Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субъединичная организация внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Субъединичная организация внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

/ Сюй Шш

УДК 577.152.31 : 582.282.232

Субъединичная организация внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Б а ссЬаготусев сегепяае

специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель - канд. биол. наук С. Н. Егоров

Официальные оппонеты - доктор биол. наук Я.Е. Дунаевский

доктор биол. наук И.Б. Наумова

Ведущая организация - Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится " 13 " марта 1995 г. в 15:30 час. на заседании специализированного совета Д. 053.05.70. Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова в аудитории М-1 биологического факультета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу. 119899, Москва, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан " 10 " февраля 1995 г.

Ученый секретарь Специализированого совета кандидат биологических наук

Ю. Н. Лейкин

Актуальность проблемы. Дрожжи сахаромицеты являются одним из самых популярных организмов для изучения механизма секреции у эукариот. Секретируемые белки вьитолняют множество биологических функций , в том числе обеспечение клеток питательными веществами. Секреция белков - сложный многоуровневый процесс, б результате которого различные компартменты клетки снабжаются необходимыми белками. Транспорт белков к поверхности клеток таит много загадок. Не решен вопрос о разнообразии везикулярных транспортных систем у дрожжей, экспортирующих белки из клетки. Не определены механизмы, направляющие везикулярные потоки, не решен вопрос о том, где заложен код определяющий распределение секретируемых белков по определенным везикулам. Важным вопросом является выяснение общих, для всех организмов, принципов организации секреторного процесса.

У животной клетки существует два пуп г транспорта секретируемых белков к поверхности: конститутивный и регулируемый. Для дрожжевой клетки этот вопрос окончательно не решен. Роль белков, образующих субъединичное строение некоторых секретируемых белков, требует решения.

Цель и задачи исследования. Репрессибельная кислая фосфатаза дрожжей БассЬагоготусе5 сеге\']$1ае, в отличие от конститутивной, имеет в составе зрелого фермента три различных полипептида, которые образуют отдельные субъединицы. Выяснение роли субъединиц в структуре нативного фермента является целью данной работы. В связи с этим, необходимо было решить ряд конкретных задач:

Определить возможность и особенности секреции кислых фосфатаз, состоящих из различных субъединиц;

Разработать методы очистки фосфатаз, имеющих различный субъединичный состав;

Охарактеризовать ферменты, состоящие из одного типа субъединиц.

Определить возможную роль субъединиц, входящих в состав внеклеточной репрессибельной кислой фосфатазы.

Научная новизна работы. Вопрос об участии отдельных субъединиц в секреции кислых фосфатаз дрожжей ранее не ставился. В работе были использованы кислые фосфатазы, субъединичный состав которых определялся экспрессией определенных структурных генов.

Показано, что выход в среду культивирования, ассоциация с клеточной поверхностью и количество фермента внутри клетки зависит от субъединичного состава. Субъединичный состав фермента влияет на выбор транспортного пути к поверхности клетки. Разработаны способы выделения отдельных субъедишщ фермента с выходом 10 - 25 %. Выяснена субъединичная организация и получены основные кинетические характеристики изучаемых ферментов. Предложена к обсуждению роль отдельных субъединиц.

Практическая значимость. Использование в современной биотехнологии дрожжей, как продуцентов гетерологичных белков, приводит к необходимости детального изучения процесса секреции. Открытие нескольких транспортных путей при экспорте гликопротеинов заставляет проводить поиск наиболее перспективных из них для экспорта, как своих, так и чужеродных белков в среду культивирования. Выяснение регуляторной роли субъединиц репрессибельной кислой фосфатазы, кодируемых генами РНОЮ и РН011, может дать в руки исследователя новые возможности при попытках получения внеклеточных генноинженерных белковых препаратов у дрожжей.

Апробация работы. Материалы диссерташш были доложены на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета (1994).

Публикации. По Материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура и. объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные в работе штаммы и условия выращивания: дрожжи БассЛаготусе.у сегеу1в'ше Б288С (а, гапровд, лабораторный штамм) и УМ 114 (а Ай3-11,3-15 1еи2-3,2-112 сап^рЪо5-р1юЗ::игаЗВ1), УМЯ44 (а Ы$3-11,3-15 1еи2-Зу2-112 сапкр1ю5-рЛоЗ::ит301 р1ю11::игаЗ), УМЯ46 (а Ы$3-11,3-15 ки2-3,2-П2 сап^р1ю5-р1юЗ::игаЗП1 р1ю10::игаЗ).

При анализе и получении кислой фосфатазы культивировали дрожжи в жидкой среде, состав которой ( в расчете на 1 л 0.02 M Na-сукцинатного буфера рН5.0): пептон - 20 г, глюкоза - 60 г.

Для трансформации клеток дрожжей YMR4 использовали челночную плазмиду, в которую были встроены отдельные структурные гены рКФ: РН05, РНОЮ и РН011. Естественная промоторная область генов была заменена на промотор GAP (Janes, 1990), который является более мощным и не подвержен влиянию регуляторных генов при изменении концентрации ортофосфата в среде.

Определение количества белка проводилось по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Определение ортофосфата проводили с помощью метода Пануша (Panusz et al., 1970).

Удаление ортофосфата из пептона проводили осаждением ионами кальция.

Активность кислой фосфатазы определяли по скорости гидролиза р-нитрофенилфосфата или 1-нафтилфосфата.

Определение активности инвертазы проводили по методике

Миллер (Miller, 1959).

Электрофоретическое разделение белков проводилось в PAG с SDS по Лэмли (Laemly, 1970).

Изоэлекгрофокусирование в агарозном геле и в РА G с иммобилинами проводили согласно методикам, разработанным фирмой LKB "Instruction for high-performance analytical electrofocusing in 0.5mm thin-layer agarose gels " 181 SA, LKB. и Application Note 324 - High Resolution Analytical Electrofocusing in Polyacrylamide Gels with Immobiline pH Gredients из фирмы LKB BROMMA.

Получение клеточных стенок дрожжей проводили по методике, предложешюй Пастор со соавт. (Pastor et al, 1982) с некоторыми модификациям!.

Концентрирование среды культивирования проводили на мембране UF-PS-50 (MEMBRANE TECHNOLOGIES Co.Ltd. Plovdiv Bulgaria) и на полиакрилонитриловой мембране ПА-20, 46/9.

Хроматографические методы очистки препаратов кислой фофатазы 1. Гельфильтрация: Колонка Superóse 6 HR10/30 фирмы Phannacia на HPLC системе (LKB и Pharmacia). Колонка 26/100 фирмы Pharmacia со смолой TSK-GEL Toyopearl HW-60 Fine. 2. Ионобменная хроматография: Колонка 16/100 фнp^fы Pharmacia с TSK-GEL Ion Exchanger DEAE-Toyopearl 650М. Колонка MonoQ HR 5/5 фирмы

Pharmacia. 3. Адсороцнсная хроматография: Колонка 26/50 фирмы Pharmacia с HA-ULTROGEL (LKB). 4. Аффнная хроматография: Калонка HR 5/5 фирмы Pharmacia с ConA-Sepherose (LKB). Элюцию гликопротеинов проводили метил-а-О-маннопиранозидом (Sigma).

Определение кинетических параметров кислых фосфатаз: оптимальную температуру ферментативной реакции, рН оптимум и константу Михаэлиса (Км) проводили на спекторфотометре(ЬКВ, Ultrospec 4050) с контроллером (LKB, Controller 4070) и самописцом (LKB, Recorder 2210).

Анализ атгнокислотной последовательности полипептидов кислой фосфатазы проводили по последовательности гена, используя программы: Prosis (Hitachi Software Engineering Co., LTD, Швеция), PCgene (IntelliGenetics Inc. and Genofit SA, Швейцария). Для анализа кинетики фермента была использована программа Enzpack version 3.0. Для анализа результатов электрического разделения белков с помощью сканера Hoefer GS-300 Scanning Densitometer, была использована программа GS-365 program (США). Для статистического анализа и графической обработки была использована программа MicroSoft Excel 4.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.

Секреция в среду культивирования гомо- и гетерополимерных кислых фосфатаз.

Для получения кислых фосфатаз с определенным субъединичным составом, проводили трансформацию клеток дрожжей YMR4 плазмидой, содержащей отдельные структурные гены рКФ. Естественная промоторная область была заменена на промотор GAP (Janes, 1990), который не подвержен влиянию регуляторных генов при изменении концентрации ортофосфата в среде. Субъединичный состав, используемых в работе кислых фосфатаз и примененные нами обозначения, представлены в таблице 1.

Дрожжи выращивали в течение 36 часов на средах с ЮшМ содержанием ортофофата и на средах, лишенных фосфата. Пробы, для определения активности в среде культивирования и на поверхности клеток, отбирали через 3 часа. Из полученных результатов следует, что удельные активности, различных типов секретируемых кислых фосфатаз,

отличаются в сотни раз. таблица 2 Тем не менее, все полученные в данной работе типы кислых фосфатаз способны секретироваться в среду. Таблица 1. Условия образования внеклеточных кислых фосфатаз

Штамм дрожжей Ген в ллазмиде Содержание фосфата в среде Экспрессиру-емые гены кислых фосфатаз Обозначение субъели-ниц Обозначение фосфатаз

YMR4 РНОЗ +Pi PHOS а ! А

YMR4 РНОЮ +Pi 1 РНОЮ ß 1 в

YMR4 РН011 +Pi PHOll V 1С

YMR4 РН05 -Pi PHOS, РНОЮ, PHOll а, ß, у | ABC

YMR4 - -Pi РНОЮ, PHOll ß. V 1 ВС

YMR4 - -Pi РНОЮ 3 ;в

YMR4 - -Pi PHOll 7 i с

S288C - -Pi PHOS, РНОЮ, PHOll а, ß,Y рКФ

S288C - +Pi РНОЗ - кКФ

Ранее были получены результаты о разной степени ассоциации л способности к секреции в среду, для репрессибельной и конститутивной кислых фосфатаз (Шнырева, Егоров, 1990). В таблице 3. представлены данные о распределении суммарной ферментативной активности кислых фосфатаз, секретируемой в среду культивирования в конце экспоненциальной фазы роста дрожжей, содержащейся в клетке и ассоциированной с клеточной стенкой.

Гомополимерные фосфэтазы А, В и С типов большую часть суммарной активности проявляют в среле культивирования, в то время, как нативная рКФ экспортирует в среду около 1/3 суммарной активности. Фосфатаза А типа секретирует в среду более 90% активности, с клеточной стенкой при этом, связано около 1% суммарной активности. Незначительная ассоциация с клеточной стенкой характерна и для нативной рКФ, в то время, как кКФ (гомополимер РНОЗ гена) определялась в значительных количествах в клеточной стенке. Высокая ассоциация с клеточной поверхностью выявлена у В типа фосфатаз (гомополимер РНОЮ гена) и у смешанного ВС типа фермента.

Таблица 2. Ферментативная активность кислых фосфатаз в зкспонек-Ш1альной (21 час) и стацианарной (33 часа) фазах роста клеток дрожжей.

экспрессия единиц единиц единиц единиц

генов кислой активности в активности в активности в активности,

фосфатазы. среде среде среде ассоциирован

(содержание кутьтивиро- кутьтивиро- кутьтивнро- -ной с

фосфата в вания/ вания/ вания/ клеточной

среде) мл мг белка 10У клеток поверхностью

х 100 /109 клеток

21 33 21 33 21 33 21 33

час часа час часа час часа час часа

РН05 (+Pi) 0.35 0.72 3.5 7.2 2.92 3.85 2.44 8.30

РН05, 10, 11 0.25 0.60 2.5 6.0 4.41 4.56 5.57 4.51

(РН05 -Pi)

РНОЮ (+Pi) 0.004 0.002 0.04 0.02 0.034 0.011 0.441 0.169

PH011(+Pi) 0.006 0.002 0.06 0.02 0.067 0.010 0.365 0.259

РНОЮ 0.0004 0.0000 0.004 0.000 0.009 0.0000 0.574 0.445

(YMR44-Pi)

PHOll 0.0009 0.0017 0.009 0.017 0.003 0.010 0.302 0.225

(YMR46-Pi)

PHOS, 10, 11 0.17 0.33 1.7 3.3 1.08 1.21 6.86 5.78

(S288C -Pi)

РНОЗ 0.09 0.12 0.9 1.2 0.23 0.18 1.72 1.09

(S288C +Pi)

Таблица 3. Распределение ферментативной активности кислых фосфатаз между средой культивирования, клеточной стенкой и содержимым клетки

Суммарная ферментативная активность (%)

Штаммы экспрессируемые в среде в клетке на клеточной

дрожжей гены культивирования стенке

YMR4 РН05 91.9 7.0 1.1

YMR4 РНОЮ 52.0 30.0 18.0

YMR4 PHOll 64.1 29.2 6.6

YMR4 РНОЮ, 11 16.3 71.2 12.4

S288C РН05, 10, И 33.5 57.0 9.5

S288C РНОЗ 13.2 ' 62.9 23.9

Рисунок 1. Пути транспорта белков у дрожжей S. cerevisiae.

эндоплазмат1гческпп ретикулум. Vac - вакуоль, V - везикулы, СМ -цитоплазматическая мембрана.

Высокая удельная активность и способность к значительной секреции в среду А типа фосфатаз, подтверждает ранее высказанное мнение о РН05 гене, как кодирующем биосинтез основной каталитической субъединицы рКФ (а-субьедишша). Высказанное нами предположение о роли субъединиц в регулировании транспорта зрелого фермента, требовало постановки эксперимента по обнаружению связи субъединичного строения фосфатаз с направлением по одному из терминальных транспортных потоков.

На рисунке 1 представлена схема транспортных путей у дрожжей. По предположению др. Шекмана (19S2 г.), основной поток секретпруемых белков направлен к зоне образования почки. Естественно, что накопление этих белков должно иметь высокую степень корреляции с почкообразованием. В случае, если динамика ассоциации активности фермента с клеточной поверхностью пли динамика определения

активности в среде, не связана с почкованием, то можно говорить об альтернативном терминальном пути секреции. У животной клетки два терминальных потока секреции носят название коституционного и регулируемого ( Ви^ех, Ке11еу, 1987).

Рисунок 2. Динамика почкования у дрожжей 5". се/етме

3 6 5 12 15 18 21 24 27 30 33 36 Время (час)

— в (+Р0 С (+Р1) ■о— В (-Р0 С (-Р1)

о— рКФ(-РО

-»— кКФ (+Р0 -— А (+Р0 АБС №)

0

На рисунке 2 представлена динамика почкообразования у клеток дрожжей, использованных в работе. Максимальный процент почкующихся клеток был определен после 6-9 часов роста культуры. Следовало ожидать, что именно в это время в среде и на поверхности клеток будут накапливаться кислые фосфатазы, экспортируемые к почке. В таблице 4 приведены результаты по определению коэффициента корреляции между динамикой изменения активности гомо- и гетерополимерньтх внеклеточных кислых фосфатаз и динамикой образования почек в культуре дрожжей. Коэффициент корреляции определяли при анализе 12 экспериментальных точек. При этой системе выборки, ошибка, равная 2% получается при коэффициенте корреляции 0,658 (Бейли, 1964).

Мы подтвердили ранее полученные данные о высокой степени корреляции между почкованием и динамикой накопления ферментативной активности кКФ в среде и на поверхности клеток. Таким образом, кКФ дрожжей может являться примером фермента, экспортируемого по пути, постулированному др. Шекманом для

дрожжей. Секреция натнвной репрессибельной кислой фосфатазы имеет высокий, по абсолютной величине, но отрицательный по знаку (-0,764) коэффициент корреляции с почкообразованием дрожжевых клеток, что показывает на наличие у дрожжей иного терминального транспортного пути. Из полученных данных следует, что по этому пути могут транспортироваться к поверхности клеток, выращенных на бесфосфорной среде, также ферменты ЛВС, А и В типов, которые обладают крайне низкими и, даже, отрицательными значениями коэффициента корреляции. При росте на среде с фосфатом, кислые фосфатазы В и С типов приобретают способность транспортироваться к клеточной поверхности по пути, связанному с почкованием. По этому пути, как отмечалось выше, секретирует кКФ. Проявление внеклеточной активности А типа не имеет высокой корреляции с почкообразованием и не зависит от содержания фосфата в среде. Секреция фосфатазы В типа зависит от концентрации фосфата в среде и при его повышении приобретает способность к выбору терминального транспортного потока, связанного с почкообразованием. С тип фосфатаз, секретирует, преимущественно, по тому же пут.

Таблица 4. Коэффициент корреляции (г) между динамикой образования внеклеточных кислых фосфатаз (в среде и на поверхности клеток) и почкообразованием

Тип кислых фосфатаз в среде на поверхности

клеток

тип А +Pi 0.261 0.303

тип В +Pi 0.594 0.218

тип В -Pi 0.358 - 0.667

тип С +Pi 0.561 0.307

тип С -Pi 0.681 0.724

тип ABC -Pi 0.357 -0.764

кКФ +Pi 0.721 0.8S4

рКФ -Pi -0.764 -0.S03

Таким образом, основной каталитической субъединицей рКФ дрожжей является а-субъединица (РН05 ген). При секреции гомополимерного фермента, состоящего только из а-субъединиц, кислая фосфатаза не способна к однозначному выбору направления

терминального транспортного потока. Секреция фосфатаз В и С типов подвержена влиянию внешних факторов и имеет более четкую ориентацию по транспортным потокам. Низкая активность в среде культивирования и значительно меньшее содержание в зрелом внеклеточном ферменте, по сравнению с количеством а-субъединицы, предполагает участие р- и у-субъединииы в регуляции секреции рКФ дрожжей на последних этапах этого процесса.

2

Очистка гомополимерных кислых фосфатаз.

Низкая активность в среде и нестабильность в процессе выделения кислых фосфатаз В и С типов, заставило нас отказаться от существующих схем очистки кислых фосфатаз и разработать свои более простые и "мягкие" варианты очистки кислых фосфатаз.

На рисунке 3 представлены секретируемые в среду белки дрожжей. . Внеклеточные кислые фосфатазы А, В и С типов, также, как нативные рКФ и кКФ предстают в виде сильно размытых белковых зон после электрофореза в полиакриламидном геле. Молекулярная масса их субъединиц может быть определена между 120 и 140 кБ. Высокая молекулярная масса и значительное гликозилпрованпе ферментов было положено в основу предлагаемых методов выделения кислых фосфатаз.

В таблице 5 приведены результаты чистки гомополимерных кислых фосфатаз.

Таблица 5. Схема очистки кислой фосфатазы, продукта экспрессии гена РН05.

стадия очистки объем актив- белок удельн. выход степень

мл ность ак-ность очисти

мЕ мг Е/мг %

1. Культуральная 26 6500 121.2 0.054 100 1

жидкость

2. Ультрафильтрация 3.5 7056 21.4 0.33 109 6.1

З.СопА-Sepherose 8.5 5438 0.45 12.08 83.7 224

4. на Superóse 6 нанес 2.8 19 0.0014 13.57 - 252

0.1 мл пробы

4. расчет на 3 мл 237 1606 0.118 13.6 24.7 252

образца после стадии 3.

Схема очистки кисло]. фосфат:.зы. состоя:::;!": из продукта экспрессии гена РНОЮ.

стадия очистки объел; мл активность мЕ белок мг удельн. ак-ность Е/мг выход % степень очисти

1. Культуральная жидкость 25 557 39.4 0.014 100 1

2. Ультрафильтрация 0.5 420 1.07 0.393 75.5 28.1

3. ConA-Sepherose 3 80 0.12 0.667 14.4 47.6

4. на Superóse 6 нанес 0.1 мл пробы 2.4 2.3 0.0013 1.75 - 125

4. расчет на 3 мл образца после стадии 3. 72 70 0.040 1.75 12.6 125

Схема очистки кислой фосфатазы, состоящей из продукта

экспрессии гена РН011.

стадия очистки объем мл активность мЕ белок мг удельн. ак-ность Е/мг выход % степень очисти

1. Культуральная жидкость 25 420 39.4 0.011 100 1

2. Ультрафильтрация 0.5 290 0.79 0.367 69.0 33.4

3. ConA-Sepherose 3 213 0.294 0.724 50.7 65.S

4. на Superóse 6 нанес 0.1 мл пробы 2.4 2.7 0.0015 1.761 - 160.1

расчет на 3 мл образц; после стадтг 3. 72 81 0.046 1.761 19.3 160.1

После хроматографии на конА-сефарозе, значительное количество балластных белков было удалено из препарата. На этой стадии достигалась очистка в десятки раз. После концентрирования образец вносили в FPLC-систему на колонку Superóse б (рисунок 4.).После гель фильтрации получали препарат очищенного фермента, который использовался для энзимологических исследований. В таблице 6

г.ривгхгны удельные активности, полненных после очистки, кислых фосфатаз.

Рисунок 3. Градиентный SDS-электрофорез в S% - 20% PAG белков секретируемых в среду культивирования клетками дрожжей: 3 и 4 -S2S8C; 5 и 6 - YMR4, трансформированный геном РН05; 7 и 8 -YMR4, трансформированный геном РНОЮ; 9 и 10 - YMR4, трансформированный геном РН011; (3, 5, 7 и 9 - культивированные в отсутствии фосфата; 4, 6, 8 и 10 - культивированные в присутствии фосфата); 1 и 2 - метчики молекулярной массы, MW-SDS-200 и MW-SDS-70 (Sigma) соответственно.

кД 12345678 9 10

3

Сравнительный анализ гомополимерных кислых фосфатаз дрожжей.

Определенные на колонке Superóse 6 молекулярные массы кислых фосфатаз приведены в таблице 6.

Из результатов электрофореза кислых фосфатаз в присутствие SDS, следует, что молекулярная масса отдельных субъединиц кислых фосфатаз составляет 120-140 kD. Видно, что к тетрамерной организации фермента способны только а-субъединииы. Ферменты В н С типов являются тримерами.

Разделить исследуемые ферменты и;, отделu¡ме белковые зонь. мь, смогли только с помошьго метода нзоэлектрофокусировання. Наилучшие результаты получались при использовании иммобилизованного в полиакриламидном геле градиента рН от 3.5 до 5,0 (рисунок 5.).

Рисунок 5. Проявление активности кислых фосфатаз при изоэлектрифокусирования на PAG с пммобнлинами рН 3.5 - 5.0 препаратов: 1. кКФ, 2. рКФ, 3. фосфатпзп тип А. 4. фосфатаза тип С, 5. фосфатаза тип В.

12 3 4 -

Гомополимерные ферменты, также, как и рКФ и кКф представлены в виде множественных форм. Таким образом, ставится под сомнение существовавшее ранее предположение о существовании множественных форм кислых фосфатаз только за счет возможных комбинаций субъедитпгц. Из возможных предположений о природе множественных форм ферментов-гликопротеинов типа кислой фосфатазы, нам кажется наиболее вероятным объяснение данного феномена различной степенью гликозилирования полипептида. В самом деле, количество возможных точек М-гликозилировання в Р1ю5, РЬоЮ и Р!ю11 полипептидах очень близко к количеству множественных форм фермента, полученных в результате изоэлектрофокусировання.

Рисунок 7.

Относительная термостаби льность различных внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей 5. сегеу:'и'ае

Т °С

Термостабильность гомополимерных форм кислой фосфатазы приведена на рисунке 7. Из полученных результатов следует, что наиболее стабильным является фермент, состоящий из а-субъединиц. Относительная ферментативная активность этого фермента оставалась стабильной при нагревании до 44° в течение 30 минут. В и С формы сохраняли ферментативную активность при нагревании до 23° и 30°, соответственно.

Данные по определению рН-зависимости фермента и Кш по пара-нитрофенилфосфату, в качестве субстрата, приведены в таблице 6.

Таблице 6. Свойства внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей

Б. сегепяпе

Типы молекулярная рН оптимум Км удельная

ферментов масса (М) актвность

(Е/мг)

А 545000 4.6 5.5 х 10-4 13.6

В 366000 4.9 3.3 х 10-4 1.8

С 366000 4.9 2.5 х 10-4 1.8

рКФ 644000 4.0* 5.5 х 10-4 11.5

кКФ 855000 3.6* 2.1 х 10-4* 0.5*

* по литературным данным.

Таким образом, несмотря i;a очень высокую гомологию, кислые фосфатазы состоящие из разных типов субъединиц проявляли различные ферментативные свойства и выполняли различные функции в молекуле зрелого внеклеточного фермента.

ВЫВОДЫ

1. Кислые фосфатазы, состоящие из различного набора субъединиц, обладают способностью к секреции в среду культивирования.

2. Набор типов субъединиц в молекуле внеклеточного фермента определяет выбор терминального участка секреторного пути кислой фосфатазы.

3. Разработаны способы очистки внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей на основе использования аффинной хроматографии и колоночной гельфильтрацни в системе FPLC.

4. Гомополимеры кислой фосфатазы, образованные в клетке при экспресс™ структурных генов репрессибельной кислой фосфатазы, не

теряют способность к субъеднничнои организации зрелого фермента.

5. Выявлены разлтшя в ферментативных свойствах отдельных субъединиц рКФ.

6. а -субъединица определяет каталитическую активность рКФ.

7. р и у являются субъединииами, определяющими выбор терминального участка пути секреции рКФ дрожжей.

8. Гомополимерные кислые фосфатазы обладают множественными ферментативными формами.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Сюй Цин, С.Н. Егоров. 'The Distribution Character of Acid Phosphatase family in the Cell of Saccharomyces cerevJsfae" Тезисы Конференции молодых китайских ученых по биотехнологии. Сентябрь 1994, У Хань, КНР.

2. Сюй Цин, С.Н. Егоров. Некоторые подходы к выяснению функциональной роли отдельных субъединиц в составе секретируемых кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вестник МГУ 1995, Биологическия серия № 3.