Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов

Трофимова, Ольга Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов"

На правах рукописи

Трофимова Ольга Дмитриевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА РЕАКЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2004

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор КОВАЛЕВА Тамара Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор биологичеких наук, профессор ЕПРИНЦЕВ Александр Трофимович

кандидат биологических наук, ассистент ШКУТИНА Ирина Викторовна.

Ведущая организация:

Московский государственный университет

Защита диссертации состоится 2 июля 2004 г. в /Уг.на заседании диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете (394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан '. ЖЮ4 г.

совета г /Уу

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов широко используются гидролитические ферменты микроорганизмов, характеризующиеся более высокой активностью и низкой себестоимостью по сравнению с гидролазами растительного и животного происхождения. Выявление особенностей структуры и функционирования липолитичеких ферментов становится особенно актуальным в связи с их биологической ролью, а также предоставляет новые возможности для создания катализаторов с целью их дальнейшего эффективного применения в различных отраслях промышленности и в качестве медицинских препаратов.

В настоящее время в лабораториях научно-исследовательских институтов разрабатывается новая прогрессивная технология - катализ с использованием иммобилизованных ферментов, которые имеют ряд преимуществ перед растворимыми катализаторами в связи с более высокой стабильностью по отношению к денатурирующим факторам окружающей среды. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и способ связывания, можно значительно уменьшить неблагоприятное воздействие матрицы носителя на структуру белка и повысить тем самым его ценность как биокатализатора.

Возрастающие масштабы использования липаз в биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в качестве которого в настоящей работе служит микромицет Rhizopus japonicus 1403. Для решения проблем регулирования биологических свойств липазы необходимо детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств фермента, особенностей его структурной организации, раскрытие молекулярного механизма реакции превращения субстрата.

Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета, входящей в координационный план научно-исследовательских работ РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:

• разработка эффективной методики выделения и очистки липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403;

• исследование особенностей надмолекулярной организации изучаемого фермента методами гель-хроматографии, электрофореза и атомно-силовой микроскопии;

• создание гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной модифицированным глутаральдегидным способом на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анионите АВ-17-2П;

изучение физико-химических и кинетико-термодин;

БИБЛИОТЕКА

СПетср] оэ

гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой;

• выявление оптимальных технологических режимов функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия;

• идентификация функциональных групп каталитического и субстрат-связывающего центров в молекуле липазы;

• описание молекулярного механизма разрыва сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.

Научная новизна.

• разработан эффективный метод получения гомогенного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки;

• впервые обнаружена четвертичная структура у липолитического фермента семейства Мисогасеае, выявлены физико-химические свойства и природа взаимодействия субъединиц;

• создан новый гетерогенный биологический катализатор.на основе липазы, иммобилизованной на отработанном в сахаро-рафинадном.производстве анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом;

• изучено строение активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 методами Диксона, химической модификации специфическими реагентами и фотоокислением в присутствии метиленового голубого;

• на основании экспериментальных данных и при использовании программы MolScript описан молекулярный механизм реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus ja-ponicus 1403.

Практическая значимость. Получен гомогенный препарат липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой, гидролитической активностью. Изучение особенностей надмолекулярной организации липазы позволяет расширить представления о механизмах регуляции функциональных свойств ферментов in vivo. Создан гетерогенный биокатализатор с ковалентно иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П липазой, выявлены оптимальные условия его функционирования. Разработанные технологические режимы работы реактора непрерывного действия с полученным гетерогенным катализатором позволяют рекомендовать его для применения в промышленных масштабах. Результаты исследования строения активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 и молекулярного механизма каталитического гидролиза сложноэфирных связей расширяют и углубляют представления о закономерностях функциони-рованни эстераз семейства Мисогасеае.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на IV Международном симпозиуме «Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пушино, 2001); XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001); Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001); Международной научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); 2м Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), 8th Conference ofIntemational Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 9 статей и 11 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Нативная молекула липазы из Rhizopus japonicus 1403 функционирует в виде димера, образованного в результате гидрофобных взаимодействий между двумя субъединицами фермента, находящимися в «открытой» конформа-ции.

2. Разработан модифицированный метод ковалентной иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П, полученный препарат является эффективным биокатализатором и может быть рекомендован для применения в промышленной технологии.

3. Функционально значимые аминокислотные остатки субстратсвязы-вающего и каталитического центров, а также их микроокружения для липаз рода Rhizopus являются идентичными и входят в состав консервативных участков первичных структур гидролаз данной группы.

4. Схема молекулярного механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 156 страниц машинописного текста; состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы (177 источников) и приложения. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 19 таблиц; в Приложении 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Современные представления о липолитических ферментах

В разделе представлен анализ данных литературы об основных продуцентах, особенностях структурной организации и физико-химических свойств ли-политических ферментов.

Глава 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических ферментов

Рассматриваются наиболее эффективные методы иммобилизации липаз,, их теоретическое и практическое значение.

Глава 3. Объекты и методы исследований

Объекты исследований

Объектом исследования служил фермент липаза (триацилглицерол ацил-гидролаза, КФ 3.1.1.3), выделенная из микромицета Rhizopus japonicus 1403 на кафедре микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии. В качестве субстрата использовали трибутирин, эмульгированный с равным объемом 2 % раствора поливинилового спирта.

Методы исследований

Определение каталитической активности липазы проводили спектрофо-тометрическим методом, основанным на измерении оптической плотности окрашенных продуктов взаимодействия основной формы цветного реагента родамина 6Жв бензоле и карбоновых кислот (в данном случае — бутановой), освобождающихся в ходе гидролиза триглицеридов.

Определение количества белка в препарате растворимой липазы осуществляли методом Лоури.

Определение количества белка в препарате иммобилизованной липазы проводили модифицированным методом Лоури.

Выделение и очистка препарата липазы. Культивирование микромицета Rhizopus japonicus 1403 осуществляли глубинным способом. Препарат липазы получали путем ультрафильтрации культуральной жидкости на мембране УАМ-30, осаждения 70 % ацетоном, гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Гомогенность полученных ферментных препаратов контролировали путем электрофореза в полиакриламидном геле по методу Дэвиса.

Определение кажущихся молекулярных масс Фермента проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150 и электрофореза по методу Дэвиса.

Регистрацию инфракрасных спектров поглощения липазы осуществляли на ИК-спектрофотометре Specord M-80 в диапазоне 4000-400 см"1. Образцы готовили методом прессования с избытком КВг.

Визуализацию пространственной структуры молекул белков на основе данных рентгеноструктурного анализа осуществляли с помощью программ Мо-lAuto и MolScript (P. Kraulis, 1991) при использовании VRML-plugin в Internet Explorer (Windows).

УФ-облучение растворов липазы проводили при непрерывном перемешивании в термостатируемой' кювете с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм на расстоянии 10 см с интенсивностью 0,15 кДж/м2 в 1 мин.

Исследование поверхности молекул липазы осуществляли методом атом-но-силовой микроскопии на приборе Nanoscope Ш.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ "Statgraphics". Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

Глава 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препарата липазы из Rhizopus iaponicus 1403

Для получения препарата экзолипазы из Rhizopus japonicus 1403 культивирование продуцента проводили глубинным способом в колбах объемом 500 мл в 100 мл питательной среды на рефрижераторной качалке с частотой вращения 180 об/мин. Начальное значение рН среды 7,0; рациональный режим культивирования: температура выращивания 30 °С, продолжительность 72 чг

Установлено, что для наиболее эффективного осаждения липазы из экстракта микромицета целесообразно использовать 70% раствор ацетона при рН экстракта 6,5, в этом случае наблюдается максимальный выход фермента (49,8 %) и наибольшая каталитическая активность (569,0 ед/мг).

Предварительная ультрафильтрация на мембране УАМ-30 обеспечила концентрирование культуральной жидкости в 5 раз, удельная активность на данной стадии составила 1396 ед/мг, степень очистки - 10,3.

Для изучения физико-химических свойств и молекулярных механизмов функционирования ферментов необходимо проводить эксперименты с высоко-очищенными препаратами. В этой связи был разработан эффективный способ очистки липазы, включающий стадии гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Результаты по очистке липазы Rhizopus japonicus 1403 представлены в таблице 1. Достигнута 74,7-кратная очистка изоформы I и 58-кратная очистка изоформы П, с выходом по активности 8,38% и 14,15 % соответственно/Гомогенность полученных фракций подтверждена методом электрофореза. Молекулярные массы изоформ I и П липазы составили 91±2,0 кДа и 95± 2,0 кДа соответственно.

В ходе исследования физико-химических свойств полученного препарата липазы установлено, что оптимальными условиями гидролиза триглицеридов являются: температура катализа 37 *С; рН - 6,5. Показано, что кинетика ферментативного расщепления трибутирина не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Кривая V(S) характеризуется сигмоидной формой, что позволяет сделать предположение о наличии четвертичной структуры в молекуле липазы Rhizopus japonicus. Оптимальная концентрация трибутирина для исследуемого фермента составляет 1,75*10" моль/л. Для характеристики реакции гидролиза

трибугирина были определены значения Кт и Упкд., которые составили 3,22*10 моль/л и 71,42 мкмоль/мин соответственно.

Таблица 1

Очистка внеклеточной липазы Шшориэ japoшcus 1403

Этапы очистки Количество белка, мг Активность липазы Выход, % Степень очистки

удельная, ед/мг обшая, ФЕ по активности по белку

Фильтрат куль- туральной жидкости 784 135,5 241732 100 100 0

Ультрафильтрация - на мембране УАМ-30 500 400 200000 82,74 28,03 2,95

Осаждение ацетоном 70 1396 97720 40,43 3,92 10,30

Гель- фильтрация в-150 44 1707 75108 31,07 2,47 12,60

Хроматография на ДЭАЭ-52 I 2,0 10125 20250 8,38 0,11 74,72

И 3,6 7859 28292 14,15 0,20 58

Глава 5. Исследование особенностей строения активного центра липазы

КЬгёорш 1арошсш

Для идентификации функциональных групп активного центра липазы КЫгорш ]арошсш 1403 были использованы следующие методы: 1) определение значений рК ионизирующихся. групп фермента и фермент-субстратного комплекса; 2) фотоокисление липазы в присутствии красителя метиленового голубого; 3) химическая модификация фермента специфическими реагентами; 4) метод ИК-спектрофотометрии.

Графическая обработка данных в координатах от значения

рН позволила определить константы ионизации функциональных групп активного центра липазы: рКЕ1=6,5; рК£2=7,5. Найденное значение рКе1=6,5 соответствует рК имидазольной группы гистидина.

Фотоокисление в присутствии метиленового голубого (МГ) позволяет выявить наличие в активном центре фермента аминокислотных остатков с ароматическими радикалами. При повышении дозы УФ-облучения в диапазоне 1,56,0 кДж/м2 наблюдается частичная инактивация липазы, усиливаемая в присутствии метиленового голубого. С увеличением значения рН происходит возрастание величины константы скорости фотооинактивации (И) фермента, а в диапазоне рН 6,0-7,0 кривая выходит на плато, что свидетельствует о разры

ве имидазольного кольца гистидина вследствие УФ-модификации.

Для подтверждения предположения о возможности участия ОН-группы серина в реакции гидролиза липидов было изучено влияние фенилметилсуль-фонилфторида (ФМСФ) на каталитическую активность липазы. Анализ экспериментальных данных по химической инактивации липазы ФМСФ и по определению стехиометрии реакции взаимодействия фермента с данным реагентом (рис. 1А) позволяет заключить, что 1 моль ФМСФ вызывает полную инактивацию 1 моль липазы, следовательно, при взаимодействии молекулы фермента с модификатором блокируется одна функциональная группа серина.

Увеличение К, реакции гидролиза триглицеридов в присутствии ФМСФ свидетельствует о конкурентном механизме ингибирования липазы и, следовательно, о вхождении гидроксильной группы серина в состав, субстрат-связываюшего центра липазы. При сравнении ИК-спектров нативной липазы и комплекса липаза - ФМСФ обнаружено, что количество а-сгшралей, Р-структур и неупорядоченных участков изменяется незначительно, об этом также свидетельствует отсутствие сдвигов в полосе амид П в сторону более высоких энергетических уровней. Результаты экспериментов по химической модификации и данные ингибиторного анализа позволяют заключить, что нуклеофильная группа серина играет ключевую роль на начальном этапе катализа - закреплении молекулы триглицерида в оксианионной щели глобулы липазы.

Для исследования роли карбоксилов в липолизе использовали метод химической модификации липазы дициклогексилкарбодиимидом. Эксперименты по исследованию кинетики инактивации липазы данным реагентом проводили по той же схеме, как в случае с ФМСФ. Выявлено (рис. 1В), что 1 моль модификатора полностью инактивирует 1 моль липазы, следовательно, в расщеплении эфирной связи в молекуле триглицерида участвует одна функциональная группа аспарагиновой кислоты.

Неконкурентный тип ингибирования липазы карбодиимидом также указывает на химические изменения в районе функциональных групп активного центра. ИК-спектры комплекса липаза-карбодиимид не отличаются достоверно от таковых немодифицированного фермента, соотношение типов вторичной структуры также не изменяется в сравнении с нативной формой препарата, это позволяет нам заключить, что карбодиимид избирательно блокирует остаток аспарагиновой кислоты каталитической триады липазы Rhizopus japonicus.

Для исследования роли кальция в ферментативном катализе было изучено влияние ЭДТА, связывающего ионы двухвалентных металлов, на кинетические параметры реакции гидролиза триглицеридов. Обнаружено, что ЭДТА является неконкурентным ингибитором липазы. Эксперименты по термической инактивации фермента в присутствии ЭДТА подтвердили значительный вклад ионов кальция в термостабильность липазы. Показано, что при внесении раствора СаС^ в реакционную смесь липолитическая активность фермента полностью восстанавливалась, чему способствовало, по-видимому, возвращение иона металла в состав Са-связывающего домена молекулы фермента.

Рис. 1. Стехиометрия инактивации липазы ШнгориБ japoшcus фенилметал-сульфонилфторидом (А) и дициклогексилкарбодиимидом (В)

При сравнении ИК-спектров нативного препарата липазы, и в присутствии ЭДТА установлено, что количество а-спиралей в молекуле фермента снижается по сравнению с немодифицированной формой белка, содержание р4-структур изменяется незначительно, также наблюдается увеличение доли неупорядоченных участков, о чем также свидетельствует наличие сдвигов в полосе амид II в сторону более высоких энергетических уровней (табл. 2).

Таблица 2

Содержание типов вторичной структуры в иативной липазе и липазе после инкубации с ЭДТА (2,2 ГО"2 моль/л)

Конформация Фермент

Нативная липаза Липаза + ЭДТА (2,2 10"2 моль/л)

V, см"1 В % V, см"1 В %

а-спирали 1640 0,549 17 1641 0,408 .14

р-структуры 1720 0,345 44 1695 0,266 44

неупорядоченные участки 1660 0,548 39 1658 0,401 42

Наблюдаемые явления можно объяснить важным вкладом ионов Са в поддержание нативной конформации липазы КЪкориуарошсш.

Глава 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы

КМгорт 1арошст 1403 При сочетании методов гель-хроматографии, электрофореза в полиакри-ламилном геле и атомно-силовой микроскопий (рис. 2) показано, что молекула

липазы Rhizopus ]арошсш является димером и содержит 2 субъединицы с молекулярной массой 46±2 кДа каждая.

ил—►¿¡53 0 еов 1,00 3<0в "т

А В

Рис. 2. Исследование четвертичной структуры липазы КЬиорш ]арошсш 1403. А - электрофореграммы липазы и ее субъединицы; В - АСМ-изображение поверхности молекулы липазы, иммобилизованной на слюде (размер кадра 30x30 нм).

Каталитическая активность отдельных протомеров значительно ниже значения активности нативного фермента, что указывает на важный вклад четвертичной структуры в регуляцию молекулярных механизмов реакции гидролиза триглицеридов. ИК-спектр субъединиц с молекулярной массой 46 кДа не претерпевает значительных изменений, что свидетельствует об отсутствии нарушений структуры при расхождении протомеров. Незначительные смешения полос амид I и амид П в область более низких энергий и уменьшение интенсивности их колебаний может свидетельствовать об уменьшении числа водородных связей, участвующих в стабилизации вторичной структуры мономерной формы липазы.

Для определения химической природы взаимодействий между субъединицами липазы было осуществлено ковалентное связывание протомеров фермента глутаровым альдегидом. Функциональные группы глутарового альдегида реагируют с аминогруппами боковых цепей лизина, располагающихся на поверхности субъединиц липазы. Следовательно, высока вероятность введения дополнительных поперечных связей в области межсубъединичных контактов. Исследование каталитической активности модифицированной липазы показало, что ее значение понижается на 73 %, что позволяет предположить, что в процессе димеризации липазы участвуют две белковых глобулы, находящихся в «открытой» конформации, взаимодействия между протомерами имеют гидрофобную природу.

Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из КЬгёорш |арошсш 1403 на анионите АВ-17-2ГТ модифицированным глутаральдегидным методом Химические методы иммобилизации ферментов в настоящее время являются доминирующим способом получения гетерогенных биокатализаторов, так как при этом фермент не переходит в раствор даже при длительном применении в непрерывной промышленной технологии. Химическая и механическая стойкость стиролдивинилбензольных смол является основанием для поиска путей их использования в качестве твердых носителей липаз. Наряду с карбоксильными катионитами слабоосновные аниониты на базе стирола и ди-винилбензола образуют высокоактивные полимерные комплексы. Ковалентная иммобилизация липазы на анионите АВ-17-2П осуществлялась модифицированным глутаральдегидным, методом, который заключается в следующем. Матрица анионита последовательно обрабатывается янтарным ангидридом, хлористым тионилом, этилендиамином и глутаровым альдегидом и далее проводится иммобилизация фермента. Схема иммобилизации: со

Ъ -«- Я—ЫСО(СН 2)2СООН ♦ вОС1 2 -к— ЫСО(СН })гСОС1 ♦

со

* Н2М(СН2)2МН2 -— Я-МСО(СН 2)2СОМН(СН 2ЬЫН2 ^С—(СН2)з-С^ -

н н

-»- Я—ИСО(СН з)2СОЫН(СИ 2)2М=СН(СН 2>з-С^ ♦ -Ф

где Я - полимерная матрица, Ф - остаток молекулы белка Увеличение расстояния между матрицей носителя и молекулой фермента приводит к увеличению количества связанного белка, и, следовательно, к повышению каталитической активности иммобилизованного фермента. Кроме того, полученная «ножка», с одной стороны, дает ферменту возможность образования прочной связи с носителем, а с другой - способствует увеличению числа степеней свободы третичной структуры, ответственной за каталитическое превращение молекул субстрата. Иониты, проработавшие в технологических процессах по очистке промышленных продуктов, теряют свои ионообменные свойства и приобретают свойства амфотерного ионообменника за счет необратимого поглощения меланоидинов - продуктов взаимодействия сахара и аминокислот. Смола АВ-17-2П представляла для нас наибольший интерес как отработавшая максимальное количество циклов. Закрепление меланоидинов на ОН-форме высокоосновных анионитов может быть обусловлено как их механическим «перепутыванием», так и за счет образования ковалентных связей между сорбатом и сорбентом.

Показано, что иммобилизованный фермент сохраняет 23 % активности по сравнению с нативной формой липазы.

Изучение оптимальных условий функционирования разработанного гетерогенного биокатализатора показало, что при иммобилизации липазы опта

мальная температура гидролиза трипшшеридов повышается на 3 *С и составляет 40 *С, оптимум рН сдвигается вправо на 0,5 единиц и составляет 7,0 единиц. Эти данные позволяют нам сделать вывод, что при ковалентном связывании липазы с анионитом АВ-17-2П повышается термостабильность фер мента и происходят изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов ферментативной реакции.

Исследование кинетико-термодинамических аспектов ферментативных реакций липолиза в условиях регуляции скорости с помощью различных физико-химических факторов позволяет выяснить особенности поведения липо-литических ферментов при нормальном функционировании клетки, а изучение особенностей ферментативного катализа иммобилизованными ферментами необходимо для выявления механизмов действия мембраносвязанных ферментов, олигомерных белков и полиферментных систем, сконструированных по модульному принципу. В этой связи была исследована зависимость скорости ферментативной реакции гидролиза трибутирина от концентрации субстрата растворимой и иммобилизованной липазой. Сигмоидная форма кривой подтверждает сохранение четвертичной структуры липазы при кова-лентном связывании с носителем. Усложнение кинетики ферментативного катализа может свидетельствовать о том, что при глутаральдегидном методе иммобилизации наблюдается небольшое изменение конформации отдельных субъединиц, сказывающееся на кооперативности взаимодействия в процессе расщепления субстрата. Уменьшение значения Кт при ковалентной иммобилизации липазы на анионите АВ-17-2П свидетельствует о более прочном связывании фермента с молекулой субстрата, в ходе образования фермент-субстратного комплекса

Для исследования термодинамических характеристик гидролиза субстрата растворимой и иммобилизованной на АВ-17-2П липазы были проведены эксперименты по термической инактивации фермента. Инактивацию фермента характеризовали константами скорости первого порядка К,ш (с*1), которые определяли из полулогарифмических анаморфоз кинетических кривых изменения активности фермента во времени в координатах Аррениуса 1п(А/Ао)/т, где Ао и А - активности липазы в начальный момент времени (т) и после частичной инактивации.

Показано (табл. 3), что иммобилизация липазы приводит к увеличению значений энергий активации и энтальпии активации гидролиза по сравнению с растворимой формой фермента. Это свидетельствует о затруднении процесса перехода иммобилизованного фермента в каталитически активную кон-формацию под действием субстрата, и таким образом, о снижении скорости ферментативного гидролиза триглицеридов.

Отрицательные значения Л8 для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, позволяют заключить, что расщепление эфирных связей трибутирина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью. При иммобилизации липазы абсо

лютное значение Д5ап. возрастает незначительно, видимо, за счет более направленного взаимодействия фермента с субстратом.

Таблица 3

Значения кинетико-термодкнамических параметров реакции гидролиза трибутирина, катализируемой свободной и иммобилизованной на АВ-17-2П

липазой

Фермент Кщ, ммаль/л ^щах, ммоль/мин Еакт, кДж/моль дн, кДяс/моль- ДБ, кДж/моль.К

Свободная липаза 3,22 71,42 23,54 2,62 -8,39

Иммобилизованная липаза 1,56 37,04 30,70 4,01 -8,56

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что связь молекулы липазы с полимерной матрицей носителя приводит к затруднениям перехода иммобилизованного фермента из неравновесного состояния в равновесное по сравнению со свободной липазой и удлинению лимитирующей стадии ферментативного катализа.

Основное преимущество ковалентно связанных ферментов проявляется в возможности их многократного использования в производственных процессах или аналитических целях. Автоматизация технологического процесса возможна лишь при непрерывном процессе гидролиза, который предполагает применение реакторов колоночного типа. Катализаторы на основе иммобилизованных липо-литических ферментов используются в той или иной мере в ряде крупномасштабных промышленных производств. В этой связи исследовано влияние многократного применения иммобилизованной липазы в реакторе колоночного типа.

Стеклянный реактор, изготовленный в лаборатории, представляет собой термостатируемую колонку высотой 12 см и диаметром 1,6 см. Показано, что оптимальными условиями функционирования иммобилизованной липазы в колонке являются: t=45 °C; pH=7,0; S=0,75 ммоль/л. При многократном применении полученного биокатализатора достоверного снижения активности не наблюдалось.

Большое значение при использовании реакторов непрерывного действия имеют технологические режимы: скорость и направление протока субстрата. Анализ эклериментальных данных по влиянию технологических режимов на скорость гидролиза триглицеридов позволяет нам заключить, что для применения иммобилизованной на анионите АВ-17-2П липазы Rhizopus ]арошсш в промышленных масштабах целесообразно использовать следующие условия: t =45 °С; рН=7,0; пропускание субстрата по восходящему току со скоростью 2,5 мл/мин.

Глава 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного гидролиза триглииеридов

Для выявления консервативных областей первичных структур липоли-тических ферментов узкой.группы мы осуществили сравнительный анализ аминокислотных последовательностей некоторых липаз семейства Мисогасе-ае: КМгошисог ш1еИе1, КМгорш шуеш, Rhizopus aггhizus, К^орш oгyzae.

Обнаружено, что первичные структуры рассматриваемых четырех белков гомологичны на 61,5 %. В состав консервативных областей аминокислотных последовательностей рассматриваемых.липаз входят следующие компоненты: остатки 8ег145 (здесь и далее указывается порядковый номер остатка для молекулы липазы К^орш шуеш), выполняющие в каталитической триаде функцию связывания фермента с субстратом; Ьеи146, являющийся составным элементом оксианионной щели (наряду с ТЪг83, располагающимся у большинства плесневых эстераз у основания домена-«крышки»), остатки аспарагино-вой кислоты 254 и гистидина 258, осуществляющие разрыв сложноэфирных связей в молекулах триглицеридов. Показано, что 6 остатков цистеина, участвующие в образовании дисульфидных мостиков, занимают фиксированные позиции, а для трех липаз рода К^орш входят в состав гомологичных участков цепи.

Для детального анализа трехмерной структуры полипептидов необходимо использование таких информативных биофизических методов, как рентге-ноструктурный анализ, ИК-спектрофотометрия, дисперсия оптического вращения и ряда других. Для дополнения и детализации данных, полученных методом ИК-спектрофотометрии, мы использовали результаты РСА молекулы липазы К^орш шуеш (М. КоИпо е! а1. 1998), визуализацию которых осуществляли с помощью программы Мойспр!

Анализ полученных данных позволяет заключить, что липаза К^орш шуеш (как и другие представители эстераз рода К^орш) относится к группе а/р-белков и содержит 10 а-спиралей. Элементы Л-структуры фермента характеризуются разнообразием подтипов: 13 р-тяжей, 3 Р-листа, 4 Р-выступа и 29 Р-поворотов. В пространственной укладке белковой глобулы участвуют также 3 у-поворота,. ряд Р-тяжей образуют с а-спиральными участками рар-блоки. Стабилизацию нативной конформации липазы обеспечивают 3 дисульфидные связи. Высокое содержание в молекуле фермента р- и у-поворотов с преимущественно полярными аминокислотными остатками также благоприятствует компактизации глобулы, кроме того, способствует увеличению гидрофильных свойств поверхности молекулы.

Для подтверждения и дополнения результатов экспериментальных исследований по идентификации функциональных групп каталитического центра с помощью программы Мо18спр1 2.1 на основе данных РСА созданы трехмерные изображения субъединицы молекулы липазы микромицета К^орш шуеш. Молекула фермента состоит из 269 аминокислотных остатков, образующих центральный домен и домен-«крышку» (остатки 84-97). Гидрофиль

ное микроокружение липазы обеспечивается 230 молекулами воды, строго ориентированными вдоль поверхности белковой глобулы. Показано, что активный центр фермента располагается в полости (-1,3 нм) и представлен остатками Serl45, Шз258 и Asp204 - каталитической триадой. Serl45 находится между первым 0аР-блоком и 5-й а-спиралью, His258 входит в состав 10-й а-спирали, Asp204 участвует в формировании 18-го |3-поворота.

Аминокислотная последовательность вблизи каталитического серина Glyl43-Hisl44-Serl45-Leul46-Glyl47 представляет собой наиболее консервативный элемент в структуре липаз родов Rhizopus и Rhizomucor, являясь ключевой частью субстрат-связывающего центра. №И-группы тиг83 и Leul46 являются элементами оксианионной щели. В механизме формирования активированного комплекса главную роль играет своеобразный участок глобулы, локализованный на вершине каталитического центра - домен-«крышка» (остатки Ап84-$ег85-РЪе86-Ащ87-$ег88-А1а89-Пе90-ТЬг91 -Азр92-11е93-Уа194-РЬе95-Asn96-Phe97). Данная структура представляет собой два протяженных подвижных сегмента, закрученных в спираль и связанных с доменом-«ядром» посредством гидрофобных взаимодействий.

Конформационные перестройки, имеющие место при формировании фермент-субстратного комплекса, заключаются в жестком петлеобразном движении домена-«крышки» и экспонировании гидрофобных аминокислотных остатков на поверхность глобулы (создавая, оптимальные условия для межфазовой активации на границе липид-вода). В то же время А1а89, расположенный у основания «крышки», в открытой конформации липазы взаимодействует с Ser145 и также экспонируется наружу, увеличивая сродство каталитической: триады к гидрофобному субстрату. При «открывании крышки» полярные аминокислотные остатки последней и смежные с ними оказываются «спрятанными», а 230 молекул воды, которые в закрытой конформации были ориентированы на поверхности глобулы, претерпевают делокализацию. Последнее явление термодинамически выгодно для стабилизации активированного комплекса. Полость активного центра молекулы липазы можно схематически представить следующим образом:

№5-258

В это же время в районе каталитической триады Serl45-His258-Asp204 происходят следующие события:

Боковой радикал Serl45 -СН2-ОН передает протон имидазолу гистидина 258 (при участии Asp204) и таким образом переходит в активную форму, способную к связыванию алкокислорода субстрата.

Молекула триглицерида, получившая при «открывании крышки» возможность приблизиться к Serl45, располагается в полости активного центра таким образом, чтобы атом кислорода сложноэфирной связи оказался в промежутке между двумя^Н-группами оксианионной щели 1Ъг83 Leul46. На этом этапе происходит образование тетраэдрического комплекса I (ПО и аци-лирование:

Активированный комплекс на ферменте стабилизируется следующим образом. Во-первых, отрицательный заряд атома кислорода, образующийся при тетраэдризации углеродного атома, на ферменте втягивается в оксианион-ную щель, где находятся два протона. Связывание с этими положительно заряженными протонами понижает свободную энергию отрицательного заряда О и, следовательно, энергию тетраэдризации, и таким образом приводит к понижению энергии (энтальпии) переходного состояния, или к так называемому энтальпийному катализу. В тетраэдрическом интермедиате «центральный» атом углерода связан с кислородом гидроксила серина и кислородом карбонильной группы одинарными связями.

На следующем этапе катализа происходит восстановление двойной связи карбонила и отщепление одного из продуктов гидролиза - спирта; причем в ориентировании последнего принимают участие консервативные аминокис

лотные остатки Ьеи259 и 01у82. Между оставшейся частью субстрата и Бег145 формируется сложноэфирная связь - образуется адилфермент:

Н>$-258

Зет-145

— с-_ Ьси-146

НгС^ /

ацил-Е

+ Р|

Asp-204V-С'

R2-ОН

N Thr-83

Распад ацилфермента происходит при обязательном участии молекулы воды, которая предварительно активируется имидазолом Н1з258 при участии А$р204.

His-258

Ser-145 "С__Lcu-146

/ Г

^ р

Asp.204\— С / R-

"> Н

N Thr-83

Взаимодействие ацилфермента с активированной водой (НзО+) способствует образованию тетраэдрического комплекса II (Т12):

His-258

Ser-145 " с__Leu-146

\ \\

Т1 н \

H/N^N\ ......н

о ^ нГ с

"**с/ \

^ I '

Asp-204* -С I

г нг н

Е-ТЬ

Последний претерпевает разрушение, сопровождающееся отщеплением * второго продукта — карбоновой кислоты:

5«-]45

His-258

е-Р2

N Thr-83

Asp-204v-С'

х Hj

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При исследовании структурно-функциональных свойств липолитиче-ских ферментов и молекулярных механизмов осуществляемых ими реакций необходимо проводить эксперименты с гомогенными препаратами липаз с высокой каталитической активностью. В связи с этим была разработана методика получения ферментного препарата липазы ЯМгорш ]арошсш 1403 с высокой степенью очистки. Выявлены оптимальные условия гидролиза триглицеридов липазой. Показано, что кинетика ферментативного расщепления трибутирина не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, имеет место субстратное ин-гибирование.

При использовании метода Диксона и по результатам фотоокисления фермента в присутствии метиленового голубого установлено, что в состав активного центра молекулы липазы КЬкорш ]арошсш 1403 входит имидазоль-ная группа гистидина. Сочетание методов химической инактивации специфическими реагентами фенилметилсульфонилфторидом и дициклогексилкарбо-диимидом и ИК-спектрофотометрии позволило идентифицировать гидро-ксильную группу серина и карбоксильную группу аспарагиновой кислоты. При модификации липазы этилендиаминтетраацетатом установлено, что ионы кальция являются необходимыми в гидролизе, по-видимому, входят в состав Са-координационного домена, поддерживая каталитически активную конфор-мацию фермента.

При рассмотрении взаимодействия липазы с додецилсульфонатом натрия методами гель-хроматографии и электрофореза установлено, что молекула фермента имеет четвертичную структуру, представленную двумя идентичными мономерами. Полученные данные подтверждены методом атомно-силовой микроскопии. Анализ результатов экспериментов по ковалентному связыванию субъединиц при помощи бифункционального реагента глутарово-го альдегида позволяет предположить, что в процессе димеризации липазы участвуют две белковых глобулы, находящихся в «открытой» конформации, взаимодействия между протомерами имеют гидрофобную природу. Данное предположение объясняет, более высокое сродство олигомерной формы фермента к субстрату, поскольку при формировании четвертичной структуры липазы нарушаются свойственные «закрытой» конформации взаимодействия «ядро»'«крышка», экранирующие реакционноспособный серии.

При подборе условий иммобилизации препарата липазы КЫжрш ]арош-cus 1403 выявлено, что наиболее предпочтительным носителем является анио-нообменная смола АВ-17-2П, отработавшая в условиях сахаро-рафинадного производства в течение 400 циклов. Предложен модифицированный глута-ральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связующего звена между липазой и анио-нитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизованный фермент характеризуется более низкими значениями , увеличение

значений энергий активации и изменения энтальпии реакции гидролиза по сравнению с растворимой формой фермента свидетельствуют о затруднении процесса перехода иммобилизованного фермента в каталитически активную конформацию под действием субстрата. Отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей трибутирина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью.

Экологическая безопасность предложенного носителя АВ-17-2П и его относительно низкая стоимость позволяют рекомендовать модель. промышленного реактора непрерывного действия с иммобилизованной липазой, с помощью которого можно осуществлять гидролиз натуральных и синтетических. триглицеридов с высоким выходом, в ряде отраслей легкой, пищевой и химической промышленности. Оптимальные технологические режимы липолиза гетерогенным катализатором в разработанном реакторе: t* = 45 *С; рН = 7,0; [S] = 1,3 "10"3 моль/л, режим «кипящего слоя» при скорости протока эмульсии субстрата vs = 2,5 мл/мин.

Для разработки схемы гипотетического механизма реакции гидролиза сложноэфирных связей в молекулах природных и синтетических ацилглицеро-лов были привлечены экспериментальные данные, а также ряд компьютерных программ: AliBee Multiple Alignment (по выравниванию аминокислотных последовательностей белков), MolScript 2.0 (по визуализации данных рентгено-структурного анализа биологических макромолекул). Степень гомологии первичных структур липаз семейства Мисогасеае составляет 61,7 %. Показано, что элементы каталитической триады Ser-His-Asp входят в состав консервативных участков полипептидных цепей ферментов данной группы. Кроме того, 6 остатков цистеина, участвующие в образовании дисульфидных мостиков, занимают фиксированные позиции, а для липаз рода Rhizopus входят в состав гомологичных участков цепи. Следует отметить тенденцию двух важных остатков: Leu-259 и Gly-82 располагаться в пространственно отдаленных, но строго определенных участках третичной структуры липаз. Остаток Leu следует за каталитическим гистидином в первичных структурах сравниваемых белков, Gly-82 предшествует спиралевидной «крышке». Предполагается, что данная пара играет ключевую роль в ориентировании первого продукта — спирта при расщеплении сложноэфирной связи. Составные элементы оксианионной щели: Leu 146 и Thr83, располагаются у большинства плесневых эстераз у основания домена-«крышки».

Результаты РЖ-спектроскопии исследуемой липазы, а также компьютерный анализ пространственных структур ферментов узкой группы позволяют отнести объект наших исследований к группе а/р-белков, для которых характерны следующие элементы вторичной структуры: а-спирали, Р-структуры фермента, отличающиеся разнообразием подтипов: р-тяжи, Р-листы, р-выступы и р-повороты. В пространственной укладке белковых глобул липаз рода Rhizopus участвуют 3 у-поворота, а также ряд р-тяжей, образующих с а-

спиральными участками Рсф-блоки.

Каталитический 8ег145 находится между первым (Шр-блоком и 5-й а-спиралью, His258 входит в состав 10-й а-спирали, Ар204 участвует в формировании 18-го р-поворота. Конформационные перестройки, имеющие место при формировании фермент-субстратного комплекса, заключаются в движении домена-«крышки» и экспонировании гидрофобных аминокислотных остатков на поверхность глобулы (создавая оптимальные условия для межфазовой активации на границе липид-вода).

Анализ экспериментальных данных и использование упомянутых выше компьютерных программ позволили нам разработать схему гипотетического механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицерида, которая предусматривает следующие события: потерю каталитическим серином протона при участии имидазола гистидина; образование тетраэдрического комплекса I атомом углерода сложноэфирной связи и ацилирование, сопровождающееся отщеплением спирта; стадию образования тетраэдрического комплекса II при участии молекулы воды и деацилирование. В осуществлении данных событий ключевую роль играет нуклеофильно-электрофильная пара карбоксил-имидазол, контролирующая перенос заряда, а также КН-гругшы ок-сианионной щели, ориентирующие молекулу субстрата на стадиях тетраэдри-ческих комплексов I и II.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный метод очистки препарата липазы из микро-мицета Rhizopus ]арошсш 1403, включающий стадии ультрафильтрации куль-туральной жидкости на мембране УАМ-30, осаждения ацетоном, гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, который позволил получить гомогенный препарат фермента с высокой степенью очистки.

2. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза триглицеридов являются: температура катализа 37 "С; рН катализа 6,5; концентрация субстрата 1,75* 10-3 моль/л.

3. С помощью методов Диксона, фотоокисления в присутствии метиле-нового голубого, ИК-спектрофотометрии и химической модификации специфическими реагентами установлено, что в состав активного центра липазы входят гидроксильная группа серина, имидазольное кольцо гистидина и карбоксильная группа аспарагиновой кислоты; ионы кальция являются необходимыми в гидролизе, поддерживая каталитически активную конформацию фермента.

4. Нативная молекула фермента с Мг 95 кДа существует в виде димера, протомеры обладают каталитической активностью. Четвертичная структура липазы образуется в результате взаимодействия двух белковых глобул, находящихся в «открытой» конформации, поддерживается гидрофобными «силами

сцепления» и принимает участие в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц.

5. Предложен модифицированный ковалентный способ иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П. Иммобилизованный препарат липазы сохраняет 23 % активности по сравнению с растворимой формой фермента. Оптимальная температура гидролиза триглицеридов при иммобилизации повышается на 3 *С, оптимум рН смещается вправо на 0,5 единиц, значения К, и Vmax увеличиваются на 52 % и 49 % соответственно.

6. Иммобилизация липазы приводит к увеличению значений энергии активации и энтальпии активации гидролиза, что связано с затруднением процесса перехода иммобилизованного фермента в «открытую» конформащпо на границе раздела фаз липид-вода; отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей субстрата характеризуется высокой упорядоченностью.

7. Создана модель промышленного реактора непрерывного действия с иммобилизованной липазой, позволяющего осуществлять гидролиз натуральных и синтетических триглицеридов с высоким выходом; оптимальные технологические режимы липолиза гетерогенным катализатором: t* = 45 *С; рН = 7,0; [S] = 1,3*10'3 моль/л, режим «кипящего слоя» при скорости протока эмульсии субстрата v$ = 2,5 мл/мин.

8. Степень гомологии липаз семейства Мисогасеае составляет 61,5 %, консервативные участки сосредоточены вблизи элементов каталитической триады Serl45-His258-Asp204, оксианионной щели Thr-Leu, Leu и Gly, участвующих в удалении продуктов гидролиза.

9. Активацию серина каталитической триады вызывают информационные перестройки домена-«крышки»; на ключевых этапах гидролиза субстрата, задействованы: NH-группы оксианионной щели Thr-Leu, ориентирующие карбонильный атом кислорода, электрофильно-нуклеофильная пара карбоксил-имидазол, остатки Leu и Gly, отщепляющие первый продукт - спирт.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Трофимова О.Д. Ковалентная иммобилизация липазы на анионите АВ-17-2П / О.Д. Трофимова // Химия. Теория и технология: сб. научных статей молодых ученых. - Воронеж, 2000. - С. 68-71.

2. Исследование физико-химических и кинетико-термодинамических характеристик реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой / Т.А. Ковалева, СА Шеламова, О.Д. Трофимова, Н.В. Бондарева // Материалы XVIII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. -Казань,2001.-С. 355.

3. Ферментативная модификация жировых продуктов и ее практическое

использование / СЛ Шеламова, Н.В. Янышева Н.В., Т.А. Ковалева О.Д. Трофимова // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии. Материалы Международ, конференции молодых ученых. - Тверь, 2001. - С. 70-71.

4. Иммобилизация липазы В.Ыг,орт ]аропкж 1403 путем ковалентного связывания / С.А Шеламова, Т.А. Ковалева, В.Ф. Селеменев, О.Д. Трофимова, Н.В. Бондарева // Биотехнология. - 2001. - Т.1, №5; - С. 32-39.

5. Исследование физико-химических и кинетических характеристик свободной и иммобилизованной липазы из Rhizopus ]арошсш / Т.А Ковалева, С.А. Шеламова, О.Д. Трофимова, Н.В: Бондарева // Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования: Материалы IV Международ, симпозиума. - Пущино, 2001. - Т.Ш. - 493-495.

6. Иммобилизация липазы Rhizopus japonicus на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом / Т. А. Ковалева, С.А. Шеламо-ва, О.Д. Трофимова, Н.В. Бондарева, В.Ф. Селеменев // Сорбционные и хрома-тографические процессы. - 2001. - Т.1, №1. - С. 107-114.

7. Исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой из Rhizopus japonicus / Т.А. Ковалева, С.А. Шеламова, О.Д. Трофимова и др.// Организация и регуляция физиолого-биохимических процесссов: Межрегион, сб. научных работ. - Воронеж, 2001. - Вып. 3. - С. 64-66.

8. Исследование особенностей строения • активного - центра липазы из Rhizopus japonicus / Т.А Ковалева, СА Шеламова, О.Д. Трофимова, Н.В. Янышева. // Вестник Воронеж, гос. ун-та. - 2001. - №2: Химия, биология. - С. 114-117.

9. Функциональность жировых продуктов в хлебопечении / С.А. Шела-мова, Т.А. Ковалева, Н.В. Янышева, О.Д. Трофимова // Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг: Материалы Международ, на-учн.-практ. конф. - Орел, 2001. - С. 304.

10. Масла как регуляторы свойств клейковины/СА. Шеламова, Н.М. Дерканосова, ХА. Ковалева, Н.В. Янышева, О.Д. Трофимова // Пищевые продукты XXI века: Материалы Международ, научн.-практ. конф. - М., 2001. - С. 115.

11. Модификация носителя при ковалентной иммобилизации липазы / Т.А. Ковалева, С.А. Шеламова, В.Ф. Селеменев, О.Д. Трофимова, Н.В. Янышева // Всероссийский симпозиум «Современные проблемы хроматографии». -М., 2002.-С. 103.

12. Исследование влияния модифицированного растительного масла на свойства клейковины / С.А. Шеламова, Н.М. Дерканосова, Н.В. Янышева, Т.А. Ковалева, О.Д. Трофимова // Веста. Рос. Академии с.х. наук. - 2002. - №5. - С. 82-85.

13. Модификация глутаральдегидного метода при иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus на ионообменных смолах / Т.А. Ковалева, В.Г. Артю-хов, О.Д. Трофимова, С.А. Шеламова, Н.В. Янышева // Материалы Междуна-

9 1 5 3 1 f

родного Форума «Аналитика и аналитики». - Воронеж, 2003. - С. 413.

14. Production and purification of extracellular lipase from Rhizopus japoni-cus 1403 / T.A. Kovaleva, SA Shelamova, O.D. Trofimova, N.V. Yanisheva // 100 Years of Chromatography - 3rd International Symposium on Separations in BioSci-ences.-M.,2003-P. 179.

15. Ковалева Т.А. Модификация глутаральдегидного метода при кова-лентной иммобилизации липазы Rhizopus japonicus 1403 на ионообменных смолах / Т.А. Ковалева, В.Г. Артюхов, О.Д. Трофимова // Материалы 2го Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2003. - С. 204.

16. Исследование условий выделения и очистки некоторых гидролитических ферментов / Ковалева ТА, Кожокина О.М., Трофимова О.Д., Николаева Н.В., Таха А.С. // Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». - М., 2004. - С. 244.

17. Immobilization of hydrolytic enzymes on ion-exchange resins: kinetic and thermodynamic aspects of substrate hydrolysis / T.A. Kovaleva, V.G. Artyukhov, O.D. Trofimova, O.M. Kozhokina, Taha A.S. // Материалы II Международной научной конференции и выставки «Биотехнология - охране окружающей среды». - М., 2004. - С. 79-85.

18. О механизме действия липазы Rhizopus niveus — представителе семейства 1.3 а/р-гидролаз / Т.А. Ковалева, О.Д. Трофимова, А.С. Беленова, Е.В. Воропаева // Материалы III Съезда биофизиков. - Воронеж, 2004 (в печати).

19. Kinetic and thermodynamic parameters of catalysis by soluble and immobilized on ion-exchanger AV-17-2P lipase Rhizopus japonicus 1403 / Tamara A. Kovaleva, Valeriy G. Artyukhov, Olga D. Trofimova, Alena S. Belenova, Yelena V. Voropayeva / 8th IUBMB Conference. - Boston, 2004. - B. 418.

20. Investigation of kinetic and thermodynamic aspects of polymeric substrate hydrolysis by soluble and immobilized hydrolases / T.A. Kovaleva, V.G. Artyukhov, Taha Abdul Sattar, O.D. Trofimova, O.M. Kozhokina // Al-Mustansiriya Journal of Science. - 2004. - №6 (in print).

Автор выражает искреннюю благодарность к.т.н., доц. ВГТА С.А. Шеламовой, д.х.н., проф. В.Ф. Селеменеву, к.ф.н., доц. Л.А. Битюцкой, к.х.н., доц. Ж.В. Шмыревой за научные консультации, внимание и помощь, оказанную при выполнениинастоящейработы.

Заказ № 377от 27.05.2004 г. Тираж 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трофимова, Ольга Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о липолитических ферментах

1.1. Характеристика продуцентов и физико-химические свойства липаз

1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз

1.3. Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека

ГЛАВА 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических ферментов

2.1. Методы иммобилизации липаз

2.2. Физико-химические аспекты катализа иммобилизованными ферментами

2.3. Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объект исследования

3.2. Методы исследования

3.2.1. Выделение препарата липазы из микромицета Rhizopus japonicus

3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии

3.2.3. Ионообменная хроматография на колонке с диэтиламиноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой)

3.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури

3.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментых препаратах модифицированным методом Лоури

3.2.6. Спектрофотометрический метод определения каталитической активности липазы

3.2.7. Подготовка ионитов АВ-26 и АВ-17-2П к иммобилизации

3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации липазы

3.2.9. Методика ковалентной иммобилизации липазы с помощью глутарового альдегида

3.2.10. Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-спектрофотометрии (ИКС)

3.2.11 Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле

3.2.12. Метод визуализации пространственной структуры белковых молекул на базе программы MolScript

3.2.13. Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого

3.2.14. Статистическая обработка результатов экспериментов

ГЛАВА 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препарата липазы из Rhizopus j aponicus

4.1. Изучение условий выделения и очистки липазы из Rhizopus j aponicus

4.2. Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus

ГЛАВА 5. Исследование особенностей строения активного центра липазы Rhizopus japonicus

5.1. Идентификация имидазольной группы гистидина в каталитическом центре молекулы липазы Rhizopus japonicus

5.2. Воздействие фенилметилсульфонилфторида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы

5.3. Воздействие дициклогексилкарбодииимида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы

5.4. Исследование роли ионов двухвалентных металлов в функционировании липазы Rhizopus japonicus

ГЛАВА 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы Rhizopus j aponicus

6.1. Воздействие додецилсульфоната натрия на состояние четвертичной структуры липазы

6.2. Исследование особенностей вторичной структуры субъединиц липазы методом ИК-спектрофотометрии

6.3. Модификация липазы бифункциональными реагентами

6.4. Визуализация олигомерной структуры липазы Rhizopus japonicus 1403 методом атомно-силовой микроскопии

Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из Rhizopus japonicus 1403 на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом

7.1. Исследование условий иммобилизации липазы на некоторых ионообменных смолах

7.2. Некоторые физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободной и иммобилизованной липазой

7.3. Исследование технологических характеристик реакции гидролиза триглицеридов липазой, иммобилизованной на анионите АВ-17-2П

ГЛАВА 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного гидролиза триглицеридов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов"

Актуальность проблемы. В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов широко используются гидролитические ферменты микроорганизмов, характеризующиеся более высокой активностью и низкой себестоимостью по сравнению с гидролазами растительного и животного происхождения. Выявление особенностей структуры и функционирования липолитичеких ферментов становится особенно актуальным в связи с их биологической ролью, а также предоставляет новые возможности: для создания катализаторов с целью их дальнейшего эффективного применения в различных отраслях промышленности и в качестве медицинских препаратов.

В настоящее время в лабораториях научно-исследовательских институтов разрабатывается новая прогрессивная технология — катализ с использованием иммобилизованных ферментов, которые имеют ряд преимуществ перед растворимыми катализаторами в связи с более высокой стабильностью по отношению к денатурирующим факторам окружающей среды. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и способ связывания, можно значительно уменьшить неблагоприятное воздействие матрицы носителя на структуру белка и повысить тем самым его ценность как биокатализатора.

Возрастающие масштабы использования липаз в биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в качестве которого в настоящей работе предложен микромицет Rhizopus japonicus 1403. Для решения проблем регулирования биологических свойств липазы необходимо детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств фермента, особенностей его структурной организации, раскрытие молекулярного механизма реакции превращения субстрата.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи: разработка эффективной методики выделения и очистки липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403; идентификация функциональных групп каталитического и субстрат-связывающего центров в молекуле липазы; исследование особенностей надмолекулярной организации изучаемого фермента методами гель-хроматографии, электрофореза и атомно-силовой микроскопии; создание гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной модифицированным глутаральдегидным способом на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анионите АВ-17-2П; изучение физико-химических и кинетико-термодинамических аспектов гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой; выявление оптимальных технологических режимов функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия;

• описание молекулярного механизма разрыва сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.

Научная новизна. разработан эффективный метод получения гомогенного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки; впервые четвертичная структура обнаружена у липолитического фермента семейства Mucoraceae, выявлены физико-химические свойства и природа взаимодействия субъединиц; создан новый гетерогенный биологический катализатор на основе липазы, иммобилизованной на отработанном в сахаро-рафинадном производстве анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегид-ным методом;

• по результатам исследования кинетико-термодинамических и технологических характеристик свободной и иммобилизованной липазы сконструирован реактор непрерывного действия, позволяющий осуществлять гидролиз триглицеридов с высоким выходом; изучено строение активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 методами Диксона, химической модификации специфическими реагентами и фотоокислением в присутствии метиленового голубого; на основании экспериментальных данных и при использовании программы MolScript описан молекулярный механизм реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403

Практическая значимость Получен гомогенный препарат липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой гидролитической активностью. Изучение особенностей надмолекулярной организации липазы позволяет расширить представления о механизмах регуляции функциональных свойств ферментов in vivo. Создан гетерогенный биокатализатор с ковалентно иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П липазой, выявлены оптимальные условия его функционирования. Разработанные технологические режимы работы реактора непрерывного действия с полученным гетерогенным катализатором позволяют рекомендовать его для применения в промышленных масштабах. Результаты исследования строения активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 и молекулярного механизма каталитического гидролиза сложноэфирных связей расширяют и углубляют представления о закономерностях функционировании эстераз семейства Mucoraceae.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на IV Международном симпозиуме «Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001); Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001); Международной научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); Межрегион, конференции молодых ученых «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2001); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматогра-фические приборы» (Москва, 2004), конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 20 публикаций: 9 статей и 11 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

3. Функционально значимые аминокислотные остатки субстратсвязы-вающего, каталитического центров и их микроокружения для липаз рода Rhizopus являются идентичными и входят в состав консервативных участков первичных структур гидролаз данной группы.

4. Схема молекулярного механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 156 страниц машинописного текста; состоит из Введения, 8 глав, Заключения, Выводов, Списка литературы (177 источников) и Приложения. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 19 таблиц; в Приложении 9 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Трофимова, Ольга Дмитриевна

выводы

1. Разработан эффективный метод выделения и очистки препарата липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403, включающий стадии выращивания культуры глубинным способом, ультрафильтрации культуральной жидкости на мембране УАМ-30, осаждения ацетоном, гель-фильтрации на сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, который позволил получить гомогенный препарат фермента с 58-кратной степенью очистки.

2. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза триглицеридов являются: температура катализа 37 "С; рН катализа 6,5; концентрация субстрата 1,75 10"3 моль/л.

4. Нативная молекула фермента с Mr 95 кДа существует в виде димера, протомеры обладают каталитической активностью. Четвертичная структура липазы образуется в результате взаимодействия двух белковых глобул, находящихся в «открытой» конформации, поддерживается гидрофобными «силами сцепления» и принимает участие в регуляции каталитической активности за счет взаимодействия субъединиц.

5. Предложен модифицированный ковалентный способ иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П. Иммобилизованный препарат липазы сохраняет 23 % активности по сравнению с растворимой формой фермента. Оптимальная температура гидролиза триглицеридов при иммобилизации повышается на 3 eC, оптимум рН смещается вправо на 0,5 единиц, значения Кт и Vmax увеличиваются на 52 % и 49 % соответственно.

6. Иммобилизация липазы приводит к увеличению значений энергии активации и энтальпии активации гидролиза, что связано с затруднением процесса перехода иммобилизованного фермента в «открытую» конформа-цию на границе раздела фаз липид-вода; отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей субстрата характеризуется высокой упорядоченностью.

7. Создана модель промышленного реактора непрерывного действия с иммобилизованной липазой, позволяющего осуществлять гидролиз натуральных и синтетических триглицеридов с высоким выходом; оптимальные технологические режимы липолиза гетерогенным катализатором: te = 45 °С; рН = 7,0; [S] = 1,3 10' моль/л, режим «кипящего слоя» при скорости протока эмульсии субстрата vs = 2,5 мл/мин.

9. Активацию серина каталитической триады вызывают конформаци-онные перестройки домена-«крышки»; на ключевых этапах гидролиза субстрата, задействованы: NH-группы оксианионной щели Thr-Leu, ориентирующие карбонильный атом кислорода, электрофильно-нуклеофильная пара карбоксил-имидазол, остатки Leu и Gly, отщепляющие первый продукт — спирт.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При исследовании структурно-функциональных свойств липолитических ферментов и молекулярных механизмов осуществляемых ими реакций необходимо проводить эксперименты с гомогенными препаратами липаз с высокой каталитической активностью. В связи с этим была разработана методика получения ферментного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки. Выявлены оптимальные условия гидролиза триглицеридов липазой. Показано, что кинетика ферментативного расщепления трибутирина не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, имеет место субстратное ингибирование.

При использовании метода Диксона и по результатам фотоокисления фермента в присутствии метиленового голубого установлено, что в состав активного центра молекулы липазы Rhizopus japonicus 1403 входит имида-зольная группа гистидина. Сочетание методов химической инактивации специфическими реагентами фенилметилсульфонилфторидом и дициклогексил-карбодиимидом и ИК-спектрофотометрии позволило идентифицировать гид-роксильную группу серина и карбоксильную группу аспарагиновой кислоты. При модификации липазы этилендиаминтетраацетатом установлено, что ионы кальция являются необходимыми в гидролизе, по-видимому, входят в состав Са-координационного домена, поддерживая каталитически активную конформацию фермента.

При рассмотрении взаимодействия липазы с додецилсульфонатом натрия методами гель-хроматографии и электрофореза установлено, что молекула фермента имеет четвертичную структуру, представленную двумя идентичными мономерами. Полученные данные подтверждены методом атомно-силовой микроскопии. Анализ результатов экспериментов по ковалентному связыванию субъединиц при помощи бифункционального реагента глутарового альдегида позволяет предположить, что в процессе димеризации липазы участвуют две белковых глобулы, находящихся в «открытой» конформации, взаимодействия между протомерами имеют гидрофобную природу. Данное предположение объясняет более высокое сродство олигомерной формы фермента к субстрату, поскольку при формировании четвертичной структуры липазы нарушаются свойственные «закрытой» конформации взаимодействия «ядро»-«крышка», экранирующие реакционноспособный серин.

При подборе условий иммобилизации препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 выявлено, что наиболее предпочтительным носителем является анионообменная смола АВ-17-2П, отработавшая в условиях сахарорафинадного производства в течение 400 циклов. Предложен модифицированный глутаральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связующего звена между липазой и анионитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизованный фермент характеризуется более низкими значениями Кт и Vmax , увеличение значений энергий активации и изменения энтальпии реакции гидролиза по сравнению с растворимой формой фермента свидетельствуют о затруднении процесса перехода иммобилизованного фермента в каталитически активную конформацию под действием субстрата. Отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей трибутирина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью.

Выявлены оптимальные технологические режимы липолиза гетерогенным катализатором в разработанном реакторе: t° = 45 "С; рН = 7,0; [S] = 1,3*10'3 моль/л, режим «кипящего слоя» при скорости протока эмульсии субстрата vs = 2,5 мл/мин. Экологическая безопасность предложенного носителя АВ-17-2П и его относительно низкая стоимость позволяют рекомендовать модель промышленного реактора непрерывного действия с иммобилизованной липазой, с помощью которого можно осуществлять гидролиз натуральных и синтетических триглицеридов с высоким выходом в ряде отраслей легкой, пищевой и химической промышленности.

Для разработки схемы гипотетического механизма реакции гидролиза сложноэфирных связей в молекулах природных и синтетических ацилглице-ролов были привлечены экспериментальные данные, а также ряд компьютерных программ: AliBee Multiple Alignment (по выравниванию аминокислотных последовательностей белков), MolScript 2.0 (по визуализации данных рентгеноструктурного анализа биологических макромолекул). Степень гомологии первичных структур липаз семейства Мисогасеае составляет 61,7 %. Показано, что элементы каталитической триады Ser-His-Asp входят в состав консервативных участков полипептидных цепей ферментов данной группы. Кроме того, 6 остатков цистеина, участвующие в образовании дисульфидных мостиков, занимают фиксированные позиции, а для липаз рода Rhizopus входят в состав гомологичных участков цепи. Следует отметить тенденцию двух важных остатков: Leu-259 и Gly-82 располагаться в пространственно отдаленных, но строго определенных участках третичной структуры липаз. Остаток Leu следует за каталитическим гистидином в первичных структурах сравниваемых белков, Gly-82 предшествует спиралевидной «крышке». Предполагается, что данная пара играет ключевую роль в ориентировании первого продукта - спирта при расщеплении сложноэфирной связи. Составные элементы оксианионной щели: Leu 146 и Thr83, располагаются у большинства плесневых эстераз у основания домена-«крышки».

Результаты ИК-спектроскопии исследуемой липазы, а также компьютерный анализ пространственных структур ферментов узкой группы позволяют отнести объект наших исследований к группе а/р-белков, для которых характерны следующие элементы вторичной структуры: а-спирали, р-структуры фермента, отличающиеся разнообразием подтипов: р-тяжи, р-листы, Р-выступы и Р-повороты. В пространственной укладке белковых глобул липаз рода Rhizopus участвуют 3 у-поворота, а также ряд Р-тяжей, образующих с а-спиральными участками РаР-блоки.

Каталитический Ser находится между первым pap-блоком и 5-й а-спиралью, His258 входит в состав 10-й а-спирали, Asp204 участвует в формировании 18-го ^-поворота. Конформационные перестройки, имеющие место при формировании фермент-субстратного комплекса, заключаются в движении домена-«крышки» и экспонировании гидрофобных аминокислотных остатков на поверхность глобулы (создавая оптимальные условия для межфазовой активации на границе липид-вода).

Анализ экспериментальных данных и использование упомянутых выше компьютерных программ позволили нам разработать схему гипотетического механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицерида, которая предусматривает следующие события: потерю каталитическим сери-ном протона при участии имидазола гистидина; образование тетраэдрического комплекса I атомом углерода сложноэфирной связи и ацилирование, сопровождающееся отщеплением спирта; стадию образования тетраэдрического комплекса II при участии молекулы воды и деацилирование. В осуществлении данных событий ключевую роль играет нуклеофильно- электрофиль-ная пара карбоксил-имидазол, контролирующая перенос заряда, а также NH-группы оксианионной щели, ориентирующие молекулу субстрата на стадиях тетраэдрических комплексов I и II.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трофимова, Ольга Дмитриевна, Воронеж

1. Бейли Д.Ж. Основы биохимической инженерии /Д.Ж. Бейли, Д. Ол-лис. М.: Мир, 1989.-692 с.

2. Березин И.В. Новый тип носителя для разделения биологических смесей / И.В. Березин, А.А. Карякин // Инженерная энзимология: Материалы VI Всесоюз. симп. -Вильнюс, 1988. -Ч. 1. С. 60-61.

3. Блиева Р.К. Синтез гидролитических ферментов иммобилизованными микромицетами / Р.К. Блиева // Инженерная энзимология: Материалы VI Всесоюз. симп. — Вильнюс, 1988. —Ч. 1. —С. 61-62.

4. Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма / А.Е. Браунштейн. М.: Наука, 1987. - 546 с.

5. Брокерхоф X. Липолитические ферменты / X. Брокерхоф, Р. Дженсен / Пер. с англ. Т.П. Левчук; Под ред. А.Е. Браунштейна. М.: Мир. - 1978. — 396 с.

6. Варфоломеев С.Д. Кинетические методы в биохимических исследованиях / С.Д. Варфоломеев, С.В. Зайцев. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1982. — 343 с.

7. Влияние водорастворимых добавок на каталитическую активность и вторичную структуру панкреатичекой липазы / А. В. Еленский, Г. П. Ям-польский, В.Н. Измайлова и др. // Химия. 1986. - Т. 27, №5. - С. 751 -757.

8. Давранов К.Д. Изучение внеклеточных липаз Rhizopus microsporus / Давранов К.Д., Дилеров Ж., Ризаева М.// Прикл. биохимия и микробиология . 1978. - Т. 14, №3. - С. 389-393.

9. Давранов К.Д. Липаза гриба Rhizopus microsporus / К.Д. Давранов, М.З. Закиров, М.И. Ризаева // Химия природных сред. 1976. - №5. - С. 636639.

10. Давранов К.Д. Препаративное выделение, очистка, кристаллизация и некоторые свойства липазы из Oospora lactis / К.Д. Давранов, МЛ. Табак,

11. A.С. Саттаров // Биохимия. 1989. - Т. 54, №11.- С. 1866-1872.

12. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб М.: Мир, 1982. - Т. 1. -389 с.

13. Дьяков В.J1. Активация панкреатической липазы детергентами 7

14. B.JI. Дьяков, А.В. Мишин, М.Н. Антонов // Биоорган, химия. 1980. — Т. 6. —1. C. 296-299.

15. Землянухин А.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: Учеб. пособие / А.А. Землянухин, JI.A. Землянухин. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. — 188 с.

16. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир, 1988. - 215с.

17. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - Т. 1. - 296 с.

18. Ионообменные методы очистки веществ / Под ред. Г.А. Чикина, О.Н. Мягкого. — Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1984. 372 с.

19. Кабанова B.C. Совещание по применению ферментных препаратов / B.C. Кабанова // Фермент, и спиртовая пром-ть. 1983. - Т. 7. - С. 41-43.

20. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. — М.: Мир, 1990.-350 с.

21. Ковалева С.В. Фотоокисление и модификация диэтилпирокарбона-том «биосинтетической» L-треониндегидратазы из пивных дрожжей Sac-charomyces calrsbergensis / С.В. Ковалева, А.И. Дорожко, З.С. Каган // Биохимия. 1984. - Т. 49, №8. - С. 1253-1261.

22. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинами-ческие аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами: Автореф. дис.докт.биол.наук. Воронеж, 1998. - 48 с.

23. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии: Учеб. пособие / Г.А. Кочетов; под ред. С.Е. Северина. М.: Высш. шк., 1980. - 272 с.

24. Красновский А.А. Фосфоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотобиохимических системах / А.А. Красновский // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, №5. - С. 530-547.

25. Ксандопуло Г.Б. Влияние различных активаторов и ингибиторов на липазную активность грибов рода Geotrichum / Г.Б. Ксандопуло, E.JI. Рубан // Микробиология. 1974. - Т.43, № 5. - С.814-821.

26. Логинова Л.Г. Новые формы термофильных бактерий / Л.Г. Логинова, Л.А. Егорова. М.: Наука, 1977. - 175 с.

27. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители / А.А. Лурье. М.: Химия. - 1972. - 320с.

28. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты / К. Мартинек. — М.: 1984.-100 с.

29. Можаев В.В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии / В.В. Можаев // Успехи биологической химии. 1983. - Т. 24. - С. 99-134.

30. Некоторые сведения о структурах пористых сополимеров стирола и дивинилбензола / А.К. Светлов, Ю.С. Цветков, В.В. Крючков и др. // Иониты и ионный обмен. Л., 1975. - С. 78-85.

31. Полимерно модифицированные кремнеземные носители для иммобилизации белков / А.Е. Иванов, В.В. Жильцов, В.В. Гузеев и др. // Инженерная энзимология: Материалы VI Всесоюз. симп. — Вильнюс, 1988. - Ч. 1. — С. 74-75.

32. Полторак О.М. Физико-химические основы ферментативного катализа / О.М. Полторак, Е.С. Чухрай.-М.: Высш. шк., 1971.-311 с.

33. Поляновский О.Я. Роль функциональных групп белка в ферментах. -М., 1964.-С. 101-117.

34. Прайор У. Свободные радикалы в биологии / У.Прайор: в 2 т. / Пер. с англ. М.Г. Гольдфельда, JI.A. Сибельдиной; под ред. Н.М. Эмануэля. М.: Мир.-Т.2.-1979.-328 с.

35. Применение иммобилизованных ферментов / Под ред. И.В. Березина // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. — М.: ВИНИТИ, 1986. — Т. 6. 300 с.

36. Рубан E.JI. Микробные липиды и липазы / E.JI. Рубан. М.: Наука, 1977.-216 с.

37. Салдадзе К.М. Сравнительные данные по физико-химическим свойствам ионообменных смол / К.М. Салдадзе, Б.Я. Кельман, H.JI. Лукьянова // Химически активные полимеры и их применение. Л.: Химия, 1969. — С. 129-134.

38. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1994. 126 с.

39. Солдатов B.C. О структуре сополимеров стирола и дивинилбензола / B.C. Солдатов, В.А. Артамонов // Сорбция и хроматография М., 1979. - С. 140-145.

40. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков: Учеб. для биол. спец. вузов / В.М. Степанов; под ред. А.С. Спирина. -М.: Высш. шк., 1996. 334с.

41. Тривен И. Иммобилизованные ферменты / И. Тривен. М.: Наука, 1984.-312 с.

42. Фениксова Р.В. Получение концентрированных ферментных препаратов. М.: ЦИНГИ Пищепром, 1960. - 154 с.

43. Чикин Г.А. Ионообменные технологические процессы в пищевой промышленности / Г.А. Чикин, И.П. Шамрицкая, В.Ф. Селеменев // Прикладная хроматография. М., 1984.-С. 141-156.

44. Шатаева Л.К. Карбоксильные катиониты в биологии / Л.К. Шатае-ва, Н.И. Кузнецова, Г.Е. Елькин. Л.: Наука, 1979. - 286 с.

45. Шеламова С.А. Биосинтез и физико-химические свойства липазы Rhizopus japonicus: Автореф. дисс.канд. биол. наук. Воронеж, 1984. - 26 с.

46. Яровенко В.В. Концентрирование ферментных растворов методом ультрафильтрации / В.В. Яровенко. М.: ОНТИТЭИ Микробиопром, 1978. -36 с.

47. A new kind of immobilized lipase in organic solvent and its structural model / H. Yang, S. Cao, Z. Ding et al. // Biochem Biophys Res Commun. 1994. -Vol. 200,№1.-P. 83-88.

48. Alternate conformations of observed in catalytic serine in Bacillus subtilis lipase determined at 1.3 A resolution / K. Kavasaki, H. Kondo, M. Suzuki et al. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002. - Vol. 58,№7.-P. 1168-1174.

49. Arroyo M. High enantioselective esterification of 2-arylpropionic acids catalyzed by immobilized lipase from Candida antarctica: a mechanistic approach / M. Arroyo, J. Sinisterra // J. Org. Chem. 1994. - Vol. 59. - P. 4410-4417.

50. Aucoin M. Hyperactivation of Rhizomucor miehei lipase by hydrophobic xerogels / M. Aucoin, F. Erhardt, R. Legge // Biotechnol Bioeng. 2004. - Vol. 85, №6.-P. 647-655.

51. Balcao V. Lipase catalysed modification of milkfat / V. Balcao, F. Mal-cata//Biotechnol Adv.- 1998.-Vol. 16, №2.-P. 309-341.

52. Bhardish J. Enzymes from thermophilic fungi: proteases and lipases / J. Bhardish, J. Sanjay, C. Satish // Proc. Indian Acad. Sci. 1985. - Vol. 94, №2-3. -P. 175-196.

53. Bhardwaj A. Identification, purification, and characterization of a thermally stable lipase from rice bran. A new member of the (phospho) lipase family /

54. К. Bhardwaj, A. Raju, R. Rajasekharan // Plant Physiol. 2001. - Vol. 127, №4. -* P. 1728-1738.

55. Bhatia S. Modeling and simulation of an enzymatic reactor for hydrolysis of palm oil / S. Bhatia, A. Naidu, A. Kamaruddin // Artif Cells Blood Subsit Immo-bil Biotechnol. 1999. - VoL 27, №5-6. - P. 435-440.

56. Binnig G. Atomic Force Microscope / G. Binnig, C. Quate, C. Gerber // Phys. Rev. Lett. -1986. Vol. 56. -P. 930-933.

57. Brunig C. Aldehyde-functionalized ethoxysilanes as new enzyme immobilization reagents/ C. Brunig, J. Grobe // J Chem Soc Commun. 1995. - № 22. — P.k 2323-2324.

58. Ca(2+)-induced folding of a family 1.3 lipase with repetitive Ca(2+)-binding motifs at the C-terminus / K. Amada, H. Kwon, M. Haruki et al // FEBS Lett. 2001. - Vol. 509, №1. - P. 17-21.

59. Cao L. Lipase-catalyzed solid-phase synthesis of sugar esters. Influence of immobilization on productivity and stability of the enzyme 7 L. Cao, U. Born-scheuer, R. Schmid // J Mol Catal. 1999. - Vol. 6. - P. 279-285.

60. Cheomar I. Production of a thermostable lipase by Humicola lanuginosa grown on sorbitol-corn steep liquor medium /1. Cheomar, N. Naomichi, N. Shiro // Agr Biol Chem 1987. - Vol. 1, №8. - P. 2145-2151.

61. Chiou S. Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with ^ activation of the hydroxyl groups / S. Chiou, W. Wu. // Biomaterials. 2004. - Vol.25№2.-P. 197-204.

62. Chopra A. Partial characterization of extracellular lipase from Mucor ra-cemosus / A. Chopra, H. Chander, J. Singh // Egypt J Dairy Sci. 1981. - Vol. 9, №3.-P. 598-600.

63. Cloning and characterization of a novel lipase from Vibrio harveyi strain AP6 / W. Jeanette, P. Teoa, L. Zhangb et al. // Gene. 2003. - Vol. 312. - P. 181188.

64. Collins Y. Evidence of a relationship between autolysis of starter bacteria and lipolysis in cheddar cheese during ripening / Y. Collins, P. McSweeney, M. Wilkinson // J Dairy Res. 2003. - Vol. 70, №1. - P. 105-113.

65. Connelly P. Hepatic lipase deficiency / P. Connelly, R. Hegele // Crit Rev Clin Lab Sci. 1998. - Vol. 35, №6. - P. 547-572.

66. Connelly P. The role of hepatic lipase in lipoprotein metabolism / P. Connelly // Clin Chim Acta. 1999. - Vol. 286, №1-2. - P. 243-255.

67. Cornish-Bowden A. The influence of binding domains on the nature of subunit interactions in oligomeric proteins. Application to unusual kinetic and binding patterns / A. Cornish-Bowden, D. Koshland // J Biol Chem. 1970. - Vol. 245, №23.-P. 6241-6150.

68. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation. The prototype for family 1.1 of bacterial lipases / M. Nardini, D. Lang, K. Lie-beto et al. // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275, №40. - P. 31219-31225.

69. Cuatrecases P. Adsorbents for affinity chromatography use of N-hydroxyccinimide esters of agarose / P. Cuatrecases, I. Parikh // Biochemistry. -1972. Vol. 11, №12. - P. 2291-2298.

70. Dalev P. An enzyme biotechnology for the total utilization of leather waster / P. Dalev, L. Simeonova // Biotechnol Lett. 1992 - Vol. 14, №6. - P. 531534.

71. Davis B. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins//Ann NY Acad Sci.- 1964.-Vol. 121.-P. 404-427.

72. Derewenda Z. Structure and functions of lipases / Z. Derewenda // Adv Protein Chem. 1994. - V. 45. - P. 1-52.

73. Differential scanning calorimetry of the effects of Ca(2+) on the thermal unfolding of Ps. cepacia lipase / A. Tanaka, H. Sugimoto, Y. Muta et al. // Biosci Biotechnol Biochem. 2003. - Vol. 67, № 1. - P. 207-210.

74. Dodson G. Structural and evolutionary relationships in lipase mechanism and activation / G. Dodson, D. Lawson, F. Winkler // Faraday Discuss. 1992. -Vol. 93.-P. 95-105.

75. Effect of mutations of Candida antarctica В lipase / S. Patkar, J; Vind, E. Kelstrup et al. // Chem Phys Lipids/ 1998. - V. 93. - P. 95-101.

76. Electron microscopy of negatively stained jackbean urease at three levels of quaternary structure,, and comparison with hydrodynamic studies // W.N. Fishbein, W. Engler, J. Griffin et al. // Eur. J Biochem. 1977. - Vol. 73. - P. 185190.

77. Enantioselective transesterification using lipase-displaying yeast whole-cell biocatalyst / T. Matsumoto, M. Ito, H. Fukuda et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 2004. - Vol. 64, №4. - P. 481-485.

78. Essential dynamics of lipase binding sites: the effect of inhibitors of different chain length /G. Peters, D. van Aalten, A. Svendsen et al. // Protein Eng. — 1997.-Vol. 10, №2.-P. 149-158.

79. Esterolytic and lipolytic activities of lactic acid bacteria isolated from ewe's milk and cheese / M. Katz, R. Medina, S. Gonzalez et al. // J Foot Prot. —2002. Vol. 65, №12. - P. 1997-2001.

80. Expression of LIP 1 and LIP2 genes from Geotrichum species in Baker's yeast strains and their application to the bread-making process / A. Monfort, A. Blasco, P. Sanz et al. 1999. -Vol. 47, №2. - P. 803-808.

81. Factors affecting lipase production in Aspergillus ventiiVH. Chander, V. Batis, J. Singh et al. // J Food Sci. 1980 - Vol. 45, №3. - P. 636-639.

82. Falb R. Covalent bonding of protein to solid surfaces / R. Falb, G. Grode // Federation Proceedings. 1971. - Vol. 30, №5. - P. 1688-1691.

83. Flood M. Safety evaluation of lipase produced from Candida rugosa: summary of toxicological data / M. Flood, M. Kondo // Regul Toxicol Pharmacol. -2001. Vol. 33, № 2. - P. 157-164.

84. Fourier-transform infrared spectroscopy study of dehydrated lipases from Candida antarctica В and Pseudomonas cepacia / G. Vecchio, F. Zambianchi, P. Zacchetti et al. Biotechnol Bioeng. 1999. - Vol. 64, №5. - P. 545-551.

85. Garner C. Porcine pancreatic lipase. A glycoprotein / C. Garner, L. Smith // J Biol Chem. 1972. - Vol. 247, №2. - P.561-565.

86. Gastric lipase: crystal structure and activity / S. Canaan, A. Roussel, R. Verger et al. // Biochim Biophys Acta. 1999. - Vol. 7, №10. - P. 2123-2130.

87. Gavel D. Fluorescence investigation of immobilized enzymes / D. Gavel //Biotechnol Bioeng. 1974. - Vol. 2, №2. - p. 165-168.

88. Gelatin blends with alginate: gels for lipase immobilization and purification / N. Fadnavis, G. Sheelu, B. Kumar et al. // Biotechnol Prog. 2003. - Vol. 19, №2.-P. 557-564.

89. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality / J. Palomo, M. Fuentes, G. Fernandez-Lorente // Biomacromolecules. 2003 - Vol. 4, №1. - P. 1-6.

90. Gomes F. Immobilization of lipase on chitin and its use in nonconventional biocatalysis /F. Gomes, E. Pereira, H. de Castro // Biomacromolecules. 2004. - Vol. 5, №1. - P. 17-23.

91. Gupta R. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties / R. Gupta, N. Gupta, P. Rathi // Appl Microbiol Biotechnol 2004.

92. Harris H. The lipemia of sepsis: triglyceride-rich lipoproteins as agents of innate immunity / H. Harris, J. Gosnell, Z. Kumwenda // J Endotoxin Res. 2000. -Vol. 6,№6.-P. 421-430.

93. Harwood J. The versatility of lipases for industrial uses / J. Harwood // Trend Biochem Sci. 1989. - №4. - P. 125-126.

94. Herrgard S. Role of an electrostatic network of residues in the enzymatic action of Rhizomucor miehei lipase family / S. Herrgard, C. Gibas, S. Subramaniam // Biochem 2000. - Vol. 39, №11. - P. 2921-2930.

95. Hintsche R. Verfahren zur Immobilisiring von biologisch aktiven Materi-alen / R. Hintsche // Molekular Biologie. 1994. - Vol. 23, №3. - P. 527-530.

96. Homology modeling and active-site residues probing of the thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius esterase / G. Manco, F. Febbraio, E. Adinolfi et al. // Protein Sci. 1999. -Vol. 8, №9.-P. 1789-1796.

97. Huang S. Direct binding and characterization of lipase onto magnetic nanoparticles / S. Huang, M. Liao, D. Chen // Biotechnol Prog. — 2003. Vol. 19, №3.-P. 1095-1100.

98. Human pancreatic lipase: A glycoprotein / A. De Саго, C. Figarella, J. Amic et al. // Biochim Biophys Acta. 1977. - Vol. 490, №2. - P. 411-419.

99. Humicola lanuginosa lipase hydrolysis of mono-oleoyl-rac-glycerol at the lipid-water interface observed by atomic force microscopy / K. Balashev, M. Gudmand, L. Iversen et al. // Biochim Biophys Acta. 2003. - Vol. 1615, №1-2. -P. 93-102.

100. Identification of histidine and aspartic acid residues essential for enzymatic activity of a family 1.3 lipase by site-directed mutagenesis / H. Kwon, K. Amada, M. Haruki et al. / FEBS Lett. 2000. - Vol. 483, №2-3. - P. 139-142.

101. Imaging the distribution and secondary structure of immobilized enzymes using infrared microspectroscopy / Y. Mei, L. Miller, R. Gross et al.// Biomacromolecules. j2003. - Vol. 4, №1. - P.:70-74.

102. Immobilization of hydrophobic lipase derivatives on to organic polymer beads / M. Basri, K. Ampon, W. Yunus et al. // J Chem Technol Biotechnol. 1994. -Vol. 59,№1.-P. 37-44.

103. Immobilization of lipases on polymethylene and application to perilla oil hydrolysis for production of alpha-linilenic acid / T. Watanabe, Y. Susuki, Y. Sge-saka et al. // J Nutr Sci Vitaminol. 1995. - Vol. 41, №3. -P. 307-312.

104. Immobilized lipase-catalyzed production of alkyl esters of restaurant grease as biodisel / A. Hsu, K. Jones, T. Foglia et al. // Biotechnol Appl Biochem. -2002. Vol. 36, №3. - P. 181-186.

105. Impact of tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability /К. Hsu, A. Jutila, E. Tuominen et al.// Biochim Biophys Acta. — 2001. -Vol. 1547, №2, P. 329-338.

106. Improvement of the optimum temperature of lipase activity for Rhizopus niveus by random mutagenesis and its structural interpretation / M. Kohno, M. Ena-tsu, J. Funatsu et al. // J Biotechnol. 2001. - Vol. 87, №3, P. 203-210.

107. Influence of product phase separation on phospholipase A(2) hydrolysis of supported phospholipid bilayers studied by force microscopy / L. Nielsen, K. Balashev, T. Callisen et al. / Biophys J. 2002. - Vol. 83, №5. - P. 2617-2624.

108. Integration of purification with immobilization of Candida rugosa lipase for kinetic resolution of racemic ketoprofen / Y. Liu, J. Xu, H. Wu et al. // Biotechnol. 2004. - Vol. 110, №2. - P. 209-217.

109. Intensification of lipase biosynthesis as a result of electrofusion of Rhizopus cohniii protoplasts / R. Sawicka-Zukowska, D. Juszczakiewicz, A. Misiewicz et al. Appl Genet. - 2004. - Vol. 45, №1. - P. 37-48.

110. Intensification of lipase perfomance for long-term operation by immobilization on controlled pore silica in presence of polyethylene glycol / C. Soares, H. De Castro, M. Santana et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2002. - Vol. 98, №1. -P. 863-874.

111. Isolation and partial characterization of heat stable proteinase, lipase and phospholipase from Pseudomonas fluorescens / L. Stepaniak, S. Birkeland, T. Sor-haug et al // Milchuessenschaft. 1987. - Vol 42, №2.- P. 75-79.

112. Izumi I. Purification and characterization of a thermostable lipase from newly isolated Pseudomonas sp. KWI-56 /1. Izumi, T. Nakamura, K. Fukase // Ag-ric. Biol. Chem. 1990.- Vol. 54. -P. 1253-1258.

113. Jaeger K., Dijkstra В., Reets M. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnologocak applications of lipases / K. Jaeger, B. Dijkstra, M. Reets // Annu Rev Microbiol. 1999. - Vol. 53. -P. 315351.

114. Jaeger K. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology / K. Jaeger, M. Reetz // Trends Biotechnol. 1998. - Vol. 16, №9 - P. 396-403.

115. Kinetic studies of lipase from Candida rugosa: a comparative study between free and immobilized enzyme onto porous chitosan beads / E. Pereira, H. De Castro, F. De Moraes et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2001; - Vol. 91-93. - P. 739-752.

116. Kosugi J. Continious hydrolysis of oil by immobilized lipase in a counter-current reactor / J. Kosugi, H. Tanaka, N. Tomizuka // Biotechnol Bioeng. -1990. Vol. 36, №6. - P. 617-622.

117. Kraulis P. MOLSCRIPT: a Program to Produce Both Detailed and Schematic Plot of Protein Structures / P. Kraulis / J. Appl. Ciyst. 1991. - Vol. 24. -P. 946-950.

118. Langmuir and Langmuir-Blodgett films of amphiphilic hexa-peri-hexa-benzocoronene: new phase transitions and electronic properties controlled by pressure / N. Reitzel, T. Hassenkam, K. Balashev et al. / Chemistry. 2001. - Vol. 7, № 22.-P. 4894-4901

119. Leon A. Utilization of enzyme mixtures to retard bread crumb firming / A. Leon, E. Duran, C. Benedito De Barber // J Agric Food Chem. 2002. - Vol. 58, №6.-P. 1416-1419.

120. Lysophospholipase A activity of Pseudomonas aeruginosa type III secretory toxin ExoU / M. Tamura, T .Ajayi, L. Allmond et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - Vol. 316, №2. - P. 323-331.

121. Maugard Т. Study of vitamin ester synthesis by lipase-catalysed tran-setherification in organic media / T. Maugard, J. Tudella, M. Legoy // Biotechnol Prog. -2000. Vol. 16, №3. - P. 358-362.

122. Mijmoto K. On the insolubilized enzyme activities using adsorbents jon-exchanges / K. Mijmoto, T. Fujii, J. Miura // J. Ferment. Technol. 1971. - Vol. 49. -P. 565-573.

123. Minning S. De Lipase aus Rhizopus oiyzae: Klonierung, Expression, Re-inigung und Mutagenese eines industriell relevanten Enzyms fur die Biokatalyse und die Strukturbestimmung / S. Minning // 1999

124. Morrissey J. Stagonospora avenae secretes multiple enzymes that hydrolyze oat leaf cutins / J. Morrissey, J. Wubben, A. Osbourn // Mol Plant Microbe Interact. -2000. Vol. 13, №10. - P. 1041-1052.

125. Mutants provide evidence of the importance of glycosydic chains in the activation of lipase 1 from Candida rugosa / S. Brocca, M. Persson, E. Wehtje et al. // Protein Sci. 2000. - Vol. 9, № 5. - P. 985-990.

126. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tiley, S.J. Upton // J Biochem Biol. 1994. - Vol. 28. - P. 239-242.

127. Novel methods for studying lipids and lipases and their mutual interaction at interfaces. Part I. Atomic force microscopy / K. Balashev, T. Jensen, K. Kjaer et al. / Biochimie. 2001. - Vol. 83, №5. -P. 387-397.

128. Novel zink-binding center and a temperature switch in the Bacillus stearothermophilus LI lipase /S. Jeong, H. Kim, S. Chi et al. // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277, №28. - P. 17041-17047.

129. Optimization of a thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus PI: overexpression, purification, and characterization / S. Sinchaikul, B.Sookkheo, S.Phutrakul et al. // Protein Expr Purif. 2001. - Vol. 22, №3. - P. 388-398.

130. Oskolkova O. Fluorescent inhibitors reveal solvent-dependent micropo-larity in the lipid binding sites of lipases / O. Oskolkova, A. Hermetter // Biochim Biophys Acta. 2002 - Vol. 1597, №1. - p. 60-66.

131. Ota Y. Lipase from Candida paralipolytica. Purification, some properties and modification of the purified enzyme with the concentrated Sodium Chloride / Y. Ota, K. Yamada, T. Nakamija // Agr. Biol. Chem. 1970. - V. 34, № 9. - P. 13681378.

132. Penecreac'h G. Activity of Pseudomonas cepacia lipase in organic media is greatly enhanced after immobilization on a polypropylene support / G. Penecreac'h, J. Baratti / Appl Microbiol Biotechnol. 1997. - Vol. 47, №6. - P. 630635.

133. Perutz M. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M. Perutz // Nature. 1970. - Vol. 277, №19. - P. 17041-17047.

134. Pires E. Gas-phase enzymatic esterification on immobilized lipases in MCM-41 molecular sieves / E. Pires, E. Miranda, G. Valenca // Appl Biochem Biotechnol. 2002. - Vol. 98, №1.-P. 963-976.

135. Porcine pancreatic lipase. Completion of the primary structure / J. de Саго, M. Boudouard, J. Bonicel et al // Biochim Biophys Acta. 1981. - Vol 671, №2.-P. 129-138.

136. Posner I. The comparative kinetics of soluble and heparin-Sepharose-immobilized bovine lipoprotein lipase /1. Posner, C. Wang, W. McConathy // Arch Biochem Biophys. 1983. - Vol. 226, №1. - P. 306-316.

137. Purification and characterization of a Penicillium sp. lipase which discriminates against diglycerides / K. Gulomova, E. Ziomek, J. Schrag et al. 1996. -Vol. 31, №4. —P. 379-384.

138. Purification, immobilization, and stabilization of a lipase from Bacillus thermocatenulatus by interfacial adsorption on hydrophobic supports /J. Palomo, R. Segura, G. Fernandez-Lorente et al. // Biotechnol Prog. 2004. - Vol. 20, №2. - P. 630-635.

139. Raghavendra M. Phenylboronic acid a potent inhibitor of lipase from Oryza sativa / M. Raghavendra, V. Prakash // J Agric Food Chem. - 2002. - Vol. 50,№21.-P. 6031-6041.

140. Rational design of Rhizopus oryzae lipase with modified stereoselectivity toward triradylglycerols / H. Schleib, J. Pleiss, P. Stadler et al. // Protein Eng. -1998. Vol. 11, №8.-P. 675-682.

141. Redesigning the active site of Geothrichum candidum lipase / J. Schrag, T. Vernet, L. Laramee et al. // Protein Eng. 1994. - V. 8. - P. 835-842.

142. Regan D., Greenfield P. The industrial use of immobilized enzymes // Chemistry in Australia. -1978. Vol. 45, №9. -P. 317-321.

143. Roberts I. Secondary structures of rat lipolytic enzymes: circular dichroism studies and relation to hydrophobic moments /1. Roberts, P. Jacobson, J. Cornette // Biochem Biophys Res Commun. 1989. - Vol. 162, №1. -P. 95-101.

144. Schuleit M. Enzyme immobilization in silica-hardened organogels / M. Schuleit, P. Luisi // Biotechnol Bioeng. 2001. - Vol. 72, №2. - P. 249-253.

145. Schultz T. Stereoselectivity of Pseudomonas cepacia lipase toward secondary alcohols: A quantitative method / T. Schultz, J. Pleiss, R. Schmid // Protein Sci.-2000.-Vol. 9.-P. 1053-1062.

146. Self-assembly of Pseudomonas fluorescens lipase into bimolecular aggregates dramatically affects functional properties / G. Fernandez-Lorente, J. Palomo, C. Fuentes et al. // Biotechnol Bioeng. 2003. - Vol. 82, №2. - P. 232-237.

147. Semb H. The relation between glycosylation and activity of guinea pig lipoprotein lipase / H. Semb, T. Olivecrona // J Biol Chem. 1989. - Vol. 264, №7. -P. 4195-4200.

148. Semeriva M. Some properties of a lipase from Rhizopus arrhizus. Separation of a glycopeptide bond to the enzyme / M. Semeriva, G. Benzonana, D. Desnuelle // Biochim Biophys Acta. 1989. - Vol. 191, №3. - P.195-200.

149. Shuler M. Diffusive and electrostatic effects with immobilized enzymes / M. Shuler, R. Aris, H. Tsuchiya // J. Theor. Biol. 1972. - Vol. 35. - P. 67-76.

150. Significance of serum lipase in patients undergoing hemodialysis / T. Shibasaki, H. Matsuda, I. Ohno et al. // Am J Nephrol. 1996. - Vol. 16, №4. - P. 309-314.

151. Silva J. Evaluation of the catalytic activity of lipases immobilized on chrysotile for esterification / J. Silva, P. Jesus // An Acad Bras Cienc. 2003. - Vol. 75, №2.-P. 157-162.

152. Singh S. Fluorescence properties and conformation of human milk bile salt-activated lipase / S. Singh, D. Lee, C. Wang // Int J Biol Macromol. 1987. -Vol. 9,№5.-P. 294-296.

153. Structural and functional roles of highly conserved serines in human lipoprotein lipase / F. Faustinella, L. Smith, C. Semenkovich et al. // J Biol Chem. — 1991. Vol. 226, №25. - P. 9481-9485.

154. Structural basis for the intensitivity of a serine enzyme (palmitoyl-protein thioesterase) to phenylmethylsulphonylfluoride /А. Das, J. Bellizzi, S. Tan-del et al. // J Biol Chem 2000. - Vol. 275, №31.- P. 23847-23851.

155. Structure and composition of the fusion pore / B. Jena, S. Cho, A. Jeremic et al. // Biophys J. 2003. - Vol. 84, №2. - P. 1337-1343.

156. Studies on immobilized lipase in hydrophobic sol-gel / C. Soares, O. Dos Santos, H. De Castro et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2004. - Vol. 113, №1-3. -P. 307-320.

157. Svendsen A. Lipase protein engineering / A. Svendsen // Biochim Biophys Acta. 2000. - Vol. 1543. - P. 223-238.

158. Synthesis of inactive nonsecretable high mannose-type lipoprotein lipase by cultured brown adipocytes of combined lipase-deficient mice / H. Masuno, E. Blanchette-Mackie, S. Chemick et al. // J Biol Chem. 1990. - Vol. 265, 3. - P. 1628-1638.

159. Taylor C. Controlling calcium entry / C. Taylor // Cell. 2002. - Vol. 111.-P. 767-769.

160. The alpha/beta hydrolase fold / P. Ollis, E. Cheach, M. Cygler et al. // Protein Eng. 1992. - Vol. 5, N3. - P. 197-211.

161. The cold-active lipase of Pseudomonas fragi. Heterologous expression, biochemical characterization and molecular modeling / C. Alquati, L. De Gioia, G. Santarossa et al. Eur J Biochem. - 2002. - Vol. 269, №13. - P. 3321-3328.

162. The crystal structure of Bacillus subtilis lipase: a minimal alpha/beta hydrolase fold enzyme / G. van Pouderoyen, T. Eggert, K. Jaeger et al. // J Mol Biol. -2001.- Vol. 309,№1.-P. 215-226.

163. The crystal structure of bovine bile salt activated lipase: insights into the bile salt activated mechanism / X. Wang, C. Wang, J. Tang et al. // Structure. -1997. Vol. 5, №9. - P. 1209-1218.

164. The crystal structure of s tryacylglycerol lipase from Pseudomonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of a bound inhibitor / K. Kim, H. Song, D. Shin et al. // Structure. 1997. - Vol. 5, №2. - P. 173-185.

165. The crystal structure of triacyclglycerol lipase from Pseudomonas glu-mae reveals a partially redundant catalytic aspartate / M. Noble, A. Cleasby, J Johnson et al. //FEBS 13020. 1993.-Vol 331, №1-2. - P.123-128.

166. The cysteine residues of recombinant human gastric lipase / S. Canaan, M. Riviere, R. Verger et al. // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - Vol. 257, №3. - VoL 851-854.

167. The folding and activity of the extracellular lipase of Rhizopus oryzae are modulated from a prosequence / H. Beer, G. Wohlfahrt, R. Schmid // Biochem J. 1996. - Vol. 319. - P. 351-359.

168. The primaiy structure of porcine colipase II. I. The amino acid sequence / M. Charles, C. Erlanson, J. Bianchetta et al. // Biochim Biophys Acta. 1974. - Vol 359, №1.-P. 186-197.

169. Toshijuki N. Purification and some properties of lipase produced by Pseudomonas fragi / N. Toshijuki, C. Takahide //Agr and Biol Chem. 1987. - Vol. 51,№1.-P. 181-186.

170. Vasileva-Tonkova E. Hydrolytic enzymes and surfactants of bacterial isolates from lubricant-contaminated wastewater / E. Vasileva-Tonkova, D. Galabova // Z Naturforsch. 2003. - Vol. 58, №1-2. - P. 87-92.

171. Wang С. Kinetics of acylglycerol sequental hydrolysis and effect of tauricholate as fatty acid acceptor / C. Wang, J. Hartsuck, D. Downs // Biochem. — 1988. Vol. 27, №13. - P. 4834-4840.

172. Weight cycling-induced alteration in fatty acid metabolism / M. Sea, W.Fong, Y. Huang et al. // Am Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2002. - Vol. 279, №3.-P. 1145-1155.

173. Willstatter R. Problems and methods of enzyme research. -Jthaca: Cornell University Press, 1927. 52 p.

174. Yahya A. Ester synthesis in lipase-catalyzed reactions / A. Yahya, W. Anderson, M. Moo-Young // Enzyme Microb Technol. 1998. - Vol. 23. - P. 438450.154

Информация о работе

Трофимова, Ольга Дмитриевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы