Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белков теплового шока в адаптации природных дрожжей к экстремальным условиям обитания

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль белков теплового шока в адаптации природных дрожжей к экстремальным условиям обитания"

рг к ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК и ° СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 581.1: 577.42

Рихванов Евгений Геннадьевич

РОЛЬ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В АДАПТАЦИИ ПРИРОДНЫХ ДРОЖЖЕЙ К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ ОБИТАНИЯ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 1996

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Б.К.Войников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

A.C. Романенко

кандидат биологических наук,

B.И. Чемерилова

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт Био логии при Иркутском государственном университете

Защита диссертации состоится "25" июнл_ 1996 г.

в Ю час. на заседании специализированного совета К. 003.25.01 по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физи ологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул Лермонтова, 132, а/я 1243

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан "20" 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета /? /I

кандидат биологических наук {¿//¿Симо^^- г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на исследования, посвященные белкам теплового шока (БТШ), и на достигнутое в последние годы некоторое понимание механизмов их функционирования, в научной литературе не прекращаются дискуссии относительно роли и места БТШ в клетке при экстремальных температурных воздействиях (Lindquist, 1986; Александров, Кислюк. 1994; Кузнецов, Рощулкин, 1994).

Если синтез БТШ является одним из факторов, определяющих способность клетки выдерживать действие неблагоприятных температур, то можно предполагать, что у организмов, существующих в экстремальных условиях обитания, синтез БТШ либо происходит конститутивно, либо отличается большей реактивностью или синтезируются специфические классы БТШ.

Одним из способов ответить на вопрос о роли БТШ в адаптации к повышенной температуре может быть сравнение механизмов функционирования БТШ у организмов, принадлежащих к одному и тому же систематическому таксону, но в природе обитающих при контрастных температурах. Перспективным объектом для такого изучения являются дрожжевые организмы.

В 1991-1993 гг. из горячих и холодных источников Байкальского региона было выделено 142 штамма дрожжей. Кроме того, как бактериальное загрязнение дрожжевого штамма ГК46-2 (род Debaryomyces), нами изолирована термофильная бактерия Bacillus sp., повышающая устойчивость штамма ГК46-2 к тепловому воздействию.

Цель и задл^ш исследования. Целью настоящей работы являлось исследование роли БТШ в обеспечении устойчивости природных дрожжей к экстремальным температурным условиям обитания. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить систематическую принадлежность выделенных дрожжей и изучить температурные параметры их роста, чтобы отобрать штаммы, относящиеся к одной систематической группе, но различающиеся по способности к росту при повышенной температуре.

2. Изучить изменение дыхательной активности исследованных штаммов дрожжей при гипо- и гипертермии.

3. Определить у отобранных для исследования штаммов устойчивость к тепловому шоку и изучить характер и спектр БТШ при раз-

личных условиях температурного воздействия.

4. Изучить возможность влияния термофильной бактерии Bacillus sp. на устойчивость дрожжей к тепловому шоку.

Научная новизна. В работе впервые проведено изучение спектров БТШ, различающихся по устойчивости к тепловому шоку психро-филыюго, мезофильного, термотолерантного штаммов дрожжей рода Debaryomyces, а также возможность влияния термофильной бактерии Bacillus sp. на устойчивость дрожжей к тепловому шоку.

Полученные результаты позволяют предполагать, что устойчивость термотолерантных дрожжей к температурному воздействию и более высокая интенсивность дыхания при гипертермии могут быть обусловлены конститутивным и индуцированным синтезом БТШ.

Обнаружено, что устойчивость дрожжей к гипертермии может обусловливаться внеклеточным белковым фактором, экскретируемым термофильной бактерией, что дает новое представление о механизмах адаптации дрожжей к температурному фактору в природных условиях.

Практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение роли и места БТШ в устойчивости клетки к повышенной температуре в природных условиях. Полученные результаты о связи устойчивости дрожжей к тепловому шоку с синтезом БТШ и о влиянии внеклеточных выделений термофильной бактерии на повышение термоустойчивости дрожжей могут быть использованы в лабораторной практике для дальнейшего изучения функциональной организации клетки в стрессовых условиях, а также в микробиологической промышленности и в биотехнологических исследованиях.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, 2 работы находятся в печати. Результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (1992, 1996 г.), на 3 съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и его обсуждения, заключения, выводов и библиографии, включающей 201 наименование, из них 28 на русском языке; работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 12 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали дрожжи рода Debaryomyces, выделенные из горячих и холодных источников Байкальского региона по методам Бабьевой и Голубева (1979): штаммы В10-1 и В10-2 изолированы из реки Выдринная при температуре 10"С; штамм ГК46-2 - изолирован из горячего источника в районе г.Горячинска при температуре 46°С. Кроме того в работе использовали термофильную бактерию Bacillus sp. (ТВ), изолированную как бактериальное загрязнение штамма ГК46-2 и термоустойчивый штамм TK46-2tr, полученный из исходного штамма ГК46-2 путем селекции на способность выдерживать температуру 46°С, а также штамм Saccharomyces cerevisiae GRF18 (his 3-11-15, leu 2).

Для культивирования дрожжей использовали среду YEPD: дрожжевый экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), глюкоза (20 г/л). Для приготовления твердых сред в среду YEPD добавляли агар (15 г/л) (Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов, 1984).

Для культивирования термофильной бактерии использовали питательную среду следующего состава (среда М): нитрилуксусная кислота (100 мкг/л), CaS04'2H20 (60 мкг/л), MgS04'7H20 (100 мкг/л), NaCl - 8 мкг/л, КНОз - 103 мкг/л, ЫаДОц - 689 мкг/л, ZnS0/[-7H;i0 -5 мкг/л, Н3ВО3 - 5 мкг/л, CuSO.i - 160 нг/л, Na^MoOv2^0 - 250 нг/л, C0CI26H2O- 460 нг/л, FeCl3 - 2800 нг/л, MnS04■НО - 22 мкг/л, НаоНР04 - 111 мкг/л, пептон - 1 г/л, дрожжевый экстракт -1 г/л, pH 8.2 (Методы общей бактериологии, 1983).

Для определения температурных параметров роста исследуемые штаммы дрожжей культивировали в колбах объемом 100 мл, содержащих 20 мл жидкой среды YEPD, на качалке (200 об/мин) при температурах 5, 17, 23, 30 и 41°С. Определение удельной скорости роста клеток определяли в соответствии с С.М.Шдан-Пушкиной (1983).

Для изучения дыхательной активности клеток при различных условиях температурного воздействия использовали культуру дрожжей, выращенную при 5, 17, 23, 30, 41°С. Так как штаммы В10-1 и В10-2 не росли при температуре 41°С, а штамм В10-1 не рос и при 30°С, то для определения дыхания при этих температурах дрожжи выращивали при максимально возможной для них температуре: В10-1 -23°С, BIO-2 - 30°С. Перед началом опыта определяли концентрацию клеток каждого штамма в среде спектрофотометрически при 600 нм.

Суспензии клеток разводили свежей средой до концентрации 10 -5'10 клеток/мл, культивировали при первоначальной температуре выращивания (для дрожжей, выращенных при 5 С, "первоначальной" температурой являлась 5МС, для дрожжей, выращенных при 17 С -17 С и т.д.) в течение 60 минут и подвергали заданному температурному воздействию: 5, 17, 23, 30 и 41°С в течение 15. 30, 60, 180 и 360 минут при каждой температуре. Затем полярографически. используя платиновый электрод закрытого типа (электрод Кларка), определяли дыхание клеток при соответствующей температуре. Для этого 1.4 мл суспензии клеток, находившихся в течение 15-360 минут при температурах 5, 17, 23, 30 и 41°С, переносили в полярографическую ячейку, которая термостатировалась при соответствующей температуре, и регистрировали поглощение кислорода. Расчет скорости дыхания проводили с учетом растворимости кислорода в воде при различных температурах (Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом, 1973). Скорости дыхания дрожжей выражали в виде поглощения кислорода в нмолях в минуту на 10 клеток в 1 мл. Для этого одновременно с измерением поглощения кислорода проводили фотометрическое определение концентрации клеток в суспензии. В определенных случаях, когда при заданной температуре наблюдали гибель клеток дрожжей, проводили определение их выживаемости.

Для определения устойчивости клеток к тепловому шоку, дрожжи выращивали при указанных температурах до концентрации 107 клеток/мл. Причем дрожжи, инкубируемые при 5°С, предварительно наращивали при комнатной температуре до концентрации 10^ клеток/мл, затем еще 24 часа инкубировали при 5°С до достижения необходимой концентрации. По 1 мл суспензии дрожжей переносили в пробирки и подвергали действию теплового шока.

При изучении действия внеклеточного белкового фактора (ВБФ) на термоустойчивость дрожжей в суспензию дрожжей добавляли внеклеточный белок термофильной бактерии в концентрации 25 мкг/мл и подвергали тепловому шоку (4б"с, 30 и 60 мин). В качестве дополнительного контроля вносили бычий сывороточный альбумин (БСА) в этой же концентрации.

После температурного воздействия суспензию дрожжей охлаждали до комнатной температуры, разводили до концентрации 10'* кл/мл и высевали на твердую среду YEPD для определения выживаемости. Вы- 6 -

живаемость клеток оценивали по количеству образовавшихся колоний спустя трое суток при 30 С.

Для определения влияния культуральной жидкости ТВ на термоустойчивость дрожжей бактерию выращивали в колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл жидкой среды YEPD, на качалке (200 об/мин) при 4GUC в течение 24 часов. Клетки осаждали центрифугированием (GOOOe, 10 мин), затем культуральную жидкость добавляли в расплавленную агаризованную среду YEPH (агар ЗХ) при температуре 50-60°С в соотношении 1:1. Для предотвращения нежелательного бактериального заражения в среду добавляли канамицин в концентрации 50 мкг/мл. На чашки Петри со средой YEPD с культуральной жидкостью ТБ или с культуральной жидкостью дрожжей (в качестве контроля) высевали 12-14 часовую культуру штамма ГК46-2, выращенную на жидкой среде YEPD. Чашки Петри инкубировали при 4б°С в течение 48 часов, затем оставляли при комнатной температуре. Образование колоний регистрировали спустя 4 суток.

Для получения ВБ4> Bacillus sp. 12-16 часовую культуру бактерии вносили в колбы объемом 250 мл, содержащие 100 мл жидкой среды Н, и инкубировали на качалке (200 об/мин) при 46 "с в течение 24 часов. После осаждения клеток центрифугированием (6000g, 10 мин) содержание белка в культуральной жидкости определяли по Ло-ури (Lowry et al., 1951). Белок из культуральной жидкости осаждали 5Z ТХУ, промывали ацетоном и ресуспендировали в 1 мл буфера (0.1 М Трис HCl, 2 мМ ЭДТА, 2мМ дитиотрейтол, pH 7.4) и хранили при температуре жидкого азота.

Инактивацию внеклеточного белка ТБ осуществляли проназой Е (130 мкг/мл) в течение 60 мин при температуре 37 "С. Активность проназы Е подавляли кипячением в течение 5 мин.

Для регистрации белков, синтезировавшихся в клетке в момент температурной обработки, в дрожжи вводили меченую аминокислоту 14С-лейцин (27 МБк/мл, Россия). Дрожжи, выращенные при 5, 30 и 41°С, отмывали от среды YEPD, осаждая центрифугированием (5000 g, 5 мин), ресуспендировали в дистиллированной воде и разделяли на две части. После одного часа инкубирования при первоначальной температуре в водную суспензию дрожжей вносили 14С-лейцин в концентрации 0.25 МБк/мл. Одну часть суспензии дрожжей подвергали действию теплового шока (46 С, 30 мин), затем еще дополнительно инкубировали 30 мин при первоначальной температуре выращивания

(клетки дрожжей, выращенные при 5 С, дополнительно инкубировали 60 мин). Другую часть суспензии использовали в качестве контроля и инкубировали такое же количество времени при первоначальной температуре. После чего дрожжи трижды отмывали дистиллированной водой от невключившейся метки, каждый раз осаждая центрифугированием (5000 g, 5 мин), и проводили выделение белка.

Для выделения дрожжевого белка клетки ресуспендировали в воде и 60 минут обрабатывали зимолигином (1мг зимолитина на 1 г биомассы) на качалке для разрушения клеточной стенки. После чего протопласты осаждали центрифугированием (5000 g, 5 мин), растворяли в буфере для выделения (0.1 М Трис-НС1, 2 мМ EDTA, 2мМ дити-отрейтол, рН 7.4) ), разрушали замораживанием-оттаиванием. Белковую фракцию отделяли от грубых клеточных компонентов центрифугированием (15000 g, 15 мин). Белок супернатанта использовали для определения концентрации белка по методу Гринберга и Крэддока (1982), после чего белок трижды переосаждали ацетоном, ресуспендировали в буфере для образца (0.5 М Трис-HCl, рН 6.8, 1 мМ EDTA, 20% глицерин, 10% ДДС-Na, 10% меркаптоэтанол, 0.0018% бромфеноло-вый синий) и нагревали до 97°С в течение 5 минут. Измерение радиоактивности образцов проводили с помощью жидкостного сцинтилляци-онного счетчика 1219 RackBeta (LKB, Швеция). При этом использовали диоксановую сцинтилляционную жидкость Брея (Вгау, 1960).

Электрофорез белков проводили по Лэмли (Laemmli, 1970) в 12% полиакриламидном геле. Каждая проба содержала выравненное по радиоактивности количество белка (20000-11000 импульсов в минуту на пробу). Выявление на электрофореграмме зон полипептидов, содержащих радиоактивную аминокислоту, проводили флюорографически (Ос-терман, 1983). Для этого гели с импрегнированным ППО высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой РМ-В при -70"с. Молекулярные массы полипептидов определяли, используя в качестве стандартов набор белков (Pharmacia, Швеция).

Эксперименты повторяли не менее трех раз. Полученные результаты обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические величины и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение параметров роста и дыхательной активности дрожжей при гипо- и гипертермии

Рис.1. Зависимость удельной скорости роста дрожжей на жидкой среде УЕРБ (р., ч-1) от температуры инкубирования В10-1 (1), В10-2 (2), ГК46-2 (3).

Твмпврлтура,*С

|_Е2]В10-1 Е7ЯВ10-2 ^ГК46-2 |

Рис.2. Зависимость скорости дыхания дрожжей от температуры.

Проведение систематического описания и определения температурных параметров роста дрожжей, выделенных из природы с контрастными температурными условиями, позволило выявить три штамма дрожжей рода ОеЬа-гуотусеэ, различающихся по способности расти при повышении температуры: психрофильный штамм В10-1, мезофильный В10-2 и термотолерантный штамм ГК46-2 (рис.1). Кроме того, в результате селекции на устойчивость к температуре 46°С из ГК46-2 был получен штамм ГК4б-21:г, отличающийся от исходного повышенной термоустойчивостью.

Измерение поглощения кислорода показало, что по мере повышения температуры инкубирования дыхание всех исследуемых штаммов возрастало, причем в низкотемпературной области дыхание психрофиль ного штамма было выше, чем дыхание двух остальных штаммов дрожжей. При высокой температуре, наоборот, по дыханию клеток термотолерантный штамм значительно превосходил психрофильный штамм (рис.2).

2. Устойчивость дрожжей к тепловому шоку и синтез БТШ

Определение выживаемости клеток после кратковременного температурного воздействия (30 мин, 46°С) показало, что три выбранных нами штамма различались не только по способности развиваться при повышеной температуре, но и характеризовались разной степенью устойчивости к тепловому шоку, причем наблюдалась прямая зависимость между температурным максимумом роста дрожжей и устойчивостью их к повреждающему действию повышенных температур (рис.3).

кД

94 _

67 _

43 -

30 -

20 -14.4

В10-1

В10-2

ГК46-2

С '«ШулП

67

сгаз-

"40

К ш I I

ВЫЖИВАЕМОСТЬ. 7. 100 0.004 I—--1

ТЕМПЕРАТУРА ИНКУБИРОВАНИЯ

23°С

К

I

100 I_

ш I

0.1

30°С

100

ш I

52

30°С

Рис. 3. Флюорограмма полипептидов, синтезированных дрожжами в присутствии 14С-лейцина при указанных ниже температурах. Внизу приведены результаты определения выживаемости клеток после теплового шока. Слева обозначены массы белков-стандартов. Стрелками показаны БТШ. (К - контроль, Ш - шок (46°С, 30 мин)).

В ответ на действие теплового шока у клеток штаммов В10-1 и BIO-2 наблюдалось значительное понижение общего синтеза белка, выражающееся в снижении включения радиоактивной метки в белок, и полное прекращение синтеза отдельных полипептидов. Такая реакция клетки на тепловой шок неоднократно описана в литературе (Nover et al., 1984; Lindquist, 1986; Vierling, 1991) и согласуется с показателями низкой выживаемости клеток психрофильного и мезо-фильного штаммов дрожжей после теплового шока (рис.3).

В то же время у термотолерантного штамма ГК46-2 тепловой шок приводил к индукции синтеза БТШ с молекулярными массами 100, 90, 82, 75, 67 и 32 кД (Рис. 3). Вероятно, незначительный уровень синтеза БТШ с массами 67 и 40 кД имел место и у мезофильного штамма В10-2, хотя, как видно из результатов электрофореза, об этом нельзя говорить с уверенностью. Вместе с тем, при данных условиях у психрофильного штамма В10-1 не зарегистрирована индукция синтеза полипептидов в ответ на тепловой шок (рис. 3).

Отсутствие синтеза БТШ у психрофильного штамма в данных условиях теплового воздействия не исключает, что БТШ у этих дрожжей могут синтезироваться при более мягких условиях теплового стресса. Тем не менее, мы считаем правомочным связывать синтез БТШ с устойчивостью штамма ГК46-2 к тепловому шоку, в противоположность термочувствительному штамму В10-1, у которого синтез БТШ отсутствовал. Существуют литературные данные о наличии синтеза БТШ при тепловом шоке у устойчивой к повышению температуры Hydra attenuate и об отсутствии синтеза у чувствительной Hydra oligactis (Bosch et al., 1988; Bosch et al., 1990).

В этой связи следует заметить, что температурные условия существования в природе психрофильного штамма В10-1 (речка Выдрин-ная, 100 метров до впадения в Байкал) не подвергаются значительным флуктуациям в сторону их повышения. Следовательно, у природных дрожжей, существующих в относительно стабильных температурных условиях, нет необходимости поддерживать систему функционирования БТШ. В то же время у термотолерантного штамма ГК46-2, выделенного из горячего источника и имеющего достаточно широкий температурный диапазон роста (от 5 до 41°С), вероятно, существует необходимость в синтезе БТШ de novo, поскольку поверхность выхода горячего источника весьма ограничена и вероятность попадания дрожжей из области более повышенной температуры в область более

пониженной и обратно весьма значительна.

3. Устойчивость дрожжей к тепловому шоку в зависимости- от температуры выращивания

Определение выживаемости клеток штамма ГК46-2, инкубируемого при различных температурах, показало, что дрожжи, выращиваемые при температуре 41°С, практически ,не чувствительны к действию теплового шока - в этом случае выживало 91% клеток. Тогда как дрожжи, инкубируемые при 5°С, характеризовались достаточно низким (21%) процентом выживаемости, а выживаемость дрожжей, инкубированных при 30°С, составляла 52.3% (рис.4).

кД

94 67

43

30 20

14.4

К

ВЫЖИВАЕМОСТЬ, ' Z 100

ГК46-2

-А-

ГК46-2Ьг _л_

¡1 fed,

8ШШэ1|

21

к I

100

52

К ш I I

100 91

К

I

100 I_

ТЕМПЕРАТУРА 5°С ИНКУБИРОВАНИЯ

30°С

41°С

30°С

ш I

95

К ш I I

100 99

I

41°С

Рис. 4. Флюорограмма полипептидов, синтезированных штаммами ГК46-2 и ГК46-21г в присутствии 14С-лейцина при указанных ниже температурах. Внизу приведены результаты определения выживаемости клеток после теплового шока. Слева обозначены массы белков-стандартов. Стрелками показаны БТШ. (К - контроль, Ш - шок (46°С, 30 мин).

Ш

ш

При всех температурах выращивания штамм ГК46-2 отвечал на действие теплового шока синтезом БТШ с молекулярными массами 100, 90, 82, 75 и 32 кД (рис.4). Однако, уровень индуцированного синтеза БТШ 100 и 90 кД у дрожжей, культивировавшихся при 5°С, был значительно ниже, чем в остальных вариантах. Кроме того, у дрожжей, выращенных при 30° и 41°С, наблюдали индукцию тепловым шоком синтеза белка с молекулярной массой 67 кД, а также некоторый конститутивный уровень синтеза белков с массой 90 и 75 кД. В то же время белки 55 и 51 кД синтезировались при действии теплового шока только в клетках, выращенных при 5°С (рис.4).

Данная закономерность подтвердилась при изучении белковых спектров более термоустойчивого штамма TK46-2tr. Выраженная индукция синтеза БТШ 100, 90, 82 и 75 кД наблюдалась только при инкубировании клеток при 30°С. Белковые спектры дрожжей, выращенных при 41°С, а затем подвергнутых или не подвергнутых тепловому шоку, не различались, что говорит о достаточном уровне конститутивного синтеза БТШ при этой температуре (рис.4).

В результате можно предположить, что более выраженная индукция и достаточный уровень конститутивного синтеза БТШ при повышении температуры инкубирования может быть одной из причин, обусловливающих существование дрожжей в условиях горячего источника. Конститутивным синтезом БТШ, вероятно, можно объяснить и более высокую дыхательную активность штамма ГК46-2 при 41°С.

Одним из вероятных "виновников" возникновения устойчивости к тепловому шоку у штаммов ГК46-2 и TK46-2tr является БТШ 100. При температуре инкубирования 5°С у штамма ГК46-2 наблюдалась самая низкая выживаемость клеток и .одновременно, самый низкий уровень индукции синтеза БТШ 100 в ответ на тепловой шок по сравнению с другими температурами инкубирования (рис.4). В то же время, у штамма TK46-2tr, который более устойчив к тепловому шоку, чем оригинальный штамм, белок с массой 100 кД синтезировался конститутивно (рис.4). БТШ 100 заслуживает особого внимания в связи с тем, что он принадлежит к группе высокомолекулярных белков БТШ, к которым относится и БТШ 104, являющийся самым большим белком, индуцируемым тепловым шоком у S.cerevisiae, для которого получено генетическое доказательство, подтверждающее его роль в устойчивости к тепловому стрессу (Sanchez, Lindquist, 1990; Sanchez et al., 1992; Parsell et al.. 1994).

4. Изменение в синтезе белков при различных температурах культивирования дрожжей

При понижении температуры культивирования штамма ГК46-2 до 5°С в спектре обнаруживались белки с массой 35 и 67 кД (рис.5), отсутствующие у дрожжей, культивируемых при более высоких температурах, хотя, как отмечалось выше, белок 67 кД в этих клетках синтезировался в ответ на тепловой шок и, как ни странно, не регистрировался при тепловом шоке у дрожжей, выращенных при 5°С. Возможно, появление белка 67 кД связано с метаболической адаптацией штамма к низкой температуре, поскольку известно, что индукция синтеза близкого по массе БТШ 70 у З.сегеу1з1ае приводила к повышению выживаемости дрожжевых клеток при замораживании и последующем оттаивании (Копили е1 а!., 1990).

кД

В10-1 В10-2 ГК46-2

5°С 23°С 5°С 30°С 5°С 30°С 41°С

Рис. 5. Флюорограмма полипептидов, синтезированных дрожжами в присутствии 14С-лейцина при различных температурах инкубирования. Слева обозначены массы белков-стандартов. Стрелками показаны белки, синтез которых изменяется в зависимости от температуры инкубирования. Внизу указана температура инкубирования.

Также, как и в случае штамма ГК46-2. белковые спектры штаммов В10-1 и В10-2 различались в зависимости от температуры культивирования. При температуре выращивания 5ЛС у штамма В10-1 синтезировались белки с молекулярными массами 90 и 37 кД, а при температуре 23°С более интенсивно синтезировались белки с массами 30 и 35 кД. У штамма В10-2 при 5°С синтезировались белки 30 и 35 кД, а при 30РС более заметным был синтез белков 55 и 48 кД (рис.5).

Обращает на себя внимание, то, что у всех исследованных штаммов в ответ на понижение температуры до 5°С происходил синтез белков с молекулярными массами 35-37 кД. Это заставляет предполагать, что эти белки играют особую роль при холодовом стрессе у дрожжей. В то же время, синтез белка с массой 90 кД только у наиболее холодолюбивого штамма В10-1 при этих же условиях дает основание связывать появление этого белка с большой удельной скоростью роста и дыхательной активностью штамма В10-1 при 5°С.

6. Влияние термофильной бактерии Bacillus sp. на устойчивость

дрожжей к тепловому шоку

Устойчивость природных дрожжей к высокой температуре в районе выхода термальных вод может, вероятно, достигаться и ассоциацией дрожжей с термофильными бактериями. В литературе до настоящего времени имеются весьма скудные данные о повышении термотолерантности одних организмов за счет взаимодействия с термофильными бактериями (Одинцова, 1947; Davis, Andrews, 1987), но ни в одной из работ не сообщалось о природе соединений, выделяемых бактериями и влияющих на устойчивость клетки к тепловому шоку.

Нами показано, что термофильная бактерия Bacillus sp. выделяла в культуральную среду соединение, которое повышало устойчивость штамма ГК46-2 к длительному воздействию повышенной температуры (рис.6). Мы предположили, что это соединение имело белковую природу, поскольку предварительная обработка дрожжей внеклеточным белковым фактором (ВБФ), полученным из культуральной жидкости термофильной бактерии, повышала выживаемость клеток после действия теплового шока, но протекторный эффект отсутствовал, если ВБФ был предварительно обработан проназой Е (табл.1). Действие фактора специфично, так как обработка суспензии дрожжей БСА в тех

Рис.6. Влияние культуральной жидкости ТБ на жизнеспособность дрожжей штамма ГК46-2 при тепловом шоке.

А - 48 часов инкубации при температуре 46°С без добавления культуральной жидкости Bacillus sp.; Б - 48 часов инкубации при температуре 46°С с добавлением культуральной жидкости Bacillus sp. Учет выживаемости клеток проводили после 4 суток инкубирования при комнатной температуре.

94 1 | же условиях не оказывала ника-

70-*- _ ; 67 | кого влияния на выживаемость

52-v. _ | ГК46-2. ВБФ повышал устойчи-

43 | вость к тепловому шоку штамма

33 | (ЖР18 З.сегеу1з1ае (данные не

| | приведены).

30 | Электрофорез в ПААГе по-

| казал, что в культуральной жид-

20 | кости ТБ содержались три мажор-

| ных белка с молекулярной массой

14.4 | 70, 51 и 38 кД (рис.7), но ос-

Рис. 7. Электрофорез в ПААГ | тается неясным, какой из этих

в присутствии ДДС-Ма ВБФ Ва- | белков и каким образом обуслов-

cillus sp. Справа указаны мо- | ливал протекторный эффект.

лекулярные массы белков-марке- | Мы предполагаем, что про-

ров. | текторное действие ВБФ может

_ 16 -

Таблица 1.

Влияние внеклеточного белкового фактора (ВВФ), экскре-тируемого Bacillus sp. (25 мкг/мл), на устойчивость клеток ГК46-2 к тепловому шоку (461 С)

1 | Время 1 1 Процент |

| теплового Варианты опыта выживших 1

| шока (мин) клеток |

| 30 контроль,(без преинкубации с ВБФ) | 55.2+3.3 |

ВБФ, преинкубация при 30МС 70.0+3.8 |

ВБФ, обработка проназой Е, 53.4+2.8 |

преинкубация при 30 С

БСА, преинкубация при ЗО'С 52.4+3.8 |

| 60 контроль,(без преинкубации с ВБФ) | 1.4+0.25 |

ВБФ, преинкубация при ЗО'С 7.4+1.4 |

ВБФ, обработка проназой Е, 1. 94). 33 |

преинкубация при 30°С |

быть аналогично явлению, известному в литературе как "приобретенная толерантность" (Александров, Кислюк, 1994; Lindquist, 1986). Известно, что предварительная обработка организма умеренными положительными температурами или солями тяжелых металлов индуцировала в клетке синтез БТШ и повышенную устойчивость к последующему более жесткому тепловому шоку (Lindquist, 1986; Vierling, 1991; Perka, 1993). Кроме того, бактериальная или вирусная инфекция клетки может приводить к индукции синтеза БТШ (Mackowiak et al.. 1992; Schwan, Goebel, 1994). Поэтому ВБФ термофильной бактерии

может являться провокационным фоном, индуцирующим защитную реакцию у дрожжевой клетки, и эта защитная реакция может выражаться в виде неспецифического синтеза БТШ.

ВЫВОДЫ

1. Из горячих и холодных источников Байкальского региона выделены 142 штамма дрожжей, из которых отобраны для дальнейшего исследования три штамма, различающиеся по чувствительности к температуре: психрофильный (В10-1), мезофильный (В10-2) и термотолерантный (ГК46-2) штаммы дрожжей рода Debaryomyces.

2. В результате селекции на способность переносить температуру 46°С из штамма ГК46-2 получен штамм TK46-2tr, отличающийся от исходного повышенной термоустойчивостью.

3. Термоустойчивость термотолерантного штамма (ГК46-2) коррелирует с индукцией тепловым шоком (30 мин. 46°С) синтеза БТШ с молекулярными массами 100, 90, 82, 75, 67 и 32 кД. В то же время у психрофильного штамма (В10-1), отличающегося высокой термочувствительностью, синтеза БТШ при тепловом шоке не происходит.

4. При повышении температуры выращивания термотолерантного штамма (с 5" до 41°С) возрастает его устойчивость к тепловому шоку (30 мин. 46'С), что сопровождается конститутивным синтезом (при 30' и 41°С) БТШ 90, 75 и 60 кД и более выраженной индукцией тепловым шоком синтеза БТШ 100 и 90 кД. У термоустойчивого штамма (rK46-2tr) синтез этих БТШ происходит конститутивно.

5. Конститутивный синтез БТШ 90, 75 и 60 кД термотолерантного штамма (ГК46-2) коррелирует с высокой интенсивностью дыхания и удельной скоростью роста этого штамма при повышении температуры выращивания (до 41°С).

6. Более высокая скорость дыхания и удельная скорость роста психрофильного штамма (В10-1) в низкотемпературной области (5'-'С) может быть обусловлена синтезом клетками этого штамма белка с массой 90 кД.

7. Как бактериальное загрязнение штамма ГК46-2 была изолирована термофильная бактерия Bacillus sp., повышающая устойчивость дрожжей к тепловому шоку.

1 ^ -IL'

8. Устойчивость дрожжей к повышенной температуре может достигаться ассоциацией их с термофильными бактериями. Фактор, который выделяет в культуральную среду термофильная бактерия и который неспецифически повышает устойчивость дрожжей к тепловому шоку, имеет белковую природу.

9. Показана приципиальная возможность участия БТШ в обеспечении устойчивости природных дрожжей к повышенной температуре в естественных условиях обитания.

Основные публикации по теме диссертации

Рихванов Е.Г. Механизмы возникновения двойного генетическог контроля биогенеза митохондрий // Сиб. ин-т $изиол. и биохими раст. СО АН СССР. Иркутск. 1989. 15 с. Деп. 18.10.89, N6339-В89.

Рихванов Е.Г., Войников В.К. Эффект внеклеточного белка продуцируемого Bacillus sp., на термотолерантность дрожже Debaryomyces vanriji // Тезисы докл. Третьего съезда ВОФР Санкт-Петербург. 1993. Т.7. С.712.

Рихванов Е.Г., Игумнова В.Е., Войников В.К. Белки тепловог шока термотолерантных дрожжей Debaryomyces vanriji // Тезис докл. Третьего съезда ВОФР. Санкт-Петербург. 1993. Т.7. С.713.

Рихванов Е.Г., Войников В.К. Эффект внеклеточного белка продуцируемого Bacillus sp., на термотолерантность дрожже Debaryomyseß vanriji // Прикл. биохимия и микробиология. 1995 Т.31. N3. С.329-333.

Рихванов Е.Г., Боровский Г.Б., Войников В.К. Синтез белко теплового шока дрожжами Debaryomyces vanriji при различны температурах инкубирования // Физиология растений. - в печати.

Рихванов Е.Г., Варакина H.H., Войников В.К. Дыхательная ак тивность психрофильных, мезофильных и термотолерантных дрожже при гипо- и гипертермии // Микробиология. - в печати.