Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы

Холявка, Марина Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы"

004606657

На правах рукописи

Холявка Марина Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИНУЛИНАЗЫ

03.01.02. - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2010

004606657

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Ковалева Тамара Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук, ■ доцент Семенова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 29 июня 2010 года в 13:00 на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 27 мая 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования в области получения высокостабильных гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов приобретают все большую актуальность. Общепризнано, что при промышленном масштабировании каталитических процессов гетерогенный режим их проведения является экономически более выгодным по сравнению с гомогенными технологиями, так как при этом значительно упрощается и удешевляется весь производственный цикл. Очевидно, что носители для гетерогенных биокатализаторов должны быть доступными, обладать хорошими эксплуатационными свойствами и высокой адсорбционной емкостью по отношению к ферментативно активному компоненту.

Изучение структурно-функциональных, физико-химических и кинетических свойств гликозидгидролаз (инулиназ, инвертаз, фруктозилтрансфераз, леваназ) в нативном и иммобилизованном состояниях имеет большое теоретическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей, играют важную роль в контролировании процессов клеточной дифференцировки и развития. Они также могут быть использованы в циклах производства Сахаров с различной степенью полимеризации, • в частности, инулина, фруктозы и инулоолигосахаридов - неотъемлемых компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения.

В отечественной пищевой промышленности, в том числе в производстве сахаристых веществ (крахмальные патоки, глюкозо-фруктозные и инвертные сиропы), гетерогенные биокаталитические процессы практически не реализованы. В связи с этим разработка отечественных биотехнологических производств и замена устаревших гомогенных катализаторов на передовые гетерогенные является актуальной.

Решение многих вопросов и задач, связанных с методическими приемами иммобилизации, подбором носителей, определением кинетико-термодинамических параметров катализа, является необходимым условием для создания новых технологических разработок, конструирования реакторов и проектирования более эффективных гетерогенных биокатализаторов пролонгированного действия для промышленности, медицины и аналитических целей.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение структурно-функциональных, физико-химических и кинетических свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы, выяснение особенностей гидролиза молекулы инулина нативными и иммобилизованными ферментными образцами, определение типов взаимодействий между белковой глобулой и матрицами ряда синтетических ионитов.

В связи с вышесказанным перед нами были поставлены следующие задачи: 1) получение гомогенных препаратов инулиназы из Шиууеготусея татапш и НеНапАш шЬегояш и исследование надмолекулярной организации

этих ферментов; 2) поиск наиболее перспективного носителя для иммобилизации инулиназы и исследование механизма взаимодействия молекулы фермента с матрицей синтетических ионитов; 3) изучение физико-химических и кинетических свойств инулиназ в свободном и иммобилизованном состояниях; 4) исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Helianthus taberosus; 5) изучение режимов работы гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного действия.

Научная новизна: разработана методика получения гомогенных препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberósus-, определены молекулярные массы и линейные размеры инулиназ из Helianthus tuberósus; впервые для визуализации молекул инулиназ был применен метод атомно-силовой микроскопии; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы, адсорбированной на синтетических катионитах и анионитах; установлены закономерности процесса термической инактивации инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberósus.

Практическая значимость. Получены гомогенные препараты инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-ЗОЗ и инулиназ I, II и III из клубней Helianthus tuberósus. Степень очистки и выход фермента соответственно 39,8 и 13,5 %, 55,7 и 5,4 %, 28,9 и 3,1 %, 21,6 и 1,9 %. Показано, что оптимальными условиями гидролиза инулина для инулиназы из Kluyveromyces marxianus являются температура катализа 50 °С и рН 4,7. Энзимы растительного происхождения характеризуются оптимумами функционирования соответственно 48 °С, рН 6,8 (I), 39°С, рН 6,2 (II) и 44 °С, рН 4,5 (III). Изучение особенностей молекулярной организации расширило представление о механизмах регуляции функциональных свойств гликозидгидролаз in vivo.

Предложены гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованной инулиназы, определены оптимальные условия их функционирования. Установлено, что катионит КУ-2 и анионит АВ-17-2П, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей для адсорбции энзима. Показано, что для дрожжевой инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, оптимум рН практически не изменяется, а температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного фермента. Иммобилизованные на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П препараты инулиназы из Helianthus tuberósus проявляют максимальную каталитическую способность в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7.

Выявлены закономерности процесса термической инактивации ферментов из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberósus, что позволяет подобрать температурный режим для использования препаратов в производственных циклах. Разработаны технологические режимы работы

реактора непрерывного действия, которые можно рекомендовать для применения в промышленных масштабах.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на научной конференции «Innovation Technologies» (New-York, 2007); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», (Москва, 2008); Международной научной конференции «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); Втором международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Международном междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); конференции Десятого юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века» (Москва, 2009); международной научно-практической конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований '2009». (Одесса, 2009); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2009); III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); International Conference «Nanobiophysics: Fundamental and Applied Aspects» NBP 2009 (Kharkov, 2009); в материалах VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ - 2010» (Севастополь, 2010), а также на ежегодных научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2008 - 2010).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 23 публикации: 12 статей и 11 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработана методика выделения и очистки до гомогенного состояния инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 и инулиназ I, II и III из клубней Helianíhus tuberosus.

2. Инулиназа, выделенная из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianíhus tuberosus функционируют в форме гетеродимеров, инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

3. Дрожжевая инулиназа более устойчива к температурным воздействиям по сравнению с энзимами растительного происхождения.

4. Адсорбционный способ иммобилизации инулиназы позволяет сохранить до 75,5 и 80,4 % активности нативного энзима у фермента дрожжевого и растительного происхождения соответственно. Ионообменные смолы АВ-17-2П и КУ-2, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей для адсорбции инулиназы.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 178 страниц машинописного текста; состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 253 источника. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков и 21 таблицу в основном тексте и 22 рисунка в «Приложении».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В главе дана биологическая характеристика инулиназ и их продуцентов, в сравнительном аспекте представлены физико-химические и структурно-функциональные свойства инулиназ, кинетические параметры реакции ферментативного гидролиза инулина, охарактеризован механизм ферментативного гидролиза полифруктанов, а также рассмотрены методы иммобилизации инулиназы и их практическое применение.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектами исследования были инулиназы, выделенные из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus и клубней Helianthus tuberosus. В качестве субстрата использовали инулин фирмы MP biomedicals. В качестве носителей для иммобилизации применяли ионообменные смолы АВ-17-2П, КУ-2, КУ-2-8, КУ-2-8чС, IMAC-HP, АВ-16-ГС, AM 21 А, ЭДЭ-10П, АН-12П, IMAC-HP, PUROLITE и ионообменные волокна ВИОН КН-1, ВИОН АН-1 и КОПАН-90.

Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus осуществляли глубинным способом. Осаждение белков ацетоном, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию проводили по стандартным методикам (Кочетов Г.А., 1980). Электрофорез белков осуществляли по модифицированному методу Дэвиса. По окончании электрофоретического разделения производили окрашивание белковых полос нитратом серебра по методу М.В. Нестеренко (1994). При определении кажущейся молекулярной массы инулиназы применяли метод SDS-PAGE электрофореза.

Метод определения каталитической активности инулиназы основан на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента, при помощи реакции Селиванова на фруктозу (Ермаков А.И., 1987). За единицу инулиназной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль фруктозы за 1 мин. Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (О.Н. Lowiy et al., 1951). Для иммобилизованной инулиназы использовали модифицированный метод Лоури. Сущность модификации заключалась в том, что на первом этапе анализа осуществляли разрушение связей между матрицей носителя и молекулой фермента. Для этого

обрабатывали иммобилизованный препарат раствором К,Ыа-тартрата, приготовленном на 1 М NaOH при 50 °С в течение 10 мин.

Подготовку к работе ионообменных смол и волокон и сорбционную иммобилизацию осуществляли по стандартным методикам (А.Ф. Жуков и др., 2001; Полянский Н.Г., 1976). Для исследования процесса термической инактивации белков применяли цифровую методику дифференциально-термического анализа. Эксперименты проводили в температурном интервале 20-85 °С со скоростью нагревания 1-2 °С/мин. Шаг считывания данных составлял 1 с. Визуализацию молекул инулиназы проводили методом атомно-силовой микроскопии в лаборатории наноскопии и нанотехнологии ЦКПНО ВГУ на сканирующем зондовом микроскопе SOLVER P47PRO.

Определение доли агрегированных и инактивированных молекул осуществляли, используя стандартные подходы. Подготовку и анализ образцов методом инфракрасной спектроскопии проводили по стандартной методике. Измерения осуществляли с помощью ИК-спектрофотометров SPECORD М-80 и Vertex-70. Определение размеров молекул методом динамического светорассеивания проводили на приборе Photocor complex (X = 647 нм, лазер гелий-неонный). Статистическая обработка результатов экспериментов осуществлялась при уровне значимости 5 % с использованием t-критерия Стьюдента.

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНУЛИНАЗ ИЗ

KLUYVEROMYCESMARXIANUS И HELIANTHUS TUBEROSUS И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ

3.1. Очистка инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianíhus tuberosus

В результате 4-стадийной обработки был получен препарат инулиназы со степенью очистки 39,8 и выходом 13,5 %. Протокол очистки представлен в табл. 1.

Таблица 1

Протокол очистки инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303

Стадия очистки Объем, мл Активность, ед/мл Общее число единиц активности Концентрация белка, мг/мл Удельная активность, ед/мг Выход, % Степень очистки

Экстракт 100 40,12 4012 72,2 0,56 100 1

Осаждение ацетоном 30 37,90 1137 58,4 0,65 28,3 1,2

G-25 8 125,25 1002 31,7 3,95 25,5 7,1

ДЭАЭ-целюлоза 5 154,80 774 16,6 9,33 19,3 16,8

G-200 3 179,82 539,5 8,1 22,10 13,5 39,8

Установлено, что для экстракции инулиназы из НеНаыЪт шЬегоъиз более целесообразно применять 10 % №С1 и 1-часовую инкубацию при-37 °С, а для осаждения можно использовать ацетон и изопропиловый спирт в соотношениях 1:3 и 1:4. В следующей серии экспериментов мы подбирали концентрацию сульфата аммония для фракционирования инулиназы. Результаты показали, что осаждение фермента лучше проводить в диапазоне концентраций сульфата аммония от 35-40 до 60 %. К сожалению, применение сульфата аммония повышало степень очистки инулиназы лишь в 0,5 раза, поэтому мы сочли нецелесообразным сочетание стадии осаждения ацетоном и стадии высаливания и оставили только первую из них. Следующим этапом очистки инулиназы была ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Сначала элюцию осуществляли ацетатным буфером, рН 4,7, ступенчато в диапазоне концентраций №С1 0,005-0,2 моль/л. Инулиназа выходила одним пиком при концентрации соли 0,025-0,05 моль/л. Далее мы провели эксперименты по очистке инулиназы методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в градиенте рН 8,0-^4,0. В результате элюции были получены 4 фракции, обладающие инулиназной активностью. Расчет 1/8 отношений для полученных нами 4-ех ферментов показал, что только 3 из них являются инулиназами. Назовем их условно инулиназа I, инулиназа II и инулиназа III.

Таким образом, путем 4-стадийной очистки из клубней НеНаШЬиз tuberosus были получены три фракции инулиназы (табл. 2). На электрофореграммах фракций, выделенных из КЫууеготусеБ татапш У-303 и НеНапМш шЬегоьня, мы наблюдали наличие одной полосы, что свидетельствует о гомогенности полученного ферментного препарата, электрофорез на специфичность показал, что образец проявляет инулиназную активность.

Таблица 2

Протокол очистки инулиназ I, II и III из Helianthus tuberosus

Гомогенат 100 20,30 2030,0 58,0 0,35 100 1

Осаждение ацетоном 50 12,67 633,5 30,1 0,42 31,2 1,2

С-25 10 42,64 426,4 8,7 4,90 21,0 14,0

ДЭАЭ- целюло- за I 4 52,33 209,3 3,0 17,44 10,3 44 8

II 4 46,84 187,4 4,9 9,56 9,2 27,3

III 4 23,32 93,28 3,5 6,66 4,6 19

G-150 I 2 54,61 109,2 2,8 19,50 5,4 55,7

II 2 31,35 62,7 3,1 10,11 3,1 28,9

III 2 19,67 39,34 2,6 7,57 1,9 21,6

3.2. Некоторые физико-химические и кинетические свойства инулиназ

Оптимальные условия для функционирования ферментных препаратов инулиназ, выделенных из К1иу\еготусе$ тагхгапт У-ЗОЗ и НеНапЛт ШЬегозш, представлены в табл. 3. Значения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции для инулиназ были определены графическими методами Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти (табл. 4).

Таблица 3

Оптимальные условия функционирования инулиназ

Фермент Температурный оптимум, °С Оптимум рН

Инулиназа из К1и\^егот\>се$ татапш 50 4,7

Инулиназа I из НеИшиИия 1иЬего$ия 48 6,8

Инулиназа II из ПеНашЬт ¡иЬегсних 39 6,2

Инулиназа III из НеНапвгш шЬегот.ч 44 4,5

Таблица 4 Каталитические свойства инулиназ

Фермент Кш, мМ V » шах» мкмоль/(мг><мин)

Инулиназа из К1иу\>егот\'сез татапиэ 0,22 102,00

Инулиназа I из НеИашИт ¡иЬего.тя 1,89 90,91

Инулиназа II из НеНаШкш шЬего.чт 2,38 47,62

Инулиназа III из НеНаШИт шЬеготз 9,09 37,04

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ИНУЛИНАЗ

Методами гель-фильтрации и электрофореза показано, что кажущаяся молекулярная масса инулиназы из К1иу\>еготусея татапиз составляет 63±2 кДа, а молекулярные массы субъединиц № 1 и № 2 равны 54,8 и 8,4 кДа соответственно. Проведенный нами электрофоретический анализ показал гомогенность полученных фракций субъединиц. Установлено, что они обладают каталитической активностью.

Дальнейшие исследования инулиназы проведены с помощью метода инфракрасной спектроскопии. Установлено, что при разделении димерной молекулы инулиназы на мономеры происходит увеличение количества нерегулярных участков на 6 % для субъединицы № 1 (54,8 кДа) и на 10 % для субъединицы № 2 (8,4 кДа).

На изображении молекулы инулиназы из К1иу\>еготусех татапиз, полученном с помощью атомно-силовой микроскопии, отчетливо видно, что данный белок имеет димерную структуру (рис. 1). Показано, что высота субъединицы № 1 (54,8 кДа) превышает высоту субъединицы № 2 (8,4 кДа) в 2 раза. Аналогичным способом были получены изображения обеих субъединиц

инулиназы (рис. 2, 3). При диссоциации димера инулиназы на мономеры субъединицы практически сравниваются по высоте, и происходит их небольшая компактизация.

Методами гель-хроматорафии и электрофореза было установлено, что инулиназа I из НеИаШИив шЬегозия является димером с кажущейся молекулярной массой 65±3 кДа, а инулиназы II и III - мономерами 31 и 25 кДа. Субъединицы инулиназы I различаются по величине: 45,5 и 22 кДа. С помощью атомно-силовой микроскопии (рис. 4-6) показано, что инулиназа I образует димеры, а инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

нм

нм 9

1 53

0 мкм

А \

V 4--------

0 0.5 1.0 1.5 2.0 мкм Б

Рис. 1. Изображение поверхности молекулы инулиназы из К1иууеготусе5 татапт У-303 (размер кадра 2,2x2,2 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности

НМ НМ

НМ ■»• 2.0- , А

1.6

1.2- А

I 5 ¿,0мкм ___ _______

0.5 1.0 1.5 2.0 мкм Б

Рис. 2. Изображение поверхности субъединицы инулиназы № 1 (54,8 кДа) (размер кадра 2x2 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности нм мкм 4 2 011

им 4.0 3.0 2.0 1.0

мкм

А А

I I

г'

0" 0Х 170 15 2.0 мкм А Б

Рис. 3. Изображение поверхности субъединицы инулиназы № 2 (8,4 кДа) (размер кадра 2*2 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности

им 50

им 0.9

0.7

0.5

0.3

1UU

О 40

120 Б

200 им

Рис. 4. Изображение поверхности молекулы инулиназы I из НеНапЛш шЬегоэив (размер кадра 0,5x0,5 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности

нм 2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

/Л

^ ш

W U А I Гуч

100 200 Б

300нм

Рис. 5. Изображение поверхности молекулы инулиназы II из НеИамИш IиЬегозиэ (размер кадра 0,5Х0,5 мкм): А - трехмерное изображение, Б -сечение рельефа поверхности нм нм 2 50(Яв 40(Г

зскг 20бч

« I гм- . IX ^ ; - .

^ГЛ-уАГ"

2.0 А ; \

1.4 А

1.0 i 1

0.6 "//VW 1

О 20

60 100 140 нм Б

Рис. 6. Изображение поверхности молекулы инулиназы III из Helianthus tuberosus (размер кадра 0,5x0,5 мкм): А - трехмерное изображение, Б -сечение рельефа поверхности

Таблица 5

Радиусы (нм) молекул инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus

tuberosus

Продуцент и тип инулиназы Нативная молекула Субъединицы

№ 1 №2

Kluyveromyces marxianus 6,124 ±0,179 5,189 ±0,298 1,005 ±0,004

Helianthus tuberosus, инулиназа I 5,529 ±0,513 3,152 ±0,303 1,007 ±0,217

Helianthus tuberosus, инулиназа II 0,964 ± 0,085 - -

Helianthus tuberosus, инулиназа III 1,082 ±0,157 - -

Методом динамического светорассеивания на приборе Photocor complex мы пытались определить размеры молекул инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus (табл. 5).

В следующих сериях экспериментов мы изучали особенности вторичных структур инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus. Для ИК-спектров ферментов характерны наиболее интенсивные полосы поглощения: амид I (1690-1630 см"1), амид II (1560-1520 см"1), полоса валентных колебаний NH2 - группы (3400-3200 см"1). В спектре инулиназ присутствуют также широкие полосы поглощения амид III (1300-1200 см"), амид IV (1050 см"1) и амид V (700-580 см'1), обусловленные соответственно плоскими и неплоскими деформационными колебаниями NH-групп. Интересно отметить, что полосы поглощения амид I в области 1690-1630 см"1 у инулиназ из исследуемых нами продуцентов имеют разную форму и максимумы поглощения. Полоса поглощения в области 3400-3200 см"1, обусловленная валентными колебаниями ИНг-группы, хорошо выражена у всех исследуемых нами инулиназ. Существенные отличия обнаружены в пиках в областях 3000-2100 см"1, 1740±40 см"1, 1690-1630 см"1, 1049 и 868 см"1.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ПРОЦЕССА ТЕРМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ ИНУЛИНАЗ ИЗ KLUYVEROMYCES MARXIANUS Y-303 И HELIANTHUS TUBEROSUS

Установлено, что термомодификация дрожжевой инулиназы начиналась уже через 10 мин инкубации энзима в буферном растворе при 40 °С, через 60 мин оставалось 42 % первоначальной активности. При 50 °С процесс инактивации происходил интенсивнее и через 60 мин инкубации сохранялось лишь 33 % каталитической способности. Следует отметить, что кривые термопревращения инулиназы при 60-80 °С имеют два участка: первый (время инкубирования менее 10 мин) отличается высокой скоростью падения каталитической способности. Для второго (время инкубирования от 20 до 60 мин) характерна стабилизация остаточной активности фермента (рис. 7). Наличие излома и двухфазный характер кривой термоинактивации инулиназы, возможно, свидетельствуют о последовательном развитии как минимум двух стадий сложного процесса термомодификации белка и о наличии в системе двух форм фермента, характеризующихся различной устойчивостью к денатурирующему воздействию. При 40 и 50 °С кривые термопревращения инулиназы из Шиууеготусез тагх'шпт резкого излома не имеют.

Обнаружено, что кривая дифференциального термического анализа для изучаемого препарата инулиназы характеризуется наличием двух эндотермических пиков. Исходя из их формы и площади, можно предположить, что первый пик обусловлен малыми локальными перестройками макромолекулы белка, второй - ее «плавлением». Наблюдаемая температура, соответствующая минимуму первого пика кривой, составляет 54, второго -64 °С (рис. 8).

Форма кривых термической инактивации свободной инулиназы при температурах 60, 70 и 80 °С указывает на возможность участия четвертичной

структуры в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц. Для доказательства справедливости данного предположения в отношении инулиназы из КЫучеготусев татапт мы применили метод атомно-силовой микроскопии. Было получено изображение инулиназы после ее инкубации в термостате при 60 °С в течение 10 мин. Отчетливо видно, что происходит диссоциация фермента на субъединицы (рис. 9).

АТ 0.04

0.02

00 К

60 ■

40 ¡vi

20 t

4.5

Wr 6i

же

о 10 20 30 40 50 60 мин

Рис. 7. Зависимость каталитической активности (%) инулиназы из К1иууеготусе5 тагх'шгтз У-ЗОЗ от времени термической инактивации: 1 - 40, 2 - 50, 3 - 60, 4 - 70, 5 - 80 °С

-0.02 -0.04'

Рис. 8. Кривая дифференциального термического анализа процесса плавления инулиназы из

Юиууеютусез татат« У-303

им 3.5

2.5

1.5

0.5

| I

100 200 300 400 им Б

Рис. 9. Изображение молекулы инулиназы из Kluyveromyces marxianus после инкубации в термостате при 60 °С в течение 10 мин (размер кадра 0.5x0.5 мкм): А - трехмерное изображение, Б- сечение рельефа поверхности

А, ед/мг

А, ед/мг 10*-' ' ' 8 6 4 2

\ з

10 20 3040 50 60 мин А

О 10 20 30 40 50 60 мин

0 10 20 30 40 50 60 мин В

Рис. 10. Зависимость каталитической активности инулиназы I (А), II (Б) и III (В) из Helianthus tuberosus от времени термической инактивации: 1 - 40, 2 - 50, 3 - 60, 4 - 70, 5 - 80 °С

На рис. 10 показана динамика процесса инактивации инулиназ I, II и III из НеИапМш шЪегоьш. При 60 и 70 °С кривые зависимости активности инулиназы I от времени термической инактивации достоверно не отличаются друг от друга. Интересен тот факт, что при названных температурах резкая потеря ферментом каталитической способности происходит после 10-минутной инкубации: на 49,4 и 51,2 % соответственно. При дальнейшем увеличении времени инактивации наблюдается постепенное снижение активности, которое достигает 67 и 67,5 % соответственно при 60-минутном прогревании образцов. Инкубация инулиназы I при 50 °С не приводит к скачкообразным изменениям активности препарата, фермент инактивируется постепенно, сохраняя 56,1 % каталитической способности при 60-минутном прогревании.

Кривые зависимости активности инулиназы II от времени термической инактивации совпадают по форме при 50, 60 и 70 °С и достоверно не отличаются друг от друга после 40-минутной инкубации. После 60-минутного прогревания образцы сохраняют 50,4 %, 50 % и 45,8 % первоначальной каталитической способности соответственно.

Для инулиназы III характерно практически полное совпадение кривых зависимости активности от времени термической инактивации при температурах 50 и 60 °С. При 70 °С происходит достоверно большая потеря каталитической способности. Процент сохранения активности для инулиназы III при 50, 60 и 70 °С после 60-минутной инкубации составляет соответственно 57,9 %, 53 % и 43,6 %.

Далее мы проанализировали не абсолютные значения активности инулиназ I, II и III, а процент ее сохранения по сравнению с нативными препаратами при инактивации в диапазоне температур 40-80 °С. Динамика потери каталитической способности при 40, 50 и 70 °С для всех трех ферментов сходна: кривые инактивации совпадают по форме при этих трех температурах и близки по значениям при 40 и 50 °С (рис. И). При 60 °С наблюдается практически полное совпадение кривых инактивации для инулиназы II и III, инулиназа I теряет каталитическую способность гораздо быстрее. При 80 °С мы также видим совпадение кривых инактивации для инулиназы II и III, инулиназа I в данных условиях теряет активность более интенсивно в интервале времени 0-10 мин, но еще проявляет каталитическую способность после 40 минутной инкубации, тогда как две другие инулиназы полностью инактивируются после нагревания в течение 30 мин.

Интересно, что при наибольшей каталитической активности нативного образца (19,9 ед/мг) и относительно высоким, по сравнению с инулиназами II и III, температурным оптимумом (48 °С) инулиназа I является менее устойчивой при 60 и 70 °С, чем инулиназы II и III. Константы скорости инактивации при названных температурах для инулиназы I выше, чем для инулиназ II и III и составляют 18,28 и 18,55 соответственно (табл. 6).

А, % 10(W. 80 " 60 40

60 мин

0 20 40 60 мин

А, % ЮОц

60 мин

10 20 30 40 мин

60 мин

Рис. 11. Процент сохранения активности инулиназ I, II и III из Helianthus tuberosus: А -при 40 °С, Б - при 50 °С, В - при 60 °С, Г - при 70 °С, Д - при 80 °С

Таблица 6

Константы скорости термической инактивации инулиназы из Kluyveromyces marxianus и инулиназ I, И и III из Helianthus tuberosus

Температура к, ч"' хЮ'3

Инулиназа I Инулиназа II Инулиназа III Инулиназа из Kluyveromyces marxianus

40 °С 2,17 2,49 2,26 1,46

50 °С 9,55 11,30 9,02 1,83

60 °С 18,28 11,45 10,49 3,58

70 °С 18,55 12,87 . 13,72 5,82

80 °С 107,32 96,70 128,80 10,4

Таблица 7

Доля агрегированных (уаи>) и инактивированных (y¡„) молекул инулиназы из Kluyveromyces marxianus и инулиназ I, II и III из Helianthus tuberosus

Температура Инулиназа I Инулиназа II Инулиназа III Инулиназа из Kluyveromyces marxianus

Уааг Ут Уаее Ут Утя. Tin Уагг Yin

40 °С 0,014 0,122 0,024 0,139 0,035 0,127 0,037 0,083

50 °С 0,031 0,439 0,184 0,496 0,103 0,421 0,055 0,107

60 °С 0,054 0,670 0,231 0,500 0,115 0,470 0,067 0,194

70 °С 0,078 0,675 0,232 0,542 0,119 0,564 0,111 0,296

80 °С 0,401 0,960 0,433 0,945 0,516 0,979 0,346 0,465

В дополнение к экспериментам по термической инактивации инулиназ из Шиууеготусеъ татапт У-ЗОЗ и НеИапЛи.ч ГиЬегояш мы определили долю молекул, агрегировавших под действием температур 40, 50, 60, 70 и 80 °С и сравнили ее с долей инактивированных молекул (табл. 7). Установлено, что для всех инулиназ доля инактивированных молекул существенно (минимум в 2 раза) превышает долю агрегированных. Поэтому логично предположить, что процесс термической инактивации фермента идет быстрее, по сравнению с процессом агрегации, а следовательно, потеря каталитической способности энзима в малой степени коррелирует или совсем не связана с процессом образования белковых агрегатов.

Глава 6. РАЗРАБОТКА ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИНУЛИНАЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

6.1. Исследование механизма взаимодействия молекулы инулиназы с матрицей синтетических ионитов, поиск наиболее перспективного носителя для иммобилизации фермента

Показано, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы из Юиууеготусеэ татапт на синтетических ионитах наиболее высокую степень сохранения удельной активности мы наблюдали у препаратов на основе АВ-17-2П и КУ-2 (75,5 % и 61,7 % соответственно). Для препарата, выделенного из НеНапЛий ЫЪегоэт, оптимальным оказался катионит КУ-2, сорбция на котором позволила сохранить 80,4 % первоначальной активности энзима.

После иммобилизации инулиназы на ионитах в их ИК-спектрах появляются полосы поглощения, характерные для аминокислот, пептидов и белков. Например, об успешной иммобилизации инулиназ из Юиууеготусея тагх1апш и НеНапЛия 1иЪего.Ч1к на АВ-17-2П свидетельствует ряд изменений в ИК-спектре носителя: увеличение интенсивности пиков в областях 1596-1582, 1430-1400, 1630-1612, 1528-1518 см'1, которые соответствуют полосам поглощения ряда аминокислот (Сливкин А.И., 1999).

Анализ ИК-спектров показал, что связывание инулиназы с матрицами различных носителей происходит в основном за счет электростатических взаимодействий, а водородная связь не является ведущей при адсорбции молекулы фермента на матрице ионита. Только в одном случае было обнаружено смещение пиков свободной ОН-группы в область более низких значений частоты колебаний - при иммобилизации инулиназы из НеНамЪж шЬегозт на АН-12П, что может свидетельствовать о значительной роли водородной связи при формировании комплекса «фермент-носитель».

Далее мы исследовали степень изменения вторичной структуры для инулиназ из КЫууеготусеь тагх1апиБ и НеИапАш ШЬего.чш при их адсорбции на синтетических анионообменных смолах и волокнах. Наряду со снижением каталитической способности, при иммобилизации инулиназы из Шиууеготусез тагхгапю на полимерных синтетических носителях АВ-17-2П, КУ-2 и ВИОН КН-1 уменьшается количество неупорядоченных структур в молекуле

фермента: на 2, 11 и 9 % соответственно, что указывает, вероятно, на компактизацию белковой глобулы в процессе адсорбции. Интересно отметить еще и тот факт, что при сорбции на анионообменной смоле АВ-17-2П происходит резкое увеличение количества а-спиральных участков (на 13 %) и уменьшение числа структур, содержащих р-слои (на 11 %). При иммобилизации на катионообменниках КУ-2 и ВИОН КН-1 подобного эффекта мы не наблюдаем: количество а-спиралей увеличивается лишь на 3 % в первом случае и уменьшается на 1 % во втором, зато существенно увеличивается количество Р-слоев в молекуле фермента (на 8 и 10 % соответственно). Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод о том, что механизмы взаимодействия инулиназы из К1иу\'еготусез тагх'шпиз с матрицей катионо- и анионообмешшков принципиально отличаются друг от друга: в процессе адсорбции принимают участие разные участки белковой глобулы и в результате происходят различные конформационные перестройки в молекуле энзима. .

При адсорбции инулиназы из НеНашИш ЫЪегоьт на всех исследуемых носителях мы наблюдали уменьшение количества нерегулярных участков в белковой глобуле, причем какой-либо корреляции между процентом сохранения активности иммобилизованного препарата по сравнению со свободным и структурными перестройками а-спиралей, Р-слоев и неупорядоченных участков мы не обнаружили. В связи с этим можно заключить, что процесс адсорбции для каждого исследуемого носителя протекает по сложному индивидуальному механизму и невозможно прогнозировать структурные изменения в молекуле фермента в зависимости от химической природы матрицы сорбента, с которым он взаимодействует.

6.2. Физико-химические и кинетические свойства инулиназ, иммобилизованных на различных носителях Установлено, что для инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного фермента. Кроме того при иммобилизации на ВИОН КН-1 каталитическая активность сохраняется при 95 °С, в то время как растворимый фермент инактивируется при 80 °С. Оптимум рН для свободного фермента составляет 4,7 единиц, при иммобилизации энзима на всех исследуемых носителях он практически не изменяется: 4,7 - для препарата, абсорбированного на КУ-2, а при связывании с матрицей ионитов АВ-17-2П и ВИОН происходит небольшое расширение оптимального диапазона до 4,5-4,7.

С помощью преобразования кривых зависимости V от Я в координатах Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти были определены кажущиеся Утах' и Кт' реакции гидролиза инулина гетерогенными ферментными препаратами (табл. 8). Показано, что иммобилизация приводит к увеличению значений константы Михаэлиса и уменьшению максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом.

Аналогичные серии экспериментов были проведены для препаратов инулиназы из НеНамИш шЪегохиз, иммобилизованных на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П. Установлено, что максимальную каталитическую активность

иммобилизованные на всех исследуемых носителях образцы проявляют в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7. Более высокая степень сродства к инулину и скорость его гидролиза характерны для инулиназ из НеИаМИш шЪегоьик, иммобилизованных на КУ-2, по сравнению с другими гетерогенными препаратами (табл. 9).

Таблица 8

Значения Кш' и Утах' для реакции гидролиза инулина иммобилизованным препаратом инулиназы из К1иууеготусе.5 таЫапиз

Ферментный препарат Кт', мМ V ' » шах, мкмоль/(мг*мин)

Инулиназа, иммобилизованная на АВ-17-2П 0,32 54

Инулиназа, иммобилизованная на КУ-2 0,36 34

Инулиназа, иммобилизованная на ВИОН КН-1 0,33 35

Таблица 9 Значения Кт' и Утах' для реакции гидролиза инулина иммобилизованным препаратом инулиназы из НеИапЛш шЬего.чи$

Ферментный препарат Кт', мМ V ' * шах , мкмоль/(мг*мин)

Инулиназа, иммобилизованная на КУ-2 7,3 20

Инулиназа, иммобилизованная на КУ-2-8чС 10,0 12

Инулиназа, иммобилизованная на АВ-17-2П 12,5 10

6.3. Исследование гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного

действия

Показано, что инулиназа, иммобилизованная на ВИОН КН-1, эффективно расщепляет химически чистый и содержащийся в экстракте топинамбура инулин. При использовании данного биокатализатора в реакторе непрерывного действия оптимальным является пропускание субстрата сверху вниз со скоростью 3 мл/мин или снизу вверх со скоростью 5 мл/мин. В обоих случаях каталитическая активность гетерогенного биопрепарата значительно превышает его способность в реакторе периодического действия: на 69 % (при нижнем токе) и 97 % (при верхнем токе) при пропускании химически чистого инулина или на 82 % (при нижнем токе) и 118 % (при верхнем токе) при использовании в качестве субстрата экстракта НеМаЫЪт тЪегоьт.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

происхождения с высокой степенью чистоты. Однако очень мало работ посвящено изучению растительных инулиназ. Результаты исследований ряда авторов доказывают, что дрожжи Шиужготусез тагхшпш являются перспективными продуцентами этого фермента в промышленных масштабах. В связи с вышесказанным мы посвятили эту работу инулиназам из К\иу\>еготусез тагх1ат<5 У-ЗОЗ и НеНапМия /иЬегозиз.

В нашей лаборатории был получен препарат инулиназы из К1иу\еготусе$ татапиз У-ЗОЗ, очищенный в 39,8 раза при выходе 13,5 %, а также разработана методика для выделения и очистки до гомогенного состояния трех фракций инулиназ (I, II и III) из НеНашЫз шЬегозиз\ степень очистки и выход фермента соответственно 55,7 и 5,4 % (I), 28,9 и 3,1 % (II), 21,6 и 1,9 % (III).

В современной литературе незначительное число работ посвящено анализу третичной и четвертичной структуры инулиназы и родственных ей ферментов, относящихся к группе гликозидгидролаз, поэтому актуальными являются исследования особенностей их надмолекулярной организации: до сих пор не выяснено, какие энзимы данной группы образуют олигомеры, а какие существуют только в мономерной форме.

Для исследования особенностей надмолекулярной организации белковых глобул в настоящее время успешно применяются различные сочетания классических методов биохимического анализа и современные биофизические подходы, в том числе метод атомно-силовой микроскопии, поэтому именно его мы использовали для визуализации молекул инулиназ из Юиучеготусея татапиз У-ЗОЗ и НеНапЛи.ч шЬегозш. Было установлено, что энзим, выделенный из Юиууеготусея татапиз, и инулиназа I из НеНапЛш шЬегозиз функционируют в форме гетеродимеров, а инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

Общеизвестно, что иммобилизованные ферменты, по сравнению с растворимыми, имеют существенные технологические преимущества, поэтому исследователи не прекращают попытки осуществить иммобилизацию инулиназы на ряде носителей природного и синтетического происхождения.

Нами было продемонстрировано, что некоторые ионообменные смолы, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей энзима. Показано, что процесс иммобилизации для каждого исследуемого ионита протекает по сложному индивидуальному механизму, поэтому невозможно прогнозировать структурные изменения в молекуле фермента в зависимости от химической природы матрицы сорбента.

При адсорбционной иммобилизации инулиназы из Юиууеготусез татапиз на синтетических ионитах наиболее высокую степень сохранения удельной активности мы наблюдали у препаратов на основе АВ-17-2П и КУ-2 (75,5 % и 61,7 % соответственно). Для инулиназы, выделенной из НеНапЛш шЪегозт, оптимальным оказался катионит КУ-2, сорбция на котором позволила сохранить 80,4 % первоначальной активности энзима.

Изучение физико-химических и кинетических свойств гетерогенных ферментных препаратов позволяет подобрать оптимальные условия их функционирования, что способствует их более рациональному использованию в производственных циклах. В нашей лаборатории было установлено, что

наиболее перспективными условиями для промышленного применения дрожжевой инулиназы, иммобилизованной на всех исследуемых носителях, являются температура 70 °С (что на 20 °С выше оптимума нативного фермента) и рН среды - 4,5. Максимальную каталитическую активность гетерогенные образцы растительного происхождения проявляли в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7-7,5.

Показано, что иммобилизованные препараты дрожжевой инулиназы обладают высокими значениями максимальных скоростей реакции и степенью сродства к инулину по сравнению с ферментами растительного происхождения, а следовательно, являются более перспективными для использования в технологических линиях.

Термоустойчивость является важнейшим критерием отбора для ферментов промышленного значения, поэтому нами были выявлены закономерности процесса термической инактивации инулиназ из К1иууеготусех шатании и НеНаШИш ¡иЬегоши. Продемонстрировано, что переход «упорядоченная глобула - хаотический клубок» для молекулы инулиназы из Юиууеготусея тагх'шпт происходит не одноточечно, а в интервале температур от 53-55 до 80 °С. Очевидно, что процесс разворачивания молекулы складывается из нескольких отдельных этапов информационных переходов и представляет собой динамически необратимый процесс. Показано, что дрожжевой энзим является более устойчивым к температурным воздействиям по сравнению с ферментами растительного происхождения: при 80 °С значение константы скорости инактивации практически на порядок ниже, чем у инулиназ из топинамбура.

Установлено, что процесс инактивации инулиназ под действием высоких температур идет быстрее, по сравнению с процессом агрегации, а следовательно, потеря каталитической способности энзима в малой степени коррелирует или совсем не связана с процессом образования белковых агрегатов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения и очистки до гомогенного состояния инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces тагх'шпт и клубней НеИапЛш /иЬегозт. Получен препарат из Юиууеготуссз гг.агх1апиз У-303, очищенный в 39,8 раза при выходе 13,5 %, и энзимы из НеИапЛиэ ¡иЬегачия: степень очистки и выход фермента соответственно 55,7 и 5,4 % (I), 28,9 и 3,1 % (II), 21,6 и 1,9% (III).

2. Оптимальными условиями гидролиза инулина для инулиназы из Kluyveromyces татати являются температура катализа 50 °С, рН 4,7, концентрация инулина 5Х10"4 моль/л. Ферменты растительного

происхождения характеризуются оптимумами функционирования соответственно 48 °С, рН 6,8 (I), 39°С, рН 6,2 (II) и 44 °С, рН 4,5 (III).

3. Установлено, что инулиназы дрожжевого н растительного происхождения различаются друг от друга по структурным параметрам. Энзим, выделенный из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianthus tuberosus функционируют в форме гетеродимеров, инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

4. Предложен адсорбционный способ иммобилизации инулиназы на ряде синтетических катеонитов и анионитов, позволяющий сохранить до 75,5 (при сорбции на АВ-17-2П) и 80,4 % (при связывании с матрицей КУ-2) активности нативного фермента дрожжевого и растительного происхождения соответственно.

5. Показано, что ряд ионообменных смол (АВ-17-2П, КУ-2, КУ-2-8, КУ-2-8чС, IMAC-HP, АВ-16-ГС, АМ 21А, ЭДЭ-10П, АН-12П, IMAC-HP, PUROLITE) и волокон (ВИОН КН-1, ВИОН АН-1 и КОПАН-90) может применяться в качестве носителей для адсорбции инулиназы.

6. Для дрожжевой инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, оптимум рН практически не изменяется, а температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного фермента. Иммобилизованные на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П препараты инулиназы из Helianthus tuberosus проявляют максимальную каталитическую способность в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7.

7. Выявлено, что иммобилизованные препараты дрожжевой инулиназы обладают высокими значениями максимальных скоростей реакции и степенью сродства к инулину, по сравнению с ферментами растительного происхождения, то есть являются более перспективными для промышленного использования.

8. Установлены закономерности процесса термической инактивации ферментов из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus. Показано, что дрожжевая инулиназа является более устойчивой к температурным воздействиям по сравнению с энзимами растительного происхождения: при 80 °С значение константы скорости практически на порядок ниже, чем у энзимов из топинамбура.

9. Разработанный нами гетерогенный препарат инулиназы эффективно расщепляет химически чистый и содержащийся в экстракте Helianthus tuberosus инулин при использовании данного биокатализатора в реакторе непрерывного действия, что позволяет рекомендовать его для применения в промышленных масштабах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка гетерогенного катализатора реакции гидролиза инулина на основе иммобилизованного препарата инулиназы из Kluyveromyces marxianus / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. A.C. Taxa // Биотехнология. -2007.-№3,-С. 80-87.

2. Кинетико-термодинамические аспекты процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 9. ВГУ, 2007. - С. 75-82.

3. Исследование иммобилизации инулиназы на ионогенных и неионогенных носителях / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. A.C. Taxa // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2007. - Т. 7, вып. 5. - С. 804-810.

4. Stability of the Native and Immobilized Inulinase to Various Denaturizing Agents / T.A. Kovaleva, M.G. Holvavka. O.M. Kozhokina, S.A. Taha // European Journal of Natural History. - 2008. - № 1. - P. 86.

5. Исследование параметров иммобилизации инулиназы на синтетических полиэлектролитах / М.Г. Холявка // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», Москва, 8-11 апреля 2008. - С. 27.

6. Атомно-силовая микроскопия как метод исследования структурных свойств карбогидраз / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка, Битюцкая Л.А., Гречкина М.В. // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 6. - С. 79.

7. Кинетические и термодинамические аспекты гидролиза инулина свободными и иммобилизованными инулиназами / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и восьмой съезд белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 25-27 июня 2008. Сборник статей в двух частях, часть 1. - С. 66-68.

8. Исследование структурно-функциональных свойств инулиназы методом атомно-силовой микроскопии / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка, Л.А. Битюцкая, М.В. Гречкина // Рефераты докладов. Второй международный форум «Аналитика и аналитики», Воронеж, 22-26 сентября 2008. - Т. 1. - С. 87.

9. Разработка гетерогенного биокатализатора для получения фруктозы из растительного сырья на основе инулиназы, иммобилизованной на синтетических полиэлектролитах / М.Г. Холявка. Т.А. Ковалева. // Материалы II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины». Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008. - С, 146-147.

10.Исследование условий применения ряда органических растворителей для очистки инулиназ из различных источников // Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. Н.И. Сапрыкина // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 9. -С. 14-18.

11.Исследование гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы с целью получения фруктозы из полимерных субстратов

растительного происхождения / М.Г. Холявка, Т.А. Ковалева // Материалы Пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2-4 декабря 2008. - С. 189-191..

12.Активность иммобилизованной инулиназы при непрерывном гидролизе экстракта топинамбура (Helianthus tuberosus) / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка // Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация». 2008. -№2. -С. 104-107.

13.Сочетание классических биохимических и биофизических подходов с методом атомно-силовой микроскопии для исследования структурных свойств некоторых гидролаз / М.Г. Холявка. A.C. Беленова, Т.А. Ковалева, J1.A. Битюцкая, М.В. Гречкина // Международный Междисциплинарный Симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». Судак, Крым, Украина, 19-30 сентября 2008. -С. 131-132.

Н.Возможности использования гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных карбогидраз для получения продуктов функционального питания / Т.А. Ковалева, В.Г. Артюхов, М.Г. Холявка. A.C. Беленова // Материалы конференции Десятого юбилейного международного форума «Высокие технологии XXI века». Москва, 21-24 апреля 2009. - С. 223-226.

15.Применение иммобилизованных гидролаз для получения фармацевтических препаратов и продуктов функционального питания / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. A.C. Беленова, E.JI. Макарова // Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований 2009». Том. 27. Биология, физическое воспитание и спорт. - Одесса: Черноморье, 2009. - С. 3-5.

16.Исследование некоторых параметров иммобилизованной инулиназы из Kluyveromyces marxianus как перспективного катализатора реакции гидролиза инулина / Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. A.C. Taxa // Биотехнология. - 2009. - № 2. - С. 55-59.

17. Разработка технологических ' режимов получения фруктозы при использовании гетерогенного препарата инулиназы в реакторах непрерывного действия / М.Г. Холявка, Т.А. Ковалева // Сборник тезисов докладов X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии н биотехнологии». - Казань, 12-15 мая 2009. - С. 245.

18.Атомно-силовая микроскопия и классические -биофизические и биохимические методы в исследовании олигомерной структуры некоторых гидролитических ферментов / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка. A.C. Беленова // 1-ая Международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах». - Пасионат «Заря», Московская область, Ступинский район, 29 июня-4 июля 2009. - С.158-161.

19.Разработка условий осаждения инулиназы органическими растворителями из экстракта клубней Helianthus tuberosus / М.Г. Холявка. Т.А. Ковалева, Е.А. Поликаркина // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы III Международной научно-практической

конференции, Ростов-на-Дону, 1-4 октября 2009 г. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2009. - 300 с. - С. 32-33.

20.Atomic-force microscopy with classical biophisical and biochemical methods in studying of oligomerous structure of inulinase / M.G. Holyavka. T.A. Kovaleva, V.G. Artyukhov, L.A. Bityutskaya, M.V. Grechkina // International Conference «Nanobiophysics: Fundamental and Applied Aspects» NBP 2009. Book of abstracts. - Kharkov, Ukraine. - October 5-8, 2009. - P. 56.

21.Исследование олигомерной структуры и некоторых физико-химических свойств инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303 / В.Г. Артюхов, T.A. Ковалева, М.Г. Холявка. JI.A. Битюцкая, М.В. Гречкина, Т.Б. Образцова // Биофизика, 2009. - Т. 54, № 6. - С. 1005-1011.

22.Термическая инактивация свободной и иммобилизованной инулиназы / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалёва, М.Г. Холявка. JI.A. Битюцкая, М.В. Гречкина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46, № 4. - С. 1-5.

23.Исследование некоторых структурных особенностей и функциональных свойств инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303 / М.Г. Холявка. Т.А. Ковалева, В.Г. Артюхов // Материалы VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ - 2010». Т. 2. Биофизика и биофизическая медицина - Севастополь. - 26-30 апреля 2010. - С. 33-36.

Статьи № 1, 3, 16, 21, 22 опубликованы в печатных изданиях, состоящих

в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано r прчятк 24.05.10. Формат 60*84 '/¡п. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 80 экз. Заказ 698

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Холявка, Марина Геннадьевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая характеристика инулиназ и их продуцентов

1.2. Физико-химические свойства инулиназ

1.3. Кинетика ферментативного катализа и субстратная специфичность инулиназ

1.4. Структурно-функциональные свойства инулиназ, механизм ферментативного гидролиза полифруктанов

1.5. Методы иммобилизации инулиназы и их применение

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Методы исследования 62 2.2.1. Культивирование дрожжей К1иул>еготусе$ тагх'шпт

2.2.3. Осаждение белков ацетоном

2.2.4. Фракционирование белков сульфатом аммония

2.2.5. Гель-фильтрация на сефадексе С

2.2.6. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.2.7. Гель-хроматография на сефадексах О-150 и 0

2.2.8. Электрофорез белков по модифицированному методу Дэвиса

2.2.9. Метод Лоури

2.2.10. Метод определения каталитической активности инулиназы

2.2.11. Методика подготовки к работе ионообменных смол

2.2.12. Подготовка к иммобилизации ионообменных волокон

2.2.13. Методика сорбционной иммобилизации

2.2.14. Цифровая методика дифференциального термического анализа (ДТА) для исследования процесса термической инактивации белков

2.2.15. Визуализация молекул методом атомно-силовой микроскопии

2.2.16. Определение доли агрегированных молекул

2.2.17. Определение доли инактивированных молекул

2.2.18. Подготовка и анализ образцов методом инфракрасной спектроскопии (ИКС)

2.2.19. Определение размеров молекул методом динамического светорассеивания

2.2.20. Статистическая обработка результатов экспериментов

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНУЛИН A3 ИЗ KLUYVEROMYCES MARXIANUS И HELIANTHUS TUBEROSUS И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

3.1. Очистка инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthns tuberosus

3.2. Некоторые физико-химические и кинетические свойства инулиназ

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ИНУЛИНАЗ

6.2. Физико-химические и кинетические свойства инулиназ, иммобилизованных на различных носителях

6.3. Исследование гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного действия

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы"

Изучение структурно-функциональных, физико-химических и кинетических свойств гликозидгидролаз (инулиназ, инвертаз, фруктозилтрансфераз, леваназ) в нативном и иммобилизованном состояниях имеет большое теоретическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей, играют важную роль в контролировании процессов клеточной дифференцировки и развития. Они также могут быть использованы в циклах производства Сахаров с различной степенью полимеризации, в частности, инулина, фруктозы и инулоолигосахаридов - неотъемлемых компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения.

Решение многих вопросов и задач, связанных с методическими приемами иммобилизации, подбором носителей, определением кинетико-термодинамических параметров катализа, является необходимым условием для ч создания новых технологических разработок, конструирования реакторов и проектирования более эффективных гетерогенных биокатализаторов пролонгированного действия для промышленности, медицины и аналитических целей.

В связи с вышесказанным перед нами были поставлены следующие задачи: 1) получение гомогенных препаратов инулиназы из КЫууеготусез тагх1апт и НеНаЫкт шЬегоят и исследование надмолекулярной организации этих ферментов; 2) поиск наиболее перспективного носителя для иммобилизации инулиназы и исследование механизма взаимодействия молекулы фермента с матрицей синтетических ионитов; 3) изучение физико-химических и кинетических свойств инулиназ в свободном и иммобилизованном состояниях; 4) исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы из КЫууеготусеБ тагх1апт и НеИап1ки,ч шЪегоБШ', 5) изучение режимов работы гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованной инулиназы в реакторах периодического и непрерывного действия.

Научная новизна: разработана методика получения гомогенных препаратов инулиназ из КЫууеготусеБ тагх'шпж и НеНапШш ыЪегоъи^ определены молекулярные массы и линейные размеры инулиназ из НеНаМкт шЬегоБиБ', впервые для визуализации молекул инулиназ был применен метод атомно-силовой микроскопии; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы, адсорбированной на синтетических катионитах и анионитах; установлены закономерности процесса термической инактивации инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus.

Практическая значимость. Получены гомогенные препараты инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 и инулиназ I, II и III из клубней Helianthus tuberosus. Степень очистки и выход фермента соответственно 39,8 и 13,5 %, 55,7 и 5,4 %, 28,9 и 3,1 %, 21,6 и 1,9 %. Показано, что оптимальными условиями гидролиза инулина для инулиназы из Kluyveromyces marxianus являются температура катализа 50 °С и рН 4,7. Энзимы растительного происхождения характеризуются оптимумами функционирования соответственно 48 °С, рН 6,8 (I), 39°С, рН 6,2 (II) и 44 °С, рН 4,5 (III). Изучение особенностей молекулярной организации расширило представление о механизмах регуляции функциональных свойств гликозидгидролаз in vivo.

Предложены гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованной инулиназы, определены оптимальные условия их функционирования. Установлено, что катионит КУ-2 и анионит АВ-17-2П, являющиеся отходами пищевых производств, могут применяться в качестве носителей для адсорбции энзима. Выявлено, что для дрожжевой инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, оптимум рН практически не изменяется, а температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного фермента. Иммобилизованные на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П препараты инулиназы из Helianthus tuberosus проявляют максимальную каталитическую способность в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7.

Выявлены закономерности процесса термической инактивации ферментов из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus, что позволяет подобрать температурный режим для использования препаратов в производственных циклах. Разработаны технологические режимы работы реактора непрерывного действия, которые можно рекомендовать для применения в промышленных масштабах.

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 23 публикации: 12 статей и 11 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработана методика выделения и очистки до гомогенного состояния инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 и инулиназ I, II и III из клубней Helianthus tuberosus.

2. Инулиназа, выделенная из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianthus tuberosus функционируют в форме гетеродимеров, инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

Структура и объем работы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Холявка, Марина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения и очистки до гомогенного состояния инулиназы из культуры дрожжей Kluyveromyces marxianus и клубней Helianthus tuberosus. Получен препарат из Kluyveromyces marxianus Y-303, очищенный в 39,8 раза при выходе 13,5 %, и энзимы из Helianthus tuberosus: степень очистки и выход фермента соответственно 55,7 и 5,4 % (I), 28,9 и 3,1 % (И), 21,6 и 1,9 % (III).

2. Оптимальными условиями гидролиза инулина для инулиназы из Kluyveromyces marxianus являются температура катализа 50 °С, рН 4,7, концентрация инулина 5><10"4 моль/л. Ферменты растительного происхождения характеризуются оптимумами функционирования соответственно 48 °С, рН 6,8 (I), 39°С, рН 6,2 (И) и 44 °С, рН 4,5 (III).

3. Установлено, что инулиназы дрожжевого и растительного происхождения различаются друг от друга по структурным параметрам. Энзим, выделенный из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianthus tuberosus функционируют в форме гетеродимеров, инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

4. Предложен адсорбционный способ иммобилизации инулиназы на ряде синтетических катионитов и анионитов, позволяющий сохранить до 75,5 (при сорбции на АВ-17-2П) и 80,4 % (при связывании с матрицей КУ-2) активности нативного фермента дрожжевого и растительного происхождения соответственно.

5. Показано, что ряд ионообменных смол (АВ-17-2П, КУ-2, КУ-2-8, КУ-2-8чС, IMAC-HP, АВ-16-ГС, АМ 21 А, ЭДЭ-10П, АН-12П, IMAC-HP, PUROLITE) и волокон (ВИОН КН-1, ВИОН АН-1 и КОПАН-90) может применяться в качестве носителей для адсорбции инулиназы.

6. Для дрожжевой инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на ВИОН КН-1, АВ-17-2П и КУ-2, оптимум рН практически не изменяется, а температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для нативного фермента. Иммобилизованные на КУ-2, КУ-2-8чС и АВ-17-2П препараты инулиназы из НеНапЖт ыЪегозт проявляют максимальную каталитическую способность в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 ДО 7.

8. Установлены закономерности процесса термической инактивации ферментов из ШиууеготусеБ тагхгапт и НеНамкт шЬегоът. Показано, что дрожжевая инулиназа является более устойчивой к температурным воздействиям по сравнению с энзимами растительного происхождения: при 80 °С значение константы скорости практически'на порядок ниже, чем у энзимов из топинамбура.

9. Разработанный нами гетерогенный препарат инулиназы эффективно расщепляет химически чистый и содержащийся в экстракте НеИапМш шЬегозш инулин при использовании данного биокатализатора в реакторе непрерывного действия, что позволяет рекомендовать его для применения в промышленных масштабах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инулиназы являются промышленно важными ферментами, так как с их помощью можно производить такие продукты функционального питания как фруктоза и инулоолигосахариды. В настоящее время путем сочетания разнообразных методов получены препараты инулиназ различного происхождения с высокой степенью чистоты. Однако очень мало работ посвящено изучению растительных инулиназ. Результаты исследований ряда авторов доказывают, что дрожжи Kluyveromyces marxianus являются перспективными продуцентами этого фермента в промышленных масштабах. В связи с вышесказанным мы посвятили эту работу инулиназам из Kluyveromyces marxianus Y-303 и Helianthus tuberosus.

В нашей лаборатории был получен препарат инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303, очищенный в 39,8 раза при выходе 13,5 %, а также разработана методика для выделения и очистки до гомогенного состояния трех фракций инулиназ (I, II и III) из Helianthus tuberosus: степень очистки и выход фермента соответственно 55,7 и 5,4 % (I), 28,9 и 3,1 % (II), 21,6 и 1,9 % (III).

В современной литературе незначительное число работ посвящено анализу третичной и четвертичной структуры инулиназы и родственных ей ферментов, относящихся к группе гликозидгидролаз (GH32), поэтому актуальными являются исследования особенностей их надмолекулярной организации: до сих пор не выяснено, какие энзимы данной группы образуют олигомеры, а какие существуют только в мономерной форме.

Для исследования особенностей надмолекулярной организации белковых глобул в настоящее время успешно применяются различные сочетания классических методов биохимического анализа и современные биофизические подходы, в том числе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), поэтому именно его мы использовали для визуализации молекул инулиназ из Kluyveromyces marxianus Y-303 и Helianthus tuberosus. Было установлено, что энзим, выделенный из Kluyveromyces marxianus, и инулиназа I из Helianthus ыЪегоБт функционируют в форме гетеродимеров, а инулиназы II и III существуют в мономерной форме.

При адсорбционной иммобилизации инулиназы из КЫууеготусез тагх1апт на синтетических ионитах более высокую степень сохранения удельной активности мы наблюдали у препаратов на основе АВ-17-2П и КУ-2 (75,5 % и 61,7 % соответственно). Для инулиназы, выделенной из НеИагйкт шЬегоБШ, оптимальным оказался катионит КУ-2, сорбция на котором позволила сохранить 80,4 % первоначальной активности энзима.

В нашей лаборатории было установлено, что наиболее перспективными условиями для промышленного применения дрожжевой инулиназы, иммобилизованной на всех исследуемых носителях, являются температура 70 °С (что на 20 °С выше оптимума нативного фермента) и рН среды - 4,5. Максимальную каталитическую активность гетерогенные образцы растительного происхождения проявляли в диапазоне температур 60-70 °С, при рН от 5 до 7-7,5.

Термоустойчивость является важнейшим критерием отбора для ферментов промышленного значения, поэтому нами были выявлены закономерности процесса термической инактивации инулиназ из ШиууеготусеБ тагхгапш и НеИаЫкш шЬегоБШ. Продемонстрировано, что переход «упорядоченная глобула - хаотический клубок» для молекулы инулиназы из Юиууеготусея тагх1ап№ происходит не одноточечно, а в интервале температур от 53-55 до 80 °С. Очевидно, что процесс разворачивания молекулы складывается из нескольких отдельных этапов конформационных переходов и представляет собой динамически необратимый процесс. Показано, что дрожжевой энзим является более устойчивым к температурным воздействиям по сравнению с ферментами растительного происхождения: при 80 °С значение константы скорости инактивации практически на порядок ниже, чем у инулиназ из топинамбура.

Показано, что инулиназа, иммобилизованная на ВИОН КН-1, эффективно расщепляет химически чистый и содержащийся в экстракте топинамбура инулин. При использовании данного биокатализатора в реакторе непрерывного действия оптимальным является пропускание субстрата сверху вниз со скоростью 3 мл/мин или снизу вверх со скоростью 5 мл/мин. В обоих случаях каталитическая активность гетерогенного биопрепарата значительно превышает его способность в реакторе периодического действия: на 69 % при нижнем токе) и 97 % (при верхнем токе) при пропускании химически чистого инулина или на 82 % (при нижнем токе) и 118 % (при его верхнем токе) при использовании в качестве субстрата экстракта Helianthus tuberosus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Холявка, Марина Геннадьевна, Воронеж

1. Абелян В.А. Иммобилизация микробной инулиназы на различных носителях / В.А. Абелян, Л.С. Манукян // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. - Т. 28, № 3. - С. 356-361.

2. Абелян В.А. Получение фруктозо-глюкозного сиропа из инулинсо держащего сырья с применением иммобилизованных клеток дрожжей / В.А. Абелян, Л.С. Манукян, Э.Г. Африкян // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34, №. 5. - С. 544-548.

3. Абелян В.А. Характеристика экзо-инулаз Kluyveromyces marxianus и Bacillus licheniformis I В.А. Абелян, Л.С. Манукян // Биохимия. 1996 - Т. 61, № 6. — С. 1028-1036.

4. Аналитическая химия. Физические и физико-химические методы анализа / А.Ф. Жуков и др.. -М. : Химия, 2001. 496 с.

5. Белозерский А.Н. Практическое руководство по биохимии растений / А.Н. Белозерский, Н.И. Проскуряков. М. : Советская наука, 1951. - 388 с.

6. Биотехнология. В 8 т. Т. 7. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др.. М. : Высш. шк., 1987. - 159 с.

7. Бруцкус Т.К. Иониты. Каталог / Т.К. Бруцкус, Е.В. Замбровская, И.В. Самборский. Черкассы, 1975. - 36 с.

8. Варфоломеев С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М. : Изд-во ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

9. Горбунов Н.В. О кондиционировании катионитов / Н.В. Горбунов, Н.Г. Полянский. // Журнал физической химии. 1978. - Т. 52, № 5. -С. 1259-1262.

10. Ю.Диксон М. Ферменты: в 2 т. / М. Диксон, Э. Уэбб М. : Мир, 1982. - Т. 1. -389 с.

11. П.Егорова Т.А. Основы биотехнологии / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина М. : Академия, 2003. - 208 с.

12. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков, В.В. Арасимович, Н.П. Ярош. JI. : Агропромиздат, 1987. -429 с.

13. Жеребцов Н.А. О механизме каталитического действия карбогидраз (обзор) / Н.А. Жеребцов, О.С. Корнеева, Т.Н. Тертычная // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, № 2. - С. 123-132.

14. Идентификация каталитически активных групп инулиназы Bacillus polymyxa 722 / Н.А. Жеребцов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т. 39, № 6. - С. 619-624.

15. Иммобилизованные ферменты: в 2 т. Т. 1 : Современное состояние и перспективы // под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинек. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 296 с.

16. Инулиназы Pénicillium palitans и Pénicillium cyclopium / А.М. Балаян и др. // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 5. с. 895-902.

17. Инфракрасная спектроскопия ионообменных материалов / В.А. Углянская и др.. Воронеж : Изд-во Воронежского государственного университета, 1989.-208 с.

18. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М. : Мир, 1990. -350 с.

19. Ковалева Т. А. Кинетико-термодинамические аспекты катализа полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами / Т.А. Ковалева // Биофизика. 2000. - Т. 45, № 3. - С. 439-444.

20. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами : дис. . д-ра биол. наук : 03.00.02 : защищена 21.10.98 : утв. 1.04.99 / Т.А. Ковалева. Воронеж, 1998.-421 с.

21. Корнеева О.С. Карбогидразы: препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды / О.С. Корнеева. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2001. - 184 с.

22. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. -М. : Высш. шк, 1980. 273 с.

23. Курганов Б.И. Анализ колоколообразных рН-зависимостей скорости ферментативной реакции / Б.И. Курганов, Е.В. Петушкова // Биохимия. -1992.-Т. 57, №3,-С. 348-361.

24. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители / А.А. Лурье. М. : Химия, 1972.-320 с.

25. Особенности адсорбции инулазы на волокнистых полиэлектролитах / И.В. Шкутина и др. // Сорбционные и хроматографические процессы. -2004. Т. 4, № 4. - С. 422-427.

26. Полянский Н.Г. Методы исследования ионитов / Н.Г. Полянский, Н.В. Горбунов, Н.Л. Полянская. М. : Химия, 1976. - 208 с.

27. Применение ферментных препаратов с целью ускоренного гидролиза инулина при производстве этилового спирта / М.В. Вагабов и др. // Биотехнология. 2005. - № 1. - С. 34-36.

28. Сливкин А.И. Физико-химические и биологические методы оценки качества лекарственных средств / А.И. Сливкин, В.Ф. Селеменев, Е.А. Суховерхова. -Воронеж : Изд-во Воронежского государственного университета, 1999. -368 с.

29. Тертычная Т.Н. Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы Aspergillus ciwamori BKMF — 2250 : автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.Н. Тертычная. Воронеж, 1994. - 24 с.

30. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М. : Мир, 1983. -213 с.

31. Уэндландт У. Термические методы анализа / У. Уэндландт. М. : Мир, 1978.-526 с.

32. Шкутина И.В. ИК-спектроскопия для исследования комплекса инулаза-носитель / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. 2004. - № 1. - С. 110-113.

33. Adsorption of the inulinase from Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 on Streamline DEAE resin / Y. Makino et al. // Brazilian Journal of Chemical Engineering. 2005. - Vol. 22, № 4. - P. 539-545.

34. Allais J. Continuous production of ethanol with Zymomonas mobilis growing on Jerusaleum artichoke juice / J. Allais, E. Torres // Biotechnol. and Bioeng. — 1987. Vol. 29, № 6. - P. 778-782.

35. Aspergillus niveus Blochwitz 4128URM: new source for inulinase production / C.M. de Souza-Motta et al. // Braz. Arch. Biol, and Technol. 2005. - № 3. -P. 343-350.

36. Bajpai P. Continuous ethanol productions from Jerusalem artichoke stalks using immobilized cell of Kluyveromyces marxianus / P. Bajpai, A. Margaritis // Process Biochem. 1986. - Vol. 21. - P. 86-89.

37. Bajpai P. Immobilization of Kluyveromyces marxianus cells containing activity in open pore gelatin matrix: application for high fructose syrup production / P. Bajpai, A. Margaritis // Enzyme Microbiol. Technol. 1985. - Vol. 7. -P. 459-461.

38. Bajpai P. Immobilization of Kluyveromyces marxianus cells with inulinase activity in agar gel / P. Bajpai, A. Margartis I I J. Gen. Appl. Microbiol. 1985. -Vol. 31.-P. 297-304.

39. Bankar A.V. Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica / A.V. Bankar, A.R. Kumar, S.S. Zinjarde // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. -Vol. 84.-P. 847-865.

40. Beluche I. Inulinase activity of Debaromyces cantarellii /1. Beluche, J.P. Guiraud, P. Galzy // Folia Microbiol. 1980. - Vol. 25, № 1. - P. 32-39.

41. Bhat P.G. Separation & purification of an invertase and an inulase from germinating garlic {Allium sativum L.) bulbs / P.G. Bhat, T.N. Pattabiraman // Indian J. Biochem. Biophys. 1980. - Vol. 17, № 5. - P. 338-343.

42. Bienzyme amperometric biosensor using gold nanoparticle-modified electrodes for the determination of inulin in foods / J. Manso et al. // Anal. Biochem. -2008. Vol. 375, № 2. - P. 345-353.

43. Biochemical characterization of Aspergillus awamori exoinulinase: substrate binding characteristics and regioselectivity of hydrolysis / A.A. Kulminskaya et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1650, № 1. - P. 22-29.

44. Bonnett G.D. Fructan-hydrolyzing activities from Lolium rigidum Gaudin / G.D. Bonnett, R.J. Simpson//New Phytol. 1993. - Vol. 123. - P. 443-451.

45. Burne R.A. Characterization of the Streptococcus mutans GS-5 fruA gene encoding exo-ß-D-fructosidase / R.A. Bume, J.E Penders. // Infect. Immun. -1992.-Vol. 60.-P. 4621-4632.

46. Carbohydratebinding modules: fine-tuning polysaccharide recognition / A.B. Boraston et al. // Biochem. J. 2004. - Vol. 382. - P. 769-781.

47. Catalytic mechanism of inulinase from Arthrobacter sp. S37 / K.Y. Kim et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. - Vol. 371, № 4. - P. 600-605.

48. Cellvibrio japonicus a-L-arabinanase A43 has a novel five-blade ß-propeller fold / D. Nurizzo et al. // Nature Struct. Biol. 2002. - Vol. 9. - P. 665-668.

49. Characterization of a purified ß-fructofuranosidase from Bifidobacterium infantis ATCC 15697 / M. Warchol et al. // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - Vol. 35, № 6. - P. 462-467.

50. Characterization of thermo-stable endoinulinase from a new strain Bacillus smithii T7 / W. Gao et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. - Vol. 157, № 3.-P. 498-506.

51. Chaudhuri I. Evolution of the beta-propeller fold / I. Chaudhuri, J. Soding, A.N. Lupas // Proteins. 2008. -Vol. 71, № 2. - P. 795-803.

52. Chen X. Optimization of solid-state medium for the production of inulinase by Kluyveromyces SI20 using response surface methodology / X. Chen, J.H. Wang, D.S. Li // Biochem. Eng. J. 2007. - Vol. 34. - P. 179-184.

53. Cho Y. Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonas orysae / Y. Cho, J. Yun // Process Biochemistry. 2002 - Vol. 37, № 5. -P. 1325-1331.

54. Claessens G. / Purification and properties of an inulinase from chicory roots (iCichorium intybus L.) / G. Claessens, A. Van Laere, M. De Profit // J. Plant Physiol. 1990. - Vol. 136, № 1 - P. 35-39.

55. Cloning and characterization of an • exoinulinase from Bacillus polymyxa / H.J. Kwon et al. // Biotechnol. Lett. 2003. - Vol. 25, № 2. - P. 155-159.

56. Cloning and characterization of the inulinase gene from a marine yeast Pichia guilliermondii and its expression in Pichia pastoris / T. Zhang et al. // Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. - Vol. 95, № 1. - P. 13-22.

57. Cloning and nucleotide sequence of the endoinulinase-encoding gene, inu2, from Aspergillus ficuum / T.B. Uhm et al. // Biotechnology Letters. — 1998. -Vol. 20.-P. 809-812.

58. Cloning and sequencing of the inulinase gene of Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 12424 / O. Laloux et al. // FEBS Lett. 1991. - Vol. 289, № 1. - P. 64-68.

59. Cloning, developmental, and tissue-specific expression of sucroseisucrose 1-fructosyl transferase from Taraxacum officinale. Fructan localization in roots / W. Van den Ende et al. // Plant Physiology 2000. - Vol. 123. - P. 71-80.

60. Cloning, expression and purification of exo-inulinase from Bacillus sp. Snu-7 / K.Y. Kim et al. // J. Microbiol. Biotechnol. 2004. - Vol. 14, № 2. -P. 344-349.

61. Continuous preparation of fructose syrups from Jerusalem artichoke tuber using immobilized intracellular inulinase from Kluyveromyces sp. Y-85 / W. Wei et al. // Proc. Biochem. 1999. - Vol. 34. - P. 643-646.

62. Continuous production of fructose syrups from inulin by immobilized inulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. II Journal of Fermentation and Bioengineering. 1995. - Vol. 80, № 2. - P. 164-169.

63. Copley R.R. Sialidase-like Asp-boxes: sequence-similar structures within different protein folds / R.R. Copley, R.B. Russell, C.P. Ponting II Protein Sci. 2001. -Vol. 10, №2. -P. 285-292.

64. Coutinho P.M. Carbohydrate-active enzymes server / P.M. Coutinho, B. Henrissat. (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)

65. Crystal structure of exoinulinase from Aspergillus awamori : the enzyme fold and structural determinants of substrate recognition / R.A. Nagem et al. II J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 344, № 11 - P. 471-480.

66. Crystal structure of inactivated Thermotoga maritima invertase in complex with the trisaccharide substrate raffmose / F. Alberto et al. II Biochem. J. 2006. -Vol. 395.-P. 457-462.

67. Crystal structure of the carbohydrate recognition domain of p58/ERGIC-53, a protein involved in glycoprotein export from the endoplasmic reticulum / L.M. Velloso et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 15979-15984.

68. Crystallization and general properties of an extracellular inulase from Aspergillus sp. IV. Studies on microbial inulase / T. Nakamura et al. II Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1978. - Vol. 52. - P. 159-166.

69. Demeulle S. Study of inulase from Debaryomyces phaffii Capriotti / S. Demeulle, J.P. Guiraud, P. Galzy // Z. Allg. Mikrobiol. 1981. - Vol. 21, № 3. - P. 181-189.

70. Effect of inulin concentration on the production of inulo-oligosaccharides by soluble and immobilized endoinulinase / J.W. Yun et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84. - P. 365-368.

71. Effect of media supplements and culture conditions on inulinase production by an actinomycete strain / P.K. Gill et al. // Bioresour. Technol. 2003. — Vol. 87, №3.-P. 359-362.

72. Effects of carbon and nitrogen sources and oxygenation on the production of inulinase by Kluyveromyces marxianus / O. Bernardo et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. - Vol. 152. - P. 249-261.

73. Elyachioui M. General properties of extracellular bacterial inulinase / M. Elyachioui, J.P. Horeiz, R. Taillez // J. Appl. Bacteriol. 1992. - Vol. 73, № 2.-P. 514-519.

74. Enhanced fructooligosaccharides and inulinase production by a Xanthomonas campestris pv. phaseoli KM 24 mutant / K. Naidoo et al. // Bioprocess Biosyst. Eng. 2009. - Vol. 32, №5.-P. 689-695.

75. Ettalibi M. Immobilization of Aspergillus ficuum inulinases on porous glass / M. Ettalibi, J.C. Baratti // Biocatalysis. 1992. - Vol. 5. - P. 175-182.

76. Ettalibi M. Purification, properties and comparison of invertase, exoinulinases and endoinulinases of Aspergillus ficuum / M. Ettalibi, J.C. Baratti // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - Vol. 26. - P. 13-20.

77. Ettalibi M. Sucrose hydrolysis by the thermostable immobilized inulinases from Aspergillus ficuum / M. Ettalibi, J.C. Baratti // Enzyme Microb. Tech. — 2001. — Vol. 28.-P. 596-601.

78. Exo-inulinase from Aspergillus awamori var. 2250: enzymatic properties, sequence analysis and preminary X-ray data / M. Arand et al. // J. Biosci. Bioeng.-2001.-Vol. 96, №6.-P. 324-331.

79. Expression of the INU2 gene for endoinulinase of Aspergillus ficuum in Saccharomyces cerevisiae / H. Kim et al. // Biotechnology Letters. — 1999. — Vol. 21.-P. 621-623.

80. Expression of the inulinase gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris / L. Zhang et al. // Process Biochem. 2003. - Vol. 38. - P. 1209-1212.

81. Fructan biosynthetic and breakdown enzymes in dicots evolved from different invertases: expression of fructan genes throughout chicory development / W. Van den Ende et al. // Sci. World J. 2002. - Vol. 2. - P. 1273-1287.

82. Fructosyltransferase mutants specify a function for the P-fructosidase motif of the sucrose-binding box in specifying the fructan type synthesized / T. Ritsema et al. //Plant. Mol. Biol. 2004. - Vol. 54. - P. 853-863.

83. Galactose recognition by the carbohydrate-binding module of a bacterial sialidase / S.L. Newstead et al. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. -2005.-Vol. 61.-P. 1483-1491.

84. Gaskell A. The three domains of a bacterial sialidase: a P-propeller, an immunoglobulin module and a galactose-binding jelly-roll / A. Gaskell, S. Crennell, G. Taylor // Structure. 1995. -Vol. 3, № 11. - P. 1197-1205.

85. Ge X. Effect of octadecanoylsucrose derivatives on the production of inulinase by Aspergillus niger SL-09 / X. Ge, W. Zhang // World Journal of Microbiology & Biotechnology.-2005.-Vol. 21.-P. 1633-1638.

86. Gene cloning, expression, and crystallization of a thermostable exo-inulinase from Geobacillus stearothermophilus KP1289 / Y. Tsujimoto et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - Vol. 62, № 2. - P. 180-185.

87. Gill P.K. Comparative analysis of thermostability of extracellular inulinase activity from Aspergillus fumigatus with commercially available (Novozyme) inulinase / P.K. Gill, R.K. Manhas, P. Singh // Bioresour. Technol. 2006. -Vol. 97, №2.-P. 355-358.

88. Gill P.K. Hydrolysis of inulin by immobilized thermostable extracellular exoinulinase from Aspergillus fumigatus / P.K. Gill, R.K. Manhas, P. Singh // J. Food Engineer. 2006. - Vol. 76. - P. 369-375.

89. Gill P.K. Purification and properties of a heat-stable exoinulinase isoform from Aspergillus fumigatus / P.K. Gill, R.K. Manhas, P. Singh // Bioresource Technology. 2006. - Vol. 97. - P. 894-902.

90. Goosen C. Identification and characterization of glycoside hydrolase family 32 enzymes from Aspergillus niger / C. Goosen — (http://dissertations.ub.rug.nl/ faculties/ science/2007/c.£oosen/)

91. Grootwassink J.W. Inducible and constitutive formation of |3-fractofuranosidase (inulase) in batch and continuous culture of the yeast Kluyveromyces fragilis / J.W. Grootwassink, G.M. Hewitt // J. Gen. Microbiol. -1983.-Vol. 129.-P. 31-41.

92. Guiraud J.P. Inulinase of Debaryomyces cantarellii / J.P. Guiraud, C. Bernit, P. Galzy // Folia Microbiol. 1982. - Vol. 27, № 1. - P. 19-24.

93. Hamdy H.S. Purification and some important characters of extracellular inulinase of Alternaria alternata (Fr.) Keissler /H.S. Hamdy // Indian J. Exp. Biol. 2002. -Vol. 40, № 12. - P. 1393-1398.

94. Henson C.A. Characterization of a fructan exohydrolase purified from barley stems that hydrolyzes multiple fructofuranosidic linkages / C.A. Henson, D.P. Livingston // Plant Physiol. 1998. - Vol. 36. - P. 715-720.

95. Hydrolysis of inulin: a kinetic study of the reaction catalysed by an inulinase from Aspergillus ficuum / P. Carniti et al. // Biotechnol. Bioeng. — 1991. — Vol. 37, №6.-P. 575-579.

96. Immobilization of inulinase for sucrose hydrolysis / R. Catana et al. // Food Chem.-2005.-Vol. 91.-P. 517-520.

97. Immobilization of recombinat inulase II from a genetically modified Escherichia coli strain / D. Letca et al. // Roum. Biotechnol. Lett. — 2004. — Vol. 9, №5.-P. 1879-1886.

98. Immobilization system of Kluyveromyces marxianus cell in barium alginate for inulin hydrolysis / E. Barranco-Florido et al. // Process Biochemistry. — 2001. -Vol. 37, №5.-P. 513-519.

99. Inhibition of glucose on an exoinulinase from Kluyveromyces marxianus expressed in Pichia pastoris / L. Zhang et al. II Process Biochem. — 2005. -Vol. 40.-P. 1541-1545.

100. Inulinase production by a marine yeast Pichia guilliermondii and inulin hydrolysis by the crude inulinase / F. Gong et al. II J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2007.-Vol. 34, №3.-P. 179-185.

101. Inulinase production by Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 using solid state fermentation / J.P. Bender et al. // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2006. - Vol. 129.-P. 951-958.

102. Inulinase production by the marine yeast Cryptococcus aureus G7a and inulin hydrolysis by the crude inulinase / J. Sheng et al. II Proc. Biochem. 2007. -Vol. 42.-P. 805-811.

103. Inulinase synthesis from a mesophilic culture in submerged cultivation / A. Pandey et al. // Applied Biochemistry and Biotechnology. 1999. — Vol. 82.-P. 103-114.

104. Inulinase-expressing microorganisms and applications of inulinases / Z. Chi et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. - Vol. 82, № 2. - P. 211-220.

105. Inulinase-hyperproducing strains of Kluyveromyces sp. isolated from aguamiel (Agave sap) and pulque / A.E. Cruz-Guerrero et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2006. - Vol. 22. - P. 115-117.

106. Inulinase-producing marine yeasts: evaluation of their diversity and inulin hydrolysis by their crude enzymes / L. Gao et al. // Microb. Ecol. 2007. — Vol. 54, № 4. - P. 722-729.

107. Isolation and characterization of thermophilic bacterial strains with inulinase activity / J. Allais et al. // Applied and Environmental Microbiology. 1987. — Vol. 53, № 5. - P. 942-945.

108. Isolation of a mutant of Kluyveromyces sp. Y-85 resistant to catabolite repression / W. Wei et al. //J. Biosci. Bioeng. 1999.-Vol. 87.-P. 816-818.

109. Ji Y. Purification and properties of inulinases from Aspergillus niger M89 / Y. Ji, X. Zhao // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1998. - Vol. 38, № 2. - P. 120-125.

110. Kalil S.J. Ion exchange expanded bed chromatography for the purification of an extracelular inulinase from Kluyveromyces marxianus / S.J. Kalil, F. Maugeri,• M.I. Rodrigues // Process Biochemistry. 2005. - Vol. 40. - P. 581-586.

111. Kang S. Molecular cloning and sequence analysis of an endo-inulinase gene from Arthrobacter sp. / S. Kang, S. Kim // Biotechnology Letters. 1999. -Vol. 21, №7. -P. 569-574.

112. Kango N. Production of inulinase using tap roots of dandelion (Taraxacum officinale) by Aspergillus niger / N. Kango // J. Food Eng. 2008. - Vol. 38. -P. 473-478.

113. Kim B. Continuous production of fructose-syrups from inulin by immobilized inulinase from recombinant Saccharomyces cerevisiae II B. Kim, H. Kim, S. Nam // Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997. - Vol. 2. - P. 90-93.

114. Kim C.H. Ethanol production Jerusaleum artichoke by inulinase and Zymomonas mobilis / C. Kim, S. Rhee // Appl. Biochem Biotechnol. 1990. -Vol. 23, №2.-P. 171-180.

115. Kim C.H. Fructose production from Jerusalem artichoke by inulinase immobilized on chitin / C.H. Kim, S.K. Rhee // Biotechnology Letters. 1989. -Vol. 11, № 3. - P. 201-206.

116. Kim K.Y. Role of the N-terminal domain of endoinulinase from Arthrobacter sp. S37 in regulation of enzyme catalysis / K.Y. Kim, S. Rhee, S.I. Kim // J. Biochem. 2005. - Vol. 138. - P. 27-33.

117. Kluyveromyces marxianus CDBB-L-278: a wild inulinase hyperproducing strain / A. Cruz-Guerrero et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. -1995.-Vol. 80, №2.-P. 159-163.

118. Kochhar A. Inulinase from Aspergillus versicolor: a potent enzyme for producing fructose from inulin / A. Kochhar, N. Kaur, A.K. Gupta // J. Sei. Ind. Res. 1997. - Vol. 56. - P. 721-726.

119. Kochhar A. Purification and immobilisation of inulinase from Aspergillus Candidus for producing fructose / A. Kochhar, A.K. Gupta, N. Kaur // J. Sei. Food Agric. 1999. - Vol. 79. - P. 549-554.

120. Kushi R.T. Production, purification and characterization of an extracellular inulinase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / R.T. Kushi, R. Monti, J. Contiero // J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 2000. - Vol. 25. - P. 63-69.

121. Kwon Y.M. Cloning and characterization of Pseudomonas mucidolens exoinulinase / Y.M. Kwon, H.Y. Kim, Y.J. Choi // J. Microbiol. Biotechnol. -2000. Vol. 10, № 2. - P. 238-243.

122. Laoux D. Purification and partial characterization of the inulinase of Kluyveromyses fragilis / D. Laoux, J. Delcour, J. Vandenhaute // Arch. int. physiol. et biochim. 1989. - Vol. 97, № 6. - P. 161-165.

123. Manzoni M. Purification and characterization of the extracellular inulinase from Kluyveromyces cicerisporus / M. Manzoni, V. Cavazzoni // Lebensmittel Wissenschaft und Technolgie. 1991. - Vol. 24. - P. 236-240.

124. Marx S.P. Seasonal variation of fructan-ß-fructosidase (FEH) activity and characterization of a ß-(2,l)-linkage specific FEH / S.P. Marx, J. Nosberger, M. Frehner // New Phytol. 1997. - Vol. 135. - P. 267-277.

125. Meng G. Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis levansucrase / G. Meng, K. Futterer // Nature Struct. Biol. 2003. - Vol. 10. — P. 935-941.

126. Microbial production on inulo-oligosaccharydes by an endoinulinase from Pseudomonas sp. expressed in Escherichia coli / W.Y. Jong et al. // Journal of Bioscience and Bioengineering. 1999. - Vol. 87. - P. 291-295.

127. Molecular cloning and characterization of an exoinulinase gene from Aspergillus niger strain 12 and its expression in Pichia pastoris / S. Moriyama et al. // J. Biosci. Bioeng. 2003. - Vol. 96. - P. 324-331.

128. Molecular cloning and characterization of the fructooligosaccharide-producing ß-fructofuranosidase gene from Aspergillus niger ATCC 20611 / K. Yanai et al. //Biosci. Biotechnol. Biochem. -2001. Vol. 65. - P. 766-773.

129. Molecular cloning and nucleotide sequences of cDNA and gene encoding endo-inulinase from Penicillium purpurogenum / S. Onodera et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996.-Vol. 60, № 11.-P. 1780-1785.

130. Molecular cloning and sequence analysis of an endoinulinase gene from Penicillium sp. strain TN-88 / H. Akimoto et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000 - Vol. 64, № 11. - P. 2328-2335.

131. Molecular cloning and sequence analysis of two endoinulinase genes from Aspergillus niger / K. Ohta et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 -Vol. 62, №9.-P. 1731-1738.

132. Moriyama S. Functional characterization and evolutionary implication of the internal 157-amino-acid sequence of an exoinulinase from Pénicillium sp. strain TN-88 / S. Moriyama, K. Ohta // J. Biosci. Bioeng. 2007. -Vol. 103, №4.-P. 293-297.

133. Moriyama S. Quantitative expression analysis of inulinase gene cluster of Pénicillium sp. strain TN-88 / S. Moriyama, M. Muguruma, K. Ohta // J. Biosci. Bioeng. 2006. - Vol. 101, № 3. - P. 277-279.

134. Mutanda T. Controlled production of fructose by an exoinulinase from Aspergillus ficuum / T. Mutanda, B. Wilhelmi, C.G. Whiteley // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. - Vol. 159, № 1. - P. 65-77.

135. Mycelial and extracellular inulinases from Fusarium oxysporum grown on aquous extract of Cichorium intybus roots / A.K. Gupta et al. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1988. - Vol. 42, № 1. - P. 69-76.

136. Nakamura T. Culture conditions for inulase production by Aspergillus (P III) / T. Nakamura, S. Hoashi, S. Nakatsu // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1978. -Vol. 52.-P. 105-110.

137. Nakamura T. General properties of extracellar inulase from Penicillum (P II) // T. Nakamura, S. Nakatsu // J. Agr. Chem. Soc. Jap. 1977. - Vol. 51, № 12. -P. 681-689.

138. Nam S. Secretion and localization of invertase and inulinase in recombinant Saccharomyces cerevisiae / S. Nam, K. Yoda, M. Yamasaki // Biotechnology Letters.- 1993,-Vol. 15, № 10.-P. 1049-1054.

139. Naumoff D.G. Conserved sequence motifs in levansucrases and bifunctional (3-xylosidases and a-L-arabinases / D.G. Naumoff // FEBS Letters. 1999. -Vol. 448. -P. 177-179.

140. Naumoff D.G. P-fructosidase superfamily: homology with some a-L-arabinases and p-D-xylosidases / D.G. Naumoff // Proteins. 2001. -Vol. 42.-P. 66-76.

141. Nesterenko M.V. A simple modification of Blums silver stain method allows for 30 minute detection of protein in polyacrilamide gel / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biol. 1994. - Vol. 28. - P. 239.

142. Norman J.M. Characterization of lev J, a sucrase/fructanase-encoding gene from Actinomyces naeslundii T14V, and comparison of its products with other sucrose-cleaving enzymes / J.M. Norman, K.L. Bunny, P.M. Giffard // Gene. — 1995.-Vol. 152.-P. 93-98.

143. Occurrence of two forms of extracellular endoinulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1994. - Vol. 78, № 2. - P. 134-139.

144. Ohta K. Fungal inulinases: enzymology, molecular biology and biotechnology / K. Ohta, H. Akimoto, S. Moriyama // J. Appl. Glycosci. — 2004. — Vol. 51.-P. 247-254.

145. Ohta K. Purification and properties of an extracellular inulinase from Rhizopus sp. strain TN-96 / K. Ohta, N. Suetsugu, T. Nakamura // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002 - Vol. 94, № 1. - P. 78-80.

146. One-step ethanol fermentation with Kluyveromyces marxianus YX01 from Jerusalem artichoke / W. Yuan et al. // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. -2008. Vol. 24, № 11. - P. 1931-1936.

147. Ongen-Baysal G. Production and properties of inulinase from Aspergillus niger / G. Ongen-Baysal, S. Suha Sukan, N. Vassilev 11 Biotechnology Letters. -1994. -Vol. 16, №3.-P. 275-280.

148. Onodera S. Purification and subsite affinities of exo-inulinases from Penicillium trzebinskii / S. Onodera, N. Shiomi // Biosci. Biotechnol. Biochem. -1992. Vol. 56. - P. 1443-1447.

149. Onodera S. Purification and substrate specificity of endo-type inulinases from Pénicillium purparogenum / S. Onodera, N. Shiomi // Agric. Biol. Chem. -1988. Vol. 52. - P. 2569-2576.

150. Optimization of inulinase production by Kluyveromyces marxianus using factorial design / S.J. Kalil et al. II Applied Biochemistry and Biotechnology. — 2001.-Vol. 94, №3.-P. 257-264.

151. Optimization of inulinase production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrat / M.A. Mazutti et al. // Enzyme and Microbial Technology. 2006. - Vol. 39. - P. 56-59.

152. Optimization of process parameters for the production of inulinase from a newly isolated Aspergillus niger / K.G. Pratap et al. II World J. Microbiol, and Biotechnol. 2005. - № 8.- 1359-1361.

153. Optimizing the culture conditions for higher inulinase production by Kluyveromyces sp. Y-85 and scaling-up fermentation / W. Wei et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998. - Vol. 86. - P. 395-399.

154. Park J.P. Utilization of chicory roots for microbial endoinulinase production / J.P. Park, J.W. Yun // Letters in Applied Microbiology. 2001. - Vol. 33, № 3. -P. 183-187.

155. Pessoa A. Inulinase from Kluyveromyces marxianus: culture medium composition and enzyme extraction / A. Pessoa, M. Vitolo // Braz. J. Chem. Eng. 1999. - Vol. 16. - P. 237-245.

156. Pessoni R.A. Purification and properties of exo-inulinases from Pénicillium janczewskii growing on distinct carbon sources / R.A. Pessoni, M.R. Braga, R.C. Figueiredo-Ribeiro // Mycologia. 2007. - Vol. 99, № 4. - P. 493-503.

157. Prediction of a common P-propeller catalytic domain for fructosyltransferases of different origin and substrate specificity / T. Pons et al. // Protein Sci. -2000. Vol. 9. - P. 2285-2291.

158. Process for producing the potential food ingredient DFA III from inulin: screening, genetic engineering, fermentation and immobilisation of inulase II / U. Jahnz et al. // Int. J. Pharm. 2003. - Vol. 256, № 1. - P. 199-206.

159. Production and properties of a bacterial thermostable exo-inulirtase / K. Uzunova et al. // Z. Naturforsch. 2001. - Vol. 56, № 11. - P. 1022-1028.

160. Production and separation of exo- and endoinulinase from Aspergillus fzcum / W. Jing et al. // Process Biochemistry. 2003. - Vol. 39. - P. 5-11.

161. Production of fructooligosaccharides by crude enzyme preparations of ß-fructanofuranosidase from Aureobasidium pullulans / J. Yoshikawa et al. // Biotechnology Letters. 2008. - Vol. 30. - P. 535-539.

162. Production of fructose from inulin using mixed inulinases from Aspergillus niger and Candida guilliermondii / S. Sirisansaneeyakul et al. II World J Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 23. - P. 543-552.

163. Production of inulin fructotransferase (depolymerising) by Arthrobacter sp H65-7 and preparation of DFAIII from inulin by the enzyme / A. Yokota et al. // Journal of fermentation and bioengineering. 1991. - Vol. 72, № 4. - P. 258—261

164. Production of inulooligosaccharides using endo-inulinase from a Pseudomonas sp. / D.H. Kim et al. II Biotechnology Letters. 1997. - Vol. 19, № 4 P. 369-371.

165. Production, characterization and gene cloning of the extracellular enzymes from the marine-derived yeasts and their potential applications / Z. Chi et al. // Biotechnol. Adv. 2009. - Vol. 27, № 3. - P. 236-355.

166. Production, purification and identification of fructooligosaccharides produced by ß-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI 303386 / Q.D. Nguyen et al. // Biotechnology Letters. 1999. - Vol. 21, № 3. - P. 183-186.

167. Production, purification and immobilization of inulinase from Kluyveromyces fragilis / A.K. Gupta et al. // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994. - Vol. 59 №4.-P. 377-385.

168. Production, purification and properties of an endoinulinase of Penicillum sp TN-88 that liberates inulotriose / T. Nakamura et al. / Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84, № 4. -P. 313-318.

169. Production, thermal stability and immobilisation of inulinase from Fusarium oxysporum / A.K. Gupta et al. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1990. -Vol. 47, №3.-P. 245-257.

170. Properties of exoinulinase from Aspergillus niger (P-I) / T. Nakamura et al. // Bull. Fac. Agric. Miyazaki Univ. 1996. - Vol. 43. - P. 93-101.

171. Protein measurement with folin-phenol reagent / O.H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265- 275.

172. Purifcation and characterization of 1-SST, the key enzyme initiating fructan biosynthesis in young chicory roots (Cichorium intybus L.) / W. Van den Ende et al. // Physiol. Plant. 1996. - Vol. 98. - P. 455-466.

173. Purifcation and characterization of fructan: fructan fractosyl transferase from chicory roots (Cichorium intybus L.) / W. Van den Ende et al. // Planta. -1996. Vol. 199. - P. 493-502.

174. Purification and characterisation of an Aspergillus niger invertase and its DNA sequence / L.M. Boddy et al. // Curr. Genet. 1993. - Vol. 24. - P. 60-66.

175. Purification and characterization of an exoinulinase from Aspergillus fumigatus / P.K. Gill et al. // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2004. -Vol. 117, № l.-P. 19-32.

176. Purification and characterization of Aspergillus ficuum endoinulinase / T.B. Uhm et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. - Vol. 63, № 1. -P. 146-151.

177. Purification and characterization of extracellular inulinase from a marine yeast Cryptococcus aureus G7a and inulin hydrolysis by the purified inulinase / J. Sheng et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. - Vol. 144, № 2. -P. 111-121.

178. Purification and characterization of extracellular inulinase from a marine yeast Pichia guilliermondii and inulin hydrolysis by the purified inulinase / F. Gong et al. // Biotechnol. Bioproc. Eng. 2008. - Vol. 13. - P. 533-539.

179. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / L. Zhang et al. // Protein Expr. Purif. — 2004. — Vol. 35, №2.-P. 272-275.

180. Purification and characterization of three soluble invertases from barley (.Hordeum vulgare L.) leaves / D.M. Obenland et al. // Plant Physiol. — 1993. -Vol. 101.-P. 1331-1339.

181. Purification and partial characterization of fructosyltransferase and invertase from Aspergillus niger AS0023 / L. L'Hocine et al. // J. Biotechnol. — 2000. — Vol. 81.-P. 73-84.

182. Purification and properties of a second fructan exohydrolase from the roots of Cichorium intybus L. / J. De Roover et al. 11 Physiol. Plant. 1999. - Vol. 106. -P. 28-34.

183. Purification and properties of an endo-inulinase from an Arthrobacter sp. / S.I. Kang et al. // Biotechnol. Lett. 1998. - Vol. 20. - P. 983-986.

184. Purification and properties of an extracellular exoinulinase from Penicillium sp. strain TN-88 and sequence analysis of the encoding gene / S. Moriyama et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. - Vol. 66, № 9. - P. 1887-1896.

185. Purification and properties of endoinulinase from Chaetomium sp. / G.Q. Zhang et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2004. - Vol. 44, № 6. -P. 785-788.

186. Purification and properties of inulin fructotransferase (depolymerizing) from Arthrobacter globiformis CI 1-1 / K. Haraguchi et al. // Agric. Biol. Chem. — 1998. Vol. 52. - P. 291-292.

187. Purification and properties of inulinase from Aspergillus niger / G. Chen et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1997. - Vol. 37, № 5. - P. 362-367.

188. Purification and properties of inulinase from Kluyveromyces sp. Y-85 / W. Wei et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1997. - Vol. 37, № 6. - P. 443-448.

189. Purification and properties of ß-fructofuranosidase from Aspergillus niger / T.B. Uhm et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - Vol. 926. - P. 119-126.

190. Purification, characterization, gene cloning and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori / M. Arand et al. // Biochem. J. — 2002.-Vol. 362, № 1 P. 131-135.

191. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications / A. Pandey et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1999. — Vol. 81, № 1.-P. 35-52.

192. Santos A.M. Synthesis of fructooligosaccharides from sucrose using inulinase from Kluyveromyces marxianus / A.M. Santos, F. Maugeri // Food Technology and Biotechnology. 2007. - Vol. 45. - P. 181-186.

193. Screening for microorganisms that produce only endo-inulinase / R.M. Gern et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 55. - P. 632-635.

194. Selvakumar P. Solid state fermentation for the synthesis of inulinase from Staphylococcus sp. and Kluyveromyces marxianus / P. Selvakumar, A. Pandey // Process Biochemistry. 1999.-Vol. 34. - P. 851-855.

195. Sharma A.D. Inulinase production using garlic {Allium sativum) powder as a potential substrate in Streptomyces sp. / A.D. Sharma, S. Kainth, P.K. Gill // J. Food Eng. 2006. - Vol. 77. - P. 486-491.

196. Silva F.R. Adsorption of inulinases in ion-exchange columns / F.R. Silva, C.C. Santana// Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. - Vol. 84. - P. 1063-1078.

197. Silva-Santisteban B. Agitation, aeration and shear stress as key factors in inulinase production by Kluyveromyces marxianus / B. Silva-Santisteban, F. Maugeri // Enzyme and Microbial Technology. 2005. - Vol. 36. -P. 717-724.

198. Silva-Santisteban B.O. Effects of carbon and nitrogen sources and oxygenation on the production of inulinase by Kluyveromyces marxianus / B.O. Silva

199. Santisteban, A. Converti, F.M. Filho // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. -Vol. 152, №2.-P. 249-261.

200. Simpson R.J. Fructan exohydrolase from grasses / R.J. Simpson, G.D. Bonnett // New Phytol. 1993. - Vol. 123.- P. 453-469.

201. Singh P. Production of inulinases: recent advances / P. Singh, P.K. Gill // Food Technol. Biotechnol. 2006. - Vol. 44. - P. 151-162.

202. Singh R.S. Development of a stable continuous flow immobilized enzyme reactor for the hydrolysis of inulin /R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008. - Vol. 35, № 7. - P. 777-782.

203. Singh R.S. Partial purification and characterization of exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1 for preparation of high-fructose syrup / R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 17, № 5.-P. 733-738.

204. Singh R.S. Production of high fructose syrup from Asparagus inulin using immobilized exoinulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1 / R.S. Singh, R. Dhaliwal, M. Puri // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 34, № io. -P. 649-655.

205. Single-cell protein production from Jerusalem artichoke extract by a recently isolated marine yeast Cryptococcus aureus G7a and its nutritive analysis / L.M. Gao et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 77. - P. 825-832.

206. Skowronek M. Selection of biochemical mutants of Aspergillus niger resistant to some abiotic stresses with increased inulinase production / M. Skowronek, J. Fiedurek // Journal of Applied Microbiology. 2003. - Vol. 95, № 4. -P. 686-691.

207. Snyder H.E. Studies on a (3-fructosidase (inulinase) produced by Saccharomyces fragilis / H.E. Snyder, H.J. Phaff // Antonie van Leeuwenhoerk J. Microbiol. Serol. 1960. - Vol. 26. - P. 433-452.

208. Stability evaluation of an immobilized enzyme system for inulin hydrolysis / R. Catana et al. // Food Chem. 2007. - Vol. 101. - P. 260-266.

209. Structural model for family 32 of glycosyl-hydrolase enzymes / T. Pons et al. // Protein Structure Function and Genetics 1998. — Vol. 33, № 3. — P. 383-395.

210. Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556 / R.J. Rouwenhorst et al. // Appl. Envirion. Microbiol. — 1990.-Vol. 56, № 11.-P. 3337-3345.

211. Studies on optimal conditions for inulinase production by Kluyveromyces sp. Y-85 / W. Wei et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1998. - Vol. 38, № 3. -P. 208-212.

212. Sturm A. The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development, growth and carbon partitioning / A. Sturm, G.Q Tang // Trends Plant Sei. — 1999.-Vol. 4.-P. 401-407.

213. Sucrose hydrolysis by gelatin-immobilized inulinase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / F.C. de Paula et al. // Food Chem. 2008. — Vol. 111.-P. 691-695.

214. Tachylectin-2: crystal structure of a specific GlcNAc/GalNAc-binding lectin involved in the innate immunity host defense of the Japanese horseshoe crab Tachypleus tridentatus / H.G. Beisel et al. II Embo J. 1999. - Vol. 18. -P. 2313-2322.

215. Technical viability of the production, partial purification and characterisation of inulinase using pretreated agroindustrial residues / H. Treichel et al. // Bioprocess. Biosyst. Eng. 2009. - Vol. 32, № 4. - P. 425-433.

216. The metabolism of fructans in roots of Cichorium intybus L. during growth, storage and forcing / W. Van den Ende et al. // New Phytol. 1996. -Vol. 132. - P. 555-563.

217. The yeast Kluyveromyces marxianus and its biotechnological potential /

218. G.G. Fonseca et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. - Vol. 79, № 3. -P. 339-354.

219. Three acidic residues are at the active site of a P-propeller architecture in glycoside hydrolase families 32, 43, 62, and 68 / T. Pons et al. // Proteins. — 2004. Vol. 54. - P. 424-432.

220. Transcriptional analysis of two endoinulinase genes inuA and inuB in Aspergillus niger and nucleotide sequences of their promoter regions /

221. H. Akimoto et al. // J Biosci Bioeng. 1999. - Vol. 88. - P. 599-604.

222. Trends in inulinase production review / K. Vijayaraghavan et al. // Crit. Rev. Biotechnol. - 2009. - Vol. 29, № 1. - P. 67-77.

223. Uhm T.B. Thermal stability of the multiple charge isoforms of inulase from Aspergillus niger / T.B. Uhm, S.M. Byun // Biotechnol. Lett. 1987. - Vol. 9. -P. 287-290.

224. Using natural variation to investigate the function of individual amino acids in the sucrose-binding box of fructan:fructan 6G-fructosyltransferase (6G-FFT) in product formation / T. Ritsema et al. // Plant. Mol. Biol. 2005. - Vol. 58. -P. 597-607.

225. Van den Ende W. Fructan synthesizing and degrading activities in chicory roots (Cichorium intybus L.) during field-growth, storage and forcing / W. Van den Ende, A. Van Laere // J. Plant Physiol. 1996. - Vol. 149. - P. 43-50.

226. Van Laere A.Tnulin metabolism in dicots: chicory as a model system / A. Van Laere, W. Van den Ende // Plant Cell Environ. 2002. - Vol. 25. - P. 803-815.

227. Vandamme E.J. Microbial inulinase: fermentation process, properties and applications / E.J. Vandamme, D.G. Derycke // Adv. Appl. Microbiol. — 1983. — Vol. 29.-P. 139-176.

228. Viswanathan P. Properties and application of inulinase obtained by fermentation of costus (Saussurea lappa) roots powder with Aspergillus niger II P. Viswanathan, P.R. ICulkarni // Nahrung. 1995. - Vol. 39. - P. 288-294.

229. Wagner W. Properties and subcellular localization of fructan hydrolase in the leaves of barley (Hordeum vulgare L. cv. Gerbel) / W. Wagner, A. Wiemken // J. Plant Physiol. 1986. - Vol. 123. - P. 429-439.

230. Wallis G.L. Secretion of two (3-fructofuranosidases by Aspergillus niger growing in sucrose / G.L. Wallis, F.W. Hemming, J.F. Peberdy // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - Vol. 345. - P. 214-222.

231. Wang G.Y. Screening and identification of yeast strains producing inulinases // G.Y. Wang, A.R. Song, G.J. Chen // J. Microbiol. 2006. - Vol. 26. - P. 39-41.

232. Weis W.I. Structural basis of lectin-carbohydrate recognition / W.I. Weis, K. Drickamer II Annu. Rev. Biochem. 1996. - Vol. 65. - P. 441-473.

233. Wenling W. Continuous preparation of fructose syrups from Jerusalem artichoke tuber using immobilized intracellular inulinase from Kluyveromyces sp. Y-85 / W. Wenling, W.W. Huiying, W. Shiyuan // Process Biochem. 1999. -Vol. 34. - P. 643-646.

234. Workman W.E. Enzymatic hydrolysis of inulin to fructose by glutaraldehyde fixed yeast cells / W.E. Workman, D.F. Day // Biotechnology and Bioengineering. 1984. - Vol. 28, № 8. - P. 905-910.

235. Workman W.E. Purification and properties of the P-fructofuranosidase from Kluyveromyces fragilis / W.E. Workman, D.F. Day // FEBS Letters. 1983. -Vol. 160.-P. 16-20.

236. Xiao R. Purification and characteristics of two exo-inulinase from Chrysosporium pannorum / R. Xiao, M. Tanida, S. Takao // J. Ferment. Technol.- 1989.-Vol. 67.-P. 331-334.

237. X-ray diffraction structure of a plant glycosyl hydrolase family 32 protein: fructan 1-exohydrolase Ha of Cichorium intybus / M. Verhaest et al. // The Plant Journal. 2005. - Vol. 41. - P. 400-411.

238. Yacon {Polymnia sanchifolia) extract as a substrate to produce inulinase by Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / M.L. Cazetta et al. II Journal of Food Engineering. 2005. - Vol. 66. - P. 301-305.

239. Yokota A. Purification and properties of an inulin fructotransferase (depolymerizing) from Arthrobacter sp. H65-7 / A. Yokota, K. Enomoto, F. Tomita // Journal of fermentation and bioengineering. 1991. - Vol. 72, № 4. — P. 262-265.

240. Zittan L. Enzymatic hydrolysis of inulin an alternative way to fructose production / L. Zittan // Starche. - 1981. - Vol. 33, № 11. - P. 373-377.

Информация о работе

Холявка, Марина Геннадьевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы