Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами

Ковалева, Тамара Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами"

На ир&ба* р у к в теп

Ковалева Тамара Андреевна

Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж 1998

На правах рукописи

Ковалева Тамара Андреевна

Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж -1998

Работа выполнена в Воронежском государственном университете.

Научный консультант: доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов В.Г.

Официальные оппоненты:

1. Доктор физико-математических наук, профессор Аксенов С.И.

2. Доктор биологических наук, профессор Зима B.JI.

3. Доктор технических наук, профессор Аотипова Л.В.

Ведущая организация: Институт биохимической физики Российской Академии наук.

Защита диссертации состоится " оог-С1998 г. на заседа-

нии диссертационного совета Д 063.48.11 в Воронежском госуниверситете (394693 г. Воронеж, Университетская площадь, 1) в

час.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежского госуниверситета .

Автореферат разослан "_" сентября 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение любо» проблемы в области познания механизмов жизнедеятельности обязательно связано с исследованием соответствующих ферментных систем, способных кинетически контролировать химические реакции и осуществлять регуляцию метаболических процессов. Успехи современной теории биологического катализа показали, что ферментативные реакции при всей их сложности протекают в полном соответствии с общими закономерностями обычных химических превращений. Объяснение огромных преимуществ, которыми ферментативный катализ отличается от небиологического гетеро- и гомогенного катализа, заложено фактически в исключительно сложной структуре макромолекулы ферментов и функционировании их активного центра. Химические группы, формирующие активный центр, как правило, сами по себе являются очень слабыми катализаторами соответствующих реакций, по включение этих группировок в состав полипептидных цепей белковых молекул приводит к появлению такой каталитической активности, которая превышает активность катализаторов небиологического происхождения на несколько порядков.

В настоящее время не существует единой теории, объясняющей необычайно высокую специфичность и активность ферментных катализаторов. В изучении ферментов наиболее актуальными являются такие вопросы, как расшифровка их первичной структуры; влияние различных физико-химических факторов на конформацию белков и связанных с ней механизмов активации и инактивации ферментов; идентификация функциональных групп их каталитических центров; расшифровка молекулярных механизмов катализа. В последние годы особое внимание уделяют амилазам, физико-химические свойства которых были изучены на ранних этапах развития энзимологии, причем их применение в пищевой, легкой промышленности и медицине помогло существенно изменить и усовершенствовать многие существующие технологии и создать новые. Однако кинетико-термодинамические аспекты действия ферментов на полимерные субстраты, а также особенности характера фермент-субстратных взаимодействий на достаточно протяженных участках активных центров амилаз изучены недостаточно.

Результаты многочисленных исследований ингибиторов ферментов, представляющих собой одну из систем регуляции активности клетки и универсальных оперативных систем контроля, а также защиты от собственных амилаз, обусловлены практической необходимостью поиска возможных медицинских препаратов.

Исследование некоторых кинетических аспектов ферментативных реакций в условиях регуляции скорости с помощью различных химических соединений позволяет выяснить, как посредством изменения нормальных каналов регуляции можно резко повысить эффективность промышленных био-

логических процессов. Большое внимание уделяется изучению взаимодействий ферментов с их окружением на молекулярном уровне, но выяснение возможностей использования таких взаимодействий для углубления наших знаний о поведении амштолитических ферментов в природных условиях и для оптимизации соответствующих биокаталитических процессов изучено недостаточно. Исследование особенностей ферментативного катализа иммобилизованными ферментами необходимо для выявления механизмов действия мембранносвязанных ферментов, олигомерных белков и полиферментных систем, сконструированных по модульному принципу, и поэтому различные элементы, необходимые для выполнения биологических функций, объединяются в сложных белках в надмолекулярные комплексы.

Особую значимость приобретают работы по иммобилизации амилаз, обладающих субъединичной структурой, так как носитель может оказывать влияние не только на подвижность отдельных белковых глобул, но и на процесс взаимодействия субъединиц. Результатом изменения конформационной динамики может быть увеличение или уменьшение активности иммобшшзо-ваиного фермента, а также изменение избирательности субстрата.

В настоящее время, несмотря на то, что описано большое число иммобилизованных ферментов, нет универсального носителя или общего метода связывания. Для иммобилизации определенного биокатализатора нужно выбрать индивидуальный способ фиксации молекулы фермента, учитывая последующее применение полученного препарата не только с точки зрения его каталитических свойств, но также экономической доступности особенно при использовании в промышленности.

Решение многочисленных проблем, связанных с методическими приемами иммобилизации амилаз, подбором носителей, определением кинетико-термодинамических параметров катализа иммобилизованными ферментами является необходимым условием для создания новых технологических разработок, конструирования биореакторов и создания более эффективных гетерогенных биокатализаторов пролонгированного действия для промышленности, медицины и аналитических целей.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является исследование кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами.

Она определяет ряд задач:

- изучить структурно-функциональные свойства амштолитических ферментов в условиях различного микроокружения;

- исследовать функциональные группы, топографию активных центров и молекулярные механизмы ферментативных реакций гидролиза крахмала и инулина;

- разработать эффективные методы иммобилизации амилаз на ионообменных смолах;

- рассмотреть влияние иммобилизации на кинетико - термодинамические характеристики реакций гидролиза крахмала и инулина;

- изучить стабильность амилолитических ферментов, иммобилизованных на ионитах, по отношению к денатурирующим химическим агентам, а также воздействию ультрафиолетового и ионизирующего излучении;

- разработать метод определешш токсичности зерновых продуктов и комбикормов на основе определения каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы пнокозооксидазным методом;

- определить технологические режимы реакции гидролиза инулина, осуществляемой иммобилизованной инулазой в биореакторах периодического и непрерывного действия.

Научная новизна работы. Впервые разработан модифицированный глу-таразьдегндный метод иммобилизации гидролитических ферментов (глюкоамилазы и инулазы) на ионообменных смолах, заключающийся в предварительной обработке носителя янтарным ангидридом, хлористым ацетилом, этилендиамином и глутаровым альдегидом. Показано, что увеличение длины связывающего звена между матрицей и ферментом уменьшает неблагоприятное воздействие химической структуры носителя на конформацию фермента и способствует увеличению каталитической активности иммобилизованного ферментного препарата. Предложен способ адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы па анионите АВ-17-2П, использовавшемся в качестве адсорбента в сахаро-рафинадиом производстве и приобретающем свойства амфотерного ионообменника за счет необратимого поглощения ме-ланоидинов и других продуктов щелочного распада инвертного сахара, выполняющих роль своеобразной подложки в порах ионита.

Впервые установлено, что глюкоамилаза и инулаза имеют четвертичную структуру, состоящую го 2 субъединиц, причем межсубъедтшчные контакты возникают за счет гидрофобных сил сцепления, и отдельные глобулы обладают каталитической активностью.

Обнаружено, что в процессе ковалентной и адсорбционной иммобилизации амилаз имеет место многоточеченое связывание фермента с носителем, приводящее к увеличению Кт и АН, уменьшению Утпх и ДБ, а также константы конформационного перехода Ьо-

Впервые разработаны:

1) экспресс-метод определения токсичности комбикормов и зернопро-дуктов, зараженных плесневыми грибами, на основе определения каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы с помощью глюкозооксидазы и пероксидазы, позволяющий количественно регистрировать присутствие микотоксинов Ф-2, Т-2, охратоксина А, афлатоксина В1 при концентрации 10"3-104 мкг на пробу;

2) схема внутримолекулярных превращений реакции гидролиза инулина и крахмала, осуществляемой глюкоамллазой и инулазой;

3) механизмы функционирования активных центров глюкоамилазы и инулазы;

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования позволяют расширить представление о молекулярных механизмах ферментативного расщепления высокополимерных субстратов, структуре и топографии активных центров глюкоамилазы и шгулазы, кинетико-термодинамических аспектах ферментативного катализа свободными и иммобилизованными амилазами. Полученные в работе данные могут найти применение для модификации носителей при создании сорбентов для аффинной хроматографии, при конструировании биореакторов периодического и непрерывного действия, а также при разработке технологии промышленного получения глюкозы и фруктозы из возобновляемого природного сырья (крахмала и инулина).

Молекулярная модель па основе фермента глюкоамилазы и глюкозоок-сидазного метода используется для определения содержания микотоксинов в зернопродуктах и комбикормах (авторское свидетельство № 1641888 А1).

По материалам диссертации изданы 2 учебных пособия, одно из которых с грифом Минвуза РФ, используемые при чтении общих курсов биофизики на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета и Воронежского государственного технического университета.

Апробация работы. Основные результаты исследовшшй, выполненных автором в период 1975 - 1998 гг., докладывались на международных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях. Они были представлены на Международном научно-практическом конгрессе "Экология России" (Москва, 1994), на Международной конференции 'Ъесох 92" (Воронеж, 1992), II Международном симпозиуме "Молекулярная организация и мобильность полимерных систем" (Санкт-Петербург, 1996), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1997), Международном симпозиуме "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах" (Москва-Суздаль, 1995), II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997), Международном симпозиуме "Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах" (Тверь, 1996), Международном симпозиуме "Физико - химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995, 1998), V Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 1997), Международной научной конференции " Геоэкологические проблемы устойчивого развития городской среды" (Воронеж, 1996), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), VII Всесоюзном съезде микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), Ш Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики (Рига, 1983), VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная этимология" (Вильнюс, 1988), I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и

медицине" (Москва, 1980), IV Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохим)гческих препаратов" (Рига, 1982), IV и VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981, 1991), III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биолопш (Тбилиси, 1982), V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), Всесоюзной конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности (Москва, 1990), IV и VII Всесоюзной конференции "Иошггы" (Воронеж, 1986, 1991), I Всероссийской конференции по фотобиологии (Пущино, 1996), VIII Всероссийской конференции "Физико-хтпгческие основы и практическое применение ионообменных процессов" (Воронеж, 1996), IV Всероссийской конференции "Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов" (Саратов, 1996),, II и III Всероссийской конференции по моле-кулярно-клеточным основам кислотного и температурного гомеостаза (Сыктывкар, 1994, 1997), Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" (Санкт-Петербург, 1996), III и IV межрегиональной конференции "Проблемы химии и химической технологии" (Воронеж, 1995, Тамбов, 1996), Научной конференции "Артериальная гинертензия: клиника и экспериментальные аспекты" (Санкт-Петербург, 1995), Научно-практической конференции "Мониторинг и охрана окружающей среды ЦЧР" (Воронеж, 1989) и на ежегодных научных конференциях Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 2 учебш.гх пособиях, 2 авторских свидетельствах и более 60 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (445 источников) и приложения. Иллюстративный материал включает 122 рисунков и 114 таблиц.

Объекты и методы исследований

Объекты исследований. Основными объектами исследований служили амилолитические ферменты: глюкоамилаза из Aspergillus awamori, препарат Г-20Х производства Ладыжинского завода ферментных препаратов и препарат фирмы "Rapidase" (Франция); инулаза, выделенная из Aspergillus awamori BKMF-2250 на кафедре биохимии и микробиологии Воронежской технологической академии.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов использовали ряд ионообменных смол : сульфокатионит КУ-2, карбоксильные катиониты КБ-2, КБ-4, КБ-4-П2, КБ-4-10П, КБ-2э-0,5, Биокарб Т, шшониты АВ-17-8, АВ-17-2П, ЭДЭ-10П, АВ-16Г, АН-251, АН-221, Дуолит А 368 PR, структура элементарного звена которых приводится по ходу изложения экспериментальных данных. В работе исследованы четвертичные соли дигидрохиноли-

на, синтезированные на кафедре органической химии Воронежского госуниверситета, а также N,>3 - диметилдимердигидрохинолина, имеющие различное строение как анионной, так и катиоииой частей.

Определение активности ферментов. Для определения активности ферментов использовали спектрофотометрические методы. Каталитическую активность глюкоамилазы определяли глюкозоокевдазным методом, основанным на измерении количества глюкозы, образующейся при действии фермента на растворимый крахмал, с помощью глнжозоокевдазы, катализирующей окисление глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты. Вторым продуктом данной реакции является пероксид водорода, окрашивающий ферроциашщ калия под действием фермента пероксидазы в лимонный цвет, причем интенсивность окраски пропорциональна количеству глюкозы (Рыжакова В.Г., Феник-сова Р.В., 1972). Определение каталитической активности инулазы осуществляли при помощи реакции Селиванова, которая состоггт в том, что при нагревании раствора, содержащего фруктозу, с соляной кислотой образуется оксиме-тилфурфурол, который, реагируя с двумя молекулами резорцина, образует комплексное соединение вишнево-красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию оксиметилфурфурола и, следовательно, фруктозы в растворе (Ыакатига Т., Ыакайи 8., 1988).

Выделение и очистка глюкоамилазы и инулазы. Получение гомогенных препаратов ферментов осуществляли, используя метод многостадийной очистки, модифицированный в нашей лаборатории. Из культуральной жидкости инулазу осаждали 65% раствором ацетона при температуре 4-б°С и значении рН 4,0. Далее проводили фракционирование белков сульфатом аммония и освобождение ферментного препарата от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на сефадексе 0-25. Затем применяли ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографию на сефадексе С-200. При выделении глюкоамилазы из производственных растворов использовали аниошггы АН-251 и АВ-17-2П с последующей очисткой с помощью ионообменной и гель-хроматографии. Были определены и отработаны конкретные условия проведения каждой стадии.

Определение молекулярной массы ферментов проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе 0-200 (Детерман Г., 1970).

Количественное определение 5Н-групп осуществляли методом (ТЬаппЬаизег Т.№'. е1.а1., 1984), основанным на измерении прироста оптической плотности в области 255 нм при присоединении п-меркурибеюоата к БН-группам. Для количественного определения З-Б-групп использовали метод, основанный на измерении оптической плотности (1=412 им) при образовании ниггротиобензоата.

Определение общего количества белка в нативных ферментных препаратах проводили по методу Лоури, в иммобилизованных ферментах - модифицированным способом (СЬ1Ьа1а I., 1978).

Подготовку принтов к иммобилизации осуществляли путем выделения требуемой по размерам гранул фракции, кондиционированием ионообмен-ника от ионов переходных металлов и переводом его в нужную ионную форму (Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., 1976).

Иммобилизацию амилолитических ферментов проводили адсорбционным и ковалентным методами (Березин И.В., Мартинек К., 1976), а также использовали модифицированный нами глутаральдегидный способ, заключающийся в наращивании связующего звена ("вставки") между матрицей носителя и молекулой фермента.

Подготовку образцов для аналтаа методом инфракрасной спектроскопии проводили высушиванием ферментов, иммобилизованных на ионитах, до постоянной массы при 50-60°С с дальнейшим растиранием в агатовой ступке до мелкодисперсного состояния, перемешиванием с подготовленным КВг (соотношение 1:100) и получением таблеток в прессформе (Чиргадзе Ю.Н., 1965). ИК спектры снимали на спектрометрах Specord-lR-75 и ИКС-14А. Обработку и анализ серии ИК спектров осуществляли по положению, форме и ширине полос поглощения и фиксации их средних значений (Кучеров А.К., Кочубей С.М., 1983).

Определение числа ионогенных групп проводили на автоматической установке, разработанной на кафедре биофизики ВГУ, путем сравнения кривых титрования белка (Резван С.Г., 1996).

Изучение кинетических и термодинамических параметров реакций гидролиза полисахаридов осуществляли на гомогенных или высокоочищенных препаратах графическими и расчетными методами с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Келети Т., 1991).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее 4-6 раз, аналитическое определение для каждой пробы осуществляли в трех по-вторностях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее арифметическое из трех определений. Результаты экспериментов статистически обрабатывав на персональном компьютере с использованием программы STAT 2. Рассчитывали среднюю арифметическую М, ошибку средней арифметической ш и критерий достоверности со стандартным значением критерия Стьюдента. За минимальный порог достоверности полученных данных принимали порог, соответствующий вероятности Р<0,05.

Выделение и очистка глюкоамилазы и ипулазм. Методы выделения и очистки амилолипгческих фементов предусматривают многоступенчатый процесс экстракции, ионообменную и аффинную хроматографию, электрофорез, причем они характеризуются малой производительностью, большой трудоемкостью. Применение таких методических приемов в условиях промышленного производства ферментных препаратов затруднительно. Поэтому исследовали условия выделения глюкоамилазы га производственных растворов с

использованием ионообменной технологии. Культуральная жидкость (КЖ) глгакоамилазного производства окрашена, что обусловлено переходом соответствующих соединений из исходного сырья и возможным образованием новых окрашенных продуктов в процессе ферментации. Анализ КЖ глюкоамилазы проюводсгва Ладыжинского завода ферментных препаратов позволяет сделать вывод о том, что она представляет собой сложную смесь компонентов, тщательное разделите которых можно провести, комбинируя бумажную хроматографию, электрофорез и гель-хроматограф™. В составе КЖ обнаружены ме-ланоидины - высокомолекулярные азотсодержащие красящие вещества, содержащие ОН- и аминогруппы, а также карбоксильные, метальные и метилсновые группировки, ответственные за образование межмолекулярных водородных и внутрисолевых связей и возникновение цвитгерионов.

Методом пламенной спектрофотометрии показано, что в состав компонентов КЖ входят ионы К+ (128,6 мг/л), Ыа+ (89,8 мг/л), Са2+ (137,5 мг/л) и следы 1л+. С помощью гель-хроматографии определена кажущаяся молекулярная масса меланоидинов КЖ (45 и 19 кДа) и по формуле Огстона рассчитаны радиусы молекул (0,422 и 0,727 им). Показано, что ионообменные материалы могут быть использованы для выделения глюкоамилазы из КЖ в

статических и динамических условиях. Наибольшее количество фермента адсорбируется на анионитах АН-251 и АВ-17-2П (табл. 1), так как. размеры молекулы глюкоамилазы соизмеримы с размерами пор анионита. Причем в качестве адсорбента рекомендуем использование анионита АВ-17-2П, применяемого в сахаро-рафинадиом производстве в течение 400 циклов, в процессе эксплуатации которого происходила модификация поверхностных групп меланоидинами за счет образования аминной связи между вторичными аминогруппами нонообменника и карбоксильными группами меланоидинов.

Через анионит АВ-17-2П, модифицированный продуктами распада ин-вертного сахара, легко проходит значительная часть сухих веществ, содержащихся в КЖ. Глкжоамилаза является агентом - вытеснителем балластных белков и окрашенных соединений. Поэтому для выделения глюкоамилазы из производственных растворов и продуцентов можно рекомендовать анионит АВ-17-2П, являющийся отходом сахаро-рафинадного производства, и АН-251.

Для изучения физико-химических свойств глюкоамилазы использовали препарат Г20Х Ладыжиноского завода, предварительно очищенный методом ионообменной хроматографии на дизпшамшюэтилцеллюлозе по методике, предложенной Р.Ф, Фениксовой, ВТ. Рыжаковой (1968). Гомогенность очищенного препарата подтверждена методом электрофореза По модифицированной схеме получен ферментный препарат глюкоамилазы с 76-кратной степенью

Таблица 1 Сорбция модельного раствора глюкоамилазы на анионитах

Количество

Марка анионита связанного белка, мг/г

АВ-17-8 0

АВ-17-2П 0

ЭДЭ-1оП 0

ИА-1 0,6

АВ-17-2П

(модифицированный) 0,96

АН-251 1,01

очистки. Определение кажущейся молекулярной массы с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 дало величину 106 кДа. Исследование аминокислотного состава глюкоамилазы показало, что молекула фермента содержит 26,8% аминокислотных остатков с алкильными боковыми цепями (Ala, Val, Leu, Met, Не), определяющими высокую устойчивость фермента к орг аническим растворителям (ацетону, этанолу). По данным Yamashida I. et.al. (1986), глюкоамилаза из дрожжей Sacchnromyces diastaticus имеет 549 аминокислотных остатков, среди которых аминокислоты, содержащие СНз-груплы в R-радикапе, составляют 32,6%. Исследование фермента методом рентгенострук-турного анализа (А.Е. Алешин и др., 1994) показало, что поверхность молекулы глюкоамилазы гликозилирована: 10 аминокислотных остатков серина и треонина имеют маннозу (Ser-453, Ser-455, Ser-459, Thr-457 и др.). Нами обнаружено также высокое содержание в молекуле глюкоамилазы Ser и Thr (10,8 и 15,1% соответственно). Результаты наших экспериментов и анализ данных литературы по секвенировашно глюкоамилазы позволяют сделать заключение о том, что молекула фермента имеет 6 SH-групп и 4 дисульфидных связи, стабилизирующих его третичную структуру.

Ферментный препарат инулазы получали из экстракта поверхностной

культуры гриба Aspergillus awamori BKMF-2250. Установлено (табл.2), что наиболее полное осаждение фермента имеет место при использовании ацетона (65%, температура 4-6 °С, рН 4,0). Более высокие концентрации ацетона (80%) резко уменьшают выход фермента и степень очистки. Показано, что доя максимального осаждения инулазы этанолом необходима концентрация 75%, при этом удельная активность оказ&тась на 7% ниже, чем при использовании ацетона оптимальной концентрации. Методом ИК спектроскопии выявлено, что этанол обладает большим денатурирующим действием, чем ацетон, и осаждение инулазы этанолом приводит к уменьшению длины «-спиральных участков и Р-слоев и частичной инактивации фермента.

В нашей лаборатории получен ферментный препарат инулазы с 80-кратной степенью очистки, гомогенность которого была определена методом электрофореза. Молекулярная масса инулазы, вычисленная с помощью метода гель-хроматографии на сефадексе G-100, равна 88 кДа. Показано, что

Таблица 2

Очистка инулазы Aspergillus awamori BKMF-2250

Стадия Количество Удельная Степень Выход,

очистки белка, мг активность, очистки %

ед/мг

Культуральная

жидкость 290 1,12 1 100

Осаждение

ацетоном 150 12,4 11,1 84

Фракциониро-

вание сульфа-

том аммония 75 19,6 17,5 58

Сефадекс 0-25 52 24,5 21,8 50

Хроматография

наДЭАЭ-

целлюлозе 1,5 85,6 85 5

инулаза является термостабильным ферментом: даже при 70°С каталитическая активность сохранялась на 22% от максимальной. Температурный оптимум функционирования лежит в диапазоне 47-51°С с максимальной активностью при 50°С; рН-оггшмум реакции гидролиза инулина 4,7. Молекула фермента имеет 7 поверхностных SH-групп и 3 глубинных, причем третичная структура фермента стабилизируется двумя дисульфидшыми связями. Методами кислотно - основного титрования и анализа аминокислотного состава было установлено, что в структуре молекулы фермента присутствует 178+17,8 остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, 20±2 остатков гис-тидина, 9,5+0,95 - цистеина, 34+3,4 остатков лизина и тирозина.

По данным ряда авторов Haraguchi К., Seki К., Kichimoto M. (1995), инулаза имеет 540 аминокислотных остатков с типичным N-концевым сигнальным пептидом. Секвенирование фермента позволило установить сходство с инвертазой (67%), что может свидетельствовать об общем эволюционном предке р-фруктозидаз. Количество остатков Ser и Тут в первичной структуре инулазы из Kluyveromyces marxianus составляет 10%, что вполне соответствует содержанию этих аминокислотных остатков в молекуле инулазы, полученному в нашей лаборатории. К такому же выводу можно прийти, если сравнить результаты наших экспериментов по количеству NH-rpynn Lys (20) с содержшшем этих аминокислотных остатков, полученных путем секвенирования.

Исследование фнзико - химических свойств глюкоачилазы и ииу-лазы. Исследование зависимости скорости ферментативной реакции гидроЗависимость скорости реакции гидролиза лиза крахмала от концентрации

а,

«flíxr 1750 -,

крахмала глюкоамилазой от концентрации субстрата

субстрата с помощью глюкоами-лазы показало, что она не соответствует уравнению Михаэлиса-Ментен(рис. 1).

Попова C.B., Сельков Е.Е. (1978) установили, что для олиго-мерных ферментов, содержащих п активных центров, уравнение скорости ферментативной реакции имеет в!|д:

■ с. х'О ' ыоль/л

где и Ут - скорости ферментативной реакции в состоянии Я и Т соответственно; О - конформаци-онная функция.

Причем VR можно вычислить

из следующего уравнения:

Vй [Б]

, шах

Кк +£]' т

(2)

где [Б] - концентрация субстрата.

Значение Ут определяется выражением:

V -([5 МБ 1)

у = У К | птах 1 эксп-1 1 О-17 Т шах КТ+(р Ь[5])'

(3)

ш эксп-1 О

где [Бо] - концентрация субстрата, соответствующая точке перегиба кривой.

Из уравнений (1), (2) и (3) можно выразить конформационную функцию О через V:

V -V..

45)

(Э)

V -V (в) т

(4)

Исследуя зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата экспериментально, можно определить по уравнению (4) зависимость информационной функции от концентрации субстрата.

Зависимость 0,.^ может быть выражена следующим аналитическим выражением:

/ , ,\П

Ч + И/К*

1+И/к:

(5)

где п - число субъединиц в молекуле фермента, Ь0 - константа конформаци-онного перехода молекулы из состояния И в состояние Т.

После логарифмирования уравнений (4) и (5) получаем систему уравнений:

Л-4

1пр = 1пЬ0+п-1п

1п(} = 1п

1+И/к

1+Р1/К

(в)

/ -V (в) ту

Из уравнения (6), исходя из данных эксперимента, вычисляем

1пГ=1п

1+И/К

1+^/к

(6)

(7)

(8)

Причем К^ и К* определяем известивши графическими методами на участках Я и Т соответственно.

Зависимость 1п С?, 1п Г должна быть линейной (см. уравнение (5)). Значение Ц можно вычислить из длины отрезка, отсекаемого этой прямой на оси ординат. Расчет кинетических характеристик ферментативной реакции гидролиза крахмала осуществляли с помощью графической обработки экспериментальной зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 1). Выявлено, что константа конформационного перехода ферментативной реакции гидролиза крахмала Ц = 6,69, глкжоамилаза имеет четвертичную структуру, причем количество субъединиц фермента, полученное расчетным путем, равно 2.

Для изучения надмолекулярной структуры глюкоамилазы фермент инкубировали в 3,510"3 моль/л растворе додецилсульфата натрия, разрушаю-

Таблица 3 щего четвертичную структуру. При Определение молекулярной массы гель - хроматографии на колонке с глюкоамилазы и ее субъединиц сефадексом 0-200 субъединицы вы-

..„ ходят в одном объеме, что свиде-

тельствует о симметричности их строенга. Молекулярная масса субъеднниц, рассчитанная по результатам наших экспериментов, равна 53600 Да (табл. 3).

Анализируя результаты прове-

Внешний Объем Молеку-

Объект объем выхода, лярная

колонки, мл масса,

мл Да

глкжоамилаза 106600

субъединица 24,7

глюкоамилазы 49,1 53600

денных исследований, как расчетов методом графов, так и данных, полученных методом гель - хроматографии, можно констатировать, что глюкоамила-за является олигомерным ферментом и имеет в своем составе две тождественные субъединицы.

Зависимость скорости реакции гидролиза крахмала глюкоамилазой от концентрации субстрата в присутствии ДСН и без него а,

сд/нг

S 10 15 с>

хЮ"5 моль/л

- Нативная глюкоамилаза; ■ Модификация ДСН 3,5д10л uonUn.

По данным Ashikari Т. et.al. (1986), глкжоамилаза, выделенная из Rhizopus oryzae, имеет 604 аминокислотных остатка При секвенировании было обнаружено, что фермент характеризуется сложной четвертичной структурой; субъединица Glue 1 имеет 159 - 604 аминокислотные остатки, а Glue 2 - 110 - 604. Наши эксперименты показали, что отдельные субъединицы г люкоамилазы, которые получали при инкубации фермента с доде-цилсульфатом натрия (ДСН, 3,5-Ю"3 моль/л) обладают каталитической активностью. Исследование зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 2) для нативного фермента и отдельных его субъеди-

ниц, полученных с помощью метода гель-хроматографии, показало, что коо-ператшшость взаимодействия составных элементов характерна только для ^модифицированной глюкоамилазы. Соответствие кинетики ферментативного катализа для отдельных субъединиц уравнению Михаэлиса свидетельствует об отсутствии кооперативное™ и натичии конформационных изменений в молекуле глюкоамилазы. Таким образом, результаты наших экспериментов и анализ данных литературы позволяют придти к заключению о том, что глтокоамилаза имеет четвертичную структуру, состоящую из двух субьеди-ниц. Ее стабильность определяется водородными связями и гидрофобными взаимодействиями и может зависеть от небольших изменений в пространственной структуре каждой га взаимодействующих субъединиц. Причем четвертичная структура, по-видимому, обладает способностью передачи сгруктурных перестроек от одной субъединицы к другой и является одним из факторов регуляции функциональной активности молекул белка.

Спектры поглощения ииулазы при воздействии различных концентраций додецилсульфата натрия

330 350 370

При исследовании спектров поглощения ииулазы показано (рис. 3), что при инкубации с додецилсуль-фатом натрия (концентрации 3,5-10"3 и 3,5-10"4 моль/л) наблюдается денатурация фермента. При воздействии додецилсульфата натрия (3,5-10"6 моль/л) имеет место увеличение интенсивности поглощения белка в области 275 нм. При инкубации додецилсульфата Na при концентрации 3,5-1 (Г5 моль/л с инулазой на спектрах поглощения проявляется расщепление полосы поглощения и наблюдаются 2 максимума (270 и 280 нм).

При наличии олигомерности фермента хромофоры обладают лишь 2 электронными смещениями

250 270 230 310

Рис. 3.

и одной полосой поглощения, свя-з - инулаза+дсн злю-4 моль/л,- 6-дснз,яо" моль/л- занной с переходом молекулы га

основного синглетного состояния в возбужденное. При появлении димера в спектре возникают 2 полосы: одна - при большей длине волны, чем у мономера, другая - при меньшей. Интенсивность этих полос практически одинакова.

Результаты этих опытов подтверждаются экспериментальными данными, полученными методами гелъ-хроматографии (рис. 4).

Диаграммы элюирования инулазы с колонки, упакованной сефаяексом 0-200, при различных концентрациях додецилсульфата натрия

юммммюгошм

Объем элюата, мл

1 -ДСН 3„5101моль/л; 1 -ДСН 3„5Юлмо1нЛ; 2-ДСН 3„Я0^»«шил; * - ДСН 3„610*»о1чЛ|.

Рис. 4.

Диаграмма элюирования субъсдиниц

инулазы с колонки, упакованной сефадексом С-200, после обработки фермента додецилсульфатом натрия

0,3

од

0,1

При воздействии додецилсульфата На (3,5-10*6 моль/л) наблюдается выход фермента одним пиком, появление второго пика на хроматограмме регистрировали при воздействии додецилсульфата Ыа с концентрацией 3,5-10° моль/л.

Поэтому для изучения четвертичной структуры фермента необходимо применение додецилсульфата Ыа в концентрации 3,5-10'5 моль/л. При гель-хроматографии на колонке с сефадексом С-200 субъедшшцы выходят двумя пиками, причем кажущаяся молекулярная масса субъединиц, рассчитанная по результатам наших экспериментов, равна 76,9 и 10,1 кДа (рис. 5, табл. 4).

Таблица 4 Определение кажущейся молекулярной массы инулазы и её субъединиц методом

гсль-хроматог рафии

Вещество Внешний объем колонки, мл Объём выхода, мл Молекулярная масса, кДа

Инулаза 27,5 48,9 87.7

Субъединицы инулазы 50,5 76.9

75,0 10,1

90 Объем элюата, мл

Установлено, что субъедшшцы инулазы обладают каталитической активностью, причем меньшая субъединица обладает большей каталитической активностью.

Методом ИК спектроскопии установлено, что на ИК спектре большой субъединицы наблюдается некоторое смещение полосы поглощения 2929 см"1, определяемое колебаниями метиленовых групп и появлением неполярных радикалов аминокислот на поверхности, по-видимому

обусловливающих стабилизацию четвертичной структуры фермента.

Одним из эффективных методов исследования IV структуры является модификация бифункциональными реагентами, позволяющая изучать пространственное расположение и взаимодействие субъединиц. Поэтому мы провели ковалеитное связывание большой и малой субъединиц инулазы, полученных методом гель-хроматографии, с помощью глутарового диатьдеги-да. К растворам субъединиц добавляли 5 мл 1% раствора глутарового диаль-дегида и инкубировали в течение 1,5 часа, далее отбирали по 1 мл из каждой колбы и выдерживали в течение такого же времени в другой пробирке. Альдегидные группы глутарового диальдегида реагируют с аминогруппами боковых цепей лизина, которые располагаются на поверхности субъединиц. Поэтому высока вероятность введения поперечных связей в область меж-субъедишгчных контактов. Исследование каталитической активности модифицированной инулазы показало, что она значительно ниже, чем нативного фермента (в 12 раз).

Результаты наших экспериментов по ИК спектроскопии отдельных субъедшшц инулазы, а также ковалентной модификации глугаральдегидным способом позволяют сделать заключение о том, что четвертичная структура инулазы поддерживается гидрофобными "силами сцепления", что способствует повышению мобильности молекулы в процессе образования фермент-субстратного комплекса.

Таблица 5 Далее мы иммобилизовали от-

Активность субъединиц инулазы, дельные субъединицы инулазы на иммобилизованных на АВ-26 анионите АВ-26. Опыты показали, что

активность субъединицы с молекулярной массой 76,9 кДа при ковалентной иммобилизации практически не изменяется по сравнению с натив-ным ферментом, (табл. 5). При иммобилизации малой субъединицы фермента на анионите АВ-26 мы наблюдали увеличение каталитической активности модифицированной инулазы.

Исследование кипе гики гидролиза инулина иммобилизованными субъединицами при различных значениях концентрации субстрата показало, что зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата соответствует уравнению Михаэлиса.

Результаты наших экспериментов, а также данные литературы позволяют сделать следующее заключение: фермент инулаза имеет четвертичную структуру, представленную двумя субъединицами с молекулярными массами 76,9 и 10,1 кДа, обладающими катаиггической активностью. Четвертичная структура фермента принимает участие в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц и стабилизируется гидрофобными "силами сцепления".

(Г=70°С, рН 4,7, [ЗНЛбб-Ю'3 моль/л)

Содержание № Средняя

белка, мг субъединицы активность,

ед/мг

1,2 I (76,9 кДа) 25,30+2,80

0,3 2(10,1 кДа) 89,4+7,99

Зависимость каталитической активности инулазы от концентрации инулина при различных значениях рН субстрата

Особенности структуры активных центров глгокоамилазы и инулазы. При исследовании физико-химических свойств амилаз выявлено, что кривая рН-активности для инулазы имеет присущую многим ферментам ко-локолообразную форму с максимумом при рН 4,7, причем это оптимальное значение рН сохраняется при использовании всех концентраций субстрата.

Наши эксперименты по исследованию влияния температуры на каталитическую активность инулазы показали, что фермент является термоста-. бильным: даже при 70°С активность сохраняется на 22% от максимальной величины. Температурный оптимум функционирования инулазы лежит в пределах 47-51°С с максимальной активностью при 50°С. Эти данные согласуются с результатами экспериментов ряда авторов. Так, по данным Муста-фаева P.M. (1991), инулаза из Aspergillus avvamori BKMF-808 имеет в зоне

температур 30-50°С относительно меньший прирост энтропии AS*, что свидетельствует о достаточно высокой прочности и жесткости глобулы фермента. Резкое увеличение AS* в интервале 60-70° С свидетельствует об интенсивном переходе белковой глобулы фер-

-** ____*—,х мента в хаотический клубок и дает

основание предположить, что в формирование ее структуры существенный вклад вносят гидрофобные взаимодействия.

Зависимость каталитической активности инулазы от концентрации субстрата не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен (рис. 6).

Нами показано, что молекула инулазы содержит 7 поверхностных SH-групп. После обработки денатурирующими агентами были выявлены еще 3 SH-группы. При блокировании п - хлормеркури-бензоатом SH-rpynri наблюдалась инактивация фермента (табл. 6).

При определении количества S-S групп установлено, что в молекуле инулазы имеются 2 ди-сульфидные связи, определяющие

......рНЗ,0

—и-рН «,5

- • К- • рН 5,5

-х-

рН 3,5; •рН4,7; рН 6,0.

2,5 [S1, 10"' моль/л

----рН 4,0;

---рН 5,0;

Рис. 6.

Таблица б Влияние блокирования SH-групп n-хлормеркурибензоатом на

Концентрация Активность, ед/мг

инулина, 10"' моль/л без п-ХМБ в присутствии п-ХМБ

1 48,41*0,78 0,02±0,004

2 72,61±0,98 0,08±0,004

3 87,01 ±0,29 0,10^0,003

4 96,93±0,58 0,10±0,003

5 101,34±0,94 0,11±0,005

устойчивость к денатурирующим агентам и способствующие поддержанию нативиой конформации белка. Широко используемым методом для получения предварительных данных об идентификации функциональных групп активного центра фермента является анализ зависимости каталитической активности от концентрации субстрата при различных значениях рН.

Графическая обработка эксперимен-татьных данных в координатах Кт

и 18Утах\Кт от значений рН (табл.7) позволила предположить, что в состав активного центра инулазы входят у- и (1- карбоксильные группы глутамтювой, аспарапшовой кислот и имидазольная группа гистидина. Однако применение графических методов идентификации функциональных групп активного центра осложняется тем, что физико-химические свойства идентифицируемой группы могут существенно изменяться в условиях различного микроокружения. Поэтому участие имидазола в процессе каталша было подтверждено при изучении влияния фотоокисления гистидина и триптофана в присутствии мети-леновой сини на каталитическую активность инулазы (табл.8).

При наличии в каталитическом центре фермента имидазола гистидина фотоокисление в присутствии метиленовой сини должно привести к инактивации фермента, что и наблюдалось в наших экспериментах. Следует отметить, что наряду с имидазолом интенсивному окислению подвергается индольное кольцо триптофана. Для подтверждения предположения о возможности участия карбоксильных групп в процессе катализа было исследовано влияние водорастворимого М-(циклогексил)-М'-(4'- диэтиламиноцикло-гексил) - карбодшшида на активность 1шулазы. Выбор данного реагента обусловлен тем, что карбодиимиды являются наиболее эффективными реагентами для модификации карбоксильных групп в белках в мягких условиях.

Инкубация раствора фермента с карбодиимидом в течение 10 минут приводила к снижению активности инулазы до 69,79%, а при 40-мипутном взаимодействии сохранение активности составило лишь 1,29% от активности исходного ферментного препарата (рис. 7).

Таблица 7

Величины константы Михаэлиса и максимальной скорости для реакции гидролиза инулина

РН КЩ, V 1 пмх»

10"4 моль/л мкмоль-мг/мин

3,0 2,96 ± 0,09 65,80 ±1,06

3,5 2,19 £0,10 120,18 ±0,07

4,0 2,19 ±0,01 135,14 ± 1,00

4,5 2,01 ±0,10 135,45 ±1,36

4,7 1,86 ±0,06 136,90 ± 0,50

5,0 3,00 ± 0,06 135,30 ± 1,10

5,5 2,70 ± 0,20 100,69 ± 1,50

6,0 3,47 ± 0,20 42,30 ±4,08

Таблица 8

Влияние фотоокисления гистидина и триптофана в присутствии метиленовой сини _на активность инулазы_

Концентрация Активность, ед/мг

инулина, Ю"7 без метиленовой в присутствии

моль/л сини метиленевой сини

1 48,50+1,16 0,04+0,01

2 72,68+0,66 0,04±0,004

3 87,50±0,95 0,04+0,006

4 97,20±0,58 0,05+0,005

5 102,00+0,68 0,06+0,006

Влияние различных концентраций карбодиимидана активность инулазы

1 - концентрация карбодииыида 101 моль/л;

2 - концентрация карбодинмида Ю^мольМ;

3 - концентрация карбодиимида 1С мольМ;

4 - коктроль.

Рис. 7.

Известно, что высокомолекулярные субстраты полисахар идного характера в определенной концентрации обладают ингибирующим действием. В этой связи была изучена кинетика инактивации 1тулазы карбодииющом в присутствии инулина При 40-минутном взаимодействии инулазы с карбодиимидом в присутствии субстрата защитный эффект составил 16,38% (рис. 8).

Защитный эффект инулина при действии карбодиимида (Ю"5 моль/л) на инулазу

Время, ими

1 - инулаи - карбодиимид; 2 • иуулааа • карбодиимид • инулин; 3 • инулаза (контроль).

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что молекула субстрата экранирует карбоксильные группы активного центра инулазы. Расчеты, сделанные по методу Майлза (In К* от 1п[1]) на основании экспериментальных данных и анализа данных литературы (Kum Dong-Man et.al., 1992), показали, что в присутствии реагента модифицируется одна карбоксильная группа acnapart шовой кислоты.

Принадлежащие боковым цепям остатков лизина с-аминогруппы, как правило, располагаются на поверхности белковой молекулы и обладают химическими свойствами, характерными для алифатических первичных аминов. Согласно результатам наших исследований, молекула инулазы содержит 38 NH2-rpymnrp0B0K, которые являются весьма существенными для проявления каталитической активности некоторых амилаз (Абелян В.А, Ма-нукян J1.C, 1996). Наиболее распространенной типовой реакцией химической модификации е-аминогрупп в белке является реакция ацетилирования с помощью уксусного ангидрида.

Таблица 9 Установлено, что инкубация инула-Влияние уксусного ангидрида и зы с уксусным ангидридом в концентра-субстрата на активность инулазы „ , „-2 ,

' г - цип 8-10 моль/л не приводит к досто-

верному сгегжешпо активности фермента Увеличение концентрации модификатора до 10"1 и 5-Ю"1 моль/л ведет к незначительному снижению каталитической активности инулазы (на 1,08% и 1,50% соответственно). Субстрат не обладая защитным эффектом по отношению к уксусному ангидриду (табл. 9).

Анализ полученных данных позволяет предположить, что вызываемые уксусным ангидридом модификации е-аминогрупп лизина локализованы вне активного центра и поэтому не влияют существенным образом на активность инулазы. При исследовании влияния концентрации субстрата на каталитическую активность глюкоамилазы при различных значениях рН и графической обработке экспериментальных данных в координатах (lg Vml4; рН) установлено, что константа ионизации рКа функциональных групп активного центра, ответственных за каталиттеское превращение молекул крахмата, соответствует рКа карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот (2,7). При фотоокислении имндазола гистидина молекулы глюкоамилазы в присутствии метиленового синего и без него (табл. 10) уменьшения каталитической активности глюкоамилазы не выявлено.

Опыты показали (рис. 9), что n-меркурибензоат снижает каталитическую активность глюкоамилазы, причем ингибирование идет по бесконкурентному тину.

(время инкубации 60 мин)

Условия реакции Аср, ед/мг Активность инулазы, %

Контроль 9,02 ± 0,05 100

Уксусный ан-

гидрид, 5 10"'

моль/л 8,89 ± 0,06 98,50

Уксусный ан-

гидрид, 510"'

моль/л,

инулин, 4'Ю"4

моль/л 8,90 ± 0,05 98,66

Влияние n - меркурибензоата на каталитическую активность глкжоамилазы

а,

ед/мг 1800

Таблица 10 Влияние фотоокисления гистидина и триптофана d присутствии метиленовой сини на кача-тяп1чес;.у1' ) активность глкжоамилазы

Время Активность глюкоамилазы,

ед/мг

инкубации, оез в присутствии Р>

мин метиленовой метиленовой

сини сини

- 1266+30,4 1265+10,8 0,05

10 1207+16,1 .1210+22,9 0,05

30 998+20,3 1008+16,4 0,05

60 970±20,4 965+9,2 0,05

0,8 1 1Д 1С], Х10"* мольУл

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что в состав функциональных групп активного центра глкжоамилазы не входят имадазольная группа гистидина и SH-группы и в гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы. Используя данные рентгеноструктурного анализа (Aleshin А.Е. et al., 1994) и программу MOLSKR1PT, методом молекулярной графики показано (рис. 10), что активный центр глкжоамилазы расположен в сквозной полости

0,2 0,4 0,S —Глючоам илаза; - Тлкжоамилаэз а присутствии л-МБ.

Рис. 9.

(~1,5 им), ограниченной следующими аминокислотными остатками: Leu-58, Leu-130, Leu-177, Leu-319, Trp-178, Trp-417, Phe-187.

В гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы Asp-55, Glu-179, Glu-400, причем с одной стороны щели активного центра сосредоточены Asp-55 и Glu-179, а с противоположной - Glu-400. Через полость активного центра проходит кластер молекул воды, разделяющий ее на две половины, при изменении конформации это соотношение сдвигается.

Пространственная структура глкжоамилазы

Мм

Д е <Ч»

гм A^WXi

Ял

* < J )

i »»'"Y

'IV'-vi '

Рис. 10.

Иммобилизация амнлолитическнх ферментов на нопнтах физическими и химическими методами. Иммобилизация - один из путей повышения стабильности ферментов к денатурирующим воздействиям среды,

способствующий многократному применению биокатализатора в фармацевтической, пищевой промышленности, а также в аналитических целях.

Таблица 11 Эксперименты показали Иммобилизация глюкоамилазы адсорбционным (табл 11) что глгокоамила-

за, иммобилизованная на ио-нообмешгых смолах КБ-2э-0,5, КБ-4-10П, Биокарб-Т и ИА-1 адсорбционным методом, 1шела значительную удельную активность. Однако комплекс глюкоамилаза -ИА-1 не обладал достаточной механической прочностью и разрушался в процессе иммобилизации и при гидролизе крахмала (реакция протекала при перемешивании субстрата). При иммобилизации глюкоа\шлазы на сетчатом полиэлектролите Биокарб-Т иммобилизованный фермент сохранял 97% активности нативного препарата, что можно объяснить макропористостью носителя, имеющего в патрице пустоты 1 ООО А). Но мелкая дисперсность носителя не позволяет рекомендовать его для создания гетерогенных биокатализаторов, расщепляющих растворы крахмала в промышленных установках. Использование в качестве носителей глюкоамилазы ионитов КБ-2э-0,5 и КБ-4-10П позволило получить наиболее прочные и активные комплексы фермент-носитель.

При исследовании физико - химических свойств глюкоамилазы, иммобилизованной на иошггах адсорбционным методом, показано, что гетерогенный биокатализатор проявляет максимальную каталитическую активность в диапазоне значений рН 4,0-5,0, температурный оптимум реакция гидролиза крахмала сдвинулся вправо на 20°С. Причем при нагревании иммобилизованного фермента до 90°С в течение часа он не теряет своей каталитической активности полностью. Повышение стабильности иммобилизованной глюкоамилазы обусловлено тем, что при связывании с носителем подвижность третичной структуры, ответственной за каталитические свойства, уменьшается, а это приводит к увеличению энергии активации ферментативной реакции.

При применении анионитов для очистки сахарных сиропов в промышленной технологии происходит поглощение ионообменниками меланоидинов и других окрашенных компонентов сахаро - рафинадного производства, причем такая "модификация" способствует адсорбционной иммобилизации

методом на иоиитах различного типа

Количество Удельная Осахарива-

№ Носитель связанного активность, ющая спо-

п/п белка, мг/г ед/мг собность,

носителя %

1. КБ-2э-0,5 5 574 2,8

2. КБ-4 0,3 301 0,6

3. КБ-41 0,2 2361 0,5

4. КБ-4-П2 0,3 305 0,6

5. КБ-4-10П 2,2 520 1,1

6. Биокарб-Т 0,7 4126 2,8

7. ВИОН-КН1

(волокно) 13,2 46 0,6

8. ВИОН-КН1

(нетканое) 30 86 1,7

9. ИА-1 0,6 1220 -

Примечания:

1. Все результаты анализов - средние из 6 определений;

2. Активность нагивной глюкоамилазы - 4434 ел/мг.

ферментов. Аниониты перед кондиционированием отмывали большим избытком 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия, 1,0 моль/л соляной кислоты до обесцвечивания вытекающего раствора. Показано, что наибольшей каталитической активностью обладает глюкоамилаза, иммобилизованная на анионнте АВ-17-2П, использующемся для очистки сахаро - рафинадных сиропов в производственных условиях 400 циклов. В процессе эксплуатации АВ-17-2П в промышленной технологии анионнт приобретает свойства ам-фолита, нарушается также и степень сшивки. Эти изменения приводят к тому, что молекула глюкоамилазы оказывается в таком микроокружении, которое благоприятствует проявлению каталитических свойств. Молекулы глюкоамилазы могут проникать при адсорбционной иммобилизации в более глубокие слои матрицы носителя, что и сопровождается увеличением внут-ридиффузионного торможения реакции гидролиза крахмала. При исследова-шш влияния температуры (диапазон 20-90°С) на каталитическую активность иммобилизованной'глюкоамилазы установлено, что фермент проявляет оптимальную способность к катализу реакции гидролиза крахмала при температуре 50°С. рН-оотимум реакции гидролиза крахмала для иммобилизованного на АВ-17-2П (III) фермента практически не отличается от свободного.

Следует отметить, что отработанный анлонит не может быть полностью регенерирован, а также применен в промышленной технологии. При использовании неотмытого от красящих веществ ионообмеиника связывание глюкоамилазы происходило, менее эффективно, так как большинство функциональных групп носителя занято обратимо сорбированными окрашенными компонентами. Практическое использование такого препарата иммобилизованной глюкоамилазы нецелесообразно, так как может происходить загрязнение продуктов ферментативного катализа окрашенными компонентами.

Таким образом, мы предлагаем способ иммобилизации глюкоамилазы, заключающийся в адсорбции фермента и отмывании ионообмеиника от не-связавшегося белка, отличающийся тем, что с целью удешевления целевого продукта и утилизации отходов пищевой промышленности в качестве носителя следует использовать отработанный в сахаро-рафинадном производстве анионит АВ-17-2П, предварительно отмытый от красящих веществ щелочными, а затем кислотными водными растворами.

Химические методы иммобилизации ферментов в настоящее время являются доминирующим способом получения гетерогенных биокатализаторов. Преимущество их заключается в том, что фермент, как правило, не переходит в раствор даже при длительном применении в непрерывной промышленной технологии. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и метод образования ковалентной связи, можно значительно уменьшить неблагоприятное влияние матрицы на структурно-функциональные свойства фермента и тем самым повысить удельную активность иммобилизованного ферментного препарата и его адаптацию к изменяющимся условиям техно-

логического процесса. Особенно это касается ферментов, катализирующих превращение высокомолекулярных соединений.

Несмотря на то, что описано большое количество методов иммобилизации, выбор носителя и метода химической иммобилизации оказывается во многом эмпирическим. В соответствии со строением ионитов ковалентное связывание осуществляли следующими методами: 1. для катионитов - хло-рангидридный, ангидридный, азндиый; 2. для аннонитов - альдегидный и смешанный.

Носители переводили в Н-форму стандартным методом и хранили в эксикаторе. Иммобилизацию глюкоамилазы азидным методом осуществляли путем перевода носителя с помощью дихлорметилового эфира в хлорангид-риднуто форму, далее обрабатывали этилендиамином и янтарным ангидридом с целью получения хлорангидрида.

(м)-СООН+ СН3ОСНС12-> + М12СН2СН2ЫН2 ->

/Я С1сн2ок

-> М'-С + ! . О ->

Ш —СН2СН2МН2НС1 стьсо х

Ш — СН2СН2Ш2Н-(^

СН2СН2СООН

Далее к сухой смоле добавляли дихлорметиловый эфир и 0,5 г хлорида цинка, затем безводный гидразин, потом постепенно прикапывали нитрат натрия при охлаждении до 0°С и инкубировали модифицированный носитель с глюкоамилазой (концентрация 2-10"4 моль/л) при перемешивании в течение 4 часов при 0-5°С.

(м)-с и р + СН3ОСНС12 ~>

ЫН — СН2СН2КН2Г1ССН2СН>-С

0 п "он

|| О + ш2ын2 ->

ЫН — СН2С![2ЫН2НССН2СН2- с

.0 ЧР1

7 о С1

-»(чм;-с |[ о + нмо, ->

ЫН — сн2сн2мн2нссн2сн>.д

ынын2

->(м)-с Л лр +ын2—®->

Ш — СНгСНгЫН^НССНгСНг-С

гл ^ о ^

->(м)-С Л Р

ЫН — СН^СЬЬЫНгНССНгСНг-С

(ф)

При иммобилизации глкжоамилазы на ионитах КБ-2 и КБ-4 содержание белка составляло 3,9 мг/г носителя. Фермент, иммобилизованный на катио-нитах азидным методом, проявлял высокую каталитическую активность (83,4 и 90% от активности свободной глкжоамилазы). Причем удельная активность сохранялась в течение двух месяцев. Необходимо отметить, что без соответствующей модификации носителя (обработка этилендиамином и янтарным ангидридом) иммобилизованная глюкоамилаза не имела каталитической активности.

Эксперименты показали (табл. 12), что для катионита КБ-2э-0,5 ангидридный метод иммобилизации глкжоамилазы не привел к положительным результатам (препараты 4, 5), а азидный и альдегидный методы привели к появлению незначительной активности (препараты 8-10). Лучшие результаты получены смешанными методами, основанными на усложнении или удлинении структуры связующего звена - "ножки". Так, при использовании в качестве сшивающего агента этилендиамина и глутаровото альдегида удалось добиться повышения каталитической активности иммобилизованной инулазы (препараты 3, 7). На этом основании для КБ-2э-0,5 были выбраны наиболее оптимальные модификации матрицы ионита (препарат 14), в основе которой лежат следующие реакции:

сн2-со

Я-СООН+Н2и(СН2)2ЫН2->К-СОЫН(СН2)2ЫНг+ I ->

сн2-со

-Ж-СОМН (СН2> 2ЫНСО (СНг) 2СООН+ЗОС1г->К-СОШ (СН2) 2ШС0 (СН2> 2СОС1+

+МН2-(СН2)2-Ш2-Ж-СОШ(СН2)2МНСО(СН2)2ЫН2+ /С- (СН2) з-С ->

н чн

К-СОЫН (СН2) 2ШСО (СН2) 2СОШ (СН2) 2м=сн- (СН2) Зсч +

чн

+ Н2ы - -> К-[СОЫН(СН2)2Ь-Ы = СН (СН2) зСН=Ы - (ф)

Таблица 12

Стадии модификации матрицы катеонита КБ-2э-0,5 и каталитические свойства _глкжоамилазы, иммобилизованной на нем_

№ Каталитические свойства

препа- Стадия модификации матрицы Количество глюкозы в 1 мл Осахарнвающая способность,

рата гидролизата, мкг %

1. К-СООН+хлор.тишшл-ИФ 52 0,44

2. Я-СООН+укс.аигидр.-»+Ф 40 0,34

3. Я-СООН + укс.ангидр. + ЭТД -> + альд. ->Ф 75 0,64

4. Я-СООН+.хлор.тиопил-мФ 0 0

5. Я-СООН+ укс.ангкдр.-»+Ф 0 0

6. К-СООН+ЭТД->+альд.-»+Ф 0 0

7. К-СООН+ЭТД-»+альд.~>+Ф 50 0,42

8. Я-СООН+ЭТД->+альд.->+Ф 23 0,19

9. К-ССХ)Н+КНгШ2->+Ш02->+Ф 24 0,20

10. К-СООН+ Ш2-Ш2->+альд.-у+Ф 24 0,20

11. К-СОО№-ЭТД-»+янт.ангидр.-»+хлор. тиснил —>+ЭТД->+альд.(5%)+Ф( 1 г/я) 150 1,28

12. Я-СООН+.. .то же.. ,->альд.( 1%) 100 0,85

13. Я-СООН+ЭТД->+янт. ангидр. ->пхлор, тионил -*+Ф(4сут.) 0 0

14. К-СООН+ЭТД~»+янт.ангидр.-»+хлор.тионил —>+ЭТД~И-альд.-И-Ф 170 1,45

15. То же, температура 40-50°С, 30 мин. 50 0,42 .

16. Аналогично 11, концентр, фермента 10"4 моль/л 165 1,86

17. Я-СООН+ ЭТД-») глут.ангидр.-> * хлор, ацетил ->+ЭТД->+альд. ->+Ф 165 1,36

18. Я-СС>ОН+диамин1->+гл)Т.ангидр.—> + хлор.ацетил-»+диамин1->+альд.-»+Ф 165 1,36

Условные обозначения: Я - матрица катеонита; ЭТД - этилсндкаммг; Ф - фермент; альд. -глугаровый альдегид.

Опытами установлено, что оптимальным режимом для ионита КБ-2э-0,5 является проведение иммобилизации в течение 2 часов при 10°С. Каталитическая активность иммобилизованного фермента не изменяется при использовании таких близких по структуре сшивающих агентов, как глутаровый ангидрид, янтарный ангидрид, этилендиамин, диамин.

Применение модифицированного азидного метода иммобилизации глю-коамилазы позволило получить более активный полимерный комплекс фермент - постель: количество связанного белка в 1,5 раза выше, чем при адсорбционной иммобилизации фермента, а удельная активность - в 7,6 раза. Оптимальная температура ферментативного катализа реакции гидролиза крахмала для ковалентно связанной глкжоамилазы (рис.11) - 70°С, что на 10°С выше, чем для адсорбционно связанного фермента Косвенным подтверждением сделанного вывода может служить эксперимент, выявляющий возможность многократного использования связанного фермента

Для его проведения брали по 100 мг полимерного комплекса фермент - КБ-4-10П и фермент - КБ-2э-0,5 (сорбционда и кова-лентно связашюго), помещали в реактор с 10 мл субстрата (1% раствор крахмата) и проводили гидролиз, меняя через каждый час субстрат. В гидролизате определяли содержание глюкозы, количество которой соответствует активности изучаемых образцов. Установлено, что ппокоа-„„ , . , милаза, иммобилизованная кова-

20 « во во лентно, значительно устойчивее,

-Иммобилизация адсорбцией на ионите КБ-2>0,5; ТЭК КЛК ев аКТИВНОСТЬ ПрИ 36......Иммобилизация адсорбцией на «оните КБ-4-10П; КрЭТНОЙ ЗаМСНе СубСТрЭТа CO"

---Иммобилизация модифицированным азидным СТаВЛЯеТ ОКОЛО 50% ОТ ИСХОДНОЙ,

методом на ионите КЕ-2э-0,5. ТОГДД КЭК ДЛЯ КБ-4-10П ОНЭ ИСЧв-

рис- П. зает к 17 замене. Наиболее эф-

фективным методом коваленгного связывания глюкоамипазы на ашюшгге Дуолит A 368PR оказался смешанный - применение глутарового альдегида, этилендиамина, связанный с наращиванием связующего звена между носителем и ферментом (табл. 13).

Таблица 13

Стадии модификации и каталитические свойства полимерных комплексов

№ препарата Стадии модификации" Каталитические свойства"

Количество глюкозы в 1 мл гидролизата, мкг Осахаривающая способность, %

Модификация фермента

1 Ф+глутаровый альдегид 22 0,18

2 Ф+0,1 моль/л ацетатный буфер с крахмалом 50 0,42

3 Ф+изопропиловый спирт 60 0,51

Модификация матрицы

4 Я-+глутаровый альдегид->+Ф 103 0,88

5 R-+янтарный ангидр,ид->+хлористый тионил -»+этилендиамин—>+ глутаровый альдегид->+Ф 175 1,49

6 Я'+глутаровый альдегид-И- хлористый таонил —И-этилендиамия->+ глутаровый альдегид->+Ф 130 1,10

7 Я-+г;гугаровый альдегид~»+ хлористый тионил ->+диаминоамид~»+ глутаровый альдегид-и-Ф 100 0,85

Примечания: Условные обозначения: Я - матрица анионита; Ф - фермент.

Образовавшуюся глюкозу определяли пжжозооксилазным методом, осахаривающую способность - расчетным; активность свободной глюкоамилаш - 4,529 ед'мг белка

Зависимость активности глюкоамипазы,

иммобилизованной адсорбционным и ковалентным методами, от температуры

ед/мг 4,5-,

Предложенный метод ковалентного наращивания "ножки" обеспечивает повышение активности иммобилизованной глтокоамилазы. сн2-со

R-NH +1 )о -> R-NCO(CH2) 2СООН + SOCl2 -> R-NCO <СН2) пСОС1 +

сн2-со

ч\ У>

+ H2N(CH2)2NH2 R-NCO (CH,)2CONH(CH2)2NH2 + ,С-(СНг)3-С

ÍÍ чн

-> R-NCO (СН2) 2СОЫН (СН2) 2N=CH (СН2) зС'Г + Н2М-Ф ->

чн

-> Я-N00 (СН2) 2СОШ (СН2) 2Я=СН (СН2) Зсн=н-Ф

Замена в этой схеме янтарного ангидрида на глутаровый и этилендиа-мина на диаминоамид (препараты 6 и 7) приводит к снижению активности комплекса. Постадийная модификация матрицы по приведенной выше схеме для нескольких стадий подтверждена методом ИК спектроскопии.

Показано, что увеличите расстояния между матрицей носителя и молекулой фермента привело к увеличешпо количества связанного белка в 1,5 раза. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что применение отработанного ашгонита АВ-17-2П для иммобилизации глюкоамилазы глута-ратьдегидным методом способствовало увеличению количества связанного белка по сравнению с использованием в качестве носителя товарного анио-нита увеличилось а 3 раза. Глюкоамилаза, иммобилизованная на ионите АВ-17-2П (400 циклов) модифицированным глутаратьдегидным методом, проявляет оптимальную каталитическую активность при температуре 55°С (для свободного фермента - 40°С), диапазон оптимальных значении рН субстрата для свободного и иммобилизовшшого фермента не изменяется (4,7 - 5,2), фермент сохранял 46% активности нативной глюкоамилазы. Увеличение длины связывающего звена между шшонитом и ферментом, пространственно удаляющего макромолекулу белка от матрицы носителя, уменьшает эффект воздействия химической структуры матрицы.

Анализ результатов экспериментов позволяет заключить, что для получения более активных и стабильных препаратов глюкоамилазы в качестве носителей необходимо использовать иошгг АВ-17-2П, отработавший в условиях сахаро - рафинадного производства 400 циклов, изменегаге физико-химических свойств которого обусловлено многократными процессами сорбции - десорбции меланоидинов и других продуктов щелочного распада инвертного сахара.

ГГри иммобилизации инулазы из Aspergillus awamori 2250 на анионите АВ-26 адсорбционным и глутаральдегидным методами установлено, что ад-сорбционно связанный фермент сохранял 55% активности исходного ферментного препарата, проявлял оптимальную каталитическую активность при 70°С (нативный - при 50°С). Иммобилизация приводит к тому, что сохраняется каталитическая активность при 100°С, в то время как свободный фермент характеризуется температурой инактивации 76°С.

Опыты показали, что ковалентно связанный с иошггом фермент сохраняет 75% активности свободной инулазы. Установлено, что при гдутараль-дегидном способе иммобилизации инулаза проявляет оптимальную каталитическую активность при 70°С, так же, как и при адсорбционной иммобилизации. Причем рН-оптимум иммобилизованной инулазы не зависит от способа иммобилизации и практически не отличается от свободного фермента.

Автоматизация технологического процесса возможна лишь при непрерывном процессе гидролиза, который предполагает применение реакторов колоночного типа. Поэтому изучено влияние многократного использования иммобилизованного фермента в качестве катализатора в реакторе колоночного типа. Стеклянный реактор, изготовленный в лаборатории, представляет собой термостатируемую колонку высотой 20 см и диаметром 1 см. При подготовке реактор промывали ацетатным буфером (рН 4,7), помещали 2 г инулазы, иммобилизованной на АВ-26 глутаральдегидным методом. Содержание фермента в реакторе - 4,4 мг, скорость протока - 1 мл/мин, каталитическая активность колонки - 35 ед. Пропускание субстрата ( концентрация 8,5-10"4 моль/л ) осуществляли по нисходящему потоку. Выявлено, что при 15-кратном использовании каталитическая активность ковалентно связанной инулазы не изменялась. При пропускании раствора инулина через колонку увеличивается время взшшодействия фермента с субстратом, что способствует преодолению диффузионных затруднений и создает более благоприятные условия для образования фермент-субстратного комплекса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при иммобилизации инулазы модифицированным глутаральдегидным методом на отработанном анионите АВ-17-2П фермент сохранял активность почти полностью. Ковалентно иммобилизованная на отработанном анионите инулаза характеризуется более высокой термостабильностыо, она сохраняет 19% каталитической активности даже при 100°С. Сравнивая зависимость каталитической активности свободного и иммобилизован! юго на отработанном анионите фермента от рН субстрата, можно констатировать, что как д ля нативного, так и для ковалентно связанного ферментного препарата диапазон оптимальных значений рН не изменяется. С увеличением скорости протока субстрата через реактор колоночного типа ката-липгческая активность инулазы снижается. Для осуществления реакции гидролиза инулина требуется определенное время для взаимодействия активного центра 1шулазы с функциональными группами субстрата. При скорости 0,25

мл/мин создаются оптимальные условия для получения максимального количества продукта. Применение реакторов колоночного типа с восходящим током субстрата способствует увеличению времени контакта активного центра фермента и молекулы субстрата, что и приводит к увеличению каталитической активности инулазы на 40% по сравнению с реактором колоночного типа с нисходящим током. Результаты наших экспериментов позволяют рекомендовать для получения биокатадизатора производства глюкозо - фруктозных сиропов инулазу, иммобилизованную глутаральдегидным способом на отработанном в сахаро-рафинадном прошводстве анионите АВ-17-2П . Таким образом, при применении иммобилизованной инулазы в промышленности целесообразно использовать термостатируемые реакторы колоночного Tima с оптимальной температурой 70°С и пропускание раствора инулина по восходящему току.

Кииетико-т ермолипамичсекис аспекты катализа свободными н иммобилизованным!» амилазами. Исследование кинетико - термодинамического поведения ферментов, включенных in vitro в искусственные мембраны или связанных с носителями адсорбционным или ковалентным методами, создает пути лучшего понимания функционирования ферментов in vivo, так как ферменты дыхания, белкового синтеза inn активного транспорта включены в субклеточные структуры. На кинетику ферментативного катализа иммобилизованных биокатализаторов оказывают влияние такие факторы, как диффузионные свойства субстрата и продукта, характеристика раствора пограничного слоя и носителя, химический состав и физическое состояние матрицы, локальные концентрации реагирующих веществ, плотность поверхностных зарядов.

В нашей работе установлено, что зависимость скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала и инулина не соответствует уравнению Михаэлнса. При иммобилизации химическими методами глюкоамилазы и инулазы сохраняется олигомерная структура ферментов и сложный характер зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.

Для определения кинетических и термодинамических параметров исследуемых ферментативных реакций применялись графические и расчетные

методы. Иммобилизация глюкоамилазы на ионите Дуолит A368PR модифицированным глутаральдегидным методом приводит к увеличению значения Кт и уменьшению Vmax (табл. 14.).

Это подтверждается результатами экс-

Таблица 14

Значения некоторых кинетических параметров реакции гидролиза крахмала свободной и иммобилизованной на Дуолите A368PR глюкоамилазы

Фермент моль/л мкмолъ/млмин Lo Число субъединиц и

Свободная

глкжоамилаза 7,6-10"7 370 6,69 2

Иммобилизован-

ная глкжоамилаза 1,0-10'6 125 2,1 2

периментов по исследованию каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы (рис. 12.).

Зависимость каталитической активности свободной и иммобилизованной на ионите Дуолит А 368 PR глюкоамилазы от концентрации субстрата

2 4

-Свободная гпкжоамилаза;

моль/л х 10'

-Глюкозмилаза, иммобилизованная на ионите Дуолит А 368 PR.

Установлено, что константа конформацнонного перехода (L0) при иммобилизации глюкоамилазы на Дуолите A368PR уменьшается примерно в 3 раза. Расчетные данные согласуются с характером зависимости скорости реакции от концентрации субстрата для иммобилизованного фермента. Показано, что при иммобилизации глюкоамилазы происходило сглаживание пиков R и Т, однако кинетика реакции гидролиза крахмала иммобилизованным ферментным препаратом не соответствовала уравнению Михаэлиса.

Анализ результатов экспериментов позволяет сделать заключение о том, что ковалентное связывание глюкоамилазы с И01ПГГ0М Дуолит A368PR способствует стабилизации четвер-Рис. 12. тичной структуры фермента и умень-

шению константы конформацнонного перехода га состояния R в состояние Т.

По данным Williamson G. et.al. (1992), молекула глюкоамилазы имеет 2 домена: каталитический (остатки 1-470) и С-концевой (509-616), связанный в области 471-508 аминокислотных остатков с маннозой и содержащий 70% углеводов. Каталитический и крахмалсвязывшощий домены - это отдельные глобулярные белки, разделенные расстоянием ~10 нм. Взаимодействие между доменами происходит за счет О-гликозилированных участков, что обусловливает значительную внутреннюю подвижность. Анализируя данные литературы и результаты наших исследований, можно предположить, что при иммобилизации глюкоамилазы на ионите Дуолит A368PR модифицированным глутаральдегидным способом происходит многоточечное связывание фермента как крахмалсвязывающим, так и каталитическим доменами. Поэтому иммобилизация приводит к уменьшению каталитической активности фермента, повышению стабильности четвертичной структуры и, по-видимому, сопровождается сдвигом равновесия, происходящим при переходе фермента из состояния Т в состояние R. При химических методах иммобилизации могут наблюдаться также незначительные изменения конформа-цни отдельных глобул, которые затрудняют процесс взаимодействия каталитического и крахмалсвязывающего домена.

Влияние концентрации субстрата на каталитическую активность инулазы, иммобилизованной на аниоиите АВ-17-2П

Опыты показали, что зависимость скорости ферментативной реакции гидролиза инулина, осуществляемой инулазой, иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П, от концентрации субстрата не соответствует уравнению Михаэлиса и имеет более сложную конфигурацию (с двумя точками перегиба и двумя плато), чем для нативного ферментного препарата (рис.13.).

При иммобилизации инулазы на АВ-17-2П четвертичная структура сохраняется, но имеет место усложнение кинетики ферментативного катализа, свидетельствующее о том, что при глуг ар альдегидном методе, по-видимому, наблюдаются небольшие изменения конформацш отдельных субьединиц, сказывающиеся на коо-ператпвности взаимодействия в процессе расщепления инулина

Экспериментальные данные позволили определить кинетико-термодинамические параметры ферментативного расщепления инулина свободной и иммобилизованной инулазой графическими и расчетными методами. Показано (табл. 15.), что иммобилизация приводит к увеличешпо Еакг, ДН реакции гидролиза инулина по сравнению с нативным ферментом, что может быть связано с диффузионными затруднениями высокомолекулярного субстрата при подходе к связывающим и каталитическим группам активного центра.

Таблица 15

Значения кинетико-термодинамических параметров реакции гидролиза инулина,

Рис. 13.

Фермент Кп.,10-4 моль/л V * [ШХ> мкмоль/мгмин Еа„, 1 ДН, кДж/молъ кДж/моль кДж/моль-К

Свободная инулаза 3,3 35,7 52,4 4,06 -51,5

Иммобилизованная инулаза 4,2 30,0 63,7 | 8,22 -173

Отрицательное значение ДБ для реакции гидролиза инулина, осуществляемой свободным ферментом, свидетельствует о том, что расщепление полимерного субстрата протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью. При иммобилизации инулазы А5 ферментативного расщепления инулина уменьшается, по-видимому, за счет более направленного взаимодействия фермента с субстратом.

Общая скорость ферментативного процесса, осуществляемого гетерогенными биокатализаторами, определяется скоростью массопереноса субстрата за счет молекулярной диффузии. При исследовании влияния внутри-диффузионного торможения на реакцию гидролиза инулина, осуществляемую инулазой, иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П, показано, что значение Кт>[5] ({8]~6,6-!0~4 моль/л), и в этих условиях реакция протекает на поверхности частицы и подчиняется уравнению:

(9)

где [8о] и [8] - концентрации субстрата в объеме раствора и на поверхности частицы, р - коэффициент массопереноса, V ^ - максимальная скорость реакции гидролиза инулина иммобилизованным ферментом, к'п - константа Михаэлиса для реакции гидролиза инулина иммобилизованным ферментом. Стационарная скорость ферментативной реакции V, наблюдаемая в опыте, вычисляется по формуле (Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К., 1976):

У = (10)

1/ + , /р /Ч»

Из выражений (10) и (11) определили значение 3=0,000005. Показано, что (1« У„„,./К'П{ (У„„/К'„ =0,000071). На этом основании можно считать, что реакция гидролиза инулина протекает намного быстрее, чем диффузия субстрата к функциональным группам активного центра иммобилизованного фермента, и внешнедиффузионное торможение создаст ограничения для сорбции молекул субстрата и приводит к снижению активности иммобилизованной инулазы по сравнению со свободным ферментом.

Нами изучено влияние различных значений рН субстрата на кинетику ферментативной реакции гидролиза инулина, осуществляемой иммобилизованной на АВ-17-2П инулазой. При рН 4,0 динамика изменения скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата практически не изменяется по сравнению с оптимальным значением рН (4,7). При рН 3,0 и 5,5 происходит удлинение предэкспоненциальной фазы реакции.

Обработка экспериментальных данных в координатах (^ Утах; рН), (^ Кт; рН) и позволила подтвердить наше предположение о

том, что в образовании фермент-субстратного комплекса как свободной, так и иммобилизованной инулазы принимают участие р-карбоксидьиая группа глутаминовой и аспарагиновой аминокислот и имидазояьное кольцо гисти-дина, т.к. рКа связывающих и каталитических групп активного центра фермента совпадают с рКа функциональных групп фермент-субстратного комплекса. Однако иммобилизация инулазы приводит к сдвигу рКа карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой аминокислот и имидазолыюй группы гистидина в область больших значений (рКа СООН-групп свободно-

го и иммобилизованного фермента 3,8 и 3,3 соответственно, для имидазола гистидшга - 5,5 и 5,7 соответственно).

Результаты наших экспериментов позволяют сделать заключение о том, что иммобилизация инулазы на шшопите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом сопровождается незначительным сдвигом констант ионизащш СООН-групп аспарапшовой аминокислоты и имидазола гистидииа в сторону больших значений, что и определяет снижение каталитической активности инулазы при иммобилизации.

При иммобилизации происходит изменение микроокружения молекулы фермента, и во многих случаях заранее трудно предсказать результат иммобилизации белка в отношении стабильности. Анализ полученшдх данных позволяет сделать заключение о том, что мочевина, тиомочевина и бензоил-тиомочевина (концентрация 10'6 - 10"3 моль/л) являются смешанными активаторами инулазы, т.е. модифицируют реакцию гидролиза инулина при сочетании конкурентного и неконкурентного типов активирования.

Анализ ИК спектров иммобилизованной инулазы, модифицированной мочевиной и ее производными с хинолино-вым циклом, показывает (табл. 16, 17, 18), что под влиянием мочевины в молекуле фермента уменьшается протяженность р-слоев и сс-спиратей и увеличивается протяженность нерегулярных участков. Полоса поглощения в области 3200-3300 см"! свидетельствует об образова-шш водородных связей

Таблица 16

Содержание типов вторичной структуры нммобилизо-

Конфирмация Нативный фермент Воздействие бен-золтиомочевины

V, см Т,% % У.см' Т,% %

Неупорядоченная структура 1548 36,6 32,4 1548 42,2 33,2

Р-слок 1530 60,0 35,7 1530 40,0 33,5

а-спирали . 1548 35,6 32,4 1548 39,4 32,8

Таблица 17

Содержание типов вторичной структуры иммобилизо-

Конформация Нативный фермент Воздействие мочевины

V, см Т,% % V, см-1 Т,% %

Неупорядоченная структура (5-слои а-спирали 1553 1530 1548 36,6 65,4 62,1 41,1 30,4 29,0 1553 1530 1548 45,5 47,0 47,3 44,3 27,8 27,7

Содержание типов вторичной структуры иммобилизованной инулазы при воздействии тиомочевины

Конформация Нативный фермент Воздействие

тиомочевины

V, см"' Т,% % V, см"1 Т,% %

Неупорядочен- 1553 68,7 45,5 1553 53,3 45,0

ная структура

Р-слои 1530 62,8 27,3 1530 62,0 27,2

а-спирали 1548 68,5 26,3 1548 68,0 26,9

Таблица 18 между Ш-группами мочевины и карбонильными группами аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также с ОН-группами се-рина и треонина, содержание которых в молекуле инулазы, по нашим данным, составляет 27%,

8%, 6% соответственно. Амидная группа мочевины способна "переключать" внутримолекулярные водородные связи белковой молекулы, количество которых определяет степень упорядочешюсти вторичной структуры, на себя, причем деструкция водородных связей в молекуле инулазы должна нарушать и систему гидрофобных взаимодействий боковых групп полипептидных цепей. Кроме NH-групп с молекулой иммобилизованной инулазы взаимодействуют элементы хинолинового цикла, которые образуют слабые связи с неполярными R-радикалами аминокислот по типу гидрофобных сил сцепления. Это предположение подтверждается тем, что в ИК спектрах иммобилизованного фермента, модифицированного бепзоилтиомочевшюй, полоса поглощения 1570 см"1, обусловленная наличием хинолинового цикла, изменяется при взаимодействии модификатора с ферментом.

Полученные данные свидетельствуют о том, что активирующее воздействие мочевины уменьшается при введении в состав молекулы заместителей, которые затрудняют реакции мочевины с внутримолекулярными водородными связями и гидрофобными силами сцепления. Очевидно, мочевина воздействует на гликозилированные участки полипептиднои цепи инулазы, образуя водородные связи с Ser и Thr, вытесняя углеводные компоненты гли-копептида, что приводит к облегчению процесса связывания инулина молекулой фермента и способствует ускорению реакции гидролиза инулина. При исследовании влияния УФ- и у-излучения на стабильность нативной и иммо-Влняние у-иалучения на каталитическую билизованной на ионите АВ-17-2П активность свободной и иммобилизованной инулазы облучение осуществляли

однократно в дозах от 40 до 60 Гр (для у-радиации) и от ,75,5 до 1812 Дж/м2 (для УФ-света). Показано (рис. 14 ), что зависимость каталитической активности свободной и иммобилизованной инулазы носит экспоненциальный характер. При дозах от 40 до 120 Гр процесс инактивации свободного фермента не отличатся от иммобилизованной инулазы. При дальнейшем увеличении дозы (до 160 Гр) при иммобилизации ферментного препарата на отработанном в сахарорафинадном производстве ашюните АВ-17-2П наблюдали сохранение 20% каталитической активности. Нативная инулаза полностью инактивировалась при облучении в дозах 140 - 160 Гр. Эксперименты свидетельствуют о том, что для инактивации как свободного, так и иммобилизованного фермента достаточно одного попадания. Возможной причиной инактивации инулазы

на АВ-17-2П инулазы

А,

Нативный фермекг; Иммобилизованная инулазэ.

Рис. 14.

является развертывание молекулы вследствие разрушения -S-S связей и SH-групи, входящих в состав активного центра фермента.

Изучено влияние УФ-света в дозах от 75,5 до 1812 Дж/м2 на свободную и иммобилизованную адсорбционным и ковалешным способами пнул азу. Час-

Влияние УФ-излучения на каталитическую активность свободной и иммобилизованной на АВ-17-2П инулазы

1200

а*1иг

«00 800 -Нэтквный фермент;

■ Фермент, иммобилизованный адсорбдоонно;

— — — фермент, иммобилизованный ковалентно.

Рис. 15.

тичную инактивацию свооодного фермента мы наблюдали уже при облучении дозами 75,5-453 Дж/м2, при дальнейшем увеличении дозы каталитическая активность инулазы исчезает. Характер связи оказывает значительное влияние на устойчивость иммобилизованного фермеига к УФ излучению, что может быть обусловлено повышением жесткости третичной структуры инулазы при коватснтной сшивке с иони-том, а также влиянием матрицы на диффузию свободно - радикальных продуктов, возникающих при воздействии названных излучений на белковые образцы (рис. 15.).

О механизме действия глюкоамплазы я инулазы. Грибные шокоа-милазы - это гликопротеиды, имеющие мудьтидоменную структуру. Фермент, выделенный га Aspergillus awamori Var. XI00, характеризуется наличием N-терминального домена, состоящего га 440 аминокислотных остатков, О - гли-козилироваиного участка, имеющего 70 аминокислот и С-терминального крах-мачевязывающего домена (100 аминокислот). По данным рештенострукгуркого анализа с разрешением 0,22 - 0,24 нм (Alechin А.Е. et.al., 1994), каталитический домен имеет 2 N - гликозилироваиных участка, причем контакт между N-гликозилированными цепями и полипептидом стабилизируется остатком ман-нозы с помощью водородной связи или ионизированными молекулами воды, чем и определяется стабильность фермента и возможность образования надмолекулярных структур. Наши эксперименты показывают, что глюкоамилаза из Aspergillus awamori имеет четвертичную структуру, представленную димером из двух субъединиц (М.М. 53,6 кДа). Поверхность О-гликозилированного домена характеризуется наличием маннозы, связанной с Ser-453, Ser-455, Ser-459 и Thr-457. Углеводные фрагменты участвуют в связывашш молекул субстрата и его аналогов и локализации молекул НгО, которые определяют взаимодействие одиночных звеньев углевода между собой и способствуют повышению стабильности фермента. О-гликозилированный домен имеет остатки Gly перед и

после С-конца, которые представляют собой изгибы, определяющие взаимодействие крахмалсвязывающего домена с каталитическим и соответствующую ориентацию молекулы субстрата Пгшкозилирование предотвращает скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое связывание.

По мнению ряда авторов (Williamson G. et.al., 1992, Hayashida S. et.al., 1989), в связывании молекул субсграта участвует прежде всего Тгр-120, входящий в состав первого подцентра. При модификации этого аминокислотного остатка с помощью генно-инженерных подходов молекула фермента утрачивала каталитическую активность. Взаимодействие с Тгр-120, участвующем в формировании щели активного центра, приводит к втягиванию молекулы субстрата в щель активного центра и сопровождается искривлением гликозидной связи. Роль функциональных каталитических групп играют Giu-179, Glu-400 и Asp-55. Щель активного центра имеет нескомпенсированный отрицательный заряд, эти группы занимают определенное положение и сольватированы. Молекула субстрата, внедряясь в полость активного центра, перемещает кластер молекул воды из активного центра в менее полярную среду, что благоприятствует ионизации Glu-179. Выведение молекул воды, располагающихся в активном центре, освобождает полость активного центра для молекул субстрата Результаты наших экспертаентов также показывают, что такие ингибиторы, как нитрат, салнцилат и перхлорат днгидрохинолина эффективны потому, что, в отличие от субстрата, уменьшают отрицательный заряд активного центра

Alechin А.Е. et.al. (1994) методом рештенострукгурного анализа определили, что 7 молекул воды связаны с подценгром 1 и 6 из них перемещаются вместе с молекулой субстрата, покцдая активный центр через узкий канат. Тгр-120 играет ключевую роль в стабилизации центров связывания. При фо-тоокислетш глюкоамилазы в присутствии метиленового синего, кроме гис-тидина подвергается воздействию индольное кольцо триптофана и тирозина По нашим данным (табл. 10), эти воздействия не приводят к потере каталитической активности нативного фермента. По-видимому, О - тликозшшро-ванные участки крахмалсвязывающего домена прежде всего взаимодействуют с молекулой субстрата и эффект фотоокисления практически не проявляется. При дегликозшшровании глюкоамилазы и модификащш Тгр-120 каталитическая активность исчезает полностью. При исследовании структуры комплекса акарбозы с глгокоамилазой, включающей 1-471 аминокислотные остатки и 535 центров связывания молекул воды, установлено, что Тгр-120 взаимодействует с подцентрами 1 и 2 и с Glu-179 при помощи водородных связей. Причем связывание глкжозного остатка с подцентром 1 не сопровождается изменением AG, а взаимодействие с подцентром 2 приводит к отрицательному значению AG, что и обусловливает независимое связывание глюкозных единиц субстрата с каждым га подцентров активного центра. Комплексообразование субстрата с "аффинным" сайтом глюкоамилазы

представляет собой нелимитирующие стадии в каталитическом цикле. Взаимодействие с иодцеитрами 1 и 2 способствует изменению конформацин фермента. Если при направленном мутагенезе Asp-55 превращается в Asn, то глюкоамилаза теряет каталитическую активность. Мы предполагаем следующий мехашгзм разрыва а-1,4-гликозидной связи в молекуле крахмала под действием глюкоамилазы. При образовании фермент-субстратного комплекса с участием Тгр-120 и О-гликозилированных участков крахмалсвязы-вающего домена происходит ионизация Asp-55 и Glu-179, причем акцептором протонов является -ОН-группа нередуцирующего конца молекулы крахмала. Напряжение гликозидной связи приводит к появлению конформацин "полукресло" и сопровождается гидролизом. Перенос протона и изменение конформацин фермента обеспечивают физическое ограничение скорости реакции гидролиза крахмала. Фермент-субстратные комплексы могут быть продуктивными и непродуктивными, причем в продуктивном комплексе молекула субстрата занимает 1-ый подцентр, а расщепляемая а-1,4-гликозидная связь располагается между каталитическими группами активного центра. Гидрофобные аминокислотные остатки, выстилающие полость центра, способствуют более жесткой фиксации субстрата.

По результатам наших экспериментов можно сделать заключение, что в состав активного центра инулазы входят карбоксильная группа аспарагино-вой кислоты, имндазольная группа гистиднна и SH-группа цистеина. Механизм расщепления р-2,1-фруктозидной связи молекулы инулина можно представить схемой (рис. 16.). Карбоксильная группа аспарагиновой кислоты в молекуле инулазы ассоциирована с имидазольной группой гистидина водородной связью.

При взаимодействии с инулином (II) имидазольная группа связывается водородной связью с кислородом, соединяющим кольца А и Б субстрата. Происходит также ориентация СОСГ-иона фермента относительно образующегося карбониевого иона в кольце А. В последующем ионы Н+ и ОН" го молекулы воды фиксируются в молекуле фермента на место Н+, потерянного Asp, a Of Г - на карбониевом ионе инулина. Фермент снова принимает строение I. Подобно гистидиновому радикалу могут взаимодействовать с инулином и -SH-группы фермента. Можно также предположить (рис. 17.), что ион Н+ отщепляется от карбоксильной группы Asp и связывается с кислородом, соединяющим кольца А и Б субстрата. В результате связь кислорода с кольцом А разрывается, а углерод, находящийся в положении I кольца А, образует карбониевый ион, который стабилизируется СОО"-групшй аспарагино-кислого остатка фермента. С карбониевым ионом взаимодействует ОН_-ион, доставляемый молекулой воды, а Н+-ион воды фиксируется на место Нойона, потерянного аспарапшовокислым остатком в инулазе. После этого молекулы субстрата покидают фермент, освобождая его для последующей реакции с субстратом.

Схема механизма расщепления Р-2,1 -фруктозидной связи в молекуле инулина

№1 : N

(СН2)г

с = о

н V

-0-Н2Сч ,0г--

/ч \

"01,Я А \.Гн:

НОНС — СН \ н\

/ о.

НОН2С

-срьон

/СН-0\

нс 9й Б сноп

н-он

-0-Н2Сч ■ / он

III

НОН'

(|:н2он /СН-о\

/Сч

я ?

ноне НОН2С

НС /\

но

сн

:н

он

снон /

Схема механизма расщепления [1-2,!-фруктозндной связи в молекуле инулина

.Н

пи

X (СН2)г

O'lhC.

,с.

ноне

НОНС — сн

нон,с

, - н-/

-1

Ч\

н2с

НОНС

ОН"

СУ

НС

(рНгОН

СНОП Т

СН

снон

а Я

сн

он

-сн

нон2с

-О.

сн,

Рис. 17.

{ пц

Таким образом, в расщеплении инулина важную роль играет электро-фильно - нуклеофильная система карбоксил - имидазол. При этом роль нук-леофилыгой группы выполняет азот кольца имидазола, а электрофильной -COOH-группа аспарагинового радикала.

Основные выводы:

1 .Исследованы структурно-функциональные свойства двух амилолити-ческих ферментов в условиях различного микроокружения. Показано, что глюкоамилаза и инулаза - это олигомерные ферменты, имеющие в своем составе две субъединицы, обладающие каталитической активностью. Четвертичная структура амилаз способствует увеличению чувствительности системы гидролиза полисахаридов in vivo.

2. Показано значительное влияние различных заместителей в ряду ди- и тетрагидрохинолинов на иигибиторные свойства по отношению к глюкоа-милазе. Наибольшая степень снижения каталитической активности фермента обнаружена у производных дигидрохинолина, содержащих метальный ради-

ои

готС0°"

кат, а также анионы -N03, и СГ, что может быть обусловлено

увеличением констаттты скорости образования фермент-субстратного комплекса за счет изменения эффективного заряда щели активного центра и появления стерических затруднений при адсорбции молекул крахмала на связывающих функциональных группах.

3. Разработан модифицированный способ глутаральдегидного метода иммобилизации амилаз на ионообменных смолах, заключающийся в попеременной обработке ионита янтарным ангидридом, хлористым тионилом, этилендиамином и глутаровым альдегидом в определенных условиях. Пяти-стадийный процесс наращивания промежуточного звена ("вставки") на ио-ните обеспечивает повышение активности иммобилизованного фермента по сравнению с обычным глутаральдегидным способом в 2 раза и позволяет сохранить мобильность третичной структуры, необходимую для гидролиза полимерного субстрата.

4. Предложен новый носитель для иммобилизации амилаз - анионит АВ-17-2П, отработанный в сахаро-рафинадном производстве в течение полугода в качестве адсорбента красящих веществ. Разработан способ иммобилизации глюкоамилазы на отработанном ионообменнике, отмьггом от красящих веществ щелочными и кислотными водными растворами.

5. В процессе ковалентной и адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы происходит многоточечное связывание как с крахмалсвязывающим, так и с каталитическим доменами, что сопровождается увеличением Кт, уменьшением Vroax и значительным снижением величины константы конформаци-онного перехода (Lo). Показано, что при связывании фермента с носителем кинетика реакции гидролиза крахмала и инулина не соответствует уравнению Михаэлиса, сопровождается сдвигом равновесия при переходе фермента из состояния R в состояние Т.

6. При иммобилизации глюкоамилазы на ионитах адсорбционным и кова-лентным методами наблюдаются незначительные изменения вторичной структуры амилаз, которые приводят к затруднениям процесса взаимодействия активного центра с молекулой полимерного субстрата, уменьшению кататитиче-ской активности иммобилизованных ферментных препаратов.

7. При адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы и инулазы между СОСУ -группами катионита и заряженными поверхностными группами молекулы фермента, а также кластерами молекул воды возникают многочисленные водородные связи, причем наличие О-гликозилированных областей способствует стабилизации комплекса амилаза - ионит.

8. На основании определения величин рК диссоциирующих групп и специфической модификации функциональных групп активного центра инулазы установлено, что в его состав входят одна карбоксильная группа остатка аспарагиновой кислоты, имидазольная группа гистидина и SH-rpynna цистеина.

9. Обнаружено, что ионы Mg2+ и РЬ2+ являются неполными неконкурентными ингибиторами инулазы, катионы Со2+ и Мп2+ активируют фермент по неконкурентному типу. При взаимодействии Mg2+ и РЬ2+ с молекулой инулазы кислород карбонильной группы образует водородную связь с аминогруппой глицина, что и обусловливает большую жесткость третичной

структуры фермента. Ионы Со2+ образуют ковалентную связь с карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот, что и приводит к образование термодинамически более выгодной конформации для осуществления ферментативной реакции.

10. При ковалентной иммобилизащш инулазы на ионообменных смолах имеет место увелтение Еа1СТ реакции гидролиза инулина и ДН по сравнению с нативным ферментом, что связано с диффузионными затруднениями при подходе высокомолекулярного субстрата к функциональным группам активного цешра. При иммобилизащш инулазы AS ферментативного расщепления инулина уменьшается за счет снижения подвижности вторичной и третичной структуры и более направленного взаимодействия молекулы субстрата и активного центра фермента.

11.Изучены активные центры глюкоамилазы и инулазы. В состав активного центра глюкоамилазы, включающего 6 подцентров, входят Asp-55, Gln-179, Gln-400, карбоксильные группы которых осуществляют гидролиз а-1,4-гликозидной связи. В связывании молекул субстрата принимают участие Тгр-120 и О-гликозилированные участки полипептидной цепи. Показано, что взаимодействие инулазы с субстратом приводит к протонировшппо р-2,1-фруктозидной связи и образованию реакционноспособного промежуточного соединен™.

12. При иммобилизации на ионитах повышается стабильность инулазы к денатурирующим факторам различной природы (у- и УФ-голучения, мочевина 8 'моль/л). Характер связи оказывает значительное влияние на устойчивость иммобилизованного фермента к УФ-излученшо, что может быть обусловлено повышением жесткости третичной структуры инулазы при коватентной сшивке с ионитом, а также влиянием матрицы на диффузию свободно-радикатьных продуктов, возникающих при действии излучений на белки.

13. Разработан количественный метод определения токсичности зернового сырья, комбикормов и пищевых продуктов, основанный на снижении активности фермента глюкоамилазы под влиянием экстрактов из кормового сырья и продуктов, зараженных микроскопическими грибами и содержащих микотокснны Ф-2, Т-2, охратоксин А и афлатоксин В[, с помощью которого можно определить присутствие микотоксинов в концентрациях 10"3 - 104 мкг/пробу за 3 - 4 часа.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации

1. К мегодике определения марганца в белково - витаминных добавках // Труды ВНИИКП. -Воронеж, 1970. -Вып.2. -С. 172-175. (в соавт. Степанцев Г. В.).

2. Иммобилизация глюкоамилазы сорбционным методом на ионообменных смолах карбоксильного типа // Теория и практика сорбционных процессов. -Воронеж, 1981. -Вып. 14. -С. 38-41. (в соавт. Мелешко В.П.).

3. Исследование ферментативного комплекса глюкоамилаза - иониг методом ИК-спектроскопии // Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. -Харьков, 1981. -С. 87-88. (в соавт. Клочко-ва Т.А., Углянская В.А., Чикин Г.А.).

4. Иониты - носители биокатализатора в глюкозном производстве // Применение ионитов в промышленности и аналитической химии: Тезисы докладов V Всесоюзной конференции. -Воронеж, 1981. -С. 134-135. (в соавт. Клочкова Т. А., Чикин Г. А., Смирнов В.Б.).

5. Иммобилизация глюкоамилазы физическим и химическим методами на ионообменных материалах // Методы получения и анализа биохимических препаратов: Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции. -Рта, 1982. -ч. 2. -С. 27. (в соавт. Клочкова Т.А., Шмырева Ж.В.).

6. Некоторые свойства полимерного комплекса карбоксильный катионит -глюкоамилаза // Теория и практика сорбционных процессов. -Воронеж, 1982. -Вып. 15. -С. 53-56. (в соавт. Клочкова Т.А., Смирнов В.Б.).

7. Применение метода графов для изучения кинетики катализа свободной и иммобилизованной глюкоамилазой // Труды Ш Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. -Тбилиси, 1982. -С. 240-241. (в соавт. Хайкина И.Е., Чикин Г.А.).

8. Некоторые свойства глюкоамилазы // Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. -Тбилиси, 1982. -С. 242-243. (в соавт. Селеменев В.Ф., Гречкина В.В.).

9. Исследование кинетики катализа крахмала свободной и иммобилизованной глюкоамилазой // Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. -Москва, 1982. -С. 125. (в соавт. Клочкова Т.А., Шмырева Ж.В., Залукаев Л.П.).

10. Катионит КБ-2э-0,5 как носитель глюкоамилазы // Теория и практика сорбционных процессов. -Воронеж, 1983. -Вып. 16. -С. 117-120. (в соавт. Шмырева Ж.В., Клочкова Т.А., Крыгина А.Ю.).

11. Исследование ферментативного комплекса глюкоамилаза - ионит методом ИК спектроскопии // Журн. прикл. спектросошш. -1983. -Т. 38, вып. 2. -С. 247-251. (в соавт. Клочкова Т. А., Углянская В. А., Чикин Г. А.).

12. Механо - химические процессы, сопутствующие поглощению гликопро-тешюв ионитами // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики. -Рига, 1983. -Т. 2. -С. 303-306. (в соавт. Селеменев В.Ф, Чикин Г. А.).

13. Исследование глюкоамилазы с использованием хроматографических методов II Хроматография в биологии и медицине: Тезисы докладов I Всесоюзной конференции. -Москва, 1983. -С. 186. (в соавт. Чикин Г.А., Селеменев В.Ф., Загородний A.A.).

14. Изучение некоторых свойств глкжоамилазы сорбциоииыми и спектральными методами // Теория и практика сорбциошгых процессов. -Воронеж, 1985. -Вып. 17. -С. 58-61. (в соавт. Селеменев В.Ф., Плохих A.M., Гречки-на В.В., Григорьев Е.Ф., Лужков A.M., Загородний А.А.).

15. Модификация аниошгта Дуолпт А 368 PR при ковалентной иммобилизации глкжоамилазы // Теория и практика сорбционных процессов. -Воронеж, 1985. -Вып. 17. -С. 58-61. (в соавт. Шмырева Ж.В., Клочкова Т.А., Крыгина Ю.А., Чикин Г.А.).

16. А. с. 1163639 СССР. Способ получения иммобилизованной глюкоамила-зы / Т. А. Ковалева и др. -4с.

17. Ковалентная иммобилизация глкжоамилазы на некоторых иошггных смолах // Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии: Тезисы докладов VI Всесоюзной конференции. -Воронеж, 1986. -Т. 1. -С. 211. (в соавт. Шмырева Ж.В., Клочкова Т. А.).

18. Иммобилизация глкжоамилазы на ионитах // Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии: Тезисы докладов VI Всесоюзной конференции. -Воронеж, 1986. -Т. 1. -С. 210. (в соавт. Шмырева Ж.В., Клочкова Т.А., Ковяров В.М.).

19. Спектрофотометрический метод определения протеолгггической активности// Ферментная и спиртовая промышленность. -1987. 1. -С. 12-14. (в соавт. Селеменев В.Ф., Загородний А.А., Шамрицкая И.П., Чикин Г.А., Новиков С.А.).

20. Выделение и очистка АТФ с использованием высокоосновтшх анионитои // Труды V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки". -Тбилиси, 1987. -С. 679-682. (в соавт. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А., Логвиновская Т.А., Кардышева А.А.).

21. Иммобилизация глкжоамилазы ковалентным способом на некоторых анионитах // Теория и практика сорбционных процессов. -Воронеж, 1987. -С. 101-103. (в соавт. Шмырева Ж.В., Клочкова Т.А., Примакова Г.М.).

22. Выделение и очистка глкжоамилазы из производственных растворов хроматографическими методами // Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности: Материалы Всесоюзной конференции. -Москва, 1990. -С. 3-4.

23. Исследование структурно-функциональных изменений глкжоамилазы при иммобилизации // Инженерная этимология: Материалы IV Всесоюзного симпозиума. -Вильнюс, 1988. -Ч. 2. -С. 168-169. (в соавт. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А.).

24. А.с. 1641888 СССР / Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов / Т. А. Ковалева и др. -4с.

25. Исследование активного центра и вторичной структуры глюкоамнлазы при различных значениях рН // Кислотно-основной и температурный го-меостаз: физиология, биохимия и клиника: Межвузовский сборник науч-

ных трудов. -Сыктывкар, 1991. -С. 37-42. (в соавт. Башарина О.В., Селеменев В.Ф).

26. Изучение сорбции А'ГФ анионитом АВ-17-2П // Журн. физ. химии, -1991. -Т. 65, № 4. -С. 1131-1136. (в соавт. Селеменев В.Ф., Чеканов В.Н., Логви-новская Т.А., Киселев Ю.И., Шмырева Ж.В.).

27. Отработанные ионигы - носители для иммобилизации ферментов // Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии: Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции. -Воронеж, 1991. -С. 305-306. (в соавт. Селеменев В.Ф., Шмырева Ж.В., Чикин Г.А.).

28. Исследование физико-химических свойств глюкоамилазы при действии ингибиторов // Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. -Сыктывкар, 1991. -С. 52. (в соавт. Шмырева Ж.В., Шихалиев Х.С.).

29. Исследование структуры глюкоамилазы методом ИК спектроскопии // Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. -Харьков, 1991. -С. 134-135. (в соавт. Башарина О.В., Селеменев В.Ф).

30. Laws of structural and functional changes of complex proteins in différent microenvironment // Internationa! organic substances sol vent extraction conférence: Conf. papers. -Voronezh, 1992. -Vol. 2. -P. 229-231 (et.al. Artjukhov V.G., Vashanov G. A.).

31. Биофизика. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1994. -332с. (в соавт. Ар-тюхов В.Г., Шмелев В.П.).

32. Влияние микотоксинов на физико-химические свойства инулазы / Успехи физиологических наук. -1994. -Т. 25, № 3. -С. 41-42.

33. Использование отработанных ионитов для иммобилизации ферментов и в качестве комплекситов // Зеленая книга России: Тезисы докладов Международного научно-практического конгресса "Экология России". -Москва, 1994. -Ч. IV. -С. 67. (в соавт. Селеменев В.Ф., Хохлов. В.Ю., Чикин Г.А., КотоваД.Л.).

34. Иммобилизация как способ регуляции структурно-функциональных свойств инулазы // Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах: Материалы международного симпозиума. -Москва-Суздаль, 1995. -С. 50 (в соавт. Орлова Н.Е.).

35. Хроматографическое разделение пигментов глюкоамилазного производства и безотходная технология // Состоя! ше и проблемы экосистем Среднего Подонья. -Воронеж, 1994. -С. 25-29. (в соавт. Селеменев В.Ф, Башарина О.В.).

36. Иммобилизация аминоацилазы на ионообменных смолах // Кислотно-основной и температурный гомеостаз: физиология, биохимия и клиника: Материалы Всероссийской конференции. -Сыктывкар, 1994. -С. 103-108. (в соавт. Селеменев В.Ф, Небольсина Е.В.).

37. Об особенностях строения и механизма действия инулазы // Физико -химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы международного симпозиума. -Воронеж, 1995. -С. 68-72. (в соавт. Се-леменев В.Ф., Шмырева Ж.В., Эфрон Б.Я.).

38. Сорбция нуклеиновых кислот неионогешгым сорбентом "СТИСОРБ-1БП" // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы международного симпозиума. -Воронеж, 1995. -С. 126-131. (в соавт. Селеменев В.Ф., Орос Г.Ю., Стукалов О.Н., Чикин Г.А.).

39. Поглощение продуктов щелочного распада анионитом AB-17 // Труды биологического учебно-научного центра Воронежского госуниверситета "Веневитиново". -Воронеж, 1996. -Вып.8. -С. 157-160. (в соавт. Чикин Г.А., Селеменев В.Ф., Сапожкова А.Н., Железной С.А., Казначеев A.B.).

40. Immobilization of amylolytic enzymes on the iones changing rosins // Molecular order and mobility in polimer système: Abstr. 2nd International symposium. -S.-Petersburg, 1996. -P. 158. (et.al. Selemenev V.F., Shmyreva G.V.).

41. Безотходная технология и разделение пигментов глюкоамилазного производства // Геоэкологические проблемы устойчивого развития городской среды. -Воронеж, 1996. -С. 210-211. (в соавт. Селеменев В.Ф.).

42. Влияние активаторов на структурно-функциональные свойства иммобилизованной инулазы // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Материалы второго международного симпозиума. -Пущино, 1997. -Т. 2. -С. 48-50. (в соавт. Кожедуб C.B., Колаева O.A., Шмырева Ж.В.).

43. Сорбция лроизводш.1х имидазола, тетрапиримидина и гексагидропири-миднна пористым ашюнитом АВ-17-2П // Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов: Тезисы докладов 8°" Всероссийской конференции. -Воронеж, 1996. -С. 179-180 (в соавт. Орос Г.Ю., Селеменев В.Ф., Сапожкова А.Н., Железной С.А., Чикин Г.А.).

44. Влияние 2,2,4-триметилгидрохинолинов на комплекс фермент - ионито-вая смола // Физико-химические основы и практическое примените ионообменных процессов: Тезисы докладов 8ой Всероссийской конференции. -Воронеж, 1996. -С. 238-239 (в соавт. Шмырева Ж.В., Селеменев В.Ф.).

45. Имины ряда 2,3-дитиол-1-тионов дигадрохинолина // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: Материалы VI Всероссийской конференции. -Саратов, 1996. -С. 162. (в соавт. Шмырева Ж.В., Потапов С. JO., Пономарева Л.В., Олейникова Р.П., Воробьева Р.П.).

46. 2,2,4-тр1шетилгидрохинолины как синтоны для создания биологически активных веществ // Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств: Тезисы докладов научной конференции. -С.-Петербург, 1996. -С 75.

47. Циклические процессы ферментативной кинетики // Циклы природы и общества: Материалы Пятой Международной конференции. -Ставрополь, 1997. -С. 197-198. (в соавт. Бирюк Н.Д., Селеменев В.Ф.).

48. Исследование условий иммобилизации глюкоамилазы на ионообменных смолах // Кислотно-основной и температурный гомеостаз: физиология, биохимия и клиника: Материалы III Всероссийской конференции. -Сыктывкар, 1997. -С. 77-80. (в соавт. Шмырева Ж.В., Селеменев В.Ф.).

49. Влияние ионов Са21" на физико-химические свойства глюкоамилазы // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы II Международного симпозиума -Воронеж, 1998. -С. 112-116.

50. Моделирование трехкомпонентной ферментативной реакции // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы II Международного симпозиума. -Воронеж, 1998. -С. 32-35. (в соавт. Бирюк Н.Д.).

51. Кинетико-термодинамические аспекты катализа полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами // Theoretical Biophysics. International school: Abst. -Moscow, 1998. -P. 134.

Типография ВГУ. Тираж 100 экз. Заказ № 76-98

Информация о работе

Ковалева, Тамара Андреевна
доктора биологических наук
Воронеж, 1998
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы