Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой

Таха Абдул Саттар

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой"

На правах рукописи

Таха Абдул Саттар

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И КИНЕТИКО-ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ РЕАКЦИИ ГИДРОЛИЗА ИНУЛИНА СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ИНУЛИНАЗОЙ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2005

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор КОВАЛЕВА Тамара Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

кандидат биологических наук, ассистент Семенова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН

Защита диссертации состоится 25 апреля 2005 г. в 15.00 ч. на заседании диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете (394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан^З марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

liSkSt

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Современные тенденции развития теории биологического катализа связаны с изучением ферментативных реакций, которые при всей их сложности протекают в полном соответствии с законами химической кинетики и термодинамики. Однако уникальные свойства ферментов, их способность осуществлять регуляцию всех процессов жизнедеятельности на внутримолекулярном уровне определяются исключительно сложной структурой полипептидной цепи и активного центра белковой макромолекулы.

Исследование структурно-функциональных свойств карбогидраз и кине-тико-термодинамических аспектов ферментативного гидролиза полимерных субстратов являются необходимым условием изучения полиферментных систем, локализованных в различных клеточных органеллах и нужно для создания теоретической базы ферментации возобновляемого растительного сырья и получения продуктов с заданными свойствами.

Особую значимость приобретают в настоящее время работы по иммобилизации ферментов, расщепляющих полисахариды и полифруктозиды и переводящих фермент из гомогенных катализаторов в гетерогенные, имеющие ряд технологических преимуществ.

Фермент инулиназа (2,1^-В-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.3.1.7), специфически гидролизует р-1,2-связи инулина до фруктозы и фруктоолигоса-харидов в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуы и применения специального кислотоустойчивого оборудования. В этой связи особую значимость приобретают работы по изучению структурно-функциональных свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулинсодержащего сырья, а также ряд теоретических и практических вопросов, связанных с изучением влияния природы носителя на сохранение и поддержание каталитической активности инулиназы.

Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета, входящей в Координационный план научно-исследовательских работ РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными инулиназами из микромицета Aspergillus awamori и дрожжей Kluyveromyces marxianus.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:

■ разработка методов выделения и очистки инулиназы из Aspergillus

awamori и Kluyveromyces marxianus;

• изучение физико-химических свойств инулиназы из Aspergillus

awamori и Kluyveromyces marxianus;

■ определение кинетико-термодинамических параметров реакции гидро-

РОС. НЧ}К0НАЛЫ1АЯ БЙБДИОТСКА С. Петербург

лиза инулина свободными и иммобилизованными на различных носителях препаратами инулиназ Kluyveromyces marxianus;

■ исследование закономерностей процессов термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы KJuyveromyces marxianus

Научная новизна.

■ впервые осуществлена иммобилизация инулиназы Kluyveromyces marxianus на гранулярных и волокнистых ионообменниках АВ-12 ГС, АМ-21-А, ВИОНКН-1;

• установлены оптимальные условия функционирования иммобилизованной инулиназы;

■ обнаружено, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы имеет место многоточечное связывание с носителем, приводящее к увеличению значений Кш и АН и уменьшению значений Vmax и AS реакции гидролиза инулина;

■ с помощью дифференциального термического анализа и классических методов исследован процесс термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы в интервале температур 50-85 °С. Рассчитаны активационные параметры термоинактивации инулиназы (кш, Еакт, АН, AS). Выявлено, что адсорбционный способ иммобилизации инулиназы повышает устойчивость фермента к денатурирующим факторам среды (рН, температура);

■ предложена модель перехода глобула-клубок, включающая промежуточные стадии процесса термического разворачивания белковой молекулы инулиназы;

■ разработаны эффективные методы выделения и очистки инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxianus. Выявлены оптимальные режимы функционирования инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы расширяют представления о функционировании инулиназы в свободном и иммобилизованном состояниях, дают информацию о влиянии иммобилизации на процессы термической инактивации ферментов, вносят вклад в исследование механизмов реакций гидролиза инулина. Рассчитанные кинетико-термодинамические параметры реакции гидролиза инулина позволяют прогнозировать поведение свободного и иммобилизованного фермента в технологических условиях. Полученные данные могут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов университетов и высших учебных заведений технологического профиля курсов «Биотехнология», «Химическая энзимология», «Молекулярная биология», «Биофизика».

Апробация работы. Основные результаты по теме диссертации были представлены на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); ГП Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов» (Воронеж, 2004); конференции

«Биотехнология охране окружающей среды» (Москва, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); IX Conference of Food Microbiology (Lubljana, Slovenia, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 3 статьи и 4 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработаны эффективные методы выделения и очистки препаратов инулиназ из дрожжей Kluyveromyces marxianus и микромицета Aspergillus awamori с высокой каталитической активностью.

2. Созданы гетерогенные биокатализаторы на основе инулиназы из Kluyveromyces marxianus, адсорбционно иммобилизованной на АВ-16 ГС, АМ-21 -А, ВИОН КН, выявлены оптимальные условия их функционирования.

3. Плавление вторичной структуры свободной инулиназы Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку наблюдается наличие стадий упорядоченная глобула - хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

4. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы - кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значений термодинамических параметров.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 118 страниц машинописного текста; состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы (118 источников). Иллюстрационный материал включает 24 рисунка, 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Современные представления о гидролитических Ферментах

В разделе представлен анализ данных литературы об основных продуцентах, физико-химических свойствах, особенностях структуры и механизма действия гидролаз.

Глава 2. Современные аспекты иммобилизации гидролитических ферментов

Рассматриваются современные физические и химические методы иммобилизации гидролаз, их теоретическое и практическое значение.

Глава 3. Объекты и методы исследований

Объекты исследований Объектами исследования служили фермент инулиназа, выделенная из дрожжей Kluyveromyces marxianus на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета, и инулиназа, выделенную из Aspergillus awamori 2250 на кафедре микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии. В качестве субстрата использо-

вали инулин.

Методы исследований

Определение каталитической активности инулин азы проводили спектро-фотометрическим методом, основанным на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в ходе гидролиза инулина, при помощи реакции Селиванова на фруктозу.

Определение количества белка в препарате растворимой инулиназы осуществляли методом Лоури.

Определение количества белка в препарате иммобилизованной инулиназы проводили модифицированным методом Лоури.

Выделение и очистка препарата инулиназы из Kluyveromyces marxianus. Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus осуществляли глубинным способом. Препарат инулиназы получали путем осаждения культуральной жидкости 80 % изопропиловым спиртом и гель-фильтрации на сефадексе G-100.

Экстракция и очистка препарата инулиназы из Aspergillus awamori. Препарат инулиназы получали путем осаждения культуральной жидкости 80 % ацетоном, фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации на сефадексе G-25 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Определение кажущихся молекулярных масс фермента проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150.

Изучение процессов термической денатурации свободной и иммобилизованной инулиназы осуществляли методом дифференциального термического анализа (ДТА).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ "Statgraphics". Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Глава 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori

Для получения препарата инулиназы из Kluyveromyces татаапиз_культи-вирование продуцента проводили глубинным способом в колбах объемом 500 мл в 100 мл питательной среды на рефрижераторной качалке с частотой вращения 180 об/мин. Начальное значение рН среды 4,7; рациональный режим культивирования: температура выращивания 25 °С, продолжительность 72 ч.

Установлено, что для наиболее эффективного осаждения инулиназы из экстракта дрожжей целесообразно использовать 80% раствор изопропанола при рН экстракта 4,7, в этом случае наблюдается максимальный выход фермента и наибольшая каталитическая активность.

Для изучения физико-химических свойств и молекулярных механизмов функционирования ферментов необходимо проводить эксперименты с высоко-очшценными препаратами. В этой связи была осуществлена гель-фильтрация спиртосажденного препарата на сефадексе G-100. Результаты по очистке инули-

назы ЮиууеготусеБ тапиапш представлены в табл. 1. Достигнута 17,9-кратная очистка фермента, с выходом по активности 2 %. Молекулярная масса инулиназы ЮиууеготусеБ тапиапиБ составила 63±2,0 кДа.

Таблица 1

Очистка инулиназы из дрожжей Юиууеготусез татапш, выращенных на питательной среде с фруктозой в качестве источника углерода

Стадия очистки количество белка, мг/мл удельная активность, ед/мг степень очистки Выход, %

Культуральная жидкость 1,227 0,082 1,0 100,0

Экстракт поверхностной культуры 0,541 0,254 зд 44,1

осаждение изо- пропиловым спиртом 1,128 0,814 9,9 10,4

гель- хроматография на сефадексе О-100 0,025 1,470 17,9 2,0

При получении препарата инулиназы из микромицета Aspergillus awamori выявлено, что экстракцию фермента целесообразно проводить при температуре 4-6 °С и значении рН 4,0. Использование ацетона в концентрации 80% является наиболее эффективным, рациональным и экономичным (табл. 2).

Таблица 2

Очистка препарата инулиназы из Aspergillus awamori BKMF 2250

Стадия очистки Количество белка, мг/мл удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход, %

Культуральная жидкость 290 1,12 1 100

Осаждение ацетоном 150 12,4 11,1 84

Фракционирование сульфатом аммония 75 19,6 17,5 58

Сефадекс С-25 52 24,5 21,8 50

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 1,5 85,6 85 5

На второй стадии очистки инулиназы из Aspergillus awamori мы осуще-

ствляли освобождение его от балластных белков с помощью фракционирования сульфатом аммония при насыщении 55% - 70%. Далее проводили освобождение ферментного препарата от низкомолекулярных примесей с использованием гель - фильтрации на сефадексе С-25. Завершающей стадией очистки инулиназы являлась ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. В результате достигнута 85-кратная очистка инулиназы, с выходом по активности 5 %.

В ходе исследования физико-химических свойств полученных препаратов инулиназ установлено, что для фермента из микромицета характерно проявление наиболее высокой каталитической активности в диапазоне температур 40-60°С с максимумом при 50 "С. Дрожжевая инулиназа также характеризуется оптимальным значением температуры гидролиза 50 °С, но более узким диапазоном оптимальных температур (рис. 1 А).

Максимальное значение скорости гидролиза субстрата для обоих ферментных препаратов проявляется в диапазоне рН от 4,0 до 5,0 (в случае дрожжевой инулиназы от 4,5 до 5,0) с максимумом при рН 4,7, при этом ветви кривых несимметричны друг другу (рис. 1 В).

а в

юо д%

Обозначения

1 - инулиназа Kluyveromyces marxianus

2 - инулиназа Aspergillus awamori

Рис. I. Зависимость каталитической активности инулиназ Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori от температуры (А) и концентрации ионов водорода (В)

При исследовании зависимостей удельной активности инулиназ от концентрации инулина показано, что в обоих случаях они не подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. Форма кинетических кривых характеризуется наличием двух стационарных режимов, позволяющих сделать предположение о

субъединичной структуре молекул исследуемых инулиназ.

Значения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции, найденные графическим методом Лайнуивера-Берка, составили для инулиназ Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori 2,24" 10"4 моль/л и 1,86-Ю"4 моль/л; 102,5 мкмоль-мг/мин и 136,9 мкмоль-мг/мин соответственно.

Глава 5. Адсорбционная иммобилизация инулиназы из Kluyveromyces marxianus на различных носителях

Иммобилизация - один из путей повышения стабильности ферментов к денатурирующим воздействиям внешней среды, способствующий многократному применению биокатализаторов в фармацевтической, пищевой промышленности, а также в аналитических целях

Ионообменные волокна и смолы применяются в качестве носителей для иммобилизации ферментов различных классов, так как они удовлетворяют требованиям, предъявляемым к носителям, и широко используются в пищевой промышленности для концентрирования, очистки пищевых продуктов и соответствуют санитарно-химическим нормам. В этой связи мы исследовали возможность адсорбционной иммобилизации инулиназы из Kluyveromyces marxianus на следующих носителях: промежуточно-основном анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике полистирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1.

Было показано, что инулиназа, иммобилизованная на ВИОН КН-1, сохраняла 27,5 % активности свободного фермента. При связывании со смолой АВ-16-ГС наблюдалось 17,8 % первоначальной активности, а при адсорбционной иммобилизации на ионообменнике АМ-21-А инулиназа сохраняла 14,5 % каталитической активности по сравнению с растворимым препаратом.

Нами была исследована зависимость каталитической активности свободной инулиназы и иммобилизованной на ионообменной смоле АВ-16-ГС от температуры гидролиза.

Иммобилизация придает большую жесткость полипептидной цепи белка и поэтому повышает ее стабильность. Она предотвращает такие процессы, как агрегация молекул фермента, автолиз и диссоциация олигомерных белков на субъединицы. В результате связывания молекул фермента с носителем возрастает их термостабильность. Показано, что температурный оптимум свободной инулиназы лежит в диапазонах 45-55 °С с максимальной активностью при 50 °С. Для инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на анионообменнике АВ-16-ГС, температурный оптимум смещается вправо и лежит в пределах 6575 °С с максимальной активностью при 70 °С, что на 20 °С выше, чем для на-тивного фермента. Кроме того, при иммобилизации каталитическая активность сохраняется при 95 "С, в то время как растворимый фермент инактиви-руется при 80 "С. Полученные данные позволяют нам сделать заключение, что иммобилизованный фермент более термостабилен.

Выявление оптимальных условий функционирования

препаратов инулиназы, иммобилизованной на анионообменнике полистироль-ной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1, осуществляли аналогично экспериментам с анионообменной смолой АВ-16-ГС. Показано, что температурные оптимумы для ферментных препаратов, иммобилизованных на АМ-21-А и ВИОН КН-1, не отличаются от такового для инулиназы, иммобилизованной на АВ-16-ГС и составляют 70 °С.

При иммобилизации молекула попадает в микроокружение, отличающееся от водного раствора фермента, что обусловлено наличием функциональных группировок матрицы носителя. Сдвиг оптимума рН при иммобилизации можно объяснить различием между локальными значениями рН микроокружения активного центра и рН, измеряемым в объеме раствора. На локальное значение рН микроокружения оказывают влияние следующие факторы: заряд матрицы носителя, изменение заряда субстрата при превращении его в продукты, диффузия субстрата и продукта, изменение суммарного заряда белка при иммобилизации.

Мы изучили зависимость каталитической активности свободной инулиназы и иммобилизованной адсорбционным способом на анионообменной смоле АВ-16-ГС от значения рН гидролиза. Для инулиназы, адсорбционно иммобилизованной на анионообменнике АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1, рН оптимумы составляют 4,5 единиц, то есть соответствуют таковому для фермента, адсорбированного на АВ-16-ГС.

Анализ полученных данных позволяет нам предположить, что механизмы стабилизации иммобилизованных ферментов против термоинактивации, инактивации под действием экстремальных значений рН и денатурирующих агентов в главных чертах совпадают и обусловлены, прежде всего, повышением жесткости третичной структуры за счет образования связей с носителем

Глава 6. Изучение кинетико-термодинамических аспектов катализа свободной и иммобилизованной инулиназой Kluyveromyces marxianus

Исследование кинетико-термодинамических аспектов ферментативных реакций гидролиза в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов позволяет выяснить особенности поведения гидролитических ферментов при нормальном функционировании клетки, а изучение особенностей ферментативного катализа иммобилизованными ферментами необходимо для выявления механизмов действия мембраносвязанных ферментов, олигомерных белков и полиферментных систем, сконструированных по модульному принципу.

В этой связи была исследована зависимость скорости ферментативной ^ реакции гидролиза инулина от концентрации субстрата инулиназой Kluyveromyces marxianus, иммобилизованной адсорбционно на носителе АВ-16-ГС. Показано, что зависимость A(S) для иммобилизованного фермента имеет более сложную форму, характеризующуюся наличием трех изломов, в то

время как кривая A(S) для свободной инулиназы имеет два излома.

Данное явление можно объяснить тем, что при адсорбции белка на носителе происходит увеличение жесткости третичной структуры, ответственной за превращение молекул субстрата, а также имеют место затруднения, связанные с переходом иммобилизованного фермента из неравновесного состояния в равновесное по сравнению со свободной инулиназой и удлинению лимитирующей стадии ферментативного катализа. Для реакции, катализируемой инулиназой, адсорбционно иммобилизованной на АМ-21-А, кривая A(S) также имеет форму, отличную от классической зависимости Михаэлиса-Ментен. Кроме того, наблюдается ингибирование фермента избытком субстрата, что объясняется диффузионными затруднениями, вызванными образованием связи фермент-матрица анионита. Ряд изломов на данном графике может свидетельствовать о том, что при сорбции белка наблюдается небольшое изменение конформации отдельных субъединиц, сказывающееся на кооперативное™ взаимодействия в процессе расщепления субстрата.

Наибольшее сходство с кинетикой Михаэлиса-Ментен наблюдалось при рассмотрении зависимости скорости гидролиза инулина от концентрации субстрата при иммобилизации инулиназы на ионообменном волокне ВИОН КН-1.

Наличие изломов на кинетических кривых подтверждает факт сохранения четвертичной структуры инулиназы при адсорбционном взаимодействии с носителями. Усложнение кинетики ферментативного катализа может свидетельствовать о том, что при сорбции белка наблюдается небольшое изменение конформации отдельных субъединиц, сказывающееся на кооперативное™ взаимодействия в процессе расщепления субстрата

С помощью преобразования кривых зависимости V от S в координатах Лайнуивера-Берка были определены величины Кт и Vmax реакции гидролиза инулина тремя изучаемыми ферментными препаратами (табл. 3).

Таблица 3

Значения Кт и Ущ^ для реакции гидролиза инулина инулиназой, иммобилизованной на различных носителях

Фермент Кт, моль/л V v maxj мкмольмг/мин

Свободная инулин аза 2,24-10"4 1,02±0,9

Инулиназа, иммобилизованная на АВ-16-ГС 5,4-10^ 0,19±0,9

Инулиназа, иммобилизованная на АМ-21-А 6,МО"4 0,15±0,9

Инулиназа, иммобилизованная наВИОНКН-1 3,3-10"4 0,35±0,9

Итак, сравнительный анализ кривых А(Б) и значений основных кинетических параметров реакций гидролиза инулина полученными иммобилизованными препаратами инулиназы Юиууеготусев татапш позволяют нам заключить, что наибольшее сродство к субстрату проявляет инулиназа, ад-сорбционно связанная с ионообменным волокном ВИОН КН-1. Показано, что величины Кт и Ущи в этом случае оптимальны и составляют 3,3" 10"4 моль/л и 0,35 мкмоль'мг/мин соответственно. Очевидно, ионообменное волокно ВИОН КН-1, во-первых, достаточно прочно связывается с инулиназой, обеспечивая более высокую термо- и рН-стабильность белка, во-вторых, нарушения натив-ной конформации субъединиц инулиназы по сравнению с двумя предыдущими носителями выражены в меньшей степени, поскольку иммобилизованный фермент проявляет достаточно высокую каталитическую способность после взаимодействия с матрицей волокна. Вышеизложенное позволяет рекомендовать ионообменное волокно ВИОН КН-1 для многократного использования в лабораторных и промышленных условиях.

С целью изучения воздействия различных температур на конформацию макромолекулы инулиназы Юцууеготусез татапив были проведены эксперименты по исследованию термостабильности данного препарата. Для этого раствор фермента в концентрации 5-10"5 моль/л инкубировали в интервале времени 10-60 мин при различных температурах с последующим определением каталитической активности. Установлено, что нагревание раствора при 70 "С в течение 60 мин приводит к полной инактивации ферментного препарата. При 80 "С инулиназа утрачивает способность к гидролизу в течение 50 мин. Наблюдаемое увеличение скорости инактивации фермента при повышении температуры от 60 °С до 70 °С для инулиназы ИиууеготусеБ тагх-}апш можно объяснить тем, что избыточная тепловая энергия вызывает разрушение гидрофобных взаимодействий, вносящих важный вклад в стабильность белков, в результате чего происходит более глубокое развертывание полипептидной цепи.

Таким образом, процесс инактивации инулиназы носит сложный характер, и его механизмы для ферментов из различных источников не идентичны.

Кинетические параметры процесса термоинактивации инулиназы представлены в табл. 4

Анализ полученных результатов свидетельствует о низкой термоустойчивости инулиназы ЮиууегбтусеБ тапиапиэ, константа скорости инактивации которой при любой температуре ниже, чем для ферментов из других источников (А. РевБоа, М. Уйо1о, 1999; В.А. Абелян, Л.С. Манукян, 1996).

Термодинамические параметры процесса термической инактивации инулиназы Юиууеготусеэ татапш представлены в табл. 5.

Таблица 4

Константы скорости термической инактивации инулиназы

Температура, °С Константа скорости инактивации,

50 0,32

60 1,67

70 3,45

Показано, что действие высоких температур на препарат инулиназы сопровождается увеличением Еа1СТ, АН, Д8 реакции гидролиза инулина до фруктозы. Графики Аррениуса для определения энергии активации характеризуются наличием излома, указывающего на протекание последовательной реакции катализа.

Следствием увеличения Евкт при повышении температуры является снижение скорости процесса катализа. Очевидно, белковая глобула при температурах значительно ниже температуры денатурационного перехода претерпевает существенные конформационные перестройки типа малых локальных изменений, принимая рыхлую метастабильную структуру, определяющую стерические затруднения при образовании фермент-субстратного комплекса. Отсюда следует увеличение энергетического барьера для осуществления реакции катализа (Еает) и ДН. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что конформационные изменения белковых молекул, отражающиеся на их каталитической способности, происходят для инулиназы при 54 и 65 °С соответственно.

Таблица 5

Значения термодинамических параметров реакции гидролиза инулина, катализируемой инулиназой Юиууеготусез татапив

Температура, "С Ещсг, кДж/моль Дв, кДж/моль дн, кДж/моль АЭ, кДж/моль'К

50 7,2 65,3 4,6 -89,1

55 7,4 66,1 4,5 -91,0

60 7,3 65,8 4,4 -90,7

65 12,5 67,5 11,7 -99,8

70 12,7 67,8 11,9 -98,8

75 14,1 68,0 11,9 -96,5

Отрицательные значения ДБ для реакции гидролиза инулина свидетельствуют о том, что реакция гидролиза инулина протекает с большой скоростью

и характеризуется высокой упорядоченностью. Возрастание Д8 при увеличении температуры связано с переходом молекул инулиназы из упорядоченной глобулы в хаотический клубок. Небольшие значения изменения АБ указывают на преимущественное разрушение слабых связей (водородных и электростатических), приводящее к наименьшей потере каталитической активности.

Обнаружено, что кривая процесса термической денатурации изучаемого ферментного препарата инулиназы, зарегистированная методом ДТА, характеризуется наличием двух эндотермических пиков, имеющих различные площади (рис. 2). Исходя из формы и площади, первый пик обусловлен малыми локальными перестройками макромолекулы белка, второй - ее «плавлением». Наблюдаемая температура, соответствующая минимуму первого пика кривой, составляет 54 °С; второго - 65 °С. Как следует из результатов наших экспериментов, температура минимума первого пика совпадает с температурой точки перегиба на графике Аррениуса для обоих ферментных препаратов; температурная характеристика минимума пика «плавления» приблизительно соответствует температуре полной инактивации инулиназы.

Рис. 2. Кривая дифференциального термического анализа процесса охлаждения свободной инулиназы Юиууеготусев тапйапш

При денатурации, кроме падения каталитической активности, изменяется упорядоченность окружения боковых групп белка. При этом степень упорядоченности главной цепи белка (ее вторичная структура), размеры глобулы и даже плотность гидрофобного ядра могут как практически сохраняться, так и изменяться в значительной степени. Таким путем процесс разворачивания молекулы фермента можно представить себе как «промежуточное состояние» в виде расплавленной глобулы, в которой не сохраняется уникальная упаковка боковых групп. В расплавленной глобуле они приобретают свободу движений, теряют энергию плотного контакта. При

этом наблюдаются локальные флуктуации, распад большинства дальних по цепи контактов.

Несмотря на наличие в области температур денатурации ярко выраженных пиков, характерных для плавления классических периодических кристаллов, переход упорядоченная глобула - хаотический клубок для молекулы происходит не одноточечно, а в конечном интервале и без разрыва термодинамических функций (ЛН, ДБ и др.). Очевидно, что процесс разворачивания белковой глобулы складывается из нескольких отдельных этапов конформационных переходов.

На основании полученных результатов можно предложить следующую схему механизма перехода типа порядок - беспорядок в молекуле инулиназы из Ыиууеготусеэ тагаапив, вызванного действием различных температур (рис. 3). Белковая глобула при достижении температурного оптимума, при котором фермент способен проявлять максимальную каталитическую активность, принимает конформацию, выгодную по энергетическому и стерическому факторам для протекания реакции гидролиза инулина. Это означает, что внутримолекулярные взаимодействия в ферменте резко ослабевают, а подвижность боковой цепи резко увеличивается (состояние А). Повышение температуры сопровождается малыми локальными перестройками структуры молекулы, термодинамические параметры при этом изменяются незначительно по сравнению с таковыми для состояния А. Данный процесс является обратимым, молекула фермента при охлаждении может вернуться к изначальному состоянию без энергетических затрат. Увеличение температуры на 10 °С приводит к резкому увеличению ЕаК1, ДН и ДБ, что можно объяснить разрывом большого количества водородных связей и гидрофобных взаимодействий в белковой глобуле. Возникающую конформацию можно обозначить как «промежуточное состояние В», соответствующее первому эндотермическому пику на кривой ДТА. Процесс перехода А—>-В является обратимым и складывается из большого количества промежуточных состояний (Аь А2, А3, ... Ап).

«Промежуточное состояние С» соответствует максимуму между эндотермическими пиками на кривой ДТА и характеризуется достаточно высокой степенью упорядоченности и структурной жесткости. Переход С—»-А также возможен и представляет собой последний этап обратимой термической денатурации молекулы инулиназы.

Промежуточное состояние С можно представить как расплавленную глобулу, компактность которой обеспечивается остаточными гидрофобными взаимодействиями, необходимыми для свободы движения боковых групп, заполнены растворителем, так как перенос молекул воды внутрь белка термодинамически выгоден, что и способствует увеличению их размера.

А нативная глобула (1 = 50 °С)

хаотический клубок О °С = 75-80 °С)

Рис.3. Схема перехода типа порядок-беспорядок при термической денатурации инулиназы из Юиууеготусез тапиапш

При значительном увеличении температуры (65 °С) набухание расплавленной глобулы приводит к переходу глобулы в клубок. Причем ДБ растет на первом этапе денатурации незначительно, затем быстро. Неравномерный прирост энтропии на переходе С-О может быть связан с тем, что существует характерная («барьерная») плотность глобулы, когда А8 резко возрастает с расширением глобулы. В результате расплавленная глобула проходит через максимум, отделяющий ее от рыхлого денатурированног состояния.

Промежуточное состояние С для изучаемого фермента имеет место при 55 °С Расплавленная глобула инулиназы не является точно очерченным состоянием, а представляет собой ряд промежуточных интермедиатов. Таким образом, нативное состояние инулиназы отделено от других промежуточных состояний и отличается от денатурированного подвижностью полипептидных цепей белковой молекулы. Так создается энергетичексая щель между самой энергетически целесообразной структурой и ее конкурентами. Причем она возникает не в любой случайной аминокислотной последовательности, а создается отбором пригодных чередований аминокислот, допускающих единственно возможную плотную упаковку цепи в глобулу, способную надежно выполнять физиологические функции.

Дальнейшее повышение температуры сопровождается деструктивными изменениями молекулы инулиназы, затрагивающими вторичную структуру. Белковая молекула переходит в состояние О, каталитическая активность при этом утрачивается; данная конформация соответствует второму эндотермическому пику на кривой ДТА и наблюдается при 65 °С. Переход порядок - беспорядок завершается при температуре 79 "С. Клубок характеризуется наличием перегруппировавшихся водородных связей, обеспечивающих высокую подвижность фрагментов полипептидной цепи. Конфор-мацию развернутой белковой макромолекулы обозначим как «промежуточное состояние Е».

Обнаружено, что остаточная активность иммобилизованного фермента при 70 °С после 60 мин инкубации составила 40 % от нативной формы. Нагревание инулиназы при 80 °С в течение 60 мин приводит к неполной инактивации иммобилизованного фермента: он сохраняет 15 % каталитической активности.

Наблюдаемое увеличение термостабильности иммобилизованного фермента объясняется тем, что при воздействии тепловой энергии на иммобилизованную инулиназу при температурах от 60 до 70 °С разрушения гидрофобных взаимодействий и других слабых связей не имеют места.

Анализ полученных результатов свидетельствует о более высокой термоустойчивости иммобилизованного фермента по сравнению со свободным: константы скорости инактивации для иммобилизованного препарата инулиназы при любой температуре будут ниже, чем для свободного фермента (табл. 6 )

Таблица 6

Константы скорости термической инактивации иммобилизованной на ВИОН КН инулиназы

Температура, °С Константа скорости инактивации, ч"1

50 1,01

60 1,06

70 0,45

80 2,51

Термодинамические параметры процесса термической инактивации для иммобилизованной инулиназы представлены в табл. 7. Показано, что действие высокой темепературы (80 °С) на фермент приводит к повышению Еакт, АН, АО, при этом ДБ незначительно уменьшается. Очевидно, связывание инулиназы с ионообменным волокном приводит к тому, что при температуре денатурационного перехода для свободного фермента никаких конформаци-онных перестроек, определяющих увеличение Еакт при образовании фермент-субстратного комплекса при иммобилизации не имеет места. Об этом же свидетельствует изменение значения АН. Конформационные изменения для иммобилизованного фермента, отражающиеся на способности гидролизовать инулин до фруктозы, происходят при 80 °С. Некоторое уменьшение значения ДБ для реакции гидролиза инулина иммобилизованной инулиназой свидетельствует о том, что при адсорбции на носителе увеличивается степень упорядоченности взаимодействия расщепляемых связей субстрата с активным центром фермента. Небольшие изменения Ав также указывают на преимущественные разрушения слабых связей, что приводит к потере каталитической активности.

Таблица 7

Значения термодинамических параметров реакции гидролиза инулина, катализируемой свободной и иммобилизованной на ВИОН КН инулиназой Юиууеготусев тагаапш

Фермент Еакт» кДж/моль да кДж/моль АН, кДж/моль ДБ, кДж/моль'К

Свободная инулиназа 12,5 67,5 11,7 -99,8

Иммобилизованная инулиназа 14,5 77,4 30,7 -101,1

Наибольшее значение при переходе иммобилизованного фермента из состояния глобулы в клубок имеет экспонирование гидрофобных групп, сопровождающееся переходом макромолекулы белка в неупорядоченное состояние. Для иммобилизованного фермента этот процесс обнаруживает сложную зависимость от температуры. В диапазоне 60-70 °С усиливается тенденция гидрофобных аминокислотных остатков к сближению внутри глобулы. При дальнейшем повышении температуры до 80 °С данная тенденция ослабевает. Таким образом, иммобилизация приводит к значительному повышению термоустойчивости белковой макромолекулы.

Анализируя данные по термоустойчивости свободной и иммобилизованной инулиназы, полученные посредством ДТА и классическими методами, можно сделать заключение, что кривая ДТА для иммобилизованной инулиназы отличается «сглаженностью» эндотермических пиков. Если для свободной инулиназы наблюдалось два пика, то в случае иммобилизованного фермента наличие одного пика соответствует температуре полной инактивации (рис. 4). Следовательно, инактивация иммобилизованной инулиназы осуществляется таким образом, что промежуточные стадии между полностью развернутой и упорядоченной формами молекулы отсутствуют. При термоинактивации адсорбционно связанной с носителем белковой молекулы последняя, по-видимому, не переходит из состояния А в состояния В и С, и степень упорядоченности главной цепи полностью сохраняется. Расплавленной глобулы, в которой наблюдаются локальные перестройки при отдельных температурах, при иммобилизации не существует.

Рис. 4. Кривая дифференциального термического анализа процесса охлаждения иммобилизованной на ВИОН КН-1 инулиназы Юиууеготусев татаапш

Итак, мы изучили термостабильность инулиназы, выделенной из Юиууеготусев татапиэ, в свободной и адсорбционно связанной формах.

Показано, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы не является кооперативным процессом и наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний. Термоденатурация иммобилизованного фермента - кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значения термодинамических параметров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При исследовании структурно-функциональных свойств инулиназы нами была разработана методика получения ферментного препарата из дрожжей Kluyveromyces marxianus и микромицета Aspergillus awamori с высокой степенью очистки. Показано, что оптимальное значение температуры гидролиза инулина ферментами дрожжевого и плесневого происхождения одинаковы (50 °С), но инулиназа Aspergillus awamori обладает более широким диапазоном температур, определяющих скорость расщепления субстрата. При сравнении первичных структур инулиназ Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori обнаружено, что молекула дрожжевого фермента содержит 15 остатков триптофана, то есть на 2 остатка меньше, чем инулиназа плесени. Данный факт позволяет нам сделать предположение о том, что именно триптофану принадлежит ключевая роль в проявлении инулиназами термостабильности. Показано, что в обоих случаях кинетика реакции гидролиза инулина не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, кривые A(S) характеризуются наличием изломов, которые могут свидетельствовать о наличии четвертичной структуры у изучаемых ферментов.

Изучение физико-химических свойств инулиназ позволило выявить более выраженную кислотную устойчивость инулиназы Aspergillus awamori по сравнению с препаратом, выделенным из дрожжей, что может быть обусловлено более высоким содержанием остатков глутаминовой и аспарагино-вой кислот в молекуле фермента, выделенного из плесени.

В диссертационной работе продемонстрирована возможность адсорбционной иммобилизации инулиназы на агранулярных и волокнистых носителях: анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике по-листирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Определены оптимальные условия иммобилизации: pH 4,7; концентрация фермента в растворе 10"5 моль/л; время адсорбции - 1,5 часа. Установлено, что применение волокнистого сорбента приводит к образованию комплекса с наибольшей каталитической активностью (27 % активности свободного фермента).

При адсорбционной иммобилизации инулиназы связывание с носителем происходит за счет водородных, электростатических взаимодействий

между карбоксильными группами фермента и аминогруппами ионообменников. Иммобилизованные ферментные препараты характеризуются более высокой оптимальной температурой гидролиза инулина (по сравнению со свободным ферментом).

Кинетика реакций гидролиза гетерогенными катализаторами носит более сложный характер, чем для нативного ферментного препарата инулиназы, наблюдается увеличение значений Кт и уменьшение - Угаах. Сравнительный анализ значений основных кинетических параметров реакций гидролиза инулина полученными иммобилизованными препаратами инулиназы К1иууегошусез тапиапив позволяет заключить, что наибольшее сродство к субстрату проявляет инулиназа, адсорбционно связанная с ионообменным волокном ВИОН КН-1. Очевидно, ионообменное волокно ВИОН КН-1, во-первых, достаточно прочно связывается с инулиназой. обеспечивая более высокую термо- и рН-стабильность белка, во-вторых, нарушения нативной конформации субъединиц инулиназы по сравнению с двумя предыдущими носителями выражены в меньшей степени, поскольку иммобилизованный фермент проявляет достаточно высокую каталитическую способность после взаимодействия с матрицей волокна. Вышеизложенное позволяет рекомендовать ионообменное волокно ВИОН КН-1 для многократного использования в лабораторных и промышленных условиях.

При анализе экспериментальных данных по исследованию термостабильности инулиназы Ииууеготусев татапш можно сделать предположение о частичном разрушении под воздействием температуры слабых электростатических и, возможно, водородных связей, поддерживающих конформацию белковой молекулы, что сопровождается потерей гидролитической активности фермента.

Показано, что действие высоких температур на препарат инулиназы сопровождается увеличением Е^, ДН, ДБ реакции гидролиза инулина до фруктозы. Графики Аррениуса для определения энергии активации характеризуются наличием излома, указывающего на протекание последовательной реакции катализа.

Отрицательные значения Д8 для реакции гидролиза инулина свидетельствуют, что реакция гидролиза инулина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью. Возрастание ДБ при увеличении температуры связано с переходом молекул инулиназы из упорядоченной глобулы в хаотический клубок. Небольтпие значения изменения ДБ указывают на преимущественное разрушение слабых связей (водородных и электростатических), приводящее к наименьшей потере каталитической активности.

Обнаружено, что кривая процесса термической денатурации изучаемого ферментного препарата инулиназы характеризуется наличием двух эндотермических пиков, имеющих различные площади. Выявлено, что наблюдаемая температура, соответствующая минимуму первого пика кривой, составляет 54 °С; второго - 65 °С.

Исследование термостабильности инулиназы, кинетико-термодинами-ческих параметров термоинактивации, а также дифференциальный термический анализ конформационных переходов в белковой глобуле позволяют представить разворачивание молекулы фермента под действием высоких температур как промежуточное состояние в виде «расплавленной глобулы», в которой не сохраняется уникальная упаковка боковых групп. В расплавленной глобуле они приобретают свободу движений, теряют энергию плотного контакта. При этом наблюдаются локальные флуктуации, распад большинства дальних по цепи контактов.

Сравнение данных по исследованию термостабильности препарата инулиназы, кинетико-термодинамических параметров термоинактивации и дифференциального термического анализа позволяет заключить, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы не является кооперативным процессом и наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

Анализируя данные по термоустойчивости свободной и иммобилизованной инулиназы, полученные посредством ДТА и классическими методами, можно сделать заключение, что кривая ДТА для иммобилизованной инулиназы отличается «сглаженностью» эндотермических пиков. Если для свободной инулиназы наблюдалось два пика, то в случае иммобилизованного фермента наличие одного пика соответствует температуре полной инактивации. Следовательно, при инактивации иммобилизованной инулиназы промежуточные стадии между полностью развернутой и упорядоченной формами молекулы отсутствуют. При термоинактивации адсорбционно связанной с носителем белковой молекулы степень упорядоченности главной цепи полностью сохраняется. Расплавленной глобулы, в которой наблюдаются локальные перестройки при отдельных температурах, при иммобилизации не наблюдается.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный метод выделения и очистки препарата инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxiamis, включающий стадии выращивания культуры глубинным способом, осаждения изопропиловым спиртом и гель-хроматографии на сефадексе G-150, который позволил получить гомогенный препарат фермента с 17,9-кратной степенью очистки. Получен препарат инулиназы из микромицета Aspergillus awamori путем осаждения культуральной жидкости ацетоном, фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации на сефадексе G-25 и ионообменной хромато-" графии на ДЭАЭ-целлюлозе.

2. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза инулина для инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori являются: тем-

пература катализа 50 °С; pH катализа 4,7; концентрация субстрата 5,4-Ю'4 моль/л.

3. Предложен адсорбционный способ иммобилизации инулиназ различного происхождения на следующих носителях: промежуточно-основном анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике полисти-рольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Иммобилизованные препараты инулиназ сохраняютт 17%; 14%; 27% активности соответственно по сравнению с растворимыми формами ферментов.

4. Оптимальная температура гидролиза инулина при адсорбционной иммобилизации во всех случаях повышается на 20 "С; оптимум pH сдвигается вправо на 0,5 единиц; наблюдается увеличение значении Кш и уменьшение Vmax по сравнению с нативной формой фермента.

5. Иммобилизация инулиназы Kluyveromyces marxianus приводит к увеличению значений энергии активации и энтальпии активации гидролиза. Отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей субстрата характеризуется высокой упорядоченностью.

6. Показано, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

7. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы Kluyveromyces marxianus - кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значения термодинамических параметров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Модифицированный глутаральдегидный способ иммобилизации инулазы из aspergillus awamori на ионообменных смолах / A.C. Taxa [и др.] // Аналитика и Аналитики : международ, форум. - Воронеж, 2003. - С. 428.

2. Бирюк Н.Д. Автоколебательные процессы в ферментативных реакциях с субстратным ингибированием и автогенераторах / Н.Д. Бирюк, Т.А. Ковалева, A.C. Taxa // Ш съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г. : тез. докл. - Воронеж, 2004. - Т. 1. - С. 324.

3. Исследование адсорбционной иммобизизации инулиназы на волокнистых полиэлектролитах / A.C. Taxa, [и др.] // Ш съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г. : тез. докл. - Воронеж, 2004. - Т. 1. - С. 51.

4. Исследование условий выделения и очистки некоторых гидролитических ферментов / A.C. Taxa [и др.] // Хроматография и хроматографиче-ские приборы: материалы Всерос. симп. — М., 2004. - С. 244.

5. Immobilization of hydrolytic enzymes on ion-exchange resins: kinetic and thermodynamic aspects of substrate hydrolysis / A.S. Taha [et al.] // Биотехнология - охране окружающей среды : материалы II Международ, науч. конф. и выставки. - М., 2004. - С. 79-85.

6. Investigation of kinetic and thermodynamic aspects of polymeric substrate hydrolysis by soluble and immobilized hydrolases / A.S. Taha, [et al.] // Iraqi. J. of Agri.Sci. - 2004. - Vol. 35, № 6. - P. 183-188.

7. Influence of UV irradiation on physicochemical proprties of immobilized inulinase Aspergillus awamori / A.S. Taha [et al.] // ASBMB Annual Meeting and 8th IUBMB Conference, Late-Breaking : abstracts. - Boston, Massachusetts, 2004. - C. 17.

Заказ Km от Л/, ал 2005г Тираж У^экз Лаборатория оперативной полиграфии

РНБ Русский фонд

45431

2 2 ДПР 2005

205

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Таха Абдул Саттар

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о гидролитических ферментах

1.1. Основные характеристики карбогидраз

1.2. Физико - химические свойства инулиназы

ГЛАВА 2. Иммобилизация гидролитических ферментов

2.1. Методы иммобилизации гидролаз

2.2. Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине и аналитической практике

2.3. Иммобилизация инулиназы на различных носителях 37 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объект исследования

3.2. Методы исследования

3.2.1. Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus

3.2.2. Определение содержания белка в препарате методом Лоури

3.2.3. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури

3.2.4. Метод определения активности инулиназы

3.2.5. Метод определения активности иммобилизованной инулиназы

3.2.6. Очистка и определение молекулярной массы инулиназы методом гель-хроматографии

3.2.7. Подготовка ионообменных материалов к иммобилизации

3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации инулиназы

ГЛАВА 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori 52 4.1. Исследование условий экстракции и очистки препарата инулиназы Aspergillus awamori

4.2. Изучение условий выделения и очистки инулиназы из Kluyveromy-ces marxianus

4.3. Некоторые физико-химические свойства инулиназ из Kluyveromy-ces marxianus и Aspergillus awamori

ГЛАВА 5. Адсорбционная иммобилизация инулиназы из Kluyveromy-ces marxianus на различных носителях

5.1. Исследование условий иммобилизации инулиназы Kluyveromyces marxianus на некоторых ионообменных смолах

ГЛАВА 6. Изучение кинетико-термодинамических аспектов катализа свободной и иммобилизованной инулиназой Kluyveromyces marxianus

6.1. Исследование кинетики реакции гидролиза инулина адсорбционно связанной инулиназой Kluyveromyces marxianus

6.2. Кинетико-термодинамические аспекты процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus

6.3. Исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus методом дифференциально-термического анализа

6.4. Основные закономерности процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus, иммобилизованной на ВИОН-КН

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой"

Современные тенденции развития теории биологического катализа связаны с изучением ферментативных реакций, которые при всей их сложности протекают в полном соответствии с законами химической кинетики и термодинамики. Однако уникальные свойства ферментов, способность осуществлять регуляцию всех процессов жизнедеятельности на внутримолекулярном уровне определяются исключительно сложной структурой полипептидной цепи и активного центра белковой макромолекулы.

Исследование структурно-функциональных свойств карбогидраз и кинетико-термодинамических аспектов ферментативного гидролиза полимерных субстратов являются необходимым условием изучения полиферментных систем, локализованных в различных клеточных органеллах и нужны для создания теоретической базы ферментации возобновляемого растительного сырья и получения продуктов с заданными свойствами.

Фермент инулиназа (2,1-р-0-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.3.1.7), специфически гидролизует Р-1,2-связи инулина до фруктозы и фруктоолигосахаридов в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуы и применения специального кислотоустойчивого оборудования. В этой связи особую значимость приобретают работы по изучению структурно-функциональных свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулинсодержащего сырья, а также ряд теоретических и практических вопросов, связанных с изучением влияния природы носителя на сохранение и поддержание каталитической активности инулиназы.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи: разработка методов выделения и очистки инулиназы из Aspergillus awamori и Kluyveromyces marxianus; изучение физико-химических свойств инулиназы из Aspergillus awamori и Kluyveromyces marxianus; определение кинетико-термодинамических параметров реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными на различных носителях препаратами инулиназ Kluyveromyces marxianus; исследование закономерностей процессов термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы Kluyveromyces marxianus.

Научная новизна. впервые осуществлена иммобилизация инулиназы Kluyveromyces marxianus на гранулярных и волокнистых ионообменниках АВ-16 ГС, АМ-21-А, ВИОНКН-1; установлены оптимальные условия функционирования иммобилизованной инулиназы; обнаружено, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы имеет место многоточечное связывание с носителем, приводящее к увеличению значений Кт и АН, уменьшению значений Vmax и AS;

• с помощью дифференциального термического анализа и классических методов исследован процесс термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы в интервале температур 50-85 "С. Рассчитаны активационные параметры термоинактивации инулиназы (kin, Еакт, АН, AS). Выявлено, что адсорбционный способ иммобилизации инулиназы повышает устойчивость фермента к денатурирующим факторам среды (рН, температура); предложена модель перехода глобула-клубок, включающая промежуточные стадии процесса термического разворачивания белковой молекулы инулиназы; ■ разработаны эффективные методы выделения и очистки инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxianus. Выявлены оптимальные режимы функционирования инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori. Практическая значимость. Результаты диссертационной работы расширяют представления о функционировании инулиназы в свободном и иммобилизованном состоянии, дают информацию о влиянии иммобилизации на процессы термической инактивации ферментов, вносят вклад в исследование механизмов реакций гидролиза инулина. Рассчитанные кинетико-термодинамические параметры реакции гидролиза инулина позволяют прогнозировать поведение свободного и иммобилизованного фермента в технологических условиях. Полученные данные могут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов университетов и высших учебных заведений технологического профиля курсов «Биотехнология», «Химическая энзимология», «Молекулярная биология», «Биофизика».

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов»

Воронеж, 2004); конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); IX Conference of Food Microbiology (Lubljana, Slovenia, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 3 статьи и 4 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

2. Созданы гетерогенные биокатализаторы на основе инулиназы из Kluyveromyces marxianus, адсорбционно иммобилизованной на АВ-16 ГС, АМ-21-А, ВИОН КН-1, выявлены оптимальные условия их функционирования.

3. Плавление вторичной структуры свободной инулиназы Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку наблюдаются стадии упорядоченная глобула — хаотический клубок и ред промежуточных микросостояний.

4. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы — кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значений термодинамических параметров.

Структура и объем работы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Таха Абдул Саттар

выводы

1. Разработан эффективный метод выделения и очистки препарата инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxianus, включающий стадии выращивания культуры глубинным способом, осаждения изопропиловым спиртом и гель-хроматографии на сефадексе G-150, который позволил получить гомогенный препарат фермента с 17,9-кратной степенью очистки. Получен препарат инулиназы из микромицета Aspergillus awamori путем осаждения куль-туральной жидкости ацетоном, фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации на сефадексе G-25 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

2. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза инулина для инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori являются: температура катализа 50 °С; рН катализа 4,7; концентрация субстрата 5,4*10"4 моль/л.

3. Предложен адсорбционный способ иммобилизации инулиназ различного происхождения на следующих носителях: промежуточно-основном анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике полистирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Иммобилизованные препараты инулиназ сохраняютт 17,8 %; 14,5 %; 27,5 % активности соответственно, по сравнению с растворимыми формами ферментов.

4. Оптимальная температура гидролиза инулина при адсорбционной иммобилизации во всех случаях повышается на 20 °С; оптимум рН сдвигается вправо на 0,5 единиц; наблюдается увеличение значении Кт и уменьшение Vmax по сравнению с нативной формой фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение физико-химические свойств инулиназ позволило выявить более выраженную кислотную устойчивость инулиназы Aspergillus awamori по сравнению с препаратом, выделенным из дрожжей, что может быть обусловлено более высоким содержанием остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот в молекуле фермента, выделенного из плесени.

В диссертационной работе продемонстрирована возможность адсорбционной иммобилизации инулиназы на агранулярных и волокнистых носителях: анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике поли-стирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Определены оптимальные условия иммобилизации: рН 4,7; концентрация фермента в растворе 10"5 моль/л; время адсорбции - 1,5 часа. Установлено, что применение волокнистого сорбента приводит к образованию комплекса с наибольшей каталитической активностью (27,5 % активности свободного фермента).

При адсорбционной иммобилизации инулиназы связывание с носителем происходит за счет водородных, электростатических взаимодействий между карбоксильными группами фермента и аминогруппами ионообменни-ков. Иммобилизованные ферментные препараты характеризуются более высокой оптимальной температурой гидролиза инулина (по сравнению со свободным ферментом).

Кинетика реакций гидролиза гетерогенными катализаторами носит более сложный характер, чем для нативного ферментного препарата инулиназы, наблюдается увеличение значений Кт и уменьшение - Утах- Сравнительный анализ значений основных кинетических параметров реакций гидролиза инулина полученными иммобилизованными препаратами инулиназы Kluyveromyces marxianus позволяют заключить, что наибольшее сродство к субстрату проявляет инулиназа, адсорбционно связанная с ионообменным волокном ВИОН КН-1. Очевидно, ионообменное волокно ВИОН КН-1, во-первых, достаточно прочно связывается с инулиназой, обеспечивая более высокую термо- и рН-стабильность белка, во-вторых, нарушения нативной конформации субъединиц инулиназы по сравнению с двумя предыдущими носителями выражены в меньшей степени, поскольку иммобилизованный фермент проявляет достаточно высокую каталитическую способность после взаимодействия с матрицей волокна. Вышеизложенное позволяет рекомендовать ионообменное волокно ВИОН КН-1 для многократного использования в лабораторных и промышленных условиях.

При анализе экспериментальных данных по исследованию термостабильности инулиназы Kluyveromyces marxianus можно сделать предположение о частичном разрушении под воздействием температуры слабых электростатических и, возможно, водородных связей, поддерживающих кон-формацию белковой молекулы, что сопровождается потерей гидролитической активности фермента.

Показано, что действие высоких температур на препарат инулиназы сопровождается увеличением ЕаКт, АН*, AS* реакции гидролиза инулина до фруктозы. Графики Аррениуса для определения энергии активации характеризуются наличием излома, указывающего на протекание последовательной реакции катализа.

Отрицательные значения AS* для реакции гидролиза инулина свидетельствуют, что реакция гидролиза инулина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью. Возрастание AS* при увеличении температуры связано с переходом молекул инулиназы из упорядоченной глобулы в хаотический клубок. Небольшие значения изменения AS указывают на преимущественное разрушение слабых связей (водородных и электростатических), приводящее к наименьшей потере каталитической активности.

Исследование термостабильности инулиназы, кинетико-термодинами-ческих параметров термоинактивации, а также дифференциальный термический анализ конформационных переходов в белковой глобуле позволяет представить разворачивание молекулы фермента под действием высоких температур как промежуточное состояние в виде «расплавленной глобулы», в которой не сохраняется уникальная упаковка боковых групп. В расплавленной глобуле они приобретают свободу движений, теряют энергию плотного контакта. При этом наблюдаются локальные флуктуации, распад большинства дальних по цепи контактов.

Следовательно, сравнение данных по исследованию термостабильности препарата инулиназы, кинетико-термодинамических параметров термоинактивации и дифференциального термического анализа позволяет заключить, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы не является кооперативным процессом и наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

Анализируя данные по термоустойчивости свободной и иммобилизованной инулиназы, полученные посредством ДТА и классическими методами, можно сделать заключение, что кривая ДТА для иммобилизованной инулиназы отличается «сглаженностью» эндотермических пиков. Если для свободной инулиназы наблюдалось два пика, то в случае иммобилизованного фермента наличие одного пика соответствует температуре полной инактивации. Следовательно, при инактивации иммобилизованной инулиназы промежуточные стадии между полностью развернутой и упорядоченной формами молекулы отсутствуют. При термоинактивации адсорбционно связанной с носителем белковой молекулы степень упорядоченности главной цепи полностью сохраняется. Расплавленной глобулы, в которой наблюдаются локальные перестройки при отдельных температурах, при иммобилизации не наблюдается.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Таха Абдул Саттар, Воронеж

1. Абелян В А. Характеристика экзо-инулиназ Kluyveromyces marxianus и Bacillus lichenioformis / ВА. Абелян, Л.С. Манукян / Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 61, №6. - С. 1028-1036.

2. Александровский Я.А. Ферментный датчик для определения глюкозы / Я.А. Александровский, П.К. Агасян, A.M. Егоров // Журн. аналит. химии. 1978. - Т. 33, №9. - С. 1833-1837.

3. Беленький Д.М. Особенности ферментативного гидролиза а-1,4-глюкозидных связей / Д.М. Беленький // Успехи биол. химии. 1971. - Т. 34, вып. 12. - С. 164-181.

4. Березин И.В. Новый тип носителя для разделения биологических смесей / И.В. Березин, А.А. Карякин // Инженерная энзимология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 60-61.

5. Биосинтез ферментов грибами рода Ризопус / А.Я. Панкратов, Л.В. Антипова, Г.П. Шуваев и др. // Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1993. -183 с.

6. Блиева P.K. Синтез гидролитических ферментов иммобилизованными микромицетами / Р.К. Блиева // Инженерная энзимология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 61-62.

7. Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма / А.Е. Браунштейн. М. : Наука, 1987. - 546 с.

8. Бреслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. М.: Наука, 1966.-512 с.

9. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1981. - 575 с.

10. Влияние активаторов на структурно-функциональные связи иммобилизованной нулазы / Т.А. Ковалева и др. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования : материалы второго междуно-род. симп. Пущино, 1997. - Т.2. - С.48-50.

11. Вольф М. Лечение ферментами / М. Вольф, К. Рансбергер. М. : Мир, 1976.-231 с.

12. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов / И.П. Галич. Киев : Нау-кова думка, 1987. - 192 с.

13. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб М. : Мир, 1982. - Т. 1.-389 с.

14. Блинов Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Блинов. СПб. : Наука, 1995.-600 с.

15. Ермолаев М.В. Биологическая химия / М.В. Ермолаев. М. : Медицина, 1978.-320 с.

16. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности / Н.А. Жеребцов. М. : Легкая и пищ. пром-сть, 1984. - 160 с.

17. Землянухин А.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений : учеб. пособие / А.А. Землянухин, Л.А. Землянухин. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. - 188 с.

18. Иммобилизованные клетки и ферменты / под ред. Дж. Вудворда. -М. : Мир, 1988.-206 с.

19. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др.. М. : Высш. шк., 1987. - 159 с. - (Биотехнология : в 8 кн. : учеб. пособие для ВУЗов ; кн. 7).

20. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. - Т. 1. - 296 с.

21. Ионообменные методы очистки веществ / под ред. Г.А. Чикина, О.Н. Мягкого. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1984. - 372 с.

22. Использование дрожжевых инулаз для гидролиза растительного сырья / В.Л. Куев и др. // Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу : тез. докл. Всесоюз. конф. - Черновцы, 1991. - Т. 1. - С. 141.

23. Исследование глюкоамилазы с использованием хроматографиче-ских методов / Чикин Г.А. и др. // Хроматография в биологии и медицине : тез. докл. 1 Всесоюз. конф. М., 1983. - С. 186.

24. Кантор Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, Р. Шиммел. М. : Мир, 1979.-280 с.

25. Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы / Г.И. Квеси-тадзе. Тбилиси : Мецниерба, 1984. - 154 с.

26. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М. : Мир, 1990. - 350 с.

27. Кестнер А.И. Иммобилизованные ферменты / А.И. Кестнер // Успехи химии. 1974. - № 8. - С. 1480-1511.

28. Кинетика и термодинамика реакции гидролиза синтеза ацетил-L-метионина, катализируемой ацилазой I свиной почки / В.К. Швядас и др. // Биохимия. - 1980. - Т. 50, вып. 10. - С. 1833-1835.

29. Ковалева Т.А. Иммобилизация инулазы на ионообменных смолах / Т.А. Ковалева, В.Ф. Селеменев, Е.В. Небольсина // Кислотно-основный и температурный гомеостаз: физиология биохимия и клиника : межвуз. сб. науч. тр. Сыктывкар, 1994 . - С. 103-108.

30. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинами-ческие аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами : автореф. дис. . д-ра биол. наук / Т.А. Ковалева. Воронеж, 1998. - 48 с.

31. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю. Кулис. Вильнюс : Мокслас, 1981. - 200 с.

32. Кулис Ю.Ю. Создание и внедрение в производство амперометри-ческих электродов / Ю.Ю. Кулис, В.А. Лауринавичюс // Инженерная энзи-мология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 142143.

33. Кушнер В.П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. -Л.: Наука, 1977. -274 с.

34. Кяйвяряйнен А. И. Динамическое поведение белков в водной среде и их функции. Л. : Наука, 1980. - 272 с.

35. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. М. : Мир, 1985.-Т. 1.-329 с.

36. Логинова Л.Г. Новые формы термофильных бактерий / Л.Г. Логинова, Л.А. Егорова. М. : Наука, 1977. - 175 с.

37. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты / К. Мартинек. М. : 1984.- 100 с.

38. Морозов В. М. Структурно-функциональный анализ аминокислотных последовательностей через Internet // Молекулярная биология. 1996. -Т. 30, вып. 2. - С. 387-393.

39. Мустафаев P.M. Биосинтез и некоторые физико-химические свойства инулазы Aspergillus awamori BKMF 808 : автореф. дис.канд. биол. наук. Воронеж, 1991. - 24 с.

40. Номенклатура ферментов / под ред. А.Е. Браунштейна. М. : ВИНИТИ, 1979.-320 с.

41. Об особенностях строения активного центра и механизм действия инулазы / Т.А. Ковалева и др. // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов : материалы международ, симп. Воронеж, 1995. - С. 68-72.

42. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. -М. : Просвещение, 1987. 815 с.

43. Поляновский О.Л. Роль функциональных групп белка в ферментах. / О.Л. Поляновский // Ферменты. М., 1964. - С. 101-117.

44. Попова Т.Н. Основные принципы выделения и очистки ферментов / Т.Н. Попова. Воронеж, 1995. - 38 с.

45. Розенфельд Е.А. Специфичность и механизм действия гликозиза-даз / Е.А. Розенфельд // Механизм и кинетика ферментативного катализа. -М., 1964.-С. 158-169.

46. Савельев В.Р., Сергеев В.Р., Фирсов Л.М. Изучение активного центра глюкоамилазы из Asp. awamori // Биохимия. Т. 10, № 5. - С. 390396.

47. Сергеев В.Р., Фирсов JI.M. Анализ модели для глюкоамилазы из Asp. awamori с помощью ингибиторов // Биохимия. 1985. - Т. 50, №2. -С. 300-306.

48. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1994. - 126 с.

49. Сорбционные и хроматографические препаративные методы разделения микробных ферментов / JI.K. Шатаева и др. // Биотехнология. -1988.-Т. 4, №6. -С. 745-759.

50. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков: учебник для биол. спец. вузов / В.М. Степанов ; под ред. А.С. Спирина. М. : Высш. шк., 1996. - 334с.

51. Тертычная Т.Н. Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы Aspergillus awamori BKMF 2250 : автореф. дис.канд. биол. наук. Воронеж, 1994. - 24 с.

52. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М. : Мир, 1983.-213 с.

53. Уэндлант У. Термические методы анализа. М.: Мир, 1978. - 513 с.

54. Фениксова Р.В. Получение концентрированных ферментных препаратов / Р.В. Фениксова. М. : ЦИНТИ Пищепром, 1960. - 154 с.

55. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М. : Мир, 1980.-432 с.

56. Финкелынтейн А.В. Физика белка / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын. М. : Кн. дом «Университет», 2002. - 376 с.

57. Фримантл М. Химия в действии / М. Фримантл. М. : Мир, 1991. -582 с.

58. Хорлин А .Я. Активные центры карбогидраз / А.Я. Хорлин // Структура и функции активных центров ферментов. М., 1974. - С. 39-69.

59. Чернавский Д.С. Белок машина. Биологические макромолекулярные конструкции / Д.С. Чернавский, Н.М. Чернавская. -М„ 1999. - С. 775-781.

60. Шульц Г. Принципы структурной организации белков / Г.Шульц, Р. Ширмер. М. : Мир, 1982. - 369 с.

61. Энциклопедия полимеров. М. : Сов. энциклопедия, 1972. - Т. 1. -860 с.

62. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа / В.А. Яковлев. -М. : Наука, 1985.-248 с.

63. Allais J. Continuous production of ethanol with Zymomonas mobilis growing on Jerusaleum artichoke juice / J. Allais, E. Torres // Biotechnol Bio-eng. 1987. - Vol. 29, № 6. - P. 778-782.

64. Characterization of the high-molecular weight of fructan isolated from garlic (Allium Sativum L.) / S. Baumgartner et al. // Carbohydrate Research. -2000-Vol. 328-P. 177-183.

65. Chibata I. Industrial application of immobilized enzyme system / I. Chibata // Pure and Appl. Chem. 1978. - Vol. 50, №7. - P. 667-675.

66. Cho Y. Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonas orysae / Y. Cho, J.Yun // Process Biochemistry. 2002 - Vol. 37, № 5. - P. 1325-1331.

67. Claassens G. Purification and propeties of on unulinase from chicory roots (Cichorium intibus) / G. Claassens, A. Van Laere, M. De Proft // J. Plant. Physiol. 1990. - Vol. 136, № 1. - P. 35-39.

68. Cloning and sequencing of the inulinase gene of Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 12424 / O. Laloux et al. // Federation of European Biochemical Societies. 1991 - Vol. 289, № 1 - P. 64-68.

69. Continuous production of fructoce syrups from inulin by immobilized inulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1995. - Vol. 80, № 2. - P. 164-169.

70. Chibata J., Tosa T. Industrial applications of immobilized enzymes and immobilized microbic cells // Appl Biochem Microbiol. 1976. - P. 325357.

71. Ettalibi M. Molecular and kinetic properties of Aspergillus ficium inu-linases / M. Ettalibi, J. Baratti // Agr. and Biol. Chem. 1990. - Vol. 54, № 1. -P. 61-68.

72. Evolution of inulinase production by Kluyveromyces bulgaricus ATTC 16045 / S. Kalil et al. // Enpromer'99 P : II Congresso de Engenharia de processos do Mercosul, 30 de Agosto a 02 de Setembro de, 1999. Florianopo-lis; Santa Catarina; Brasil, 1999.

73. Falb R. Covalent bonding of protein to solid surfaces / R. Falb, G. Grode //Federation Proceedings. 1971. - Vol. 30, № 5. - P. 1688-1691.

74. Gavel D. Fluorescence investigation of immobilized enzymes / D. Gavel // Biotechnol Bioeng. 1974. - Vol. 2, № 2. - P. 165-168.

75. Hamdy H. Purification and some important characters of extracellular inulinase of Alternaria alternata (Fr.) / H. Hamdy // Indian J Exp Biol. 2002. -Vol. 40, № 12. - P. 1393-1398.

76. Hoschke A. A study of the role of histidine side chains at the active center of anxiolytic enzymes / A. Hoschke, E. Laslo, J. Hollo // Biol. Chem. -1980. - Vol. 81, № 1. - P. 145-156.

77. Impact of tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability / K. Hsu et al. // Biochim Biophys Acta. 2001. - Vol. 1547, №2. -P. 329-338.

78. Kim C. Ethanol production Jerusaleum artichoke by inulinase and Zymomonas mobilis / C. Kim, S. Rhee // Appl. Biochem Biotechnol. 1990. -Vol. 23, №2.-P. 171-180.

79. Kim W. Hydrolysis of inulinum from Jerusalem artichoke by inulase immobilized on aminoethylcellulose / W. Kim, S. Byun // Enzyme Microb. Technol. 1982. - Vol. 4, № 2. - P. 239-244.

80. Kovaleva T.A. Immobilization of amylolytic enzymes on the iones changing rosins / T.A. Kovaleva, V.F. Selemenev, G.V. Shmyreva // Molecular order and mobility in polimer system: abstr. 2 nd International symposium. S. Petersburg, 1996.-P. 158-164.

81. Kusunoki M. X-ray structure and catalytic mechanism of taka-amylase A / M. Kusunoki, Y. Matsura // J. Sap. Soc. Starch. Sci. 1983. - Vol. 30, № 2. P. 141-147.

82. Laoux D. Purification and partial characterization of the inulinase of Klyveromyses fragilis / D. Laoux, J. Delcour, J. Vandenhaute // Arch. int. physiol. et biochim. 1989. - Vol. 97, № 6. - P. 161-165.

83. Leon A. Utilization of enzyme mixtures to retard bread crumb firming 1 A. Leon et al. // J Agric Food Chem. 2002. - Vol. 58, № 6. - P. 1416-1419.

84. Mijmoto K. On the insolubilized enzyme activities using adsorbents ionexchangers / K. Mijmoto, T. Fujii, J. Miura // J. Ferment. Technol. 1971. -Vol. 49.-P. 565-573.

85. Molecular Cloning and Sequence Analysis of an Endoinulinase Gene from Penicillium sp. Strain TN-88 / H. Akimoto et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000 - Vol. 64, № 11. - P. 2328-2335.

86. Molecular cloning and sequence analysis of two endoinulinase genes from Aspergillus niger / K. Ohta et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 -Vol. 62, №9.-P. 1731-1738.

87. Nakamura T. Action and production of inulinase / T. Nakamura, S. Nakatsu // J. Jap. Soc. Starch. Sci. 1988. - Vol. 35, № 2. - P. 121-130.

88. Nakamura T. Action and production of inulinase / T. Nakamura, S. Nakatsu // J Jap Soc Starch Sci. 1988. - Vol. 35, № 2. - P. 121-130.

89. Occurrence of two forms of extracellular endoinulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84, № 4. - P. 313-318.

90. Ohta K. Purification and properties of an Extracellular inulinase from Rhizopus sp. Strain TN-96 / K. Ohta, N. Suetsugu, T. Nakamura // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002 - Vol. 94, № 1. - P. 78-80.

91. Oiwa H. Acetonobutanol production from Dahlia inulin by Clostridium pasterianum / H. Oiwa, M. Naganuma, S. Ohnima // Agr Biol Chem. -1987. Vol. 51, № 10. - 2819-2820.

92. Perutz M. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M. Perutz// Nature. 1970. -Vol. 277, № 9. - P. 17041-17047.

93. Pessoa A. Inulinase from Kluyveromyces marxianus. Culture medium composition and enzyme extraction / A. Pessoa, M.Vitolo // Braz. J. Chem. Eng. 1999 - Vol. 16, № 3. p. 324-340.

94. Pessoa A. Inulinase from Kluyveromyces marxianus: culture medium, composition and enzyme extraction / A.Pessoa, M.Vitolo // Braz J Chem Eng. -1999.-Vol. 16, №3.-P. 21-28.

95. Pessoni R. Extracellular inulinases from Penicillium janczewskii, a fungus isolated from the rhizosphere of Vernonia herbacea (Asteraceae) / R.

96. Pessoni, R. Figueiredo-Ribeiro, M. Braga. // J Appl Microbiol. 1999 - Vol. 87 -P. 141-147.

97. Production, purification and characterization of an extracellular inuli-nase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / R. Kushi et al. / Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2000. - Vol. 25. - P. 63-69.

98. Production, purification and properties of an endoinulinase of Penicil-lum sp. TN-88 that Liberates inulotriose / T. Nakamura et al. / Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84, № 4. - P. 313-318.

99. Purification and characterization of an exoinulinase from Aspergillus fumigatus / L. Zhang et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2004. - Vol. 117, № 1. - P. 19-32.

100. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / L. Zhang et al. // Protein Expression and Purification. 2004. - P. 1121-1127.

101. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / W. Jing et al. // Curr Microbiol. 2003. -Vol. 47, №2.-P. 109-112.

102. Purification and Properties of an Extracellular Exoinulinase from Penicillium sp. Strain TN-88 and Sequence Analysis of the Encoding Gene / S. Moriyama et al. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. - Vol. 66, № 9, p. 1887-1896.

103. Purification, characterization, gene cloning and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori / M. Arand et al. // Bio-chem.J. 2002. - Vol. 362. - 131-135.

104. Quiroga E. Purification and characterization of the invertase from Pycnoporus sanguineus / E. Quiroga, M. Vattuone M, A.Sampietro // Biochim Biophys Acta. 1995. - Vol. 1251, № 2. - P. 75-80.

105. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications / A. Pandey et al. // Appl Biochem Biotechnol. 1999.-Vol. 81.-P. 35-52

106. Refined molecular structure of pig pancreatic a-amylase at 2,1 A resolution / S.B. Larson et. al. // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 235, № 5. - P. 1560-1584.

107. Schuleit M. Enzyme immobilization in silica-hardened organogels / M. Schuleit, P. Luisi // Biotechnol Bioeng. 2001. - Vol. 72, № 2. - P. 249253.

108. Screening for microorganismus that produce only endo-inulinase / R. Gern et al. //Appl Microbiol Biotechnol. 2001. - Vol. 55. - P. 632-635.

109. Selvakumar P. Comparative studies on inulinase synthesis by Staphylococcus sp. And Kluyveromyces marxianus in submerged culture / P. Selvakumar, A. Pandey // Bioresource Technologiy. 1999. - Vol. 69. - P. 123127.

110. Seon B. Analysis of disulfide preparation of its reduced carboxy-methylated derivative / B. Seon, H. Toda, K. Narita // Biochem. 1975. - Vol. 58, № 4. - P. 348-356.

111. Shuichi O. Immobilization of endo type inulinase with К - carra-geenin and characterization of the immobilized enzyme / O. Shuichi, S. Nario // J. Coll. Dairing. - 1989. - Vol.14, № 1. - p. 17-21.

112. The calcium requirement for stability and enzymatic activity of two isoforms of barley aleurone a amylase / D. Bush et al. // J Biol Chem. -1989. - Vol. 264, № 32. - P. 19392-19398.

113. Tredberg F. NMR spectra for distinguishing a- and p-amylase action / F. Tredberg, A. Turner, C. Storm // Naturwissenschaften. 1985. - Vol. 72, № 19. - P. 486-487.

114. Xiao R. Purification and some properties of endoinulinase from Chrysosporium pannorum / R. Xiao, M. Tanida, S. Tokao // J. Ferment. Tech-nol. 1989. - Vol. 67, № 4. - P. 244-248.

115. Yacon (Polimnia sanchifolia) extract as a substrate to produce inuli-nase by Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / M. Cazetta et al. // J. Food Engineering. 2004. - Vol. 1. - P. 129-138.

116. Zitton L. Enzymatic hydrolysis of inulin and alternative way to fructose production // Die Starche. 1981. - Vol. 33, №11.- P. 373-377.

Информация о работе

Таха Абдул Саттар
кандидата биологических наук
Воронеж, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы