Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия гена инулазы KLUYVEROMYCES MARXIANUS в штаммах SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена инулазы KLUYVEROMYCES MARXIANUS в штаммах SACCHAROMYCES CEREVISIAE"

...лм 'ЛГ-3

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (ГосНИИ Генетика)

На правах рукописи

БРЕВНОВА Елена Эдуардовна

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ИНУЛАЗЫ КШУУЕЯОМУСЕЗ \1ARXIANUS В ШТАММАХ БАССНАКОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ

Специальность: 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук С. В Беневоленский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

А. В. Глазунов; кандидат биологических наук Л. М.Захарчук

Ведущая организация:

Защита состоится Ц С, ¿^с Ос^

Центр "Биоинженерия" РАН

1998 года в

14

часов на

заседании специализированного совета Д 098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики н селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожных пр-д, д. I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан

15

С* А ¡лЛ^ои' 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одновременно важнейшей производственной культурой и популярным объектом экспериментальных исследований в генетике и молекулярной биологии. Это обусловлено многими причинами, в том числе безопасностью этого вида дрожжей, а также тем, что дрожжи - простейшие эукариоты, благодаря чему онн представляют собой удобный объект для разработки проблем общей и молекулярной генетики эукарнот.

В связи с безопасностью Sacch. cerevisiae этот вид дрожжей можно использовать для создания продуцентов различных продуктов не только технического, но, также пищевого и медицинского назначения Одним из таких продуктов может быть, например, фруктоза, которая, как известно, в I 5-2 раза слаще сахарозы в зависимости от температуры. pH и концентрации. Кроме того, фруктоза в меньшей степени, чем сахароза, способствует кариесу (Heyns. 1978), атеросклерозу, нарушению обмена веществ и. что особенно важно, совершенно безвредна для людей, страдающих сахарным диабетом, в отличие от глюкозы и сахарозы (Vandamme и Derycke, 1983). Источником фруктозы может быть, например, инулин - запасной полифруктозный углевод растительного происхождения, который состоит из остатков ß-D-фруктофуранозы. соединенных ß(2-»l) связями друг с другом и а( I—>2) связью с единственным глюкозным остатком на конце полимерной цепи. Мобилизация инулина в клетке происходит под действием ннулазы (КФ 3 2.1.7; 2. l-ß-D-фруктан-фруктаногидролаза), которая катализирует расщепление гликозидны.х связей с образованием главным образом D-фруктозы.

Для создания продуцента фруктозы на основе штамма инулин-негативных дрожжей Sacch. cerevisiae необходимо ввести в его геном экспресснонную кассету с гетерологичным геном инулазы и блокировать утилизацию фруктозы этим штаммом. При культивировании полученного штамма на инулинсодержащей среде образующаяся фруктоза может накапливаться в культуральной жидкости.

С целью получения штаммов-продуцентов на основе Sacch. cerevisiae используется два основных подхода: гетерологнчная экспрессия генов из различных организмов в Sacch. cerevisiae (обзоры: Martin и Scheinbach. 1989; Wilcox и Studnicka. 1988; Buckholz и Gleesen. 1991) и изменение метаболизма дрожжей за счет введения в их геном мутаций в структурных или регуляторных генах (Kim и др . 1996).

Конструирование искомого продуцента фруктозы предполагает демонстрацию качественно новых возможностей при комбинировании обоих подходов, используемых при создании новых штаммов. Источником гена ннулазы может служить один из видов инулин-позитивных дрожжей. Например, при экспрессии гена инулазы Kluyvemmyccs marxumiis в Sacch. cerevisiae штамм Sacch. cerevisiae приобретает способность к росту на среде, содержащей инулин в качестве единственного источника углерода (Laloux п др .1991). Другой составляющей процесса конструирования продуцента фруктозы является блокирование утилизации фруктозы клетками Saccli. cerevisiae. Для этого необходимо

ввести нуль-мутации в структурные части генов НХК1 и НХК2 гексокиназ, контролирующих фосфорилированне глюкозы и фруктозы в ¿'асс/;. сегех'йчае. Полученный мутант генотипа Ихк1 Ихк2, не способен к фосфорилированию и утилизации фруктозы, но сохраняет способность к росту на глюкозе за счет гена С/Х/ глюкокиназы, фосфорилирующей только глюкозу (£$¡55011 и Ргаепке1, 1982).

Цель работы: продемонстрировать возможность и преимущества комбинирования двух различных подходов, используемых при конструировании новых штаммов, на примере создания штамма БассИ. сеге\11а1ае, обладающего инулазной активностью и способного накапливать фруктозу в культуральной жидкости при росте на среде, содержащей инулин.

Задачи работы: выбрать штамм дрожжей - донор гена инулазы; клонировать ген инулазы и оптимизировать его экспрессию в &ссЛ. се/отшае; сконструировать штамм ЛассЛ. сегеушае генотипа Ихк1 Ихк2, обладающий инулазной активностью за счет гетерологичной экспрессии гена инулазы, и продемонстрировать его способность накапливать фруктозу в культуральной жидкости при росте на среде с инулином.

Научная новизна и практическая значимость работы. Продемонстрированы возможность и результат комбинирования гетерологичной экспрессии и изменения базовых характеристик метаболизма клетки. Впервые описан факт ингибирования активности инулаз конечным продуктом реакции - фруктозой. Обнаружено, что белковый продукт экспрессии гена инулазы К. тагх/апих в ЬассИ. сит\>1$1ач в большей степени подвержен гликозилпрованию, чем инулаза, продуцируемая К. тагх/апи.ч. На модели инулазы показано, что дрожжи ХиссИ. сегечшае обладают секреторной активностью в стадии позднего стационара. Получены данные, позволяющие предположить, что инулаза К. тчгх1С1ш.\ не подвержена обратной регуляции при экспрессии в ЗассИ. сеге\>1Х1ае. Сконструирован штамм ХиссИ. сегеумнк, способный накапливать до 10 % фруктозы (свободной от примеси глюкозы) в культуральной жидкости при росте на среде с инулином. Полученный штамм может служить основой для разработки нового способа производства фруктозы.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции, посвященной памяти акад. А. А. Баева (Москва, 1996), на Конференции ГосНИИгенетнка (Москва, 1997) и на межлабораторном семинаре ГосНИИгенетика.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы генетически маркированные штаммы йассНаготусех ссгсу^ше из коллекции лаборатории и штаммы дрожжей дикого типа, полученные из ВКПМ К1иу\,еготусех тагхктих У- 303, К1иу\'еготусе.ч/гарИ.ч Х- 485, йеЬагуотусем ро1утог/>1ч1.\ У-678 ОеЬагуотуссх/ю/утогрНн.ч У-680 и Хс/птпнютусех оссМеШаН.ч У-1627.

Для амплификации плазмиднон ДНК использовали штамм Е.соИ С600 [Р 1/и-1 1Иг-1 1сиВС> 1чсУ1 ЮпЛ21 м/рЕ^-1 Х~ ], полученный из ВКПМ.

Плазмида pBWl 13, содержащая ген HXKI (Kopetzki, 1985), получена от проф Д Г. Френкеля, США. Плазммды GT43 и UT-J3, содержащие промоторы GT н UT (Козлов. 1997), любезно предоставлены к б н Д. Г Козловым (ГосНИИГенетика)

В работе использовали челночный (дрожжи - Е. coli ) вектор pPW263 (Puta и Wambutt. 1992).

Фрагменты ДНК Saccli. cerewsiae, кодирующие промотор гена GI'D (Bitter и Egan, I9S4), N-концевую область сигнальной последовательности гена Ml-'al (Kurjan и Herskowitz, 1982) и область терминашш транскрипции гена PGKJ (Hitzeman и др., 1982), содержатся в составе плазмид коллекции лаборатории.

Дрожжи культивировали на агаризованных и жидких средах - богатой (YEP) и синтетической (SC), содержащих различные источники углерода и необходимые ауксотрофные добавки (для SC). (Rose и др , 1989) Источники углерода обозначили D - 2% глюкозы; F - 2% фруктозы; f - 0 3% фруктозы; EG - 2% этанола + 3% глицерина; I - инулин.

Трансформацию клеток дрожжей плазмидной ДНК проводили как описано (Ио и др . 1983).

Разрушение клеток дрожжей и выделение хромосомной ДНК проводили как опнсано (Rose и др , 1989).

Манипуляции с Е. coli и плазмидной ДНК осуществляли как описано (Maniatis и лр ,

1982).

Олпгонуклеотпдные праймеры синтезированы в лаборатории В. П. Вейко (ГосНИИгенетика).

Полные геномные библиотеки К. marxianus - Y303 и S. occuknialis - Y1627 конструировали как описано (Баева и др., 1996). При конструировании геномной мини-библиотеки К. marxianus хромосомную ДНК штамма К. marxianus -Y303 обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами Ham HI, Hmá\\\, Pst\, Slu\ и Xh<>\ и встраивали в вектор pPW263 по сайту #,(,'(11 с предварительной частичной достройкой концов.

Гибридизационный анализ колонии Е. coli проводили как описано (Maniatis и др .

1982).

Мечение зонда осуществляли с помощью набора "Rendom primer DNA-labeling" (Fermentas) как рекомендовано в прилагаемой инструкции.

Секвснирование ДНК осуществляли по методу Сэнгера (Sanger и др., 1977)

Однокопнйное введение экспрессионных кассет с геном инулазы К. marxianus в клетки Saccli. ccrcvisiae обеспечивали при помощи их интеграции в хромосомные локусы 1'КАЗ или HXKI. В каждом случае для последующей работы отбирали не менее трех независимых трансформантов, обладавших одинаковой, минимальной активностью фермента среди 10-15 проверенных клонов

Концентрирование секретпруемой инулазы проводили путем диализа и последующего упаривания

Дегликозилнрование инулазы проводили с использованием эндо-Р-//-ацетил-глюкозаминидазы Н (Эндо-Н; ЕС 3.2.1.96) как описано (Rouwenhorst и др , 1990).

Электрофорез белков в ПААГ-гелях в денатурирующих условиях проводили как описано (Maniatis и др., 1982). При этом использовали 4% концентрирующий и 10% разделяющий гели

Концентрацию глюкозы и фруктозы определяли как описано (Bernfeld, 1955).

Для измерения концентрации чистой глюкозы (без фруктозы) использовали стандартный набор реагентов (SIGMA). Измерения проводили согласно инструкциям производителя.

Концентрацию инулина и активность секретируемой инулазы определяли как описано (Бревнова и др., 1998). За единицу активности инулазы принимали количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль фруктозы и глюкозы за 1 мин.

Активность секретируемой глюкоамилазы определяли как описано (Berezin и др., 1997). За единицу активности глюкоамилазы принимали количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль глюкозы за 1 мин.

Активность инулазы и глюкоамилазы, связанных с клеткой, определяли также, как активность соответствующих секретируемых ферментов, но в качестве источника фермента брали 50 мкл грубого клеточного экстракта. Клеточный экстракт получали как описано (Rose и др., 1989) при определении активности Р-галактозидазы, за исключением того, что в качестве буфера для разрушения клеток использовали ВА буфер (0.2М ацетатный буфер рН 5.2, 20% глицерин; 1мМ дитиотрейтол) для инулазы и BF буфер (0.1М фосфатный буфер рН 5.4, 20% глицерин; 1мМ дитиотрейтол) для глюкоамилазы.

Скорость продукции ферментов (Рг) вычисляли как описано (Suntsov и др., 1990). Рг измеряли в единицах активности фермента (инулазы или глюкоамилазы), продуцируемого 10"' клетками за I час (ед/ ч Ю10 кл.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выбор штамма дрожжей - донора гена ннулазы.

В качестве возможных доноров гена инулазы испытали несколько штаммов дрожжей, отобранных из ВКГТМ (табл.1). Все эти штаммы способны расти на среде, содержащей инулин в качестве единственного источника углерода [Schwanuiomyces occiJcnlalis Y-1627 (Barnett и др., 1983); Kltiyveromyces marxiamts Y-303, Kltiyveromyccs fragiltx Y-485, Debaryomycespotymorphus Y-678 и Debaryomycespolymorphus Y-680 (Вустин M. M., ВКПМ. частное сообщение)], следовательно, каждый из отобранных штаммов обладает инулазой.

Инулаза дрожжей может распределяться между клеткой, клеточной стенкой и культуральной средой (Rouwenhorst и др., 1988). Наличие каждой из фракций инулазы и процентное соотношение этих фракций зависит от продуцента. В связи с дальнейшими целями данной работы потенциальный интерес представляла секретируемая фракция

инулазы. Поскольку способность фермента к секреции связана со свойствами самого фермента, первоначальный скрининг среди отобранных штаммов дрожжей проводили по уровню продукции секретнруемой инулазы. Для этого измеряли активность инулазы в культуральной жидкости на стационарной стадии роста клеток. Дрожжи выращивали на среде УЕРГ, поскольку, в связи с дальнейшими целями работы, необходимо было убедиться, что присутствие фруктозы в среде не репрессирует синтез инулазы, как это наблюдается для некоторых видов дрожжей (Ве1исЬе и др., 1980). Результаты измерении представлены в табл. 1.

Таблица 1

Продукция секретнруемой инулазы штаммами дрожжей.*

Штамм Активность, ед/мл к.ж.** Активность. ед/Ю'кп.***

КЫмуеготусех тагх'шпих У-ЗОЗ 2.1 0.26

К1и\'\'егот\сех Яар/Нх У-485 0.4 0.14

ОеЬаг\ч>т\'сех ро1утогрких У-678 0.1 0.07

ОеЬагуотусех ро1утогрИих У-680 0 1 0 02

ЯсЫ атиотусех оссШепюПх У-1627 06 0.15

* Активность инулазы измеряли при 37 °С; * * к.ж. - культуральной жидкости: ***кл. - клеток

Из данных табл. I видно, что все испытанные штаммы дрожжей способны секретнровать нпулазу с различной эффективностью. Наиболее низкий уровень секретнруемой инулазы обнаружили штаммы ОеЬагуотусехро1утогр1шх У-678 и I к'Ьагугшусех /ю1утогр>Н1Х У-680. Возможно, это объясняется тем. что присутствие фруктозы в среде репрессирует синтез инулазы в этих штаммах, поскольку, такой эффект был обнаружен для дрожжей ОеЬагуптусе.ч сапШгеИИ (Ве1исЬе и др., 1980).

Для дальнейшего анализа выбрали штаммы К. тапаситх У-ЗОЗ и .V. осс/ЖшаИх У-1627, обнаружившие наиболее высокий уровень продукции секретнруемой инулазы. В дальнейшем эти штаммы будут называться К. тагхкптх и &'. оссн/епшИх.

Помимо способности к секреции, другим важным свойством ферментов является характер их взаимодействия с субстратом, тес инулином. Сродство фермента к субстрату характеризуется константой Мнхаэлиса. Невозможно точно определить инулазы на инулине из-за ограниченной растворимости этого субстрата (ЯоишепИогБ! н др , 1988). Для того, чтобы приблизительно оценить разницу в сродстве инулаз К. /пагхшннх и Л'. чссчкшаИх к инулину, получили зависимость начальной скорости (V,,) гидролиза инулина инулазами К. тагхичтх и .V. осаЖп/аПх от концентрации инулина в реакционной смеси (Б) в обратных координатах (рис. 1А). Из рис. 1А видно, что параметры полученных прямых существенно различаются и. экстрополируя их до пересечения с осью 1/5, г е. до -1/ К„„ можно предположить, что величина К„, для инулазы .V. оссн/сп1аН.\ существенно меньше, чем для инулазы К. нюгхкнтх, следовательно, сродство инулазы .V. оссШпшИх к инулину выше, чем у инулазы К. /тнхнтпл Экстрополируя прямые до оси 1/ V,,. т.е. до

видно, что при данных концентрациях ферментов V™, инулазы К. пюпс/атк выше, чем инулазы .V. ас^епшЬз. Такое соотношение каталитических констант (Кт и Ут„) приводит к тому, что К. тагхшпих проявляет большую активность при высоких концентрациях инулина, в то время как инулаза 51. оссМепшШ более актнвна при низких концентрациях инулина (рис. 1В). Таким образом, при высоких концентрациях инулина, создаются оптимальные условия для работы инулазы К. тагхюпиз, а при низких концентрациях инулина, которые связаны с окончанием любых ферментативных процессов, становится более активной инулаза осаЛепшИх. Следовательно, с точки зрения создания оптимальной системы утилизации инулина, инулазы К. тагхгапих и Б. оссМеМаИх выгодно дополняют друг друга.

Рис. I. Зависимость начальной скорости (V,,) пиролиза

инулина инулазами 5

К. тагхтпи! (закрытые символы) и .У. осыЦегнаИх

(открытые символы) ,-.—

-.2 -.1

от начальной концентрации

ннулина в реакционной смеси (Б) в обратных (А) и прямых (В) координатах. Начальную скорость измеряли также, как активность инулазы. Активность инулазы в культуральной жидкости определяли на стационарной стадии роста клеток на среде УЕРЭ при 37 "С. Величины активностей инулазы. в данном случае, представлены в относительных единицах, а концентрация ннулина - в процентах.

.2 I /.ч

Помимо характера взаимодействия инулаз с субстратом, другим важным свойством этих ферментов является возможность и степень ингибирования их активности конечным продуктом, т е. фруктозой. С целью изучения характера ингибирования активностей инулаз К. тагхшпих и Л'. чссМеШаИх фруктозой определены зависимости активностей секретпруемых фракций этих ферментов от концентрации фруктозы в реакционной смеси (рис. 2). Из рис. 2 видно, что активность обеих инулаз ингибнруется фруктозой. Однако, характер ингибирования этих ферментов фруктозой различается. Инулаза К. татапих в большей степени подвержена ингибированию фруктозой, чем инулаза .V. оссШеШаИх. Так. при начальной концентрации фруктозы в реакционной смеси 5% активность инулазы К. татапих уменьшается в 10 раз, в то время как активность инулазы .У. осаЛепшНх уменьшается в 3 раза.

Полученные результаты, свидетельствующие об ингибировании активности инулаз К. тагх^апиБ и осс1с/сп1аИя фруктозой не являются неожиданными. Явление ингибирования ферментов конечным продуктом реакции довольно типично и наблюдается для многих ферментов (Келети, 1990) В то же время, факт ингибирования активности инулаз фруктозой до сих пор не описан в литературе.

Рис 2 Зависимость активности сскретируемых инулаз К. тагхюпи'; (закрытые символы) и 5'. осс/с/ел(открытые символы) от начальной концентрации фруктозы в реакционной смеси. Активность инулазы определяли в культур альмой жидкости на стационарной стадии роста клеток на среде УЕРО при 37 'С

£ 120 -т

3 100 -

ГЗ

80 -

-а 60 -

Ч 40

я

- 20

и

< 0

I

0 1 2 3 4 5 6 Концентрация фруктозы. %

На основании полученных результатов можно заключить, что оба гена инулаз, К. тагх/ата и 5. оссШеМаПя, представляют потенциальный интерес с точки зрения их клонирования и использования.

2. Клонирование генов инулаз.

Поскольку инулин-негативный штамм дрожжей Sacch. cerevisiae приобретает способность расти на среде с инулином в качестве единственного источника углерода при гетерологичной экспрессии в этом штамме гена инулазы К. marxiarms (Lalotix и др., 1991). мы попытались клонировать гены инулаз К. marxiatms и S. occidenlalis по экспрессии в Sacch. cerevisiae Для этого сконструированы геномные библиотеки К. marxmmts и S. occidetUalis. Штамм Sacch. cerevisiae YBS245 трансформировали ДНК каждой из двух геномных библиотек. Трансформанты высевали на селективную агаризованную среду SCI с инулином в качестве единственного источника углерода. Предполагалось, что на этой среде вырастут только те трансформанты, которые способны к секреции инулазы за счет экспрессии соответствующего гена. Параллельно определяли общую эффективность трансформации, т.е. количество |6теток, получивших плазмиду с любой вставкой. С учетом представительности геномных библиотек (данные не приведены) эффективность трансформации дрожжей в данном случае (данные не приведены) была вполне достаточной (т.е. вероятность клонирования близка к 100%) для клонирования любого гена, представленного в библиотеке (Maniatis и др , 1982) Однако, для обеих библиотек на среде с инулином (SCI) не обнаружено ни одного трансформанта.

Учитывая вышесказанное, мы пришли к выводу, что методом функциональной комплементации клонировать гены инулаз К. marxianus и S. occidetUalis невозможно.

Поскольку последовательность гена инулазы К. marxianus известна (Laloux и др .1991). для его клонирования использовали метод гибридизации с синтетическим зондом. После трансформации клеток Е. coli ДНК минимальной геномной библиотеки К.

татапт получено около 103 клонов, среди которых отобраны три клона по гибридизации с синтетическим зондом к гену инулазы К. тапиати

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, показал, что все три клона содержат плазмиды с одинаковой вставкой. Одна из плазмид (ИХ1) выбрана для дальнейшего анализа. По результатам рестрикционного анализа построена рестрикционная карта вставки, содержащейся в плазмиде ИХ1 (рис. 3). Полученная рестрикционная карта клонированной вставки почти полностью соответствует определенной ранее последовательности гена инулазы К. татапиз (1^а1оих и др., 1991). Единственное отличие состоит в наличии сайта ХЪЛ в клонированной вставке в области терминации транскрипции гена инулазы К. тагхииш.ч, в то время как, в опубликованной последовательности гена инулазы К. тагхииш.ч этот сайт отсутствует.

Проведено, также, частичное секвенирование вставки в районе первого (от начала гена) сайта Ысо\ (данные не приведены). Определенная нуклеотидная последовательность части клонированной вставки практически совпадает с опубликованной последовательностью начала гена инулазы К. татапи.ч, за исключением единственной нуклеотидной замены (1.а1оих и др., 1991)

Незначительные различия в рестрикционных картах и нуклеотидных последовательностях клонированной вставки и гена К. тагх/аних, очевидно, связаны с явлением полиморфизма генов, выделенных из разных штаммовых изолятов одного и того же вида дрожжей. Таким образом, результаты рестрикционного картирования и секвенпрования подтвердили, что вставка содержит полноразмерный ген инулазы К. тагхкишх (ШШ^т).

(!.■»> /ГсоИС.З)

И.сЛ1Л/|»1(|>) Ус"1(0.4) ('/„1(0.6) *.>||(1.(>) Л',„|( 1.3)1 £с«К[(1.3) ЛМ(2.2) I «КЛ1/ЛМ (2.4)

| I' I ' I ' I I |

л тс |сг

Рис 3 Рестрикционная карта фрагмента хромосомной ДНК К. тагхшпиз. содержащегося в плазмнде ИХ I. В^Ш/ХИо] - обозначены сайты лпгнрования концов вставки с концами вектора рР\У263 (при лигировании оба сайта рестрикции, В\>!II и ХЫА. исчезли). Цифры в скобках обозначают примерное расстояние (в т п.н. - тысяч пар нуклеотндов) сайта рестрикции от начала вставки. АТС и Тег обозначены стартовый и терминирующий кодоны гена инулазы К. тагхюпих. соответственно. Сайты локализации АТС и Тег определены с использованием опубликованной последовательности гена инулазы К. тагхюта (Ьа1оих и др.. 1991).

3. Экспрессия гена инулазы К. тагх»апих в .9асск. еегеушяе.

3.1. Оптимизация системы экспрессии гена инулазы К. тагх^апи.ч в Л'лссА. ссгсгЫяе.

Для анализа и оптимизации экспрессии гена в ЗассИ. сеге^чмае, были

сконструированы три интегративные плазмиды. ОРО-1Ми. ОТ-П^и и иТ-ГМи,

различающиеся между собой промотором, контролирующим ген INUI^„. На рис. 4 изображена структура одного из векторов, GPD-rNU. Транскрипция гена INU¡Km контролируется одним из трех промоторов: GPD (для GPD-INU), GT (для GT-liNU) или UT (для UT-INU). GPD промотор представляет собой промоторную область гена GPD Sacch. cerevisiae. Промотор UT содержит промоторную область гена GPD Sacch. cerevisiae, к 5'-концу которой подстыкован неспеиифическнй сайт узнавания активатором транскрипции (Козлов, 1997). Промотор GT состоит из сайта узнавания активатором транскрипции промотора гена CALI Sacch. cerevisiae, соединенного с делеционным вариантом промотора GPD (Козлов, 1997). Поскольку величины активностей этих трех промоторов (с |3-галактозидазой в качестве репортерного белка) различались более, чем на порядок, в зависимости от условий культивирования, мы предположили, что уровень продукции инулазы также может зависеть от промотора. Чтобы проверить эту гипотезу и выбрать оптимальный для инулазы промотор, каждой из трех плазмид был трансформирован штамм Sacch. cerevisiae YBS2I. Все полученные трансформанты приобрели способность к росту на среде SCI. т е. уровень продукции инулазы был достаточным для роста на среде с инулином в качестве единственного источника углерода. Штаммы, полученные в результате трансформации штамма YBS21 плазмидами GPD-rNU, GT-INU и UT-FNU, будут называться 21/ GPD-1NU, 21/ GT-INU и 21/ UT-INU, соответственно.

Рис. 4. Структура плазмиды GPD-INU XhiAII'sñ фрагмент плазмиды GPD-INU. содержащий ген устойчивости к ампнцилину /*-. cnli (Ыа). ген UUA3 Sacch. cerevisiae (сслсктир\'смын маркер) и промотор GPD (GPDp). объединенный с фрагментом гена MI al. кодирующим сигнальную пре-область (SP) a-фактора Sacch. cerevisiae (Kurjan н Herskowitz. 19X2). является дериватом соответствующего ЛТ>я1/Л7|-фрагмента плазмиды pWAppinsI-18 (Kozlov и др . 1995). в котором делегирована EcnRVBcH область с репликоном дрожжевой 2мкм плазмиды (orí), а сайт Xha\ заменен сайтом Л7к>| с исполь юванием линкера Xhn\. При конструировании плазмиды GPD-INU упомянутый дериват был лигирован с /Íi;/ll/,\7iríl-фрагментом клонированного гена МШкт (2 т п.н.) через соединительный фрагмент, кодирующий С-концевуго область SP до потинпнального сайта расщепления сигнальной пептндазой Sacch cerevisiae. Нуклсотидная последовательность соединительного фрагмента, включая упомянутый сайт проиессннга (обозначен стрелкой), показана над изображением плазмиды. Использованный ген INVIKm кодирует зрелый полипегттнд и содержит область терминаиип транскрипции до слита Xha\. который в плазмнле GPD-INU заменен на сайт Х1т\ с использованием линкера ,\7wl.

Для того, чтобы сравнить эффективность промоторов GPD. GT и UT и, таким образом, выбрать наиболее оптимальную систему экспрессии гена измерена

leu Civ Sof Ser V.il lie

гглг.(»лтстгслг.к:лтс

1411 ¡

HindHl// M' -{,/ GI'Dp

.Sm.il//

l l

\ \ 11RA.1

\>

INUIkm 1

pINT-INU

активность инулазы, секретируемой штаммами 21/ 0РР-1Ыи. 21/ ОТ-ИМи и 21/ иТ-Ши, на стационарной стадии роста (табл 2) В табл. 2, для сравнения, приведено, также, значение активности секретируемой инулазы штамма К. тагхишнх. Из табл 2 видно, что при данных условиях культивирования штаммы Атсс/.1. сае\ч.\1ае продуцируют сскретируемую инулазу в 3-4 раза эффективнее, чем штамм К. пшгхшпих.

Значения активности секретируемой инулазы для штаммов 21/ОРО-1Ми. 21/ОТ-1Ыи и 21/иТ-1Ыи довольно близки друг к другу. Это означает, что промотор, контролирующий экспрессию гена ¡N11! к„, незначительно влияет на уровень продукции секретируемой инулазы штаммами Sacch. сегемтае. Возможно, на уровень продукции секретируемой инулазы, в данном случае, оказывают влияние какие-то более "сильные" лимитирующие факторы на уровне трансляции, секреции или связанные со стабильностью мРНК

Для дальнейшей работы была выбрана экспрессионная система с промотором ОРО (плазмида ОРО-1Ыи), поскольку его свойства лучше изучены, чем свойства новых промоторов ОТ и иТ. сконструированных на основе промотора вРЭ (Козлов, 1997)

Таблица 2

Активность инулазы, секретируемой штаммами Sacch. сеге\чх1ае, 21/ ОРО-1Ми,

21/ GT-1NU ч 21/ UT-1NU.*

Штамм Активность. Активность.

ел/мл к. ж. ea/loVi.

21/ GPD-INU 1 5 0.31

21/ GT-INU 1 7 0.38

21/ UT-INU 1.2 0 30

К. marxianux 1.0 0.1 1

"Дрожжи выращивали на срслс YEPD до стационарной стадии роста. Активность пнула ш измеряли при .17 "С

Уровень продукции и секреции белка зависит не только от системы экспрессии, но и от свойств штамма-реципиента (Smith и др . 1985. van den Bergh и др . 1987; Sleep и др.. 1990) Вопрос о влиянии генетического бекграунда штамма на уровень продукции гстерологично экспрессируемых белков полностью пока не изучен Про Sacch. cerevixiae известно, что на уровень продукции белков оказывают влияние мутации в некоторых генах (RHO, l'I'.l'-l-J. SKI5 и др.), увеличение числа копий гена ККХ2, а также другие факторы (Kozlov и др . 1995).

С целью поиска штаммов, способных к эффективной продукции и секреции инулазы. из коллекции лаборатории отобрали несколько штаммов Sacch. cerevixiae (табл 3) Каждый штамм трансформировали интегратпвной плазмндоп GPD-1NU. Все тестированные трансформанты приобрели способность к росту на среде SCI.

Проведена оценка полученных штаммов-трансформантов по уровню продукции инулазы. секретируемой этими штаммами (табл 3). Из данных табл 3 видно, что уровень продукции секретируемой инулазы существенно зависит от штамма

Многие штаммы Sacch. cerevisiae обладают высокоактивной инвертазой. кодируемой генами семейства SUC Некоторые инвертазы обладают ограниченной пнулазной активностью (Vandamme и Derycke, 1983) Из данных табл. 3 видно, что, несмотря на наличие секретируемой инвертазы у штамма YBS6I8 не удастся тестировать инулазную активность в культуральной жидкости YBS6I8. Следовательно, инвертаза Sacch. cerevisiae не обладает пнулазной активностью

Штамм 6IS/INU обеспечивает самый высокий уровень активности инулазы в культуральной жидкости (табл. 3) и, поэтому, выбран для дальнейшей работы

Используя величину удельной активности секретируемой инулазы К. тагхюпих на инулине (88 сд/мг белка) (Rouwenhorst и др , 1990), можно оценить уровень продукции инулазы штаммами Sacch. cerevisiae Концентрация секретируемой инулазы 618/INU на стационарной стадии роста составляет 73 мг/л к ж или 1 I мкг/Ю'кл Для Sacch. cerevisiae такой уровень секреции гетерологичного белка близок к максимальному (без использования увеличения плотности культуры) (Sleep и др . 1990)

Таблица^

Активность инулазы, секретируемой различными штаммами Sacch. cerevisiae *

Штамм-реципиент Полученный штамм Активность, ед/мл к ж Активность. ед/10 "кл

YBS6I8 618/INU 3 2 0 47

YBS248 248/INU 1.8 0 28

YBS254 254/1NU 0.9 0 14

YBS385 385/INU 1 0 0 20

YBS389 389/INU 2.4 0 42

YBS4I8 418/INU 1.0 0.17

YBS618 0 0

*В первой колонке прслставлены лабораторные названия пгтпчмоп Sncr.li ссге\ч\1пс. испытанных в качестве рспнпнс1ггов. а во второй колонке - названия штаммов полученных путем трлнс(|юрмацин соответствующих РСНИПИС1ГТОВ пла шилом ОРО-1Ми (кроме последней строки» Дрожжи выращивали на среде УНРО ло стационарно!» ст:ипн роста Активность ит.ъпы и теряли при 50 ''С.

3.2. Днялш оелкопого продукта экспрессии геня /N01 а-, п ЯиссЬ. ссгс\ч.\1пе.

Для того чтобы охарактеризовать белковый продукт экспрессии гена инулазы /Л'У,7д„, в Sacch. сеге\чмае провели электрофорез секретируемой инулазы в ПААГ-гсле в денатурирующих условиях (рис 5). При этом использовали нативную и дегликозилированную формы инулазы. секретируемой штаммом 618/1Ыи В качестве отрицательного контроля использовали культуральную жидкость штамма УВБб 1Э Из рис 5 видно, что полосы в диапазоне 83-125 кДа (для к ж . не обработанной глюкозампнидазой Н) и 63 кДа (для к.ж., обработанной глюкозампнидазой Н) отсутствуют в отрицательном

контроле. Следовательно, эти полосы относятся к натнвной и дегликозилнрованной инулазе, соответственно.

Молекулярная масса денатурированной, дегликозилнрованной инулазы, продуцируемой 6I8/1NU (63 кДа) соответствует (с учетом погрешности измерения) величине молекулярной массы дегликозилнрованной субъединицы инулазы К. marxianus. равной 64 кДа (Rouvvenhorst и др , 1990) Следовательно, пептид, являющийся продуктом экспрессии гена !NUIK„ в .Seiet'/), cerevisiae, тождественен пептиду инулазы, продуцируемой К. marxianus. В тоже время, диапазон распределения молекулярной массы гликозилнрованной инулазы, продуцируемой Sacch. cerevisiae (83-125 кДа) оказался шире, чем для натнвной инулазы К. marxianus (87-102 кДа) (Rouvvenhorst и др., 1990) При этом, спектр молекулярной массы инулазы Sacch. cerevisiae в среднем смещен в сторону увеличения, по сравнению с инулазой К. marxianus.

Из полученных результатов можно заключить, что степень гликозилирования инулазы в Sacch. cerevisiae (24-50%) в среднем выше, чем степень гликозилирования инулазы в К. marxianus (26-37%). Данный результат не является неожиданным, поскользу известно, что гликопротеины, секретируемые Sacch. cerevisiae, как правило, подвержены гипергликозилированию (Buckholz и Gleeson, 1991).

Рис.5 Денатурирующий электрофорез в ПААГ-гсле натнвной и дегликознлированной инулазы. сскрстнрусмой штаммом Г>1К/1Ыи Пробы к ж. отбирали на стационарной стадии роста шта.ммоп УВЯЛ IX и 618/ТЫи на среде УЕРЭ и концентрировали I-к.,к УВБГИ* (130 мкл). 2- к.ж. 618/1Ы11 (150 мкл); 3-к.ж. 61Х/1Ыи. обработанная глюкозаминидазон Н (30 мкл). В скобках указано начальное количество к.ж. (до концентрирования), нанесенной в гель Справа от рисунка приведены размеры белков (в кДа). пспольз\емых в качестве маркеров подвижности.

3.3. Температурная н pli- зависимости активности инулазы в зависимости от шгамма-продуцента (К. marxinnus п Sacch. cererisiue).

Температурная и рН- зависимости активности фермента являются важнейшими его характеристиками, от которых зависит подбор наиболее оптимальных условий культивирования штаммов, продуцирующих данный фермент Поэтому, необходимо было убедиться, в том. что температурной и рН- оптимумы активности инулазы Sacch. ccrcvisutc не меняются по сравнению с аналогичными характеристиками для К. marxuvms

Для инулаз. продуцируемых штаммами 6IS/INU и К. marxianus изучены зависимости их активности от температуры и рН (рис 6) Из рис 6 видно, что температурный (50 "С) и рН (5 2) оптимумы инулазы. секретируемой 6I8/INU совпадают с соответствующими характеристиками инулазы донора. Характер обеих зависимостей у 618/INU меняется незначительно по сравнению с характером соответствующих

замиснмостен для К. marxiaims, хотя у фермента, продуцируемого штаммом 6I8/INU оба оптимума (особенно pH-оптимум) выражены более резко, чем у натнвного фермента.

Рис fi. Влияние температуры (А) н pH (В) на ферментативную активность ииулазы. секретируемон штаммами 6I8/1NU (открытые символы) и К. тагхютн (закрытые символы) В качестве источника фермента использовали к ж., отобранную на стационарной стадии роста дрожжей на среде YEPD

3.4. Продукция н секреция ииулазы К. marxianus штаммом Sacclt. cerevisiae 61S/1NU.

Как было сказано выше, штамм 6I8/INU способен продуцировать икулазу в количестве, достаточном для эффективного роста на среде с инулином в качестве единственного источника углерода Для того, чтобы подробнее изучить экспрессию гена INIII(,„ в Sacch. cerevisiae. были получены кинетики роста, накопления активности ииулазы в культуралыюй жидкости и утилизации инулина при росте штамма 6I8/INU на среде YEP1 (рис 7) Для сравнения на рис 7 представлены, также, аналогичные зависимости при росте штамма 6I8/INU на среде с глюкозой (YEPD) Из рис. 7 видно, что характер роста штамма 618/INU на средах YEPD и YEPI несколько различается. Кривая роста (титр клеток) на среде YEPI отличается от кривой, описывающей диауксический рост на глюкозе (среда YEPD) Кроме того, в экспоненциальной фазе константа скорости роста (ц) на среде YEPD (ц=0 42) была выше, чем на среде YEPI (ц=0.38), а в стационарной фазе титр клеток на среде YEPI был выше, чем на среде YEPD. Вероятно, это связано с тем. что на инулине клетки росли в условиях лимита по глюкозе/фруктозе, поэтому в данном случае отсутствует эффект Крэбтри [переход к сбраживанию Сахаров при их избыточной концентрации в аэробных условиях (Crabtree. 1929)], сопровождающийся снижением эффективности ассимиляции углерода.

Кинетики накопления инулазной активности в культуралыюй жидкости при росте на средах YEPD и YEPI оказались довольно близкими Это не является неожиданным, поскольку в обоих случаях ген ШШкт экспрессировался под контролем сравнительно сильного и конститутивного промотора (GPDp) (Bitler и Ецап, 1984). Характерной особенностью кинетик накопления активности секретируемой ииулазы (для обеих сред) является то. что накопление активности ииулазы п. следовательно, секреция ииулазы продолжается на стадии роста клеток, соответствующей позднему стационару Обычно, максимальный уровень секреции в дрожжах приходится на стадию позднего логарифма.

—I '

I 3 з

20 25 30 35 <10 ¿5 50 55 65 ? * 5

рП

Tesmqwypa. °С

5 2

J S

Процесс секреции в дрожжах сопряжен с почкованием клеток, поэтому секреция практически прекращается, как только клетки перестают делиться (Ыоуюк и др., 1981). В данном случае инулаза продолжает интенсивно секретироваться, даже, когда клетки не делятся уже в течение 20 часов. Для обеих сред максимальная скорость продукции инулазы, Рг, в стадии позднего логарифма составляет около 7-8. К моменту начала стационарной стадии роста Рг снижается до 2-3 и данное значение Рг сохраняется в течение последующих 15-17 часов, после чего начинает медленно снижаться. Этот факт, вероятно, связан со свойствами самой инулазы, поскольку секреция в стадии стационара наблюдается и для инулазы К1иу\>еготусех /гарИя при росте на среде с инулином (Оегуске, 1981)

Из полученных результатов можно заключить, что несмотря на некоторые различия в характере рассмотренных кинетик для каждой из двух сред, УЕРО и УЕР1, скорость продукции инулазы 618/Ши оказалась достаточной для того, чтобы обеспечить этому штамму рост на среде УЕР1 практически с такой же скоростью, как на среде УЕРО

Рис.7 Рост штамма 618/1Ыи на 25 - ю - г 4 . 25

Чтобы более детально изучить особенности продукции и секреции инулазы К. тагхмннх, для штамма 618/1N и получена кинетика распределения активности инулазы на фоне кинетики роста клеток (рис. 8) Кинетика распределения активности инулазы представляет собой две кинетики: кинетику накопления активности инулазы в культуральнон жидкости и кинетику накопления активности инулазы, связанной с клеткой (т с находящейся внутри клетки или ассоциированной с клеточной стенкой)

Как видно из рис. 8. почти на всех стадиях роста обе кинетики накопления активности инулазы имеют аналогичный характер Кроме того, до стадии позднего стационара активность инулазы примерно поровну распределяется .между клеткой и культуральнон средой. Однако, в определенный момент позднего стационара кривые резко расходятся В культуральной среде активность инулазы продолжает накапливаться, в то время как. величина активности инулазы, связанной с клеткой, перестает расти и. даже, снижается. Возможно, в момент расхождения кривых в клетке включаются какие-то механизмы, благодаря которым распределение инулазы смещается в сторону секреции. При ферментации К. тагх1аппх на среде с инулином также наблюдается некоторое снижение величины удельной (на мл культуры) клеточной активности инулазы (Оегуске.

средах УЕРО (закрытые символы) и УЕР1 (открытые символы). Круги - 1§Т. где Т -титр клеток, квадраты - активность инулазы в культ\ральной жидкости, треугольники - концентрация глюкозы или инулина в культуральной жидкости В данном случае и везде далее активность инулазы измеряли при 50 "С.

0 20 30 40 50 13ромя. ч

Однако, это снижение наминается значительно раньше - на стадии роста клеток, соответствующей раннему стационару Вероятно, характер распределения инулазы, продуцируемой Ь'ассИ. сеге\'шае. определяется как свойствами самой инулазы, так и свойствами штамма, ее продуцирующего

Рис 8 Распределение инулазы при росте штамма |

\occ7j сст'шпе 61Х/1Ыи на среле УЕРО Круги - 1дТ, где ]

Т - титр клеток: закрытые треугольники - активность 2 j

2 ' ■ / *

секретнрусмон инулазы: открытые треугольники - , >- /

активность инулазы. связанной с клеткой. ~ , .

/

15 ГО :5 10 15 ао «5 50 W Иречя. ч

Чтобы выяснить, насколько характер продукции и распределения инулазы в Sacch. ccrevtsiae связан со свойствами самого фермента, мы сравнили ее распределение с секрецией и распределением другого фермента, продуцируемого тем же штаммом. В качестве такого фермента выбрали глюкоамилазу Sacch. cerevisiae. которая кодируется геном STA2 и контролируется собственным промотором (Lambrechts и др , 1991). Этот ген содержится в геноме штамма Sacch. cercvisiae YBS618 и, соответственно, в производном от него штамме 618/INU

Поскольку экспрессия гена STA2 подвержена катаболитной репрессии (Kartasheva и др . 1906), для оценки уровня продукции глюкоамплазы при культивировании штамма 6I8/INU необходимо использовать источники углерода, обеспечивающие состояние дерепрессии гена STA2. Одним из таких источников углерода для систем экспрессии с промотором STA2 является смесь этанола с глицерином (Kartasheva и др.. 1996) На рис 9Л представлены кинетики распределения активности инулазы и глюкоамилазы на фоне кинетики роста штамма 6I8/INU на среде YEPEG Из рис. 9А видно, что активность секретпруемой глюкоамилазы раньше достигает стационарного уровня, чем активность соответствующей фракции инулазы.

Накопление глюкоамилазы в клетке и в культуральной среде может быть лпмнтнропано работой промотора. Экспрессия гена ST.A2 в 6IS/INU контролируется собственным промотором, который, в отличие от GPD промотора, контролирующего экспрессию гена инулазы. не является конститутивным (Kuchin и др . 1992). Однако, известно, что на стационарной стадии роста Sacch. ccrcvisiac в клетках сохраняется высокий уровень STA2 мРНК (Pretorins и лр . 1986), что свидетельствует об открытом состоянии STA2 промотора

Чтобы более наглядно рассмотреть и сравнить особенности продукции инулазы и глюкоамилазы штаммом 6IS/INU. из кннетнк, представленных на рис. 9А, получили кинетики скорости продукции секретируемых инулазы и глюкоамилазы (рис. 9В) и

инулазы и глюкоамилазы, связанных с клеткой (рис. 9С). Из рис. 9В видна драматическая разница в характере снижения Рг секретируемых инулазы и глюкоамилазы в стадии позднего стационара. Значение Рг глюкоамилазы становится равным нулю, когда Рг инулазы еще сохраняет довольно высокое значение В характере снижения величины Рг инулазы и глюкоамилазы, связанных с клеткой, принципиальной разницы не наблюдается (рис. 9С). Рг обоих ферментов становится равным нулю примерно в одно и тоже время.

Можно предположить, что секреция глюкоамилазы ограничена обратной регуляцией Эффект обратной регуляции состоит в том, что глкжоамилаза, продуцируемая Sacch. cerevisiae, начиная с некоторой концентрации негативно влияет на собственную продукцию (Suntsov и др., 1990). Механизм обратной регуляции полностью пока не изучен, однако, известно, что это явление наблюдается и тогда, когда ген STA2 контролируется конститутивным GPD промотором (Сунцов Н. И., ГосНИИГенетика, частное сообщение). Этот факт свидетельствует о том, что явление обратной регуляции является независимым от промотора. Полученные результаты могут означать, что. во-первых, явление обратной регуляции глюкоамилазы возникает на уровне секреции, и, во-вторых, инулазаЛ marxianus не подвержена обратной регуляции

Из результатов, рассмотренных выше и их обсуждения, можно заключить, что дрожжи Sacch. cerevisiae способны к секреции белков на стадии роста клеток, соответствующей позднему стационару, что продемонстрировано для инулазы. Это, в свою очередь, означает, что возможно неограниченное накопление инулазы в культуральной среде. Данное свойство инулазы К. marxianus позволяет использовать ее для создания репортерных моделей с целью изучения особенностей секреции штаммов-реципиентов.

* . к.

- .6

Hl

5 2 i£ '

35 40 *5 50 55 SO 65 70 75 НрСММ. Ч

„

• \\

! /V/ \ч

\

г I- - —-,-------

» «О «5 50 55 60 65 70 75 Врем«. -I

I i

Рис Ч. Распределение (А) и скорость продукции (В и С) инулазы (треугольники) и глюкоамилазы (квадраты), продуцируемых штаммом '>IК/1 NI' при росте на среде УЕРЕв Круги - ^Т. где Т - титр клеток: закрытые символы - активность секретируемых ферментов: открытые символы - активность ферментов, связанных с клеткой.

\г

13

I !

V

)5 <0 <5 50 55 60 65 70 75 Врем«, ч

-I. Конструирование штамма Sacch.cerevisiae 695/IiNU - продуцента фруктозы на ннулнн-еодержашен среде.

За основу для создания штамма, способного накапливать фруктозу в культуральнои среде, выбран штамм Sacch. cerevisiae YBS695, который является изогенным дериватом штамма YBS618 с нуль-мутацией хромосомного гена НХК2 (Ихк2Л 1::LEU2) (Kartasheva и др , 1996).

Для того, чтобы на основе штамма YBS695 генотипа hxk2 сконструировать штамм генотипа hxkl hxk2 1ЫШкт, необходимо разрушить в геноме YBS695 ген НХК1 и ввести в геном YBS695 ген ШШ,-т. С этой целью сконструирован ДНК фрагмент F(Ipl). содержащий экспрессионную кассету с геном инулазы К. marxianus и плечи рекомбинации, гомологичные окрестностям гена НХК1 (рис 10). В результате трансформации штамма YBS695 произошло замещение хромосомного гена НХК\ интегративным фрагментом ДНК F(Ipl). Полученные трансформанты обладали сразу двумя новыми свойствами Они. во-первых, не росли на среде SCF с фруктозой в качестве единственного источника углерода, а значит, в геноме трансформантов разрушены гены HXKI и НХК2, и, во-вторых, приобрели способность продуцировать инулазу при росте на среде YEPD. Один из трансформантов (штамм 695/TNU генотипа />xi/zl::F(Ip[) /NUIkm hxk2A..LEU2) выбрали для дальнейшего изучения.

HXKL Ter URA3 GPDp INUlKm HXKR

ГТ I II I I

Рис. 10. Структура фрагмента F(lpl). HXKL и HXKR (размером соответственно 0 2 и 0 6 т п и.) - фрагменты полноразмерного гена HXKI Sacch. cercvtsiac (Kopctzki и др.. 19X5) содержащегося в плазмнде pBWI 13: Тег (0.4 т.п.н.) область терминацни транскрипции гена 1'CiKl Sacch ccrcvisiae (Hitzcman и др.. 19X2); URA5- GPDp - SP - INUIKm- сегмент, идентичный аналогичному фрагменту плазмнды GPD-INU (рис. 4).

5. Изучение свойств штамма 695/INU.

Для того чтобы охарактеризовать свойства штамма 695/INU были изучены рост, секреция инулазы и утилизация источника углерода при росте 695/INU на средах с глюкозой (YEPD) и инулином (YEPI) (рис II). Из рис. 11 видно, что неспособность к поглощению фруктозы вследствие нуль-мутаций hxkl и hxk2 блокировала рост штамма YBS695/INU на среде YEPI. но не препятствовала эффективному росту этого штамма на среде с глюкозой YEPD

25 -, 10

Г S « 25

Рис. 11. Рост штамма 695/1Ми иа среде УЕРО (закрытые символы) и на среде \'ЕР1 (открытые символы). Круги - ^Т, где Т - титр клеток; квадраты- активность инулазы в культуральнон жидкости; треугольники -концентрация глюкозы или инулина в культуральнон жидкости.

О 20

30 4 0 50 60

Время, ч

При росте на среде YEPD штамм 695/INU эффективно продуцирует секретируемую инулазу, в то время как, на среде YEPI уровень активности инулазы к концентрация инулина в культуралыюй среде остаются практически на первоначальном уровне, вероятно, за счет низкого титра клеток.

Чтобы выяснить, каким образом нуль-мутации hxk\ и hxkl в геноме штамма 695/INU влияют на его рост и продукцию инулазы, кинетики роста и накопления активности секретируемой инулазы при росте штамма 695/INU на среде YEPD сравнили с аналогичными зависимостями для штамма 618/INU (рис. 12). Из рис. 12 видно, что, несмотря на делеции в генах обеих гексокиназ, штамм 695/TNU растет на среде YEPD практически с такой же эффективностью, как штамм 618/TNlf. Константа скорости роста на глюкозе для штамма 695/INU (ц=0.37) была не намного ниже, чем для штамма 618/INU (ц=0 42). В отсутствие гексокиназ функция фосфорнлирования глюкозы полностью переходит к глюкокиназе. Следовательно, активность одной глюкокиназы компенсирует отсутствие обеих гексокиназ. Это может показаться странным, если учесть, что в норме активность глюкокиназы весьма незначительна по сравнению с активностью гексокиназ. Но, в то же время, известно, что отсутствие гексокиназ каким-то образом способствует активизации глюкокиназы (Gancedo. 1994), что подтверждается полученными результатами.

Характер роста клеток штаммов 695/INU и 6I8/INU на среде YEPD различается. В кривой роста штамма 695/INU отсутствует диауксический переход, характерный для роста на среде с глюкозой. Поскольку известно, что продукт гена НХК2 участвует в репрессии транскрипции некоторых катаболитных генов (Trumbly, 1992), в данном случае можно предположить, что отсутствие гексокиназы PII приводит к дерепрессии экспрессии генов, участвующих в утилизации этанола.

По накоплению активности инулазы в культуральной жидкости штаммы 6I8/1NU и 695/INU практически не различались. Также, как для штамма 6I8/INU, величина максимальной скорости продукции секретируемой инулазы составила около 7-8, а на стационарной стадии роста клеток - 2-3 (см. выше). Это сходство, по-видимому, обусловлено тем, что в обоих штаммов экспрессия гена INUI^„ контролируется одним и тем же промотором GPDp, активность которого не зависит от функционирования генов

гексокиназ. Скорее всего, делеции в генах гексокнназ не повлияли, также, на процессы трансляции и секреции инулазы.

Гаким образом, делегирование генов гексокиназ в геноме штамма ЗассИ. сетчхше незначительно снижает его скорость роста (на логарифмической стадии роста клеток), несколько меняет характер роста клеток и не влияет на продукцию секретируемой инулазы при росте на среде УЕРО.

5.4. Накопление фруктозы вкультуральной среде при культивировании штамма 695/Т1Ч11 на среде с этзнблом, глицерином и инулином (УЕРЕС1).

С целью изучения способности 695/11Чи накапливать фруктозу в культурапьной жидкости штамм выращивали на среде УЕРЕ01, содержащей инулин, а также этанол и глицерин, которые в данном случае добавляли в среду в качестве источника углерода, поскольку штамм 695/ПЧи не способен утилизировать инулин (см. выше). На рис. 13 представлены кинетики роста, накопления активности инулазы и фруктозы в культуральной жидкости при росте штамма 695/Ши на средах УЕРЕ01 (с 2, 6 и 10 % инулина). Как видно из рис.13, исходная концентрация инулина в среде не влияет или влияет незначительно на скорость и характер роста клеток.

При всех испытанных концентрациях инулина имела место эффективная секреция инулазы. сопровождаемая накоплением фруктозы в культуральной жидкости. Следовательно, наличие фруктозы в культуральной среде (даже в высоких концентрациях) не влияет на продукцию инулазы, штаммом Sacch. сегеггч/ае.

Максимальная концентрация фруктозы, достигаемая после полного гидролиза инулина в культуральной жидкости, не снижается в течение последующего времени, как это можно было бы ожидать в случае ограниченной ассимиляции фруктозы клетками. Это означает, что даже при значительном повышении концентрации фруктозы в среде в дрожжах ЛоссЛ. сеге\чз1ае не происходит активации шунтирующего метаболического пути утилизации фруктозы.

При всех испытанных концентрациях инулина в среде инулаза К. тагсюпих полностью гидролизует инулин, превращая его во фруктозу. Следовательно, ингибирование фруктозой не оказало драматического влияния на кинетики накопления фруктозы (т.е. утилилизацию инулина). Вероятно, это объясняется очень высокой

10

5

Рис. 12. Рост клеток (круги) и накопление активности инулазы в культуральной жидкости (квадраты) при росте штаммов 618/1Ми (закрытые символы) и 695/!>Ш (открытые символы) на среде

УЕРа

О 20 30 40 50 50 Время, ч

концентрацией инулазы в культуральной среде, что, в свою очередь, связано с тем, что эффективная секреция инулазы продолжается даже в стадии позднего стационара (см. выше)

Концентрация глюкозы в культуральной жидкости на стационарной стадии роста 695/TNU на среде YEPEGI с 10% инулина оказалась меньше 0.005 %, т.е. на уровне погрешности измерения. Таким образом, можно сказать, что в процессе роста на среде с инулином штамм 695ANU полностью очищает образующийся фруктозный сироп от примеси глюкозы.

20 18

- 16

14 к

и

|-,2я

- 10 9

30 40 50 Время, ч

Рис. 13. Накопление фруктозы штаммом 695/ГЫ1) на среде УЕРЕ01 с содержанием инулина 2 % (А). 6 % (В), 10 % (С). Круги - 1ВТ. где Т - титр клеток; квадраты - активность инулазы в культуральной жидкости; треугольники - концентрация фруктозы в культуральной жидкости.

30 40 Время, ч

Испытанные концентрации инулина (до 10%), при которых инулин полностью превращается во фруктозу, близки к исходным концентрациям сахаросодержащего субстрата, характерным для промышленных технологий крупномасштабного производства Сахаров. Процесс микробиологической трансформации инулина во фруктозу, основанный на штамме 695/Ши, может быть, по-видимому, усовершенствован путем увеличения титров клеток с пропорциональным увеличением инулазной активности. Увеличение ннулазной активности позволит повысить исходную концентрацию инулина в среде и сократить продолжительность культивирования. Таким образом, штамм 695/Ши может служить основой для разработки новой технологии производства чистой фруктозы из инулинсодержащего сырья.

Более того, штамм 695/1М1! может быть использован для производства фруктозы из сахарозосодержащего сырья. Подобно другим штаммам ЗассЛ. сегедаг/ае этот штамм

обладает высокоактивной инвертазой, кодируемой геном 5(/С2. В дополнение к этому инулаза. кодируемая геном ¡ЫШкт, также обладает ннвертазной активностью (Уапс1аттс и 1)егуске, 1983), что повышает способность штамма 695/ПЧи к специфическому гидролизу сахарозы. В результате действия пнвертаз образуются эквимолярные количества глюкозы и фруктозы. Также, как в случае роста на инулинсодержащей среде, фруктоза будет накапливаться в культуральной жидкости штамма 695/ТКи, в то время как глюкоза будет либо сбраживаться до этанола, либо ассимилироваться аэробно в зависимости от условий культивирования.

При всех описанных ранее способах получения фруктозы конечный продукт содержит примесь глюкозы, поскольку с помощью ионообменной хроматографии полностью избавиться от глюкозы не удается. В данном случае, независимо от типа используемой среды (с инулином или с сахарозой), культивирование штамма 695/11Чи будет сопровождаться биологической очисткой фруктозных сиропов от глюкозы. Кроме того, способность штамма 695/Г>Ш секретировать инулазу в стадии позднего стационара открывает возможность использовать этот штамм для создания биотехнологических систем с иммобилизованными клетками. Не исключено, что новый биологический способ получения фруктозы будет успешно конкурировать с ныне существующими.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген инулазы К. тагхиит.ч и оптимизирована его экспрессия в Ь'ассЬ. сегсу/хше. При этом, уровень экспрессии гена инулазы обеспечивает штамму За с с И. ссгеУ1.\1ае скорость роста на инулине близкую к максимальной.

2. Описан факт ингибирования активности инулаз конечным продуктом реакции -фруктозой.

3. Обнаружено, что секреция инулазы К. тагхшпих дрожжами ЗассИ. сеге^чхшс сопряжена с ее гипергликозилнрованнем.

4. На модели инулазы показано, что дрожжи ХассЬ. ссгсу/хшс обладают секреторной активностью белков в стадии позднего стационара.

5. Одновременное использование гетерологичной экспрессии и изменения базовых характеристик метаболизма клетки позволило сконструировать штамм Л'оссЛ. сегс\чхше, способный накапливать до 10 % фруктозы (свободной от примеси глюкозы) в культуральной жидкости при росте на среде с инулином.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Баева Л Ф., Козлов Д.Г.. Бревнова Е.Э., Беневоленский С В. Клонирование гена а-амилазы дрожжей Saccharomyces fibuhgera и его экспрессия в Saccharomyces cerevisiae. 1996, Прикладная биохимия и биотехнология, 32(3), 311-3 14.

2. Brevnova Е Е., Kozlov D G , Benevolensky S.V. Expression of Kluyveromyces marxianus inulase gene in Saccharomyces cerevisiae. Baev Memorial Conference, 20-22 May. 1996, Moscow, Russia, p.294.

3. Бревнова Е.Э., Козлов Д.Г , Ефремов Б.Д , Беневоленский С.В Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент фруктозы из инулина. 1998, биотехнология, I, 12-20

4. Brevnova Е. Е., Kozlov D G . Efremov В. D., Benevolensky S. V Inulase-secreting strain of Saccharomyces cerevisiae produces fructose. 1998, Biotechnology and Bioengeneering, in press.