Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Секреция белков у дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Циоменко, Арнольд Борисович, Пущино

"/ !

/ ' чу

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

На правах рукописи УДК 577.122.175

ЦИОМЕНКО АРНОЛЬД БОРИСОВИЧ СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ У ДРОЖЖЕЙ (03.00.04 - биохимия)

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Президиум ВАК России :

(.реш^зм от " А... " .. & :^^^

пр;

И-

"ПстШа^ГДШЕ

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Официальные оппоненты:

доктор* биологических наук, профессор М. Д. Тер-Аванесян

доктор химических наук, .профессор В. Н. Лузиков

доктор биологических наук, профессор Д.А. Мошков Ведущее учреждение: . Институт биохимии им.акад. Баха РАН

Защита диссертации состоится в 14 час 30 мин на заседании Специали-Д. 00.2. 69. 01 при Инс" э биохимии . микроорганизмов РАН, г -ино, Москов

49 р^с и

1998 г. ого Совета ■4И

асти.

С диссертацией можно с> биохимии и физиологии '

Диссертация разослана

змиться в [отеке Института оорг"чкзмоз РАН

3

1998 года

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

В. М. Вагабов

"гтйт.г.'

19') Я -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность секретировать

разнообразные микро- и макромолекулы - непременное свойство всех г живых клеток. Изучение этого свойства занимает одно из центральных мест в современной биологии. Впечатляющие успехи в данной области, безусловно, стали возможными лишь благодаря комплексному исследованию большинства существующих здесь проблем, что подразумевает использование наиболее прогрессивных идей и подходов из смежных областей биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии и генетики.

Секреторный процесс интегрирован многообразными связями в общий клеточный метаболизм, выделяясь при этом своей особой предназначенностью. Используя сложные регуляторные механизмы, позволяющие контролировать не только синтез, но и строго детерминированную адресованную доставку секретируемых компонентов к месту их функционирования, этот процесс обеспечивает биогенез обширной группы макромолекул и надмолекулярных структур, составляющих вместе уникальное клеточное образование, называемое секреторной системой.

Функции секреторной системы чрезвычайно разнообразны. Вместе с тем, наиболее специфические из них эволюционно консервативны и присущи как прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. В обоих случаях, экспрессия на клеточной поверхности и экспорт из клеток белков и других биополимеров является основой механизма передачи химических сигналов, определяет характер межклеточных взаимодействий и, в целом, обеспечивает возможность адаптации клеток к сложным условиям среды обитания.

Нельзя не отметить еще одну, пожалуй, наиболее очевидную и одновременно особенно важную роль секреторной системы в построении и функционировании клеточной поверхности эукариотических клеток, к каковым относятся и дрожжи. Так, дрожжевая клетка удваивает площадь своей поверхности в течение одного клеточного цикла. При этом формируется новая клеточная арэлочка и практически все её компоненты, в том числе и белки, которые синтезируются и созревают в секреторной системе, а затем -депортируются к месту конечной локализации.

. Исследования механизмов секреции белков развиваются быстро и плодотворно. Их начало было положено более двух десятилетий тому назад работами Паллада [1], определившими генеральную схему .--.--движения секретируемых полипептидов от места их синтеза к месту ""конечной локализации в клетках животных. В то время трудно было

предположить, что дрожжи, как экспериментальная модель, вскоре займут, если не лидирующую, то, по крайней мере, одну из центральных позиций в изучении механизмов секреции [2,3].

До недавнего времени устройство секреторной системы дрожжевой клетки представлялось весьма упрощенно и базировалось во многом на аналогии с секреторной системой животных и растительных клеток. Считалось , что низшие эукариоты, к каковым относят дрожжи, располагают редуцированным вариантом секреторной системы высших эукариот. Не существовало прямых доказательств, но допускалось наличие у дрожжей аппарата Гольджи (АГ), равно как и разнообразных везикул, осуществляющих межорганелльный перенос белков. Однако, по мере накопления экспериментальных данных дрожжевая секреторная система приобретала очертания близкие, если не идентичные, секреторной системе высших эукариот.

На сегодняшний день секреторная система дрожжевой клетки представляется состоящей из нескольких индивидуальных органелл (компартментов), связь между которыми осуществляется посредством мембранных везикул [4] .. Последние, в зависимости от типов связываемых ими компартментов называются либо транспортными, либо секреторными везикулами.

Все секреторные белки начинают свой путь к месту конечной локализации из цитозоля со свободных рибосом, и после непродолжительного временного интервала (инициация трансляции, синтез сигнального пептида и прикрепление рибосомы к мембране), транслоцируются уже с мембраносвязанных рибосом в люменальное пространство эндоплазматич.еского ретикулюма (ЭР), если белки растворимые, или встраиваются в мембрану ЭР, если белки имеют соответствующее предназначение. Дальнейший транспорт и все модификации секреторных белков происходят в составе мембранных органелл секреторной системы.

Принято считать, что до определенного момента транспорт всех секреторных белков дрожжей происходит совместно, по общему (конститутивному) пути секреции. На уровне АГ белки, предназначенные для попадания в вакуоль, (аналог лизосом клеток высших- эукариот), отсортировываются й транспортируются в эту органеллу с помощью специальных везикул [5]. Остальные белки продолжают свое движение на периферию клетки в клеточную оболочку в составе секреторных везикул.

Наиболее слабым звеном в представлениях о механизме секреции белков у дрожжей является терминальная стадия, в результате

которой белки попадают в клеточную оболочку, а некоторые из них пересекают её и экспортируются в окружающую среду. Последнее (экспорт) вообще долго не воспринималось как нормальная способность дрожжевой клетки, а считалось результатом нарушений проницаемости клеточной стенки, вызванных неблагоприятными внешними и внутренними факторами [6].

Сейчас понятно, что белки и другие биополимеры, составляющие клеточную оболочку, попадают в нее секреторным путем . Существует несколько экспериментально обоснованных попыток представить организацию дрожжевой оболочки (ее архитектонику) в виде мультикомпонентной поверхностной структуры , главной особенностью которой является наличие непроницаемого для макромолекул внешнего маннопротеинового слоя, центральной глюкановой сети, составляющих вместе клеточную стенку и прилегающего к плазмалемме периплазматического пространства С7).

Механизмы , с помощью которых компоненты оболочки попадают в эти субкомпартменты и образуют строго упорядоченную структуру , пока не совсем ясны. Не существует четкого представления о том, каким образом белки проходят сквозь оболочку и экспортируются из клетки. Неясно, в какой степени периплазма изолирована от внешней среды клеточной стенкой. Иными словами, имеют ли периплазматические белки возможность свободного, или опосредованного выхода во внеклеточное пространство? Существуют ли секреторные белки предназначенные исключительно (или в основном) для функционирования вне клетки? Какие типы везикул участвуют в доставке белков в клеточную оболочку и в экспорте их из клетки? Как реагирует секреторная система на внешние стрессовые факторы?

Цель и задачи исследования. Пытаясь ответить на эти и другие вопросы, мы предприняли исследование, целью которого являлось изучение механизмов секреции собственных и чужеродных белков из дрожжевых клеток . В связи с этим особое внимание было уделено таким вопросам как: способность интактных клеток дрожжей экспортировать белки в культуральную среду, механизмы межорганельного переноса (АГ-» плазмалемма) и прохождения белков через клеточную оболочку, существование секреторных белков, адресуемых преимущественно во внешнюю среду, связь между типом сигнального пептида и эффективностью экспорта белков из клеток, роль гликозилирования в секреции белков, иммуноцитохимическая локализация секреторных белков . Специальное место в исследовании

занимает вопрос об участии секреторной системы в реакции дрожжевых клеток на стрессовые факторы.

Для достижения поставленных целей мы использовали сочетание биохимических, молекулярно-биологических и цитологических подходов, полагая таким путем решить следующие основные задачи:

1. Охарактеризовать процесс секреции белков во внешнюю среду (экспорт) у интактных дрожжевых клеток.

2. Изучить взаимосвязь между проницаемостью клеточных стенок и экспортом белков из клеток.

3. Найти доказательства существования белков, относящихся к типично экспортным, основным местонахождением которых является внешняя среда.

5. Провести сравнительное изучение свойств экспортных белков у дрожжей, принадлежащих к различным видам и родам.

5. Сконструировать векторы экспрессии/секреции, позволяющие оценить роль И-концевых сигнальных пептидов в эффективности экспорта белков.

6. Определить характер реакции секреторной системы на внешние стрессовые факторы ( на примере влияния повышенной температуры).

7. Показать возможный механизм прохождения экспортируемых белков через клеточную оболочку.

Научная новизна. Результаты, приведенные в работе, получены впервые. Показано, что секреторные белки, движущиеся по общему секреторному пути, на поздней стадии секреции разделяются на два потока - периферийный и экспортный. Последний определяет способность интактной дрожжевой клетки экспортировать некоторые белки в окружающую среду . Прохождение белков сквозь клеточную оболочку осуществляется через микроучастки аномальной проницаемости. При этом экспортируемые белки не попадают в периплазму.

Обоснованно продемонстрирована зависимость эффективности экспорта белков от природы И-концевой сигнальной последовательности. Получены данные, свидетельствующие о том, что роль просегмента дрожжевого феромона - сх-фактора заключается в адресовке связанных с ним белков в экспортный поток. При этом, эффективность экспорта белков, направляемых просегментом, не зависит, в изученных пределах, от размеров этих белков.

Обнаружено, что среди секретируемых белков имеются такие, которые предназначены преимущественно для экспорта из клетки. Их

основным местом сосредоточения является окружающая клетку среда. К таким белкам относятся секреторные белки теплового шока, представляющие новое семейство стрессовых белков. В условиях теплового шока они быстро и практически полностью экспортируются из клетки. В этом состоит одна из реакций секреторной системы дрожжевой клетки на внешний стресс.

В дополнение к тому, что дрожжи располагают типичными элементами секреторной системы (ЭР, АГ), показано, что среди секреторных везикул существует популяция, отличная по свойствам от везикул конститутивного пути секреции. Эти везикулы нового типа функционируют в экспортном потоке.

Совокупность полученных результатов позволила дополнить схему дрожжевой секреторной системы элементом, позволяющим ей выполнять функции коммуникаций между внутри- и внеклеточной средой. Все это в значительной степени расширяет наши представления о секреторной системе клеток эукариотических микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интактные клетки дрожжей способны экспортировать белки, предназначенные для функционирования в окружающей клетку среде. Транслокация экспортируемых белков осуществляется через микроучастки аномальной проницаемости клеточной стенки, которые локализованы по всему периметру дрожжевой клеточной оболочки.

2. В ответ на тепловой шок дрожжи синтезируют и экспортируют в окружающую среду новый тип стрессовых белков - секреторные белки теплового шока. Последние широко распространены среди аскомицетных дрожжей. По способности реагировать на тепловой шок дрожжи делятся на три группы с различной способностью к синтезу и экспорту стрессовых белков.

3. Препросегмент дрожжевого с(-фактора адресует большую часть слитых с ним гетерологичных и гомологичных белков в специальный экспортный поток, предназначенный для транспорта секреторных белков из клеток во внешнюю среду. Эффективность экспорта не зависит, в определенных пределах от молекулярной массы белка.

Научно-практическое значение. Проведенные исследования подтвердили преимущества дрожжевой клетки в качестве модели для изучения секреции белков. В серьезной мере углубились наши представления о механизме экспорта белков из клетки в окружающую среду. Из этого логически вытекает практическая значимость представленной работы.

Известно, что множество ферментов и других физиологически активных белков и пептидов, используемых в различных сферах человеческой деятельности, вырабатываются с помощью микроорганизмов, в том числе благодаря их способности к секреции этих веществ. Важная биотехнологическая задача состоит в получении с помощью микроорганизмов целевых продуктов как для технических целей, так и совместимых с человеческим организмом. Дрожжи, как наиболее безопасные и веками используемые в практике, представляют идеальный объект для производства таких продуктов. Однако, до сих пор нет окончательной ясности в вопросах получения, например, гетерологичных белков, в интактном немодифицированном виде. Кроме того существует много проблем в плане эффективности дрожжевых клеток, как продуцентов целевых белков.

Современные генноинженерные методы позволяют создать практически любую конструкцию и использовать биосинтетическую машину дрожжевой клетки для синтеза белка, а затем вывести его из клетки в высокоочищенном и функционально активном виде. Однако, эффективность этого процесса зависит от того, насколько верно выбрана стратегия конструирования. Полученные в настоящей работе данные о существовании экспортного потока и особенностях гликозилированйя( гетерологичных белков в дрожжевой клетке, позволят усовершенствовать технологии производства физиологически активных белков и пептидов с помощью дрожжевых клеток.

Апробация работы. V-Всесоюзный биохимический съезд, Киев, 1986; III-Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмов", Пущино-Кобулети, 1986; Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1986; 7-th German-Soviet Symp. "Organization and function of the eucaryotic genome", Heidelberg, FRG, 1987; VI-Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмов, Ташкент, 1988; 4-th Int. Congr. Cell Biology, Montreal, Canada, 1988; Всесоюзная конференция "Изучение и применение лектинов", Тарту, 1989; Всесоюзная конференция "Актуальные проблемы биохимии эукариотов и прокариотов", Пущино, 1990; I - IV Рабочие совещания "Секреция белков у микроорганизмов", Пущино, 1988-1991; 15-th Int. Symp. Yeast, Riga, 1991; V Russian-Swedish symposium on ptiysi со-chemical biology, Moscow-Pushchino, 1992. Семинары в лаборатории проф. G. Waters, Принстонский университет (Princeton, USA, 1995) и в лаборатории проф. R. Füller, Мичиганский

университет (Ann-Arbor, USA, 1995).

Публикации. По теме диссертации* опубликовано 30 печатных работ.

Благодарности. Благодарю всех коллег, участвовавших в той или иной степени в исследованиях, легших в основу данной работы. Особую признательность выражаю моим ближайшим помошникам и коллегам, внесшим серьезный вклад в решение проблемы экспорта гомологичных и гетерологичных белков из дрожжевых клеток: В. В. Лупашину, М. А. Эльдарову, С. В. Кононовой, И. В. Карпычеву, Г. П. Туйметовой , Е. Н. Ратнеру и П. Г. Плеханову.

Цитированная литература

1. Palade G. 1975. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science, 189, 347-358.

2. Schekman R. 1985. Protein localization and membrane traffic in yeast. Ann.Rev.Cell Biol., 1, 115-143.

3. BotsteinD., Fink G.R. 1988. Yeast: An experimental organism for modern biology. Science, 240, 1439-1443.

4. Kaiser Ch.A., Gimeno R.E., Shaywitz D. A. 1997. Protein secretion, membrane biogenesis, and enctocytosis. In: The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Cell cycle and cell biology, 91-227. Eds. J.R.Pringle, J. R. Broach, E.W.Jones. CSHL.

5. Rothman J.E. 1994. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature, 372, 55-63.

6. Sentandreu R., Herrero E., Martinez-Garcia J.P., L r iba G. 1984. Biogenesis of the yeast cell wall. In: Subcell. Biochem. 10, 193-235. Ed. D. B. Roodyn, Plenum Press, NY, London.

7. Ballou C.E. 1982. Yeast cell wall and cell surface. In: Mol. Biol. Yeast Saccharomyces, 335-360. Eds. Strathern J. N. et al. CSHL.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Микроорганизмы и условия их выращивания. В работе использованы прототрофные и ауксотрофные штаммы дрожжей рода Saccharomyces, а также представители других родов аскомицетных и базидиомицетных дрожжей. Всего изучено более ста штаммов, характеристики которых приведены в соответствующих разделах работы. За исключением специально оговоренных случаев, �