маркер молекулярных Бесов (п,н.) 100 bp DNAladder ("Fermentas", Литва).

Дрожжи К. 1асШ уаг. выделенные из молочных продуктов и

клинических источников, имеют рестриктазные профили с четырьмя фрагментами размером около 650, 250, 200 и 100 п.н. (дорожки 1-4). Изоляты "кгаззЛткоун" характеризуются тремя фрагментами размером около 650, 450 и 100 п.н. (дорожки 5-9).

Рис. 4. Анализ молекулярных кариотипов штаммов К. Iactis var. ¡actis и популяции "krassílniküvii" í - S cerevisiae YNN 295; 2 - P. canadensis YB-4662-VIA, К. ¡actis var. ¡actis: 3 - В KM Y-868, 4 - NRRL Y-1118, 5- NRRL Y-1140; "krassilnikovii": 6 ~ BKM Y-831, 7 - BKM Y-834 , 8 - Vor86; 9 ~ K. marxianus CBS 712. Размеры хромосом (т.п.н.) приводятся по кариотипическим стандартам S. cerevisiae YNN 235 и Р. canadensis YB-4ÓÓ2-VÍA.

Электрофорез нативкйх хромосомных ДНК показал, что штамм ы К. ¡actis var, ¡aclis и "krassilnikovii" имеют практически идентичные кариотипы с пятью хромосомными полосами размером от 1050 до 2800 т.п.н. (рис. 4). Согласно интенсивности окраски полос бромистым этидием, четвертая полоса снизу является двойной. Таким образом, штаммы К. Iactis var, ¡actis и "krassilnikovii" имеют гаплоидное число хромосом равное шести.

Для установления генетического родства штаммов К- Iactis различного происхождения был использован ПЦР-анализ с микросателлитным праймером (GTG)s. Этот маркер имеет множественную локализацию в геноме дрожжей, что позволяет сравнивать большое количество полиморфных локусов. На основании сходства ПЦР-профилей была построена дендрограмма, на которой штаммы популяции "krassilnikovii" сформировали отдельную группу (рис. 5). Дрожжи К. 1actis var. ¡actis, выделенные из различных молочных продуктов, И клинические изоляты распределились между остальными тремя группами,

Проведенный молекулярный анализ свидетельствует о близком генетическом родстве молочных и госпитальных штаммов. Обнаружены молекулярные маркеры, позволяющие дифференцировать молочные дрожжи К.

/<зс/« уаг. /ас/и и генетически близкие, несбраживающие лактозу, дикие дрожжи К. 1асШ из европейской популяции "кгаБзПшкоуи".

0.1

100

CBS 2877 СЕСТ 1122 Vor 86 Est 86 UCM Y-329 BKM Y-834 BKM Y-831 UCM Y-328 CBS 2621 BKM Y-870 NRRL Y-1140 NRRLY-1118 BKM Y-1527

BKM Y-868 BKM Y-1339 BKM Y-1333 CBS 2619 BKM Y-762 CBS 1067 CBS 2620 CBS 8043 CBS 5618 SM 3.8 BKM Y-896

ЧВКМ Y-869 CBS 1065 CBS 1797 SM 6.7 ■CBS 712

популяция 'krassilnikovii'

K. lactis var. ¡actis

I K. marxianus

Рис. 5. Дендрограмма родства штаммов К. 1ас№ уаг. 1асШ и популяции "кга5зНп1коУ11", основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с микросателлитным праймером (ОТО)5

Структура природных популяций дрожжей К. lactis. На материале 42 штаммов различного географического и экологического происхождения нами изучено природное разнообразие дрожжей К. lactis.

По результатам рестриктазного анализа ГСБ2-района рДНК было дифференцировано 8 различных Л/гЛ-профилей (рис. 3). В первую группу наряду с дрожжами К. lactis var. lactis (Lac+), вошли типовая культура популяции "vanudenii" и дальневосточный штамм 158.01-1А (рис. ЗА, дорожки 1-4, 13, 14). Штаммы из популяции "krassilnikovii" и изоляты из Средней Азии сформировали вторую группу (дорожки 5-12). Третью группу образовали штаммы, выделенные в Дальневосточной Азии и имеющие ПДРФ-профили с тремя фрагментами размером около 600, 450 и 150 п.н. (дорожки 15-18). У североамериканских изолятов обнаружено пять различных рестриктазных профилей (рис. ЗВ, дорожки 2-26). Две группы представлены собственно разновидностью var. drosophilarum (группа 4, дорожки 2-10) и популяцией "phaseo'iosporus" (группа 8, дорожки 24-26). Остальные три североамериканские

популяции ранее не имели таксономических названий и были обозначены нами как "pseudovanudenir (группа 5, дорожки 11—15), "новая" (группа 6, дорожки 16 к 17) и "водная" (группа 7, дорожки 18-23).

Мы провели молекулярное кариотипирование трех изолятов из Средней Азии, которые на основании Alul-рестрикции попали в одну группу с европейскими штаммами из популяции "krassilnikovii", и дальневосточного штамма 158.01-1А, имеющего одинаковый Л /и I- рестрикт&зный профиль с К. lactis var. lactis (рис. 6). Хромосомная ДНК штамма 158.ОМА также как и типовых культур К. lactis var. ¡actis и "krassilnikovii" разделилась на пять полос размером от 1050 до 2800 т.п.н., четвертая полоса снизу соответствует дуплету хромосом (дорожки 3-5). Среднеазиатские изоляты кари оти пи чес к и оказались схожи с типовой культурой "vanudenii", образуя 6 хромосомных полос размером от 1050 до 3200 т.п.н. (дорожки 6-8, 11),

12 34 5 6789 10 11

3200

2800 2300

1660 1050

Рис. 6. Анализ молекулярных кариотипов штаммов К. lactis. I — S. cerevisiae YNN 295; 2-К marxianus CBS 712; Ъ - К. lactis ВКМ Y-868, 4 - "krassilnikovii" ВКМ Y-831; 5 - 158.01-1 А; "среднеазиатская": 6 - UCM Y-1891, 7 - UCM Y-1892, 8 - UCM Y-1893; 9 - К. lactis var. drosophilarum ВКМ Y-1302; 10 - "phaseolosporus" ВКМ Y-1296; 1! - "vanudenii" ВКМ Y-1535. Размеры хромосом (т.п.н.) приводятся по кариотипическому стандарту S. cerevisiae YNN 235,

Для определения генетического родства штаммов, имеющих различные рестриктазные профили 1GS2-фрагментов рДНК и молекулярные кариотипы, мы провели филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ITS-участков рДНК. Относительно внешней 1руппы, типовой культуры К. marxianus CBS 712, на филогенетическом древе выделяются три кластера (рис. 7).

Представители первого кластера имеют одинаковые нуклеотидные последовательности или различаются по 1-3 нуклеотидным заменам. Внутри этого кластера выделяются 4 субкластера. Первый субкластер объединил

дрожжи К. 1ас& уаг. /ас?«, "уапис1епц", "кгаязИшкоуи и среднеазиатский штамм иСМ У-1891, которые имеют одинаковые молекулярные кариотипы и/или одинаковые рестриктазные профили Ю82-фрагментов рДНК. Эти штаммы характеризуются идентичными последовательностями 1Т81 и согласно литературным данным (Ыаитоу, Ыаитоуа, 2002) генетически не изолированы друг от друга.

100

IUCD71-45 ICBS6171

водная"

III

UW079-127

"pseudovanudenii"

UW080-12

-ВКМ Y-1296 (Т) "phaseolosporus"

ВКМ Y-1302 (Т)

UW079-169 var- drosophilarum UW080 -45 "новая" UCD61-200 "phaseolosporus"

ВКМ Y-868 (T) var .¡actis

JUCD 69-8 IDV30

CBS 2 896 "krassilnikovii" BKM Y-1535 (T) "vanudenii" UCM Y-1891 "среднеазиатская"

"восточная

' CBS 712 К. marxianus

Рис. 7. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS-pafi0H0B рДНК дрожжей К. ¡actis. Приводятся значения бутстрепа >50 %.

Среднеазиатские изоляты имеют одинаковые последовательности ITS2 со штаммами "krassilnikovii'V'vanudenii" и отличаются от штаммов К. lactis var. /actis наличием уникальной замены нуклеотида Т на С в позиции 616 (рис. 8). У штамма 158.01-1А выявлена дополнительная транзиция С-Т в позиции 570.

Остальные три субкластера представлены североамериканскими штаммами. Следует отметить, что К. lactis var. drosophilarum и "phaseolosporus" частично генетически изолированы друг от друга и от молочных дрожжей К. lactis var. lactis (Naumov, Naumova, 2002). Отдельный субкластер сформировали

штаммы, обозначенные нами как популяция "pseudovanudenii" (группа 5). Ранее эти штаммы были идентифицированы фенотипически как К. vanudenii (Lachance, 1980). Тем не менее, по изоферментным профилям эта популяция наиболее близка штаммам К. lactis var. lactis и отличается от типовой культуры К. vanudenii и штаммов К. lactis var. drosophilarum (Sidenberg, Lachance, 1986). На основании филогенетического анализа 5.8S-ITS-y4acTKOB рДНК установлено сходство этой популяции с К. lactis var. drosophilarum. Последовательности 5.8S-ITS рДНК этих дрожжей отличались одной нуклеотидной заменой от типовой культуры ВКМ Y-1302 (трансверсия А-Т в позиции 207). Штамм UW080-45 (популяция "новая"), имеющий уникальный Ю82-рестриктазный профиль (группа 6) не отличался по нуклеотидной последовательности от типовой культуры К. lactis var. drosophilarum ВКМ Y-1302.

Рис. 8. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2 рДНК штаммов К. lactis. К. lactis var. lactis-. ВКМ Y-868, СЕСТ 10356, ВКМ Y-1527, СЕСТ 10361; 'Vanudenii": ВКМ Y-1537; "среднеазиатская": UCM Y-1891, UCM Y-1892; "krassilnikovii": CBS 2877, CBS 2896.

Нумерация последовательностей приводится по типовой культуре К. lactis var. lactis ВКМ Y-868. Точками обозначены идентичные последовательности. Знаком «Т» выделены уникальные нуклеотидные замены.

Второй кластер на филогенетическом древе образован изолятами из Дальневосточной Азии (популяция "восточная"), 5.8S-ITS-последовательности которых отличаются от остальных штаммов К. lactis по 5-10 нуклеотидным заменам. Штаммы этой популяции частично генетически изолированы от К. lactis var. lactis, обладают уникальным кариотипическим профилем, а также имеют промежуточные значения ДНК-ДНК реассоциации (64-68%) с типовыми культурами К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum (Fuson et al., 1987; Naumov, Naumova, 2002).

Штаммы UCD 71-45 и CBS 6171, изолированные из болота в США, сформировали третий кластер - популяция "водная". Их 5.8S-ITS-

ITS2

<-►

386 570 616 623 631 Т

ВКМ Y-868 С Т Т Т Т

СЕСТ 10356 . .

ВКМ Y-1527 .....

СЕСТ 10361

ВКМ Y-1535 . С

UCM Y-1891 . . С

UCM Y-1892 . С

CBS 2877 . С

CBS 2896 . . С

158.01-1А . С С

последовательности оказались наиболее дивергентными, и отличались от представителей кластера 1 и 2, соответственно, 6-8 и 10 нуклеотидными заменами. Ранее было установлено, что штамм UCD 71-45 имеет, соответственно, 72% и 78% ДНК-ДНК реассоциации с типовыми культурами К. Iactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum (Fuson et al., 1987).

Таким образом, вид К. lactis имеет сложный состав и включает наряду с культурными молочными дрожжами К. lactis var. lactis дикие экологические и географические популяции. Молекулярными методами показана гетерогенность таксономической разновидности К. lactis var. drosophilarum. Дифференцировано девять генетических популяций дрожжей Lac": пять в Северной Америке (var. drosophilarum, "phaseolosporas", "pseudovanudenii", "новая" и "водная"), по одной в Европе ("krassilnikovii"), Средней Азии ("среднеазиатская"), Южной Африке ("vanudenii") и в Дальневосточной Азии ("восточная").

3. Внутривидовой полиморфизм дрожжей К. marxianus

В настоящее время вид К. marxianus объединяет несколько таксонов-синонимов: К. fragilis - молочные дрожжи, способные сбраживать лактозу, К. bulgaricus и К. cicerisporus - дрожжи, выделяемые из молочных продуктов и млекопитающих и, как правило, сбраживающие лактозу, К. wikenii — южноафриканские эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов, неспособные усваивать лактозу и К. marxianus - природные штаммы, способные только ассимилировать или в редких случаях слабо сбраживать лактозу. Среди штаммов К. marxianus встречаются также клинические изоляты, способные сбраживать лактозу.

Мы провели сравнительное молекулярное изучение 55 штаммов К. marxianus, выделенных из различных источников в Европе, Африке, Америке и Южной Азии. Видовую принадлежность штаммов определяли на основании ЛМ-рестрикции IGS2-pafioHa рДНК. Ряд штаммов, полученных как К. lactis var. lactis и К. vanudenii, были реидентифицированы нами как К. marxianus. В отличие от К. lactis, изученные штаммы К. marxianus имели практически идентичные последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2. Единичные нуклеотидные замены, обнаруженные в этом районе рДНК, не связаны с экологическим и/или географическим происхождением штаммов. Различия между штаммами были обнаружены по нуклеотидным последовательностям более вариабельных участков рДНК - межгенных спейсеров IGS1 и IGS2. Штаммы К. marxianus отличались как по длине этих участков, так и по их нуклеотидному составу. Обнаружены вставки размером от 4 до 28 нуклеотидов у одних штаммов и их отсутствие у других.

На основании выравненных нуклеотидных последовательностей участков Ю81 и Ю82 были построены филогенетические деревья, имеющие сходную топологию (рис. 9).

0.012

0.008

Ч CBS 5667 ^CBS 5671

^ CBS 5668

-CBS 2762

CBS 6873

100

|— CBS 4857

_ICBS 712

92"CBS 397

0.004

0.000

0.015

100

CBS 5670 CBS 5671 CBS 5667 LCBS 5668 CBS 6873 CBS 2762

83г CBS 397 ^ CBS 4857

CBS 396 CBS 712 CBS 1620

0.010 0.005 0.000

Рис. 9. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера ГС81 (А) и ЮЭ2 (В) рДНК дрожжей К. татапих. Приводятся значения бутстрепа >50%.

Южноафриканские дрожжи из алкогольных ферментаций CBS 5671, CBS 5667 и CBS 5668 сформировали первый кластер, к которому примыкают типовая культура К. bulgaricus CBS 2762 и почвенный штамм из Южной Африки CBS 6873. Следует отметить, что штамм CBS 6873, также как и дрожжи К. wikenii, неспособен утилизировать лактозу. Второй кластер включает типовые культуры .AT. marxianus CBS 712, K.fragilis CBS 397, К. cicerisporus CBS 4857, госпитальный штамм CBS 1620 и природный изолят CBS 396. Дрожжи К. wikenii отличаются от остальных изученных штаммов также по нуклеотидной последовательности фрагмента ядерного гена ACTJ: трансверсия G-T в позиции 351 и транзиция Т-С в позиции 552, согласно нумерации последовательности гена. ACT J типовой культуры К. marxianus CBS 712.

На основании ПЦР-анализа с RAPD-праймером OPA-11 штаммы К. marxianus различного происхождения разделились на пять групп (рис. 10). Первую группу сформировали большинство молочных штаммов и госпитальные изоляты. В состав второй и третьей групп вошли природные изоляты и штаммы, выделенные из млекопитающих; в третью группу также попал молочный штамм CBS 2762. Штаммы из алкогольных ферментаций образовали четвертую группу.

В состав пятой группы вошли штаммы CBS 745 и CBS 6873, изолированные из природных источников в Африке.

Рис. 10. Дендрограмма родства штаммов К. таЫапш, основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с ИАРБ праймером ОРА-11. Приводятся значения бутстрепа >50%.

100

0.20

" К. lactis BKMY-868

fi ВКМ Y-454 iCBS 1559 |CBS 1620 'CBS 2173 -CBS 1553 CBS 3002 CBS 1555

-CBS 397

Г- CBS 4354 ■BKM Y-2454 IjUCD 69-1033.2 UCD 61-189 _i UCD 81-489.1 Л—CBS 6634 l_f—CBS 5069

~-UCD50-16

J—UCD 81-630.3 TiCBS 6923 1 CBS 6556

-CBS 4857 ■CBS 2762 ¡1089 ¡2079 -ATTC52486 "CBS 712

CBS 5667 J CBS 5668 'CBS 5672

-CBS 5669 I CBS 5673 'CBS 5671 :BS 6873 ■CBS 745

■C. kcfyr NRRL Y-329

I V

Недавно был проведен генетический анализ полиморфизма утилизации лактозы у дрожжей Kluyveromyces, включая штаммы из указанных групп (Наумов, 2006). Установлено, что молочные штаммы обладают сильной лактозной пермеазой, не зависящей от дыхания, тогда как природные изоляты характеризуются зависящей от дыхания слабой пермеазной активностью, Эндемичные южноафриканские дрожжи из алкогольных ферментационных процессов, как правило, вообще не имеют активной пермеазы лактозы.

Кариотипический анализ выявил сходство хромосомных профилей природных изолятов и штаммов из алкогольных ферментаций; их хромосомная ДНК разделилась на 5 полос размером примерно от 1000 до 2400 т.п.н. (рис. 11). Исходя из интенсивности окрашивания бромистым этидием, верхняя полоса является двойной, а нижняя полоса - тройная. Таким образом, гаплоидное число хромосом у этих штаммов, по-видимому, равно восьми. В то же время, среди молочных штаммов обнаружен значительный полиморфизм кариотипических паттернов по числу и размеру хромосомных полос. Молочные штаммы К. marxianus, возможно, содержат дополнительные хромосомы или гомологичные хромосомы измененных размеров. В этом смысле, молочные дрожжи К. marxianus схожи с культурными штаммами дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для которых характерен значительный полиморфизм молекулярных кариотипов (Bakalinsky, Snow, 1990; Наумова и др., 1993).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

хромо-

300(1

2200

1125 945

VII, VIII VI

сомы

I, 11, III

Рис. 11. Анализ молекулярных кариотипов штаммов К. marxianus. 1 - S, cerevisiae YNN 295; К. marxianus: 2-CBS 712, 3 - ATTC52486, 4 - UCD 50-16, 5 - CBS 5671,6 - CBS 5672, 7 - CBS 5669, 8 - CBS 2762, 9 - CBS 397, 10 - В KM Y-2454, 11 - CBS 4857, 12 - NFLRL Y-329. Размеры хромосом (т.п.н.) приводятся по кариотипическому стандарту S. cerevisiae YNN 235.

Полученные нами результаты и литературные данные (Наумов, 2006) свидетельствуют о сложном строении вида К. marxianus, включаюшем три популяции; 1) собственно "marxianus" - природные космополитные дрожжи (в состав этой популяции входит типовая культура вида CBS 712); 2) "fragilis" -молочные, очевидно, также космополитные дрожжи и клинические изоляты; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке.

4. Молекул яр но-генетические особенности природных популяций дрожжей

Дрожжи К. wickerhamii и К. dobzhanskii обитают1 исключительно в природе, В настоящее время известно небольшое количество штаммов К. wickerhamii, выделенных в основном в Северной Америке. В нашем распоряжении было 6 штаммов, изолированных в США и Канаде, К сожалению, дальневосточные изоляты К. wickerhamii (Бибикова и др., 1987, 1988, 1990) не сохранились. Все изученные штаммы К. wickerhamii имеют идентичные молекулярные кариотипы с 6 хромосомными полосами размером от 700 до 2600 т.п.н, (рис. 12), Исходя из интенсивности свечения, третья полоса снизу содержит более одной хромосомы. Таким образом, гаплоидное число хромосом дрожжей К. wickerhamii, очевидно, равным восьми. В отличие от североамериканских дрожжей К. lactis var, drosophilarum, соответствующая популяция К. wickerhamii, вероятно, является генетически гомогенной.

К. wicherhamii и К. dobzhanskii

хромосомы

2600т-»-

220СГ*

945-7«Г

Рис. 12. Анализ молекулярных кариотипов штаммов К. wickerhamii. I - S, cerevisiae YNN 295; 2 - К. marxianus CES 712; 3 -К. Iactis ВКМ Y-868; К. wickerhamii': 4 - ВКПМ Y-1168, 5 - UWO85-330.5, 6 - UW085-396.2. Размеры хромосом (т.п.н.) приводятся по ка р нота пическому стандарту S. cerevisiae YNN 295.

Дрожжи К. ¿¡оЬгкапзкИ распространены во многих частях света и представляют собой удобную модель для популяционно-генетическйХ исследований. Мы провели сравнительное молекулярное изучение 30 штаммов К. с1оЬгЬатки, выделенных в Европе, Северной Америке и на Дальнем Востоке. Штаммы, изолированные в Северной Америке и на Дальнем Востоке России, а также большинство европейских штаммов имеют близкие молекулярные кариотипы с 7 полосами размером примерно от 1040 до 3130 т.п.н, (рис. 13, дорожки 2-8,10-15).

1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 *РОМО"

Рис. 13. Анализ молекулярных кариотипов штаммов К dobzhanskii \ - S. cerevisiae YNN 295; К. dobzhanskii: 2 - CBS 2104, 3 - UW080-28, 4 - UW082-232, 5 - UCM Y 321, 6 - UCM Y 323. 7 - CBS 5061, 8 - CBS 5062,9-CKCT 10147, 10 -CECT 10180, 11 - CECT 10187, 12-CECT 10189. 295. 13 -BKM Y-2745, 14 -BKM Y-2744, 15-Gol 283. Размеры хромосом (т.п.н.) приводятся по кариотипическому стандарту S. cerevisiae YNN,

Согласно интенсивности окрашивания бромистым этидием, полоса IV, по-видимому, является двойной. Исключением являются три испанских штамма СЕСТ 10147, СЕСТ 10148 и СЕСТ 10177, обладающие специфическими паттернами с 4 полосами, две из которых соответствуют хромосомам II и III стандартного размера, тогда как оставшиеся две являются уникальными (дорожка 9). Исходя из интенсивности свечения, три нижние полосы могут содержать более одной хромосомы. Таким образом, гаплоидное число хромосом у дрожжей К. dobzhanskii, вероятно, равно восьми. Обнаруженный полиморфизм кариотипов испанских штаммов К. dobzhanskii может свидетельствовать о существовании отдельной экологической популяции.

С целью изучения природного полиморфизма дрожжей К. dobzhanskii был проведен анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS-pafioHa рДНК и митохондриального гена СОХ2 у 30 штаммов этого вида. На обоих филогенетических деревьях относительно внешней группы К. marxianus CBS 712 выделяются три кластера (рис. 14). Первый кластер образован североамериканскими штаммами. Нуклеотидные последовательности 5.8S-ITS рДНК и фрагмента гена СОХ2 у большинства этих штаммов были идентичны. Дальневосточные изоляты, не отличающиеся по последовательностям 5.8S-ITS рДНК и гена СОХ2, вошли в состав второго кластера. Европейские штаммы сформировали третий кластер. По 5.88-1Т8-последовательностям эти штаммы не отличались между собой, тогда как по последовательностям гена СОХ2, образованная ими группа является более гетерогенной, чем группы, сформированные североамериканскими и дальневосточными изолятами. Нуклеотидные последовательности гена СОХ2 европейских штаммов различаются 2-7 нуклеотидными заменами, тогда как их отличия от остальных штаммов К. dobzhanskii по данному участку составляют от 8 до 11 замен.

Для более детального изучения генетического родства штаммов К. dobzhanskii различного географического происхождения мы провели ПЦР-анализ с микросателлитным праймером (GTG)S. На основании полученных ПЦР-профилей изученные штаммы К. dobzhanskii также распределились на три группы согласно их географическому происхождению (рис. 15). Внутри каждой из групп выявлен полиморфизм ПЦР-профилей. Так, у североамериканских штаммов обнаружены три подгруппы, одна из которых образована штаммами, выделенными в США, а остальные две представлены канадскими изолятами. Вторая группа, включающая европейские штаммы, разделилась на две подгруппы. В первую подгруппу попали штаммы, выделенные во Франции и на Украине, тогда как все испанские штаммы вошли в состав второй подгруппы. Дальневосточные изоляты сформировали третью группу, которая также представлена двумя подгруппами.

0.002

и\У079-189 и\УО 79-199 и\У082-243 64 1^079-267 и\У082-232 UW079-187 и\УО 79-183 UWO 82-326 и\УО 79-188 и\У080-48

NRKL У-2338 СВ5 2104 СЕСТ 10182 СЕСТ 10197 СЕСТ 10194 иСМ У-321 СЕСТ 10189 СЕСТ 10177 СЕСТ 10148

ВКМ У-2745 87 Со1212 Со1 283 ВКМ ¥-2744 СЕСТ 10180 СВ5 5062 СЕСТ 10147 СЕСТ 10187 иСМ У-323 СЕСТ 10161 СВБ 5061

Североамериканская популяция

Европейская популяция

Дальневосточная популяция

Европейская популяция

~К. тагх 'шпш СВв 712

(—СВЭ 21042 и\У079-188 ^ИЬ У-2338 и\У079-183 61 и\У079-199 UW082-232 ШУ079-189 и\У079-267 81 и\У082-243 1ДУ080-28 и\У079-187 и\У082-326 ВКМ У-2745 Со1212 85 Со1283

ВКМ У-2744 '—СЕСТ 10182

Íl СЕСТ 10147 СЕСТ 10187 СЕСТ 10148 СЕСТ 10184 СЕСТ 10189 СЕСТ 10180 — СЕСТ 10161 СЕСТ 10177 СВв 5062 СЕСТ 10197 иСМ У-323 СВЭ 5061 иСМ У-321

К. тагхшпт СВ8 712

Североамериканская популяция

Дальневосточная популяция

Европейская популяция

0.005

Рис. 14. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.88-1Т8-районов рДНК (А) и фрагмента митохондриального гена СОХ2 (В) дрожжей К. ¿оЪгкатШ. Приводятся значения бутстрепа >50%. Шкала соответствует количеству нуклеотидных замен на 1000 нуклеотидных позиций.

0.02 Н

100

ШУ079-187 Ц\У079-183 Ц\У079-189 1Г№079-188 иШ079-267 Щ¥079-199

Ц\У082-326 Ц\У082-243 и\У082-232 1^080-28 N1*111, У-2338 СВв 2104

Североамериканская популяция

■ ВКМ У-2745 88 I ВКМ У-2744

СВв 5062 СВв 5061 иСМ 323 иСМ 321 СЕСТ 10147 СЕСТ 10197 СЕСТ 10177 СЕСТ 10148 СЕСТ 10161 СЕСТ 10182 СЕСТ 10194 СЕСТ 10189 СЕСТ 10187 СЕСТ 10180

во! 238 во! 212

■ К. тагхшпт СВБ 712

Дальневосточная популяция

Европейская популяция

Рис. 15. Дендротрамма родства штаммов К. ёоЬгкатки, основанная на сходстве по ПЦР-профилям с праймером (ОТС)5 Приводятся значения бутстрепа >50.

Таким образом, вид К. йоЪгкатки представлен тремя географическими популяциями (европейской, североамериканской и дальневосточной), которые отличаются по ПЦР-профилям с праймером (ОТО)5, а также по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров 1Т81/1ТБ2 и митохондриального гена СОХ2. Согласно молекулярному кариотипированию и сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей митохондриального гена СОХ2 в Испании, по-видимому, существует экологически обособленная субпопуляция этого вида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Род К1иу?еготусез в настоящее время включает группу из четырех гибридизируемых видов К. 1асЫ$, К. тагхштшз, К. с1ост.^к11, К. уужкегИати и таксономически близкие дрожжи К. аезШагИ, К. поп/егтепЮх (КшГгтап, 2003). Современная классификация дрожжей К1щл>еготусе$ хорошо согласуется с биологической концепцией вида, разработанной на высших эукариотах.

Родственные виды К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii могут скрещиваться в любых комбинациях и, очевидно, обладают общей системой типов спаривания (Johannsen, van der Walt, 1978; Johannsen, 1980; Naumov, Naumova, 2002).

Проведенный нами филогенетический анализ различных районов рДНК и ядерного гена А СТ1 подтвердил генетическое родство гибридизируемых видов К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. С помощью пульс-электрофореза интактных хромосомных ДНК проведено сравнение геномов указанных видов. Установлено, что гаплоидное число хромосом у видов К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii, равно восьми, а у К. lactis - шести. Предельные размеры хромосомных полос существенно различаются у четырех видов, что позволяет дифференцировать их друг от друга по кариотипическим профилям.

На материале штаммов различного экологического и географического происхождения проведено изучение природного разнообразия дрожжей К. lactis, К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. Первые два вида включают наряду с культурными молочными дрожжами дикие природные изоляты, тогда как дрожжи К. dobzhanskii и К. wickerhamii обитают исключительно в природе.

Разделение дрожжей К. lactis на две разновидности К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum (Sidenberg, Lachance, 1986) основано на физиологических и экологических особенностях этих дрожжей; к последней разновидности отнесены все штаммы, не способные ферментировать лактозу. Проведенный нами молекулярный анализ 73 штаммов К. lactis различного происхождения выявил недостатки существующей классификации. На основании рестриктазного анализа IGS2-paftoHa рДНК, секвенирования внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и молекулярного кариотипирования обнаружена значительная гетерогенность таксономической разновидности К. lactis var. drosophilarum, которая включает девять генетических популяций: по одной в Европе ("krassilnikovii"), Средней Азии ("среднеазиатская"), Южной Африке ("vanudenii"), Дальневосточной Азии ("восточная") и пять в Северной Америке (собственно разновидность var. drosophilarum, "phaseolosporus", "pseudovanudenii", "новая" и "водная"). У штаммов указанных популяций обнаружена уникальная транзиция Т-С в 616 позиции 5.88-1Т8-последовательности рДНК (нумерация приводится по типовой культуре К. lactis var. lactis ВКМ Y-868). Обнаруженные популяции имеют различную степень генетического родства. Согласно филогенетическому анализу нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 наиболее дивергентными являются популяции "восточная" и "водная", тогда как популяции "krassilnikovii", "vanudenii" и "среднеазиатская" генетически близки молочным дрожжам К. lactis var. lactis.

Нами обнаружены молекулярные маркеры, позволяющие дифференцировать штаммы последних трех популяций от молочных дрожжей К. lactis var. lactis.

Установлено, что вид К. dobzhanskii представлен тремя географическими популяциями (европейской, североамериканской и дальневосточной), которые отличаются по ПЦР-профилям с праймером (GTG)5, а также по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и митохондриального гена СОХ2. Согласно молекулярному кариотипированию и сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей митохондриального гена СОХ2 в Испании, по-видимому, существует экологически обособленная субпопуляция этого вида. В отличие от североамериканских дрожжей К. lactis var. drosophilarum соответствующая популяция К. wickerhamii, вероятно, является генетически гомогенной. Изученные нами штаммы имели идентичные молекулярные кариотипы и похожие ПДРФ-профили ЮБ2-района рДНК.

В отличие от К. dobzhanskii и К. lactis, дрожжи К. marxianus имеют практически идентичные последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2. Причем, единичные нуклеотидные замены, обнаруженные в этом районе рДНК, не связаны с экологическим и/или географическим происхождением штаммов. Штаммы К. marxianus значительно отличаются по нуклеотидным последовательностям более вариабельного района рДНК - межгенных спейсеров IGS1 и IGS2 спейсеров. Проведенный нами комплексный молекулярный анализ (секвенирование районов IGS1/IGS2 рДНК, ядерного гена АСТ1, RAPD-ПЦР с праймером ОРА-11, молекулярное кариотипирование) и литературные данные по полиморфизму утилизации лактозы (Наумов, 2006) свидетельствуют о генетической неоднородности вида К. marxianus и позволяют дифференцировать три популяции: 1) "marxianus" -природные космополитные дрожжи, включая типовую культуру CBS 712; 2) "fragilis" - молочные, также космополитные дрожжи и клинические изоляты; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке.

Ассоциация дрожжей, сбраживающих лактозу с молочными продуктами, а, следовательно, и с млекопитающими животными делают их очевидными прародителями госпитальных штаммов. Следует отметить, что ряд характеристик, свойственных патогенным дрожжам уже имеются у штаммов К. marxianus (популяция "fragilis"): образование псевдомицелия, устойчивость к повышенной температуре и высокая пектолитическая активность.

Полученные результаты позволили нам разработать экспресс-методы молекулярной идентификации дрожжей рода Kluyveromyces. Для определения видовой принадлежности штаммов предложено использовать рестриктазный анализ вариабельного района рибосомальной ДНК - межгенного спейсера IGS2. Показана пригодность ПЦР-анализа с праймерами (GTG)s, (ATG)5 и OPA-11 для типирования отдельных штаммов и изучения внутривидововго полиморфизма дрожжей Kluyveromyces.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспресс-метод молекулярной идентификации видов рода Kluyveromyces на основе рестриктазного анализа ТТТТР-амплифицированных Ю82-фрагментов. Предложено использовать RAPD-ПЦР с праймерами (GTG)5, (ATG)5 и OPA-11 для изучения внутривидововго полиморфизма дрожжей К. lactis, К. marxianus и К. dobzhanskii.

2. Впервые проведен сравнительный анализ геномов гибридизируемых видов Kluyveromyces. Кариотипическим анализом установлено, что гаплоидное число хромосом у видов К. marxianus, К. wickerhamii и К. dobzhanskii равно восьми, а у К. lactis - шести.

3. Выявлены недостатки существующей классификации дрожжей К. lactis, а именно разделение на две разновидности К. lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum. На большом материале штаммов различного происхождения показана гетерогенность разновидности К. lactis var. drosophilarum, внутри которой дифференцировано девять генетических популяций: пять в Северной Америке (var. drosophilarum, "phaseolosporus", "pseudovanudenii", "новая" и "водная"), по одной в Европе ("krassilnikovii"), Средней Азии ("среднеазиатская"), Южной Африке ("vanudenii") и в Дальневосточной Азии ("восточная").

4. Обнаружено, что типовой вид рода Kluyveromyces — К. marxianus является генетически неоднородным и включает три дивергентные популяции: 1) собственно "marxianus" - природные космополитные дрожжи; 2) "fragilis" - молочные, также космополитные дрожжи, и клинические изоляты; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке.

5. Установлено, что по многим молекулярным маркерам клинические изоляты К. lactis и К. marxianus не отличаются от штаммов этих же видов, выделенных из молочных продуктов и, очевидно, происходят от них.

6. Сравнительный молекулярный анализ выявил генетическую гомогенность североамериканской популяции дрожжей К. wickerhamii.

7. Впервые проведено изучение популяционной структуры дрожжей К. dobzhanskii. Показано, что этот вид включает, по крайней мере, три географические популяции (европейскую, североамериканскую и дальневосточную), отличающиеся по нуклеотидным последовательностям района ITS1/ITS2 рДНК и митохондриального гена СОХ2, а также ПЦР-профилями с микросателлитным праймером (GTG)5.

8. Создана большая коллекция штаммов различных видов Kluyveromyces, охарактеризованных молекулярными методами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Naumova E.S., Sukhotina N.N., Naumov G.I. Molecular-genetic differentiation of the Kluyveromyces lactis and its closest wild relatives // FEMS Yeast Research. 2004. V.5. P. 263-296.

2. Наумова E.C., Сухотина H.H., Наумов Г.И. Молекулярные маркеры, дифференцирующие молочные дрожжи Kluyveromyces lactis var. lactis от их ближайших диких родственников - европейской популяции "krassilnikovii" // Микробиология. 2005. Т.74. №13. С. 387-393.

3. Сухотина H.H., Наумова Е.С., Наумов Г.И. Молекулярный полиморфизм дрожжей Kluyveromyces dobzhanskii: географические популяции // ДАН. 2006. Т. 409. №5. С. 694-698.

4. Наумов Г.И., Сухотина H.H., Наумова Е.С. Новый генофонд для молочных дрожжей: молекулярно-генетическая дифференциация комплекса Zygofabospora/Kluyveromyces lactis Материалы 2-го Международного Конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития". 10-14 ноября 2003. Москва. Россия. С. 276.

5. Наумов Г.И., Сухотина H.H., Наумова Е.С. Молекулярно-генетический анализ происхождения госпитальных штаммов Kluyveromyces/Zygofabospora marxiana // Успехи медицинской микологии. - М. Национальная академия микологии. 2004. С. 8-9.

6. Наумов Г.И., Сухотина H.H., Наумова Е.С. Сравнительный молекулярно-генетический анализ госпитальных штаммов Kluyveromyces lacis II Успехи медицинской микологии. - М. Национальная академия микологии. 2005. Москва. С. 20-21.

7. Сухотина Н.Н., Наумова Е.С., Наумов Г.И. Молекулярная гетерогенность молочных дрожжей Kluyveromyces marxianus // Успехи медицинской микологии. - М. Национальная академия микологии. 2006. Москва. С. 21-22.

8. Naumov G.I., Naumova E.S., Sukhotina N.N. Complex composition of the yeast Zygofabospora/Klityveromyces lactis: genetic and molecular differentiation of subpopulations // Abstracts of First FEMS Congress of European microbiologists. June 29-July 3. 2003. Slovenia. Ljubljana. P. 205.

9. Naumov G.I., Sukhotina N.N., Naumova E.S. Differentiation of dairy yeast Kluyveromyces lactis var. lactis and its closest wild relatives from European population 'krassilnikovii' // Abstracts of XXIIth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. August 7-12th. 2005. Bratislava. Slovak Republic. Yeast. V. 22. S. 43.

Принято к исполнению 30/01/2007 Исполнено 31/01/2007

Заказ № 66 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухотина, Наталия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ

KLUYVEROMYCES

ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ

KLUYVEROMYCES

2.1. Молекулярные методы, используемые в систематике дрожжей

2.1.1. Определение мол. % ГЦ и ДНК-ДНК-реассоциация

2.1.2. Установление филогенетического родства дрожжей с помощью анализа последовательностей рДНК >

2.1.3. Использование ПЦР-анализа для классификации дрожжей

2.1.4. Полиморфизм митохондриальной ДНК и пульс-электрофорез нативных хромосомных ДНК

2.2. Генетико-таксономическое изучение дрожжей Kluyveromyces с помощью молекулярных методов и современная классификация рода

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования и методы культивирования штаммов

3.2. ПЦР-анализ

3.3. Секвенирование

3.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК

3.5. Филогенетический анализ

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ

ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИДОВ РОДА KLUYVEROMYCES

4.1. Физиологические особенности дрожжей рода Kluyveromyces

4.2. Выбор участков рДНК для секвенирования и ПДРФ-анализа

4.2.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей района D1/D2 26S рДНК типовых культур рода Kluyveromyces

4.2.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей и ПДРФ-анализ 5.8S-ITS-pafloHa рДНК типовых культур рода Kluyveromyces

4.2.3. ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК

4.3.Анализ гена АСТ

4.4. Молекулярное кариотипирование 63 4.4. Обсуждение

ГЛАВА 5. ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ДРОЖЖЕЙ К. LACTIS

5.1. Сравнительный анализ геномов молочных дрожжей К. lactis var. lactis и их ближайших диких родственников - европейской популяции "krassilnikovii"

5.1.1. ПДРФ-анализ амплифицированных Ю82-фрагментов рДНК

5.1.2. Молекулярное кариотипирование

5.1.3. ПЦР-анализ с микросателлитными праймерами (GTG)5 и (ATG)

5.2. Молекулярная дифференциация природных штаммов К. lactis

5.2.1. ПДРФ-анализ 5.8S-ITS-pafioHa рДНК

5.2.2. ПДРФ-анализ Ю82-района рДНК

5.2.3. Молекулярное кариотипирование

5.2.4. Секвенирование 5.88-1Т8-фрагментов рДНК

5.3. Обсуждение

ГЛАВА 6. ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ДРОЖЖЕЙ К. MARXIANUS

6.1. Определение видовой принадлежности изученных штаммов

6.2. Анализ нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 рДНК

6.3. Анализ нуклеотидных последовательностей межгенных спейсеров IGS и IGS2 рДНК

6.4. Анализ нуклеотидных последовательностей ядерного гена АСТ

6.5. ПЦР-анализ с неспецифичными праймерами

6.6. Молекулярное кариотипирование

6.7. Обсуждение

ГЛАВА 7. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДРОЖЖЕЙ К. DOBZHANSKII и

К. WICKERHAMII

7.1. Молекулярный анализ штаммов К. wickerhamii

7.2. Изучение географических популяций дрожжей К. dobzhanskii

7.2.1 ПДРФ-анализ ГС82-фрагментов рДНК

7.2.2. Молекулярное кариотипирование

7.2.3. Анализ нуклеотидных последовательностей 5.88-1Т8-фрагмента

7.2.4. Анализ нуклеотидных последовательностей митохондриального гена СОХ

7.2.5. ПЦР-анализ с микросаттелитным праймером (GTG)5 123 7.3. Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces"

Генофонд дрожжей, используемых в фундаментальных и прикладных исследованиях, постоянно расширяется. Большое внимание уделяется нетрадиционным несахаромицетным дрожжам с уникальными свойствами (Голубев, 1992а, Наумова, 2006). Молочные дрожжи Kluyveromyces lactis являются важным эукариотическим объектом молекулярной генетики и биотехнологии. Полноценное использование этих дрожжей невозможно без знания их физиолого-генетических особенностей и научно обоснованной классификации и идентификации.

Систематическое положение дрожжей рода Kluyveromyces подвергалось многочисленным ревизиям: пересматривался их родовой и видовой статус. Первоначально описанные в роде Saccharomyces (Lodder и Kreger-van-Rij, 1952), эти дрожжи включали в состав различных родов: Zygosaccharomyces, Fabospora, Zygofabospora и др. После того как van. der Walt изменил первоначальный диагноз полиспорового рода Kluyveromyces, в него были включены немногоспоровые дрожжи Saccharomyces marxianns и родственные виды (van der Walt, 1965). Генетический анализ и секвенирование рибосомальных генов выявили полифилию рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt (Наумов, 1986, 19876; Cai et al., 1996; Kurtzman, Robnett, 1998). Внутри этого гетерогенного рода была выделена группа, включающая гибридизируемые виды (К. lactis, К marxianus, К dobzhanskii и К. wickerhamii) и таксономически близкие дрожжи К aestuarii и К nonfermentas. На основании мультигенного филогенетического анализа была проведена ревизия клада Saccharomyces и консервация рода Kluyveromyces, в котором были оставлены только шесть указанных видов (Kurtzman, 2003). В этом составе Kluyveromyces фактически является переименованием рода Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov 2002.

Традиционная систематика дрожжей базируется на использовании морфологических и физиологических признаков, которые обладают значительной изменчивостью. Поэтому использование только стандартных физиологических тестов зачастую приводит к неправильной идентификации штаммов. Для создания научной классификации дрожжевых организмов и получения достоверных сведений об их эволюции необходимо, помимо фенотипических признаков, изучать молекулярные особенности генов и геномов. Последние являются предметом изучения геносистематики или макромолекулярной систематики (Антонов, 1974, 1980, 2005; Белозерский, 1969; Наумов 1987а). Актуальным является использование молекулярных методов, позволяющих быстро и достоверно идентифицировать большое количество штаммов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-амплификация различных участков рибосомальной ДНК (рДНК) и последующий анализ полиморфизма длин реслриктазнжфр^гмеето£^ПДРФ) успешно используются в настоящее время в таксономии дрожжей. Недавно проведенное секвестрование генома дрожжей К. lactis (Bussereau et al., 2006) заложило хорошую основу для изучения других видов этого рода. Однако молекулярные исследования проводятся на ограниченном количестве штаммов Kluyveromyces, в основном на типовых культурах и генетических линиях одного происхождения. Таким образом, изучается только ограниченная часть генофонда этих дрожжей, а их^ природное разнообразие остается не исследованным. Практически ничего не известно о популяционно-генетических особенностях важных для науки и практики культивируемых дрожжей рода Kluyveromyces и их диких родственников. В последние десятилетия молочные дрожжи К. lactis и К marxianus привлекают большое внимание биотехнологов как продуценты разнообразных веществ (Bonekamp, Oosterom, 1994). Тем не менее, среди обоих видов встречаются медицинские изоляты. Остается неясным происходят ли они от культурных или диких дрожжей Kluyveromyces.

Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции культурных и диких дрожжей рода

Kluyveromyces на материале штаммов различного экологического и географического происхождения.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сухотина, Наталия Николаевна

выводы

1. Разработан экспресс-метод молекулярной идентификации видов рода Kluyveromyces на основе рестриктазного анализа ПЦР-амплифицированных Ю82-фрагментов. Предложено использовать RAPD-ПЦР с праймерами (GTG)5, (ATG)5 и ОРА-11 для изучения внутривидововго полиморфизма дрожжей К. lactis, К marxianus и К. dobzhanskii.

3. Выявлены недостатки существующей классификации дрожжей К. lactis, а именно неправильное разделение на две разновидности К. lactis var. lactis и К lactis var. drosophilarum. На большом материале штаммов различного происхождения показана гетерогенность разновидности К lactis var. drosophilarum, внутри которой дифференцировано девять генетических популяций: пять в Северной Америке (var. drosophilarum, "phaseolosporus", "pseudovanudenii", "новая" и "водная"), по одной в Европе ("krassilnikovii"), Средней Азии ("среднеазиатская"), Южной Африке ("vanudenii") и в Дальневосточной Азии ("восточная").

4. Обнаружено, что типовой вид рода Kluyveromyces - К marxianus является генетически неоднородным и включает три дивергентные популяции: 1) собственно "marxianus" - природные космополитные дрожжи; 2) "fragilis" - молочные, также космополитные дрожжи, и клинические изоляты; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке.

7. Впервые проведено изучение популяционной структуры дрожжей К. dobzhanskii. Показано, что этот вид включает, по крайней мере, три географические популяции (европейскую, североамериканскую и дальневосточную), отличающиеся по нуклеотидным последовательностям района ITS 1/ITS2 рДНК и митохондриального гена СОХ2, а также ПЦР-профилями с микросателлитным праймером (GTG)5.

8. Создана большая коллекция штаммов различных видов Kluyveromyces, охарактеризованных молекулярными методами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Род Kluyveromyces в настоящее время включает группу из четырех гибридизируемых видов К. lactis, К marxianus, К. dobzhanskii, К. wickerhamii и таксономически близкие дрожжи К. aestuarii, К. nonfermentas (Kurtzman, 2003). Современная классификация дрожжей Kluyveromyces хорошо согласуется с биологической концепцией вида, разработанной на высших эукариотах. Родственные виды К. lactis, К marxianus, К dobzhanskii и К. wickerhamii могут скрещиваться в любых комбинациях и, очевидно, обладают общей системой типов спаривания (Johannsen, van der Walt, 1978; Johannsen, 1980; Naumov, Naumova, 2002).

Проведенный нами филогенетический анализ различных районов рДНК и ядерного гена АСТ1 подтвердил генетическое родство гибридизируемых видов К. lactis, К marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii. С помощью пульс-электрофореза интактных хромосомных г 1 --

ДНК проведено сравнение геномов указанных видов. Установлено, что гаплоидное число хромосом у видов К. marxianus, К. dobzhanskii и К. wickerhamii, равно восьми, а у К. lactis - шести. Предельные размеры хромосомных полос существенно различаются у четырех видов, что позволяет дифференцировать их друг от друга по кариотипическим профилям.

Разделение дрожжей К. lactis на две разновидности К lactis var. lactis и К. lactis var. drosophilarum (Sidenberg, Lachance, 1986) основано на физиологических и экологических особенностях этих дрожжей; к последней разновидности отнесены все штаммы, не способные ферментировать лактозу. Проведенный нами молекулярный анализ 73 штаммов К. lactis различного происхождения выявил недостатки существующей классификации. На основании рестриктазного анализа IGS2-paftoHa рДНК, секвенирования внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и молекулярного кариотипирования обнаружена значительная гетерогенность таксономической разновидности К. lactis var. drosophilarum, которая включает девять генетических популяций: по одной в Европе ("krassilnikovii"), Средней Азии ("среднеазиатская"), Южной Африке ("vanudenii"), Дальневосточной Азии ("восточная") и пять в Северной Америке (собственно разновидность var. drosophilarum, "phaseolosporus", "pseudovanudenii", "новая" и "водная"). У штаммов указанных популяций обнаружена уникальная транзиция Т-С в 616 позиции 5.88-1Т8-последовательности рДНК (нумерация приводится по типовой культуре К. lactis var. lactis BKM Y-868). Обнаруженные популяции имеют различную степень генетического родства. Согласно филогенетическому анализу нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 наиболее обособленными являются популяции "восточная" и "водная", тогда как популяции "krassilnikovii", "vanudenii" и "среднеазиатская" генетически близки молочным дрожжам К. lactis var. lactis. Нами обнаружены молекулярные маркеры, позволяющие дифференцировать штаммы последних трех популяций от молочных дрожжей К. lactis var. lactis.

Установлено, что вид К. dobzhanskii представлен тремя географическими популяциями (европейской, североамериканской и дальневосточной), которые отличаются по ПЦР-профилям с праймером (GTG)j, а также по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и митохондриального гена СОХ2. Согласно молекулярному кариотипированию и сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей митохондриального гена СОХ2 в Испании, по-видимому, существует экологически обособленная субпопуляция этого вида. В отличие от североамериканских дрожжей К. lactis var. drosophilarum, популяция К. wickerhamii этого же региона, вероятно, является генетически гомогенной. Изученные нами штаммы имели идентичные молекулярные кариотипы и схожие ПДРФ-профили IGS2-pafi0Ha рДНК.

В отличие от К. dobzhanskii и К. lactis, дрожжи К. marxianus обладают практически идентичными последовательностями внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и JTS2. Причем, единичные нуклеотидныё замены, обнаруженные в этом районе рДНК, не связаны с экологическим и/или географическим происхождением штаммов. Штаммы К. marxianus значительно отличаются по нуклеотидным последовательностям более вариабельного района рДНК - межгенных спейсеров IGS1 и IGS2 спейсеров. Проведенный нами комплексный молекулярный анализ (секвенирование районов IGS1/IGS2 рДНК, ядерного гена АСТ1, RAPD-ПЦР с праймером ОРА-11, молекулярное кариотипнрование) и литературные данные по полиморфизму утилизации лактозы (Наумов, 2006) свидетельствуют о генетической неоднородности вида К. marxianus и позволяют дифференцировать три популяции: 1) "marxianus" - природные космополитные дрожжи, включая типовую культуру CBS 712; 2) "fragilis" - молочные, также космополитные дрожжи и клинические изоляты; 3) "wikenii" - эндемичные дрожжи из алкогольных ферментационных процессов в Южной Африке.

В последние годы все больше появляется работ об обнаружении клинических изолятов среди культурных дрожжей S. cerevisiae и о возможной их патогенности. По многим молекулярным маркерам клинические изоляты S. cerevisiae похожи на пекарские штаммы и, вероятно, происходят от них (Hennequin et al., 2001; de Llanos et al., 2004). Медицинские штаммы встречаются также среди видов К. lactis и К. marxianus. Проведенный нами сравнительный анализ свидетельствует о близком генетическом родстве молочных и госпитальных штаммов Kluyveromyces. Все изученные клинические изоляты по многим молекулярным маркерам не отличались от штаммов, выделенных из молочных продуктов, и также обладали способностью сбраживать лактозу. Ассоциация дрожжей, сбраживающих лактозу с молочными продуктами, а, следовательно, и с млекопитающими делают их очевидными прародителями госпитальных штаммов. Следует отметить, что ряд характеристик, свойственных патогенным дрожжам уже имеются у штаммов К. marxianus (популяция "fragilis"): образование псевдомицелия, устойчивость к повышенной температуре и высокая пектолитическая активность.

Полученные результаты позволили нам разработать экспресс-методы молекулярной идентификации дрожжей рода Kluyveromyces. Для определения видовой принадлежности штаммов предложено использовать рестриктазный анализ вариабельного района рибосомальной ДНК -межгенного спейсера IGS2. Показана пригодность ПЦР-анализа с праймерами (GTG)5, (ATG)5 и OP А-11 для типирования отдельных штаммов и изучения внутривидововго полиморфизма дрожжей Kluyveromyces.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухотина, Наталия Николаевна, Москва

1. Антонов А.С. Геноснстематика: достижения, проблемы и перспективы // Усп. совр. биол. 1974. Т. 77. №2. С. 31-47.

2. Антонов А.С. (Ред.) Молекулярные основы геносистематики. Изд-во Моск. ун-та. 1980.286 с.

3. Антонов А.С. Геноснстематика: от Э. Чаргаффа и А.Н. Белозерского до наших дней // Молек. биология. 2005. Т. 39. №4. С. 581-589.

4. Бабьева И.П. Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. 1979. М. Пищ. пром. 120 с.

5. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей / М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004.221 с.

6. Белозерский А.Н. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов. Второй Всесоюзный биохимический съезд / Изд-во ФАН СССР. 1969.

7. Бибикова И.И., Фатеева М.В., Мамаев Б.М. Дрожжевая флора жука -слоника Cossonus rotundic Faust., поражаюшего лиственные породы деревьев //Микробиология. 1987. Т. 56. №4. С. 694-697.

8. Бибикова И.И., Фатеева М.В., Мамаев Б.М. Дрожжевая флора жука -сверлильщика Elateroides dermestoides L. в лесах Приамурья // Микол. фитопатол. 1988. Т. 22. №4. С. 289-292.

9. Бибикова И.И., Фатеева М.В., Мамаев Б.М. Дрожжи в микрофлоре дальневосточных двукрылых Protaxymia melanoptera Mamaev et Krivosheina // Известия АН СССР. 1990. Сер. биол. №3. С. 474-476.

10. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко Н.В., Ибатулин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов А.В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. 1992. Т. 28. №5. С. 19-28.

11. Булат С.А., Мироненко Н.В. Видовая идентичность фитопатогенных грибов Pyrenophora teres Drechsler и P. graminea Ito et Kuribayashi // Микол. фитопатол. 1990. Т. 24. Вып. 5. С. 435-441.

12. Булат С.А., Мироненко Н.В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами // Генетика. 1996. Т. 32. №2. С. 165-183.

13. Голубев В.И. Эволюция понятия "дрожжи" // Усп. совр. биол. 1992а. Т. 112. Вып. 5-6. С. 715-724.

14. Голубев В.И. Дрожжи филлосферы в дальневосточном заповеднике "Кедровая падь'7/Сибир. биол. журн. 19926. №2. С. 37-42.

15. Квасников Е.В., Нагорная С.С, Щелокова И.Ф. Дрожжевая флора ризосферы и филлосферы растений // Микробиология. 1975. Т. 44. Вып. 2. С. 339-345.

16. Ковалева Н.С., Юркевич В.В. Закономерности гидролиза сахарозы и инулина Р-фруктозидазой из Saccharomyces (Kluyveromyces) lactis II Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол. почвовед. 1973. №1. С. 37-43.

17. Голубев В.И., Голубев Н.В. Отбор и характеристика дрожжей активно сбраживающих лактозу // Прикладная биохимия и микробиол. 2004. Т. 40. №3. С. 332-336.

18. Крассильников Н.А. Дрожжи / Курсанов Л.И. (Ред.). Определитель низших растений. М.: Советская наука. 1954. Т. 3. С. 118-119.

19. Кудрявцев В.И. / Систематика дрожжей. М.: Изд-во АН СССР. 1954. 427 с.

20. Кудрявцев В.И. (Ред.) Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов. / М. Наука. 1976.238 с.

21. Молекулярная клиническая диагностика. Методы, под ред. Херрингтона С. и Макги Дж. / М.: Изд-во "Мир". 1999. 558 с.

22. Наумов Г.И. Генетическая концепция рода у грибов // ДАН СССР. 1978. Т. 241. №4. С. 952-954.

23. Наумов Г.И. Генетическая основа классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение скрещиваемости // Журн. Общ. Биол. 1979. Т. 40. №2. С. 282-288.

24. Наумов Г.И. Дивергенция и классификация видов дрожжей // Микол. фитопатол. 1980. Т. 14. №2. С. 187-190.

25. Наумов Г.И. Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces Kudriavzev emend. G. Naumov // Молек. генетика микробиол. и вирусол. 1986. №5. С. 10-13.

26. Наумов Г.И. Геносистематика дрожжей-аскомицетов (К выходу определителя "The yeasts. A taxonomic study". 1984) // Микробиология 1987а. Т.56. Вып. 3. С. 521-524.

27. Наумов Г.И. Номенклатура дрожжевого рода Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov //Микол. фитопатол. 19876. Т. 21. №2. С. 134-140.

28. Наумов Г.И. Итоги геносистематики дрожжей родов Williopsis Zender и Zygowiliiopsis Kudriavzev // Молек. генетика микробиол. и вирусол. 1987в. №2. С. 3-7.

29. Наумов Г.И. Идентификация видов дрожжей рода Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov //Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 1. С.114-118.

30. Наумов Г.И. Дикий европейский вид Zygofabospora krassilnikovii -прародитель молочных дрожжей Z. lactis II ДАН. 2000. Т. 372. №6. С. 846-849.

31. Наумов Г.И. Генетика полиморфизма утилизации лактозы у дрожжей Kluyveromyces marxianus II ДАН. 2006. Т. 409. №3. С. 422424.

32. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Наумова Т.И., Гудкова Н.К. Генетические основы классификации дрожжей. Изучение выживаемости аскоспор гибридов // Журн. Общ. Биол. 1983. Т. 44. №5. С. 648-660.

33. Наумов Г.И., Юркевич В.В. Изменчивость биохимических признаков, используемых в таксономии дрожжей Saccharomyces II Успехи совр. биол. 1970. Т. 70. Вып. 3. С. 315-125.

34. Наумова Е.С. Эволюционная и таксономическая генетика дрожжей / Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук. ФГУП ГосНИИгенетика М. 2006.69 с.

35. Наумова Е.С., Наумов Г.И., Корхола М. Молекулярные кариотипы различных генетических линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биотехнология. 1993. №4. С .2-5.

36. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молек. биология. 1999. Т. 33. №6. С. 997-1011.

37. Скородумова А.Н. Дрожжи молока и молочных продуктов и их производственное значение / М.: Пищевая промышленность. 1969. 117 с.

38. Asakura К., Iwaguchi S.I., Homma М., Sukai Т., Higashide К., Tanaka К. Electrophoretic karyotypes of clinically isolated yeasts of Candida albicans and Candida glabrata II J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2531-2538.

39. Bakalinsky A.T., Snow R. The chromosomal constitution of wine strains of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1990. V. 6. P. 367-382.

40. Barnett J.A., Payne RW., Yarrow D. Yeasts: Characteristics and Identification / Cambridge: Cambridge University Press. 1983. 812 p.

41. Barton R.C., Scherer S. Induced chromosome rearrangements and morphologic variation in Candida albicans II J. Bacterid. 1994. V. 176. №3. P. 756-763.

42. Belloch C., Barrio E., Uruburu F., Garcia M.D., Querol A. Characterisation of four species of the genus Kluyveromyces by mitochondrial DNA restriction analysis // Syst. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 397-408.

43. Belloch С., Barrio E., Garcia M.D., Querol A. Inter- and intraspecific chromosome pattern variation in the yeast genus Klyuveromyces II Yeast. 1998b. V. 14. P. 1341-1354.

44. Belloch C., Querol A., Garcia M.D., Barrio E. Phylogeny of the genus Kluyveromyces inferred from the mitochondrial cytochrome-c oxidase II gene // Int. J. System. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 405-416.

45. Bernardi G., Piperno G., Fonty G. The mitochondrial genome of wild type yeast cell. I. Preparation and heterogenety of mitochondrial DNA // J. Mol.Biol. 1972. V. 65. P. 173.

46. Bicknell J.N., Douglas H.C. Nucleic acid homologies among species of Saccharomyces II J. Bacteriol. 1970. V. 101. P. 505-512.

47. Boidin J., Abadie F., Jacob J.L., Pignal M.C. Les levures a spores reniformes // Bull. Soc. Mycol. France. 1962. V. 78. P. 155-203.

48. Bonekamp F.J., Oosterom J. On the safety of Kluyveromyces lactis a review // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V 41. P. 1-3.

49. Bostock A., Khattak M.N., Mattehews R., Burnie J. Comparision of PCR fingerprinting, by random amplification of polymorphic DNA, with other molecular typing methods for Candida albicans II J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 2179-2184.

50. Bruns T.D., White T.J., Taylor J.W. Fungal molecular systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1991. V.22. P. 525-564.

51. Bulat S.A., LUbeck M„ Mironenko N., Jensen D.F., Lubeck P.S. UP-PCR analysis and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and Gliocladium //Mycol. Res. 1998. V. 102. №8. P. 933-943.

52. Bussereau F., Casaregola S., Lafay J.F., Bolotin-Fukuhara M. The Kluyveromyces lactis repertoire of transcriptional regulators // FEMS Yeast Res. 2006. V. 6. №3. P. 325-335.

53. Camouqrand N., Mila В., Velous G., Lazowska J., Guerin M. Discrimination between different groups of Candida parapsilosis by mitochondrial DNA restriction analysis // Curr. Genet. 1998. V. 13. P. 445-449.

54. Cardazzo В., Minuzzo S., Sartori G., Grapputo A., Carignani G. Evolution of mitochondrial DNA in yeast: gene order and structural organization of the mitochondrial genome of Saccharomyces uvarum II Curr. Genet. 1998. V. 33. P. 52-59.

55. Carle G.F., Olson M.V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. P. 5647-5664.

56. Carle G.F., Olson M.V. An electrophoretic karyotype for yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3756-3760.

57. Chen W. Restriction fragment length polymorphisms in enzymatically amplified ribosomal DNAs of three heterothallic Pythium species // Phytopathology. 1992. V. 82. P. 1467-1472.

58. Chen W., Hoy J.W., Schneider R.W. Species-specific polymorphysms in transcribed ribosomal DNAs of Pythium species //Exptl. Mycol. 1992. V. 16. P. 22-34.

59. Clark-Walker G.D. Evolution of mitochondrial genoms in fungi // Int. Rev. Cytol. 1992. V. 141. P. 89-127.

60. Clark-Walker G.D., Weiller G.F. The sructure of the small mitochondrial DNA of Kluyveromyces thermotolerans is likely to reflect the ancestral gene order in fungi // J. Mol. Evol. 1994. V. 38. P. 593-601.

61. Daniel H.-M., Meyer W. Evaluation of ribosomal RNA and actin gene sequences for the identification of ascomycetous yeast // Int. J. Food Microbiol. 2003. V.86. P. 61-78.

62. Diaz M.R., Boekhout Т., Theelen В., Fell J.W. Molecular sequenses of the intergenic spacer (IGS) associated with rDNA of the two varieties of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans II Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. №4. P. 35-45.

63. Dieckmann C.L., Gandy B. Preferential recombination between GC clusters in yeast mitochondrial DNA // EMBO J. 1987. V. 6. P. 41974203.

64. Dombrowski W. Die Hefen in Milch und Milchprodukten // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1910. B. 28. S. 345-403.

65. Esteve-Zarzoso В., Belloch C., Uruburu F., Querol A. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rDNA gene and two ribosomal internal transcribed spacers // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 329337.

66. Fan M., Chen L.C., Ragan M.A., Gutell R.R., Warner J.R., Currie B.P., Casadevall A. The 5S rRNA and the rRNA intergenetic spacer of the two variates of Cryptococcus neoformans II J. Med. Vet. Mycol. 1995. V. 33. P. 215-221.

67. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogenetic Inference Package), version 3,5c. / Department of Genetics, University of Washington, Seattle. 1993.

68. Fernandes-Espinar M.T., Barrio E., Querol A. Analysis of the genetic variability in the species of the Saccharomyces sensu stricto complex // Yeast. 2003. V. 20. P. 1213-1226.

69. Fukuhara H. Kluyveromyces lactis a retrospective // FEMS Yeast Res. 2006. V. 6. №3. P. 323-324.

70. Fuson G.B., Presley H.L., Phaff H.J. Deoxiribonucleic acid base sequence relatedness among members of the yeast genus Kluyveromyces II Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. №4. P. 371-379.

71. Ganter P.F., Quarkes B. Analysis of population structure of cactophilic yeast from the genus Pichia: P. cactophila and P. norvegensis II Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 35-44.

72. Guillamon J.M., Barrio E., Huerta Т., Querol A. Rapid characterization of four species of the Saccharomyces sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 708-714.

73. Guilliermond F., Negroni P. Sur la presence d'une copulation heterogamique dans le Saccharomyces marxianus II Compt. Rend. Soc. Biol. 1929. V. 101. P. 565-566.

74. Hansen E.S. Undersegelser over alkoholgjaersvampenes fysiologi og morfologi. VII. Om alkoholgjaersvampenes forhold til Sukkerarterne // Meddelelser Carlsberg Lab. 1888. V. 2. P. 220-256.

75. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids Symp. Ser. 1999. V.41.P. 95-98.

76. Hennequin C., Thierry A., Richard G.F., Lecointre G., Nguyen H.-V., Gaillardin C., Dujon B. Microsatellite typing as a new tool for identification of Saccharomyces cerevisiae strains // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 3. P. 551-559.

77. Herman A.I. Interspecies sex-specific growth responses in Kluyveronyces II Ant. van Leeuwenhoek. 1970. V. 36. №3. P. 421-425.

78. Hoeben P., Weiller G., Clark-Walker G.D. Larger rearranged mitochondrial genomes in DekkeralBrettanomyces yeasts are closely related than smaller genomes with a conserved gene order // J. Mol. Evol. 1993. V. 36. P. 263-269.

79. Huffman J.L., Molina F.I., Jong S.-C. Authentication of ATCC strains in the Saccharomyces cerevisiae complex by PCR fingerprinting // Exper. Mycol. 1992. V. 16. P. 316-319.

80. Iwaguchi S., Sato M., Magee B.B., Magee P.T., Makimura K., Suzuki T. Extensive chromosome translocation in a clinical isolates showing the distinctive carbohydrate assimilation profile from a candidiasis patient // Yeast. 2001. V. 18. P. 1035-1046.

81. James S.A., Collins M.D., Roberts I.N. Use of an rRNA internal transcribed spacer region to distinguish phylogenetically closely related species of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora II Int. J. Syst. Bacterid. 1996. V. 46. №1. P. 189-194.

82. Johannsen E. Hybridization studies within the genus Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt // Ant. van Leeuwenhoek. 1980. V. 46. №2. P. 177-189.

83. Johannsen E., van der Walt J.P. Interfertility as basis for the delemination of Kluyveromyces marxianus II Arch, microbiol. 1978. V. 118. P. 45-48.

84. Kaback D.V., Davidson N. Organization of the ribosomal DNA gene cluster in the yeast Saccharomyces cerevisiae II J. Mol. Biol. 1980. V.138. P.745-754.

85. Kreger-van Rij N.J.W. (eds.) The Yeasts, a Taxonomic Study / 3rd revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier. 1984. 1082 p.

86. Kreger-van Rij N.J.W., van der Walt J.P. Ascospores of Endomycopsis selenospora (Nadson et Krassilnikov) Dekker // Nature. 1963. V. 199. P. 1012-1013.

87. Kudijawzew W.I. Die systematic der Hefen. Academic verlag. Berlin. 1960. S. 275-276.

88. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. 2004. V. 5. P. 150-163.

89. Kurtzman C.P. Molecular taxonomy of the fungi / In Bennett, J.W. & Lasure L.L. (eds.): Gene manipulations in fungi. Academic Press. New York. 1985. P. 35-36.

90. Kurtzman C.P. Molecular taxonomy of yeast // Yeast. 1994. V. 10. P. 1727-1740.

91. Kurtzman C.P. Systematics and taxonomy of yeasts // In Ernst, J.F., Schmidt A. (eds.): Dimorphism in human pathogenic and apathogenic yeasts. Contrib. Microbiol. Basel. Karger. 2000. V. 5. P.l-14. P. 35-56.

92. Kurtzman C.P., Fell J.W. (eds.) The Yeasts, a Taxonomic Study / 4th revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1998. 1055 p.

93. Kurtzman C.P., Lachance M.-A., Nguyen H.-V., Prillinger H. Proposal to conserve Kluyveromyces with a conserved type (Ascomycota: Hemiascomycetes, Saccharomycetaceae) // Taxon. 2001. V. 50. P. 907908.

94. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences // Ant. van Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 331-371.

95. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Phylogenetic relationships among yeasts of the "Saccharomyces complex" determined from multigene sequence analyses If FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 417-432.

96. Lachance M.-A. Yeasts associated with black knot disease of trees // In: Stewart G.G. and Russell I. (eds.). Current developments in yeast research 1980. Proceedings of the 5th International Symposium. Pergamon Press. Toronto. 1980. P. 607-613.

97. Lachance M. Kluyveromyces systematics since 1970 // Ant. van Leeuwenhoek. 1993. V. 63. P. 95-104.

98. Lachance M.A., Daniel H.M., Meyer W., Prasad G.S., Gautam S.P., Boundy-Mills K. The D1/D2 domain of the large-subunit rDNA of the yeast species Clavispora lusitaniae is unusually polymorphic // FEMS Yeast Res. 2003. V. 4. P. 253-258.

99. Lachance M.A., Starmer W.T., Bowles J.M., Phaff H.J., Rosa C.A. Ribosomal DNA, species structure, and biogeography of the cactophilic yeast Clavispora opuntiae И Can. J. Microbiol. 2000. V 46. P. 195-200.

100. Lieckfeldt E., Meyer W., Borner T. Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting // J. Basic Microbiol. 1993. V. 33. №6. P. 413-426.

101. Liu Z., Kurtzman C.P. Phylogenetic relationships among species of Williopsis and Saturnospora gen. nov. as determined from partial rRNA sequences // Ant. van Leeuwenhoek. 1991. V.60. P. 21-30.

102. Lodder J. (ed.) The Yeasts, a Taxonomic Study / 2nd revised and enlarged edition. North-Holland Publ. Company. Delft. The Netherlands. 1970. 1385 p.

103. Lodder J., Kreger-van Rij N.J.W. The Yeasts, a Taxonomic Study / North-Holland Publ. Company. Amsterdam. 1952.713 p.

104. Lott T.J., Kuykendall R.J., Welbel S.F., Pramanik A, Lasker B.A. Genomic heterogeneity in the yeasts Candida parapsilosis II Curr. Genet. 1993. V.23. №23. P.463-467.

105. Magge B.B., D'Souza T.M., Magge P.T. Strain and species identification by restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal DNA repeat of Candida species // J. Bacteriol. 1987. V. 169. №4. P. 16391643.

106. Maleszka R, Clark-Walker G.D. Yeasts have four-fold variation in ribosomal DNA composition // Yeast. 1993. V.9. P.53-58.

107. Martin I., ОёЬагЬоиШё M., Ferrari E., Klier A., Rapoport G. Characterization of the levanase gene of Bacillus subtilis which shows homology to yeast invertase. Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 177-184.

108. Martini A. Ibridazione DNA/DNA tra specie di lieviti del genere Kluyveromyces. II Ann. Fac. Agr. Univ. Perugia. 1973. V. 28. P. 1-15.

109. Martini A., Phaff H., Douglass S. Dexyribonucleic acid base composition of species in the yeast genus Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt // J. Bacteriol. 1972. V. 111. №2. P. 481-487.

110. Martini A., Vaughan Martini A. Assignment of Kluyveromyces cellobiovorus nomen nudum to Candida intermedia (Ciferri & Ashford) Langeron et Guerra // Ant. van Leeuwenhoek. 1992. V. 61. № 1. P. 57-60.

111. Merz W.S., Connelly C., Hieter P. Variation of electrophoretic karyotypes among clinical isolates of Candida albicans II J. Clin. Microbiol. 1988. V. 26. P. 842-845.

112. Molina F.I., Jong Sh.-Ch., Huffman J.L. PCR amplification of the 3'-external transcribed and itergenic spacers of the ribosomal DNA repeat unit in three species of Saccharomyces IIFEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 108. P. 259-264.

113. Molnar 0., Messner R., Prillinger H., Stahl U., Slavikova E. Genotypic identification of Saccharomyces species using random amplified polymorphic DNA analysis // System. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 136-145.

114. Montrocher R., Verner M.-C., Briolay J., Gautier C., Marmeisse R. Phylogenetic analysis of Saccharomyces cerevisiae group based on polymorphisms of rDNA spacer sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 295-303.

115. Mortimer R.K., Contopoulou C.R., King J.S. Genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae, edition 11 // Yeast. 1992. V. 8. P. 817-902.

116. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-350.

117. Murphy A., Kavanagh K. Emergence of Saccharomyces as a human pathogen implication for biotechnology // Enz. Microb. Technol. 1999. V. 25. P. 551-557.

118. Musters W., Boon K., van der Sande C.A., Harm van Heerikhuizen, Planta R.J. Functional analysis of transcribed spacers of yeast ribosomal DNA // The EMBO J. 1990. V. 9. №9. P. 3989-3996.

119. Nadson G.A., Krassilnikov N.A. Un nouveau genre d' Endomycetacees: Guilliermondella I I Compt. Rend. 1928. V. 187. P. 307-309.

120. Nagahama Т., Hamamoto M., Nakase Т., Horikoshi K. Kluyveromyces nonfermentas sp. nov., a new yeast species isolated from the deep sea // Int. J. Syst. Bacterid. 1999. V. 49. P. 1899-1905.

121. Naumov G.I. Genetic basis for classification and identification of the ascomycetous yeasts // Stud. Mycol. 1987. V. 30. P.469-475.

122. Naumov G.I. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex I I J. Ind. Microbiol. 1996. V. 17. P. 295-302.

123. Naumov G.I., Naumova E.S. Five new combinations in the yeast genus Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov (pro parte Kluyveromyces) based on genetic data // FEMS Yeast Res. 2002. № 2. P. 39-46.

124. Naumov G.I., Naumova E.S., Lantto R.A., Louis E.J., Korhola M. Genetic homology between Saccharomyces cerevisiae and its sibling species S. paradoxus and S. bayanus: electrophoretic karyotypes // Yeast. 1992. V. 8. P. 599-612.

125. Naumova E.S., Naumov G.I., Molina F.I. Genetic variation among European strains of Saccharomyces paradoxus: results from DNA fingerprinting I I Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. P. 86-92.

126. Novak E.K., Zolt J. A new system proposed for yeasts // Acta Botan. Acad. Sci. Hung. 1961. V. 7. P. 93-145.

127. Peterson S.W., Kurtzman C.P. Ribosomal RNA sequence divergence among sibling species of yeasts // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. P. 124-129.

128. Phaff H.J. The species concept in yeast: physiologic, morphologic, genetic, and ecologic parameters // Advances in Biotechnology (Stewart, G.G. and Russell I., Eds.). 1980. Pergamon Press, Toronto, ON. P. 635643.

129. Phaff H.J., Miller M.W., Shifrine M. The taxonomy of yeasts isolated from Drosophila in the Yosemite region of California // Ant. van Leeuwenhoek. 1956. V. 22. P. 145-161.

130. Piskur J., Mozina S.S., Stenderup J., Pedersen M.B. A mitochondrial molecular marker, ori-rep-tra, for yeast species // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 2780-2782.

131. Posteraro В., Sanguinetti M., D'amore G., Masucci L., Morace G., Fadda G. Molecular and epidemiological characterization of vaginal Saccharomyces cerevisiae isolates // J. Clinical Microbiol. 1999. V. 37. №7. P. 2230-2235.

132. Price C.W., Fuson G.B., Phaff H.J. Genome comparison in yeast systematics: delimitation of species within the genera Schwanniomyces, Saccharomyces, Debaryomyces and Pichia II Microbiol. Rev. 1978. V. 24. P. 161-193.

133. Querol A., Barrio E., Ramon D. A comparative study of different methods of yeast strain characterization // Syst. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. P. 439-446.

134. Ragnini A., Fukuhara H. Mitochondrial DNA of the yeasts Kluyveromyces-. guanine-cytosine rich sequence clusters // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 8433-8442.

135. Roberts C., van der Walt J.P. The life cycle of Kluyveromyces polysporus //Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. 1959. V. 31. P. 325-341.

136. Rokas A., Williams B.L., King N., Carroll S.B. Genome-scale approaches to resolving incongruence in molecular phylogenies // Nature. 2003. V. 425. P. 798-804.

137. Scheda R., Yarrow D. The instability of physiological properties used as criteria in the taxonomy of yeasts // Arch. Mikrobiol. 1966. V. 55. P. 209225.

138. Scheda R., Yarrow D. Variation in the fermentation pattern of some Saccharomyces species // Arch. Mikrobiol. 1968. V. 61. P. 310-316.

139. Shehata A.M., Mrak E.M., Phaff H.J. Yeast isolated from Drosophila and from their suspected feeding places in Southern and Central California // Mycologia. 1955. V. 47. P. 799-811.

140. Shen P., Jong S., Molina F. Analysis of ribosomal DNA restriction patterns in the genus Kluyveromyces II Ant. van Leeuwenhoek. 1994. V. 65. P. 99-105.

141. Sidenberg D.G., Lachance M.-A. Speciation, species delineation, and electrophoretic isoenzyme patterns of the type strains of Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt // Int. J. System. Bacteriol. 1983. V. 33. №4. P. 822-828.

142. Sidenberg D.G., Lachance M.-A. Electophoretic isoenzyme variation in Kluyveromyces populations and revision of Kluyveromyces marxianus (Hansen) van der Walt. //Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 94-102.

143. Sor F., Fukuhara H. Analysis of chromosomal DNA patterns of the genus Kluyveromyces И Yeast. 1989. V. 5. P. 1-10.

144. Stelling-Dekker N.M. Die Hefesammlung des "Centraalbureau voor Schimmelcultures", Beitrage zu einer Monographic der Hefearten I. Teil,die sporogenen Hefen // Verh. K. Ned. Akad. Wet. Afd. Natuurk., Sect. II. 1931. B. 28. S. 1-547.

145. Varma A., Swinne D., Staib F., Bennett J.E., Kwon-Chung K.J. Diversity of DNA fingerprints in Cryptococcus neoformans II J. Clin. Microbiol. 1995. V.33.№7. P.1807-1814.

146. Vaughan-Martini A., Martini A. Perfect-imperfect relationship within the yeast genus Kluyveromyces И Ann. Microbiol. 1985. V. 35. P. 93-97.

147. Vaughan-Martini A., Martini A. Taxonomic revision of the yeast genus Kluyveromyces by nuclear deoxyribonucleic acid reassociation // Int. J. Syst. Bacterid. 1987. V. 37. P. 380-385.

148. Vilgalys R., Hester M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species //J. Bacteriol. 1990. V. 172. №8. P. 4238-4246.

149. Walker W.F. 5S ribosomal RNA sequences from ascomycetes and evolutionary implications // Syst. Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 48-53.

150. Weiller G.F., Schueller C.M., Schweyen R.J. Putative target sites for mobile G+C-rich clusters in yeast mitochondrial DNA: single elements and tandem arrays // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 218. P. 277-283.

151. Weiller G.F., Bruckner H., Kim S.H., Pratje E„ Schweyen R.J. A GC-cluster repeat is a hotspot for mit-macro-deletions in yeast mitochondrial DNA // Mol. Gen. Genet. 1991. V. 226. P. 233-240.

152. Wenzlau J.M., Perlman P.S. Mobility of two optional G+C-rich clusters of the var I gene of yeast mitochondrial DNA // Genetics. 1990. V. 126. P.53-62.

153. Wesolowski M., Fukuhara H. Linear mitochondrial deoxyribonucleic acid from the yeast Hansenula mrakii II Mol. Cell. Biol. 1981. V. 1. P. 387393.

154. Wesolowski-Louvel M., Breuning K.D., Fukuhara H. Kluyveromyces lactis /Nonconventional Yeasts in Biotechnology: a Handbook (Wolf K., eds.). 1996. Springer, Berlin. P. 139-201.

155. Wickerham L.J., Burton K.A. Hybridization studies involving Saccharomyces lactis and Zyfosaccharomyces ashbyi II J. Bacteriol. 1956a. V. 71. №3. P. 290-295.

156. Wickerham L.J., Burton K.A. Hybridization studies involving Saccharomyces fragilis and Zyfosaccharomyces dobzhanskii И J. Bacteriol. 1956b. V. 71. №3. P. 296-302.

157. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful 1 as genetic markers//Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. №22. P. 6531-6535.

158. Williams D.W., Wilson M.J., Lewis M.A.O., Potts A.J.C. Identification of Candida species by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis of intergenic spacer regions of ribosomal DNA // J. Clin. Microbiol. 1995. V. 33. №9. P. 2476-2479.

159. Yamada Y., Matsuda M., Maeda K., Sakakibara C., Mikata K. The phylogenetic relationships of the saturn-shaped ascospore-forming species of the genus Williopsis Zender and related genera based on the partial sequences of 18S and 26S ribosomal RNAs

160. Saccharomycetaceae): the proposal of Komagatae gen. nov. // Biosci. Biotech. Biochem. 1994b. V. 58. №7. P. 1236-1244.

161. Zerva L., Hollis R.J., Pfaller M.A. In vitro susceptibility testing and DNA typing of Saccharomyces cerevisiae clinic isolates // J. Clinical Microbiol. 1996. V. 34. №12. P. 3031-3034.

162. Zinn A.R., Pohlman J.K., Perlman P.S., Butow R.A. In vivo double-strand breaks occur at the recombinogenic G+C-rich sequences in the yeast mitochondrial genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. V. 85. P. 2286-2690.

Информация о работе

Сухотина, Наталия Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.15

Диссертация

Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухотина, Наталия Николаевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces"

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сухотина, Наталия Николаевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухотина, Наталия Николаевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Геносистематика дрожжей рода Kluyveromyces
ВАК РФ 03.00.15, Генетика