Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гликозилирования белков в их секреции у дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туйметова, Галина Петровна

Введение Обзор литературы

Глава 1. Основные типы гликозилирования белков у дрожжей 1.1 Биосинтез дрожжевых Ы-гликозидсвязанных олигосахаридов

1.2. Биосинтез дрожжевых О- гликозидсвязанных олигосахаридов

1.3. Биосинтез дрожжевого гликозилфосфатидилинозитольного якоря

1.4. Взаимосвязь гликозилирования и секреции белков у дрожжей Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Культуры микроорганизмов и условия их выращивания

2.2. Тепловой шок

2.3. Изучение действия ингибиторов гликозилирования

2.4. Получение сферопластов из дрожжевых клеток

2.5. Лизис дрожжевых клеток

2.6. Получение субклеточных фракций

2.7. Электрофорез белков

2.8. Получение поликлональных антител

2.9. Иммуноэлектроблоттинг белков

2.10. Иммуноферментное определение гормона роста

2.11. Конструирование дрожжевых секреторных векторов

2.12. Другие методы

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Роль К-гликозилирования в секреции гетерологичного белка - гормона роста человека у дрожжей Басскаготусех сегеу1х1ае

3.1.1. Влияние ингибитора гликозилирования 2-дезокси-Д-глюкозы на секрецию гормона роста человека клетками трансформанта 20В-12/аК

3.1.2. Влияние ингибитора гликозилирования туникамицина на секрецию гормона роста человека клетками трансформанта 20В-12/аК

3.1.3. Влияние ингибитора гликозилирования туникамицина на секрецию гормона роста человека клетками трансформантов

20В-12/рОТ 14-51 и 20В-12/рОТ29

3.2. Изучение роли О-гликозшшрования белков в их секреции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гликозилирования белков в их секреции у дрожжей"

Гликозшшрование белков - один из самых распространенных в природе комплексов реакций модификации белков. Это мультистадийный процесс, происходящий поэтапно в эн-доплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, состоящий в присоединении к определенным аминокислотам полипептида разнообразных углеводных структур.

Гликопротеины обнаружены во всех живых системах: у архе- и эубактерий (Herrmann et al., 1996), у низших и высших эукариот (Lis, Sharon, 1993). Они практически вездесущи, локализованы как внутри, так и вне клетки. Сегодня известно, что гликозилируются секреторные, мембранные, растворимые, цитозольные и ядерные белки (Wyss, Wagner, 1996).

Тип гликозилирования, моносахаридный состав углеводной части гликопротеинов зависит от белковой последовательности, ее конформации, типа клеток (Varki, 1993). У цитоплазматических гликопротеинов углеводная часть проста и может состоять из одного остатка О-связанного N-ацетилглюкозамина (Haltiwanger et al., 1997). Гликопротеины дрожжей называют маннопротеинами, так как в основном их углеводная часть состоит из остатков маннозы, которые могут составлять 50 - 80 % массы гликопротеиновой молекулы и представлены протяженными, часто разветвленными олигосахаридными цепочками (Lehle, Tanner, 1995).

Исходя из природы связи углеводной части с белковой, различают три основных типа гликопротеинов: 1) N-гликозидсвязанные, 2) О-гликозидсвязанные, 3) белки, несущие GPI-якорь.

Из всех проведенных исследований сегодня ясно, что нет унифицированной функции углеводной части гликопротеинов. Углеводная часть гликопротеинов может отвечать за укладку и стабильность гликопротеина, устойчивость его к протеолишческой деградации, влияет на активности некоторых ферментов-гликопротеинов. Она участвует в механизме тканевой и клеточной специфичности, межклеточном узнавании, играет роль в адгезии и фагоцитозе, связывании гормонов с рецепторами, эмбриональном развитии и злокачественной трансформации клеток, принимает участие в иммунном ответе (Goochee, Monica, 1990; Olden et al., 1985; Sairam, 1989; Varki, 1993; Wyss, Wagner, 1996). Обсуждается ее роль в секреции белков (Fiedler, Simons, 1995; Lis, Sharon, 1993; Wang et al., 1996 ).

Секреция белков - сложный многостадийный процесс синтеза и адресованной доставки белков к местам их конечной локализации (компартменты секреторной системы, вакуоль, клеточная оболочка, внеклеточное пространство), включающий различные реакции модифи6 кадий белка - ограниченный протеолиз, образование дисульфидных связей, фосфорилиро-вание, гликозиширование и другие.

Достигнутый к настоящему моменту значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов секреции и гликозилирования во многом явился результатом использования дрожжей 5асскаготусез сеге\ш1ае в качестве модельной системы. Их изучение позволило заключить, что эти процессы у клеток дрожжей и животных во многом сходны.

Широкое использование дрожжей в качестве продуцентов различных гомо- и гетерологичных белков диктует необходимоть получения последних в легкодоступной форме. Оптимальным решением этой проблемы было бы придание белкам способности секретироваться в среду роста, то есть, экспортироваться из клетки. Успехи в этом направлении позволят углубить наши представления о функционировании секреторной системы и механизмах экспорта белков, а также позволят выбрать более совершенную стратегию разработки биохимических и генно - инженерных подходов, необходимых для производства физиологически активных белков и пептидов с помощью дрожжевых клеток.

Целью данной работы явилось изучение роли гликозилирования в секреции белков у дрожжей. В связи с этим были поставлены следующие задачи: исследовать роль Ы-гликозилирования в секреции белков у дрожжей, используя в качестве модельной системы экспорт гетерологичного белка гормона роста человека, к № концевой части которого присоединен И-гликозилируемый препросегмент дрожжевого а-фактора. исследовать роль О-гликозилирования в секреции белков у дрожжей, используя в качестве модели секреторные белки теплового шока.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Туйметова, Галина Петровна

Заключение

Открытие и дальнейшее изучение сложных белков, в частности, гликопротеинов, имеет богатую историю, изобилующую яркими эпизодами.

В силу масштабности и чрезвычайной сложности проблемы основное внимание в этой области до сих пор сосредоточено на вопросах биосинтеза гликопротеинов, их структуры, роли в межклеточном взаимодействии, определении свойств клеточной поверхности и др.

Долгое время исследователи не проявляли должного внимания тому факту, что биогенез подавляющей части гликопротеинов эукариотической клетки непосредственно связан с секреторной системой, где они окончательно формируются и в конечном счете транспортируются к месту конечной локализации и функционирования. Сам процесс транспорта, например, гликопротеинов дрожжевой клеточной оболочки к месту их локализации, представлялся весьма упрощенно, по единому конститутивному секреторному пути, без учета индивидуальных особенностей отдельных представителей этой группы макромолекул, определяющих наиболее специфические свойства клеточной поверхности. Возможность экспорта гликопротеинов из клеток и молекулярный механизм этого процесса до самого последнего времени всерьез не обсуждался.

С развитием теории топогенеза (Blobel, 1980), успешно подтверждаемой открытием разнообразных топогенных сигналов, таких как N-концевые СП, сигналы заякоривания в мембране, сигналы удержания (или возврата) белков в том или ином мембранном компартменте и др., неизбежно возник вопрос, насколько универсальна природа этих сигналов и должны ли они формироваться исключительно из аминокислот.

В этой связи естественно было обратиться к возможной роли углеводной части гликопротеинов в определении их топологии в клетках, в частности у дрожжей. Особенно важно и интересно было понять, может ли углеводная часть экспортных белков определять адресный характер их внутриклеточного транспорта, заканчивающегося выходом в окружающую среду. Мы полагаем, что в представленной работе некоторые существующие вопросы нашли обоснованное разрешение.

Так, применив для изучения роли N-гликозилирования в характере внутриклеточного распределения и экспорте из клеток гетерологичного белка - гормона роста, генноинженерную конструкцию, основанную на препросегменте дрожжевого а-фактора, мы показали, что сам по себе просегмент без сигнального пептида не обеспечивает транслокацию через мембрану ЭПР, которая наблюдается только с препросегментом. Однако, замена собственного СП препросегмента на СП РН05 не нарушала гликозилирования просегмента и не влияла на эффективность экспорта пристыкованного к его С-концу гормона роста.

Одним из эффективных приемов оценки вклада углеводной части гликопротеинов в определение тех или иных свойств является использование ингибиторов синтеза полисахаридов. К сожалению их арсенал невелик и ограничивается, применительно к дрожжам, 2 ДГ (или 2ДФГ) и туникамицином.

Подобрав оптимальную концентрацию 2ДГ, мы показали, что частичное нарушение синтеза полиманнозидных цепей просегмента под действием этого агента приводило к заметному, более чем в два раза, торможению экспорта гормона роста. Внутриклеточное содержание гормона в присутствии ингибитора мало отличалось от нормы, равно как и не наблюдалось накопления промежуточных недогликозилированных форм про-ГР. Последнее свидетельствовало о нечувствительности процессирующей реакции с участием КЕХ2 протеазы к изменению структуры углеводной части просегмента, вызванному 2ДГ.

Полное ингибирование синтеза полиманнозидных цепей просегмента в присутствии другого ингибитора гликозилирования - ТМ, существенно меняло ситуацию. Экспорт гормона роста в этом случае полностью тормозился. В то же время ТМ не влиял на транслокацию препро-ГР, лишенного углеводов, в ЭПР, дальнейший транспорт деглико-зилированного предшественника в клеточную оболочку (но не в культуральную среду!) и его превращения в зрелую форму гормона роста.

Таким образом, общим выводом из экспериментов с 2ДГ и ТМ может быть следующее: в норме, полностью гликозилированный просегмент адресует пристыкованный к нему гормон роста в экспортный поток. При нарушении гликозилирования, в той или иной степени, нарушается экспорт гормона роста, но не его транспорт в клеточную оболочку.

Препросегмент, в силу своей структурной особенности, выполняет двойную функцию. Первая, это опосредование начальной стадии секреторного процесса с помощью сигнального пептида, который, как мы показали, взаимозаменяем. Другая функция принадлежит уже просегменту после отщепления сигнального пептида и заключается в сортинге или адресовке ведомого им гетерологичного белка в экспортный поток. Важным условием выполнения этой функции является интактность его полиманнозидных цепей.

Вопрос о роли О-гликозилирования в секреции белков наиболее трудный и малоизученный. К сожалению исследователи не располагают до сих пор достаточным набором средств для его решения.

66

Наш подход, заключавшийся в использовании СБТШ как исключительно О-гликозилированных белков в качестве модели, выгодно отличается от всех известных до настоящего момента попыток в этом направлении.

Использованные нами ингибиторы - 2ДГ и 2ДФГ, не оказывали, однако, никакого качественного влияния на изученные нами СБТШ ГП400 и ГП280 дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha, что само по себе не является фактом ординарным. Мы допускаем возможность синтеза О-маннозидных цепей в присутствии этих аналогов маннозы в обход известному правилу, а именно полимеризацию не через второй, а третий углеродный атом с образованием а 1,3-связей.

Интересным и очень важным явилось наблюдение возможности экспорта полностью негликозилированной формы белка ГП400 у клеток S. cerevisiae sec 53 при температуре 37° С. Данный факт ставит под сомнение локализацию экспортного сигнала в О-гликози-лированном домене СБТШ. Экспорт этих необычно гликозилированных белков обусловлен, очевидно, иными структурными особенностями, изучить которые предстоит в будущем.

67