Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea

Серпова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea"

003485728

На правах рукописи

(

Серпова Елена Владимировна

Молекулярная филогения дрожжей рода Ьас1гапсеа

Специальность 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ДЕК 2009

Москва - 2009

003485728

Работа выполнена в секторе молекулярной биологии дрожжей и лаборатории молекулярной генетики, таксономии и экологии дрожжей (зав. лабораторией, доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»), Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Наумова Елена Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Шевелев Алексей Борисович

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

кандидат биологических наук Вустин Михаил Михайлович

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « 22 » декабря 2009 г. в 14- на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Факс: (495) 315-05-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИгенетика.

Автореферат разослан ноября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук ®оюшина Т-Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Дрожжи широко распространены во многих экосистемах и играют важную роль в различных пищевых связях. Таксономически наиболее изучен род Saccharomyces, включающий биологические виды S. cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. cariocanus, S. paradoxus, S. kudriavzevii и S. mikatae (Naumov et al., 2000; Kurtzman, 2003; Wang et Bai, 2008). Дрожжи S. cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, у которого определена нуклеотидная последовательность генома (Goffeau et al., 1996). В геноме этих дрожжей обнаружено 55 дуплицированных блоков, включающих в себя несколько сотен пар гомологичных генов (Wolfe, Shields, 2007). Одинаковый порядок и ориентация паралогичных генов в дуплицированных блоках послужили доказательством того, что геном дрожжей S. cerevisiae сформировался в результате дупликации и последующих массовых хромосомных перестроек и делеционных потерь отдельных генов. За последнее десятилетие проведено секвенирование полноразмерных геномов еще более 20 видов аскомицетовых дрожжей. Сравнительный анализ геномных последовательностей ряда видов дрожжей показал, что полная дупликация восьми предковых хромосом у дрожжей S. cerevisiae произошла после их расхождения с дрожжами Kluyveromyces waltii (Kellis et al., 2004).

Молекулярно-генетическое изучение одного из ближайших родственников дрожжей Saccharomyces — рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt показало, что этот род очень гетерогенен и содержит ряд дрожжей не находящихся в близком родстве между собой и с типовым видом рода - К. polysporus (Cai et al., 1996; Naumov, Naumova, 2002; Kurtzman, 2003; Kurtzman, Robnett, 2003). В то же время обнаружена небольшая группа видов из различных родов (Zygosaccharomyces cidri, Z. fermentati, К. thermotolerans, К. waltii, S. kluyveri), имеющих в той или иной степени близкие рибосомальные последовательности. На базе пяти указанных видов был образован новый род Lachancea (Kurtzman, 2003). Недавно описаны еще два новых вида L. meyersii (Fell et al., 2004) и L. dasiensis (Lee et al., 2009).

Помимо дупликации всего генома в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, сегментов хромосом и отдельных генов. В геноме дрожжей Saccharomyces гены, представленные большим числом копий, образуют мультигенные семейства. Гены рибосомальной РНК расположены на XII хромосоме по типу тандемных повторов, образуя последовательность ген-спейсер-ген-спейсер. Гаплоидный геном дрожжей S. cerevisiae содержит примерно 120-200 наборов генов рРНК (Maleszka, Clark-Walker, 1993). Упорядоченная структура рРНК и единообразие последовательностей в повторах сохраняются за счет так называемой

"концертной" эволюции, при которой тандемные повторы ("члены одного оркестра") эволюционируют как единое целое (Nei, Rooney, 2005). При этом происходит гомогенизация тандемных повторов, так как возникающие мутации элиминируются или распространяются по другим повторам за счет неравного кроссинговера или генной конверсии. В настоящее время анализ последовательностей рРНК является одним из наиболее используемых методов определения родственных отношений дрожжей, как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях (Valente et al., 1999; Kurtzman, 2000; Suh et al., 2006). Сравнительный анализ домена D1/D2 гена 26S рРНК позволил разделить все аскомицетовые виды дрожжей на 10 клад; дрожжи родов Saccharimyces и Lachancea объединились в кладе "Saccharomyces" (Kurtzman, Robnett, 1998,2003).

Другой тип организации имеют рассеянные по геному не тандемные повторы. К числу таких мультигенных семейств относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров дрожжей S. cerevisiae. Как правило, эти гены расположены в субтеломерных районах хромосом — наиболее динамичных участках дрожжевого генома (Kellis et al., 2003). Особый интерес представляют а-галактозидазные гены ферментации мелибиозы. а-Гапактозидазы [К.Ф.3.2.1.22] - широко распространенные ферменты, которые присутствуют у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у дрожжей. Среди дрожжей Saccharomyces и Lachancea известны как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы негативные по этому признаку. В отличие от Saccharomyces, род Lachancea практически не изучен.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции дрожжей рода Lachancea на материале штаммов различного экологического и географического происхождения. В этой связи в работе решались следующие задачи:

1. Сравнение геномов видов рода Lachancea с помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК и анализа нуклеотидных последовательностей генов рРНК.

2. Идентификация а-галакгозидазных генов ферментации мелибиозы и определение их хромосомной локализации у дрожжей Lachancea.

3. Определение нухлеотидной последовательности генов MEL дрожжей Lachancea и филогенетический анализ а-галактозидаз.

4. Скрининг штаммов Saccharomyces различного географического происхождения с целью обнаружения новых а-галактозидазных генов MEL.

5. Сравнительный анализ а-галактозидаз дрожжей клады "Saccharomyces".

Научная новизна и практическая значимость работы. На материале штаммов различного экологического и географического происхождения впервые исследован молекулярный полиморфизм дрожжей рода Lachancea. Обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans и обладающий способностью ферментировать мелибиозу.

С помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК изучены видовые особенности геномов дрожжей рода Lachancea. Установлено, что все виды этого рода имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8, тогда как предельные размеры хромосом у разных видов существенно отличаются. Наибольший диапазон размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L. cidri (400-2800 т.п.н.), а наименьший - у L. waltii (1400-2800 т.п.н.).

Впервые изучены а-галактозидазные гены MEL у дрожжей рода Lachancea и установлена их хромосомная локализация у разных штаммов. Из восьми видов рода Lachancea штаммы Ме1+ не обнаружены только у двух видов: L. meyersii и L. waltii. Показано, что не сбраживающие мелибиозу штаммы не содержат даже молчащей последовательности MEL Обнаружено накопление полимерных генов MEL у представителей видов L. fermentati, L. cidri и Lachancea sp. Скрининг штаммов Saccharomyces не европейского происхождения позволил впервые обнаружить полимерные гены MELpl и MELp2 у дрожжей S. paradoxus. Сравнительный филогенетический анализ а-галактозидаз клады "Saccharomyces" показал видоспецифичность генов MEL аскомицетовых дрожжей.

Создана коллекция охарактеризованных молекулярными методами штаммов дрожжей Lachancea и Saccharomyces, которая может быть использована в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Ш-ем Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (2004, Москва); Международной школе-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия" (2005, Москва); 25-м Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (2006, Хельсинки, Финляндия); 12-м Международном конгрессе по дрожжам (2008, Киев, Украина); V-м съезде ВОГиС "200 лет со дня рождения Дарвина (Москва, 2009). Диссертационная работа была апробирована на заседании секции генетики микроорганизмов Ученого совета ГосНИИгенетика 9 ноября 2009 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи и 5 материалов симпозиумов и конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть и обсуждение, а также заключение и выводы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного

текста, содержат 31 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает 260 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе было изучено 135 штаммов дрожжей Lachancea и Saccharomyces различного экологического и географического происхождения. Происхождение основных штаммов можно найти на следующих сайтах коллекций в интернете: CBS, www.cbs.knaw.nl: NRRL, www.ncaur.usda.gov: NBRC, www.nbrc.nite.go.ip.

Генетический анализ. Дрожжи культивировали и скрещивали на стандартной полной среде YPD при 28°С. Спорообразование индуцировали на среде с ацетатом натрия. Получение гибридов и изоляцию спор проводили при помощи микроманипулятора по стандартным методикам (Захаров и др., 1984).

ПЦР-анализ. Амплификацию различных участков рДНК и а-галактозидазных генов проводили непосредственно на дрожжевых клетках или с предварительным выделением ДНК согласно методике (Булат, Мироненко, 1990). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик™" (Россия). ПДРФ-анализ осуществляли с помощью эндонуклеаз Alul, НаеIII, Hinfi и НраII (Fermentas, Литва). Разделение продуктов ПЦР проводили в агарозном геле (1-1,6%) при 60-65В в 0.5 х TBE в течение 2-3 часов.

Молекулярное кариотипирование. Приготовление препаратов хромосомных ДНК и их электрофоретическое разделение проводили на аппарате CHEF-DR III (Bio-Rad, США) согласно Naumov et al. (1990). Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили вакуумным способом с помощью аппарата "Vacuum blotter" ("Bio-Rad", США). Введение нерадиоактивной метки с использованием dUTP, меченого дигоксигенином (dig-11-dUTP) из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I", гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя "Roche" (Германия).

Секвенирование. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора "GeneClean Kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США). Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли секвенированием по методу Сэнгера на автоматических секвенаторах ABI 373А ("Applied Biosystems") и Beckman-Coulter (США).

Филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности анализировали при помощи программы SeqMan package (DNAStar Inc., США). Доступные через интернет нуклеотидные и аминокислотные последовательности взяты из баз данных сайта CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases') и из GenBank на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov'). Множественное выравнивание нуклеотидных

последовательностей осуществляли с использованием программы BioEdit version 5.0.9 (Hall, 1999). Установление филогенетических родственных связей и построение дендрограмм проводили с использованием методов Neighbour-Joining и UPGMA из компьютерных пакетов TREECON (van der Peer, de Wachter, 1994) и MEGA 3 (Kumar et al., 2004). Индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, подсчитывали для 1000 псевдореплик.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительный анализ геномов дрожжей рода Lachancea

Изучение молекулярного полиморфизма дрожжей Lachancea проводили на материале штаммов различного происхождения. Для определения видовой принадлежности штаммов использовали ПДРФ-анализ не кодирующих участков рДНК: 5.8S-ITS и IGS2 фрагментов. В качестве видовых тестеров использовали типовые культуры L. thermotolerans NRRL Y-8284, L. cidri CBS 4575, L. fermentati CBS 707, L. meyersii CBS 8951, L. waltii CBS 6430 и L. kluyveri CBS 3082.

Идентификация нового вида Lachancea sp. Сравнительный анализ рибосомальных последовательностей и молекулярное кариотипйрование выявили гетерогенность таксономического вида L. thermotolerans. Все изученные штаммы имели одинаковый размер 5.8S-ITS фрагмента и не отличались по //яеШ-профилям этого участка (рис. 1А). Рестриктазный анализ более вариабельного IGS2 участка с помощью эндонуклеазы А1и\ разделил штаммы на две группы (рис. 1В). К первой группе относится типовая культура L. thermotolerans и штаммы UWO PS 83-1097.1, Yal. 87-1, Yal. 87-2, Yal. 87-5, Yal. 87-13, Fin. 89-2, Fin. 89-11 и DV 87-18, а сбраживающие мелибиозу штаммы NBRC 10066, NBRC 10067, UWO PS 79-139 и UWO PS 82-231 - ко второй группе.

Рис. 1. Рестриктазный анализ амплифицированных 5.8S-ITS (А) и IGS2 (В) фрагментов штаммов L. thermotolerans соответственно с помощью эндонуклеаз Haelll и Alul. Дорожки: 1 - NRRL Y-8284, 2 - Yal. 87-1, 3 - Yal. 87-2, 4 - Yal. 87-5, 5 - Yal. 87-13, 6 - Fin. 89-2, 7 - Fin. 89-11,8 -DV18, 9 - UWO PS 83-1097.1, 10 - NBRC 10066, 11 - NBRC 10067, 12 - UWO PS 79139, 13 - UWO PS 82-231. M - маркер молекулярных масс (п.н.).

10 11 12 13 М

300 -200 " 100 -

10 .11 12 13 М

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей домена И\Ю2 (рис. 2) и 5.88-1ТЙ фрагмента подтвердил деление штаммов на те же две группы, которые, по-видимому, представляют собой близкородственные виды: Ь. 1Иегто1о1егат и ЬасИапсеа Бр. ш/ш

Рис. 2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей домена 01/В2 дрожжей штаммов Ь. 1кегто1о1егапх и ЬасИапсеа ер. Нумерация приводится согласно последовательности 01/Э2 типовой культуры Ь. IИегто1о1егапя №<КЬ У-8284.

NRRX, Y-8284 UW№S 83-1097 Yal. 87-Х Fin. 89-11 EVI в

NBRC 10066 ÜKOPS 82-231

4 es 46S AOS

>09 Kl

TGC

Штаммы Lachancea sp. имеют идентичные последовательности домена D1/D2 и отличаются по этому участку от типовой культуры NRRL Y-8284 двумя транзициями: С-Т в 467 позиции и G-A в 510. Штаммы Lachancea sp. также отличаются от типовой культуры L. thermotolerans NRRL Y-8284 по последовательности 5.8S-ITS фрагмента: две транзиции Т-С в позициях 180 и 196. Указанные нуклеотидные замены являются уникальными и не обнаружены у остальных видов Lachancea.

Каритипический анализ показал, что дрожжи L. thermotolerans и Lachancea sp. имеют различные молекулярные кариотипы (рис. 3).

Рис. 3. Молекулярные кариотипы дрожжей L. гни

thermotolerans и Lachancea sp. Дорожки: 1 -Pichia 3130-»

canadensis (syn. Hasenula wingei) YB-4662-V1A 2700

(хромосомный стандарт), 2 -Saccharomyces. cerevisiae 1810—*• YNN 295 (хромосомный стандарт), L thermotolerans: ¡j-q..*. 3,12-NRRL Y-8284 (T), 4 -Yal. 87-1, 5 - Yal. 87-2, 6 - 1050 -*■ Yal. 87-5, 7-Yal. 87-13,8-Fin. 89-2, 9-Fin. 89-11, 10- »*>-»• DV18, 11-UWO PS 831097.1; Lachancea sp.: 13 -NBRC 10066, 14-NBRC 10067, 15-UWO PS 79-139, 16-UWOPS 82-231. Размеры хромосомных полос даны для YNN 295 и YB-4662-VIA.

Таким образом, сравнительный анализ рибосомальных последовательностей и молекулярное кариотипирование позволили

дифференцировать среди дрожжей таксономического вида L. thermotolerans две группы штаммов, представляющие собой близкородственные виды. Один из них, L. thermotolerans охватывает, как правило, штаммы, не усваивающие мелибиозу. Второй вид Lachancea sp. является новым для науки и включает штаммы, усваивающие мелибиозу.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS участка 8 видов Lachancea. Помимо штаммов L. thermotolerans и Lachancea sp. мы провели секвенирование 5.8S-ITS участка у штаммов: L. kluyveri (CBS 6547, CBS 6626, CBS 2861, CBS 4104, CBS 10369), L. waltii (CBS 8527, CBS 8528, CBS 7703), L. cidri (CBS 2950) и L.fermentati (CBS 6544, CBS 6711, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007). Нуклеотидные последовательности этого участка остальных штаммов Lachancea были взяты из компьютерных баз данных коллекции CBS и GenBank. На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS участка было построено филогенетическое древо (рис. 4).

100

0.02

67 98

• L thcrmottiearam NRRL 82841 L Iha-mnloUrans Val. 87-1 (1) .Lavhancea «p. UWOPS 79-139 (2) I Lachancea sp. NBRC 10066 .-

-L meverai CBS 89511 (3)

-L dasiaisii CBS I08»ST

r|~L. Wi.

L waltii CUS (4JI)1 (4)

L à,hi CBS 4575"1 (?) ШГ] tL. ferittetutiti CBS 707' (6) , fermentati CHS 4506 L Wunvn .NBRC 1892 L. Unp en CBS 10367 - L t/n)TcriCI»S3082T(7) L klun-eri CBS 582« (8) -KhuxeramvciHi marxianus CBS 7|2Г

1IH1

Рис. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5.8S-ITS участка дрожжей Lachancea. Приводятся значения бутстрепа >50%. Шкала соответствует 20 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций. Т - типовая культура. Цифрами в скобках обозначены группы штаммов, имеющие идентичные нуклеотидные последовательности: 1 — Yal. 87-2, Yal. 87-5, Yal. 87-13, DV87-18, UWOPS 83-1097, Fin. 89-2, Fin. 89-11; 2 - UWOPS 82-231, NBRC 10067; 3 - CBS 9958, CBS 9923, CBS 9924, CBS 9925; 4 - CBS 8527, CBS 8528, CBS 7703; 5 - CBS 2950, CBS 5666; 6 - CBS 797, CBS 4686, CBS 6544, CBS 6711, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007; 7 - CBS 6545; 8 - CBS 6547, CBS 6548, CBS 6626, CBS 2861, CBS 4104, CBS 10369, NBRC 1811, CBS 10368.

Штаммы одного вида имели, как правило, идентичные последовательности ITS1 и ITS2. Единичные нуклеотидные замены были обнаружены только среди штаммов L. thermotolerans, L. kluyveri и L. fermentati. На филогенетическом древе выделяются три основных кластера. Первый сформировали дрожжи L. thermotolerans, Lachancea sp„ L. waltii и L. meyersii. Различия no ITS-последовательностям у этих дрожжей составили от 2 до 33 нуклеотидов. Наиболее близкородственными являются дрожжи L. thermotolerans и Lachancea sp., а наиболее дивергировавшим — вид L. meyersii. Второй кластер ■ со 100%-ной достоверностью объединяет виды L. cidri и L. fermentati, штаммы которых отличаются 10 нуклеотдиными заменами в районе ITS1 и 5-6 нуклеотдиными заменами в районе ITS2. Различия между штаммами двух кластеров составили более 50 нуклеотидных замен. Отдельное положение на филогенетическом древе занимают штаммы L. kluyveri, которые имеют идентичные ITS-последовательности или отличающиеся 1-3 нуклеотидами. Обнаруженные у дрожжей L. kluyverii нуклеотидные замены в районе ITS1/ITS2 не связаны с географическим происхождением штаммов и источником их выделения. Это наиболее дивергентный вид рода Lachancea. Различия по последовательностям ITS1/ITS2 между L. kluyveri и другими видами этого рода составляют более 80 нуклеотидов.

Видовые особенности молекулярных кариотипов дрожжей Lachancea. Для достижения оптимального разделения хромосомных полос разного размера дрожжей Lachancea проводился индивидуальный подбор режимов кариотипирования каждого вида. Порядок и размер хромосомных полос устанавливали согласно кариотипическим стандартам штаммов S. cerevisiae YNN 295 и Pichia canadensis (syn. Hasenula wingei) YB-4662-VIA.

На рис. 5 приведена суммарная схема молекулярных кариотипов 8 видов Lachancea, составленная на основе нескольких электрофоретических гелей. В схему также включен кариотип недавно описанного вида L. dasiensis (Lee et al., 2009). Сравнительный анализ паттернов 51 штамма выявил значительный полиморфизм дрожжей Lachancea. Хромосомная ДНК различных штаммов разделилась на 7-9 электрофоретических полос размером от 400 до 2800 т.п.н. Большинство штаммов имеют паттерны с 8 хромосомными полосами. Наиболее гомогенными по молекулярным кариотипам являются дрожжи L. dasiensis, L. meyersii, L. waltii и L. kluyveri. У штаммов последних двух видов незначительный полиморфизм отмечен только для хромосомных полос размером от 1500 до 2400 т.п.н. Большинство изученных штаммов L. kluyveri не отличались по молекулярным кариотипам от типовой культуры CBS 3082. Штаммы L. meyersii имеют практически идентичные паттерны с 8 хромосомными полосами размером от 1000 до 2800 т.п.н. Большое сходство кариотипов дрожжей L. meyersii может быть связано с одинаковым источником

L. thermotoferans Lachancea sp.

? 8 В

Я I

Ш Qi

s s s

8 S

Of (A

3130

u. u. 6

% % % %

L. kluyveri

2700

2350 2200 —

Рис. 5. Суммарная схема молекулярных кариотипов дрожжей рода Lachartcea. Размеры хромосомных полос (т.п.н.) приводятся по стандартным штаммам Saccharomyces cerevisiae YNN 295 и Pichia canadensis YB-4662-VIA. Использовались различные режимы кариотипирования.

их выделения: из морской воды в мангровой бухте Багамских островов. Несмотря на различное географическое происхождение, штаммы Lachancea sp. такиСе имеют практически идентичные кариотипы с 8 хромосомными полосами размером от 900 до 2800 т.п.н.

Полиморфизм размеров хромосомных полос обнаружен среди штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri. Несмотря на одинаковый диапазон размеров хромосом от 700 до 2800 т.п.н., размеры индивидуальных хромосом отличались у каждого из 9 изученных штаммов L. thermotolerans. Типовая культура NRRL Y-8284 имеет 7 хромосом, тогда как хромосомная ДНК остальных штаммов разделилась на 8 электрофоретических полос. Различия по числу хромосомных полос были ранее отмечены у штаммов L. thermotolerans, изолированных в Испании (Beiloch, 1998). Недавно проведенное секвенирование и аннотирование полноразмерного генома дрожжей L. thermotolerans подтвердило наличие семи хромосом у штамма NRRL Y-8284 (Souciet et al., 2009). Хромосомная ДНК дрожжей L. fermentati разделилась на 8 полос. Сходные паттерны имеют только штаммы CBS 4686, CBS 7004, CBS 7005 и CBS 7007, выделенные из альпехина (отходы производства оливкового масла) в Испании и способные ферментировать мелибиозу. Эти штаммы, по-видимому, представляют собой отдельную экологическую популяцию дрожжей L. fermentati. В отличие от остальных дрожжей L. fermentati, выделенные из альпехина штаммы имеют более низкий уровень ДНК-ДНК-реассоциации с типовой культурой CBS 707: 70-77% (Kurtzman et al., 1991).

Наиболее гетерогенными оказались дрожжи L. cidri, кариотипы которых различаются по числу и размерам хромосомных полос: у типовой культуры CBS 4575 и штамма CBS 2950 выявлено 9 электрофоретических полос, а у штамма CBS 5666 — восемь. Все три штамма имели одинаковые предельные размеры хромосомных полос: от 400 до 2800 т.п.н. Однако размеры индивидуальных хромосом существенно отличались. Сходными по размерам являются только две верхние хромосомные полосы и две самые нижние размером. У штамма CBS 2950 имеется дополнительная нижняя хромосома размером около 580 т.п.н. Нельзя исключать, что штаммы CBS 4575 и CBS 2950 являются анеуплоидными и содержат экстра хромосомы.

Таким образом, помимо межвидовых различий кариотипических профилей, у ряда видов Lachancea мы обнаружили внутривидовой полиморфизм размеров хромосомных полос. Почти каждый из изученных штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri имеет уникальный паттерн. Независимо от кариотипического профиля, штаммы одного вида, как правило, имеют идентичные ITS1 и ITS2 последовательности. Гомогенные по молекулярным кариотипам дрожжи L. kluyverii оказались наиболее полиморфными по ITS-последовательностям: до 3 нуклеотидных замен.

2. а—Галактозидазные гены дрожжей Ьаскапсеа

Мы провели изучение а-галактозидазных генов у семи видов рода ЬасИапсеа. Штаммы недавно описанного вида Ь. dasiensis в опытах не участвовали.

Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК с зондами МЕЬ позволила определить локализацию а-галактозидазных генов у изученных штаммов ЬасИапсеа. На рис. 6 представлена Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК Ь. Ыиучеп с зондом МЕЬк1. У всех изученных штаммов обнаружена только одна гибридизационная полоса размером 1500-1600 т.п.н. (рис. 6, дорожки 2-14).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

хр. VII 640 ЯМК ШШк

Рис. 6. Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК дрожжей L. kluyveri'c зондом MELk. Дорожки: 1,15- Saccharomyces cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 - CBS 3082 (Т), 3 - CBS 6545, 4 - CBS 6547, 5 - CBS 6548, 6 - CBS 6626, 7 - NBRC 1811, 8 - NBRC 10955, 9 - CBS 10367, 10 - CBS 10368, 11 - CBS 10369, 12 - CBS 2861, 13 - CBS 4104, 14 - CBS 5828.

Недавно определена полная нуклеотидная последовательность генома типовой культуры L. kluyveri CBS 3082 и показано, что ген MELkl расположен в субтеломерной области правого плеча хромосомы VII (http://www.genolevures.org).

С помощью Саузерн-гибридизации с зондом МЕЬ: установлена локализация генов MEL у дрожжей L. cidri (рис. 7). У штаммов CBS 2950 и CBS 5666 обнаружено по одному гибридизационному сигналу, но различной хромосомной локализации. У первого штамма ген MEL расположен в хромосоме размером около 2300 т.п.н. (MEL:2), а у второго размером около 1900 т.п.н. (МЕЬ:2) (рис. 7, дорожки 3 и 4). У штамма CBS 4575 зонд MEL: гибридизовался с двумя хромосомами размером 1900 т.п.н. (MELzl) и наименьшей хромосомой 500 т.п.н. (MEL:3) (рис. 7, дорожка 2).

У штамма CBS 4686 L. fermentad была проведена амплификация гена MELfl. Полученный ПЦР-продукт был использован в качестве зонда при Саузерн-гибридизации хромосомных ДНК 9 штаммов L. fermentad (рис. 8, дорожки 2-10). У типовой культуры CBS 707, а также у штаммов CBS 797, CBS

12 3 4 2 i 4

Т.П.Н,

2300-*-1900—>

МК1.Л2 MKIjsI

MKLzJ

Рис. 7. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК (А) дрожжей L. cidri и Саузерн-гибридизация с зондом MELzl (В). 1 - Saccharomyces cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 - CBS 4575 (Т), 3 - CBS 2950, 4 - CBS 5666. Размеры хромосомных полос приводятся по S. cerevisiae YNN 295.

А В

4506, CBS 6544 и CBS 6711 гибридизационные сигналы отсутствовали. Указанные штаммы имеют фенотип МеГ. У штаммов CBS 4686, CBS 7004 и CBS 7005 обнаружена одна гибридизационная полоса размером около 1600 т.п.н. (рис. 8, дорожки 4-6). У штамма CBS 7007 зонд MELfl гибридизовался к двум хромосомным полосам: одной размером 1600 т.п.н. (как у других Ме1+-штаммов), а второй размером около 1250 т.п.н. (MELÍ2) (рис. 8, дорожка 7).

Рис. 8. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК (А) дрожжей L. fermentati и Саузерн-гибридизация с зондом MELfl (В). 1 -Saccharomyces cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 - CBS 707, 3 - CBS 797, 4 - CBS 4686, 5 -CBS 7004, 6 - CBS 7005, 7 - CBS 7007, 8 - CBS 4506, 9 - CBS 6711, 10 - CBS 6544. Размеры хромосомных полос приводятся по S. cerevisiae YNN 295.

t li-tíé? S9MI3 < ) t 1 I I И

А В

У всех четырех штаммов Lachancea sp было обнаружено по два гнбридизационных сигнала (рис. 9). У штаммов (NBRC 10066, NBRC 10067, UWO PS 79-139) их положение было одинаковым - в районе 900 и 1100 т.п.н. (рис. 9, дорожки 4, 6, 7), а у штамма UWO PS 82-231 зонд MELs гибридизовался к полосам размером около 1050 и 1350 т.п.н. (рис. 9, дорожка 5).

Рис. 9. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК дрожжей Lachancea (А) и Саузерн-гибридизация с зондом MELs (В). 1 - S. cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт); L. thermotholerans: 2 - NRRL Y-8284 (Т), 3 - UWO PS 83-1097; Lachancea sp.: 4 - UWO PS 79139, 5 - UWO PS 82-231, 6 -NBRC 10066, 7 - NBRC 10067. Размеры хромосомных полос приводятся по YNN 295.^

Все изученные до настоящего времени штаммы L. thermotholerans имеют фенотип МеГ. Нами был обнаружен штамм UWO PS 83-1097, изолированный из дрозофилы на Каймановых островах, который способен ферментировать мелибиозу. Согласно Саузерн-гибридизации с зондом MELs, этот штамм обладает одним геном MELhl, расположенным в хромосоме размером около 1020 т.п.н (рис. 9, дорожка 3). У остальных штаммов L. thermotholerans гибридизационные сигналы с зондом MELs не обнаружены.

Сравнительный анализ а-галактозидазных генов дрожжей рода Lachancea. Мы провели секвенирование а-галактозидазных генов MEL у штаммов L. kluyveri (CBS 10369), L cidri (CBS 2950, CBS 4575), L. fermentati (CBS 4686, CBS 7004, CBS 7005, CBS 7007). У штаммов Lachancea sp. UWO PS 79-139 и UWO PS 82-231 хромосомы, содержащие гены MEL были элюированы агарозного геля и на их основе была проведена амплификация генов MELsl, MELs2 и MELs3. У двух других штаммов Lachancea sp. (NBRC 10066, NBRC 10067) секвенирование а-галактозидазных генов было проведено Takakuwa et al. (2007), и соответствующие гены были обозначены как MELthl и MELth2. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили с соответствующими фрагментами последовательностей генов MEL дрожжей Lachancea, доступными через GenBank. У 16 изученных штаммов L. kluyveri обнаружено 9 типов а-

галактозидазных последовательностей, обозначенных как MELkl-MELk9. По уровню сходства гены MEL дрожжей Lachancea можно разделить на 4 группы. Гены MEL одного вида имеют, как правило, большое сходство (94-100%), тогда как гены MEL разных видов идентичны на 68-86%. Исключением являются гены MELsl-MELs3 дрожжей Lachancea sp. и ген MELhl штамма L. thermotolerans UWO PS 83-1097, которые сходны на 98-99%, что больше соответствует внутривидовому уровню. В то же время сходство дивергентных генов MELk2 и MELk4 больше соответствует межвидовому уровню: 79-82%.

0.02 Н

и»

ioolCBS5828(MEU6) I CBS 2861 CBS 4104 (MELk9) NBRC 10955 (MELk7) •CBS 10369 (MELkS) CBS 6546

CBS 3082 (MELkl) CBS 6626 CBS 6547

NBRC 1892 (МЕШ) ^ CBS 10368 (MELkS)

CBS 10367 (MEI.k4)

1 Oft

1«

' Tonilaspora delbnteckii (MEl.t)

NBRC 1811 (MELk2)

CBS 4575 (MELd+MEUJ) CBS 5666 (MEU1) CBS 2950 (MELi2) I CBS 70Й4 (MELtl) CBS 4686 (MELfl) CBS 7007 (MELfl+MELI2) 'CBS 7005 (MELfl)

NBRC 10066 (MELthl) NBRC 10067 (MELlh2) IAVO PS 79-139 (MELsl) IIXVO PS 79-139 (MELs2) _r mva PS 82-231 (MEI.s3) ~ UWO l'S 83-1097 (MELh)

L klmrcn

L chin

L fermmtati

Lachancea sp.

L themotokram

Рис. 10. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей а-галактозидаз дрожжей рода ЬасИапсеа. В качестве внешней группы использована а-галактозидаза дрожжей Тоги1а$рога delbrueckii. Приводятся значения бутстрепа >50%. Шкала соответствует 20 аминокислотным заменам на 1000 аминокислотных позиций.

На рис. 10 представлен филогенетический анализ аминокислотных последовательностей а-галактозидаз дрожжей рода Lachancea. В целом, изученные а-галактозидазы имеют от 68 до 99% сходства. При анализе относительно внешней группы (а-галактозидаза МЕ1Л дрожжей Тоги1а5рога delbrueckií) на древе выделяются два основных кластера. Первый включает а-галактозидазы МЕЬк1-МЕЬк9 дрожжей L. Ыиухеп, имеющие 82-99% идентичности. Во втором кластере со 100%-ной поддержкой выделяются три

подгруппы. Одна из них представлена белками MELzl-MELz3 дрожжей L. cidri, вторая - а-галактозидазами MELfl и MELÍ2 дрожжей L. fermentad. В третью подгруппу объединились белки MELsl-MELs3, MELthl и MELth2 дрожжей Lachancea sp., а также а-галактозидаза MELhl, штамма L. thermotolerans UWO PS 83-1097. Причем, последняя а-галактозидаза наиболее сходна с белком MELs3 и отличается от него тремя аминокислотными заменами. Сравнительный анализ а-галактозидаз дрожжей Lachancea показал, что уровень их сходства внутри одного вида составляет 94—100%, тогда как а-галактозидазы разных видов, как правило, идентичны на 68-86%.

3. Сравнительный анализ а-галактозидаз клады "Saccharomyces"

Помимо дрожжей рода Lachancea, сбраживающие мелибиозу штаммы обнаружены еще в трех родах клады "Saccharomyces": Saccharomyces, Zygotorulospora и Torulospora.

У дрожжей S. cerevisiae идентифицировано два семейства а-галактозидазных генов. Первое включает полимерные гены MEL1-MEL11, обнаруженные в разных комбинациях у штаммов европейского происхождения (Naumov et al., 1995d, 1996b). Ко второму семейству относятся гены MEL12-MEL15, идентифицированные у штаммов 5. cerevisiae африканского происхождения (Наумов, Наумов, 1997а,б; Наумов и др., 2002). По одному гену MEL секвенировано у S. paradoxus (MELp), S. bayanus var. bayanus (MELb), S. bayanus var. uvarum (MELu) и S. mikatae (MELj), а также у гибридного таксона S. pastorianus (MELpt) и его синонима S. carlsbergensis (MELx) (Turakainen et al., 1991; Turakainen et al., 1993; Naumova et al., 1996; Наумова и др.; 2003). Проведенный ранее в нашей лаборатории сравнительный анализ генов MEL выявил довольно низкий уровень сходства генов MEL1-MEL11 и MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae: 86-88%. В то же время идентичность последних трех генов и гена MELp дрожжей S. paradoxus составила 95-98%, что ближе к внутривидовому, чем межвидовому уровню.

С целью обнаружения новых а-галактозидазных генов мы провели скрининг сбраживающих мелибиозу штаммов Saccharomyces преимущественно не европейского происхождения. Согласно проведенному нами ПДРФ-анализу 5.88-1Т8-фрагментов 11 штаммов относятся к S. cerevisiae и по два — к S. paradoxus и S. bayanus. Для картирования генов MEL использовали пульс-электрофорез нативных хромосомных ДНК и последующую Саузерн-гибридизацию с зондом MEL1 дрожжей S. cerevisiae (рис. 11). В качестве контроля Саузерн-гибридизации был использован штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-61, обладающий пятью генами MEL, имеющими различную хромосомную локализацию: MEL3 (хромосома XVI), MEL4 (XI), MEL5 (IV), MEL6 (XIII) и MEL7 (VI) (рис. 11, дорожка 2). Следует отметить, что гены MEL3 и MEL6

расположены в дуплете, содержащем хромосомы XIII и XVI. Саузерн-анализ 11 штаммов S. cerevisiae, изолированных из сахарного тростника в Бразилии (CBS 7961, CBS 7962), виноделия в Южной Африке (YO 495, YO 504, YO 614) и Китае (NBRC 0289, NBRC 0290) и нектара пальмы в Малайзии (UWO 03-429.1, UWO 03-433.3, UWO 03-459.1, UWO 03-461.4) показал, что все они обладают только одним геном MEL (рис. 11, дорожки 3-7, 10-15).

Одна гибридизационная полоса также обнаружена у штаммов ВВ2 и Харьковская 39, изолированных соответственно с винограда в Белоруссии и из шампанского на Украине (рис. 11, дорожки 8 и 9). У 12 штаммов единственный ген MEL расположен в хромосоме II, в которой у дрожжей S. cerevisiae картирован только ген MELI. У штамма YO 495 гибридизационный сигнал обнаружен в дуплете ДНК хромосом XV и VII (дорожка 5), в которых расположены, соответственно, гены MEL2 и MEL8. Секвенирование отдельных а-галактозидазных генов и рекомбинационный тест на аллелизм подтвердили, что большинство штаммов обладает геном MELI, тогда как у штамма YO 495 идентифицирован ген MEL8.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1S 16 17 18 19 20 21 22

■К т» тш mm шт ат -ттт» wmtmœ um

MEL5

MEL8 MEL3/MEL6

ME LI

MEL4

ME 1.7 —Ш

Рис. 11. Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК штаммов МеГ рода Saccharomyces с зондом MEL1. Дорожки: S. cerevisiae: 1 - YNN 295 (хромосомный стандарт), 2 - ВКПМ Y-61 - контрольный штамм, 3 - CBS 7961-2В, 4 - CBS 7962-4В, 5 - YO 495-2А, 6 - YO 504-4D, 7 - YO 614-2С, 8 - ВВ2, 9 - Харьковская 39, 10 -NBRC 0289, 11 - NBRC 0290, 12 - UWO 03-429.1, 13 - UWO 03-433.3, 14 - UWO 03459.1, 15 - UWO 03-461.4; 5. bayamis: 16 - MCYC 623, 17 - UWO 99-807.1.1, 18 -UWO 99-808.3, 5". mikatae: 19 - NBRC 1816, S. paradoxus: 20 - UWO PS 80-13, 21 -UCD 61-359, 22 - UCD 61-248.

Саузерн-гибридизация показала, что сбраживающие мелибиозу штаммы S. paradoxus также имеют только по одному гену MEL, но разной хромосомной локализации (рис. 11, дорожки 20-22). У штаммов UWO PS 80-13 и UCD 61359 гибридизационный сигнал обнаружен в хромосомной полосе, которая по размеру соответствует хромосоме VI стандартного штамма S. cerevisiae YNN 295 (дорожки 20 и 21). Ранее секвенированный ген MELp штамма UCD 61-248 (Naumova et al., 1996) расположен в хромосоме X (рис. 11, дорожка 22). Для идентификации гена MEL штамма S. paradoxus UCD 61-359 был проведен рекомбинационный анализ с геном MELp штамма UCD 61-248. Штамм UWO PS 80-13 не спорулировал и, следовательно, был непригоден для генетического анализа. В качестве контроля использовали не сбраживающий мелибиозу штамм 95-1 также североамериканского происхождения. У штаммов UCD 61359 и 95-1 были индуцированы ауксотрофные мутации ade и lys. Полученные мутанты имели высокую жизнеспособность аскоспор - 89% и 91% соответственно. Межштаммовые гибриды имели нормальное расщепление ауксотрофных маркеров, жизнеспособность аскоспор составляла от 30 до 87% (табл. 1).

Табл. 1. Анализ гибридов дрожжей S. paradoxus

Происхождение гибридов Число изолированных тетрад Жизнеспо собность аскоспор, % Расщепление Ме1+:МеГ Мейотическое расщепление контрольных маркеров

UCD 61-359 lys х 95-1 ade 48 87 83:84 84 LYS:83 lys

81 ADE:86 ade

UCD 61-248 х 95-1 ade 93 42 77:81 80 ADE:78 ade

UCD 61-248 x 61-359 lys 92 30 80:30 54 LYS:56 lys

Моногенное расщепление по способности ферментировать мелибиозу подтвердило, что штаммы UCD 61-359 и UCD 61-248 обладают только одним геном MEL. Наличие МеГ-сегрегантов в скрещивании UCD 61-359 х UCD 61248, соответствовало дигенному расщеплению по признаку ферментации мелибиозы. Таким образом, рекомбинационный тест на аллелизм подтвердил, что штаммы UCD 61-248 и UCD 61-359 обладают разными а-галактозидазными генами, соответственно MELpl и MELp2. У штаммов UWO PS 80-13 и UCD 61359 были амплифицированы фрагменты ДНК, размером около 1300 п.н. Полученные нуклеотидные последовательности были идентичными и

отличались от соответствующего фрагмента последовательности гена MELpl штамма UCD 61-248 по 16 нуклеотидам (98.7% сходства).

Изолированные в Аргентине штаммы S. bayanus UWO 99-808.3 и UWO 99-807.1.1 обладают только одним геном MEL, расположенным в хромосомной полосе, которая по размеру соответствует хромосоме VI контрольного штамма S. cerevisiae YNN 295 (рис. 11, дорожки 17, 18 и 1). Следует отметить, что у всех ранее изученных штаммов S. bayanus гены MEL имеют такую же хромосомную локализацию (Naumov et al., 1994). Мы провели секвенирование генов MEL у штаммов S. bayanus различного происхождения. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили между собой и с имеющимися в GenBank последовательностями генов MEL других штаммов S. bayanus и S. pastorianus. Уровень сходства проанализированных а-галактозидазных последовательностей составил 98-100%. Наиболее дивергентными оказались а-галактозидазные гены дальневосточных штаммов 136.01 и 148.01.

Молекулярный анализ выявил полиморфизм дрожжей S. mikatae по молекулярным кариотипам и по последовательностям ITS1 участка. Саузерн-гибридизация с зондом MELj показала, что 13 штаммов S. mikatae обладают только одним геном MEL, расположенным в хромосоме XV. У штамма NBRC 10999 обнаружена дополнительная гибридизационная полоса, по размеру соответствующая хромосоме XVI контрольного штамма S. cerevisiae YNN 295.

Сравнительный анализ последовательностей а-галактозидаз и домена D1/D2 26S рРНК дрожжей клады "Saccharomyces". Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей а-галактозидаз дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. Для сравнения были использованы а-галактозидазы трех видов аскомицетовых дрожжей, не входящих в кладу "Saccharomyces": Debaryomyces hansenii, Pichia guilliermondii (клада Debaryomyces/ Lodderomyces) и Schtosaccharomyces pombe (клада "Archiascomycetes"). Последние дрожжи относятся к подотделу Archiascomycotina.

На филогенетическом древе выделяются две основные группы (рис. 12А). В первую группу со 100%-ной достоверностью объединились а-галактозидазы дрожжей клады "Saccharomyces". Внутри этой группы выделяются три кластера. Первый включает а-галактозидазы дрожжей рода Saccharomyces. В этом кластере выделяются три подгруппы. Одна из них представлена белками MEL дрожжей S. cerevisiae, вторая - MELpl и MELp2 дрожжей S. paradoxus, а третья - а-галактозидазами дрожжей S. bayanus и S. pastorianus. К последней подгруппе примыкает а-галактозидаза MELj дрожжей S. mikatae. Сходство а-галактозидаз дрожжей рода Saccharomyces составляет от 82 до 100%. К первому кластеру примыкают белки MELt (Torulaspora delbrueckii) и MELr

(Zygotorulaspora mrakii). а-Галактозидазы последних двух видов дрожжей значительно отличаются от белков MEL дрожжей Saccharomyces: уровень сходства составляет 74-77%.

Второй кластер объединяет а-галактозидазы дрожжей L. cidri, L. fermentati, Lachancea sp. и L. thermotholerans (значение индекса бутстрепа 91%). В этом кластере со 100%-ной достоверностью выделяется группа, включающая белки MELsl-MELs3 дрожжей Lachancea sp. и MELhl дрожжей L. thermotholerans. Указанные белки идентичны на 98-99%. В целом сходство а-галактозидаз этого кластера составляет 70-100%.

В третий кластер вошли белки MELkl-MELk9 дрожжей L. kluyveri, которые идентичны на 88-100%. Уровень сходства белков MELkl—MELk9 с белками MEL дрожжей L. cidri, L. fermentati, Lachancea sp. и L. thermotholerans составляет от 68 до 73%. Примерно такой же уровень сходства отмечен между а-галактозидазами L. kluyveri и дрожжей рода Saccharomyces: 67-70%.

Аминокислотные последовательности а-галактозидаз дрожжей Sch. pombe, D. hansenii и Р. guilliermondii сильно отличались от белков MEL дрожжей клады "Saccharomyces": уровень сходства в среднем составляет 49%. В свою очередь наиболее близкими являются а-галактозидазы дрожжей D. hansenii и Р. guilliermondii, которые идентичны на 69%. Их сходство с а-галактозидазой MELm Sch. pombe не превышает 57%.

Мы сравнили полученные результаты с данными филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рРНК дрожжей клады "Saccharomyces", а именно родов Lachancea, Saccharomyces, Torulaspora и Zygotorulaspora. В филогенетический анализ были также включены типовые культуры Sch. pombe, D. hansenii и Р. guilliermondii. На филогенетическом древе, построенном на основании нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 все исследованные дрожжи разделились на две основные подгруппы (рис. 12В). В первую со 100%-ной поддержкой вошли все представители клады "Saccharomyces". Внутри этой группы можно выделить два кластера. В первом кластере объединены виды рода Saccharomyces. Наиболее дивергентным представителем этого рода является S. bayanus, который вместе с гибридными дрожжами S. pastorianus сформировал отдельную подгруппу. Наиболее филогенетически близкими являются S. cerevisiae, S. paradoxus и S. cariocanus. К первому кластеру примыкают дрожжи Т. delbrueckii и Z. mrakii. Второй кластер включает 8 видов Lachancea. В этом кластере с 95%-ной поддержкой выделяются две подгруппы. Одна включает виды L. meyersii, L. dasiensis, L. waltii, Lachancea sp. и L. thermotolerans, а вторая L. cidri и L. fermentati. Дрожжи L. kluyveri занимают отдельное положение в этом кластере.

0.05

,_r MELul ' rf MELu2

MELb fS.bavanus

L MELu3

-MELu4

MELx 5. carisbergensis 1001 MELpt S. pastorianus * S. mikatae

MEL6 1

loo LJ- MELl > s. cerevisiae

99l~MEL2 J J

MELr Zygororulaspora mrakii " MELt Torulaspora delbrueckii MELzl L. cidri

MELfl L. fermentan

MELthl thermotholerans MELh i lachancea sp. SS-.MELs3 J

MELk8 MELk7

L. kluweri

■ MELm Scitizosaccharoinyces pombe " MF.Ld Debaryomyces hansemi -MELg Pichia guUliermondii

0.02

CBS 432 S. paradoxus UFRJ 50816 S. cariocanus CBS 1171 S. cerevisiae

- NBRC 1815 S. mikaiae

- CBS 10644 S. arboricolus

- NBRC 1802 S. kudriavzevii CBS 395 S. bayaniis var. uvarum CBS 1538 S. pastorianus

• CBS 380 S. bayamis var. bayamis j

CBS 1146 Torulaspora delbrueckii

CB S 4218 Zy%otorulaspora mrakii

CBS 3082 L. klinveri CBS 707 L. fermentan CBS 4575 L. cidri

CBS 8951L meyersii CBS 10888 L. dasiensis CBS 64301. waltii UWO PS "9-139 Lachancea sp. NRRL Y-8284 L. thermotholerans

CBS 2030 Prchia guilliermondii CBS 789 Debaryomyces hansenii

CBS 356 Schizosaccharomyces pombe

Рис. 12. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей а-галактозидаз (А) и нуклеотидных последовательностей домена 01/02 (В) дрожжей клады '^ассЬагошусез".

Вторую группу составили относящиеся к кладе Debaryomyces/ Lodderomyces дрожжи P. guilliermondii и D. hansenii (значение индекса бутстрепа - 100%). Наиболее дивергентной является последовательность домена D1/D2 дрожжей Sch. pombe.

В общем виде топологии филогенетических деревьев по аминокислотным последовательностям а-галактозидаз и нуклеотидным последовательностям домена D1/D2 26S рРНК совпадают. На обоих деревьях дрожжи клады "Saccharomyces" со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную группу. Это указывает на общее эволюционное происхождение а-галактозидазных генов дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. Биологический вид S. bayanus является самым дивергентным в роде Saccharomyces по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 и аминокислотных последовательностей а-галактозидаз (рис. 12). На обоих деревьях дрожжи Т. delbrueckii и Z. mrakii примыкают к дрожжам рода Saccharomyces. В то же время филогения а-галактозидаз не во всем совпадает с филогенией рибосомальных генов. На филогенетическом древе, построенном на основании сравнения нуклеотидных последовательностей домена D1/D2, дрожжи S. paradoxus являются наиболее близкородственным видом дрожжам S. cerevisiae. На близкое генетическое родство этих видов указывают и другие молекулярные данные (Naumova et al., 2003; Kellis et al., 2003; Kurtzman, 2003). Однако, на филогенетическом древе, построенном по результатам анализа последовательностей а-галактозидаз дрожжи S. paradoxus занимают отдельное положение (рис. 12А).

Другое несоответствие топологий двух филогенетических деревьев касается дрожжей L. cidri и L. fermentan. На филогенетическом древе, построенном по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей домена D1/D2, эти виды со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную подгруппу в кластере, образованном дрожжами Lachancea (рис. 12В). Однако, согласно сравнительному анализу аминокислотных последовательностей а-галактозидаз, дрожжи L. fermentati более родственны дрожжам Lachancea sp. и L. thermotolerans, чем L. cidri (рис. 12А). Белок MELfl дрожжей L. fermentati идентичен с белками MELsl-MELs3 и MELh на 93-94%, тогда как его сходство с белками MELzl-MELz3 дрожжей L. cidri только 76%.

Наиболее существенным отличием двух типов филогений является положение на филогенетических деревьях дрожжей L. kluyveri. В отличие от других видов Lachancea, эти дрожжи сформировали отдельный кластер на филогенетическом древе, построенном по данным сравнительного анализа аминокилотных последовательностей а-галактозидаз (рис. 12А).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный нами молекулярный анализ указывает на близкое генетическое родство изученных штаммов Lachancea. На основании сравнительного анализа рибосомальных последовательностей и молекулярного кариотипирования обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans и обладающий способностью ферментировать мелибиозу.

На материале штаммов различного экологического и географического происхождения изучены видовые особенности геномов дрожжей Lachancea. Кариотипический анализ выявил значительный полиморфизм размеров хромосом у дрожжей Lachancea. Хромосомная ДНК большинства штаммов разделилась на восемь электрофоретических полос. Таким образом, все виды рода Lachancea, по-видимому, имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8. Это указывает на эволюционное родство дрожжей L. thermotolerans, L. cidri, L.fermentati, L. kluyveri, L. meyersii, L. waltii и Lachancea sp. Кариотипы всех указанных видов содержат хромосомную полосу размером около 2800 т.п.н. Однако, в отличие от дрожжей Saccharomyces, предельные размеры хромосом у разных видов Lachancea существенно отличаются. Эго может свидетельствовать о различных размерах геномов изученных видов. Наибольший размах размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L. cidri (от 400 до 2800 т.п.н.), а наименьший - у L. waltii (от 1400 до 2800 т.п.н.). Поскольку диапазон размеров хромосомных полос практически одинаков у штаммов одного вида, этот признак является видоспецифичным.

Помимо межвидовых различий кариотипических профилей, у ряда видов Lachancea мы обнаружили внутривидовой полиморфизм размеров хромосомных полос. Почти каждый из изученных штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri имеет уникальный паттерн. В то же время, независимо от кариотипического профиля, штаммы одного вида имеют практически идентичные ITS 1 и ITS2 последовательности. Например, гомогенные по молекулярным кариотипам дрожжи L. kluyverii оказались наиболее полиморфными по ITS-последовательностям: до 3 нуклеотидных замен.

дрожжей Saccharomyces, вызывают значительное снижение фертильности межвидовых гибридов и, вероятно, являются одной из причин репродуктивной изоляции и образования новых биологических видов (Naumov et al., 2000; Delneri, 2003). Известно, что реципрокные транслокации способны индуцировать образование мультивалентов во время мейоза и приводить при расхождении хромосом к частому формированию анеуплоидных гамет, снижающих фертильность гибридов. В процессе эволюции у дрожжей Lachancea, по-видимому, сохранилось предковое количество хромосом, равное 8. Обнаруженная нами вариабельность кариотипов может быть результатом различных хромосомных перестроек (дупликаций и делеций коротких сегментов хромосом или отдельных генов, реципрокных транслокаций и др.), происходивших в процессе эволюции дрожжей Lachancea.

Известно, что субтеломерные районы хромосом представляют собой наиболее пластичную часть генома, которая обеспечивает приспособляемость дрожжей к различным условиям среды. В субтеломерных районах хромосом дрожжей локализованы различные мультигенные семейства, такие как семейства генов, контролирующих ферментацию различных Сахаров: мальтозы, сахарозы, мелибиозы и др. (Mortimer et al., 1992). Особый интерес представляют а-галактозидазные гены ферментации мелибиозы, которые широко представлены у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у аскомицетовых дрожжей. Сбраживающие мелибиозу штаммы обнаружены у четырех из 14 родов клады "Saccharomyces": Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulospora и Torulospora. Из восьми видов рода Lachancea штаммы МеГ не известны только у L. meyersii и L. waltii. Среди дрожжей L. thermotolerans и L. fermentati нами обнаружены как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы, негативные по этому признаку. Подобно дрожжам S. cerevisiae, не сбраживающие мелибиозу штаммы Lachancea не содержат даже молчащей последовательности MEL. Саузерн-гибридизация показала, что Ме1+-штаммы S. bayanus, S. mikatae, S. paradoxus и L. kluyveri имеют только по одной копии гена MEL и не накапливают их как некоторые популяции S. cerevisiae. В то же время, обнаружены полимерные гены MEL у дрожжей L. cidri, Lachancea sp. и у некоторых штаммов L. fermentati. Молекулярно-генетическое изучение дрожжей Saccharomyces не европейского происхождения позволило впервые обнаружить у S. paradoxus полимерные гены MELpI и MELp2, имеющие 98.7% сходства и расположенные, соответственно, в хромосомах X и VI. Сравнительный анализ а-галактозидаз дрожжей Lachancea показал, что уровень их сходства внутри одного вида составляет 94-100%, а у разных видов 68-86%.

Сравнительный филогенетический анализ a-галакгозидаз аскомицетовых дрожжей свидетельствует о видоспецифичности генов MEL дрожжей клады

"Saccharomyces". В общем виде топологии филогенетических деревьев, построенных на основании аминокислотных последовательностей а-галактозидаз и нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рРНК совпадают. На обоих деревьях дрожжи клады "Saccharomyces" со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную группу от дрожжей не входящих в эту кладу. Это указывает на общее эволюционное происхождение а-галактозидазных генов дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. В то же время филогения а-галактозидаз не во всем совпадает с филогенией рибосомальных генов. Наиболее существенным отличием двух типов филогений является положение дрожжей L. kluyveri, которые сформировали отдельный кластер на филогенетическом древе, построенном по данным сравнительного анализа аминокилотных последовательностей а-галактозидаз. Следует отметить, что дрожжи L. kluyveri достаточно сильно отличаются от остальных видов рода Lachancea по ряду молекулярных и физиологических признаков (Kurtzman, 2003) и могут относиться к отдельному роду, родственному дрожжам Lachancea.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведен сравнительный анализ геномов дрожжей Lachancea. Кариотипический анализ показал, что все 8 видов рода Lachancea имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8.

2. Выявлен значительный внутривидовой и межвидовой полиморфизм кариотипов дрожжей рода Lachancea. Наибольший размах размеров хромосомных ДНК отмечен у штаммов L. cidri (от 400 до 2800 т.п.н.), а наименьший - у L. waltii (от 1400 до 2800 т.п.н.).

3. С помощью молекулярного кариотипирования и анализа последовательностей генов рРНК обнаружен новый вид Lachancea sp., близкородственный дрожжам L. thermotolerans.

4. Впервые изучены а-галактозидазные гены MEL у дрожжей рода Lachancea. Обнаружены полимерные гены MEL у L. fermentati, L. cidri и Lachancea sp.

5. Молекулярно-генетическим анализом у дрожжей S. paradoxus выявлены полимерные гены MELpl и MELp2, которые картированы, соответственно, в хромосомах X и VI.

6. Сравнительный филогенетический анализ а-галактозидаз клады "Saccharomyces" свидетельствует о родовой и видовой специфичности генов MEL аскомицетовых дрожжей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Наумов Г.И. Видообразование у дрожжей Lachancea thermotolerans: молекулярно-генетические данные // ДАН. 2005. Т. 405. №5. С. 711-714.

2. Наумов Г. И., Серпова Е. В., Наумова Е. С. Генетически изолированная популяция Saccharomyces cerevisiae в Малайзии // Микробиология. 2006. Т 75. №2. С. 245-249.

3. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Коршунова И.В., Наумов Г.И. Молекулярно-генетические особенности дрожжей Lachancea kluyveri // Микробиология, 2007, Т. 76. №3. С. 361-368.

4. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Наумов Г.И. Молекулярная систематика дрожжей рода Lachancea // Биохимия, 2007. Т. 72. № 12. С. 1659— 1667.

5. Серпова Е.В., Наумова Е.С., Наумов Г.И.. Системный подход в идентификации дрожжей Saccharomyces // Материалы международной школы-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия", 28 ноября - 2 декабря 2005, Москва, Россия, С. 116.

6. Наумова Е. С., Серпова Е. В., Наумов Г. И. Молекулярный,анализ дивергентных штаммов Kl. thermotolerans // Материалы Ill-го Съезда ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития", 6-12 июня 2004, Москва, Россия, С. 399. ..

7. Ivannikova Yu.V., Serpova E.V. Comparative genomics of „species Saccharomyces // In: Systems Biology of Yeasts - from Models to Applications, 25th International Specialised Symposium on Yeasts (ISSY25), June 18-21, 2006, Hanasaari, Espoo, Finland, P. 83.

8. Serpova E.V., Naumova E.S., Naumov G.I. Evolutionary systematics of Lachancea yeasts // Book of abstracts. 12th International Congress on Yeasts (ICY2008), August 11-15,2008, Kyiv, Штате, P. 25.

9. Серпова E.B., Наумова E.C., Наумов Г.И. Эволюционная динамика хромосомных областей генома дрожжей Saccharomyces // Материалы V-ro съезда ВОГиС "200 лет со дня рождения Дарвина", 21-28 июня 2009, Москва, Россия, С. 46.

Подписано в печать: 18.11.2009

Заказ № 3094 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серпова, Елена Владимировна

Введение

Обзор литературы

ГЛАВА 1. Основные концепции вида у дрожжей

1.1. Фенотипическая концепция вида

1.2. Биологическая концепция вида 11 1.3 .Филогенетическая концепция вида

1.3.1. Молярный % гуанина и цитозина и ДНК-ДНК реассоциация

1.3.2. Филогенетический анализ различных участков рДНК

1.3.2.1. Определение нуклеотидной последовательности молекул ДНК

1.3.2.2. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ)

1.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК

1.5. ПЦР с неспецифичными праймерами

ГЛАВА 2. Современная систематика аскомицетовых дрожжей

2.1. Филогенетические схемы, построенные на основании нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 гена 26S рРНК

2.2. Клада "Saccharomyces"

2.2.1. Род Saccharomyces

2.2.2. Род Lachancea Kurtzman gen. nov.

2.3. Сравнительный анализ полноразмерных геномов аскомицетовых дрожжей

ГЛАВА 3. а-Галактозидазные гены ферментации мелибиозы

3.1. Семейства полимерных генов ферментации Сахаров

3.2. Общая характеристика а-галактозидаз

3.3. Аскомицетовые дрожжи, способные ферментировать мелибиозу

3.4. а-Галактозидазные гены дрожжей рода Saccharomyces

3.4.1. 5". cerevisiae

3.4.2. S. ba.ya.nus, S. mikatae, S. paradoxus и S. pastorianus A

3.5. а-Галактозидазные гены других родов дрожжей 48 Экспериментальная часть

ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования

4.1. Объекты исследования

4.2. Микробиологические методы

4.3. ПЦР-анализ

4.3.1. Амплификация рибосомальных последовательностей

4.3.2. Амплификация а-галактозидазных генов

4.4. Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ)

4.5. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гибридизация хромосом дрожжей

4.5.1. Выделение интактной хромосомной ДНК

4.5.2. Пульс-электрофорез нативных хромосомных ДНК 59 4.5.3 Саузерн-гибиридизация

4.6. Методы генной инженерии

4.7. Филогенетический анализ

ГЛАВА 5. Сравнительный анализ геномов дрожжей рода Lachancea 63 5.1 Определение видовой принадлежности изученных штаммов

5.1.1. Рестриктазный анализ некодирующих участков рДНК

5.1.2 Секвенирование домена D1/D

5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей

5.8 S-ITS-y частка

5.2.1. L. thermotolerans и Lachancea sp.

5.2.2. L. kluyveri

5.2.3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей

5.8S-ITS участка 8 видов Lachancea

5.3. Молекулярные кариотипы дрожжей Lachancea

5.3.1. L. thermotolerans и Lachancea sp.

5.3.2 L. kluyveri

5.3.3. L. cidri, L. fermentati и L. meyersii

5.3.4. Видовые особенности молекулярных кариотипов дрожжей Lachancea

5.4. Обсуждение

ГЛАВА 6. а-Галактозидазные гены дрожжей Lachancea 82 6.1. L. kluyveri

6.2. L. cidri

6.3. L. fermentati

6.4. Lachancea sp.

6.5. L. thermotholerans

6.6. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей а-галакгозидаз дрожжей рода Lachancea

6.7. Обсуждение

ГЛАВА 7. Сравнительный анализ а-галактозидаз клады "Saccharomyces"

7.1. Определение видовой принадлежности штаммов Ме1+

7.2. Гены MEL дрожжей S. cerevisiae, S. paradoxus. S. bayanus и S. mikatae

7.2.1. 5". cerevisiae

7.2.2. S. paradoxus

7.2.3. S. bayanus 103 1.2 A. S. mikatae

7.3. Сравнительный анализ последовательностей а-галактозидаз и домена D1/D2 26S рРНК дрожжей клады "Saccharomyces"

7.4. Обсуждение 114 Заключение 115 Выводы 118 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea"

Дрожжи широко распространены во многих экосистемах, играя важную роль в различных пищевых связях. Таксономически наиболее изучен дрожжевой род Saccharomyces (Naumov et al, 2000; Kurtzman, 2003; Wang et Bai, 2008). Семь биологических видов этого рода (S. cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. cariocanus, S. paradoxus, S. kudriavzevii, S. mikatae), являются хорошей моделью для изучения фундаментальных биологических проблем, включая генетические и молекулярные механизмы видообразования. Дрожжи S. cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, у которого была определена нуклеотидная последовательность генома (Goffeau et al., 1996). В геноме этих дрожжей обнаружено 55 дуплицированных блоков, включающих в себя несколько сотен пар гомологичных генов (Wolfe, Shields, 2007). Одинаковый порядок и ориентация паралогичных генов в дуплицированных блоках послужили доказательством того, что геном дрожжей S. cerevisiae сформировался в результате дупликации и последующих массовых хромосомных перестроек и делеционных потерь отдельных генов. За последнее десятилетие проведено секвенирование полноразмерных геномов еще более 20 видов аскомицетовых дрожжей. Сравнительный анализ геномных последовательностей ряда видов дрожжей показал, что полная дупликация восьми предковых хромосом у дрожжей S. cerevisiae произошла после их расхождения с дрожжами Kluyveromyces waltii (Kellis et al., 2004). Гаплоидное число хромосом у дрожжей S. cerevisiae равно 16, а у К. waltii - 8.

Молекулярно-генетическое изучение одного из ближайших родственников дрожжей Saccharomyces - рода Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt показало, что этот род очень гетерогенен и содержит ряд дрожжей не находящихся в близком родстве между собой и с типовым видом рода - К. polysporus (Cai et al., 1996; Kurtzman, 2003; Kurtzman, Robnett, 2003; Naumov, Naumova, 2002). В то же время обнаружена небольшая группа видов из различных родов (Zygosaccharomyces cidri, Z. fermentati, К. thermotolerans, К. waltii, S. kluyveri), имеющих в той или иной степени близкие рибосомальные последовательности. На базе пяти указанных видов был образован новый род Lachancea, а в качестве типового вида выбран L. thermotolerans (Kurtzman, 2003). Недавно описаны еще два новых вида L. meyersii (Fell et al., 2004) и L. dasiensis (Lee et al., 2009). В отличие от Saccharomyces, род Lachancea изучен очень мало.

Помимо дупликации всего генома в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, сегментов хромосом и отдельных генов. Чрезвычайно высокая концентрация повторов практически на всех уровнях молекулярно-генетической организации характерна для большинства эукариотических организмов, у которых дупликация является основным механизмом приобретения новых генов. В геноме дрожжей Saccharomyces гены, представленные большим числом копий, образуют мультигенные семейства. Гены рибосомалыюй РНК расположены на XII хромосоме по типу тандемных повторов, образуя последовательность ген-спейсер-ген-спейсер. Гаплоидный геном дрожжей S. cerevisiae содержит примерно 120-200 наборов генов рРНК (Maleszka, Clark-Walker, 1993). Упорядоченная структура рРНК и единообразие последовательностей в повторах сохраняются за счет так называемой "концертной" эволюции, при которой тандемные повторы эволюционируют как единое целое ("члены одного оркестра") (Nei, Rooney, 2005). При этом происходит гомогенизация тандемных повторов, так как возникающие мутации элиминируются или распространяются по другим повторам за счет неравного кроссинговера или генной конверсии. Изучение нуклеиновых кислот позволяет решать многие проблемы эволюции, филогении и систематики организмов (Белозерский, 1969; Антонов, 2005). С начала 90-х годов прошлого века стал широко применяться анализ последовательностей рибосомальной РНК для установления родства дрожжей, как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях. Это способствовало активному развитию филогенетической систематики дрожжей (Valente et al., 1999; Kurtzman, 2000; Suh et al., 2006). Семь биологических видов Saccharomyces практически неразличимы по последовательностям генов 18S и 26S рРНК (Naumov et al., 2000; Kurtzman, 2003; Wang, Bai, 2008), но четко дифференцируются по последовательностям некодирующих участков рДНК - внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и межгенного спейсера IGS2. ITS-район характеризуется значительной межвидовой дивергенцией и низким уровнем внутривидового полиморфизма; его длина постоянна у штаммов одного и того же вида, а последовательность может варьировать (James et al., 1998).

Другой тип организации имеют нетандемные или "диспергированные" повторы, рассеянные по геному. К числу таких мультигенных семейств относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров дрожжей S. cerevisiae. Как правило, эти гены расположены в субтеломерных районах хромосом - наиболее динамичных участках дрожжевого генома (Kellis et al., 2003). Особый интерес представляют а-галактозидазные гены ферментации мелибиозы. а-Галактозидазы [К.Ф.3.2.1.22] - широко распространенные ферменты, которые присутствуют у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у дрожжей. Среди дрожжей Saccharomyces и Lachancea известны как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы негативные по этому признаку. Известно, что не сбраживающие мелибиозу штаммы S. cerevisiae даже не содержат молчащей последовательности MEL (Naumov et al., 1991; Turakainen et al, 1993). К этим штаммам относятся генетические линии, использованные в международном проекте по секвенированию генома дрожжей S. cerevisiae (Goffeau et al., 1996). a-Галактозидазные гены дрожжей Lachancea ранее практически не изучались.

Целью настоящей работы является изучение молекулярного полиморфизма, таксономии и эволюции дрожжей рода Lachancea на материале штаммов различного экологического и географического происхождения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Серпова, Елена Владимировна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На материале штаммов различного экологического и географического происхождения изучены видовые особенности геномов дрожжей Lachancea. Кариотипический анализ выявил значительный полиморфизм размеров хромосом у дрожжей Lachancea. Хромосомная ДНК большинства штаммов разделилась на восемь электрофоретических полос. Таким образом, все виды рода Lachancea, по-видимому, имеют одинаковое гаплоидное число хромосом равное 8. Это указывает на эволюционное родство дрожжей L. thermotolerans, L. cidri, L. fermentati, L. kluyveri, L. meyersii, L. waltii и Lachancea sp. Кариотипы всех указанных видов содержат хромосомную полосу размером около 2800 т.п.н. Однако, в отличие от дрожжей Saccharomyces, предельные размеры хромосом у разных видов Lachancea существенно отличаются. Это может свидетельствовать о различных размерах геномов изученных видов. Наибольший размах размеров хромосомных полос отмечен у штаммов L. cidri (от 400 до 2800 т.п.н.), а наименьший - у L. waltii (от 1400 до 2800 т.п.н.). Поскольку диапазон размеров хромосомных полос практически одинаков у штаммов одного вида, этот признак является видоспецифичным.

Помимо межвидовых различий кариотипических профилей, у ряда видов Lachancea мы обнаружили внутривидовой полиморфизм размеров хромосомных полос. Почти каждый из изученных штаммов L. thermotolerans, L. fermentati и L. cidri имеет уникальный паттерн. В то же время, независимо от кариотипического профиля, штаммы одного вида имеют практически идентичные ITS1 и ITS2 последовательности. Например, гомогенные по молекулярным кариотипам дрожжи L. kluyverii оказались наиболее полиморфными по ITS-последовательностям: до 3 нуклеотидных замен.

Изменчивость размеров индивидуальных хромосом у дрожжей Lachancea подтверждает большую динамичность дрожжевых хромосом, обнаруженную при сравнительном анализе полных геномов S. cerevisiae и других видов. Помимо дупликации всего генома, в ходе эволюции дрожжей S. cerevisiae происходили множественные дупликации отдельных хромосом, коротких сегментов хромосом и отдельных генов, а также массовая потеря около 90% дуплицированных генов, в основном, за счет небольших делеций (Wolfe, Shields, 1997; Langkjasr et al., 2000; Piskur, Langkjser, 2004). Крупные хромосомные перестройки (реципрокные транслокации), обнаруженные у дрожжей Saccharomyces, вызывают значительное снижение фертильности межвидовых гибридов и, вероятно, являются одной из причин репродуктивной изоляции и образования новых биологических видов (Naumov et al., 2000; Delneri, 2003). Известно, что реципрокные транслокации способны индуцировать образование мультивалентов во время мейоза и приводить при расхождении хромосом к частому формированию анеуплоидных гамет, снижающих фертильность гибридов. В процессе эволюции у дрожжей Lachancea, по-видимому, сохранилось предковое количество хромосом, равное 8. Обнаруженная нами вариабельность кариотипов может быть результатом различных хромосомных перестроек (дупликаций и делеций коротких сегментов хромосом или отдельных генов, реципрокных транслокаций и др.), происходивших в процессе эволюции дрожжей Lachancea.

Известно, что субтеломерные районы хромосом представляют собой наиболее пластичную часть генома, которая обеспечивает приспособляемость дрожжам к различным условиям среды. В субтеломерных районах хромосом дрожжей локализованы различные мультигенные семейства, такие как семейства генов, контролирующих ферментацию различных Сахаров: мальтозы, сахарозы, мелибиозы и др. (Mortimer et al., 1992). Особый интерес представляют а-галактозидазные гены ферментации мелибиозы, которые широко представлены у мицелиальных грибов, растений и животных, но довольно редко встречаются у аскомицетовых дрожжей. Сбраживающие мелибиозу штаммы обнаружены у четырех из 14 родов клады "Saccharomyces": Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulospora и Torulospora. Из восьми видов рода Lachancea штаммы Ме1+ не известны только у L. meyersii и L. waltii. Среди дрожжей L. thermotolerans и L. fermentati нами обнаружены как штаммы, способные сбраживать мелибиозу, так и штаммы, негативные по этому признаку. Подобно дрожжам S. cerevisiae, не сбраживающие мелибиозу штаммы Lachancea не содержат даже молчащей последовательности MEL. Саузерн-гибридизация показала, что Ме1+штаммы S. bayanus, S. mikatae, S. paradoxus и L. kluyveri имеют только по одной копии гена MEL и не накапливают их как некоторые популяции S. cerevisiae. В то же время, обнаружены полимерные гены MEL у дрожжей L. cidri, Lachancea sp. и у некоторых штаммов L. fermentati. Молекулярно-генетическое изучение дрожжей Saccharomyces не европейского происхождения позволило впервые обнаружить у S. paradoxus полимерные гены MELpl и MELp2, имеющие 98.7% сходства и расположенные, соответственно. На хромосомах X и VI. Сравнительный анализ а-галактозидаз дрожжей Lachancea показал, что уровень их сходства внутри одного вида составляет 94-100%, а у разных видов 68-86%.

Сравнительный филогенетический анализ а-галактозидаз аскомицетовых дрожжей свидетельствует о видоспецифичности генов MEL дрожжей клады "Saccharomyces". В общем виде топологии филогенетических деревьев, построенных на основании аминокислотных последовательностей а-галактозидаз и нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рРНК совпадают. На обоих деревьях дрожжи клады "Saccharomyces" со 100%-ной достоверностью выделяются в отдельную группу от дрожжей не входящих в эту кладу. Это указывает на общее эволюционное происхождение а-галактозидазных генов дрожжей Lachancea, Saccharomyces, Zygotorulaspora и Torulaspora. В то же время филогения а-галактозидаз не во всем совпадает с филогенией рибосомальных генов. Наиболее существенным отличием двух типов филогений является положение на филогенетических деревьях дрожжей L. kluyveri, которые сформировали отдельный кластер на филогенетическом древе, построенном по данным сравнительного анализа аминокилотных последовательностей а-галактозидаз. Следует отметить, что дрожжи L. kluyveri достаточно сильно отличаются от остальных видов рода Lachancea по ряду молекулярных и физиологических признаков (Kurtzman, 2003) и могут относиться к отдельному роду, родственному дрожжам Lachancea.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серпова, Елена Владимировна, Москва

1. Антонов А.С. Геносистематика: достижения, проблемы и перспективы // Усп. совр. биол. 1974. Т. 77. №2. С. 31^17.

2. Антонов А.С. Геносистематика: от Э. Чаргаффа и А.Н. Белозерского до наших дней // Молек. биология. 2005. Т. 39. №4. С. 581-589.

3. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей / М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004. 221 с.

4. Бачинская А.А. История развития и культуры нового дрожжевого грибка -Saccharomyces paradoxus //Микробиология. 1914. Т. 1. № 3/5. С. 231-247.

5. Белозерский А.Н. Нуклеиновые кислоты и их связь с эволюцией, филогенией и систематикой организмов. Второй Всесоюзный биохимический съезд / Изд-во ФАН СССР. 1969.

6. Булат С.А., Мироненко Н.В. Идентификация микромицетов на основе видоспецифичных ПЦР паттернов // Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов. Вильнюс. 1990. С. 25-27.

7. Домарадский И.В., Градова Н.Б. / чл.-кор. РАН И.Б. Ушаков. (Ред.). Очерки микологии для экологов. М.: Истоки. 2007. С. 86.

8. Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Возникновение новых белков за счет дупликации генов что общего в эволюции зрительных цветочувствительных белков и факторов терминации трансляции // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. №5. С. 759-771.

9. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Изд-во Наука. 1984. 144с.

10. Кудрявцев В.И. / Систематика дрожжей. М.: Изд-во АН СССР. 1954. 427 с.

11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы, под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги / М.: Изд-во "Мир". 1999. 558с.

12. Наумов Г.И. К вопросу о генетической изоляции дрожжей Saccharomyces И Вестн. Моск. ун-та. Биол., почв. 1969. № 4. С. 44.

13. Наумов Г.И. Генетические основы классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение скрещиваемости // Журнал общ. биол. 1979. Т 40. № 2. С. 282-288.

14. Наумов Г.И. Генетическая дифференциация и экология дрожжей Saccharomyces paradoxus Batschinskaia // ДАН СССР. 1986. Т. 291. № 3. С. 754-757.

15. Наумов Г.И. Дивергентная популяция дрожжей Saccharomyces paradoxus на Гавайях: вид in statu nascendi // ДАН. 1999. Т. 364. № 2. С. 281-283.

16. Наумов Г.И. Генетическая концепция рода у грибов // ДАН СССР. 1978. Т. 241. №4. С. 952-954.

17. Наумов Г.И. Генетические основы классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение скрещиваемости // Журнал общ. биол. 1979. Т 40. № 2. С. 282-288.

18. Наумов Г.И. Идентификация полимерных генов ферментации мелибиозы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II ДАН. 1989. Т. 304. №6. С. 1475-1477.

19. Наумов Г.И. Новая разновидность Saccharomyces bayanus var. uvarum comb, nov., установленная генетическим анализом // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 410-414.

20. Наумов Д.Г. Филогенетический анализ а-галактозидаз семейства GH27 // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. №3. С. 463-476.

21. Наумов Г.И. Гибридологический анализ нового биологического вида Saccharomyces arboricolus Wang et Bai // ДАН. 2009. Т. 426. №3. С. 424-426.

22. Наумов Г.И., Юркевич В.В. Изменчивость биохимических признаков, используемых в таксономии дрожжей Saccharomyces II Успехи совр. биол. 1970. Т. 70. вып. 3(6). С. 315-125.

23. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Наумова Т.И., Гудкова Н.К. Генетические основы классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение выживаемости аскоспор гибридов // Журнал общ. биол. 1983. Т. 44. № 5. С. 648-660.

24. Наумов Г.И., Кондратьева В.И. Наумова Е.С. Методы гибридизации гомоталличных дрожжей диплонтов и гаплонтов // Биотехнология. 1986. № 6. С. 33-36.

25. Наумов Г.И., Никоненко Т.А. Дивергенция геномов культурных и диких дрожжей Saccharomyces sensu stricto: четыре вида-двойника // ДАН. 1987. Т. 294. №2. С. 476^79.

26. Наумов Г.И., Никоненко Т.А. Восточная Азия вероятная родина культурных дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Изв. СО АН СССР. 1988. №20. вып. З.С. 97-101.

27. Наумов Г.И., Наумова Е.С. Saccharomyces douglasii nom.nud. синоним S. paradoxus согласно гибридологическому анализу // ДАН СССР. 1990. Т. 311. № 4. С. 975-977.

28. Наумов Г.И., Наумова Е.С. Дикая популяция Saccharomyces cerevisiae обнаруженная в Сибири // Микробиология. 1991. Т. 60. С. 537-540.

29. Наумов Г.И., Наумов Д.Г., Луис Э.Д. Локализация семейства а-галактозидазных генов MEL в правых и левых теломерах дрожжей // ДАН. 1995. Т. 341. №1. С. 134-136.

30. Наумов Г.И., Наумов Д.Г. Генетическое картирование нового дивергентного семейства а-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биотехнология. 1997a. №1. С. 26-28.

31. Наумов Г.И., Наумов Д.Г. Суперсемейство а-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // ДАН. 19976. Т. 353. №3. С. 426^429.

32. Наумов Г.И., Наумова Е.С., Коршунова И.В., Якобсен М. Сравнительная генетика дрожжей: Новый альфа-галактозидазный ген MEL15 II Генетика. 2002. Т.38. №10. С.1330-1336.

33. Наумов Г.И., Газдиев Д.О., Наумова Е.С. Обнаружение биологического вида Saccharomyces bayanus в Дальневосточной Азии // Микробиология. 2003. Т. 72. № 6. С. 834-839.

34. Наумова Е.С., Наумов Г.И., Майклз К.А., Бериташвили Д.Р. Идентификация хромосомных ДНК у дрожжей Saccharomyces bayanus и S. pastorianus II ДАН СССР. 1991. Т.361. №3. С.744-746.

35. Наумова Е.С, Наумов Г.И., Корхола М. Молекулярные кариотипы различных генетических линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биотехнология. 1993. № 4. С. 2-5.

36. Наумова Е.С., Коршунова И.В., Наумов Г.И. Молекулярный анализ а-галактозидазных генов MEL дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Молекулярная биология. 2003. Т. 37. №5. С. 825-833.

37. Наумова Е.С., Серпова Е.В., Наумов Г.И. Видообразование у дрожжей Lachancea thermotolerans: молекулярно-генетичеекие данные // ДАН. 2005. Т. 405. №5. С. 711-714.

38. Ратнер В.А. Молекулярная эволюция // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 3. С. 41-48.

39. Рысков А.П., Мультилокусный ДНК фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. № 6. С. 997-1011.

40. Филиппов Г. С. Порча фруктовых консервов, вызванная дрожжевым грибком // Тр. Центр, н.-и. биохим. ин-та пищ. и вкус, пром-ти Наркомснаба. 1932. Т.П. с.26.

41. Adjiri A., Chanet R., Mezard С., Fabre F. Sequence comparison of the ARG4 chromosomal regions from the two related yeasts, Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces douglasii II Yeast. 1994. V. 10, P. 309-317.

42. Banno I. Studies on the sexuality of Rhodotorula II J. Gen. Appl. Microbiol. 1967. V. 13. P. 169-196.

43. Barnett J.A. The utilization of disaccharides and some other sugars by yeasts // Adv. Carbhydr. Chem. Biochem. 1981. V. 39, P. 347-404.

44. Barns S.M., Lane D.J., Sogin M.L., Bibeau C., Weisburg W.G. Evolutionary relationships among pathogenic Candida species and relatives // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 2250-2255.

45. Belloch C., Querol A., Garcia M.D., Barrio E. Phylogeny of the genus Kluyveromyces inferred from the mitochondrial cytochrome-c oxidase II gene // Int. J. System. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 405-416.

46. Bishop D.F., Kornreich R., Desnick R.J. Structural organization of the human a-galactosidase A gene: further evidence for the absence of 3'-untranslated region // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 3903-3907.

47. Boekhout Т., Renting M., Scheffers W.A., Bosboom R. The use of karyotyping in the systematics of yeast // Ant. van Leeuwenhoek J Microbiol. 1993. V. 63. P. 157-163.

48. Bruns T.D., White T.J., Taylor J.W. Fungal molecular systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1991. V.22. P. 525-564.

49. Carle G.F., Olson M.V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal field alternation gel electrophoresis // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. P. 5647-5664.

50. Carle G.F., Olson M.V. An electrophoretic karyotype for yeast // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. P. 3756-3760.

51. Charron M.J., Read E., Haut S.R., Michels C.A. Molecular evolution of the telomere-associated MAL loci of Saccharomyces // Genetics. 1989. V. 122. P. 307-316.

52. Chen W. Restriction fragment length polymorphisms in enzymatically amplified ribosomal DNAs of three heterothallic Pythium species // Phytopathology. 1992. V. 82. P. 1467-1472.

53. Chen W., Hoy J.W., Schneider R.W. Species-specific polymorphysms in transcribed ribosomal DNAs of Pythium species // Exptl. Mycol. 1992. V. 16. P. 22-34.

54. Chow T.H.C., Sollitti P., Marmur J. Structure of the multigene family of MAL lociin Saccharomyces II Mol. Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 60-69.

55. Daniel H.-M., Meyer W. Evaluation of ribosomal RNA and actin gene sequences for the identification of ascomycetous yeast // Int. J. Food Microbiol. 2003. V.86. P. 61-78.

56. Dey P.M., Pridham J.B. Biochemistry of a-galactosidases // In Meister A. (eds.): Advances in enzymology and related areas of molecular biology. Interscience publishers, a division of John Wiley & Sons, New York, London, Sydney, Toronto. 1972.

57. Dietrich F.S., Voegeli S., Brachat S., et al. The Ashbya gossypii genome as a tool for mapping the ancient Saccharomyces cerevisiae genome // Science. 2004. V. 304. P. 304-307.

58. Dlauchy D., Tornai-Lehoczki J., Peter G. Restriction enzyme analysis of PCR amplified rDNA as a taxonomic tool in yeast identification // Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 445 -453.

59. Dujon В., Sherman D., Fischer G., et al. Genome evolution in yeasts // Nature. 2004. V. 430. P. 35-44.

60. Esteve-Zarzoso В., Belloch C., Uruburu F., Querol A. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rDNA gene and two ribosomal internal transcribed spacers // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 329-337.

61. Ezeronye O.U., Legras J.L. Genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from palm wine in eastern Nigeria. Comparison with other African strains // J. Appl. Microbiol. 2009. V. 106. P. 1569-1678.

62. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogenetic Inference Package), version 3,5c. / Department of Genetics, University of Washington, Seattle. 1993.

63. Fell J.W., Boekhout Т., Fonseca A., Scorzetti G., Statzell-Tallman A. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1351-1371.

64. Fell J.W., Statzell-Tallman A., Kurtzman C.P. Lachancea meyersii sp. nov., an ascosporogenous yeast from mangrove region in the Bahamas Islands // Studies in Mycology. 2004. V. 50. P. 359-363.

65. Fernandez-Espinar H.T., Barrio E., Querol A. Analysis of the genetic variability in the species of the Saccharomyces sensu stricto complex // Yeasts. 2003. V. 20. P. 1213-1226.

66. Fischer G., James S.A., Roberts I.N., Oliver S.G., Louis E.S. Chromosomal evolution in Saccharomyces И Nature. 2000. V. 405. P. 451-454.

67. Fitzpatrick D.A., Logue M.E., Stajich J.E., Butler G. A fungal phytogeny based on 42complete genomes derived from supertree and combined gene analysis // BMC Evol. Biol. 2006. V. 6. P. 99.

68. Foury F., Roganti Т., Lecrenier N., Purnelle B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae II FEBS Lett. 1998. V. 440.1. P. 325-331.

69. Fujimoto Z., Kaneko S., Momma M., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of rice a-galactosidase complexed with D-galactose // J. Biol. Chem. 2003. V. 272. No. 22. P. 20313-20318.

70. Galagan J.E., Henn M.R., Ma L.J., Cuomo C.A., Birren B. Genomics of the fungal kingdom: insights into eukaryotic biology // Genome Res. 2005. 15. P. 16201631.

71. Garman S.C., Hannick L., Zhu A., Garboczi D.N. The 1.9 A structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases // Structure. 2002. V. 10. P. 425-434.

72. Garman S.C., Garboczi D.N. The molecular defect leading to Fabry disease: structure of human a-galactosidase //J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 319-335.

73. Gojkovic Z, Paracchini S, Piskur J. A new model organism for studying the catabolism of pyrimidines and purines // Purine and Pyrimidine Metabolism in Man IX, edited by Griesmacher at al. Plenum Press, New York. 1998. V. 94. P. 475-479.

74. Gouliamova D.E., Hennebert G.L. Phylogenetic relationships in the Saccharomyces cerevisiae complex of species // Mycotaxon. 1998. V. LXVI. P. 337-353.

75. Guilliermond A. Monographie des levures rapportees d'Afrique Occidentale par la mission Chevalier // Ann. Sci. Nat. 9 Ser. Bot. 1914. V. 19. P. 1-32.

76. Hansen E.C. Undersogelser over alkoholgjaersvampenes fysiologi og morfologi. II. Om askosporedannelsen hos slaegten Saccharomyces II Medd. Carlsberg Lab. 1883. V. 2. P. 29-86.

77. Hansen E.C. Recherches sur la physiologie et la morphologie des ferments alcooliques // C.R. Trav. Lab. Carlsberg. 1888. V. 2. P. 143-167.

78. Hansen E.C. Recherches sur la physiologie et la morphologie des ferments alcooliques. XIII. Nouvelles etudes sur des levures de brasserie a fermentation basse// Compte. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. 1908. 7: 179-217.

79. Heckman D.S., Geiser D.M., Eidell B.R., et al. Molecular evidence for the early colonization of land by fungi and plants // Science. 2001. V. 293. P. 1129-1133.

80. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities //Biochem. J. 1991. V. 208. P. 309-316.

81. Henrissat B, Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases //Biochem. J. 1996. V. 316. 695-696.

82. Herbert С.J., Maeadre С., Beean A-M., Lazowska J., Slonimski P.P. The MRS1 gene of S. douglasii: co-evolution of mitochondrial introns and specific splicing proteins encoded by nuclear genes // Gene Expr. 1992. V. 2. P. 203-214.

83. Hohmann S., Zimmermann F.K. Cloning and expression on a multicopy vector of five invertase genes of Saccharomyces cerevisiae И Curr. Genet. 1986. V. 11. P. 217-225.

84. Hohmann S., Gozalbo D. Comparison of the nucleotide sequences of a yeast gene family. I. Distribution and spectrum of spontaneous base substitutions // Mutation Res. 1989. V. 215. P. 79-87.

85. Huang C.H., Lee F.L., Tai C.J. The p-tubulin gene as a molecular phylogenetic marker for classification and discrimination of the Saccharomyces sensu stricto complex // Ant. Van Leeuwenhoek. 2009. V. 95. P. 135-142.

86. Huffman J.L., Molina F.I., Jong S.-C. Authentication of ATCC strains in the Saccharomyces cerevisiae complex by PCR fingerprinting // Experimental Mycology. 1992. V. 16. P. 316-319.

87. James S.A., Collins M.D., Roberts I.N. Use of an rRNA internal transcribed spacer region to distinguish phylogenetically closely related species of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora 11 Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. №1. P. 189-194.

88. James S.A., Roberts I.N., Collins M.D. Phylogenetic heterogeneity of the genus Williopsis as revealed by 18S rRNA gene sequences // Int J Syst Bacteriol. 1998. V. 48 P. 591-596.

89. James T.Y., Kauff F., Schoch C.L., et al. Reconstructing the early evolution of fungi using a six-gene phylogeny // Nature. 2006. V. 443. P. 818-822.

90. Josepa S., Guillamon J.M., Cano J. PCR differentiation of Saccharomyces cerevisiae from Saccharomyces bayanus / Saccharomyces pastorianus using specific primers // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 193. P. 255-259.

91. Kaback D.V., Davidson N. Organization of the ribosomal DNA gene cluster in the yeast Saccharomyces cerevisiae И J. Mol. Biol. 1980. V.138. P.745-754.

92. Kellis M, Patterson N, Endrizzi M, Birren B, Lander ES. Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory elements // Nature. 2003. V.15.P. 241-254.

93. Kellis M., Birren B.W., Lander E.S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Nature. 2004. V. 428. P. 617-624.

94. Kodama K. Ascosporogenous yeasts isolated from tree exudates in Japan // Ann. Microbiol, ed Enzymol. 1974. V. 24. № 2. P. 215-231.

95. Kreger-van Rij N.J.W. (eds.) The Yeasts, a Taxonomic Study / 3rd revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier. 1984. 1082 p.

96. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in bioinformatics. 2004. V. 5. N. 2. P. 150-163.

97. Kurtzman C.P. Molecular taxonomy of the fungi // In Bennett J.W. & Lasure L.L. (eds.): Gene manipulations in fungi. Academic Press. New York. 1985. P. 35-56.

98. Kurtzman C.P. Prediction of biological relatedness among yeasts from comparison of nuclear DNA complementarity. Stud Mycol. 1987. V. 30. P. 459^168.

99. Kurtzman C.P. DNA relatedness avong species of the genus Zigosaccharomyces II Yeast. 1990. V.6. P. 213-219.

100. Kurtzman C.P. DNA-DNA hybridization approaches to species identification in small genome organisms // In Zimmer E. A., White T. J., Cann R. L.,Wilson A.C. (eds.): Methods in enzymology. Academic, New York. 1993. V 224. P. 335-348.

101. Kurtzman C.P. Molecular taxonomy of yeast // Yeast. 1994. V. 10. P. 1727-1740.

102. Kurtzman C.P. Systematics and taxonomy of yeasts // In Ernst J.F., Schmidt A. (eds.): Dimorphism in human pathogenic and apathogenic yeasts. Contrib. Microbiol. Basel. Karger. 2000. V. 5. P. 1-14.

103. Kurtzman C.P. New species and a new combination in the Hyphopichia and Yarrowia yeast clades // Ant. Van Leeuwenhoek. 2005 V. 88. P. 121-130.

104. Kurtzman C.P. New species and new combinations in the yeast genera Kregervanrija gen. nov., Saturnispora and Candida //.FEMS Yeast Res. 2006. V. 6. P. 288-297.

105. Kurtzman C.P., Phaff H.J., Meyer S.A. Nucleic acid relatedness among yeasts // In Smith A.R.W., Spencer J.F.T., Spencer D.M. (eds.): Yeast genetics. Fundamental and applied aspects. Springer, Berlin Heidelberg New York. 1983. P. 139-166.

106. Kurtzman C.P., Phaff H.J. Molecular taxonomy // In Rose A.H., Harrison J.S. (eds.): The yeasts. 2nd edn. Academic, London. 1987. V 1. P 63-94.

107. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Molecular relationships among hyphal ascomycetous yeasts and yeastlike taxa// Can.J. Bot. 1995. V. 73. Suppl. 1. P. S824-S830.

108. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large subunit (26S) ribosomal DNA gene // J. Clin. Microbiol. 1997. V. 35. P. 1216-1223.

109. Kurtzman C.P., Blanz P.A. Ribosomal RNA/DNA sequence comparisons for assessing phylogenetic realtionships // In Kurtzman C.P., Fell J.W. (eds.): The Yeasts, a Taxonomic Study 4th revised and enlarged edition. Elsevier. Amsterdam 1998. P. 69-74.

110. Kurtzman C.P., Fell J.M. The Yeasts a Taxonomic Study / Amsterdam: Elsevier Science Publ. 1998. 1055p.

111. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (25S) ribosomal DNA partial sequences // Ant. van Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 331-371.

112. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Phylogenetic relationships among yeasts of the "Saccharomyces complex" determined from multigene sequence analyses // FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 417-432.

113. Kurtzman C.P., Albertyn J., Basehoar-Powers E. Multigene phylogenetic analysis of the Lipomycetaceae and the proposed transfer of Zygozyma species to Lipomyces and Babjeviaanomala to Dipodascopsis // FEMS Yeast Res. 2007a. V. 7. P. 1027-1034

114. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Multigene phylogenetic analysis of the Trichomonascus, Wickerhamiella and Zygoascus yeast clades, and the proposal of Sugiyamaella gen. no v. and 14 new species combinations // FEMS Yeast Research. 2007b. V. 7. P. 141-151.

115. Lachance M.-A. Kluyveromyces van der Walt emend, van der Walt. / In: The Yeasts, a Taxonomic Study. Eds. C. P. Kurtzman, J. W. Fell. Amsterdam: Elsevier, 1998. P. 227-247.

116. Lachance M.A., Starmer W.T., Bowles J.M., Phaff H.J., Rosa C.A. Ribosomal DNA, species structure, and biogeography of the cactophilic yeast Clavispora opuntiae II Can. J. Microbiol. 2000. V 46. P. 195-200.

117. Lee C.-F., Yao C.-H., Liu Y.-R, Hsieh C.-W., Young S.-S. Lachancea dasiensis sp. nov., and ascosporogenous yeast isolated from soil and leaves in Taiwan // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 1818-1822.

118. Legakis P.A. A contribution to the study of the yeast flora of apples and apple wine.Thesis. University of Athens, in Greek. 1961.

119. Lieckfeldt E., Meyer W., Borner T. Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting // J. Basic Microbiol. 1993. V. 33. № 6. P. 413—426.

120. Liljestr6m P.L. The nucleotide sequence of the yeast MEL1 Gene // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 7257-7268.

121. Liljestrom P.L., Liljestrom P. Nucleotide sequence of the melA gene, coding for a-galactosidase in Escherichia coli K-12 // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 22132220.

122. Liu Z., Kurtzman C.P. Phylogenetic relationships among species of Williopsis and Saturnospora gen. nov. as determined from partial rRNA sequences // Ant. van Leeuwenhoek. 1991. V.60. P. 21-30.

123. Lodder J. (ed.) The Yeasts, a Taxonomic Study / 2nd revised and enlarged edition. North-Holland Publ. Company. Delft. The Netherlands. 1970.

124. Lodder J., Kreger-van Rij N.J.W. The Yeast, a Taxonomic Study / North-Holland publishing company, Amsterdam. 1952.

125. Louis E.J., Borts R.H. A complete set of marked telomeres in Saccharomyces cerevisiae for physical mapping and cloning // Genetics. 1995. V. 139. P. 125— 136.

126. Magge B.B., D'Souza T.M., Magge P.T. Strain and species identification by restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal DNA repeat of Candida species // J. Bacteriol. 1987. V. 169. №4. P. 1639-1643.

127. Maleszka R, Clark-Walker G.D. Yeasts have four-fold variation in ribosomal DNA composition // Yeast. 1993. V.9. P.53-58.

128. Margolles-Clark E., Tenkanen M., Luonteri E., Penttila M. Three a-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast // Eur. J. Biochem. 1996. V. 240. P. 104-111.

129. Mayr E. Systematics and the origin of species / New York: Columbia University Press. 1942.

130. Meyen J., Jahresbericht iiber die Resultate der Arbeiten im Felde der physiologischen Botanik von der Jahre // Arch. Naturgesch. zweiter Band. 1838. V.4.P. 1-186.

131. Mikata K. Descriptive catalogue of IFO yeast collection IV // IFO Res. Commun. 1983. V. 11. P. 77-80.

132. Miranda I., Silva R., Santos M.A. Evolution of the genetic code in yeasts // Yeast. 2006. 23. P. 203-213.

133. Molina F.I., Jong Sh.-Ch., Huffman J.L. PCR amplification of the 3'-external transcribed and itergenic spacers of the ribosomal DNA repeat unit in three species of Saccharomyces ИFEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 108. P. 259-264.

134. Molnar O., Messner R., Prillinger H., Stahl U., Slavikova E. Genotypic identification of Saccharomyces species using random amplified polymorphic DNA analysis // System. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 136-145.

135. Montrocher R., Verner M.-C., Briolay J., Gautier C., Marmeisse R. Phylogenetic analysis of Saccharomyces cerevisiae group based on polymorphisms of rDNA spacer sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 295-303.

136. Mortimer R.K., Contopoulou C.R., King J.S. Genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae, edition 11 // Yeast. 1992. V. 8. P. 817-902.

137. Mullis K.B., Falcona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase -catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-350.

138. Musters W., Boon K., van der Sande C.A., Harm van Heerikhuizen and Planta R.J. Functional analysis of transcribed spacers of yeast ribosomal DNA // The EMBO J. 1990. V. 9. №9. P. 3989-3996.

139. Nau J J., Summers K.R., Galbraith A.M., Bullard S.A., Malone R.E. Isolation of early meiotic recombination genes analogous to S. cerevisiae REC104 from the yeasts S. paradoxus and S. pastorianus II Curr. Genet. 1997. V. 31. P. 7-14.

140. Naumoff D.G. Development of a hierarchical classification of the tim-barrel type glycoside hydrolases // Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. 2006. V. 1. 294-298.

141. Naumov G.I. Genetic basis for classification and identification of the ascomycetous yeasts // Studies in Mycology. 1987. V. 30. P. 469^4-75.

142. Naumov G.I. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex // J. Indust. Microbiol. 1996. V. 17. P. 295-302.

143. Naumov G., Turakainen H., Naumova E., Aho S., Korhola M. A new family of polymorphic genes in Saccharomyces cerevisiae: a-galactosidase genes MEL\-MEL1II Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 119-128.

144. Naumov G., Naumova E., Turakainen H., Suominen P., Korhola M. Polymeric genes MEL8, MEL9 and MEL 10 new members of a-galactosidase gene family in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1991. V. 20. P. 269-276.

145. Naumov G., Naumova E., Korhola M. Genetic identification of natural Saccharomyces sensu stricto yeasts from Finland, Holland and Slovakia // Antonie van Leeuwenhoek. 1992a. V. 61. P. 237-243.

146. Naumov G.I., Naumova E.S., Lantto R.A., Louis E.J., Korhola M. Genetic homology between Saccharomyces cerevisiae and its sibling species S. paradoxus and S. bayanus electrophoretic karyotypes // Yeast. 1992b. V. 8. P. 599-612.

147. Naumov G.I., Naumova E.S., Gaillardin C., Turakainen H., Korhola M. Identification of new chromosomes of Saccharomyces bayanus using gene probes from S. cerevisiae H Hereditas. 1994. V. 120. P. 121-126.

148. Naumov G.I., Naumova E.S., Korhola M. Karyotypic relationships among species of Saccharomyces sensu lato: S. castellii, S. dairenensis, S. unisporus and S. servazzii// Syst. Appl. Microbiol. 1995a. V. 18. P. 103-108.

149. Naumov G.I., Naumova E.S., Hagler A.N., Mendonca-Hagler L.C., Louis E.J. A new genetically isolated population of the Saccharomyces sensu stricto complex from Brazil // Antonie van Leeuwenhoek. 1995b. V. 67. P. 351-355.

150. Naumov G.I., Naumova E.S., Louis E.J. Two new genetically isolated populations of the Saccharomyces sensu stricto complex from Japan // J. Gen. Appl. Microbiol. 1995c. V. 41. P. 499-505.

151. Naumov G.I., Naumova E.S., Louis E.J. Genetic mapping of the a-galactosidase MEL gene family on right and left telomeres of Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1995d. V. 11. P. 481-483.

152. Naumov G.I., Naumova E.S., Sancho ' E.D. Genetic reidentification of Saccharomyces strains associated with black knot disease of trees in Ontario and Drosophila species in California // Can. J. Microbiol. 1996a. V. 42. P. 335-339.

153. Naumov G.I., Naumova E.S., Turakainen H., Korhola M.P. Identification of the a-galactosidase MEL genes in some populations of Saccharomyces cerevisiae: a new gene MELl 1 // Genet. Res. Camb. 1996b. V. 67. P. 101-108.

154. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Differentiation of European and Far East Asian populations of Saccharomyces paradoxus by allozyme analysis // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. № 2. P. 341-344.

155. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces cerevisiae are associated with exudates of North American oaks // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44. P. 1045-1050.

156. Naumov G.I., Masneuf I., Naumova E.S., Aigle M., Dubourdien D. Association of Saccharomyces bayanus var uvarum with some French wines: genetic analysis of yeast populations // Res. Microbiol. 2000b. V. 151. № 8. P. 683-691.

157. Naumov G.I., Nguyen H.-V., Naumova E.S:, Michel A., Aigle M., Gaillardin C. Genetic identification of Saccharomyces bayanus var. uvarum, a cider-fermenting yeast // Int. J. Food Microbiol. 2001. V. 65. P. 163-171.

158. Naumov G.I., Naumova E.S. Five new combinations in the yeast genus Zygofabospora Kudriavzev emend. G. Naumov (pro parte Kluyveromyces) based on genetic data // FEMS Yeast Research. 2002. V. 2. P. 39-46.

159. Naumova E.S., Turakainen H., Naumov G.I., Korhola M. Superfamily of a-galactosidase MEL genes of the Saccharomyces sensu stricto species complex // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 253. P. 111-117.

160. Naumova E.S., Naumov G.I., Molina F.I. Genetic variation among European strains of Saccharomyces paradoxus: results from DNA fingerprinting // Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. P. 86-92.

161. Naumova E.S., Bulat S.A., Mironenko N.V., Naumov G.I. Differentiation of six sibling species in the Saccharomyces sensu stricto complex by multilocus enzyme electrophoresis and UP-PCR analysis // Ant. van Leeuwenhoek. 2003a. V. 83. P. 155-166.

162. Naumova E.S., Korshunova I.V., Jespersen L., Naumov G.I. Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer // FEMS Yeast Research. 2003b. V.3. №2. P. 177-184.

163. Naumova E.S., Naumov G.I., Masneuf-Pomarede I., Aigle M., Dubordieu D. Molecular genetic study of introgression between Saccharomyces bayanus and S. cerevisiae II Yeast. 2005. V. 22. № 14. P. 1099-1115.

164. Nei M., Rooney A. Concerted and birth-and-death evolution of multigene families // Annu. Rev. Genet. 2005. V. 39. P. 121-152.

165. Oda Y., Tonomura K. a-Galactosidase from the yeast Torulaspora delbrueckii IFO 1255 //J. Appl. Bacteriol. 1996. V. 80. P. 203-208.

166. Oda Y., Yabuki M., Tonomura K., Fukunaga M. A phylogenetic analysis of Saccharomyces species by the sequence of 18S 28S rRNA spacer regions // Yeast. 1997. V. 13. P. 1243-1250.

167. Oda Y., Fukunaga M. Isolation and characterization of MELt gene from Torulaspora delbrueckii IFO 1255 //Yeast. 1999. V. 15. P. 1797-1801.

168. Oda Y., Yabuki M., Tonomura K., Fukunaga M. Sequence analysis of 18S 28S rRNA spacer regions from Saccharomyces kunashirensis, Saccharomycesmartiniae, Saccharomyces rosinii and Saccharomyces transvaalensis // Curr. Microbiol. 1999. V. 38. P. 61-63.

169. Oda Y., Fujisawa T. Nucleotide sequence of a-galactosidase MEL gene from Zygosaccharomyces mrakii II Curr. Microbiol. 2000. V. 41. P. 220-222.

170. Oda Y., Fujisawa T. Intraspeciflc divergence of Saccharomyces kluyveri as revealed by the nucleotide sequences of 18S-28S rRNA spacer regions and a-galactosidase MEL genes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. V. 65. P. 164166.

171. Ohno S. Evolution by gene duplication. Springer-Verlag: Heidelberg, Germany, 1970.

172. Petersen R.F., Nilsson-Tillgren Т., Piskur J. Karyotypes of Saccharomyces sensu lato species 11 Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1925-1931.

173. Peterson S.W., Kurtzman C.P. Ribosomal, RNA sequence divergence among sibling species of yeasts // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. P. 124-129.

174. Phaff H.J. The species concept in yeast: physiologic, morphologic, genetic, and ecological parameters // In Stewart G.G., Russell I. (eds) Current development in yeast research. Pergamon press, Oxford. 1981. P. 635-643.

175. Phaff H.J. Trends in yeast research // Yeast (Spec Issue) 1989. V. 5. P. 341-349.

176. Phaff H.J., Starmer W.T., Tredick-Kline J. Pichia kluyveri sensu lato a proposal for two new varieties and a new anamorph // Stud Mycol. 1987. V. 30. P. 403414.

177. Price C.W., Fuson G.B., Phaff H.J. Genome comparison in yeast systematics: delimitation of species within the genera Schwanniomyces, Saccharomyces, Debaryomyces and Pichia 11 Microbiol. Rev. 1978. V. 24. P. 161-193.

178. Ragnini A., Grisanti P., Rinaldi Т., Frontali L., Palleschi C. Mitochondrial genome of Saccharomyces douglasii: genes coding for components of the protein synthetic apparatus // Curr. Genet. 1991. V. 19. P. 169-174.

179. Reddy M.S., Kramer C.L. A taxonomic revision of the Protomycetales // Mycotaxon. 1975. V. 3. P. 1-50.

180. Reess M., Botanische Untersuchungen iiber die Alkoholgarhungspilze / 1870. Felix, Leipzig.

181. Roberts С., Ganesan A.T., Haupt W. Genetics of melibiose fermentation in Saccharomyces italicus var. melibiosi II Heredity. 1959. V. 13. P. 499-517.

182. Rokas A., Williams B.L., King N., Carroll S.B. Genome-scale approaches to resolving incongruence in molecular phylogenies // Nature. 2003. V. 425. P. 798804.

183. Sampaio J.P., Gonipalves P. Natural populations of Saccharomyces kudriavzevii in Portugal are associated with oak bark and are sympatric with S. cerevisiae and S. paradoxus // Appl Environ Microbiol. 2008. V. 74. P. 2144-2152.

184. Scannell D.R., Butler G., Wolfe K.H. Yeast genome evolution the origin of the species // Yeast. 2007. V. 24. P. 929-942.

185. Schacherer J., Shapiro J.A., Ruderfer D.M., Kruglyak L. Comprehensive polymorphism survey elucidates population structure of Saccharomyces cerevisiae II Nature. 2009. V. 458. P. 342 346.

186. Scheda R., Yarrow D. The instability of physiological properties used as criteria in the taxonomy of yeasts // Arch. Mikrobiol. 1966. V. 55. P. 209-225.

187. Scheda R., Yarrow D. Variation in the fermentation pattern of some Saccharomyces species // Arch. Mikrobiol. 1968. V. 61. P. 310-316.

188. Seehaus Т., Rodicio R., Heinisch J., Aquilera A., Schmitt H.D., Zimmermann F.K. Specific gene probes as tods in yeast taxonomy // Curr. Genet. 1985. V. 10. P. 103-110.

189. Seoighe C., Wolfe K.H. Extent of genomic rearrangement after genome duplication in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95, pp. 4447-4452.

190. Sidenberg G. S., Lachance M. A. Electrophoretic isoenzyme variation in Kluyveromyces population and revision of Kluyveromyces marxianus (Hansen) van der Walt // Intern. J. Syst. Bacteriol. 1986. V.36. №1. P. 91-102.

191. Souciet J.-L., Dujon B. Gaillardin C., Johnston M., Baret P.V., Cliften P., Sherman D.J., Weissenbach J., Westhof E., Wincker P., Jubin C., Poulain J., Barbe V., Sёgurens В., Artiguenave F., Anthouard V., Vacherie B, Val M.E.,

192. Spangenberg P., Andre C., Dion M., Rabiller C., Mattes R. Comparative study of new a-galactosidases in ransglycosylation reactions // Carbohydr. Res. 2000. T. 329. P. 65-73.

193. Spirek M., Yang J., Groth C., Petersen R.F., Langkjaer R.B., Naumova E.S., Sulo P., Naumov G.I., Piskur J. High-rate evolution of Saccharomyces sensu lato chromosomes // FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 363-373.

194. Stelling-Dekker N.M. Die Hefesammlung des "Centraalbureau voor Schimmelcultures", Beitrage zu einer Monographie der Hefearten I. Teil, die sporogenen Hefen // Verh. K. Ned. Akad. Wet. Afd. Natuurk., Sect. II. 1931. V. 28. P. 1-547.

195. Suh S.O., Blackwell M., Kurtzman C.P., Lachance M.A. Phylogenetics of Saccharomycetales, the ascomycete yeasts. Mycologia. 2006. V. 98. P. 10061017.

196. Sumner-Smith M., Rafalski J., Sugiyama Т., Stoll M., Soil D. Conservation and variability of wheat alpha/beta gliadin genes // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3905-3916.

197. Turakainen H., Korhola M., Aho S. Cloning, sequence and chromosomal location of a MEL gene from Saccharomyces carlsbergensis NCYC396 // Gene. 1991. V. 101. P. 97-104.

198. Turakainen H., Naumov G., Naumova E., Korhola M. Physical mapping of the MEL gene family in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1993a. V. 24. P. 461^464.

199. Turakainen H., Aho S., Korhola M. MEL gene polymorphism in the genus Saccharomyces 11 Appl. Environ. Microbiol. 1993b. V. 59. No. 8. P. 2622-2630.

200. Turakainen H., Kristo P., Korhola M. Consideration of the evolution of the Saccharomyces cerevisiae MEL gene family on the basis of the nucleotide sequences of the genes and their flanking regions // Yeast. 1994a V. 10. P. 15591568.

201. Turakainen H., Hankaanpaa M., Korhola M., Aho S. Characterization of MEL genes in the genus Zygosaccharomyces II Yeast. 1994b. V. 10. P. 733-745.

202. Vaughan Martini A. Saccharomyces paradoxus comb, nov., a newly separated species of the Saccharomyces sensu stricto complex based upon nDNA/nDNA homologies // System. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 179-182.

203. Vaughan-Martini A. Saccharomyces barnettii and Saccharomyces spencerorum: two new species of Saccharomyces sensu lato (van der Walt) // Antonie van Leeuvenhoek. 1995. V. 68. P. 111-118.

204. Vaughan-Martini A., Kurtzman C.P. Deoxyribonucleic acid relatedness among species of the genus Saccharomyces sensu stricto // Int J Syst Bacteriol. 1985. V. 35. P. 508-511.

205. Vaughan Martini A., Martini A. Three newly delimited species of Saccharomyces sensu stricto // Antonie van Leeuwenhoek. 1987. V. 53. P. 77-84.

206. Vaughan-Martini A., Martini A., Cardinali G. Electrophoretic karyotyping as a taxonomic tool in the genus Saccharomyces // Antonia van Leeuwenhoek. 1993. V. 62. P. 145-156.

207. Vilgalys R., Hester M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species // J. Bacteriol. 1990. V. 172. №8. P. 4238^1246.

208. Vollrath D., Davis R.W., Connelly C., Hieter P. Physical mapping of large DNA by chromosome fragmentation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6027-6031.

209. Walker W.F. 5S ribosomal RNA sequences from ascomycetes and evolutionary implications // Syst. Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 48-53.

210. Walker W.F., Doolittle W.F. Redividing the basidiomycetes on the basis of 5S rRNA sequences //Neture. 1982. V. 299. P. 723-724.

211. Wang S.-A., Bai F.-Y. Saccharomyces arboricolus sp. nov., a yeast species from tree bark // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 510-514.

212. Weising K., Nybom H., Wolff K., Meyer W. DNA fingerprinting in plants and fungi // CRC Press. USA. 1995.

213. Wickerham L.J. Taxonomy of yeasts // US Department of Agriculture Technical bulletin, Washington. 1951. V. 1069. P. 1-56.

214. Wiley E.O. Phylogenetics. The theory and practice of phylogenetics sistematics. 1981. Wiley, New York.

215. Williams J.G.K., Kubelic A.R., Livak K.J., Rafaski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acid Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

216. Williams D.W., Wilson M.J., Lewis M.A.O., Potts A.J.C. Identification of Candida species by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis of intergenic spacer regions of ribosomal DNA // J. Clin. Microbiol. 1995. V. 33. №9. P. 24762479.

217. Winge O., Laustsen O. On 14 new yeast types, produced by hybridization // Compt. Rend. Trav. Lab. Carldberg. Ser. Physiol. 1939. V. 22. P. 337.

218. Wolfe K.H., Shields D.C. Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome // Nature. 1997. V. 387. P. 708-713.

219. Wong S., Butler G., Wolfe K.H. Gene order evolution and paleopolyploidy in hemiascomycete yeasts // PNAS. 2002. V. 99. №14. P. 9272-9277.

220. Yarrow D. Four new combinations in yeast // Antonie van Leeuwenhoek. 1972. V. 38. №3. P. 357-360.

221. Yarrow D. Genus 22. Saccharomyces Meyen ex Reess // In Kreger-van Rij N.J.W. (eds.): The yeasts a taxonomic study. 3rd edn. Elsevier. Amsterdam. 1984a. P. 379-395.

222. Yarrow D. Zygosaccharomyces Barker // In Kreger-van Rij N.J.W. (eds.): The yeasts a taxonomic study. 3rd edn. Elsevier. Amsterdam. 1984b. P. 449-465.

223. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts // In Kurtzman C.P., Fell J.W. (eds.) The yeasts a taxonomic study, 4th edn. Elsevier, Amsterdam. 1998. P. 77-100

224. Zhu A., Goldstein J. Cloning and functional expression of a cDNA encoding coffee bean a-galactosidase // Gene (Amst.). 1994. V. 140. P. 227-231.

Информация о работе

Серпова, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярная филогения дрожжей рода Lachancea - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы