Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403"

На правахрукописи

ЯНЫШЕВА НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИММОБИЛИЗАЦИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА яитгориБ ояуглЕ 1403

Специальность 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена па кафедре микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии (ВГТА)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

ГРИГОРОВ Василий Степанович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

ЯМСКОВ Игорь Александрович

Ведущая организация: научно-технический центр

биотехнологии «Лекарства и биотехнология» (Лекбиотех)

Защита состоится «_;£}> а^оеил 2005 г. вЛ)_чл>мин па заседании Диссертационного Совета ДМ.212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047. Москва, Миусская пл.. д. 9) в 443 ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Менделеева.

Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в 2-х экземплярах, заверенных печатью учреждения, по вышеуказанному адресу.

Автореферат диссертации разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук, профессор БРАУДО Евгений Евгеньевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.

Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерифи-кации открыли новые возможности использования липаз.

Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимиче-ской, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.

Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.

Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих плану госбюджетной НИР на 2001-2005 гг. (№ гос. регистрации 01930004491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цели и задачи исследования. Цель работы - получение препаратов липазы Rhizopus оуае 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некоторых аспектов практического использования липазы в хлебопечении. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очистки;

установление фракционного состава липолитического комплекса продуцента;

исследование некоторых свойств изоферментов липазы; изучение каталитических свойств Липазы I:

♦ идентификация функциональных групп активного центра;

♦ определение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридов;

♦ изучение специфичности действия. иммобилизация липазы химическим и физическим способами; исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазами;

проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами; изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).

Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus оуае 1403 состоит из двух изоформ.

На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сери-новым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.

Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностью; селективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.

Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.

Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоносажденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17-2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001); «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001); 6-ой Международной научной конференции памяти В. М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотех-

нология микробов» (Москва, 2004); ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999-2002 г.г. и др.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц. Список литературы включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.

Автор выражает глубокую благодарность кандидату технических наук, доценту кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии СВЕТЛАНЕ АЛЕКСЕЕВНЕ ШЕЛАМОВОЙ, при непосредственном консультировании которой была выполнена настоящая работа.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Представлены данные литературы по способности микроорганизмов различных таксономических групп к синтезу липазы, современные подходы к получению препаратов различной чистоты. Обобщены данные по изучению их физико-химических свойств, структуры, механизма действия и специфичности. Дано описание способов иммобилизации микробных липаз на различных носителях и приведены их некоторые характеристики. Рассмотрены современные направления применения свободных и иммобилизованных липаз в различных отраслях промышленности.

Экспериментальная часть

Объект исследований. В работе использовали штамм мик-ромицета Rhizopus oryzae 1403, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Биосинтез липазы осуществляли глубинным способом в колбах объемом 500 см3 на лабораторной

качалке со скоростью вращения 1,7-1,8 с-1, температуре 28-30 °С в течение 60 ч.

Методы исследований. Активность липазы определяли методами Ota, Machida и рН-статирования. Высокоочищенный ферментный препарат получали методами гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и электорофореза в ПААГ. Кинетические свойства липазы изучали по начальной скорости реакции гидролиза субстрата. Значения констант находили путем подбора в ходе интегральной обработки экспериментальных данных. Анализ состава жирных кислот в маслах проводили методом ионообменной и газовой хроматографии. Разделение моно-, ди- и триг-лицеридов осуществляли методом тонкослойной и высокоразрешающей жидкостной хроматографии.

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 3-7-кратной повторности. Обсуждаются данные, величина достоверности которых не превышала 0,05. Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации. В исследованиях было применено центральное композиционное ротатабельное униформпланирование.

Результаты исследований

Получение препаратов липазы Rhizopus orvz.ae 1403, изучение их фракционного состава и физико-химических свойств. Технические препараты липазы выделяли путем ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями, сублимационной сушки.

Активность препарата полученного с помощью ультрафильтрации составила 2424 ед/г, осажденного этанолом и ацетоном 2746 и 3647 ед/г соответственно.

Очистку липолитического комплекса проводили путем гель-фильтрации на Sephadex G-150 и ионообменной хроматографии на DEAE Cellulose-52 с применением ступенчатого градиента концентрации NaCl от 0,1 до 0,9 М. Липаза I элюировалась при концентрации NaCl 0,1 М, а Липаза II - 0,7 М. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика этапов очистки липазы Rhizopus oryzae 1403

Липазная активность Выход,

Этапы очистки Количество белка, мг удельная, ед/мг общая х10,3 ед Степень очистки по активно-сти, %

Фильтрат

культуральной

жидкости 1784 ±54 11,8 ±0,4 21,0 ±0,63 100,00

Ультрафильтрация на мембране УАМ-ЗО 961 ±29 21,2 ±0,6 20,4 ±0,61 1,80 97,00

Подкисление

ультраконцентрата до рН 5,5 804 ± 24 22,9 ± 0,7 18,5 ±0,45 1,95 87,9

Осаждение

ацетоном (1:1) 50 ±1,5 121,3 ± 4 6,1 ±0,22 10,30 28,91

Гель-фильтрация

на 8ерИаёех О-150 33 ±1,0 165,2 ± 5 5,6 ±0,08 14,00 26,22

Хроматография I 2,0 ±0,1 880,2 ± 26 1,8 ±0,05 74,72 8,38

на БЕЛЕ-5 2 II 3,6 ±0,1 683,2 ± 20 2,5 ± 0,07 58,00 11,74

Молекулярную массу фракций липазы определяли методами гель-фильтрации и электрофореза в присутствии SDS. Исследования показали, что она была практически одинаковой у двух изоферментов и равнялась (44±2) кДа.

Оптимальная температура действия для обеих форм составила (35±1) °С, рН-оптимум для Липазы 1-6,5; Липазы II - 6,0 (рис. 1); pl 3,0 и 4,2 соответственно.

Рис. 1 Влияние температуры и рН на активность липазы Rh.iz.opus о^ае 1403: 1 -Липаза 1,2- Липаза И

Аминокислотный состав изоформ различался отношением (С1х+Азх)/(Ьу5+А^) - для Липазы I оно составило 3,23, Липазы П -2,27, что согласуется с их изоэлектрическими точками.

Исследование кинетических характеристик гидролиза трибутирина Липазой I. Известно, что основными продуктами гидролиза субстратов липазой Rhizopus оуае 1403 являются диглицериды и жирные кислоты, моноглицериды образуются в незначительном количестве, поэтому схему процесса можно представить следующим образом:

ТГ-^ДГ + ЖК (1)

Зависимость начальной стационарной скорости гидролиза от концентрации субстрата будет иметь вид уравнения Михаэли-са:

где к2 — константа; К - константа Михаэлиса; Cso и Сео — начальная концентрация субстрата и фермента соответственно.

После преобразования уравнения получили зависимость, CE,</v=f(l/CSia) с помощью которой находили константы Км и к2.

В результате эксперимента были получены серии кинетических кривых гидролиза трибутирина Липазой I (рис. 2).

Кинетические константы процесса, определенные по методу двойных обратных координат Лайнуивера-Берка составили: Км = 786 цМ и Утах = 4,66 цМ-мин'-мг"1. В ходе интегральной обработки экспериментальных данных согласно схеме (1) и уравнению (2) были найдены эффективные константы скорости гидролиза к2 и уточненное значение Км, которое составило 779 цМ.

Исследования по влиянию температуры на кинетические константы позволили установить энергию активации Еа для реакции гидролиза трибутирина, которая составила 19,8 кДж-моль-1, что согласуется с литературными данными для ферментативных реакций (рис. 3).

По логарифмической зависимости 1/кг от рН при концентрации субстрата, далекой от насыщения, были определены рК функциональных групп Липазы I рК]=5,2; рК2-6,9 (рис. 4). Эти значения близки к рК карбоксильной группы и имидазола гисти-дина.

Рис. 3. Зависимость 1 /к фермента- Рис. 4 Определение рК функциональ-тивного гидролиза трибути- ных групп Липазы I

рина от температуры

Исследование функциональных групп активного центра Липазы I. Для идентификации функциональных групп активного центра Липазы I использовали инактивацию фермента специфическими реагентами.

Для подтверждения участия гистидина в каталитическом действии Липазы I проводили её модификацию фотоокислением в присутствии метиленовой сини (рис. 5 а) и диэтилпирокарбона-том (DEP).

По зависимости инактивации Липазы I при фотоокислении от рН были определены рК функциональной группы - 6,5 (рис. 5, б) и величина теплоты ионизации - 29,1 кДж-моль-1, что указывает на наличие гистидина в активном центре фермента.

5,5 6 6,5 7 рН

0,5 -'-'-1->-■-■

О 10 20 30 40 т, мин 60

Рис. 5. Зависимость скорости ферментативной реакции для фотоинактивиро-ванной Липазы I от значения рН: а) временные скорости гидролиза субстрата: (Д) - 6,5; (□) - 6,0; (О) - 5,5; (*) - 7,0, (*) - 7,5; б) определение рК фотоокисляемой группы

При исследовании процесса ингибирования Липазы I DEP установлено характерное для его взаимодействия с гистидином повышение поглощения при 242 нм и реактивация гидроксиламином.

Определены кинетические характеристики реакции гидролиза трибутирина Липазой I в присутствии различных ингибиторов (табл. 2). DEP уменьшает Утах, а сродство фермента к субстрату не изменяется. Модификация PMSF, по-видимому, приводит не только к блокированию активного центра, но и к изменениям в конформации молекулы фермента, препятствующим связыванию её с субстратом.

Под действием п-ХМБ отмечено увеличение только Км. Это говорит о том, что SH-группы Липазы I не задействованы в

самом акте катализа, но участвуют в поддержании активной кон-формации молекулы.

Таблица 2

Кинетические характеристики гидролиза трибутирина Липазой I в присутствии модификаторов

Модификатор Км, цМ V * шах, цМ мин"', мг'

- (Нативный фермент) 779 ±23 4,66 ± 0,2

Диэтилпирокарбонат 791 ±24 1,84 ±0,1

л-Хлормеркурибензоат 1134 ±34 4,44 а 0,2

Фенилметилсульфонилфторид 1180 ±35 1,70 ±0,1

Исследование специфичности действия липазы ЯМгоую огуг.ае 1403 и определение кинетических характеристик ферментативного гидролиза триглицеридов. В настоящей работе субстратную специфичность липазы из ЯЫ^орш отутде 1403 исследовали с использованием природных и синтетических триа-цилглицеринов. При этом реализованы различные подходы - динамика гидролиза субстратов и анализ образовавшихся продуктов, что позволило дать многостороннюю оценку специфичности данной липазы.

Установлено, что ацетоносажденным препаратом липазы с различной интенсивностью гидролизуется широкий спектр природных жиров и масел. Лучшими субстратами являются оливковое, подсолнечное, кукурузное и соевое масла.

При исследовании специфичности Липазы I определялись кинетические параметры гидролиза триглицеридов, жирнокис-лотная и позиционная специфичность.

На триглицеридах выявлена корреляция между сродством фермента к субстратам и максимальной скоростью их расщепления (табл. 3). На трипальмитине и тристеарине активность не выявлена, на тримиристине она была очень низкой. По всей вероятности, это связано с тем, что эти субстраты были твердыми в условиях эксперимента. Таким образом, по сродству Липазы I к синтетическим триглицеридам их можно расположить в следующий ряд:

С4<С8 <C10<C12<C181 <С[82

Таблица 3

Кинетические характеристики ферментативного гидролиза триглицеридов Липазой I

Позиционную специфичность Липазы I выражали через значение PSI (positional spedifty index), отражающего соотношение 1,2(2,3) и 1,3-диглицеридов в составе продуктов гидролиза (табл. 4). Липазу I можно отнести скорее к позиционно специфичным липазам, чем неспецифичным PSI, которых находится в пределах от +80 до +70.

Таблица 4

Определение позиционной специфичности Липазы I

Субстрат Массовая доля продуктов гидролиза, % PSI

1,2(2,3 )-диглицериды 1,3-диглицериды

Триолеин 9,76 ± 0,29 0,49 ±0,015 +81,8

Оливковое масло 8,23 ± 0,25 0,51 ±0,015 +77,9

Какао-масло 6,85 ± 0,20 0,63 ±0,019 +60,6

Для определения жирнокислотной специфичности липазы в качестве субстратов использовали метиловые эфиры жирных кислот, полученные путем метилирования различных природных масел и жиров, имеющих характерный жирнокислотный состав (молочный и рыбий жир, касторовое и льняное масло). Специфичность фермента оценивали по коэффициенту К(ЕЛ), представляющему отношение концентрации жирных кислот в продуктах гидролиза к их концентрации в исходном субстрате (рис. 4).

Если скорость накопления жирной кислоты ниже средней, то K(FA)<1, при предпочтительном гидролизе коэффициент K(FA) > 1.

Выявлена предпочтительность Липазы I к жирным кислотам С12 -С18. В этих пределах выражена специфичность к ненасыщенным жирным кислотам с одной и двумя двойными связями. Линоленовая кислота являлась менее предпочтительной, так же как и рицинолевая. Это говорит о том, что наличие большого количества (больше 2) двойных связей и окси-группы может создавать стери-ческие помехи при соединении фермента с субстратом.

Иммобилизация_липазы

Rhizopus огугае 1403 и исследование её физико-химических свойств. Иммобилизацию ацетоносажденной липазы осуществляли на двух носителях. Это гидрофобный сорбент стиросорб МЭР 100 (ЦГ), полученный сшиванием полистирола моно-хлордиэтиловым эфиром в среде циклогексана и анионообменная смола АВ-17-2П, отработанная в сахарорафинадном производстве. При очистке сахарных сиропов происходит необратимое поглощение ионо-обменником меланоидинов, что позволяет использовать его для связывания белков.

Эффективность иммобилизации на гидрофобном сорбенте составила 67,5 %, на АВ-17-2П - 23 %.

Оптимальные условия действия фермента при адсорбции на стиросорбе не изменились, а при связывании с анионитом оптимум температуры повысился до 40 °С, а рН-сдвинулся в щелочную зону - от 6,5 до 7,0.

Сравнение кинетических параметров гидролиза трибутири-на растворимой и связанными формами липазы показали, что при иммобилизации сродство фермента к субстрату увеличивается, о чем свидетельствует понижение кажущейся константы Михаэли-са (Км). А величина Угаах снижается - при связывании с ионооб-менником в 4,8, а со стиросорбом в 1,2 раза. Отношение Утах/Км показывает большую производительность связанной с АВ-17-2П липазы по отношению к трибутирину (табл. 5).

Таблица 5 Значения Км и Ущ^ реакции гидролиза трибутирина различными препаратами липаз

Ферментный препарат Км, ^М V * шах» мкмоль мин"1 мг'1 %

Растворимая липаза 351 ±11 3,8 ±0,11 10,8 100

Иммобилизованная на стиросорбе липаза 311 ±9 3,1 ±0,09 9,9 92

Иммобилизованная на анионите АВ-17-2П липаза 65,7 ±2 0,8 ± 0, 02 14,5 131

Показана возможность использования иммобилизованных липаз для гидролиза подсолнечного масла непрерывным способом в лабораторном реакторе. Установлено, что время полужизни для связанной с анионитом липазы составило 96 ч, а со стиросорбом -18 ч. Масло, полученное путем обработки в реакторе с иммобилизованными липазами целесообразно использовать в производстве хлебобулочных изделий.

Некоторые аспекты использования гидролизованного иммобилизованной липазой Rhiz.opus (>гу?ае 1403 масла в хлебопечении. С целью научного обоснования применения гидроли-зованного масла в технологии хлебопечения нами исследовано его влияние на жизнедеятельность дрожжевых клеток, свойства клейковины пшеничного теста и пшеничного крахмала.

Гидролиз масла проводили непрерывным способом в реакторе с иммобилизованной липазой при температуре 35 °С, до содержания свободных жирных кислот 6,8; 9,6 и 12,5 %. Массовая доля добавляемого масла составляла 2, 5,7,10%.

При культивировании

дрожжей на модельной синтетической среде установлено, что в присутствии гидролизованного масла в сравнении с нативным ускоряется потребление глюкозы (С, % от исходного) дрожжевыми клетками (рис. 7, а). Подобный эффект получен с жирными кислотами - олеиновой и линолевой. Это может быть связано с повышением проницаемости мембран клеток и снижением затормаживающего действия нативного масла на проникновение в них углеводов. Этим объясняется интенсификация процессов брожения теста при использовании гидроли-зованного масла.

Показано, что характер изменения деформирующей нагрузке сжатия изменяется при добавлении масла. Оно придает клейковине пластичные свойства, о чем свидетельствует монотонное возрастание в процессе брожения.

т-►

Рис. 7. Влияние 5 % нативного и гидролизованного масла, со степенью расщепления (о) 6,8 %; (0) 9,6 %; (Д) 12,5 %; на динамику потребления глюкозы дрожжевыми клетками (а); свойства клейковины в процессе брожения (б); формирование крахмального студня (в); (•) на-тивное масло; Со) контроль

Гидролизованное масло способствует повышению сопротивляемости клейковины нагрузке сжатия (рис. 7, б). По нашему мнению, решающую роль в получении такого эффекта играют жирные кислоты. Они являются поверхностно-активными веществами с дифильным строением. Адсорбируясь на межфазовой поверхности, такие соединения снижают поверхностное натяжение, что эквивалентно образованию новой поверхности.

, Для моделирования состояния крахмальной фракции муки в готовых хлебобулочных изделиях изучено влияние гидроли-зованного масла на процесс формирования крахмального студня по изменению его пластической прочности (Рк, МПа). Прочность крахмального студня была максимальной без масла и снижалась по мере увеличения его концентрации. Очевидно, масло в этом случае выполняет роль пластификатора, уменьшая энергию связи частиц и затрудняя стабилизацию структуры.

Гидролизованное масло способствовало повышению прочности крахмального студня (рис. 7, в). Вероятно, большая прочность создается за счет создания комплексов амилозы и амило-пектина с моно- и диглицеридами, которые, как известно, вызывают флоккуляцию крахмальных зерен и увеличивают таким образом степень полимеризации студня.

Установлено, что при хранении крахмальных студней в течении 3-х сут, их пластическая прочность возрастала, но в образцах с гидролизованным маслом этот процесс протекал медленнее.

Изменение свойств клейковины и крахмала под влиянием гидролизованного масла позволяет стабилизировать физические свойства теста. Регулировать этот эффект в зависимости от исходных свойств муки можно степенью гидролиза масла.

Таким образом, данными исследованиями обоснован положительный эффект использования масла, подвергнутого ферментативному гидролизу липазой ЯЫгорш отугав 1403, в хлебопечении. Улучшались физические свойства теста, интенсифицировалось брожение и замедлялось черствение готовых изделий. Это доказано в производственных условиях в технологии приготовления батона нарезного - на ОАО «Хлебозавод № 2» г. Воронежа.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения препаратов липазы микроми-цета Rhizopus оуае 1403 на основе ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями, вакуум-сублимационной сушки. Активность препаратов составила 2424 и 2746-3647 ед/г соответственно.

2. Методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии установлено наличие двух изоформ фермента, обозначенных как Липаза I и Липаза II. Удельная активность Липазы I составила 880,2; Липазы II - 683,2 ед/мг белка. Изоферменты отличались pI: Ь3,0, П-4,2; рН-оптимумом - 6,5 и 6,0 соответственно. Оптимальная температура действия для обеих изоформ - (35±1) °С. Молекулярная масса была одинаковой - (44±2) кДа.

3. Значения рК ионизации Липазы I - 5,2 и 6,9 позволяют предположить участие в её каталитическом действии остатков гистиди-на и карбоксильной группы.

4. Наличие гистидина в активном центре Липазы I доказано значениями рК и теплоты ионизации (29,1 кДж -моль'), инактивацией фотоокислением и снижением У^ при ингибировании диэтил-пирокарбонатом. Фермент относится к сериновым гидролазам, так как ингибируется фенилметилсульфонилфторидом.

5. Липаза I проявляет селективность к жирным кислотам со средней длиной цепи (С12-С18), содержащим не более 2 двойных связей и обладает специфичностью к 1 и 3 положению в тригли-церидах.

6. Установлены оптимальные условия иммобилизации ацетоносаж-денной липазы с помощью адсорбции на стиросорбе и связывания с анионитом АВ-17-2П. Эффективность иммобилизации составила 67,5 и 23,0 % соответственно; время полужизни препаратов при непрерывной работе лабораторного реактора 18 и 96 ч соответственно.

7: Обоснован положительный эффект влияния масла, подвергнутого ферментативному гидролизу липазой Rhizopus oryzae 1403, в хлебопечении по увеличению интенсивности потребления глюкозы дрожжевыми клетками, улучшению свойств клейковины теста и суспензий пшеничного крахмала.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ковалева Т. А., Шеламова С. А., Трофимова О. Д., Бондарева Н. В. Исследование физико-химических и кинетических характеристик свободной и иммобилизованной липазы из Як.

]аротет II Труды ГУ международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и пути их использования», Москва-Пущино, 20-24 июня 2001 г., М.: Изд-во Росс. ун-та дружбы народов, 2001. - Т. 3. - С. 493-495

2. Шеламова С. А., Ковалева Т. А., Селеменев В. Ф., Трофимова О. Д., Бондарева Н. В. Иммобилизация липазы Як. ]аротеш 1403 путем ковалентного связывания // Биотехнология, 2001. -№5.-С. 32-39

3. Ковалева Т. А., Шеламова С. А., Трофимова О. Д., Бондарева Н. В., Селеменев В. Ф. Иммобилизация липазы ЯМгорт

]аротеш на анионите АВ-17-2П модифицированным глута-ральдегидным методом // Сорбционные и хроматографические процессы, 2001. - Т. 1. - Вып. 1. - С. 107-113

4. Шеламова С. А., Ковалева Т. А., Янышева Н. В., Трофимова О. Д. Функциональность жировых продуктов в хлебопечении // Материалы международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг», Орел, 18-21 дек. 2001. - Орел, 2001. - Т. 1. - С. 304

5. Шеламова С. А., Дерканосова Н. М, Ковалева Т. А., Янышева Н. В., Трофимова О. Д. Масла как регуляторы свойств клейковины // Сборник докладов юбил. научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века». - М., 2001. - Т. 1. - С. 115

6. Ковалева Т. А., Шеламова С. А., Трофимова О. Д., Бондарева Н. В. Исследование особенностей строения активного центра липазы ЯЫ1орш]аротеш II Вестник ВГУ. - 2001. - № 2. - С. 114-117

7. Кретов И. Т, Шахов С. В., Шеламова С. А., Рязанов А. Н., Янышева Н. В. Технология получения ферментного препарата липазы // Вестник РАСХН. - 2002. - № 4. - С. 76-79

8. Шеламова С. А., Янышева Н. В., Дерканосова Н. М., Ковалева Т. А., Трофимова О. Д. Исследование влияния модифицированного растительного масла на свойства клейковины // Вестник РАСХН. - 2002. - № 5. - С. 82-85

9. Дерканосова Н. М., Шеламова С. А., Янышева Н. В. Влияние гидролизованных масел на некоторые функции дрожжевых кле-

Б/1

ток // Сб. научных трудов «Производство продуктов питания из растительного сырья: свершения и надежды». - Воронеж, 2002. -С. 277

Ю.Шеламова С. А., Дерканосова Н. М., Янышева Н. В. Биоконверсия растительных масел в технологии приготовления диетических сортов хлеба // Сб. докл. 6-ой Междунар. науч. конф. памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья», М., 5-6 дек. 2002 г. — М., 2002. - С. 60-62

П.Ковалева Т. А., Артюхов В. Г., Трофимова О. Д., Шеламова С. А., Янышева Н. В. Модификация глутаральдегидного метода при иммобилизации липазы из Rh. japonicus II Каталог рефератов и статей международного форума «Аналитики и аналитика», Воронеж, 2 - 6 июня. - 2003 г. - Воронеж. - С. 413

12.Пат. 2233325 РФ, МПК7 С 12 N 9/02. Способ получения комплексного ферментного препарата липазы и липоксигеназы / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева (РФ). - № 2003100557/13. За-явл. 08.01.2003. Опубл. 27.07.2004. Бюл. №21

13.Шеламова С. А., Селеменев В. Ф., Янышева Н. В. Ковалентная и адсорбционная иммобилизация липазы Rhizopus огугае 1403 // Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов». — М.: МАКС Пресс. - 2004. - С. 97

Лицензия ЛР № 020449 от 31. 10. 97 Подписано в печать 25.01.2005. Формат бум. 60*90 у1( Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Ризограф ия. Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 107

Типография Воронежского ЦНТИ 394730 Воронеж, пр. Революции, 30 \

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Янышева, Наталья Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами.

1.2. Характеристика свойств микробных липаз

1.2.1. Выделение и очистка препаратов липаз.

1.2.2. Физико-химические свойства и особенности строения нативных липаз.

1.2.3. Специфичность действия микробных липаз.

1.3. Иммобилизация липолитических ферментов.

• 1.3.1. Физико-химические свойства иммобилизованных липаз.

1.4. Практическое использование липолититческих ферментов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403"

Актуальность темы. Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.

Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерификации открыли новые возможности использования липаз.

Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.

Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.

Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих плану госбюджетной НИР на 2001-2005 гг. (№ гос. регистрации 01930004491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цели и задачи исследования. Цель работы - получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некоторых аспектов практического использования липазы в хлебопечении. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

S разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очистки; S установление фракционного состава липолитического комплекса продуцента; S исследование некоторых свойств изоферментов липазы; S изучение каталитических свойств Липазы I: идентификация функциональных групп активного центра; определение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридов; изучение специфичности действия.

S иммобилизация липазы химическим и физическим способами; •S исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазами; S проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами; S изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).

Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus oryzae 1403 состоит из двух изоформ.

На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сериновым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.

Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностью; селективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.

Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.

Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоноса-жденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17-2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001); «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001); 6-ой Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); 7-ой Пущин-ской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999-2002 г.г. и др.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц. Список литературы включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Янышева, Наталья Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения препаратов липазы микромицета Rhizopus oryzae 1403 на основе ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями, вакуум-сублимационной сушки. Активность препаратов составила 2424 и 2746-3647 ед/г соответственно.

2. Методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии установлено наличие двух изоформ фермента, обозначенных как Липаза I и Липаза II. Удельная активность Липазы I составила 880,2; Липазы II — 683,2 ед/мг белка. Изо-ферменты отличались pi: 1-3,0, Н-4,2; рН-оптимумом - 6,5 и 6,0 соответственно. Оптимальная температура действия для обеих изоформ - (35±1) °С. Молекулярная масса была одинаковой - (44±2) кДа.

3. Значения рК ионизации Липазы I - 5,2 и 6,9 позволяют предположить участие в её каталитическом действии остатков гистидина и карбоксильной группы.

4. Наличие гистидина в активном центре Липазы I доказано значениями рК и теплоты ионизации (29,1 кДж -моль'1), инактивацией фотоокислением и снижением Vl7m при ингибировании диэтилпирокарбонатом. Фермент относится к сериновым гидролазам, так как ингибируется фенилметилсульфонилфторидом.

5. Липаза I проявляет селективность к жирным кислотам со средней длиной цепи (С12-С18), содержащим не более 2 двойных связей и обладает специфичностью к 1 и 3 положению в триглицеридах.

6. Установлены оптимальные условия иммобилизации ацетоносажденной липазы с помощью адсорбции на стиросорбе и связывания с анионитом АВ-17-2П. Эффективность иммобилизации составила 67,5 и 23,0 % соответственно; время полужизни препаратов при непрерывной работе лабораторного реактора 18 и 96 ч соответственно.

7. Обоснован положительный эффект влияния масла, подвергнутого ферментативному гидролизу липазой Rhizopus oryzae 1403, в хлебопечении по увеличению интенсивности потребления глюкозы дрожжевыми клетками, улучшению свойств клейковины теста и суспензий пшеничного крахмала.

6.4. Заключение

Таким образом, данными исследованиями обоснован положительный эффект использования масла, подвергнутого ферментативному гидролизу иммобилизованной липазой Rhizopus oryzae 1403 в производстве хлебобулочных изделий. Улучшаются физические свойства теста, интенсифицируется брожение и замедляется черствение готовых изделий. Это подтверждено производственными испытаниями в заводских условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Янышева, Наталья Васильевна, Москва

1. Алмаши А. Бысторое замораживание пищевых продуктов / Пер. с англ. А. Алмаши, Л. Эрдели, Т. Шарой. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. -408 с.

2. Аре Р. Ю. Очистка, физико-химические и каталитические свойства микробных липаз. Обзор. / Р. Ю. Аре, Б. Я. Лусиня, М. Г. Плата и др. // Известия АН Латвийской ССР. 1979. -№ 6. - С. 92-106

3. Ауэрман Л. Я. Технология хлебопекарного производства. 8-е изд. пере-раб. и допол. -М.: Легая и пищевая пром-сть, 1984. -416 с.

4. Байчив И. Изучение возможности применения липолитически активныхштаммов дрожжей для улучшения органолептических качеств ветчины / И. Байчев, М. Радева, Е. Митева и др. // Мясопромышленность. 1980. — Т. 13-№ 4. - С. 16-18

5. Башкатова Н. А. Липазы некоторых грамотрицательных бактерий // Ав-тореф. . к. б. н. М.: МГУ, 1980. - 23 с.

6. Беззубов Л. П. Химия жиров. Учебник для техникумов пищевой промети. 3-е изд.перераб. и доп. М.: Пищевая пром-сть, 1975. - 279 с.

7. Березин И. В. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованныеферменты / И. В. Березин, К. Мартинек / Учебн. пособие для студ. хим. и биол. фак-в ун-в. М.: МГУ, 1982. - 383 с.

8. Березин И. В. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология / И. В. Березин, Н. В. Клячко, А. В. Левашов и др. М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

9. Берри Д. Биология дрожжей / Пер. с англ. В. Г. Горбулева, под ред. Н. М. Мейселя.-М.: Мир, 1985.-95 с.

10. Брокерхоф К. Липолитические ферменты / К. Брокерхоф, Р. Дженсен, пер. с англ. Т. П. Левчук и др., под ред. Браунштейна А. Е. и др. —1. М.: Мир, 1978.-396 с.

11. Буник В. И. О функциональной роли гистидиновых остатков а-кетоглутаратдегидрогеназы / В. И. Буник, В. С. Гомазкова // Биохимия. 1987. - Т. 52. - С. 1235-1247

12. Варфоломеев С. Д. Биокинетика: Практический курс / С. Д. Варфоломеев, К. Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

13. Васильченко С. А. Липолитическая активность гриба Blakeslea trispora / С. А. Васильченко, Л. В. Баталкина, С. В. Васильченко и др. // Вопр. химии и хим. технол. Харьков. - 1989. - № 91. - С. 49-52

14. Вершинина О. Л. Пищевые добавки липидной природы и перспективы их применения в хлебопекарной промышленности / О. Л. Вершинина, Н. Н. Корнен, С. А. Ильинова // Изв. вузов. Пищевая технол. — 2001. -№ 1. С. 25-28

15. Вода в пищевых продуктах. / Под ред. Р. Б. Дакуорта, пер. с англ. Р. Н. Евтеевой, Г. Е. Русанова, под ред. А. С. Гинзбурга, Г. Е. Русанова. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 376 с.

16. Волошина Т. Ю. Разработка способа получения растворимой и иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 14 и её характеристика: Дисс. .к. т. н. М.: МГАПП, 1995. - 194 с.

17. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1988.-215 с.

18. Гааль Э. Электорофорез в разделении биологических макромолекул. / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи: Пер. с англ. Е. Б. Мейзеля и др., под ред. В. И. Розенгарта. М.: Мир, 1982. - 446 с.

19. Горячева А. Ф. Пути улучшения качества хлеба и сохранение его свежести / А. Ф. Горячева, Р. В. Кузьминскаий. М.: ЦНИИТЭИпищепром,1984.-28 с.

20. Горячева А. Ф. Жиры в хлебопечении / А. Ф. Горячева, В. С. Семенов, И. П. Изосимова. М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1985. - 35 с.

21. Грачев Ю. П. Математические методы планирования экспериментов. — М.: Пищевая пром-сть, 1979. 199 с.

22. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова / Учебник для студ. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Элевар, 2000.-512 с.

23. Григорьева Т. А. Изучение процесса ультрафильтрации растворов грибной липазы / Т. А. Григорьева, А. М. Рожанская и др. // Прикл. биохимия и микробиол.- 1977.-Т. 13.-Вып. 5.-С. 779-781

24. Давранов К. Д. Выделение и характеристика внеклеточных липаз микро-мицета Penicillium sp. / К. Д. Давранов, К. А. Тумялова, Б. Розмухамедова, М. Шамилева // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т. 30. - № 2. -С. 234-237

25. Давранов К. Д. Липаза гриба Rh. microsporus / К. Д. Давранов, М. 3. Заки-ров, М. И. Ризаева // Химия природ, соед. 1976. - № 5. - С. 636-639

26. Давранов К. Д. Липаза Oospora lactis / К. Д. Давранов, 3. Р. Ахмедова, М. И. Ризаева и др. // Прикл. биохимия и микробиол. 1984. - Т. 20. — №2.-С. 166-174

27. Давранов К. Д. Некоторые свойства внеклеточной липазы Rhizopus microsporus УзЛТ-3 / К. Д. Давранов, И. Т. Куйлибаев, Б. X. Розмухамедова, А. А. Махсумханов // Прикл. биохимия и микробиол. — 1995. — Т. 31. № 4. - С. 405-411

28. Давранов К. Д. Препаративное выделение, очистка, кристаллизация и некоторые свойства липазы из Oospora lactis / К. Д. Давранов, М. Я. Табак, А. С. Саггаров//Биохимия. 1989.-Т. 54.-№ 11.-С. 1866-1872

29. Давранов К. Д. Микробные липазы в биотехнологии. Обзор // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т. 30. - №. 4-5. - С. 527-534

30. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. - 320 с.

31. Диеров Ж. X. Липазы микромицетов: Дисс. . д. б. и. ПУЩИНО: И-т биохимии и физиологии микроорганизмов, 1994. - 400 с.

32. Диеров Ж. X. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus / Ж. X. Диеров, А. Б. Циоменко, К. Д. Давранов, и. С. Кулаев // Биотехнология. 1993. - № 7. - С. 26-30

33. Диксон М. Ферменты. / М. Диксон, Э. Уэбб / Пер. с 3-го англ. изд. Л. Д. Гинодмана и М. И. Левянт, под ред. акад. А. И. Опарина. М.: Мир, 1982. - Т. 1.-389 с.

34. Дубцова Г. Н. Липид-белковые комплексы пшеницы, их формирование и роль в технологических процессах. Дисс. . к. т. н. Москва: МТИПП, 1999.-650 с.

35. Дужак А. Б. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного (В-10) и мутантного (М-1) штаммов / А. Б. Дужак, 3. Н. Панфилов, Е. А. Васюнина // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. -Т. 36.-№4.-С. 402-411

36. Жеребцов Н. А. Очистка и свойства липазы Rhizopus japonicus 1403 / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Э. А. Шишкова и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. 235 с.

37. Зубченко А. В. Пути эффективного использования сахаросодержащих и жировых продуктов в хлебопекарной промышленности / А. В. Зубченко, Т. В. Санина. М.: ЦНИИТЭИхлебопродуктов, 1990. - 36 с.

38. Иммобилизованные ферменты: современное состояние и перспективы. Т. 1,2./ Под ред. И. В. Березина, В. К. Антонова, К. Мартинека. М.: Издательство МГУ, 1976. — 296 с.

39. Казаков Е. Д. О теоретических основах образования клейковины // Изв. вузов. Пищевая технол. 1992. - № 1. - С. 5-7

40. Казаков Е. Д. Клейковина, ее формирование, состав. В 2-х ч. Ч. 1. / Элеваторная промышленность. Обзорная информация. — М.: ЦНИИТЭИ, 1992. -60 с.

41. Калунянц К. А. Микробные ферментные препараты: Технология и оборудование / К. А. Калунянц, JI. И. Голгер. М.: Пищевая пром-сть, 1979. -304 с.

42. Кейтс М. Техника липидологии: Выделение, анализ и идентификация ли-пидов / Пер с анг. В. А. Вавера. М.: Мир, 1975. - 324 с.

43. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Пер. с англ. JI. Ю. Бровко и др. Под ред. Б. И. Курганова. М.: Мир, 1990. - 350 с.

44. Кёстнер А. И. Иммобилизованные ферменты // Успехи химии. — 1974. -Т. XLIII. Вып. 8. - С. 1480-1511

45. Кислухина О. В. Применение ферментов в масло-жировой промышленности / О. В. Кислухина, В. Д. Надыпта, Н. М. Минасян // Изв. вузов. Пищевая технол. 1993. - № 1-2.-С. 14-19

46. Клесов А. А. Ферментативный катализ: Уч. пособие для хим. спец. унтов. В 2-х ч. Ч. 1 / А. А. Клесов, И. В. Березин. М.: Изд-во МГУ, 1980. -Т. 1.-264 с.

47. Ковалева С. В. Фотоокисление и модификация диэтилпирокарбонатом «биосинтетической» L-треининдегидротазы из пивных дрожжей Sassharomyces carlsbergensis / С. В. Ковалева, А. И. Дорожко, 3. С. Каган // Биоихимия. 1984. - Т. 49. - № 8. - С. 1253-1262

48. Коваленко Г. А. Иммобилизация ферментов на углеродминеральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов. / Г. А. Коваленко, М. П. Ванина // Биотехнология. 1997. -№ 4. - С. 3-12

49. Ковальская JI. П. Технология пищевых продуктов / JI. П. Ковальская, И. С. Шуб, Г. М. Мелькина. М.: Колос, 1999. - 752 с.

50. Козьмина Н. П. Биохимия хлебопечения. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Пищевая пр-сть, 1978. 277 с.

51. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. школа, 1980.-272 с.

52. Кретович В. JI. Введение в энзимологию. 3-е изд. доп., перераб., испр. — М.: Наука, 1986.-336 с.

53. Кузнецова JI. С. Лабораторный практикум по технологии кондитерского производства. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 184 с.

54. Лосева Л. П. Роль остатков гистидина в конститутивной НАД(Р)-глутаматдегидрогеназе Chorella pirenoidosa II Л. П. Лосева, М. В. Бен-диашвили, В. Р. Шптилов и др. // Биоихимия. 1986. - Т. 51. - С. 840-849

55. Луговой В. И. Криоповреждения ферментов и ферментных систем. Актуальные проблемы криобиологии / Под. ред. Н. С. Пушкаря, А. М. Белоуса.- Киев.: Наукова думка, 1981. 607 с.

56. Лукьянов А. Б. Физическая и коллоидная химия. М.: Химия, 1980. - 224 с.

57. Лурье И. С. Технохимический контроль сырья в кондитерском производстве. Справочник. М.: Агропромиздат, 1987. - 271 с.

58. Маджидов К. X. Повышение качества и расширение ассортимента кондитерских изделий с использованием эффективных добавок / К. X. Маджидов, М. Г. Басиев, М. И. Мурдахиева // Изв. вузов. Пищевая технол. — 1984.-Вып. 1-2.-С. 22-26

59. Марданян С. С. Взаимодействие аденозиндезаминазы с ингибиторами, модификация диэтилпирокарбонатом / С. С. Марданян, С. Г. Шароян, А. А. Антонян и др. // Биохимия. 2002. - Т. 67. - № 7. - С. 930-938

60. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М.: Наука, 1984. - 324 с.

61. Манойлов Ю. С. Исследование ИК-спектров гемопротеидов и их составных частей / Ю. С. Манойлов, Ю. П. Комов, С. Е. Манойлов // Биофизика.- 1965 Т. 10. - №5. - С. 782-788.

62. Мартьянов В. А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В. А. Мартьянов, А. Ф. Зябрев и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭТИИ, 1989. -225 с.

63. Матвеева И. В. Пищевые добавки и хлебопекарные улучшители в производстве мучных изделий. / И. В. Матвеева, И. Г. Белявская. М.: МГУПП, 1998.-104 с.

64. Микробные ферменты и биотехнология. /Под ред. Фогарти и др., пер. с англ. И. М. Грачева. М.: Агропромиздат, 1986. - 318 с.

65. Мусил Я. А. Современная биохимия в схемах / Я. А. Мусил, О. Н. Нова-кова, К. В. Кунц. М.: Мир, 1984. - 264 с.

66. Неклюдов А. Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые ли-пидные продкты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами. (Обзор) / А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. - Т. 38.-№ 5.-С. 469^81

67. Неклюдов А. Д. Свойства препарата иммобилизованной липазы Rhizopus oiyzae 14-14 / А. Д. Неклюдов, Б. Д. Шведов, В. В. Цибанов // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. - Т. 17. - Вып. 4. - С. 510-515

68. Николаенко С. В. Повышение эффективности сублимационной сушки ферментных препаратов. Автореф. дисс. . к. т. н. — Воронеж: ВТИ, 2000. -24 с.

69. Орос Г. Ю. Механизм сорбции т-РНК неионогенным сорбентом / Г. Ю. Орос В. Ф. Селеменев, В. Ю. Хохлов и др. // Физическая химия. — 1988.- Т. 72.-№5.-С. 926-932

70. Петрова Jl. JI. Применение рН-статного метода для изучения ферментив-ного действия липазы Penicillium sp. / Jl. Jl. Петрова, Г. А. Казани на, А. А. Селезнева // Прикл. биохим. и микроб. -1977. -Т. 13. -№ 5. С. 758

71. Поландова Р. Д. Применение пищевых добавок в хлебопечении // Хлебопечение России. 1996. - № 1. - С. 25-3076