Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика секреции и надмолекулярная организация внеклеточных кислых фосфатаз Saccharomyces Cerevisae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Кинетика секреции и надмолекулярная организация внеклеточных кислых фосфатаз Saccharomyces Cerevisae"

мона жскиП ордена Ленина, ордена октябрьской

революции

и ордена трудового красною знамени

ГОС УДАРСТВ Е Н Н Ы П У Н И ВЕРСИТЕТ им. М П ЛОМОНОСОВА Пиологнчегкнй факультет

На Планах рукиши н УДК 582.282.2Л2

Шнырева Марна I еннадневна

КИНЕТИКА СЬКРЕПИИ И НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ВНЕКЛЕТОЧНЫХ КИСЛЫХ ФОСФАТА.'} SACC HAUOMYCES

CEKEVISIAE

снеина льн'кмь DJ (Ю 07 микробиология

А Ii г о |) e ф e |i а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биокничесмсх наук

Москиа 1Ü92

/ ( >'

I'лбита лмлолнена на кафедре мнкробиолопш ¡¡но ютчсгкпю факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Н.С.Глоров

кандидат биологических наук, доцент С II.!:Ю|юв

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М.А.Несмеянова

доктор биологических наук Я.Е. Дунаевский

Ведущее учреждение ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов РАН

Зашита диссертации состоится

_1992 г.

г/ ^

в час. 3 & мин, на заседают Специализированного

совета Д 053.05.66 при Московском Государственном университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " "ноября_1992 г.

Уче1ШЙ секретарь Специализированного совета

</ Пискупкова Н.Ф.

ОВШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лгстуальпость проблемы. Секреция • ол)Ш из важнейших процессов клеточного метаболизма. Изучение механизмов регуляции бшх-интрла внеклеточных бе.ткоп может способствовать решению ряда фундаментальных проблем, в частности проблемы межклеточного узнавания, рецепции клетками сигналов из внешней среды и многих других. Внимание к процессу секреции в значительной степени обусловлено успехами в использовании микроорганизмов для полуен'ия бнотогическн активных веществ.

Проведенные в последние годы исследования позволили получить доказательства принципиальной общности секреции у высших и низших зукариот. Это открыло широкие возможности для использования грибов и, в частности дрожжей, в качестве объектив для изучения механизмов транспорта белков.

На сегодняшний день для дрожжей показана возможность экспорта высокомолекулярных гликопрогештов за пределы клеточной стенки. Несомненна важность этого процесса не только с теоретической, но и с прикладной точкк зрения, поскольку дрожжи являются наиболее популярными объектами для получения белков животного происхождения (напр!гмер, интерферон и инсулин). К сожалению, механизмы проникновения секретируемых гликофсрментов за пределы клеточной стенки абсолютно не изучены. В этой связи полезными могут оказаться сведения о структурной организации этих белков. С другой стороны, знание основных показателей динамики экспорта глнкопротешюв в среду культивирования может быть использовано при оптимизации процессов производства белков с помошыо дрожжей.

Цель и задачи пселедовапия. Целью данной работы являлось изучение механизмов экспорта белков в среду культивирования у дрожжей БассЬаготусех ссгеушае на примере секреции кислых фосфатаз. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. изучение динамики секреции кислых фосфатаз а среду культивирования: 2. изучение особенностей структуры внеклеточных кислых фссфатхз.

Научим воанзил. В данной работе показано, что секреция юисппутивной н репресснбельной кислых фосфатаз приурочена к определенным стадиям роста дрожжей БассЬагогаусез сегеушае, что позволяет предположить различную функциональную роль этих глнкоферментов, а также различие в путях их секреции.

Получены высокоочшцениые препараты внеклеточных репресснбельной и конститутивной кислых фосфатаз, а также штертазы. Изучен субъединичиый состав кислых фосфатаз. Показана общность структурной организации секретируемых г ликоферментов дрожжей, '.:•''"'

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Международной школе-конференшш молодых ученых Социалистических стран (Пуишно, . 1987), на IV Всесоюзной конференции "Биосинтез . ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), на XII! Всесоюзной конференции по электронной микроскопии ■ (Звенигород, 1988), на II Международной конференции по биохимическому разделетда (Кештели, 1988), на I конференции "Проблемы и : : перспективы биотехнологии" (Братислава,; 1989). Работа прошла апробацию на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова,

Публикации. По материалам диссерташш опубликовано 9 печатных работ:

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследовашш, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 200 наименований. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 29 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использован штамм БассЬаготусеэ сегеушае Б288С (Венков, ИМ Б АН Болгарии).

Условия культивирования. Дрожжи культивировали при 30° С на среде с пептоном (Семенова, 1986).

Определение бежа проводили' по методу Лоурн (Lowry ft a!. 1950.

Определение содержания углеводов в препаратах кислой фосфатазы проводили с использованием L-триптофанового реагента Uosefson et al.. 1972).

Определение ортифосфата проводили по методу (Pan'usz et al. 1970).

Активность кислой фосфатазы определяли с использованием н нитрофеннлфосфата (Torriani, I960).

.Активность инвертазы определяли, испо и.зуя

линитросалиииловый реагент (Miller, 195.9).

При получении препаратов клеточных стенок за основу была мята методика (Pastor et al.,1982).

Элскт]н)форез проводили пи методу Лэм.ти (Lat-mly, 1970').

Комбинированное окрашивание гелей Кумаосн Р-250 и серебром проводили по методике (Gorg et al.,1985).

Илозлектрическое ({юкусированне проводили, основываясь на методических разработках фирмы Phármacía-LKB.

Хроматофокусирование проводил)! по метолгке фирмы Pharmacia-LKB. "

Деглнкозилированне препаратов кислой фосфатазы проводили с Ш По.ТКшваНИеМ ферМеНТл Л1До-Ь-ГЛК)КозаМИННДазЫ И II.) Streptomyces griseus (Trimble. Maley. 1.984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

. Глава 1. Изучение секреции репрессибельной и конслпупгоной кислой фосфатазы.

Ранее были получены данные о влиянии изменения концентрации глюкозы на образование внеклеточной кислой фосфатазы дрожжей (Ct'McHuna, 1986). Мы научили динамику секреции двух изоформ кислой фосфпта.чн - конститутивной и репрессибельной - на среде с различным содержанием глюкозы ( 2, 6 и 10%).

Активность кислой фосфатазы измеряли В среде ку тьтивнровання и на поверхности клеток. Было обнаружено, что образование клетками дрожжей внеклеточной кислой фосфатазы связано с измением скорости роста культуры. Наибольшая

шпеасивносгь биосинтеза и зкспорга коне гигу гшшои кислой (|>осфатазы на срсде с 1U мМ фосфата калия наблюдается о первые часы кульпшировашш. На средах с различным содержанием ).показы ara зависимость остается нешмечпюй. Максимальная активность репрессибельной кислой фосфатазы, обнаруживаемая на осх фосфорной с 2, .6., 10 ,% глюкозы, приходится на начали стационарной фазы роста культуры. Замена глюкозы на глицерин иикоим образом не меняет отмеченных закономерностей.

Изложенные результаты указывают на тесную корреляцию'роста культуры и экспорта кислой фосфатазы в среду культивирования.

Изучение связи секреции кислой фосфатазы с физиологическим состоянием культуры дрожжей.

Одним из наибилее характерных показателей физиологического гостоянИя культуры Saccharomyces cerevisiae можно считать процесс почвообразования. Формирование почки коррелирует также с процессом секреции. Показана локализованная секреция и накопление активности кислой фосфатазы непосредствешю в районе возникновения почки (Field, Schekraaa, 1980).

Мы также исследовали зависимость между секрецией кислой фосфатазы и процессом почкообразовашш. Статистическая обработка полученных результатов показала высокую степень корреляции секреций конститутивной кислой фосфатазы с процессом почкообразовашш. Коэффициент корреляции величины активности ьнслой фосфатазы, ассоциированной с клетками и иочкообразованнем равен 0,97.

Подобной зависимости не обнаружено при изучении секреции кислой фосфатазы на среде без фосфора. Выявлена отрицательная корреляция между секрецией репрессибельной кислой фосфатазы и нроцохом почкоибразования. Коэффициенты корреляции имеют отрицательные значения и составляют R—0,82 для величины активности, ассоциированной с клетками и R—0,81 для секреции в ( ;**ду культивирования при вероятности Р>0,99.

Выявленные закономерности позволяют предположить, во-игриых, различную функциональную роль конститутивной и р- (цкгсснбе.чышй кислой фосфатазы, во-вторых, возможность

гушеггпоиаиия не связанной с почвообразованием секреции репресп!б|\'Г1)Нпй формы кислой фосфатазы.

Для проверки первого предположения было научено распределение активности кислой фосфатазы между средой культивирования. фракцией клеточных стенок и суммарной фракцией пгрипла.)Матнчеехиги пространства и внутриклеточного годержнмего.

IIa рис.! покапано, что п процессе роста дрожжей п условиях [к-прегеин на среде с 10 мМ КН2РО4 содержание конститутивной мгетй г(-кк-флта.1ы в среде культпшгровання уменьшаете:! ггри выходе кулытры на стационар от fiii°.. ло 8*4, и происходит накопление ф.'р^рнгп н пернплазматичсском пространстве и по фраьпин ь 1ГТОЧНЫХ гтгнок. Достаточно высокое процентное содержанке

-F

— . И

-J

70

ел--м

40

30-

го ю о

Внутрнкл.гад. Клеточные Среда н пернпя.пр- стгнгя по

□ S ч1сов еэ 2* itct п <t чзсав i'iir.l Расн|>еделе!1не активности конститутивной кислой фосфаьазы

между клеточными компартментами фгч-фдтазной активности во фракции клеточных стенок может \ ьм п.гпап. на присутствие конститутивной кислой фпгфатазм п состав'* клеточной гтенкн.

ú

В составе стенок клеток 5ассЬагошусез сеге\'в!ае, выращенных в условиях голодашш по фосфору, процентное содержание фосфатазной активности остается постоянным и составляет в среднем 3% от обшей активности релрессибелъной кислой фосфагазы (рис.2). Это может указывать на то, что репрессибельная фирма кислой фисфатазы является истинно внеклеточным ферментом и предназначена для обеспечения клеток фосфатом.

О 6 члсов ; D 24 члсi Я 48 чюов

Рис. 2 Распределение активности репресснбелыюй кислой фосфатазы между клеточными компартментамн В связи с зтим встает Ьопрос об- измерении времени секреции репрессибелыюй кислой фосфатазы в среду культивироватш. Из литературных данных следует, что транспорт беЛков за пределы клеточной стенки должен занимать не менее 5 минут (Pastor et al.,1982, Vanoni et al.,1983).

Клетки дрожжей Saccharomyces cerévisiae выращивал}! на среде с 10 мМ КН2РО4 до середины экспоиенцнальноги роста, начала стационарной стадии роста и конца стационарной стадии роста. Далее отмытые клетки переносили в меньший объем свежей среды, п которой отсутствовал неорганический фосфор. Измерение

активности кислой фосфатазы проводили каждые 5 минут в течение 1 часа. Контролем служили клетки, помешенные в такой же otfi-ем среди с 10 мМ KH2PO.J. В данных условиях количество клеток не возрастало. Для клеток, находящихся на стадии экспоненциального роста, увеличение фосфатазной активности по сравнению < мшг|!олем происходит че]жз 10 минут. Учитывая литературные данные, можно предположить, что п данном случае происходит синтез фермента de novo, и время секреции репресснбелыюй кислой фосфатазы п среду культивирования составляет 10 минут.

Клетки, выращенные до стадий раннего и позднего стационара быстрее реагируют на изменение условий культивирования. Увеличение уровня секреции репресснбелыюй кислой фосфатззы происходит в первые 5 минут. В данном случае уместно предположить, что в среду попадает заранее синтезированный фермент. Мы предполагаем, что репрессибельная кислая фосфата.™ может некоторое время храниться в везикулах, подобных "сохранным" везикулам иысшнх эукарнот.

Мы провели сравнительное изучение секреции иивертазы -другого внеклеточного маннопротеииа дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Максимум секреции инвертазы в условиях дерепрессни на среде с глицерином приходится на конец лаг-фазы, что практически (онпалает С данными. Полученными ДЛЯ

конститутивной кислой ({юсфатазы. Подобная закономерносп. бы ла также обнаружена при культивировании дрожжей на среде г 1.ТЮК030Й. -В отличие от литературных данных в наших опыпх нотного подав тения секреции инвертазы не происходит (рис.3).

Рис.3 Изоэлектрофокуснрование о поднакриламидном геле с использованием амфолн'нов (рН 2.5-5.0) препаратов шшертазы, секретнруемой дрожжам» на среде с : 1 - 6% глюкозы; 2 - 6% глицершт. Окраска на активность.

Глава II. Изучение структуры секретнруемых кислых фосфатаа. В процессе работа была разработана схема очистки внеклеточных кислых фосфаГаа (табл.О.

Таблица 1

Выделение и очистка ренрссскбелмшй г л ¡слой фосфлтазм

Спин»

З'ШСТМ)

ОЗье Ьелок Суммарм Удельл. пил яг шгггп. мггсп-5 Е/нг

ЬКульгурпльн 4560 31920 жидкость

2. Ультра-

фнЛЗДраЦИМ

225 911

1550

439

Л.Адсорбщюн. 54

громатсгр.

ГА-Ультрогсль

•1, Ультрафильтр гния

5. Гель-фплътрашш АсА -.34

1.7

12

4.4

32.5 3.3

25

38

62

0.05

0.48

2.20

8.50

23.90

Шпод % Степень счистки

100

23

1.7

2.4

9.8

44.9

174.3

488.5

Введите стадии среднескоростной ионообменной хроматографии иа ДЭАЭ-Тоеперле позволило, получить препараты инвертазы и конститутивной кислой фосфатазы с 'высокой степенью очистки. Были выдр.те/ш две фракции конститутивной кислой фосфатазы (ККФ 1, ККФ 11),которые различались по константам Михаэлнса (Кл11-=2,08x10"* М, Ктп11=1,42х10"*М) и содержанием утлеводад в молекуле ( для ККФ1 - 40%, для ККФН - 30".). Обе формы конститутивной кислой фосфатазы обладали высокой степенью гетерогенности. При изоэлектрофокуенровании ферментных препаратов было обнаружено порядка 20 форм с изоточкамн в области рН X03-4.1 (рнс.1).

I II

Рис. 4 Изоэлектрофокусирование в агарте с использованием фармалитов (рН 3 5-10) Препаратов конститутивной кислой фосфатазы.

I - коисппутивная кислая фэсфатаза I; II - конститутивная кислая

фосфатаза II.

ПоЛИМи}>физМ КиНсТИТуТИВНи сеКреТИруеМоЙ МНЛиЙ фосфаТа-Ш связан с небольшими различиями в степени гликозилнрования белковых молекул. При ферментативном дегликозилпровашш конститутивной кнг.юй фосфаталы I и II ферментом Кп<1оН был обнаружен один почиш-птид с мо чеку тарной массой 57 кДа.

Изучение субъедншгчного состава сскретнруемой ренресспбелыюй кислой фосфатазы

При анализе репресснбельной кислой (|юсфатазы методом изозлектрофокуснрования п иммобилизованном градиенте рН было обнаружено 4 дискретные полосы с изоточкамн о обласп! рН 4.2-4.7 При ферментативном деглнкознлпровании очищенноги ферментного препарата с помощью ЕпёоП удается обнаружить 3 различных полипептида с молекулярными массами 62 к Да. 58 и 55 к Да.

Для преларашвного выделения отдельных форм репресспбелыюп кислой фосфатазы использовали метод хроматофскусирования. Бы м получено 4 фракции, различающиеся по нзоточкам (рис..')). У выделенных форм изучали субъединичный состав. Оказалось, чю полипептид 62 кДа обнаруживается в составе форм с более низкими р]. Использование Метода препаративного изшЛгктрификусириьанич позволило получить 2 формы репресснбельной кислой фосфатазы <. изоточкамн 4,73 и 4,45. Оказалось, что ферментная форма с р! 4.7'! содержит в споем составе один полнпетид с молекулярной массой ">.> к Да. В состав другой формы входят два. полипептида (55 и 56 к Да), которые, скорее всего, соответствуют полипептидам р5Я " р56. полученных Бостианом при анализе продуктов бесклетичной трансляции (ВохМап е1 а!.. 1980). Таким образом, существование множественных фирм репрессНбгльной кислой фосфатазы связано с различной комбинацией 3 полипептидов в молекуле этого экзофермента. Нельзя таюке исключать роли глнкозилирования и способности к образованию олигомеров.

Использование метода препаративного пзоэлсктр.офокусировання позвол)1ло получить 2 формы репресснбельной кислой фосфатазы с изоточкамн 4,73 и 4,45. Оказалось, что ферментная форма с р! 4.73 содержит в своем составе один лолппетнд с молекулярной массой 5.1 кДа. В состав другой фирмы входят два полипептида (55 н 56 кД<»), которые, скорее всего, соответствуют полипептндам р53 и р56, полученных Бостианом при анализе продуктов бесклеточной трансляшш (Во5»лап е1 а1., 1980). Таким образом, существование множественных форм репресснбельной кислой фосфатазы связано с различной комбинацией 3 полипептидов в молекуле .»того

пкзофермента. Нельзя также исключать роли глнкознлнроьаиия и способности к образованию олигомероо.

Изучение чстпсрппшой структуры сскретпрусмоГ! рспресснбелышй кислой фосфаталы.

При электрофорезе в денатурирующих условиях б присутствии ДДС-Ка репресснбельная кислая фосфати^а движется диффулюй зоной, ео молекулярная масса находится в области 95-165 к Да, что соотостстаует молекулярной массе одной субъедншшы. С номощыо .««•года высокозффсктвной жидкостной хроматографии обнаружено, что молекулы репрессибс.тьной кислой фосфаглзы склонны к обралопзиию олигомерных комплексов от тетрамера до декамера. Такие олшомеры обладают высокой стабильностью и не разрушаются даже при инкубации При 30° С в течение 12 часов.

Мы исследовали влияние ралЛНЧИЫХ концентраций МоЧеШШЫ И.1 стабильность мудьгимерных комплексов молекул репрменбольной кислой фосфаталы. Мочевина при концентрации ЗМ при хранении в течение 12 часов существенным образом не нарушает олнгомерную структуру репресгибе 1Ы(ой кислой фосфаталы Хранение г|м>рмекта в ЗМ мочевине при 4иС в течение 4 суток приводит к лигсоциании олигомера на димеры. сопровождающееся п[>акгически шпион Потерей активности. Диализ ферментного препарата в чеченце ночи (Ця)ШВ 50 мМ Ха-ЦИГраПЮТО буфера рН 4.73 с ДиСмНЛгШН'М 0.1М \'аП ириволит к восстановлению олигпмерной струкчгры мо 1ек,л рещхчтнбелыюй кислой фосфатазы.

'{чч-фагаяы. -- профиль злюими значения <;Н

и

Молекулярная организация секретируемой репресснбельной кислой фосфатазы была изучена также с помошью метода электронной микроскопии. Обнаружено, что большинство изображений одиночных частиц имеет форму квадрата со стропой около II,5±1 им (рис. 6 а). /

■ 6

Рис. В Электронная микроскопия препаратов: а - репресснбельной кислой фосфатазы: б - инвертазы На многих изображениях частиц хорошо видны 4 области белковой плотности, расположенные по вершинам квадрата. Эти данные свидетельствуют о том, что молекула репрессибельной кислой фосфатазы состоит из 4 идентичных или очень близких по массе субьединнц и имеет квадратную проекцию со стороной 11.5±1нм. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что конститутивная форма кислой фосфатазы име«т аналогичную организацию Изучение инвертазы, секретируемой дрожжами в среду культивирования в присутствии глюкозы, указывает на схожую с кислыми фосфатазами молекулярную организацию (рис. 6 б) , что совпадает с данными Эсмон с соавт. (Е$шоа е1 а!.. 1987) по анализу инвертазы, выделенной из транспортных везикул секреторных, мутантов.

выводы

1. Секреция конститутивной кислой фосфатазы дрожжей БассЬаготусез сегеушае осуществляется по так называемому "конститутивному" пути и связана с процессом почкообразования Скорее всего, эта форма кислой фосфатазы входит в сосыв клеточной стенки дрожжей.

2. Секреция репрессибельной кислой фосфатазы не связана с процессом почкообразования. Функциональная роль репрессибельной кислой фосфатазы связана с обеспечением клеток фосфором.

3. Впервые показано наличие определенной формы секретируемиЯ инвертазы у дрожжей БассЬаготусе* сегеутае 5288С, секреции Которой Не ИИГНбИруеТСЯ НаЛИЧНеМ ГЛЮКОЗЫ В Среде

культивирован!«.

4. Показано, что секретируемые гликофермепти • шшертаза н кислые фосфатазы - имеют сходную четвертичную структуру.

5. Изучен субъедшшчный состав репрессибельной кислой фосфатазы, секретируемоЙ дрожжами в среду культивирования. Показано, что в состав молекулы входят 3 полипептда с молекулярными массами 62, 58 и 56 кДа. В. состав конститутивной изоформы входит один полнпелтид с молекулярной массой 57 кДа. 5. Кислые фосфатазы представлены о среде культивирования множественными формами. Выделены отдельные формы у репрессибельной кислой фосфатазы,, изучен их субъединичный состав.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Шнырева М.Г., Егоров С.Н. Внеклеточная кислая фосфагаза и ИНВерТаза на разных стадиях роста Дрожжей ЬассЬаютусеъ сегеУ151ае. II Международная школа-Конференция молодых ученых социалистических стран "Молекулярные основы биотехнологии", тезисы докладов, Пушино, 1987. с.72.

2 Егоров С Н , Шнырева М.Г Особенности структурной организации внеклеточных ферментов дрожжей Saccharomyces

cerevisiae. IV Всесоюзная конференций ^ Ннопгнтм фгрм«;ггпп микроорганизмами", тезисы докладов, Ташкент. 1988, с 68. .4. Цупрун В.Л., Стельмашук В.Я,, Шнырева М.Г., Егоров С.И. Электронно-микроскопическое исследование секретируемых гликопротендов: кислой фосфатазы и ннвертазы. XII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, тезисы докладов, .Звенигород, 1988, с. 48.

4. Egorov S.N., Shnyreva M.G. The isoelectric focusing of secretory glycoproteins from Saccharomyces cerevisiae. 2 nd International . Conference on Biochemical Separations, Keszthely, 1988, p.75-77.

5. Шнырева М.Г., Егоров C.H. Надмолекулярная организация секретируемых гликопротендов дрожжей. I конференция "Проблемы и перспективы биотехнологии", тезисы докладов, Братислава, 1989, с.71.

6. Егоров С.П., Шнырева М.Г., Егоров 11.С. Секреция кислой фосфатазы и ннвертазы на разных стадиях роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В сб. "Ферменты микроорганизмов", М:НПО "Медбноэкономика", 1989, ч.1,с.37-48

7. Шнырева М.Г., Егоров С.Н. О возможности существования различных путей секреции кислой фосфатазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 1990, т.59, с.948-958.

8. Shnyreva M.G., Egorov S.N. The secretion of acid phosphatases by yeast Saccharomyces cerevisiae. 15 th International specialized symposium oo yeasts, Riga, 1991, p.125.

9. Шнырева М.Г., Цупрун В.Л., Стельмашук В.Я.. Егоров С.Н. Анализ четверттгчной структуры секретируемой репрессибелыгой кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 1992. т.57. N7. с. 1110-1118.