Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование дрожжей местной селекции для производства микробного белка на питательной среде из горца сахалинского

ВАК РФ 03.00.32, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Использование дрожжей местной селекции для производства микробного белка на питательной среде из горца сахалинского"

На правах рукописи

КАБУЛОВА МАРИНА ЮРЬЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ МЕСТНОЙ СЕЛЕКЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МИКРОБНОГО БЕЛКА НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ИЗ ГОРЦА САХАЛИНСКОГО

Специальность 03.00.32 — «Биологические ресурсы»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владикавказ - 2006

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» на кафедре биологической и химической технологии

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Цугкиев Борис Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чопикашвили Лидия Васильевна доктор технических наук, профессор Бирагова Нателла Федоровна

Ведущая организация: Министерство сельского хозяйства и

продовольствия Республики Северная Осетия-Алания

Защита диссертации состоится «25» декабря 2006 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета К 220.023.02 при ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» по адресу: 362000, РСО-Алания, г. Владикавказ, ул. Кирова, 37, Горский ГАУ, факультет биотехнологии и стандартизации, компьютерный зал.

Тел./факс (8-8672) 53-99-26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет».

Автореферат диссертации разослан «25» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

З.Л. Дзиццоева 2

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Культивирование микроорганизмов с целью получения питательных веществ для человека и животных представляет собой пример раннего и актуального до сих пор внедрения в промышленное производство методов биотехнологии. Необходимость использования данных биотехнологических процессов определяется остротой насущных проблем современности: экологической, продовольственной, энергетической.

Микроорганизмы можно выращивать на дешевом, непищевом субстрате, каким служат клетчатка, метанол, водород и др. Биомасса может быть источником белков, липидов, полисахаридов, витаминов, каратиноидов.

Учеными изучена способность продуцировать клеточные белки водорослей, дрожжей, грибов, бактерий. Однако в соответствии с комплексом требований, предъявляемых к микроорганизмам-продуцентам (достаточно высокая скорость роста, устойчивость к инфекциям, легкая осаждаемость, эффективность утилизации источников энергии, высокое качество белка), наибольшим потенциалом, вероятно, обладают дрожжи. Эта группа микроорганизмов используется для получения целых клеток (корма, пища), макрокомпонентов (белки, липиды, ферменты, нуклеиновые кислоты), экстрагируемых соединений (коферменты, витамины), продуктов деструкции (аминокислоты, нуклеотиды), продуктов метаболизма клеток (этанол, глицерин, углекислота, органические кислоты и др.).

В последние годы производство дрожжевых продуктов расширилось в результате внедрения новых продуцентов ценных веществ при культивировании их на дешевом сырье.

Дрожжи широко распространены в природе и в окружающей человека среде. Они активно размножаются в тех субстратах, где имеются доступные растворимые источники углерода — простые сахара, спирты, органические кислоты, т.е. в соках, сиропах, на плодах, в нектаре цветов, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в воде и почве.

Исходя из изложенного, актуальность выделения и изучения новых, высокопродуктивных штаммов разных видов дрожжей и изыскание новых источников субстрата для их культивирования очевидна, а само направление исследований — перспективно.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось выделение из различных природных источников и идентификация штаммов местных видов дрожжей; разработка технологии их выращивания на питательной среде из горца сахалинского (Poligonum sachalinense Fr. Schmidt) для получения микробной биомассы.

В соответствии с поставленной целью были определены задачи:

— выделить из природных микробиоценозов высокопродуктивные штаммы дрожжей, способных расти на растительных субстратах;

— идентифицировать видовую принадлежность выделенных штаммов дрожжей и изучить их характеристики;

— изучить химический состав горца сахалинского;

— разработать технологию производства питательной среды на основе зеленой массы горца сахалинского;

— подобрать оптимальный состав питательных сред для максимального накопления биомассы выделенными местными штаммами идентифицированных видов дрожжей;

— определить уровень белка в биомассе местных штаммов идентифицированных видов дрожжей;

— изучить влияние температуры культивирования на рост и содержание клеточного белка в дрожжах;

— установить влияние объема посевного материала на рост дрожжей рода Ме15сЬтко\у1а;

— подобрать оптимальные режимы культивирования местных штаммов идентифицированных видов дрожжей.

Научная новизна работы:

— впервые в условиях РСО-Алания выделены и идентифицированы местные штаммы разных видов дрожжей и изучены их видовые характеристики;

— показана возможность эффективного использования зеленой массы горца сахалинского в качестве растительного сырья для питательной среды с целью получения биомассы дрожжей;

— установлена перспективность использования для получения микробной биомассы на питательной среде из зеленой массы горца сахалинского местных штаммов дрожжей рода Ме18сЬткоут, способных интенсивно накапливать биомассу;

— впервые во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) задепонированы культуры 7 штаммов 3 видов дрожжей: М^БсЬшко^ча ри1сЬегпта, НалБетаэрога иуагит, СгурШсоссиэ ПауезсепБ, идентифицированных в РСО-Алания.

Практическая значимость работы:

— получены местные штаммы дрожжей рода ГУ^зсИшкоуиа, обладающие высокой продуктивностью и скоростью роста на среде из горца сахалинского;

— разработана технология производства питательной среды на основе нетрадиционного растительного сырья - горца сахалинского, интродуцированного в республику с о. Сахалин, урожайность зеленой массы которого в агроклиматических условиях Северной Осетии составляет до 1500 ц/га;

— установлена экономическая эффективность использования для культивирования дрожжей питательной среды из горца сахалинского, по сравнению с другими видами сырья растительного происхождения.

Положения выносимые на защиту:

1. Морфологические, биохимические и культуральные свойства, идентифицированных местных штаммов видов дрожжей: Ме18сЬтко\у1а ри!сЬегпта, Напзешаврога иуагит, Сгур^соссиэ АауевсепБ.

2. Показатели химического состава зеленой массы горца сахалинского в условиях РСО-Алания.

3. Технология приготовления питательной среды для производства биомассы микроорганизмов на основе зеленой массы горца сахалинского.

4. Технологические свойства местных штаммов дрожжей вида Ме1зс11тко\т ри1сЬетта.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной - научно-практической конференции «Современные проблемы формирования стратегии устойчивого развития регионального АПК» (Владикавказ, 2003), а также на научных конференциях Горского ГАУ в 2003-2006 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе одна статья в реферируемом журнале.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, библиографического списка. Содержит 21 таблицу, 9 рисунков. Список литературы включает 200 наименований, из них 52 на иностранных языках.

2. Собственные исследования 2.1. Материал и методы исследования

Исследования выполнялись на базе НИИ биотехнологии и на кафедре биологической и химической технологии Горского ГАУ. Объектами исследования служили штаммы дрожжей, выделенные из природных ценозов, а также образцы зеленой массы горца сахалинского.

Образцы материала для выделения штаммов дрожжей отбирались путем смыва с поверхности плодов и ягод: винограда, малины, айвы, дикой груши, смородины, ежевики, произрастающих на территории Северной Осетии. Посевы производили петлей по принципу истощающего штриха на плотную питательную среду (сусло-агар, агар Сабуро). После инкубации в аэробных условиях при температуре 26—29°С выделяли доминирующие колонии.

Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра.

Идентификацию дрожжей проводили по общепринятой методике (И.П. Бабьева, В.И. Голубев, 1979).

Химический состав горца сахалинского изучали до бутонизации, во время бутонизации и в период массового цветения и при этом определяли:

— первоначальную влагу методом высушивания, ГОСТ 1396.3—92 [27548—

97];

— содержание протеина по Къельдалю, ГОСТ 1396.4 [2874-89];

— содержание жира методом Сокслета, ГОСТ 13496.95;

— содержание клетчатки - по Геннебергу и Штоману, ГОСТ 1396.2-91;

— содержание растворимых углеводов методом Бертрана;

— содержание золы — методом сухого озоления, ГОСТ 26226—95;

— БЭВ — расчетным методом;

- содержание кальция комплексометрическим методом, ГОСТ 28902—

915[26570-95];

- содержание фосфора методом И.К. Волгина (1974), ГОСТ 28902—

915[26657—97].

В исследованных образцах растений изучено содержание отдельных

химических элементов:

- железа по ГОСТ 27998-88;

- меди по ГОСТ 27995-88;

- марганца по ГОСТ 27997-88;

- цинка по ГОСТ 27996-88.

Технология питательных сред модифицировалась в зависимости от необходимого уровня содержания сахара и азота в среде.

Периодический процесс культивирования осуществляли в ферментерах при рН среды 4,5-5,5 и температуре оптимальной для выращивания дрожжей (29-30°С). Выход биомассы определяли центрифугированием и взвешиванием (А.Г. Забродский, 1980).

В биомассе выращенных дрожжей определяли содержание влаги, общего азота, сырого протеина, истинного белка по ГОСТ 20083-74.

Биометрическую обработку полученных данных проводили по методике Е.К. Меркурьевой (1970).

Постановка экспериментов осуществлялась в соответствии со схемой, приведенной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема основных этапов исследования

2.2. Результаты собственных исследований и их обсуждение 2.2.1. Выделение и идентификация дрожжей из дрожжесодержащих

материалов

Источниками получения дрожжей служили спонтанные природные ценозы плодово-ягодного сырья, произрастающего на территории Северной Осетии, где они являются обычным компонентом.

В качестве метода отбора образцов нами был выбран метод смыва. Смывы производили путем перенесения плодов и ягод в колбы со стерильной водой. При использовании предложенного метода вероятность выделения дрожжей из различных материалов близка к 100 %.

Выделенным штаммам дрожжей присвоили условные буквенные обозначения: А, ВР, ДГ, МР, МВ, Е, ВС.

Для идентификации штаммов мы определили их морфологические, биохимические и культуральные свойства.

В таблице 1 дана характеристика вегетативных клеток и культуральных признаков дрожжей при росте на плотных средах.

При изучении формы клеток выделенных нами дрожжей было установлено, что шесть из семи штаммов дрожжей имеют округлую форму клеток. Штамм Е отличается от других штаммов лимоновидной формой клеток и малыми размерами. По литературным данным известно, что лимоновидной (апикулятной) формой клеток характеризуются роды Напветаэрога и К1оескега.

Выделенные нами штаммы имеют и другие различия. Колонии штамма Е имеют плотную консистенцию, ровную форму края штриха, а штаммов А, ДГ, МВ, МР, ВР - более плотную и густую консистенцию. Колонии штамма ВС отличаются слизистой консистенцией.

Таблица 1

Характеристика вегетативных клеток и культуральных признаков дрожжей при росте на плотных средах

п = 5

Условное название штамма Форма клеток Размеры клеток, мкм. Характеристика колоний

Консистен ция Цвет колоний Форма роста

ВС округлая 5-8x7-10 слизистая желтоватый гладкая, блестящая

Е лимоновидная 2-5x3-11 плотная белый матовая

ДГ округлая 6-15x5-13 плотная розовый матовая

МВ округлая 5-15x5-13 плотная белый матовая

МР округлая 6-15x5-13 плотная розовый матовая

ВР округлая 6-15x5-13 плотная розовый матовая

А округлая 6-15x5-14 плотная розовый матовая

Цвет штриха или колоний зависит от образования дрожжами некоторых пигментов. Штамм ВС образует колонии с желтовато-кремовым оттенком; штамм Е — бесцветные колонии, а штаммы А, ДГ, МР, ВР образуют красный пигмент, который диффундирует в среду (таблица 2). По данным И.П. Бабьевой, В.И. Голубева (1979) образование красного пигмента пульхерримина, диффундирующего в агар, специфично для Ме1зсЬшко\у1а рЫсЬегпта.

Штамм ВС отличается от других штаммов многосторонним почкованием. Такое явление часто наблюдается у разных представителей рода СгурЮсоссиБ.

Полярное образование дочерних клеток, начинающееся с формирования почки на широком основании, а заканчивающееся появлением четко заметной, даже в световом микроскопе, септы в районе перешейка, носит название почкующегося деления. Монополярная форма его наблюдается у Р^гоБрогит, биполярная - у апикулятных дрожжей НапзешаБрога и К1оескега. Такое биполярное почкующееся деление мы наблюдаем у штамма Е.

У шести выделенных нами штаммов дрожжей была обнаружена способность к образованию аскоспор. У штамма Е были обнаружены аскоспоры шляповидной формы от 1 до 4 в аске. У штаммов А, ДГ, ВР, МР, МВ аски булавовидной формы, аскоспоры игловидные, заостренные 2 в сумке.

В таблице 2 показана способность выделенных нами дрожжей сбраживать углеродсодержащие вещества. Анализируя приведенные данные, можно сделать вывод о том, что у штамма ВС полностью отсутствует способность сбраживать сахара, остальные штаммы сахара сбраживают.

Таблица 2

Сбраживание углеродсодержащих веществ выделенными штаммами

п = 5

Штамм Глюкоза Фруктоза Манноза Лактоза Сахароза Раффиноза Дульцит Галактоза

ВС — — — — — - - —

Е + + + — — - — —

ДГ + + + — + — — +

МВ + + + — + — - +

МР + + + — + — — +

ВР + + + — + — — +

А + + + - + - - +

Для более полной характеристики дрожжей, мы также изучали их уреазную активность, способность к разложению желатины, способность к гидролизу жира, образованиию органических кислот, эфиров и

крахмалоподобных соединений. Результаты исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3

Метаболическая активность идентифицируемых штаммов дрожжей

п = 5

штамм Гидролиз мочевины Разжижение желатины Гидролиз жира Образование органических кислот Образование эфиров Образование крахмалоподобных соединений

ВС + + — — — +

Е + + — — — —

ДГ + + — — — —

МВ + + — — - —

МР + + — — - —

ВР + + — — — —

А + + - - - -

Для определения родов дрожжевых организмов придерживаются системы разделения дрожжей на 3 группы: аскомицетовые дрожжи (образуют сумки с эндогенными половыми спорами), базидиомицетовые (образуют телиоспоры и базидиоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами) и несовершенные дрожжи (не имеют полового процесса, образуют лишь бесполые споры).

В результате проведенных исследований, на основании анализа морфологических, биохимических признаков, полового процесса, выделенных дрожжей, мы установили их родовую принадлежность: штаммы Е, ДГ, А, ВР, МВ, МР относятся к аскомицетам, штамм ВС - к несовершенным дрожжам.

По форме аскоспор и размеру клеток можно сделать вывод о том, что штамм Е относится к роду НапвешаБрога.

Штаммы А, ДГ, МВ, МР, и ВР имеют аски булавовидные или клиновидные, аскоспоры игловидные, что характерно для представителей рода Ме1зсЬшколу1а. Известно также, что один из видов — Ме15сЬтко\т ри1сЬетта - образует красный пигмент пульхерримин, который диффундирует в среду. В связи с вышеизложенным, можно заключить, что штаммы А, ДГ, МР, МВ и ВР относятся а виду Ме^сИтко^ча ри1сЬетта.

Штамм ВС по отсутствию полового процесса относится к несовершенным дрожжам.

Из пяти подгрупп, относящихся к несовершенным дрожжам, приведенным И.П. Бабьевой и В.И. Голубевым (1979) штамм ВС относится к подгруппе дрожжей, для которых характерно многостороннее почкование, а по форме клеток, цвету колоний, способности сбраживать сахара, ассимилировать инозит - к роду СгурЮсоссиБ.

Видовая принадлежность выделенных нами штаммов и отнесенных к видам Л^всЬткоут рикЬегпта, Сгур1:ососси5 АауеБсепэ, Напзетазрога иуагит подтверждена идентификацией, проведенной во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Штаммам присвоены коллекционные номера: Ме15с11тколУ1а ри1сЬегпта (А) - У-3147, Metschnikowia ри1сЬетта (МБ) — У-3146, Metschnikowia рикЬетта (МР) — У-3152, Ме15сЬтко\у1а ри1сЬетта (ВР) - У-З151, Metschnikowia ри1сЬегпта (ДГ) - У-3148, СгурШсоссиэ АауеБсепБ (ВС) - У-3149, НапБешазрога иуагит (Е)-У-3150.

2.2.2. Химический состав и питательная ценность зеленой массы горца сахалинского в условиях Северной Осетии

Вид и количество применяемых субстратов определяют в каждом конкретном случае с учетом физиологических особенностей выращиваемой культуры и цели культивирования. Причем, если в лабораторных условиях нередко выращивают микроорганизмы на синтетических питательных средах строго определенного состава, то в промышленности часто используют более дешевые натуральные виды сырья. Вопросы рационального использования сырья, его удешевления и повышения качества имеют особое значение для микробиологической промышленности. Одним из путей решения сырьевой проблемы является поиск новых, нетрадиционных источников сырья.

В данной работе изучена возможность использования зеленой массы горца сахалинского в качестве сырья для получения микробной биомассы. Выбор, сделанный нами в пользу горца сахалинского был неслучайным. Он основан на изучении химического состава, урожайности многих кормовых растений. По данным Б.Г. Цугкиева и А.И. Тютюнникова (1995) горец сахалинский даёт высокий урожай (до 1500 ц/га) за два укоса зеленной массы при высоком содержании питательных веществ.

Таблица 4

Химический состав горца сахалинского_

Показатель Фазы развития растения

до бутонизации бутонизация цветение

Сухое вещество, % 18,18 ±0,023 24,94 ±0,161 26,59 ± 0,223

Сырой протеин, % 2,65 ±0,018 1,83 ±0,036 1,06 ±0,0208

Сырой жир, % 1,906 ±0,02 0,616 ±0,013 0,41 ±0,0114

Сырая клетчатка, % 5,04 ± 0,05 9,7 ± 0,033 10,76 ±0,0507

Сырая зола, % 1,33 ±0,01 1,26 ±0,0076 1,22 ±0,0135

БЭВ, % 7,25 ± 0,07 11,54 ±0,355 13,14 ± 0,158

Са, % 0,202 ± 0,001 0,27 ±0,001 0,33 ± 0,0065

Р,% 0,144 ±0,002 0,11 ±0,006 0,1 ±0,007

Ре, мг/кг 454,8 ± 9,54 155,2 ±3,699 202,24 ±7,611

Си, мг/кг 5,4 ± 0,271 1,64 ±0,07 1,95 ±0,0255

7л\, мг/кг 12,4 ±0,129 11,1 ±0,144 7,6 ±0,144

Мп, мг/кг 30,5 ±0,415 44,75 ±0,129 17,4 ±0,167

В своих исследованиях мы посчитали целесообразным изучить химический состав зеленой массы горца сахалинского, из которой в дальнейшем готовилась питательная среда для культивирования дрожжей.

Как следует из анализа материалов таблицы 4, содержание протеина в зеленой массе горца сахалинского до бутонизации составило, в среднем 2,65 %. Однако его содержание во время бутонизации снижается (1,83 %), а в момент цветения растения содержание протеина в растении становится минимальным. Это связано с увеличением к концу вегетативного периода темпа накопления других составных частей растений, таких, как клетчатка и углеводы. Процентное соотношение протеина соответственно уменьшается.

Количество клетчатки увеличивается к концу вегетации (до бутонизации — 5,04%, в фазе цветения - 10,76 %). Это можно объяснить тем, что к более поздним фазам развития максимально накапливается количество сухого вещества, значительную часть которого составляет клетчатка.

Изучение содержания золы в зеленой массе горца сахалинского показало, что наибольшее количество минеральных элементов содержится в ней на ранних фазах развития (таблица 4). Это связано с тем, что по мере нарастания биомассы растений в ней идёт образование малозольных элементов (углеводов, крахмала и т.д.), и на более поздних фазах развития эти органические соединения занимают соответственно большее процентное соотношение в общей биомассе растений.

В накоплении Са прослеживается следующая закономерность: содержание его в фазе цветения повышается до 0,33 %, по сравнению с фазой стеблевания, до бутонизации, когда содержание кальция было равно 0,202 %. Такое увеличение, по нашему мнению, вполне закономерно, так как кальций и его соединения входят в состав формообразующих скелетных элементов растительной ткани, формирующихся в основном на более поздних фазах развития растений.

Содержание фосфора, напротив, несколько уменьшается к концу цветения: от 0,144 до 0,1 %. Это можно объяснить тем, что к концу вегетативного периода значительно сокращаются процессы дыхания, синтеза и обмена углеводов, в которых фосфор, в виде различных соединений фосфорной кислоты, играет большую физиологическую роль.

Известно, что минеральные вещества необходимы для построения тканей и многих физиологически важных веществ. Из микроэлементов в зеленой массе горца сахалинского наибольшим количеством представлено железо (Ре). Концентрация железа в зеленой массе горца существенно снижается по мере старения растения. Содержание железа в растениях по литературным данным колеблется от 17,5 до 1823,6 мг/кг, а по нашим данным содержание железа в зеленой массе горца сахалинского, в зависимости от фазы развития растения, колеблется от 155,2 ± 3,699 до 454,8 ± 9,54 мг/кг.

Медь (Си) широко представлена в различных растениях и содержится в них как в свободном, так и в связанном виде. Медь входит в состав

медьсодержащих белков и ферментов растительных кормов. Как видно из таблицы 4 содержание меди в горце сахалинском до бутонизации растения максимально (5,4 мг/кг); в фазе цветения растения оно значительно ниже (1,95 мг/кг).

Микроэлемент цинк (гп) содержится как атом в молекуле ряда ферментов и ферменты нуждаются в его присутствии, поэтому биологическая роль цинка достаточно велика. Цинк играет существенную роль в формировании репродуктивных органов растения. При его недостатке у растений не образуются семена. Известно также, что цинк повышает устойчивость растений к грибковым и бактериальным заболеваниям. По литературным данным, содержание цинка в зеленой массе растений колеблется от 0,55 до 34,0 мг/кг.

В зеленой массе горца сахалинского, как это показано в таблице 4, во время стеблевания растения, до бутонизации, содержание цинка составляет 12,4 мг/кг, снижаясь в фазе бутонизации до 11,1 мг/кг, а в фазе цветения - до 7,6 мг/кг.

По литературным данным известно, что марганец (Мп) активирует функции многих ферментов и принимает участие в процессах окисления питательных веществ кормов. Марганец входит как структурная единица в состав ферментов, а также участвует в синтезе аскорбиновой кислоты в растениях. Содержание Мп в растениях колеблется от 13,2 до 114,8 мг/кг. Повышенное содержание марганца в зеленой массе растений, сопровождается повышенным содержанием в ней витамина С.

Максимальное содержание марганца в зеленой массе горца сахалинского нами установлено в фазе бутонизации растения (44,74 мг/кг), а минимальное — во время цветения (17,4 мг/кг).

2.2.3. Технология приготовления питательной среды для выращивания

биомассы дрожжей на основе зеленой массы горца сахалинского

Задача, которую мы поставили перед собой при разработке питательной среды состояла в том, чтобы, зная оптимальную потребность дрожжей в различных неорганических элементах и других питательных веществах, снабдить ими дрожжи в достаточном количестве для получения заданного выхода.

Нами была разработана технологическая схема производства питательной среды на основе горца сахалинского, которая включает в себя выполнение следующих операций (рисунок 2).

Технологический процесс начинается с операций высушивания и измельчения. Необходимость данных действий обусловлена во — первых удобством хранения сырья в высушенном состоянии, во — вторых измельчение сырья до нужного для ферментации размера частиц возможно только в высушенном состоянии.

Рис. 2. Технологическая схема производства питательной среды на основе горца сахалинского

Высушенное и измельченное сырье из горца сахалинского для экстрагирования питательных веществ смешивается с водой в соотношении 80-100 г на 1 л воды и автоклавируется 30 мин. при 0,5 атм. Данное соотношение было выбрано после серии предварительных опытов как наиболее оптимальное для получения питательной среды. Далее анализируется состав полученной водной вытяжки для того, чтобы определить состав и сумму недостающих компонентов.

Из углеводов дрожжи Ме1зсЬшсоут ри1сЬегпта могут использовать глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу и галактозу. Этих, усвояемых дрожжами углеводов, в питательной среде содержится недостаточно для того, чтобы удовлетворить потребность в них дрожжей. Данную проблему можно решить, если провести гидролиз клетчатки, содержание которой в горце сахалинском достигает 10,76 %.

В процессе кислотного гидролиза, кроме веществ, нужных для выращивания дрожжей образуются вещества, тормозящие размножение дрожжей. К ним относятся фурфурол, оксиметилфурфурол, уроновые

кислоты, коллоидные вещества. Поэтому первоочередной задачей гидролиза является получение гидролизата с минимальным содержанием вредных примесей.

Для получения биологически доброкачественного сахаросодержащего раствора мы решили использовать ферментативный гидролиз с использованием ферментного препарата целловиридин Г20х. Данный ферментный препарат используется в животноводстве и птицеводстве для повышения питательной ценности кормов с высоким содержанием целлюлозы и других труднодоступных полисахаридов. Целловиридин Г20х — это комплексный ферментный препарат целлюлолитического действия, продуцируемый микробной культурой ТгШос1егта гееБек Катализирует расщепление целлюлозы, гемицеллюлозы, пектиновых веществ до моносахаридов.

Нами также была разработана методика проведения ферментативного гидролиза клетчатки, содержащейся в сухом веществе горца сахалинского, с целью повышения содержания моносахаридов и дисахаридов в питательной среде (таблица 5).

Таблица 5

Методика проведения ферментативного гидролиза_

Название операции: Норма

Измельчение диаметр частиц 0,5-1 мм

Автоклавирование 0,5 атм, ЗОмин.

Дозировка фермента 0,5 %

Условия ферментации:

рН среды 5-6

температура 45-50 °С

В результате проведения ферментативного гидролиза содержание РВ в питательной среде возрастает до 7 %.

2.2.4. Получение микробной биомассы на питательной среде их горца сахалинского

Изучение зависимости жизнедеятельности микробных клеток от конкретных условий окружающей среды позволяет направленно регулировать рост, развитие и обмен веществ микроорганизмов. Поддерживая определенные условия культивирования, можно управлять ходом ферментационного процесса, получать биомассу заданного состава. Особенно большое влияние на растущую микробную популяцию оказывают такие факторы среды, как состав и концентрация субстрата (прежде всего в отношении источников азота и углерода), температура культивирования, парциальное давление кислорода, биостимуляторы.

Задавшись целью разработать процесс получения на среде из горца сахалинского белкового продукта, мы остановили свой выбор на нескольких

штаммах дрожжей вида М^всИшсоут ри1сЬегпта (штаммы: А, ДГ, МР, МВ, ВР).

Получение микробной биомассы осуществлялось нами в несколько стадий:

- первая стадия: культуру дрожжей стерильно переносили петлей со скошенного сусло-агара в 10 пробирок, закрытых ватными пробками, и помещали в термостат на 36-48 часов при температуре 28—30°С;

- вторая стадия: образовавшуюся на скошенной поверхности сусло-агара в пробирке дрожжевую массу снимали петлей и переносили из пробирки в колбу с 50 мл сусла при строгом соблюдении правил стерильности проведения микробиологических работ и техники пересевов. Продолжительность роста дрожжей на сусле в колбах на качалке (при 180— 200 об/мин) 16-24 часа при температуре 28-30°С; количество пробирок с чистой культурой дрожжей первой стадии зависит от используемого количества питательной среды;

- третья стадия: по окончании срока размножения отбирали из колб стерильной пипеткой суспензию дрожжей для проверки чистоты культуры, после чего дрожжевую суспензию-закваску вносили в ферментер.

На скорость накопления биомассы дрожжей прежде всего влияет концентрация сахара в субстрате и количество взятых на засев дрожжей.

По литературным данным (А.А Андреев, Л.Н. Брызгалов, 1986) известно, что в промышленных условиях при высоком (более 1,7 %) содержании РВ, выращивание дрожжей идет замедленно с неполной утилизацией углеводов. Однако, научные работы, проведенные в лабораторных условиях, показывают, что концентрация сахара в перерабатываемой среде, а, следовательно, начальная концентрация его в субстрате может быть значительно увеличена, но при этом дрожжи следует обеспечить достаточным количеством растворенного кислорода.

Зависимость накопления микробной биомассы в среде от концентрации РВ мы изучали в следующих условиях эксперимента: температура культивирования - 28°С, исходный рН среды - 5,5, концентрация РВ в питательной среде - 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 7,5 %, посевной материал вносили в среду в виде суспензии в количестве 3 % от РВ. Результаты культивирования приведены в таблице 6.

В результате анализа полученных данных мы пришли к выводу о внутривидовой вариабельности штаммов дрожжей вида Ме18сЬшсо\у1а ри1сЬегпта по продуктивности. Наилучший выход биомассы отмечен у штаммов ДГ и А (12,7 и 12,6 г/л), что составляет 50,8 % и 50,4 % от РВ. Наименьший выход биомассы определен у штамма ВР — 11,9 г/л, что составляет 47,6 % от РВ. Оптимальный диапазон концентрации сахара лежит в пределах 3,5—5,5 %.

Таблица 6

Накопление биомассы местными штаммами дрожжей вида Ме15сЬшсо\у1а ри1сЬетша

Концентрация сахара в среде, % Испытуемый штамм дрожжей

ДГ А ВР МВ МР

Накопление АСД, г/л

2,5 12.7 12,6 11,9 12,2 12,2

±0,021 ±0,010 ± 0,020 ± 0,039 ± 0,038

3,5 16,6 16,5 14,9 15,0 15,3

±0,019 ±0,011 ± 0,035 ± 0,073 ±0,017

4,5 17,9 ± 0,032 17,70 ±0,011 16,2 ±0,178 16,4 ± 0,022 16,5 ± 0,038

5,5 18,7 18,5 17,0 17,5 17,6

±0,016 ±0,017 ±0,158 ±0,014 ±0,015

7,5 18,5 18,2 16,6 17,0 17,2

±0,012 ± 0,030 ± 0,054 ±0,137 ±0,014

При проведении периодического процесса культивирования большое значение имеет установление оптимального количества посевного материала. Известно, что при увеличении его до определенного предела сокращаются лаг-фаза и период культивирования. Это приводит к повышению производительности процесса. Количественные характеристики носят индивидуальный характер: зависят от природы субстрата и особенностей продуцента.

Нами изучено влияние количества засевных дрожжей на эффективность образования биомассы при культивировании дрожжей вида Ме18сЬшсо\т ри1сЬегпта (штамм ДГ) в следующих условиях эксперимента: среда на основе горца сахалинского с концентрацией РВ 3 %, температура 28°С, исходный рН 5,5. Посевной материал вносили в среду в количестве 2,5; 5; 10; 15 и 25 % от РВ (таблица 7).

Таблица 7

Влияние количества посевного материала на рост дрожжей

вида Ме15сЬтсоуу1а ри1сЬетта (штамм ДГ)_

Инокулят, % от РВ Прирост биомассы Продолжительность культивирования,ч Количество используемых РВ, %

гАСД/л %

2,5 4,2 ±0,16 560 12 75

5,0 7,3 ±0,127 486,6 10 87

10,0 9,1 ±0,079 303 10 87

15,0 9,5 ± 0,092 211 8 89

20,0 10,7 ±0,181 178 7 90

25,0 12,1 ±0,132 161 7 90

Из анализа данных таблицы 7 следует, что по мере увеличения количества посевного материала сокращается время утилизации РВ и повышается эффективность ее использования на образование биомассы. Наибольший прирост биомассы за период ферментации (в процентах от внесенных дрожжей) обнаружен при небольших количествах инокулята.

Таким образом, выбор оптимального количества посевного материала определяется целью ферментационного процесса. По мере увеличения процента вносимого посевного материала, при прочих равных условиях, возрастает скорость утилизации РВ, это приводит к сокращению периода ферментации.

При культивировании дрожжей в производственных условиях, как правило, используют 10-20 % инокулята от объема питательный среды, что позволяет избежать контаминации среды посторонней микрофлорой и в то же время обеспечивает достаточно высокую эффективность использования РВ на образование биомассы.

Одним из основных показателей полноценности микробной биомассы является содержание в ней азота. В таблице 8 и рисунке 3 приведены данные, полученные при определении общего азота и условного белка в биомассе дрожжей вида Ме18сИтсолу1а рикИетта, культивируемых на питательной среде из горца сахалинского.

Таблица 8

Содержание общего азота и условного белка в дрожжах Ме^сЬшсо^па

рикИегпта

Штамм дрожжей Общий азот, % Условный белок, (N x 6,25), %

MB 7,25 ±0,0127 45,31

MP 7,53 ±0,0141 47,06

A 7,75 ± 0,0304 48,44

ДГ 8,23 ±0,0162 51,44

BP 8,15 ±0,0177 50,90

Содержание общего азота в исследованных штаммах варьирует, достигая своего максимального значения в биомассе дрожжей Metschnicowia pulcherrima, штамм ДГ — 8,23 %. Для сравнения приведем данные А.К. Саксе и В.И. Кудрявцева (1972) по содержанию общего азота в некоторых дрожжах в подобных условиях эксперимента: Candida utilis — 9,05 %, Candida mycoderma - 6,58 %, Trich. cutaneum M 19 - 8,23 %, Candida tropicalis CK-4 -8,23 %.

Рис. 3. Содержание условного белка в дрожжах Ме18сИшсо\у1а рикЬегпта

В таблице 9 приведены данные по содержанию истинного белка в дрожжах вида Ме1$сЬтсо\т ри1сЬетта. Максимальное содержание истинного белка мы наблюдали у штаммов ДГ, ВР и А. Количество «истинного» белка, определенное по разности общего и небелкового азота, также достаточно стабильно (70—75 % от сырого протеина).

По данным М.В. Залашко и Л.Е. Залашко (1979) содержание истинного белка в дрожжах должно быть не менее 32 %, возможный максимум — 42 %.

Содержание истинного белка в дрожжах

Таблица 9

Штамм Истинный белок, %

МВ 33,53 ±0,06

МР 34,59 ± 0,054

А 35,85 ± 0,07

ДГ 38,58 ±0,06

ВР 37,6 ± 0,04

Дрожжи Ме15сЬшсо\у1а рикЬегпта характеризуются высокой скоростью роста, эффективно используют источники питания, технологичны, т.е. отвечают всем требованиям, предъявляемым к продуцентам белка.

В процессе культивирования дрожжей температура, определяет интенсивность протекания обмена веществ в клетках. Ее влияние отмечают по накоплению биомассы.

Температура среды является фактором, влияние которого на клетку неизбежно, поскольку он определяет скорость клеточных реакций, природу метаболизма, пищевые потребности культуры, состав биомассы (содержание РНК, белка, липидов). Так, содержание РНК в клетках бактерий и дрожжей при изменении температуры по сравнению с оптимальной, может увеличиваться или уменьшаться. В диапазоне температур, лежащих ниже оптимума, скорость роста стремится к нулю, при повышении температуры на 10 °С увеличивается вдвое (С.Дж. Перт, 1978).

Таблица 10

Влияние температуры культивирования на рост дрожжей вида Ме^сИшсо^ча _ри!сЬегпта (штамм ДГ) и содержание клеточного белка_

Температура, °С Продолжительность культивирования ,ч Выход АСД, г/л Использовано РВ,% Сырой протеин,%

18 28 7,5 ±0,061 70 42,3 ±0,17

28 16 8,9 ± 0,07 95 52,4 ±0,12

34 16 8,6 ± 0,079 95 54,6 ± 0,08

В связи с тем, что большинство видов дрожжей являются мезофильными организмами, мы изучали влияние температуры на рост и белоксинтезирующую способность дрожжей вида Ме15с1тюолу1а ри1сЬегпта (штамм ДГ) в температурном интервале 18—34°С. Результаты исследований приведены в таблице 10, из анализа материалов которой следует, что при температурах 28 и 34°С дрожжи используют 95 % РВ питательной среды в течение 16 часов культивирования; при 18°С почти такое же количество биомассы образовывалось за 28 часов с утилизацией 70 % исходных РВ.

Таким образом установлено, что продуктивность штаммов по биомассе заметно снижается при более низких, чем оптимальная, температурах. При повышении температуры на несколько градусов, от оптимальной, этот эффект менее выражен. Данное обстоятельство говорит о целесообразности культивирования дрожжей в производственных условиях при температурах, несколько превышающих оптимальную.

Снижение температуры от оптимума оказывает влияние не только на эффективность образования биомассы, но и, в большей мере, на содержание клеточного белка. При температурах 28 и 34°С дрожжи продуцируют до 54,6 % протеина. При 18°С содержание клеточного белка достигало лишь 42,3 % протеина.

2.2.5. Оценка экономической эффективности использования горца сахалинского для приготовления питательных сред при производстве

дрожжевого белка Очевидно, что изыскание «чистого» сырья, и вместе с тем с низкой себестоимостью, является своевременным и актуальным. Таким сырьем, как

показали проведенные нами исследования, является зеленая масса горца сахалинского, которая отличается сбалансированностью химического состава и питательных веществ, экологической безопасностью и высокой урожайностью.

Таблица 11

Урожайность зеленой массы горца сахалинского и содержание в ней питательных веществ

Год урожая Урожайность, ц/га Содержится в сухом веществе, ц/га

зеленой массы в том числе сухого вещества протеин клетчатка зола жир БЭВ

2003 1500 348,5 27,69 127,5 19,05 14,7 159,6

Как видно из таблицы 11 урожайность горца сахалинского высокая — 1500 ц/га. Она превышает урожайность кукурузы, пшеницы и многих других растений. Урожай зеленой массы горца сахалинского с площади 1 га включает 348,5 ц сухого вещества, в котором содержится, в центнерах: 27,69 - протеина, 127,5 - клетчатки, 19,05 - золы, 14,7 — жира, 159,6 — БЭВ. Из набора и уровня содержания питательных веществ в зеленой массе горца сахалинского следует, что она представляет собой сбалансированное по питательным веществам сырье для приготовления питательной среды, необходимой для культивирования дрожжей.

Наиболее важен для экономики процессов получения микробного белка такой показатель, как эффективность образования биомассы, выражаемая отношением массы выросших клеток к единице массы утилизированного источника углерода. Он зависит не столько от особенностей продуцента, сколько от природы субстрата. Так коэффициент эффективности образования биомассы на метане по данным G. Hamer (1977) равен 0,8, на метаноле — 0,5 (C.L. Соопеу, 1975), на этаноле - 0,7 (E.L. Gaden, 1973).

Нами была определена эффективность образования биомассы дрожжами Metschnicowia pulcherrima на питательной среде из горца сахалинского в следующих условиях эксперимента: РВ 2,5 %, температура 28°С, исходный pH 5,5 (таблица 12).

Для понижения себестоимости дрожжей большое значение имеют: культивирование высокоурожайной культуры дрожжей, каковой является культура дрожжей Metschnicowia pulcherrima.

При переработке 1 т сухой зеленой массы горца сахалинского можно получить 225 кг АСД. По данным A.A. Андреева и Л.Н. Брызгалова (1986) из 1 т абсолютно сухой хвойной древесины можно получить 50—60 кг товарной продукции.

Таблица 12

Эффективность образования биомассы дрожжами М^эсЬшсоут ри1сЬегпта на питательной среде из горца сахалинского

Штамм Выход АСД, г/л Использовано РВ, % Коэффициент эффективности

МБ 12,2 ± 0,04 89 0,548

MP 12,2 ±0,038 89 0,548

BP 11,9 ±0,02 87 0,547

А 12,6 ±0,01 91 0,554

дг 12,7 ± 0,02 91 0,558

Высокая урожайность горца сахалинского, его неприхотливость к условиям возделывания являются основополагающими в решении вопроса о целесообразности использования этой культуры для приготовления питательных сред с целью производства микробной биомассы.

В результате проведенных нами исследований депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов культуры 7 штаммов 3 видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus flavescens, идентифицированных в РСО-Алания.

Установлено, что зеленая масса горца сахалинского является высокоэффективным перспективным сырьем для питательной среды с целью производства микробного белка путем культивирования местных штаммов дрожжей вида Metschnikowia pulcherrima.

Выводы

1. Выделены, идентифицированы из природных биоценозов и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов 7 местных штаммов 3 видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus flavescens, Hanseniaspora uvarum.

2. Изучены морфологические, биохимические и культуральные свойства дрожжей Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus flavescens, Hanseniaspora uvarum.

3. Изучен химический состав зеленой массы горца сахалинского в зависимости от фаз развития растения, которая содержит в своем составе, в среднем: сухого вещества - 23,24 %, протеина - 1,85 %, жира - 0,98 %, клетчатки - 8,5 %, золы - 1,27 %, БЭВ - 10,64 %.

4. Разработана технология культивирования местных штаммов дрожжей на питательной среде из зеленой массы горца сахалинского. Наиболее перспективными продуцентами биомассы на питательной среде из горца сахалинского признаны дрожжи вида Metschnicowia pulcherrima, обеспечивающие выход 225 г АСД из 1 кг сухой массы горца сахалинского, или 7,84 т АСД из урожая данного растения с площади 1 га.

5. Установлена зависимость накопления микробной биомассы на среде из зеленой массы горца сахалинского от концентрации РВ. Исследования показали, что оптимальный диапазон концентрации сахара для культивирования дрожжей на данной питательной среде находится в пределах 3,5-5,5 %.

6. Определено влияние количества засевных дрожжей на эффективность образования биомассы при культивировании дрожжей рода Ме^сЬшсоиаа. Наибольший прирост биомассы за период ферментации (в процентах от внесенных дрожжей) установлено при небольших количествах инокулята (2,5 % от РВ).

7. Изучено влияние температуры культивирования на образование биомассы и белоксинтезирующую способность дрожжей вида М^эсИтсоут ри1сЬегпта. Продуктивность штаммов по биомассе заметно снижается при более низких, чем оптимальная, температурах. Снижение температуры от оптимума в большей мере оказывает отрицательное влияние на содержание клеточного белка в биомассе. При температурах 28 и 34°С дрожжи продуцируют до 54,6 % протеина в составе биомассы, а при температуре 18°С-всего 42,3%.

8. Выход сухого вещества зеленой массы горца сахалинского с площади в 1 га плантации составляет 34,85 тонн, в которых содержится: протеина — 2,77 т; клетчатки - 12,75 т; золы - 1,9 т; жира - 1,47 т; БЭВ - 15,96 т. С учетом того, что горец сахалинский на одном участке может произрастать без пересадки более 30 лет и обеспечивает значительный вынос питательных веществ, в том числе и легко усваиваемых микроорганизмами, данное растение является перспективным как основной субстрат для производства микробной биомассы.

Предложения производству

1. Штаммы дрожжей вида Ме1$сЬтсо\у1а ри1сЬегпта, выделенные из природных биоценозов в Северной Осетии, целесообразно использовать в микробиологической промышленности, как продуцентов белка.

2. Исходя из химического состава и наличия питательных веществ в зеленой массе, высокой урожайности и длительности возделывания на одном участке рекомендуем использовать зеленую массу горца сахалинского как сырье для производства микробного белка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цугкиев Б.Г., Гагиева Л.Ч., Кабулова М.Ю., Цугкиева Е.Б. Изучение горца сахалинского в качестве сорбента свинца // Материалы I региональной конференции студентов и молодых ученых «Экологическая безопасность юга России». — Владикавказ, 2002. — С. 59.

2. Цугкиев Б.Г., Кабулова М.Ю. Горец сахалинский — высокопродуктивная сельскохозяйственная культура // Материалы I региональной конференции

студентов и молодых ученых «Экологическая безопасность юга России». — Владикавказ, 2002. - С. 62.

3. Цугкиев Б.Г., Кабулова М.Ю. Представители семейства гречишные -перспективные кормовые культуры // Вестник научных трудов молодых ученых Горского государственного аграрного университета. - 2003. — Вып. 1.-С. 52-53.

4. Кабулова М.Ю., Цугкиев Б.Г. Изучение возможности культивирования дрожжей ЗассЬаготусез сегеу!зте на питательной среде из горца сахалинского // Матариалы Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летнему юбилею Горского ГАУ // Современные проблемы формирования стратегии устойчивого развития регионального АПК. - Владикавказ, 2003. - С. 101-102.

5. Кабулова М.Ю., Цугкиев Б.Г. О культивировании дрожжей на среде из горца сахалинского // Вестник научных трудов молодых ученых Горского государственного аграрного университета. — 2004. — Вып. 2. - С. 55-57.

6. Гревцова С.А., Кабулова М.Ю. Сезонные колебания кальция и фосфора в гречихе сахалинской // Известия ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет». — 2005. — Т. 42. — С. 42-43.

7. Цугкиев Б.Г., Басаев Т.Б., Гагиева Л.Ч., Цугкиева В.Б., Кияшкина Л.А., Кабулова М. Ю. Стратегия экологизации земледелия в Северной Осетии // Известия ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет». -2005. - Т. 42. - С. 59-60.

8. Цугкиев Б.Г., Басаев Т.Б., Гагиева Л.Ч., Цугкиева В.Б., Кияшкина Л.А., Кабулова М.Ю. Экологические способы нейтрализации тяжелых металлов в почве // Земледелие. - 2004. -№ 1. - С. 15.

Сдано в набор 11.11.2006 г., подписано в печать 22.11.2006 г.

Гарнитура Тайме. Печать трафаретная. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 189.

Типография ООО НПКП «МАВР», Лицензия Серия ПД № 01107, 362040, г. Владикавказ, ул. Августовских событий, 8, тел. 44-19-31

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кабулова, Марина Юрьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Микроорганизмы - продуценты белка.

1.2 Микробные продукты и субстраты для их получения.

1.3 Представители семейства гречишные как источники сред для получения кормового белка.

1.4. Факторы, влияющие на синтез и секрецию белков дрожжами.

2. Собственные исследования.

2.1. Материал и методы исследования.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Выделение и идентификация дрожжей из дрожжесодержащих материалов.

2.2.2. Химический состав и питательная ценность зеленой массы горца сахалинского в условиях Северной Осетии.

2.2.3. Технология приготовления питательной среды на основе горца сахалинского.

2.2.4. Получение микробной биомассы на питательной среде их горца сахалинского.

2.2.5. Оценка экономической эффективности использования горца сахалинского для приготовления питательных сред при производстве дрожжевого белка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование дрожжей местной селекции для производства микробного белка на питательной среде из горца сахалинского"

Культивирование микроорганизмов с целью получения питательных веществ для человека и животных представляет собой пример раннего и актуального до сих пор внедрения в промышленное производство методов биотехнологии.

Необходимость использования данных биотехнологических процессов определяется остротой насущных проблем современности: экологической, продовольственной, энергетической. Очевидна целесообразность применения в пищу веществ, имеющих постоянный состав и высокую биологическую ценность, которые можно получать в строго контролируемых условиях. Однако потенциал этой отрасли производства еще далеко не исчерпан. Ее развитие лимитируется, главным образом, экономическими факторами: стоимость получения микробных продуктов, не уступающих по питательной ценности традиционным, зачастую превышает таковую натуральной сельскохозяйственной продукции. Фактор флуктуации стоимости соевых бобов - альтернативного источника кормового белка - вместе с относительно высокой ценой на большинство субстратов для микробного синтеза делают производство микробной биомассы (так называемого белка одноклеточных), как правило, рискованным. Но, тем не менее, на разработку технологий получения микробных белков в течение последних нескольких десятилетий направлены значительные усилия исследователей.

Существует много микроорганизмов, которые превращают неорганический азот в органическую форму за счет различных источников энергии.

Микроорганизмы очень быстро растут. Поросенок или цыпленок могут удваивать вес за 1 месяц, а дрожжевая клетка за 3 часа. Причем около половины микробной клетки, растущей при соответствующих условиях, состоит из белка. Высокие скорости синтеза белка микробной системой составляют самое большое преимущество в сравнении с традиционным сельским хозяйством.

Микроорганизмы можно выращивать на дешевом, непищевом субстрате, каким служат клетчатка, метанол, водород и др. Биомасса может быть источником белков, липидов, полисахаридов, витаминов, каратиноидов.

Изучена способность продуцировать клеточные белки водорослей, дрожжей, грибов, бактерий. Однако в соответствии с комплексом требований, предъявляемых к микроорганизмам-продуцентам (высокая скорость роста, устойчивость к инфекциям, легкая осаждаемость, эффективность утилизации источников энергии, высокое качество белка), наибольшим потенциалом, по-видимому, обладают дрожжи. Эта группа микроорганизмов используется для получения целых клеток (корма, пища), макрокомпонентов (белки, липиды, ферменты, нуклеиновые кислоты), экстрагируемых соединений (коферменты, витамины), продуктов деструкции (аминокислоты, нуклеотиды), продуктов метаболизма клеток (этанол, глицерин, углекислота, органические кислоты и др.).

В сравнении с любыми другими микроорганизмами дрожжи играют значительную роль в пищевой промышленности. В последние годы производство дрожжевых продуктов расширилось в результате внедрения новых продуцентов ценных веществ, при культивировании их на дешевом сырье.

Дрожжи очень широко распространены в природе и в окружающей человека среде. Они активно размножаются в тех субстратах, где имеются доступные растворимые источники углерода - простые сахара, спирты, органические кислоты, т.е. в соках, сиропах, на плодах, в нектаре цветов, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в воде и почве.

Известно достаточно фактических данных о положительном влиянии дрожжей на нормофлору кишечника. Дрожжи обогащают ферментируемый субстрат незаменимыми аминокислотами, витаминами, органическими кислотами и другими биологически активными веществами, а клеточные стенки дрожжей, содержащие полимеры глюкозы и маннозы, обладают лакто и бифидогенными, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры, выводят оттуда патогенные бактерии и их токсины.

Исходя из изложенного, актуальность выделения и изучения новых, высокопродуктивных штаммов разных видов дрожжей и изыскание новых источников субстрата для их культивирования очевидна, а само направление исследований - перспективно.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось выделение из различных природных источников и идентификация штаммов местных видов дрожжей; разработка технологии их выращивания на питательной среде из горца сахалинского (Poligonum sachalinense Fr. Schmidt) для получения микробной биомассы.

В соответствии с поставленной целью были определены задачи:

- выделить из природных микробиоценозов высокопродуктивные штаммы дрожжей, способных расти на растительных субстратах;

- идентифицировать видовую принадлежность выделенных штаммов дрожжей и изучить их характеристики;

- изучить химический состав горца сахалинского;

- разработать технологию производства питательной среды на основе зеленой массы горца сахалинского;

- подобрать оптимальный состав питательных сред для максимального накопления биомассы выделенными местными штаммами идентифицированных видов дрожжей;

- определить уровень белка в биомассе местных штаммов идентифицированных видов дрожжей;

- изучить влияние температуры культивирования на рост и содержание клеточного белка в дрожжах;

- установить влияние объема посевного материала на рост дрожжей рода Metschnikowia;

- подобрать оптимальные режимы культивирования местных штаммов идентифицированных видов дрожжей.

Научная новизна работы:

- впервые в условиях РСО-Алания выделены и идентифицированы местные штаммы разных видов дрожжей и изучены их видовые характеристики;

- показана возможность эффективного использования зеленой массы горца сахалинского в качестве растительного сырья для питательной среды с целью получения биомассы дрожжей;

- установлена перспективность использования для получения микробной биомассы на питательной среде из зеленой массы горца сахалинского местных штаммов дрожжей рода Metschnikowia, способных интенсивно накапливать биомассу;

- впервые во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) задепонированы культуры 7 штаммов 3 видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus flavescens, идентифицированных в РСО-Алания.

Практическая значимость работы:

- получены местные штаммы дрожжей рода Metschnikowia, обладающие высокой продуктивностью и скоростью роста на среде из горца сахалинского;

- разработана технология производства питательной среды на основе нетрадиционного растительного сырья - горца сахалинского, интродуцированного в республику с о. Сахалин, урожайность зеленой массы которого в агроклиматических условиях Северной Осетии составляет до 1500 ц/га;

- установлена экономическая эффективность использования для культивирования дрожжей питательной среды из горца сахалинского, по сравнению с другими видами сырья растительного происхождения.

Положения выносимые на защиту:

1. Морфологические, биохимические и культуральные свойства, идентифицированных местных штаммов видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus flavescens.

2. Показатели химического состава зеленой массы горца сахалинского в условиях РСО-Алания.

3. Технология приготовления питательной среды для производства биомассы микроорганизмов на основе зеленой массы горца сахалинского.

4. Технологические свойства местных штаммов дрожжей вида Metschnikowia pulcherrima.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной научно - практической конференции «Современные проблемы формирования стратегии устойчивого развития регионального АПК» (Владикавказ, 2003), а также на научных конференциях Горского ГАУ в 2003 -2006 гг.

Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Кабулова, Марина Юрьевна

1. Выделены, идентифицированы из природных биоценозов и

депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов

7 местных штаммов 3 видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus

flavescens, Hanseniaspora uvarum. 2. Изучены морфологические, биохимические и культуральные свойства

дрожжей Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus flavescens, Hanseniaspora

3. Изучен химический состав зеленой массы горца сахалинского в

зависимости от фаз развития растения, которая содержит в своем составе, в

среднем: сухого вещества - 23,24 %, протеина - 1,85 %, жира - 0,98 %,

клетчатки - 8,5 %, золы - 1,27 %, БЭВ - 10,64 %. 4. Разработана технология культивирования местных штаммов дрожжей на

питательной среде из зеленой массы горца сахалинского. Наиболее

перспективными продуцентами биомассы на питательной среде из горца

сахалинского признаны дрожжи вида Metschnicowia pulcherrima,

обеспечиваюгцие выход 225 г АСД из 1 кг сухой массы горца сахалинского, или

7,84 т АСД из урожая данного растения с площади в 1 га. 5. Установлена зависимость накопления микробной биомассы на среде из

зеленой массы горца сахалинского от концентрации РВ. Исследования

показали, что оптимальный диапазоп концентрации сахара для

культивирования дрожжей на данной питательной среде находится в пределах

3,5-5,5 %. 6. Определено влияние количества засевных дрожжей на эффективность

образования биомассы при культивировании дрожжей рода Metschnicowia. Наибольший прирост биомассы за период ферментации (в процентах от

внесенных дрожжей) установлено при небольших количествах инокулята (2,5

% от РВ). 7. Изучено влияние температуры культивирования на образование

биомассы и белоксинтезируюн];ую способность дрожжей вида Metschnicowia

pulcherrima. Продуктивность штаммов по биомассе заметно снижается при

более низких, чем оптимальная, температурах. Снижепие температуры от

оптимума в большей мере оказывает отрицательное влияние на содержание

всего 42,3 %. 8. Выход сухого веп],ества зеленой массы горца сахалинского с плош;ади в 1

га плантации составляет 34,85 тонн, в которых содержится: протеина - 2,77 т;

клетчатки - 12,75 т; золы - 1,9 т; жира - 1,47 т; БЭВ - 15,96т. С учетом того,

что горец сахалинский на одном участке может произрастать без пересадки

более 30 лет и обеспечивает значительный вынос питательных веш,еств, в том

числе и легко усваиваемых микроорганизмами, данное растение является

перспективным как основной субстрат для производства микробной биомассы. Предложения производству:

1. Штаммы дрожжей вида Metschnicowia pulcherrima, выделенные из

природных биоценозов в Северной Осетии, целесообразно использовать в

микробиологической промышленности, как продуцентов белка. 2. Исходя из химического состава и наличия питательных веществ в

зеленой массе, высокой урожайности и длительности возделывания на одном

участке рекомендуем использовать зеленую массу горца сахалинского как

сырье для нроизводства микробного белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кабулова, Марина Юрьевна, Владикавказ

1. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для анализа 18S РНК1.. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

2. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для анализа 18S РНК1.. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

3. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

4. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для анализа 18S РНК1.. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

5. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для анализа 18S РНК1.. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

6. Рассев культуры заказчика до отдельных колоний и получение биомассы для анализа 18S РЖ

7. Выделение ДНК. (Genomic DNA Purification Kit)

8. Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky, Thomas J. White. PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic press, INC. 1990.