Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование секреторных векторов дрожжей S. cerevisiae на основе сигнальной последовательности гена MFL1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование секреторных векторов дрожжей S. cerevisiae на основе сигнальной последовательности гена MFL1"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ км. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

УДК 577.21

КЛРПЫЧЕВ Игорь Викторович

КОНСТРУИРОВАНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ ВЕКТОРОВ ДРОГПЖИ Б. СЕЯЕ7131АЕ НА ОСНОЕЕ СИГНАЛЬНОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА МРа1

03.00.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990 г.

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук,"профессор, член-корр. ВАСХНИЛ

К.Г.Скрябин кандидат биологических наук Ы.А.Эльдаров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук С.В.Манко кандидат биологических наук В.С.Прасолов.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт цитологии АН СССР.

Защита состоится "Л9" КС^Ъ^ 1990 в /у часов на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 11795 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан " "/' Л 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы - Развитие методов генетической инженерии и молекулярной биологии, накопление данных о клонировании и экспрессии генов позволяет успешно решать задачи получения в клетках белков и пептидов, важных как для фундаментальных исследований, так и необходимых в народном хозяйстве. В настоящее время одним из популярных объектов для получения методами генетической инженерии целевых белков и пептидов стали дрожжи s.cerevisiae. Возможность получения продукта в секретируемой форме является одной из немаловажных причин этой популярности. Преимущества такого подхода определяются несколькими обстоятельствами.

Во-первых, получение белка в секретируемом виде существенно упрощает и удешевляет процедуры выделения и очистки рекомбинантных белков. Кроме того, белок, находящийся в культуральной жидкости, не подвергается воздействию клеточных протеаз.

При экспрессии целого ряда белков млекопитающих в клетках E.coii возникают т.н. тельца включения, содержащие продукт в нерастворимом виде. Ясно, что накопление больших количеств чужеродных белков в цитоплазме влияет на жизнеспособность клетки, вследствие этого увеличивается вероятность потери или перестройки рекомбинантной плазмиды, направляющей экспрессию. Выведение белка из клетки через секреторный поток хотя бы частично снимает эти проблемы.

Прохождение белком секреторного пути позволяет получать целевой продукт в зрелой, биологически активной форме: обеспечивается правильное сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и образование дисульфидных связей, продукт подвергается посттрансляционным модификациям (гликозилирование и протеолитический процессинг). Таким образом, секреция гетерологичных белков позволяет разрешить ряд проблем, возникающих при создании штаммов-продуцентов целевых белков.

К настоящему времени созданы штаммы-продуценты дрожжей s.cerevis1аэ, секретирунцие гетерологичные белки в культуральную жидкость. Спектр этих белков довольно широк и включает в себя

различные ферменты, гормоны, факторы роста, лимфокины и другие белки и пептиды. Наиболее широко для дрожжей S.cerevisiâe применяется система экспрессии/секреции на основе пре-про-сегмента а-фактора. Число гетерологичных белков, секрецию которых в этом случае удалось показать, приближается к нескольким десяткам. Использование пре-про-сегмента гена MFai в большинстве случаев обеспечивает высокие уровни секреции целевого продукта.

Цель работы. 1. Клонирование генов MFai, gpdi и ADH2 S.cerevisiâe. 2. СоЗДЗНИв ДрОЖЖвВЫХ СекрвТОрНЫХ ВвКТОрОВ На

основе регуляторных последовательностей клонированных генов и прв-про-последовательности а-фактора. 3. Получение штаммов дрожжей, секретирующих в культуральную среду гормон роста человека, эпидермальный фактор роста человека, натрийуретический фактор человека и кальцитонин человека.

Научная новизна и практическая ценность работы• Клонированы фрагменты генов S.cerevisiâe MFal, GPD1 и ADH2. СОЗДЭНО семейство секреторных векторов дрожжей на основе промоторов клонированных генов и пре-про-последовательности «-фактора. Созданы штаммы дрожжей, с высокой эффективностью секретирующие гормон роста человека в культуральную среду. Определена зависимость эффективности секреции гормона роста под контролем различных промоторов от концентрации и типа источника углерода в среде роста. Получены штаммы дрожжей, секретирующие в культуральную жидкость эпидермальный фактор роста человека, натрийуретический фактор человека и кальцитонин человека. Разработан метод быстрого выделения плазмидной ДНК из е.coü для секвенирования по методу Сэнгера.

Результаты данной работы составляют основу для прикладных разработок по секреции гетерологичных белков дрожжами s.cerevisiâe. На основе полученных штаммов дрожжей, секретирующих целевые белки в среду роста, возможно провести технологические разработки промышленных штаммов-продуцентов данных белков.

Апробация работы■ Материалы диссертации были представлены на 9 конференции молодых ученых, Рига, 1987 г.; на 8 двустороннем симпозиуме СССР - Франция "Молекулярная биология генов и нуклеиновых кислот", Москва, 1986 г.; на 4 Международном

конгрессе по клеточной биологии, Монреаль, Канада, 1988 г.; на 14 Международном биохимическом конгрессе, 1988 г.; на 7 симпозиуме СССР - ФРГ "Организация и функционирование эукариотического генома", Гейдельберг, ФРГ, 1987 г.; на 15 Международной конференции по молекулярной биологии и генетике дрожжей, Гаага, Нидерланды, 1990 г.; на семинаре отдела Генетической инженерии ИМБ АН СССР, Москва, 1990 г.

Структура и объем диссертации• Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на страницах, содержит рисунков и библиографический

список из названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Клонирование гена MFal из ограниченной библиотеки генов дрожжей •

Основной задачей данной работы являлось создание семейства векторов экспрессии/секреции дрожжей S.cerevisiae. Данный тип вектора должен иметь в своем составе кассету экспрессии/секреции, содержащую: 1) промотор, 2) последовательность, направляющую секрецию - СП, 3) терминатор транскрипции. В качестве СП нами решено было использовать пре-про-последовательность структурного гена «-фактора MFal (Kurijan et al., 1982). Помимо того, что эта последовательность с высокой эффективностью направляет секрецию гетерологичных продуктов, наличие сайта узнавания рестриктазы HindiII непосредственно перед первым повтором e-фактора должно было существенно упростить последующие генноинженерные манипуляции. Схема конструирования ограниченной библиотеки генов дрожжей и ее скрининга с помощью комплементарного синтетического олигонуклеотида приведена на рис.1. После завершения скрининга методом рестрикционного анализа выяснили, что плазмидная ДНК клона pal содержит вставку ДНК ожидаемой длины. Таким образом была получена рекомбинантная плазмида pal, содержащая EcoRI/HindiII фрагмент гена MFal.

Конструирование векторов экспрессии/секреции, содержащих ген гормона роста человека (hGH) под контролем промотора и пре-про-сегмента a-фактора.

Сначала получали плазмиду pahGH, несущую кассету экспрессии/секреции. Для создания автономнореплицируицегося

брожжеЬая ДНК

EcoRI, Hindill EcoRI, Hindlll Ьыбеление 1250 п.о. фраг.

pUC 19

I

лигиробание, трансформация E.coli

ограниченная библиотека геноб Зрожжей

V

скрининг синтетическим ол и г онукл е от и 8ом

ДНК инбиЬиЭуальных клоноЬ

определение первичной нуклеотибноа послебовательности бстабок

V

ШШ

EcoRI

* Hindlll

Рио.1. Схема конструирования ограниченной библиотеки генов дрожжей и поиска плазмиды pol, содержащей фрагмент гена MFai.

дрожжевого вектора в состав плазмвды pahGH был введен Ecori фрагмент ДНК из плазмвды CV7, содержащий репликатор 2м ДНК дрожжей и селективный ауксотрофный маркер trpi. Полученные в результате клонирования два рекомбинанта, содержащие вышеупомянутый фрагмент ДНК в двух различных ориентациях, были названы YEpaF/hGH - 8 И YEpaF/hGH - 9 (рис.2).

Экспрессия и секреция гормона роста человека штаммами дрожжей. содержащими рекомбинантные плазмиды с кассетами экспрессии на основе промотора и СП гена MFal.

Рекомбинантными плазмидами YEpaF/hGH - 8 и YEpaF/hGH - 9 трансформировали реципиентный штамм дрожжей 20В12 (Jones et al., 1976). Выбор данного штамма определялся следующими обстоятельствами: во-первых, этот штамм несет мутацию по генам клеточных протеаз рер4-з, что, по нашему мнению, должно уменьшать протеолитическую деградацию гетерологичного продукта -hGH, и, во-вторых, единственной ауксотрофной мутацией у этого штамма является мутация в гене trpi, что позволяет культивировать трансформанты на обогащенных средах, содержащих пептон (в некоторых марках пептона почти отсутствует триптофан).

Оба типа трансформантов выращивали на жидкой среде ynb, клетки разрушали и определяли количество hGH в лизатах клеток и в культуральной жидкости методом elisa. (табл.1). Из табл.1 видно, что оба типа трансформантов давали примерно равный уровень экспрессии hGH и с равной эффективностью секретировали его в культуральную среду (.65% от общего синтеза hGH). Кривая накопления hGH в культуральной жидкости приведена на рис.3. Видно, что концентрация гормона роста в культуральной среде максимальна через 36 ч после инокуляции культуры.

Методом иммуноблотинга было показано, что в культуральной жидкости hGH представлен почти исключительно процессированной формой (рис.4 ) с несколько отличной от природного гормона подвижностью, что, по-видимому, связано- с наличием дополнительных N-аминокислот, кодируемых линкером, и неполным отщеплением последовательности (Giu-Aia)2 в используемом реципиентном штамме 20В12. В лизатах клеток обнаруживались множественные высокомолекулярные формы предшественника hGH, что, очевидно, связано с неодинаковой степенью их гликозилирования.

Совместно с сотрудниками ИБФМ АН СССР было определено

ААА-АСА-САС-ССТ-САА-ССТ-ААТ-ТСТ-АТС-ТТС. . . . 1уа-аг£-а1и-а1а-й1и-а1а-азр-зег-те-Ь-рЬе. .

|---I

линкер

Рис.2. А - схема строения плазмиды УЕраР/ъсн-в, Б - схема кассеты экспрессии/секреции, входящей в состав вышеуказанной плазмиды и структура места соединения пре-про-сегмента «-фактора и гена гормона роста человека.

—— hGH 6 cpeöe ~ОДббО

Рис.3. Кривая накопления hGH в культуральной жидкости при выращивании трансформантов YEpaF/hGH - 9 20В12. Отобранные аликвоты центрифугировали, супернатанты отбирали и определяли в них концентрацию hgh методом Elisa.

Табл.1. Экспрессия и секреция гормона роста человека трансформантами дрожжей YEpaF/hGH-8 20В12 И YEpaF/hGH-9 20В12.

Тип трансформанта количество гормона роста

клетки среда

мг/л : нМ/л 1 мг/1 o.e. при 660 нм мг/л ! нМ/л 1 мг/1 o.e. при 660 нм

YEpaF/hGH-а 20В12 YEpaF/hGH-9 20В12 0,343!14,25 0,326: 13,50 0,017 0,016 0,528122,00 0,530:22,07 0,027 0,027

Табл.2. Количественное распределение hGH в субъклеточных фракциях штамма дрожжей YEpaF/hGH-9 20В12.

Кол-во ьсн Всего культу- пери- цито- микро- ваку-~ ¡и 011660= ральная плазма золь сомы оли

, мг/л среда

% % % % % %

0,165 100 67 7,8 1,5 6,4 1,65

Штамм

YEpaF/hGH-9 20В12

КАА 1

гъ —

Рис.4. Иммуноолотинг препаратов культуральной среды при росте трансформантов УЕраГ/ьсн - 9 20В12. Дрожки выращивали, 1,5 мл выросшей культуры центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин, супернатанты отбирали и лиофилизовали. Полученные в виде осадка клетки разрушали, лиофилизованные культуральные среды растворяли в 10 мм Трис-нсг рН 7,5 и обессоливали, пропуская через колонку с сефадексом с-50, и затем наносили 1/5 препаратов лизатов клеток и 1/15 препаратов сред на 12% ПААГ с ЗБЗ. 1 - среда, штамм 20В12; 2 - лизат клеток, штамм 20В12; 3 - стандарт (гипофизарный ьсн); 4 - среда, штамм УЕраР/ьсн - 8 20В12; 5 -лизат клеток, штамм УЕраР/ШН - 8 20В12.

количественное (см. табл.2) и качественное распределение иммунореактивного материала в субъклеточных фракциях. Главной молекулярной формой ьсн являлся белок с молекулярным весом около 23 нДа, что соответствует молекулярному весу йен с 7 добавочными аминокислотами на N-конце. В гомогенате трансформированных клеток обнаруживались иммунореактивные полипептиды с молекулярными весами 24,5 и 34,5 кДа (данные не приводятся). Общее содержание высокомолекулярных форм не превышало 5% от иммунореактивного материала.

Процессированный. ьсн локализовался преимущественно в культуральной среде. При выращивании на среде УЫВ с

казаминокислотами в ней обнаруживалось более 65« hGH. в клетках hGH был ассоциирован преимущественно с вакуолями. Кроме вакуолей, ьсн обнаруживался во фракциях микросом, в периплазме и, в следовых количествах, в цитоплазме, что, скорее всего является артефактом выделения (частичный лизис вакуолей и смешение их содержимого с цитоплазмой).

Таким образом, при использовании в качестве модельного гена гена hGH было показано, что при конструировании кассеты экспрессии/секреции на основе пре-про-сегмента «-фактора наблюдается эффективная секреция зрелого белка в культуральную жидкость.

Клонирование Фрагментов генов GPD1 и ADH2.

Одним из путей повышения уровня секреции гетерологичных белков дрожжевой клеткой является конструирование кассет экспрессии/секреции с использованием сильных дрожжевых промоторов. Наиболее сильные из известных промоторов дрожжей

S.cerevisiae - ЭТО ПрОМОТОрЫ ГЭНОВ, КОДИРУЮЩИХ ферМбНТЫ

гликолитического пути. Нами было решено создать кассету экспрессии/секреции на основе промотора одного из таких генов -гена глицеральдегид -3- фосфат дегидрогеназы (Gpdi ) (Holland and Holland, 1979). Ген gpdi экспрессируется конститутивно в клетках а- и a-типов спаривания, а также в а/а дщргаидах и полиплоидах, в то время как ген MFai экспрессируется только в клетках а-типа спаривания. Создание кассеты экспрессии/секреции с использованием сильного и конститутивно экспрессирующегося промотора gpdi существенно увеличит спектр используемых реципиентных штаммов, что очень важно для создания промышленных штаммов-продуцентов целевых белков.

Второй промотор, выбранный нами - это промотор гена алкогольдегндрогеназы 2 дрожжей (adh2 ) (Ruasel et ai., 1983). Известно, что экспрессия данного гена подвержена катаболитной репрессии. Для получения гетерологичных белков» токсичных для клетки-продуцента, целесообразно использовать регулируемые системы экспрессии/секреции. Преимущество adh2 промотора перед другими регулируемыми дрожжевыми промоторами состоит в том, что его индукция осуществляется гораздо проще и дешевле, без применения дорогостоящих культуральных сред. Промотор adh2, также как и промотор gpdi , является сильным дрожжевым промотором.

При клонировании промоторов генов gpdi и ADH2 был применен ■подход, аналогичный таковому при клонировании гена MFal. Были сконструированы ограниченные библиотеки генов дрожжей и скринированы с помощью комплементарных синтетических олигонуклеотидов. По результатам гибридизации, рестрикционного анализа и определения первичной структуры вставок методом Сэнгера были отобраны клон pADH2, содержащий 1,970 т.п.о. BamHl/HindiII фрагмент гена ADH2, и клон pGPDi, содержащий 2,0 т.п.о. Hindiii/Saii фрагмент гена GPD1, которые были использованы в дальнейшей работе.

Конструирование кассет экспрессии/секреции с использованием ПРОМОТОРОВ GPD1 И ADH2.

Для конструирования кассеты экспрессии/секреции на основе промотора ADH2 и пре-про-сегмента а-фактора использовали 1150 п.о. BamHl/Alui фрагмент плазмиды pADH2, содержащий функциональные uasADH2 и точку инициации транскриции мРНК. При конструировании гибридного "промотора" gpdi было решено по возможности сохранить структуру 5'-нетранслируемой области гена gpdi, так как нативность данной области важна для эффективной экспрессии гетерологичных генов с использованием данного промотора.

Полученные гибридные "промоторы" использовали для конструирования секреторных векторов, содержащих в кассетах экспрессии/секреции ген hgh (рис.5). В случае gpd промотора были сконструированы два мультикопийных вектора - YEpGPD«/hGH-8 -аналогичный вектору YEpaF/hGH-8 И CVGPDa/hGH-8, на основе плазмиды CV13 (Broach et al., 1979), И НИЗКОКОПИЙНЫЙ центромерный вектор CEN3GPDc</hGH-8, содеркащий фрагмент центромеры ill хромосомы дрожжей CEN3, выделенный из плазмиды CEN3/41 (Hsiao et al. , 1981), И репликатор ARS1. В Случае ADH2 промотора был сконструирован мультикопийный вектор YEpADH2Of/hGH-8 , аНЭЛОГИЧНЫЙ вектору YEpaF/hGH-8.

Экспрессия и секреция гормона роста человека под контролем гибридных "ПРОМОТОРОВ" ADH2 И GPD1 .

Вектором YEpADH2a/hGH-8 трансформировали реципиентный штамм дрожжей 20В12, полученные трансформанты пересевали на синтетическую среду ynb с 2% этанолом и анализировали экспрессию и секрецию hGH иммунологическим методом. Трансформанты, секретирующие hGH, выращивали на жидкой ynb среде с 2% глюкозой.

ВашН1

РН051егш _ь<зн,

риар

ЕаоШ

РН05(егт

<5РГ)рг

есои Еоои-Ы г^Есот

1-Е 1)2 Г*атН1

2 Ц ог1

вашН!

РзН

риС19

ЙР13рг

ЕооИ

РзН СЕЫЗ

рЕШ322

^"Ч ЬСЗН НШШИ'/БсхЖ!' РН051ШТ1 ^--'---£ ЭШР

«I риа9

ЕаоИ

2р ог!

ргСРВ1 СПМРа1 УЛН РН05£егт

ШШВНН

800 I 230 I 600 I 380 Г

ЕсоМ (ВатН1)

Н1пс1111 /ЕсоМ

ВатН1

ргАБН2

1150

ЕсоШ

СШР«1 ЬСН РНСтегт

230 I 600 I 380 Г

Н1псШ1 /ЕсоИ

ВатН1

Рис 5. А - схемы строения плазмид, содержащих кассеты экспрессии/секреции на основе гибридных "промоторов" йРШ и АБН2 и направлящих синтез и секрецию горюна роста человека клетками дрожжей, Б - схемы кассет экспрессии/секреции, входящих в состав вышеуказанных плазмид.

-iz-

Оказалось, что в данных условиях hGH почти не обнаруживался в среде роста. Поэтому мы попытались отработать условия индукции промотора ADH2, для чего трансформанты выращивали на средах с различными источниками углерода (различные концентрации глюкозы и 2% этанол). При повышении концентрации глюкозы в среде выход биомассы также увеличивался и достигал максимума на среде с 2% глюкозой, при использовании 2% этанола в качестве источника углерода максимальная плотность культуры была в 2 раза ниже, чем при использовании 2% глюкозы, и составляла 14 o.e. при 660 нм. В то же время наблюдалась обратная зависимость накопления hGH от концентрации глюкозы в среде роста: уровень секреции был максимальным при выращивании' клеток на среде с 0,1& глюкозой (рис. 6, табл.3). Интересно отметить, что эффективность секреции обратно зависела от концентрации глюкозы в среде роста (табл. 3). Наибольший уровень секреции (около 1,5 мг/л) наблюдался при выращивании дрожжей на среде с 2% этанолом, в этом случае концентрация иммунореактивного материала в лизатах клеток была настолько низкой, что ее не удалось достоверно количественно определить. Эти данные совпадают с 4 ранее опубликованными результатами по экспрессии и секреции клетками дрожжей гетерологичного белка хирудина пиявки - его секреция усиливалась при замене в среде роста глюкозы на этанол (Loison et ai., 1988). Таким образом, использование гибридного "промотора" ADH2 позволило повысить уровень секреции клетками дрожжей гетерологичного белка - гормона роста человека почти в три раза по сравнению с ранее использованным промотором гена MFai.

В случае векторов, несущих кассеты экспрессии/секреции на основе промотора GPD1, для получения трансформантов использовали два штамма-реципиента: 20В12 и диплоидный штамм D584/27. Мы ожидали, что использование диплоида в качестве реципиента должно увеличивать уровень секреции hGH, так как в нем отсутствует синтез и секреция эндогенного а-фактора и секреторный поток в клетках менее "загружен". В результате трансформации данных реципиентов вышеупомянутыми векторами были получены и отобраны следующие штаммы дрожжей, секрбтирущие hGH: GPD/hGH 20В12 (штамм 20В12, несущий мультикопийную плазмиду YEpGPDa/hGH-8), CENGPD/hGH 20В12 (штамм 20В12, несущий однокопийную центромерную плазмиду CEN3GPDa/hGH-8), GPD/hGH D584/27 ( ШТЭММ D584/27,

мкг/л

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

10. 24 50 Ч

ЯШ 2* глюкоза КШ1х глюкам ЕЖЗ 0.1* глюкоза 0S9 2к этанол

Рис.6. Диаграммы накопления ьсн в культуральной жидкости при росте штамма ADH2/hGH на средах ynb с различными источниками углерода. Аликвоты отбирали, клетки осаждали центрифугированием, концентрацию hGH в средах определяли методом ELISA.

Табл.3. Экспрессия и секреция гормона роста человека трансформантами дрожжей ADH2/hGH 20В12 при их выращивании на средах ynb с различными источниками углерода.

Источник углерода, секреция ьсн, % от общего синтеза количество гормона роста

клетки среда

мг/л нМ/л! мг/1 o.e. ¡при 660 нм мг/л : нМ/л i мг/1 o.e. при 660 нм

2% глюкоза, 56« 1% глюкоза, 71« 0,1« глюкоза, 97« 2« этанол, — 0,088 0,127 0,017 3,7 : 0,006 5,4 : 0,006 0,141 0,003 0,111:4,60 0,316:13,1 0,545:22,7 1,460:60,8 0,008 0,014 0,107 0,100

несущий плазмиду УЕрСРЮа/ьсн-в), сеысрб/ьсн Б584/27 (штамм 0584/27, несущий плазмиду СЕМЗСРБсг/ЬСН-в) И GPDLEU/hGH 0584/27 ( штамм Б584/27, НОСУЩИЙ МуЛЬТИКОПИЙНуЮ ПЛаЗМИДУ СУСРСа/ЬСН-8). Трансформанты выращивали на селективной среде и снимали кривые накопления ьсн в культуральной среде (рис 7). Оказалось,

- GPD/hGH 20612 -+- CENGPD/hGH 2CB12 -*- GPO/hGH 0584/27

-B- CENGPD/hGH D584/27 -*- GPCLEU/hGH DJ84/27

Рис.7. Кривые накопления hGH в средах роста штаммов дрожжей, несущих вектора экспрессии/секреции на основе промотора gpdi и пре-про-сегмента o-фактора. Аликвоты отбирали, клетки осаадали центрифугированием, концентрацию hGH в среде определяли методом ELISA.

что: во-первых, уровень секреции hGH в среду зависит от типа вектора - в случае мультикопийных векторов он был выше в несколько десятков раз (табл.4); во-вторых, уровень секреции зависел также от типа штамма-реципиента - в случае использования штамма 20В12 уровень секреции был несколько выше, что, по-видимому, связано с отсутствием в данном штамме ряда клеточных протеаз. В клетках штамма GPD/hGH20Bi2 обнаруживался иммунореактивный материал в количествах, превышающих таковые клеток штамма YEpaF/hGH-8 в несколько десятков раз (эффективность секреции не превышала 8*). Нами было решено попытаться увеличить эффективность секреции путем оптимизации концентрации источника углерода - глюкозы в среде роста, для чего штамм GPD/hGH выращивали на синтетической среде ynb с различными концентрациями глюкозы. Оказалось, что

Табл.4. Экспрессия и секреция гормона роста человека трансформантами дрожжей, содержащими плазмиды, несущие кассеты экспрессии/секреции на основе промотора gpdi и пре-про-сегмента «-фактора.

Тип трансформанта эффективность секреции, % количество гормона роста

клетки среда

мкг/л нМ/л мкг/1 о.е. при 660 нм мкг/л: нМ/л мкг/1 о.е. при 660 нм

сеисро/ьсн 20в12, 120 5,00 7,89 13:0,54 0,86

9,7%

срб/ьсн 0584/27, 105 4,38 7,72 200:8,33 14,71

65,6%

сеыср0/>лн 0584/27 13 0,54 0,96 41 0,17 0,29

23,5%

сри-еи/ьсн 0584/27 145 6,04 9,06 14015,83 8,75

49,1% !

срб/ьсн 20В12: j

0,1% глюкоза - - - 1097!45,70 406,00

1% глюкоза - - - 77: 3,19 15,90

2% глюкоза, 7,3% 6000 250 788 440: 18,33 57,80

4% глюкоза - - - 413: 17,21 86,00

6% глюкоза - - - 854:35,58 178,06

10% глюкоза - - - 1543:64,29 406,00

уровень секреции зависит от концентрации глюкозы в среде следующим образом (табл.4 и рис.8): кривая зависимости уровня секреции от концентрации глюкозы имеет минимум в области, соответствующей 1% глюкозе. Максимальные значения концентрации hGH в среде обнаруживались при выращивании дрожжей на средах, содержащих 0,12 и 10% глюкозу (табл.4). Варьируя концентрацию глюкозы в среде роста, секрецию hGH в данном случае удалось увеличить в 3,5 раза по сравнению с величиной, полученной при выращивании дрожжей в стандартных условиях (2% глюкозы) и в 3 раза по сравнению с таковой штамма-продуцента YEpaF/hGH-8 20В12.

Таким образом, нами были сконструированы векторы экспрессии/секреции с использованием в качестве СП пре-про-сегмента с»-фактора и было показано, что данная СП направляет эффективный транспорт из клеток S.cerevisiae модельного чужеродного белка - гормона роста человека. Основываясь на этих данных, было решено создать дрожжевые

мкг

глюкоза, *

—.-мкг/л —I— мкг/1 o.e. при 0Д660

Рис.8. Секреция bGH в культуральную жидкость штаммом дрожжей GPD/hGH 20B12 при различных концентрациях глюкозы в среде. Дрожжи выращивали на синтетической среде YNB с 1» казаминокислотами. Концентрацию bGH в среде определяли методом ELISA.

штаммы-продуценты других белков - эпидермального фактора роста человека (hEGF), натрийуретического фактора человека (hANF) и кальцитонина человека (hCT).

Секреция hEGF. находящегося под контролем гибридных промоторов GPD1 и ADH2 клетками дрожзкэй.

Синтетический ген hEGF был ранее сконструирован химико-ферментативным способом и был получен нами от А.Акаева и Н-Батчиковой (НПО "Биотехнология"). При конструировании кассеты экспрессии/секреции был использован модифицированный вариант пре-про-сегмента гена 'MFal (получен от Д.Байсара, фирма Vepex—Biotechnika, Сегед, Венгрия), не содержащий последовательности (Ciu-Aia>z на з--конце (рис.9). Сконструированные кассеты экспрессии/секреции, несущие ген hEGF, были введены в состав мультикопийных дрожжевых векторов.

Полученные рекомбинантные ПЛЭЗМИДЫ YEpGPDa/EGF и YEpADH2a/EGF имели в качестве маркера ген trpi, репликатор 2^ и кассеты экспрессии (эти плазмиды аналогичны дрожжевым векторам YEpGPDct/hGH-8 И YEpADH2a/hGH-8, за ИСКЛЮЧбНИеМ ГбТерОЛОГИЧНОГО гена). Использование модифицированной СП a-фактора должно обеспечивать при созревании предшественника образование hEGF с N-концом» идентичным таковому природного белка.

Векторами YEpGPDa/EGF и YEpADH2a/EGF трансформировали реципиентный штамм 20в12, трансформанты выращивали на среде ynb с 2% глюкозой, после выращивания удаляли клетки центрифугированием, супернатанты концентрировали хроматографией в обращенной фазе. Сконцентрированные препараты разделяли методом электрофореза пептидов в ПААГ (рис.10). Разделенные препараты представляли собой одну мажорную полосу, соответствующую маркерному белку (рекомбинантный hEGF из е.coli) и несколько минорных полос с большими молекулярными весами, по-видимому, ЯВЛЯЮЩИМИСЯ мультимерными формами hEGF, ЧТО совпадает С данными, полученными другими авторами (Brake et ai., 1984). Секреция hEGF, находящегося под контролем гибридного "промотора" adh2, (штамм adh/egf) была примерно на порядок выше таковой в случае, когда ген egf находился под контролем промотора gpdi (штамм gpd/egf) и составляла (по данным пептидного электрофореза) приблизительно 10-15 мг/л культуры. Совместно с сотрудниками лаборатории А.Ажаева (ШО

MFal Lys Arg Asn Ser hEGF ...TTG GAT AAA AGG AAT TCT GAC...

EcoRI

Рис.9.Структура места соединения пре-про-сегмента а-фактора и синтетического гена hEGF.

"Биотехнология") было показано, что вышеописанные препараты секретируемого рекомбинантного дрожжевого hEGF взаимодействуют с антителами, полученными на природный белок. Таким образом, использование сконструированной системы экспрессии/секреции гетерологичных белков позволило нам продемонстрировать экспрессию И секрецию hEGF дрожжами S.cerevisiae.

кОл i 2 3 к 5 С 7

ад-Си :

■щя -

»

Рис.9. Пептидный электрофорез препаратов сред, полученных при выращивании штаммов дрожжей gpd/egf, adh/egf, gpd/ъст asn , adh/anf: 1 - маркеры молекулярного веса; 2 - штамм adh/anf, на колонку наносили 20 мл среды, элюция 70% этанолом; 3 - штамм adh/anf, на колонку наносили 5 мл среды, элюция 50% этанолом; 4 - синтетический hanf, i мкг; 5 - штамм adh/egf, на колонку наносили 1 мл среды; 6 - штамм gpd/egf, на колонку наносили 1 мл среды; 7 - рекомбинантный hegf из e.coii, 2 мкг (препарат любезно предоставлен А.Ажаевым и Н.Батчиковой); 8 - штамм gpd/нст Аап , на колонку наносили 20 мл среды, элюция 70% этанолом.

Секреция ЬАЫР. находящегося под контролем гибридного "промотора" АРН2. клетками дрожжей-

Синтетический ген ъаыр с оптимизированным для дрожжей кодоновым составом был' сконструирован нами из синтезированных Г.Е.Позмоговой и Б.К.Черновым (ИМБ АН СССР) олигонуклеотидов (рис.11). Путем ряда генноинженерных манипуляций была получена мультикопийная дрожжевая плазмида УЕрАБН2/АЫР (аналогична плазмиде УЕрА0Н2/ьсн-8), несущая кассету экспрессии/секреции с

ASN SEE LEU AEG AUG SEE SER СП РНЕ Gl? 617 ABS MET ASP ABS

I.......-.....1.................II-------------2...........

ААГ ТСГ TTG CGT AGA TCT AGT TGT TTC GGC GGT AGA AT6 GAC CGT

GA AAC GCA TCT AGA TCA ACA AAG CCG CCA TCT TAC CTG GAC

|-----------------5--------------------g-------------

ILE eií ALA GLN SEB GLT LED GUT CTS ASN SEE PHE ABS TTB

I---------------3-----------II--------------4--------------

ATT GGC GCT CAA AGT GGT TTG GGT TGT AAC TCT TTC AGA TAC TAG

TAA CCG CG A GTT TCA CCA AAC CCA ACA TTG AGA AAG TCT ATG АГС CTAG

------6--------------g-----------1-----------И----------fl-1

Рис.11. Структура синтетического гена hANF. Пунктирными линиями выделены синтетические олигонуклеотиды, из которых производили "сборку" гена.

геном hANF. Сконструированной плазмидой трансформировали реципиентный штамм дрожжей 20В12, отбирали трансформанты, выращивали их на синтетической ynb среде и определяли наличие иммунореактивных пептидов в культуральной жидкости методом RIA с использованием стандартного набора фирмы "Ameraham". Оказалось, что в культуральных средах присутствуют иммунореактивные пептиды в количестве до 150 мкг/л. Препараты сред концентрировали и разделяли методом пептидного электрофореза в ПААГ (рис.10). Были выявлены пептиды, имеющие больший молекулярный вес, чем hANF, и,

ПО-ВИДИМОМУ, ЯВЛЯЮЩИеСЯ муЛЬТИМерНЫМИ фОртаМИ hANF.

Экспрессия и секреция капьцитонина человека в дрожжах.

Ранее Ю.Б.Головой и др. (ИМБ АН СССР) химико-ферментативным методом был синтезирован модельный ген кальцитонина человека Met[Val8 ]hCT, содержащий дополнительный кодон atg. Нами была предпринята попытка получить штамм-продуцент дрожжей, секретирующий ьст в среду роста. Для этой цели у модельного гена Metí Val ]hCT с помощью синтетического адаптора была изменена структура 5' -концевой области таким образом, чтобы обеспечить совпадения рамок трансляции пре-про-сегмента гена MFai и кальцитонина (рис.12). Полученный модифицированный ген кальцитонина hCTIMet8 ^ встраивали в кассеты экспрессии/секреции с промоторами MFai, GPD1 и adh2. На основе полученных рекомбинантных плазмид были сконструированы мультикопийные

-го-

сте cur ASP LED BEB ТНК СТО MET LEU GUT TH8

I-------------1-------------II---------—2---------

AGCT TGT GGT GAC TTG TCT ACT TGT ATG TTG GGT ACC

CCA CCA CGT AAC AGA TGA АСА TCA AAC CCA TGG

1— TYR THR GLN -6— ASP РНБ ASN -----И------------- LIS РНЕ HIS THR РНЕ

TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTT АСА ACG TTC

ATG TGC GTC CTG AAG TTG TTC AAA TGT TGC AAG

-7 — —II- ------a-------------1

PRO GLN THR ALA ILE GUT VAL GLY ALA PRO

—4------------II--------------5------------------1

CCC CAA ACT GCA ATT GGG GTT GGA G CA CCT TGA TAG GGG GTT TGA CGT TAA CCC CAA CCT CGT GGA ACT ATCCTAG

,----------9------------Ц-------------10--------------1

Рис.12. Структура синтетического гена кальцитонина человека

hCTIMet8]Asn~. Пунктирными линиями выделены синтетические олигонуклеотиды, из которых производили "сборку" гена.

дрожжевые векторы, содержащие 2м репликатор и ген TRPl (YEphCT). Данными рекомбинантными плазмидами трансформировали реципиентный штамм дрожжей 20В12, трансформанты выращивали и анализировали наличие иммунореактивного (реагирующего с кроличьими AT против ьст ) материала в лизатах клеток и культуральных жидкостях (совместно с сотрудниками ИМБ Болгарской Академии Наук). Оказалось, что количество иммунореактивного материала как в лизатах клеток, так и в культуральной жидкости не превышало 2 мкг/л культуры вне зависимости от типа используемого вектора. Возможными причинами низкой экспрессии кальцитонина человека клетками дрожжей могли быть:

а) низкая эффективность транскрипции мРНК и/или нестабильность мРНК в клетках дрожжей, б) низкая эффективность трансляции мРНК дрожжевыми рибосомами, в) низкая стабильность вновь синтезируемого полипептида ppaF/hCT или процессированого ИСТ в клетках дрожжей, г) гликозилирование ИСТ и низкая иммунореактивность гликозилированного hCT.

Для проверки первого предположения из клеток штаммов-продуцентов кальцитонина выделили суммарную РНК и анализировали ее методом Нозерн-блотинга. Оказалось, что уровень кальцитониновой мРНК был примерно равен уровню мРНК hGH, выделенной из клеток штамма дрожжей YEpaF/hGH-9 20В12. Низкий

уровень синтеза ЬСТ, по-видимому, не связан с транскрипцией и/или стабильностью мРНК в клетках дрожжей.

Для проверки возможности гликозилирования ЬСТ в клетках дрожжей с помощью синтетического адаптора нами был сконструирован еще один вариант гена ЬСТ - ьст/ [ Met8 ]Asn~ , в котором Asn заменен на Asp и вследствии этого потенциальный сайт гликозилирования разрушен (рис.12). Полученный ген встраивали в кассету экспрессии/секреции, конструировали мультикопийный дрожжевой вектор, аналогичный YEphCT, трансформировали реципиентный штамм дрожжей 20В12 и выращивали дрожжевые трансформанты. Культуральные среды концентрировали (как описано, для egf и ANF), и сконцентрированные препараты наносили на пептидный электрофорез. Оказалось, что в препаратах обнаруживаются белки с молекулярными весами, большими чем молекулярный вес ьст (рис.10), и, по-видимому, представляющие собой мультимерные формы ьст, что совпадает с данными, полученными фирмой "Celltech" (f.Williams, ПерСОНЗЛЬНОе сообщение). Таким образом, и в этом случае нам удалось показать секрецию гетерологичного пептида - ьст с использованием сконструированной нами системы экспрессии/секреции целевых белков, правда с более низким выходом, чем при секреции hgh и hegf.

В поисках более эффективной системы синтеза ьст совместна с сотрудниками Института белка АН СССР для получения ьст мы использовали принципиально другой подход - синтез кальцитонина в бесклеточной системе трансляции непрерывного действия.-

Разработка метода быстрого выделения плазмидной ДНК из Е.col1 для секвенкрования по методу Сэнгера.

При выполнении данной работы определение первичной структуры ДНК методом дидезокситерминирования с использованием двунитевых матриц было одной из часто применяемых рутинных процедур. Существунцие методы экстракции плазмидной ДНК из клеток E.coli довольно трудоемки. Поэтому в процессе выполнения данной работы был разработан быстрый и менее трудоемкий, чем известные, метод выделения плазмидной ДНК из E.coli , основанный на описанном методе экстракции смесью фенол/хлороформ (Serghini et ai., 1989) и включающий в себя осаждение ДНК из экстракта полиэтиленгликолом-бооо в присутствии хлористого лития.

ШВОДЫ:

1. Из ограниченных библиотек генов дрожжей клонированы гены MFal, GPD1 И ADH2.

2. Созданы дрожжевые секреторные векторы на основе регуляторных областей клонированных генов и пре-про-последовательности а-фактора.

3. Показано, что сигнальная последовательность «-фактора с высокой эффективностью (65 - 9ДО) направляет секрецию в культуральную жидкость и процессинг гетерологичного белка - hGH.

4. Определена сравнительная эффективность экспрессии и экспорта в культуральную среду гормона роста человека при использовании в кассетах экспрессии/секреции промоторов MFal, GPD1 И ADH2.

5. Получены штаммы дрожжей, секретирукщие в культуральную жидкость производные кальцитонина человека, эпидермальный фактор роста человека и натрийуретический фактор человека.

6. Разработан метод быстрого выделения плазмидной ДНК из E.coii для секвенирования по методу Сэнгера.

Основные результаты диссертации изложены в следующих статьях и сообщениях:

1. Морзунов С.П., Каршчев И.В., Эльдаров М.А., Рубцов П.М., Скрябин К.Г., Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Кулаев И.О. Синтез и секреция гормона роста человека в клетках дрожжей. - В сб.: Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1986, с. 83-84.

2. Скрябин К.Г., Циоменко А.Б., Морзунов С.П., Карпычев И.В., Лупашин В.В., Эльдаров М.А., Рубцов П.М., Кулаев И.С., Баев А.А. Синтез и секреция гормона роста человека у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. - БИОТеХНОЛОГИЯ, 1987, Т.З, С. 312-318.

3. Эльдаров М.А., Морзунов С.П., Каршчев И.В., Скрябин К.Г., Василенко О.В., Свешников П.М., Северин Е.С., Брантл 3., Ланг X., Росслер X., Розенталь 3. - Синтез поверхностных антигенов п дрожжах. - Биотехнология, 1987, т.З, fP 3, с. 319-324.

4. Эльдаров М.А., Морзунов С.П., Карпычев И.В., Рубцов П.М., Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Кулаев И.С., Скрябин К.Г., Баев А.А. Экспрессия гена соматотропного гормона человека в дрожжах s.cerevisiae. - в сб.: "Гормон роста человека", Пущино, 1988, с. 74-82.

5. Морзунов С.П., Карпычев И.В., Эльдаров М.А., Лупашин В.В. Синтез и секреция гормона роста человека в клетках дрожжей. Тезисы докладов 9 конференции молодых ученых, Рига, 1987, с. 6.

6.Скрябин К.Г., Эльдаров М.А., Карпычев И.В., Морзунов С.П., Рубцов П.М., Циоменко А.Б., Кулаев И.О., Баев А.А. "Экспрессия гетерологичных генов в дрожжах. 8-й Двусторонний симпозиум СССР-Франция "Молекулярная биология генов и нуклеиновых кислот". Тезисы докладов. М., 1986, с.20.

7. Tsiomenko А.В., Karpychev I.V., Lupashin V.V., Eldarov М.А., Morzunov S.P., Rubtsov P.M., Skryabln K.G., Kulaev I.S., Bayev A. A. Intrace1lular distribución of heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae depends on the type of N-terminal signal peptide. - Yeast, 1968, v.4, S455.

8. Tsiomenko А.В., Lupashin V.V., Eldarov M.A., Morzunov S.P., Karpychev I.V., Rubtsov P.M., Skryabin K.G., Kulaev I.S., Bayev

A.A. Intracellular distribution of heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae depends on the type of N-terminal signal peptide. — In: 4-th International congress of cell biology, Montreal, 1988, Abstracts, p. 393.

9. Lupashin V.V., Stavitskaya Yu.E., Karpychev I.V., Eldarov U.A., Tsiomenko A.B. - Optimal conditions for gomologic and heterologic protein export by Saccharomyces cerevisiae. - In: 14-th International congress of biochemistry, 1988, Abstracts, p.393 .

10. Eldarov M.A., Tsiomenko A.B., Karpychev I.V., Morzunov S.P., Tchernov B.K., Rubtsov P.M., Kulaev I.S., Skryabin K.G., Bayev

A.A. Synthesis and secretion of mammalian proteins in yeast. -7-th German-Soviet Symposium "Organization and Function of the Eucaryotic Genome". Abstracts. Heidelberg (FRG), 1987, p.l. 11.

11. I.V.Karpychev, M.A.Eldarov, S.V.Korolev, D.MBrkel,

B.K.Chernov, K.G.Skryabin. Versatile vectors for secretion of intact and truncated proteins from yeast - In: Abstracts of the XV International conference on Yeast genetics and molecular biology, Hague, 1990, Yeast, v.6, sp. iss., S452.

Черметинформация, зак.898, тир.ЮО, уч.-изд.л.0,96, печ.л.1,5, усл.кр.-отт.1,75, подписано к печати 14.09.90 г.