Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой

Беленова, Алёна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой"

На правах рукописи

Беленова Алёна Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ГИДРОЛИЗА ТРИГЛИЦЕРИДОВ СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ

ЛИПАЗОЙ

03.01.02. - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О МДР 2011

Воронеж - 2011

4840257

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор Ковалева Тамара Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук, доцент Семенова Елена Васильевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Мордовский государственный

университет им. Н.П. Огарёва»

Защита состоится 25 марта 2011 года в 14— на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 г. Воронеж, Университетская пл., 1, биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан ;/5 февраля 2011 года

Ученый секретарь ^^

диссертационного совета Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование структуры липолитических ферментов, механизмов гидролиза триглицеридов in vivo, систем регуляции скоростей метаболических процессов, сложнейшей координации ферментативных превращений в клетке способствует глубокому познанию процессов жизнедеятельности на молекулярном уровне и обусловливает практическую необходимость создания новых гетерогенных биокатализаторов промышленного назначения и медицинских препаратов пролонгированного действия.

Липазы - сериновые гидролазы, действующие на поверхности раздела фаз и способные катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции этерификации, трансэтерификации, алкоголиза и ацидолиза, использующиеся в пищевой, фармацевтической, химической, текстильной и кожевенной промышленности, в производстве моющих средств, а также для аналитических целей в медицине. Свойство энантиоселективности липаз широко применяется в органическом синтезе биологически активных веществ и их синтетических аналогов.

Однако широкое использование нативных препаратов липолитических ферментов сдерживается высокой ценой энзимов, сложностями в создании оптимальных условий гидролиза триглицеридов, низкой термостабильностью и невысокими скоростями реакций в физико-химических условиях, отличающихся от оптимальных. Преодолеть эти недостатки удается посредством иммобилизации ферментов на различных природных и синтетических носителях. Лекарственные препараты, обладающие липолитической активностью, широко применяются в клинической практике для лечения недостаточности желудочно-кишечного тракта различной этиологии. В этой связи создание новых фармацевтических веществ на основе иммобилизации определяет более высокую пролонгированность действия и снижение риска побочных эффектов. При этом возникает необходимость изучения применения таких методов иммобилизации, которые не предполагают использования токсичных химических соединений, высокой температуры и других денатурирующих факторов. Подбор носителей при иммобилизации ферментов для клинического применения представляет собой определенную экспериментальную задачу, так как к подобного рода подложкам, кроме основных требований, предъявляются еще и ряд специальных установок, учитываемых фармакологической безопасностью и особенностями доклинических и клинических испытаний.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование надмолекулярной организации липазы Rhizopus niveus, физико-химических и кинетических свойств фермента, иммобилизованного на растворимых и нерастворимых носителях, изучение особенностей гидролиза триглицеридов нативными и иммобилизованными ферментными препаратами.

Реализация поставленной цели предполагает решение следующих

задач:

1) исследовать особенности надмолекулярной организации липазы Rhizopus niveus\

2) изучить закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы Rhizopus niveus-,

3) установить характер влияния ионов Са2+ на структурно-функциональные свойства различных форм липазы Rhizopus niveus;

4) осуществить иммобилизацию липазы на растворимых и нерастворимых носителях и изучить механизм взаимодействия молекулы фермента с матрицей носителя;

5) исследовать физико-химические и кинетические свойства липазы в свободном и иммобилизованном состояниях.

Научная новизна: проведен сравнительный анализ содержания различных типов аминокислотных остатков в первичной структуре липаз микробного происхождения; показана тенденция к образованию надмолекулярных структур у липазы Rhizopus niveus-, проведены комплексные исследования надмолекулярной организации липазы из Rhizopus niveus", впервые применен метод атомно-силовой микроскопии в сочетании с классическими биофизическими и биохимическими методами анализа для визуализации молекул липазы из Rhizopus niveus; установлены закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы; разработан способ иммобилизации липазы на растворимых носителях; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе липазы.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований надмолекулярной организации, термической инактивации мономерной и димерной форм липазы из Rhizopus niveus, влияния ионов кальция, олеиновой и стеариновой кислот на функциональные свойства фермента позволяют расширить и углубить представления о механизме ферментативного гидролиза триглицеридов.

В ходе исследования разработана методика адсорбционной иммобилизации липазы на поли-Ы-винилпирролидоне и растворимом хитозане, которую можно рекомендовать для получения лекарственных препаратов для заместительной энзимотерапии.

Полученные данные могут быть использованы при разработке технологии промышленного получения иммобилизованных ферментов медицинского назначения.

физиологическом съезде (Барнаул, 2008); Втором Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Воронеж, 2009); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (Белгород, 2010); XXII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 21 публикация: 9 статей и 12 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Липаза, выделенная из Rhizopus niveus, в водном растворе функционирует в форме димера. Мономерная форма липазы более устойчива к температурным воздействиям в интервале 20-60 °С по сравнению с димерной.

2. Ионы кальция, включенные в Са-связывающий домен молекулы фермента, поддерживают каталитически активную конформацию энзима и определяют оптимальные условия гидролиза триглицеридов.

3. Олеиновая и стеариновая кислоты являются ингибиторами липазы смешанного типа.

4. Адсорбционный способ иммобилизации липазы на растворимых и нерастворимых носителях позволяет сохранить до 55% (при связывании с растворимым хитозаном) и 79% (при взаимодействии с поли-N-винилпирролидоном) активности нативного энзима.

5. Связывание липазы с поли-Ы-винилпирролидоном дает возможность получить ферментный препарат, стабильный по отношению к значениям pH 4,0-6,0.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 162 страницы машинописного текста; состоит из Введения, 6 глав, Заключения, Выводов и Приложения. Список литературы содержит 230 источников. Иллюстрационный материал включает 32 рисунка и 15 таблиц в основном тексте и 5 рисунков в «Приложении».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе дана характеристика физико-химических и структурно-функциональных свойств липаз, выделенных из различных источников, охарактеризован механизм ферментативного гидролиза триглицеридов. Рассматриваются наиболее эффективные методы иммобилизации липаз, их теоретическое и практическое значение.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил фермент липаза (триацилглицерол-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.3), выделенная из микромицета Rhizopus niveus (Sigma). В качестве субстрата использовали оливковое масло, эмульгированное с равным объемом 1 % раствора поливинилового спирта. В качестве носителей применяли хитозаны, синтезированные на кафедре фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежского государственного университета и поли-N -винилпирролидон (медицинский), полученный на кафедре химии высокомолекулярных соединений и коллоидов Воронежского государственного университета.

Метод определения активности липазы основан на измерении оптической плотности окрашенных продуктов взаимодействия основной формы цветного реагента родамина 6Ж в бензоле и карбоновых кислот, освобождающихся в ходе гидролиза субстрата (М.М. Anderson, 1972). Содержание белка определяли по методу Лоури (О.Н. Lowry et al., 1951). Для иммобилизованной липазы использовали модифицированный метода Лоури. Сущность модификации заключалась в том, что на первом этапе анализа осуществляли разрушение связей между матрицей носителя и молекулой фермента. Для этого обрабатывали иммобилизованный препарат раствором К,Ш-тартрата, приготовленном на 1 М NaOH при 50 °С в течение 10 минут.

Гель-фильтрацию проводили по стандартной методике. При определении кажущейся молекулярной массы липазы применяли метод SDS-PAGE электрофореза. По окончании электрофоретического разделения осуществляли окрашивание белковых полос нитратом серебра по методу М.В. Нестеренко (1994). Подготовку и анализ образцов методом инфракрасной спектроскопии проводили по стандартной методике. Измерения осуществляли с помощью ИК-спектрофотометров SPECORD М-80 и Vertex-70. Визуализацию молекул липазы проводили методом атомно-

силовой микроскопии в лаборатории наноскопии и нанотехнологии ЦКПНО ВГУ на сканирующем зондовом микроскопе SOLVER P47PRO.

Определение размеров молекул методом динамического светорассеивания осуществляли на приборе PHOTOCOR COMPLEX (1=647 нм, лазер гелий-неоновый). Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИПАЗЫ RHIZOPUS N1VEUS

3.1. Определение молекулярной массы мономеров и димеров липазы

Методами гель-фильтрации и электрофореза показано, что липаза из Rhizopus niveus в водном рстворе функционирует в виде димера с молекулярной массой 98±2 кДа, молекулярная масса мономеров - 48±2 кДа. Установлено, что каталитическая активность отдельных протомеров в два раза ниже значения активности димерной формы фермента.

3.2. Исследование особенностей вторичной структуры мономерной и димерной форм липазы методом ИК-спектрофотометрии

Дальнейшие исследования липазы и ее мономеров проведены с помощью метода инфракрасной спектроскопии. Показано, что для димерной формы липазы характерны полосы поглощения амид1 (1630 - 1690 см"1), амидИ (1520 - 1560 см"1) и полоса валентных колебаний NH2 - группы (3200 - 3400 см"1). Имеющаяся полоса поглощения 3200-3450 см"1 отвечает колебательным переходам в результате растяжения NH-связи, поглощение при 2920 см"1 соответствует симметричным колебаниям метильных групп. Ряд пиков в области 1739 - 1970 см"1 обусловлен колебаниями карбонильных групп в концевых ассоциированных СООН-группах.

Для ИК-спектра мономеров липазы с молекулярной массой 48+2 кДа наблюдается незначительное смещение полос амид1 и амид II в области с более низкой энергией и уменьшение интенсивности их колебаний, что может указывать на уменьшение числа водородных связей, участвующих в стабилизации вторичной структуры липазы. Наблюдаемое уменьшение уровня колебаний в области 3320-3493 см"', по-видимому, свидетельствует об увеличении количества нерегулярных участков, появляющихся при разрушении димеров на мономеры. Кроме того, в данной области наблюдается четкое разделение пиков поглощения, обусловленных наличием в молекуле a-спиралей, |3- структур и нерегулярных участков. В области 2860 см"1 имеет место изменение интенсивности колебаний, что, может быть обусловлено появлением гидрофобных аминокислот на поверхности протомеров.

Выявлено, что при разделении димерной молекулы липазы на мономеры происходит уменьшение количества а-спиралей на 3 %, снижение количества |3- структур на 8 % и увеличение количества неупорядоченных участков на 11 %.

3.3. Визуализация олигомерпой структуры липазы НИ ¡гор и* п^еив методом атомно-силовой микроскопии

На изображениях молекулы липазы из Штория Ыуеш полученных с помощью метода атомно-силовой микроскопии, отчетливо видно, что белок имеет димерную структуру (рис. 1). Показано, что у димерной формы фермента можно выделить сегменты с высотами, близкими к 2,5 нм, которые могут представлять собой протомеры с одинаковой молекулярной массой. Также видно, что область межсубъединичных контактов отличается по высоте от отдельных мономеров и составляет около 1,0 нм. Аналогичным способом было получено изображение мономеров липазы (рис. 2).

1000 900 800 700 600 НМ 500 400 300 200 100 0

Рис. 1. Изображение димерной формы липазы Rhizopus niveus (размер кадра 1,0x1,0 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности

А Б

Рис. 2. Изображение мономеров липазы Якйориз туеив (размер кадра 0,5x0,5 мкм): А - трехмерное изображение, Б - сечение рельефа поверхности

Таблица 1

Радиусы молекул димерной и мономерной форм липазы

Радиус молекул, нм

Димерная форма липазы 10,24±0,41

Мономерная форма липазы 4,9±0,3

Методом динамического светорассеивания мы определили размеры мономеров и димеров липазы из Rhizopus niveus (табл. 1).

3.4. Определение процентного содержания различных типов аминокислот в первичной структуре липаз, выделенных из разнообразных

источников

Рассчитано процентное содержание различных типов аминокислотных остатков в первичной структуре липаз, выделенных из разнообразных источников, при помощи программы BioEdit версия 7.0.5.

Показано, что максимальное количество аминокислотных остатков у липаз микробного происхождения имеется в молекуле энзима, выделенного из Staphylococcus haemolyticus (711), а минимальное — из Serratia proteamacilans (255). Наибольшее количество положительно и отрицательно заряженных аминокислот характерно для липазы Staphylococcus hyicus (16,23%) и Pseudomonas aeryginosa (14,7%), а наименьшее — для Aspergillus ! niger (5,37%) и Rhizopus stolonifer (7,41%) соответственно. Процентное содержание серосодержащих аминокислот у представленных липаз колеблется в интервале 0,49-3,85% (максимальное количество у Rhizopus microsporus).

Далее мы применили критерий Э. Фишера для прогнозирования тенденции к димеризации у липаз микробного происхождения. Показано, что липазы Rhizopus microsporia, Humicola langinos, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescen, Pseudomonas aeruginosa, Candida rugosa, Staphylococcus hyicus и Rhizopus niveus в своей первичной структуре содержат более 40% гидрофобных аминокислотных остатков, что может свидетельствовать о наличии у них способности к образованию надмолекулярных комплексов.

3.5. Исследование значения ионов Ca2* в функционировании мономерной и димерной форм липазы Rhizopus niveus

При исследование влияния этилендиамидтетраацетата на гидролитическую активность мономерной и димерной форм липазы выявлено, что снижение их каталитической активности наблюдается при воздействии ЭДТА в концентрации 2,2'10"4 моль/л. Показано, что максимальный ингибирующий эффект ЭДТА имеет место при концентрации 2,2'10"2 моль/л.

А ед'мг

18!

и 6

О 10 20 30 40 50 60

мин.

Рис. 3. Влияние ионов Са1+ на процесс реактивации каталитической активности мономерной и димерной форм липазы из Rhizopus туеш: 1 -димерная форма липаза, 2 - протомеры липазы из Rhizopus т\<ет

В процессе исследования влияния ионов Са2+ на процесс реактивации активности липазы после угнетения ЭДТА (рис. 3) установлено, что гидролитическая активность как нативного фермента, так и его протомеров полностью восстанавливалась, чему способствовало, по-видимому, возвращение ионов металла в состав Са-связывающего домена молекулы фермента.

Для подтверждения полученных данных нами была проведена ИК-спектрофотометрия мономеров липазы до и после их инкубации с ионами Са2+. Установлено, что после взаимодействия мономеров с ионаим Са2+ во вторичной структуре наблюдается увеличение (на 11%) Р-структур и

соответствующее уменьшение нерегулярных участков полипептидной цепи, что может свидетельствовать о важной роли ионы Са2+ в поддержании определенной жесткости третичной структуры, ответственной за ферментативное превращение субстрата.

3.6. Физико-химические свойства липазы ЛМгорт муею

Определены оптимальные условия функционирования липазы из ЯЫгоррт п'и'еих\ температура 37°С, рН-7,0. Методами Лайнуивера-Берка, Иди-Хофсти и Хейнса рассчитаны константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции для липазы, значения которых составили 0,8 ммоль/л и 14 мкмоль/мг мин соответственно.

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ПРОЦЕССА ТЕРМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ МОНОМЕРНОЙ И ДИМЕРНОЙ ФОРМ ЛИПАЗЫ ИЗ КНГ/ОРиЗ Ы1УЕ11Б

4.1. Изучение кинетических особенностей процесса термической

инактивации димерной и мономерной форм липазы Я-Ыгорт пЬет

Установлено, что термомодификация димеров фермента начинается уже через 10 минут инкубации энзима в буферном растворе при 30°С, через 60 минут способность к гидролизу триглицеридов составляла 41%. При 50 °С процесс инактивации происходит интенсивнее и через 60 минут сохранялось лишь 6% каталитической активности. Выявлено, что кривые термоинактивации липазы во всем диапазоне исследуемых температур имеют 2 участка: первый (время инкубации до 20 минут) отличается высокой скоростью падения способности превращать субстрат. Для второго (время инкубации 20-60 минут) характерно уменьшение данного параметра (рис. 4). Наличие своеобразного излома на кривых термической инактивации нативной липазы может свидетельствовать о присутствии как минимум двух стадий процесса термической инактивации белка, и о наличии в системе двух форм энзима, характеризующихся различной устойчивостью к денатурирующему воздействию.

Для доказательства справедливости данного предположения мы применили метод гель-фильтрации. Показано, что после инкубации в течение 30 минут при 40 °С липаза выходит из хроматографической колонки двумя пиками: один с молекулярной массой 98±2 кДа, другой с молекулярной массой 52±2 кДа. Полученные данные свидетельствуют о частичном разрушении димерной структуры при воздействии температуры 40 °С. К тому же при разделении белка на мономеры происходит модификация их размеров по отношению к нативному препарату, что может свидетельствовать об изменении структуры протомеров. После инкубации липазы при 50 °С обнаруживаются как мономеры, так и агрегаты большего порядка.

В связи с образованием протомерной формы фермента в процессе денатурации нативного энзима нами была проведена серия экспериментов по изучению термостабильности мономеров липазы ЯЫгорт и/усна' (рис. 5). По нашим данным термомодификация мономеров фермента начинается позднее, чем у димерной формы липазы, инкубация энзима в течение 10 минут при 30 °С приводит к снижению каталитической активности лишь на 13%, в то время как доя нативного энзима эта цифра составляет 35%. Как и для димерной формы энзима, у протомеров процесс термоинактивации идет интенсивнее при 50 и 60 °С. В то же время процент сохранения каталитической способности у мономеров больше, чем у димеров во всем интервале исследуемых температур. Инкубация в течение 60 минут 50 °С приводит к сохранению 12 % их каталитической активности, что в два раза больше, чем для димеров липазы.

Рис. каталитической липазы из

Зависимость активности (%) и/уеш- от

ЯЫгорт

времени термической инактивации: 1-20 °С, 2-30°С, 3-40°С,4-50 °С, 5 - 60 °С

Рис. 5. Зависимость каталитической активности (%) протомеров липазы из ЯЫгорт тует от времени термической инактивации: 1 - 20 °С, 2 - 30 "С, 3 - 40 °С, 4 - 50 °С, 5 - 60 °С

В отличие от нативной липазы кривые термоинактивации мономерной формы энзима носят более сглаженный характер и не имеют столь выраженных участков. Константы скорости инактивации при температурах 20-60 °С для немодифицированного фермента выше, чем для энзима, инкубированного с ДСН (табл. 2). Таким образом, можно сделать предположение, что при температурах 20-60 °С термоустойчивость мономерной формы липазы достоверно выше по сравнению с нативной молекулой за счет разрыва водородных связей и гидрофобных взаимодействий, ответственных за поддержание целостности димера.

Таблица 2

Константы скоростей термической инактивации мономерной и дн,мерной форм липазы из Ютарт пмем

Форма фермента Температура, °С Константа скорости инактивации, ч"1

Димерная форма 20 1,07

30 1,35

40 2,52

50 3,10

60 3,62

Мономерная форма 20 0,22

30 0,42

40 0,77

50 1,60

60 2,10

4.2. Термодинамические аспекты процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы из Шигорт /т'е/«

Установлено, что при возрастании температуры до 60 °С происходит увеличение значений энтальпии ДН, энтропии ДБ и энергии активации Еакт. Анализ значений констант скоростей инактивации, Еакт, ДН и ДБ позволяет сделать заключение о том, что мономерная и димерная формы энзима при температурах 20 °С и 30 °С поддерживаются максимальным количеством сильных и слабых связей и взаимодействий. При нагревании фермента до 4060 °С происходит возрастание термодинамических параметров у липазы и её протомеров, что, по-видимому, обусловлено разрывом водородных связей и гидрофобных взаимодействий в белковой молекуле.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ОЛЕИНОВОЙ И СТЕАРИНОВОЙ КИСЛОТ НА ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ ИЗ ПИ НО РЦБ ШУЕ ЦБ

5.1. Влияние состава растворителя па каталитическую активность

липазы

При исследовании влияния бензола, гексана и изопропанола на гидролитическую активность липазы выявлено, что наиболее перспективным растворителем является изопропиловый спирт, так как процент сохранения каталитической активности липазы наибольший (69%). Показано, что фермент сохраняет от 23 до 69% активности при взаимодействии с изопропанолом в концентрациях 12,5-87,5%. Установлено, что максимальная скорость гидролиза триглицеридов проявляется при концентрациях изопропилового спирта 12,5-25%. Снижение каталитической активности

фермента после его взаимодействия с модификатором может быть связано с изменениями в третичной структуре фермента.

5.2. Олеиновая и стеариновая кислоты как ингибиторы каталитической

активности липазы

Показано, что снижение скорости гидролиза триглицеридов наблюдается при воздействии 1 моль/л олеиновой кислоты и 0,1 моль/л стеариновой кислоты. Установлено, что инкубация липазы с олеиновой кислотой в концентрации 3 моль/л приводит к уменьшению каталитической активности фермента на 61%, а со стеариновой кислотой в той же концентрации - на 76 % (рис. 6, 7).

100 80 60 40 20

А, %

липаза* 10* ю> 10' 1 2 3 изопропаиол концентрация олеиновой кислоты, моль/л

Рис. 6. Зависимость каталитической активности липазы из ¡{Ыгориз туеиь от концентрации • олеиновой кислоты

А, % 100

липаза+ Ю3 изопропанол

Ил

10* 10'

концентрация стеариновой кислоты, моль/л

Рис. 7. Зависимость каталитической активности

липазы из 11Ыгорш тмеив от концентрации стеариновой

кислоты

Выявлено, что после взаимодействия липазы с олеиновой и стеариновой кислотами происходит увеличение значения Кт и уменьшение Утах (табл. 3), что может свидетельствовать о смешанном типе ингибирования.

Таблица 3

Изменение кинетических параметров реакции гидролиза триглицеридов при воздействии олеиновой и стеариновой кислот

К,„, ммоль/л ушах, мкмоль/ мг'мин

Нативная липаза 0,8 14

липаза после инкубации с олеиновой кислотой 1,43 9,4

липаза после инкубации со стеариновой кислотой 1,47 9,1

Глава 6. РАЗРАБОТКА ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ЛИПАЗЫ, ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

6.1. Иммобилизация липазы на низкомолекулярном и высокомолекулярном хитозанах

Установлено, что липаза, связанная с низкомолекулярным хитозаном (1 кДа) сохраняет 41% активности нативного энзима, с высокомолекулярным хитозаном (10 кДА) - только 24 % активности растворимого фермента.

При иммобилизации энзима на высокомолекулярном хитозане оптимальная температура гидролиза смещается в сторону более высоких значений и составляет 45 °С. Для липазы, иммобилизованной на низкомолекулярном хитозане, данного эффекта не наблюдается, оптимальная температура гидролиза остается неизменной и составляет 37 °С.

Показано, что зависимость каталитической активности свободной липазы от концентрации ионов водорода характеризуется колоколообразной формой, характерной для большинства гидролаз, при иммобилизации имеет место сглаживание нелинейного участка. Анализируя экспериментальные данные, можно прийти к заключению, что при значениях рН 4,0-5,5 для свободной липазы и 4,0-6,0 для иммобилизованного фермента каталитическая активность не зависит от рН субстрата и наблюдается лишь равномерное, пропорциональное снижение активности при иммобилизации как на высокомолекулярном, так и на низкомолекулярном хитозане. Увеличение каталитической активности для свободного фермента наблюдается при рН 6,0. По нашим данным, свободная и иммобилизованная на исследуемых носителях липаза проявляет оптимальную каталитическую активность при рН 7,0.

С помощью преобразования кривых зависимости V от Б в координатах Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти были определены Утах' и Кт' гетерогенных ферментных препаратов (табл. 4). Показано, что при иммобилизации происходит уменьшение значений константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом.

Таблица 4

Кинетические параметры реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой

Ферментный препарат Кт (Кт'), ммоль/л ^тах (Утах ), мкмоль/мг'мин

Свободная липаза 0;8 14

Липаза, иммобилизованная на низкомолекулярном хитозане 0,53 3,2

Липаза, иммобилизованная на высокомолекулярном хитозане 0,67 1,3

Таблица 5

Основные физико-химические характеристики свободной и иммобилизованной липазы

Ферментный препарат Кт (Кга'), ммоль/л Углах (Утах'), мкмоль мг/мин

Свободная липаза 0,8 14

Липаза, иммобилизованная на растворимом хитозане 0,71 6,8

6.2. Иммобилизация липазы на растворимом хитозане

При иммобилизации липазы на растворимом хитозане происходит снижение каталитической активности липазы на 45%.

Установлено, что связывание фермента с носителем приводит к расширению диапазона оптимальных значений температуры гидролиза от 37 "С до 45 "С.

Анализ зависимости каталитической активности свободной и иммобилизованной липазы от рН среды показывает, что в диапазоне рН = 5,0-6,5 для иммобилизованного фермента не наблюдается изменений каталитической активности, в то время как для свободного энзима происходит постепенное увеличение способности осуществлять гидролиз триглицеридов. По нашим данным, свободная и иммобилизованная на исследуемом носителе липаза проявляет оптимальную каталитическую активность при рН 7,0.

С помощью преобразования кривых зависимости V от Б в координатах Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти были определены Утах' и Кт' гетерогенных ферментных препаратов (табл. 5). Показано, что иммобилизация приводит к уменьшению значений константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом.

6.3. Исследование механизма взаимодействия молекул липазы с матрицей различных типов хитозанов

Анализ ИК-спектров хитозанов показывает, что наиболее интенсивными являются полосы с максимумами: 1022 см"1, отвечающая валентным колебаниям -СИ- связей в первичной аминогруппе, а также полоса поглощения 1305 см"1, обусловленная плоскими и неплоскими деформационными колебаниями МН-групп и 1554 см"', отвечающая за деформационных колебаний -N-11 и -С-ЫН2 - группировок. Полоса поглощения с максимумом 885 см"1 проявляется за счет пульсационных колебаний пиранозного цикла структуры элементарного звена хитозана. Наблюдается и ряд других менее интенсивных полос поглощения: 2354 см"1-

соответствующая валентным колебаниям атома углерода моносахарида и 2860-2922 см"1 - ассимметричным и симметричным колебаниям -СН и -СН2 групп. Необходимо отметить, что, несмотря на наличие некоторых различий в интенсивности полос поглощения, их положение и форма остается неизменной для низкомолекулярного, высокомолекулярного и растворимого хитозанов.

При иммобилизации липазы на ИК-спектре имеет место изменение формы и интенсивности пика в области 1000-1050 см"1, обусловленных валентными колебаниями -СОО" групп, что указывает на их участие в процессе связывания белковой глобулы с функциональными группами носителя. Наблюдаются изменения формы и интенсивности поглощения в области 3050-3500 см"1, что может свидетельствовать об образовании водородных связей между поверхностными аминокислотами молекулы фермента и матрицей носителя. Кроме того, смещение полосы 885 см"1 влево и уменьшение интенсивности поглощения в области 1305 и 1554 см"1 может быть обусловлено участием NH2-rpynn хитозана при адсорбционной иммобилизации фермента. Причем интенсивность вышеперечисленных полос уменьшалась с увеличением молекулярной массы носителя.

Для липазы, иммобилизованной на растворимом хитозане, характерны полосы поглощения с масимумами 2846 и 2914 см "', ответственные за деформационные колебания СН-групп. На данном ИК-спектре проявляется также максимум в области 1440 см"1, который свидетельствует о деформационных колебаниях СН-групп, находящихся вблизи ОН-группировок хитозана. По-видимому, при иммобилизации липаз на хитозане возможно образование внутримолекулярных связей между СО" и NH3+ -группами носителя, то есть при взаимодействии фермента с растворимым хитозаном происходит модификация молекул носителя, способствующая образованию более стабильного ферментного препарата.

Анализируя результаты экспериментов, можно сделать заключение, что адсорбционная иммобилизация липазы на исследуемых носителях происходит, с одной стороны, за счет взаимодействия положительно заряженных остатков лизина, аргинина и гистидина с отрицательно заряженными группами хитозана. С другой стороны, значительную роль в стабилизации комплекса фермент-носитель играют взаимодействия между остатками аспарагиновой и глутаминовой кислот, находящихся на поверхности молекулы липазы, с NH2-rpynnaMn хитозана. При увеличении молекулярной массы носителя количество связей, определяющих прочность иммобилизованного фермента, уменьшается.

6.4. Иммобилизация липазы на растворимом носителе поли -N-винилпирролидоне

Адсорбционная иммобилизации липазы на поли-Ы-винилпирролидоне приводит к сохранению 79% активности нативного фермента.

Для доказательства наличия связи между энзимом и носителем в нашей лаборатории была проведена гель-хроматография свободного энзима и липазы после ее иммобилизации на поли-Ы-винилпирролидоне. Результаты экспериментов показали, что связывание липазы с носителем (510"4 моль/л) сопровождается увеличением молекулярной массы полученного комплекса до 110±ЗкДа, при снижении концентрации поли-М-винилпирролидона до 5 10 6 моль/л мы фиксировали два пика: один с молекулярной массой 96+3 кДа, а второй - 110+3 кДа.

На ИК-спектре поли-М-винилпирролидона выделяются следующие наиболее интенсивные полосы поглощения: 3200-3450 см"1 - валентные колебания атома азота пирролидонового кольца, 2800-3000 см"1 - валентные колебания углерод-водородных связей, 1640 см"1 - валентные колебания группы С=0, в области 1420 см"1 наблюдаются плоскостные колебания СН-группы, полоса 1282 см"1 соответствует валентным колебаниям группы С=0.

Об успешной иммобилизации липазы на поли-Ы-винилпирролидоне свидетельствует ряд изменений в ИК-спектре носителя. Появляются полосы поглощения в диапазоне 760-1100 см"1, соответствующие деформационным и валентным колебаниям СН-групп, 2320 см"1, отвечающая колебаниям СОО"-группировок, что указывает на их участие в процессе связывания белковой глобулы с носителем. Изменение формы и интенсивности пика в области 3050-3500 см"' может свидетельствовать об образовании водородных связей между поверхностными отрицательно заряженными остатками глутаминовой и аспарагиновой кислотами липазы и матрицей носителя.

Выявлено, что оптимальная температура гидролиза оливкового масла свободным ферментом составляла 37 °С. При связывании энзима с носителем она смещалась в сторону более высоких значений и составляла 40 °С.

Установлено, что свободная и иммобилизованная на поли-Ы-винилпирролидоне липаза проявляет максимальную каталитическую активность при рН 7,0. Причем в диапазоне значений рН 4,0 - 6,0 гидролитическая активность связанного фермента достоверно выше, чем у нативного энзима. Это может быть обусловлено протонированием группы >С=0 пирролидонового цикла пол и-Ыви пил пиррол идона, что возможно приводит к изменению взаимодействий в комплексе липаза-носитель и способствует увеличению скорости образования фермент-субстратного комплекса при рН 4,0 - 6,0.

С помощью преобразования кривых зависимости V от Б в координатах Лайнуивера-Берка, Хейнса и Иди-Хофсти были определены Утах' и Кт' для иммобилизованного энзима (табл. 6). Показано, что адсорбция липазы на поли-Ы-винилпирролидоне способствует увеличению значений константы Михаэлиса и уменьшению максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом.

Таблица 6

Кинетические параметры ферментативной реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой

Ферментный препарат К„ (Км), ммоль/л (О, мкмоль/мг мин

Нативная липаза 0,8 14

Липаза, иммобилизованная на поли-Ы-винилнирроиидоие 1,0 9,7

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы возросло количество публикаций, посвященных изучению первичной, вторичной и третичной структуры молекул липолитических ферментов. В то же время данные по исследованию надмолекулярной организации этих ферментов зачастую противоречивы и не дают точной информации о наличии у липаз, выделенных из различных источников, четвертичной структуры или бимолекулярных агрегатов.

В нашей лаборатории при помощи программы ВюЕсШ версия 7.0.5 было рассчитано процентное содержание различных аминокислотных остатков в первичной структуре фермента. Показано, что липаза Юторт пюет содержит 40,4% гидрофобных аминокислотных остатка, что дает возможность предположить наличие у нее тенденции к образованию надмолекулярных комплексов.

Методом гель-хроматографии и электрофореза было установлено, что липаза из Юйгарт т\'еш имеет олигомерную структуру (молекулярная масса 96±2 кДа), которая представлена двумя протомерами, имеющими одинаковую молекулярную массу 48+2 кДа.

Использование метода атомно-силовой микроскопии в наших экспериментах для визуализации молекул нативного энзима и его мономеров четко подтвердило данные классических биохимических экспериментов и помогло продемонстрировать, что в водном растворе молекула липазы функционирует в виде димера. При воздействии додецилсульфата натрия имеет место расхождение мономеров.

Обнаружено, что при разделении димеров липазы на мономеры происходит увеличение числа неупорядоченных участков на 11%.

Установлено, что термомодификация нативного фермента начинается уже при температуре 30 °С. При 50 °С происходит снижение каталитической активности со значительной скоростью и через 60 минут способность к гидролизу триглицеридов уменьшалась на 94%. Процесс термической денатурации имеет двухфазный характер, и переход «упорядоченная глобула-хаотический клубок» складывается из отдельных этапов, причем его механизм для димерной и мономерной форм липазы не идентичен. Очевидно, что термоустойчивость мономерной формы липазы достоверно выше по сравнению с димерной: при температурах 20-60 °С значение их констант скорости инактивации ниже, чем у димерного энзима.

Наиболее важным свойством ферментов в обеспечении процессов жизнедеятельности является возможность осуществлять присущие им функции со скоростью, соответствующей потребностям клетки. Для осуществления этой способности белковые молекулы должны иметь специальные механизмы, с помощью которых они воспринимают сигналы из окружающей среды и реагируют на них изменением характера функционирования. Одним из наиболее простых способов регуляции каталитической активности энзимов является действие на них ингибиторов и активаторов. Установлено, что олеиновая и стеариновая кислоты являются ингибиторами липазы смешанного типа, о чем свидетельствует увеличение Кт и уменьшение Утах. При помощи модификации липазы и ее мономеров этилендиамидтетраацетатом, а также метода ИК-спектрофотометрии продемонстрировано, что ионы кальция входят в состав Са-координационного домена и являются необходимыми в осуществлении каталитического акта расщепления эфирной связи, они участвуют и в поддержании каталитически активной конформации фермента.

Общеизвестно, что иммобилизованные ферменты имеют ряд существенных преимуществ, поэтому исследователи не прекращают попытки иммобилизации липаз на различных природных и синтетических носителях.

Нами была продемонстрирована возможность адсорбционной иммобилизации липазы на хитозанах с различной растворимостью и молекулярными массами. Несмотря на то, что процесс иммобилизации липазы на различных типах хитозанов, по-видимому, протекает по сходным механизмам, остается невозможным предсказать результат иммобилизации в зависимости от количества звеньев Б-глюкозамина и Ы-ацетил-О-глюкозамина в молекуле носителя.

При связывании липазы с различными типами хитозанов наиболее высокую степень сохранения удельной активности мы наблюдали у растворимого носителя (55%).

Изучение физико-химических и кинетических свойств полученных ферментных препаратов позволяет подобрать наиболее оптимальные условия их функционирования, что является важным фактором для дальнейшего применения. В нашей лаборатории было установлено, что иммобилизованные липазы проявляли максимальную каталитическую

активность в диапазоне температур 37-45°С, при рН 7,0 и концентрации субстрата не менее 1,6 ммоль/л.

В связи с увеличением использования липолитических ферментов в клинической практике, необходимым условием становится изучение процессов иммобилизации на растворимых носителях, которые могут быть использованы в фармакологии как самостоятельные лекарственные средства, так и вспомогательные вещества при производстве таблетированных лекарственных форм. Нами была проведена серия экспериментов по иммобилизации липазы на поли-Ы-винилпирролидоне, который используется в фармации как вспомогательное вещество. В ходе экспериментов было выявлено, что при связывании с поли-Ы-винилпирролидоном липаза сохраняет 79% каталитической активности. Показано, что оптимальные условия липолиза полученным ферментным препаратом: 1° = 40 °С; рН = 7,0; [Б] = 2,0'ммоль/л. Обнаружено, что каталитическая активность иммобилизованной липазы достоверно выше, чем у нативного фермента в диапазоне значений рН от 4,0 до 6,0. Проведенные эксперименты являются первым этапом исследований, направленных на получение новых лекарственных средств пролонгированного действия для лечения системы пищеварения.

На основании результатов экспериментов мы предлагаем следующие рекомендации, которые могут учитываться в доклинических испытаниях препаратов липазы, иммобилизованной на нерастворимом и растворимом хитозанах и пол и-Ы-винил пиррол идоне.

1. Для определения количества белка в иммобилизованном ферментном препарате липазы целесообразно использовать модифицированный метод Лоури;

2. Определение каталитической активности липазы возможно проводить спектрофотометрическим методом Андерсона-Маккарти при использовании эмульгированного оливкового масла в качестве субстрата;

3. Оптимальное время гидролиза субстрата - от 8 до 28 минут;

4. В работе целесообразно использовать фермент в концентрации 10"5 моль/л;

5. Реакцию гидролиза субстрата необходимо проводить при температуре 37° С и рН 7,0.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальными условиями гидролиза триглицеридов для липазы из ЯЫгориз туеия являются температура катализа 37°С, рН 7,0, концентрация субстрата-2,1 ммоль/л;

2. Установлено, что липаза КЫюрм па'еи.ч функционирует в форме димера с молекулярной массой 96±2кДа;

гидрофобных аминокислотных остатков, проявляют тенденцию к образованию димерных структур;

4. Выявлено, что ионы кальция являются необходимыми в гидролизе триглицеридов и предположительно входят в состав Са2+—связывающего домена, поддерживая каталитически активную конформацию фермента;

5. Установлены закономерности процесса термической инакивации мономерной и димерной форм липазы Rhizopus niveus. Показано, что механизм термической модификации липазы и ее протомеров не идентичен;

6. Обнаружено, что при воздействии олеиновой и стеариновой кислот происходит увеличение значения константы Михаэлиса и снижение максимальной скорости реакции, что свидетельствует о смешанном типе ингибирования;

7. Предложен адсорбционный способ иммобилизации липазы на различных типах хитозанов, позволяющий сохранить до 55% активности нативного фермента;

8. Исследованы физико-химические свойства липазы, иммобилизованной на низкомолекулярном, высокомолекулярном, растворимом хитозанах. Установлены оптимальные условия функционирования полученных ферментных препаратов: оптимальная температура гидролиза - 37-45 °С, pH - 7,0;

9. Показано, что поли-Ы-винилпирролидон может применяться в качестве носителя для иммобилизации липазы. Использование данного носителя позволяет получить ферментный препарат, стабильный при pH 4,06,0.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние двухвалентных металлов на физико-химические свойства липазы, выделенной из Rhizopus niveus / Т.А. Ковалева, О.Д. Трофимова, О.П. Багно, A.C. Беленова // Фундаментальные исследования. - 2006. - №5. -С. 85.

2. Жирные кислоты как регуляторы активности липазы / A.C. Беленова // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва, 8-11 апреля 2008. - С. 1.

3. Использование гидролитических ферментов для получения жирных кислот и глицерина / А.И. Сливкин, Т.А. Ковалева, A.C. Беленова. М.Г. Холявка // Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 11-13 марта 2008. -С.240-241.

4. Исследование влияния ионов Са2+ на процесс регуляции каталитической липазы / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова / Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда, Барнаул, 25-27 июня 2008. - С. 22.

5. Исследование надмолекулярной структуры липазы Rhizopus niveus / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова // Рефераты докладов второго международного форума «Аналитика и аналитики», Воронеж, 22-26 сентября 2008. - С. 112.

6. Исследование структурно-функциональных свойств липазы методом атомно-силовой микроскопии / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева // Сборник тезисов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 10-14 ноября 2008. -С.168.

7. Исследование четвертичной структуры липазы Rhizopus niveus / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева, В.Г. Артюхов, О.Д. Трофимова, О.П. Багно // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т.8, вып. 2. - С. 246-251.

8. Перспективы применения иммобилизованной на хитозане липазы / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, B.JI. Лапенко // Материалы Пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2-4 декабря 2008. - С. 22-23.

9. Термическая инактивация липазы из Rhizopus niveus / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова. Е.А. Землянухина // Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и восьмой съезд белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 25-27 июня 2008. Сборник статей в двух частях, часть 1. - С.69-72.

10. Адсорбционная иммобилизация липазы на хитозане / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, В.Л. Лапенко, Т.Ю. Соколова // Материалы И Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Пермь, 25-29 мая 2009. - С. 191-193.

11.Атомно-силовая микроскопия как метод визуализации белковых молекул / A.C. Беленова. М.Г. Холявка / Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 22 апреля 2009. - С. 23-24.

12.Атомно-силовая микроскопия как метод исследования надмолекулярной структуры липазы / A.C. Беленова // Нанобиотехнология: проблемы и перспективы. Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых, Белгород, 14-17 октября 2009. -С. 8-10.

13.11оли-Ы-винилпирролидон как носитель для иммобилизации липазы / A.C. Беленова // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 13-18 апреля 2009. - С. 4-5.

14. Создание биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на хитозане / A.C. Беленова // Тезисы докладов Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Воронеж, 12-13 ноября 2009. - С. 14-16.

15.Иммобилизация гидролитических ферментов на растворимых носителях / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова. М.Г. Холявка, Е.Л. Макарова // Сборник научных трудов по материалам конференции «Первые

Международные Беккеровекие чтения», Волгоград, 27-29 мая 2010. В двух частях, ч. 1,- С. 216-218.

16.Иммобилизация липазы на растворимых носителях, применяемых в медицинской и фармацевтической практике / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова. Г.В. Шаталов, Д.А. Сливкин, А.И. Сливкин // Материалы 4-ой Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармаобразование 2010», Воронеж, 20-22 апреля 2010. - С. 182-184.

17.Иммобилизованные гидролитические ферменты и их применение в медицине / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова, М.Г. Холявка / Сборник трудов III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия», Курск, 7-8 июня 2010.-С. 84-86.

18.Применение метода ИК-спектрофогометрии для изучения структуры некоторых гидролитических ферментов / A.C. Беленова, М.Г. Холявка, Т.А. Ковалева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки», Уфа, февраль 2010. Т. 2.-С. 28-33.

19.Растворимый хитозан как носитель для иммобилизации липолитических ферментов / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, A.A. Асташов // Сборник тезисов 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010.-С. 229.

20.Роль ионов двухвалентных металлов в функционировании гидролитических ферментов / A.C. Беленова. Т.А. Ковалева, М.Г. Холявка, E.JI. Макарова // Материалы Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественных наук», Тамбов, 15 марта 2010.-С. 29-33.

21.Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы / Т.А. Ковалева, A.C. Беленова. А.И. Сливкин, B.J1. Лапенко // Биотехнология. -2010.-№4. -С. 59-64.

Статьи № 7, 21 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 14.02.2011. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,2 Тираж 100 экз. Заказ 179.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-иолшрафического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беленова, Алёна Сергеевна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ~

1.1. Физико-химические свойства липаз

1.2. Основные представления о структуре липаз

1.3. Механизмы ферментативной реакции гидролиза триглицеридов

1.4. Применение липолитических ферментов в промышленности и медицине

1.5. Общие представления об иммобилизованных ферментах

1.6. Иммобилизованные липолитические ферменты и их физико-химические свойства 48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Очистка ферментных препаратов от низкомолекулярных примесей

2.2.2. Определение молекулярной массы липазы

2.2.3. Определение размеров молекулы липазы

2.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури

2.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури

2.2.6. Спектрофотометрический метод Андерсона-Маккарти определения каталитической активности липазы

2.2.7. Методика адсорбционной иммобилизации липазы на нерастворимых носителях

2.2.8. Методика адсорбционной иммобилизации липазы на растворимых носителях

2.2.9. Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-спектрофотометрии

2.2.10. Методика определения различных типов вторичных структур в молекуле липазы

2.2.11. Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.2.12. Методика атомно-силовой микроскопии

2.2.13. Методика определения процентного содержания аминокислот в первичной структуре белка ~

2.2.14. Статистическая обработка результатов экспериментов

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИПАЗЫ ЯНИОРV8 ШУЕШ

3.1. Определение молекулярной массы мономеров и димеров липазы

3.3. Визуализация олигомерной структуры липазы ЯЫгорт пыет методом атомно-силовой микроскопии

3.4. Определение процентного содержания различных типов аминокислот в первичной структуре липаз, выделенных из разнообразных источников

3.5. Исследование значения ионов Са2+ в функционировании мономерной и димерной форм липазы ЛЫгорт туеш

3.6. Физико-химические свойства липазы ЯЫгориэ пгоет

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ПРОЦЕССА ТЕРМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ МОНОМЕРНОЙ И ДИМЕРНОЙ ФОРМ ЛИПАЗЫ ИЗ КНИОРШ ЖУЕШ

4.1. Изучение кинетических особенностей процесса термической инактивации димерной и мономерной форм липазы ЯЫгория туеш

4.2. Термодинамические аспекты процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы из ЛЫгорш пп>ет

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ОЛЕИНОВОЙ И СТЕАРИНОВОЙ КИСЛОТ

НА ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ ИЗ ыягория шгеш юо

5.1. Влияние состава растворителя на каталитическую активность липазы

5.1. Олеиновая и стеариновая кислоты как ингибиторы каталитической активности липазы

6.1. Иммобилизация липазы на низкомолекулярном и высокомолекулярном хитозанах

6.2. Иммобилизация липазы на растворимом хитозане

6.3. Исследование механизма взаимодействия молекул липазы с матрицей различных типов хитозанов

6.4. Иммобилизация липазы на растворимом носителе поли -М-винилпирролидоне

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой"

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование надмолекулярной организации липазы ЯЫгорт туеш, физико-химических и кинетических свойств фермента, иммобилизованного на растворимых и нерастворимых носителях, изучение особенностей гидролиза триглицеридов нативными и иммобилизованными ферментными препаратами.

Реализация поставленной цели предполагает решение следующих задач:

1) исследовать особенности надмолекулярной организации липазы ЯЫгорш тмеш\

2) изучить закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы ШЫгорш пЬ?ет\

3) установить характер влияния ионов Са2+ на структурно-функциональные свойства различных форм липазы КЫгорт тугие;

5) исследовать физико-химические и кинетические свойства липазы в свободном и иммобилизованном состояниях.

Научная новизна: проведен сравнительный анализ содержания различных типов аминокислотных остатков в первичной структуре липаз микробного происхождения; показана тенденция к образованию надмолекулярных структур у липазы ЯЫгорш пЪ>еш\ проведены комплексные исследования надмолекулярной организации липазы из Югшорш пЪ?ет\ впервые применен метод атомно-силовой микроскопии в сочетании с классическими биофизическими и биохимическими методами анализа для визуализации молекул липазы из ЯЫгорш пЪ?ет\ установлены закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы; разработан способ иммобилизации липазы на растворимых носителях; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе липазы.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований четвертичной структуры, термической инактивации мономерной и димерной форм липазы из ЛЫгория туеш, влияния ионов кальция, олеиновой и стеариновой кислот на функциональные свойства фермента позволяют расширить и углубить представления о механизме ферментативного гидролиза триглицеридов.

В ходе исследования разработана методика адсорбционной иммобилизации липазы на4 поли-К-винилпирролидоне и растворимом хитозане, которую можно рекомендовать для получения лекарственных препаратов для заместительной энзимотерапии.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований по теме диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, всероссийских и региональных конференциях и симпозиумах: Международном симпозиуме «Современные спектральные методы изучения биополимеров в биологии и медицине» (Дубна, 2007); 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); Втором Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Воронеж, 2009); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (Белгород, 2010); XXII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 21 публикация: 9 статей и 12 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Липаза, выделенная из ЯЫгорш пыеш, в водном растворе функционирует в форме димера. Мономерная форма липазы более устойчива к температурным воздействиям в интервале 20-60 °С по сравнению с димерной.

2. Ионы кальция, включенные в Са2+-связывающий домен молекулы фермента, поддерживают каталитически активную конформацию энзима и определяют оптимальные условия гидролиза триглицеридов.

3. Олеиновая и стеариновая кислоты являются ингибиторами липазы смешанного типа.

4. Адсорбционный способ иммобилизации липазы на растворимых и нерастворимых носителях позволяет сохранить до 55% (при связывании с растворимым хитозаном) и 79% (при взаимодействии с поли-ЫГ-винилпирролидоном) активности нативного энзима.

5. Связывание липазы с поли-Ы-винилпирролидоном дает возможность получить ферментный препарат, стабильный по отношению к значениям рН 4,0-6,0.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Беленова, Алёна Сергеевна

выводы

1. Оптимальными условиями гидролиза триглицеридов для липазы из КЫгорш пыет являются температура катализа 37°С, рН 7,0, концентрация субстрата-2,1 ммоль/л;

2. Установлено, что липаза ЯЫгорш пюеш функционирует в форме димера с молекулярной массой 96±2кДа;

3. Рассчитано процентное содержание различных типов аминокислотных остатков в молекулах липаз микробного происхождения. Показано, что большинство ферментов, имеющих в своем составе более 40% гидрофобных аминокислотных остатков, проявляют тенденцию к образованию димерных структур;

4. Выявлено, что ионы кальция являются необходимыми в гидролизе триглицеридов и предположительно входят в состав Са2+-связываюгцего домена, поддерживая каталитически активную конформацию фермента;

5. Установлены закономерности процесса термической инакивации мономерной и димерной форм липазы КЫгорш туеш. Показано, что механизм термической модификации липазы и ее протомеров не идентичен;

9. Показано, что поли-Тч!-винилпирролидон может применяться в качестве носителя для иммобилизации липазы. Использование данного носителя позволяет получить ферментный препарат, стабильный при рН 4,06,0.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей лаборатории при помощи программы ВюЕсШ: версия 7.0.5 было рассчитано процентное содержание различных аминокислотных остатков в первичной структуре фермента. Показано, что липаза КЫгорш туеия содержит 40,4% гидрофобных аминокислотных остатка, что дает возможность предположить наличие у нее тенденции к образованию надмолекулярных комплексов.

Методом гель-хроматографии и электрофореза было установлено, что липаза из ЯЫгорш тует имеет олигомерную структуру (молекулярная масса 96±2 кДа), которая представлена двумя протомерами, имеющими одинаковую молекулярную массу 48±2 кДа.

Проблема денатурации белка имеет большое значение как для фундаментальной, так и для прикладной науки. Изучение процесса денатурации позволяет установить связь между структурой белка и его стабильностью и понять, какие факторы определяют термоустойчивость молекул. Кроме того, температурный фактор является важнейшим критерием отбора ферментов для пищевой и фармацевтической промышленности, поэтому нами были выявлены закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы ЯЫгорт туеш. Установлено, что термомодификация нативного фермента начинается уже при температуре 30 °С. При 50 °С происходит снижение каталитической активности со значительной скоростью и через 60 мин. способность к гидролизу триглицеридов уменьшалась на 94%. Процесс термической денатурации имеет двухфазный характер, и переход «упорядоченная глобула-хаотический клубок» складывается из отдельных этапов, причем его механизм для димерной и мономерной форм липазы не идентичен. Очевидно, что термоустойчивость мономерной формы липазы достоверно выше по сравнению с димерной: при температурах 20-60 °С значение их констант скорости инактивации ниже, чем у димерного энзима.

Наиболее важным свойством ферментов в обеспечении процессов жизнедеятельности является возможность осуществлять присущие им функции со скоростью, соответствующей потребностям клетки. Для осуществления этой способности белковые молекулы должны иметь специальные механизмы, с помощью которых они воспринимают сигналы из окружающей среды и реагируют на них изменением характера функционирования. Одним из наиболее простых способов регуляции каталитической активности энзимов является действие на них ингибиторов и активаторов. Установлено, что олеиновая"1Гстеариновая кислоты являются ингибиторами липазы смешанного типа, о чем свидетельствует увеличение Кт и уменьшение Утах. При помощи модификации липазы и ее мономеров этилендиамидтетраацетатом, а также метода ИК-спектрофотометрии продемонстрировано, что ионы кальция входят в состав Са-координационного домена и являются необходимыми в осуществлении каталитического акта расщепления эфирной связи, они участвуют и в поддержании каталитически активной конформации фермента.

Нами была продемонстрирована возможность адсорбционной иммобилизации липазы на хитозанах с различной растворимостью и молекулярными массами. Несмотря на то, что процесс иммобилизации липазы на различных типах хитозанов, по-видимому, протекает по сходным механизмам, остается невозможным предсказать результат иммобилизации в зависимости от количества звеньев О-глкжозамина и Ы-ацетил-В-глюкозамина в молекуле носителя.

В связи с увеличением использования липолитических ферментов в клинической практике, необходимым условием становится изучение процессов иммобилизации на растворимых носителях, которые могут быть использованы в фармакологии как самостоятельные лекарственные средства, так и вспомогательные вещества при производстве таблетированных лекарственных форм. Нами была проведена серия экспериментов по иммобилизации липазы на поли-Ы-винилпирролидоне, который используется в фармации как вспомогательное вещество. В ходе экспериментов было выявлено, что при связывании с поли-М-винилпирролидоном липаза сохраняет 79% каталитической активности. Показано, что оптимальные условия липолиза полученным ферментным препаратом: = 40 "С; рН = 7,0; [8] = 2,0'ммоль/л. Обнаружено, что каталитическая активность иммобилизованной липазы достоверно выше, чем у нативного фермента в диапазоне значений рН от 4,0 до 6,0. Проведенные эксперименты являются первым этапом исследований, направленных на получение новых лекарственных средств пролонгированного действия для лечения системы пищеварения.

На основании результатов экспериментов мы предлагаем следующие рекомендации, которые могут учитываться в доклинических испытаниях препаратов липазы, иммобилизованной на-нерастворимом и растворимом хитозанах и поли-Ы-винилпирролидоне.

3. Оптимальное время гидролиза субстрата — от 8 до 28 мин.;

4. В работе целесообразно использовать фермент в концентрации 10"5 моль/л;

5. Реакцию гидролиза субстрата необходимо проводить при температуре 37° С и рН 7,0.

131

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беленова, Алёна Сергеевна, Воронеж

1. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева. -Воронеж: Изд-во Воронежского государственного ун-та, 1996. 240 с.

2. Ашрефи Ф.Дж. Препарат липазы Mucor racemosus и некоторые его свойства / Ф.Дж. Ашрефи, С.Ю. Касумова, Р.А. Агабекова. Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2010. -№ 2. - С. 18-21.

3. Биофизика / В.Г. Артюхов и др.— Екатеринбург; М.: Деловая кн.; Акад. Проект, 2009. 293 с.

4. Блиева Р.К. Синтез гидролитических ферментов иммобилизованными микромицетами / Р.К. Блиева // Инженерная энзимология: Материалы VI Всесоюз. симп. — Вильнюс, 1988. — Ч. 1. — С. 61—62.

5. Болдырев А. А. Регуляция активности мембранных ферментов / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. 1997. - №6. — с. 2127.

6. Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма / А.Е. Браунштейн. М.: Наука, 1987. - 546 с.

7. Брокерхофт К. Липолитические ферменты / К. Брокерхофт, Р. Дженсен. М.: Мир. - 1978. - 396 с.

8. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты / Под ред. И.В. Березина, К. Мартинека. — М. : Изд-во МГУ, 1982 .— 383 с.

9. Виноградова Р.П. Молекулярные основы действия ферментов / Р.П. Виноградова. Киев : Высшая школа, 1978. - 280 с.

10. Ю.Давранов К.Д. Изучение внеклеточных липаз Rhizopus microsporus / Давранов К.Д., Дилеров Ж., Ризаева М.// Прикладная биохимия и микробиология . 1978. - Т. 14, №3. - С. 389-393.

11. П.Давранов К.Д. Микробные липазы в биотехнологии. Обзор // Прикладная биохимия и микробиология 1994. - Т. 30, №. 4-5. - С. 527-534.

12. Давранов К.Д. Современное состояние исследования микробных липаз / К.Д. Давранов, В.Б. Халамейзер // Химия природных соединений. -1997.-№2.-С. 150-169.

13. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей семян пшеницы / О.С. Корнеева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т. 44, № 1. - С. 387-393.

14. Иммобилизованные клетки и ферменты: Методы / С.П. Бидей и др. — М.:Мир, 1988 .— 215 с.

15. Иммобилизованные ферментыГ Современное состояние и перспективы / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. — М.: Изд-во Московского ун-та, 1976. 296 с.

16. Имшенецкий A.A. Ферменты микроорганизмов /A.A. Имшенецкий. -М.: Наука, 1973.-314 с.

17. Кабанова B.C. Совещание по применению ферментных препаратов / B.C. Кабанова // Ферментативная и спиртовая промышленность. 1983. - Т. 7.-С. 41-43.

18. Кантор Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммел // М. : Мир,. 1984. Т.2. - 336 с.

19. Капранчиков B.C. Препаративное получение и характеристика липазы зародышей пшеницы / B.C. Капранчиков, H.A. Жеребцов, Т.Н. Попова // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40, № 1. - С. 98-103.

20. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети.— М. : Мир, 1990 .— 348 с.

21. Кирш Ю.Э. Поли-1Ч-винилпирролидон и другие поли-М-виниламиды / Ю.Э. Кирш. М.: Наука. - 1998. -252с.

22. Коновалов С.А. Биосинтез ферментов микроорганизмами / С.А. Коновалов. М.: Пищ. пром, 1975. - 240с.23 .Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов / Б.И. Курганов. М.: Наука, 1992.- 62 с.

23. Любарев А. Е. Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующейкалориметрии / А. Е. Любарев, Б. И. Курганов // Успехи биологической химии. 2000. - Т. 40. - С. 43 - 84.

24. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии / В.Л. Миронов. Нижний Новгород: Российская академия наук, Институт физики микроструктур, 2004 - 110 с.

25. Можаев В.В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии /В.В. Можаев // Успехи биологической химии. 1983. - Т. 24. - С. 99-134.

26. Олигомерные белки: структурно функциональные модификации и роль субъединичных контактов / В.Г. Артюхов и др. - Воронеж : Изд-во Воронежского государственного ун-та, 1997. - 264 с.

27. ЗО.Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

28. Перутц М. Молекула гемоглобина / М. Перутц // Молекулы и клетки. 1965.-С. 7-25.

29. Роль структуры поли-ТчГ-виниламидов в реакции кислотного гидролиза / Ю.Э. Кирш и др. // Журнал физической химии. 1997. - Т. 68, №9.-С. 1584-1586.

30. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы / Е.Л. Рубан. M .: Наука, 1977.-216 с.

31. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. /В.М. Степанов. -М.: «Высшая школа», 1996. 335 с.

32. Тривен М. Д. Иммобилизованные ферменты: Вводный курс и применение в биотехнологии / М. Тривен.— М. : Мир, 1983 .— 213 с.

33. Тырсин Ю.А. Идентификация гистидина в активном центре липазы I Rhizopus oryzae 1403 / Ю.А. Тырсин, С.А. Шеламова // Вестник ОГУ. -2009.-№6.-С. 374-378.

34. Уверский В.Н. Review: a multiparametric approach to studies of self-organization of globular proteins / В.Н. Уверский // Биохимия. 1999. - Т. 64, №3. - С. 306-325.

35. Уэстли Дж. Ферментативный катализ / Дж. Уэстли. М. : «Мир», 1972.-270 с.

36. Фармацевтическая биотехнология / В.А. Быков и др. Воронеж: Изд. Воронежского гос.ун-та, 2009. — 432с.

37. Фершт Э. Структура и механизмьгдействия ферментов / Э. Фершт. — М. : «Мир», 1980.-432 с.

38. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы / П. Фридрих. М. : «Мир», 1986. - 374 с.

39. Химическая энзимология / В.К. Антонов и др. — М.: Изд-во Московского ун-та, 1983 .— 227 с.

40. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам / Р. Чанг. М. : Мир, 1980. - 662 с.

41. Чиргадзе Ю.Н. Инфракрасные спектры и структура полипептидов и белков / Ю.Н. Чиргадзе. М. : Наука, 1965.—133 с.

42. Шеламова С.А. Некоторые каталитические свойства липазы I Rhizopus oryzae 1403 / С.А. Шеламова, Ю.А. Тырсин // Вестник ОГУ. 2009. - №6. - С. 434-437.

43. Abdou A.M. Purification and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase / A.M. Abdou // Journal of Dairy Science. 2003. -Vol. 86.-P. 127-132.

44. Ahern T.J. The mechanism of irreversible enzyme inactivation at 100°C / T.J. Ahern, A.M. Klibanov // Science. -1985. Vol. 228. -P. 1280-1284.

45. Alberghina L. Lipase: structure, mechanism and genetic engineering / L. Alberghina, R.D. Schmid. VCH.: Wienheim, 1991. - P. 389-392.

46. An extracellular lipase from the dimorphic yeast Arxulaadeninivorans: molecular cloning of the ALIP1 gene and characterization of the purified recombinant enzyme / E. Boer et al. // Yeast. 2005. - Vol. 22, № 7. - P. 523535.

47. Anderson M.M. Rapid and sensitive assay for free fatty acids using rodamine 6G / M.M. Anderson // Analytical Biochemistry. 1972. - Vol. 45, №1. -P. 271-276.

48. Andersson R.E. Thermal Inactivation of a Heat-Resistant Lipase Produced by the Psychrotrophic Bacterium Pseudomonas fluorescens / R.E. Andersson, C.B. Hedlund, U. Jonsson // Journal of Dairy Science. 1979. - Vol. 62, №3.-P. 361-367.

49. Application of advanced materials as support for immobilization of lipase from Candida rugosa / M.A.B. Basyaruddin et al. // Biocatalysis and biotransformation. 2005. - Vol. 23, №3-4. - P. 233-239.

50. Aucoin M. Hyperactivation of Rhizomucor miehei lipase by hydrophobic xerogels / M. Aucoin, F. Erhardt, R. Legge // Biotechnology Bioengineering. -2004. Vol. 85, №6. - P. 647-655.

51. Bacterial lipases / K-E. Jaeger et al. // FEMS Microbiology Reviews. -1994.-Vol. 15.-P. 29-63.

52. Benjamin S. Isolation and characterization of three distinct forms of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation / S. Benjamin, A. Pandey // Brazilian Archives of Biology and Technology. 2001. - Vol. 44, №. 2.-P. 213-221.

53. Biochemical and molecular characterization of a lipase produced by Rhizopus oryzae / Salah RB et al. // FEMS Microbiology Letters. 2006. - Vol. 260, №2.-P. 241-248.

54. Bradoo S. Microwave-assisted rapid characterization of lipase selectivities // S. Bradoo, P. Rathi, R.K. Saxena // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2002. - Vol. 51. - P. 115-120.

55. Brune A.K. Degradation of lipids by bacterial lipases / A.K. Brune, F. Gotz // Microbial degradation of natural products. 1992. - P. 243-266.

56. Ca( )-induced folding of a family 1.3 lipase with repetitive Ca( j-binding motifs at the C-terminus / K. Amada et al. // FEBS Letters. 2001. - Vol. 509, №1. - P. 17-21.

57. Characterization and physicochemical properties of an lipase from Pseudomonas mendocina 3121-1 / B. Surinenaite et al. // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2002. - Vol. 36. - P.47-55.

58. Characterization of an extracellular lipase encoded by Lip2 in Yarrowia lipolytica / G. Pignede et al. // Journal of Bacteriology. 2000. - Vol. 182, №. 10.-P. 2802-2810.

59. Cloning and analysis of Candida cylindracea lipase sequence / M. Lotti et al. // Gene. 1993. - Vol. 124, №1. - P. 45-55.

60. Cloning and sequencing of the cDNA encoding lipase I from Trichosporon fermentans WU-C12 / T. Arai et al. // FEMS Microbiology Letters.-1997.-Vol. 152, №1.-P. 183-188.

61. Cloning, purification and characterisation of Staphylococcus warneri lipase 2 / M.D. van Kampen et al. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Protein Structure and Molecular Enzymology. 2001. - Vol. 1544, №1-2. - P. 229-241.

62. Collins Y. Evidence of a relationship between autolysis of starter bacteria and lipolysis in cheddar cheese during ripening / Y. Collins, P. McSweeney, M. Wilkinson // J Dairy Research 2003. - Vol. 70, №1. - P. 105-113.

63. Comparison of non-diglyceride- and diglyceride-based assays for pancreatic lipase activity / J.R. Stenhauer et al. // Journal of clinical laboratory analysis. 2002. - №6. - P. 52-55.

64. Covalent coupling method for lipase immobilization on controlled pore silica in the presence of nonenzymatic proteins / C. M. F. Soares et al. // Biotechnology Progress. -2003. Vol. 19, №3. - P. 803-807.

65. Crystal structure of Pseudomonas"aeruginosa lipase in the open conformation. The prototype for family 1.1 of bacterial lipases / M. Nardini et al. // Journal of Biological Chemistry. 2000. - Vol. 275, №40. - P. 31219-31225.

66. F.J. Contesini, F. de O. Carvalho // Journal of the Brazilian Chemical Society. -2008.-Vol. 19, №8.-P. 1468-1474.

67. Dalev P. An enzyme biotechnology for the total utilization of leather waster / P. Dalev, L. Simeonova // Biotechnol Letters. 1992 - Vol. 14, №6. - P. 531-534.

68. Davranov K. Microbial lipases in biotechnology (review) / K. Davranov // Applied Biochemistry and Microbiology. -1994. Vol. 30. - P. 527-534.

69. Derewenda Z. Structure and functions of lipases / Z. Derewenda // Advances in Protein Chemistry. 1994. - Vol. 45. - P. 1-52.

70. Destain J. Improvement of lipase production from Yarrowia lipolytica /J. Destain, D. Roblain, P. Thonart I I Biotechnology Letters. 1997. - Vol. 19, № 2. -P. 105-107.

71. Dharmsthiti S Purification and characterization of lipase from a raw-milk yeast (Trichosporon asteroides) / S. Dharmsthiti, P. Ammaranond // Biotechnology and Applied Biochemistry. 1997. - Vol. 2. - P. 111-116.

72. Differential scanning calorimetry of the effects of Ca(2+) on the thermal unfolding of Ps. cepacia lipase / A. Tanaka et al. // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2003. - Vol. 67, №1. - P. 207-210.

73. Dodson G. Structural and evolutionary relationships in lipase mechanism and activation / G. Dodson, D. Lawson, F. Winkler // Faraday Discuss. 1992. -Vol. 93.-P. 95-105.

74. Expression and characterization of Ca (2+)- independent lipase from Bacillus pumilus B 26 / H.K. Kim et al. // Biochimica et Biophysica Acta. -2001.-Vol. 1583.-P. 205-212.

75. Expression in Pichiapastoris of Candida antarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose binding domain / J.C. Rotticci-Mulder et al. // Protein Expression and Purification. - 2001. - Vol. 21, №. 3. - P. 386-392.

76. Expression of LIP 1 and LIP2 genes from Geotrichum species in Baker's yeast strains and their application to the bread-making process / A. Monfort et al. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1999. - Vol. 47, №2. - P. SOSSOS.

77. Factors affecting lipase production in Aspergillus ventii / H. Chander et al. // Journal of Food Science. 1980 - Vol. 45, №3. - P. 636-639.

78. Fariha H. Industrial applications of microbial lipases / H. Fariha, A. S. Aamer, H. Abdul // Enzyme and Microbial Technology. 2006. - Vol. 39, № 2. -P. 235-251.

79. Fu Y.U.C. Cloning and characterization of a gene (.LIP1) which encodes a lipase from the pathogenic yeast Candida albicans II Y.U.C. Fu et al. // Microbiology. 1997. - Vol. 143, № 2. - P. 331-340.

80. Ghanem E.H. An alkalophilic thermostable lipase produced by a new isolated of Bacillus alcalophilus / E.H. Ghanem, H.A. Al-Sayeed, K.M. Saleh // World Journal of Microbiology and. Biotechnology. 2000. - Vol. 16. - P. 459464.

81. Gilbert E. J. Purification and properties of extracellular lipase from Pseudomonas aeruginosa EF2 / E. J. Gilbert, A. Cornish, C.W. Jones // Journal of General Microbiology. 1991. - Vol. 137. - P. 2223-2229.

82. Gilbert E.J. Urification and properties of extracellular lipase from Pseudomonas aeruginosa EF2 / E.J. Gilbert, A. Cornish, C. W. Jones // Journal of General Microbiology. -19991. Vol. 137. - P. 2223-2229.

83. Gomes F. Immobilization of lipase on chitin and its use in nonconventional biocatalysis /F. Gomes, E. Pereira, H. de Castro // Biomacromolecules. 2004. - Vol. 5, №1. - P. 17-23.

84. Gupta M.N. Thermostability of enzymes / M.N Gupta. Berlin: Springer and New Delhi: Narosa Publ. House. - 1993. - 213 p.

85. Gupta R. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties / R. Gupta, N. Gupta, P. Rathi // Applied Microbiology and Biotechnology. 2004. - Vol. 64, № 6. - P. 763-781.

86. Gupta S. Lipase immobilization on Polysulfone globules and their performances in olive oil hydrolysis / S. Gupta , K. Singh, A. Bhattacharya // International Journal of Biological Macromolecules. 2010. -V. 1, №4. P. 445450.

87. Harwood J. The versatility of lipases for industrial uses / J. Harwood // Trend in Biochemical Science. 1989. - №4. - P. 125-126.

88. Hassing G.S. Partial purification and some properties of a lipase from Corynebacterium acne /G.S. Hassing // Biochemica et Biophysica Acta. — 1971. — Vol. 242.-P. 331.

89. Hofelmann M. Isolation, purification and characterization of isozymes from technical Aspergillus niger / M. Hofelmann // Journal of Food Science. -1985.-Vol. 50.-P. 1591-1592. —

90. Homology modeling and active-site residues probing of the thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius esterase / G. Manco et al. // Protein Science. 1999. Vol. 8, №9. - P. 1789-1796.

91. Horiuti Y. Purification of lipase from Chromobacterium viscosum by chromatography on palmitoyl cellulose / Y. Horiuti, S. Imamura // The Journal of Biochemistry. 1977. - Vol. 81. - P. 1639-1649'.

92. Huang J. Silanized palygorskite for lipase immobilization / J. Huang, Y. Liu, X. Wang // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009. - Vol. 57, № 1-4.-P. 10-15.

93. Huang Y. Purification and characterization of an extracellular lipase from Geotrichum marinum / Y. Huang, R. Locy, J.D. Weete // Lipids. 2004. -Vol. 39, №3. —P.251—257.

94. Identification of a calcium binding site in Staphylococcus hyicus lipase: Generation of calcium-independent variants / F. A. Jan-Willem // Biochemistry. 1999. - Vol. 38, № 1. - P. 2-T(L

95. Identification of histidine and aspartic acid residues essential for enzymatic activity of a family 1.3 lipase by site-directed mutagenesis / H. Kwon et al.[ / FEBS Letters. 2000. - Vol. 483, №2-3. - P. 139-142.

96. Identification of triacylglycerol lipase gene family in Candida deformans-. Molecular cloning and functional expression / F. Bigey et al. // Yeast. 2003. - Vol. 20, № 3. - P. 233-248.

97. Immobilization of Candida rugosa lipase on magnetized dacron: Kinetic study / Pimentel M.C.B, et al. // Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology. 2007. - Vol. 35, №2. - P. 221-235.

98. Immobilization of enzymes on slowly soluble carriers / V. P. Torchilin // Journal of Biomedical Materials Research. 1977. - Vol. 11, № 2. - P. 223-235.

99. Immobilization of lipase by entrapment in Ca-alginate beads / I. Bhushan et al. // Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 2008. - Vol. 23, №6.-P. 552-562.

100. Immobilization of lipase from Fusarium solani fsl / K. Knight et al. // Brazilian Journal of Microbiology. 2000. - Vol. 31, № .3. - P. 219-221.

101. Immobilized lipase-catalyzed production of alkyl esters of restaurant grease as biodisel / A. Hsu et al. // Biotechnology and Applied Biochemistry. -2002.-Vol. 36, №3.-P. 181-186.

102. Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability/ K.J.A. Zhu et al. // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. -Vol. 1547, №2. - P. 329-338.

103. Industrial biocatalysis today and tomorrow / A. Schmid et al. // NATURE . 2001. - Vol. 409. - 258-268.

104. Influence of precursors and additives on microbial lipases stabilized by sol-gel entrapment / F. Peter et al. // Biocatalysis and Biotransformation. 2005. -Vol. 23, № 3-4-P.251-260.

105. Integration of purification with immobilization of Candida rugosa lipase for kinetic resolution of racemic ketoprofen / Y. Liu et al. // Biotechnology. -2004. Vol. 110, №2. - P. 209-217.

106. Isbilir S.S. Some biochemical properties of lipase from bay laurel {Laurus nobilis) seeds / S.S. Isbilir, H.M. Ozcan, H. Yagar // Journal of the American Oil Chemists' Society. 2008. - Vol. 85. - P. 227-233.

107. Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1 / O.W. Lee et al. // FEMS Microbiology Letters. 1999. -Vol. 179.-P. 393-400.

108. Isolation and partial characterization of heart stable proteinase, lipase and phospholipase from Pseudomonas fluorescens / L. Stepaniak et al. //Milchwissenschaft. 1987. - Vol. 42. - P. 75-79.

109. Kermasha S. Characterization of- purified lipase fractions from Rhizopus niveus / S. Kermasha, M. Safari, B. Bisakowski // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998. - Vol. 46, № 10. - P. 4451-4456.

110. Khor H. T. Lipase-catalyzed hydrolysis of palm oil / H. T. Khor, N. H. Tan, C. L. Chua // Journal of the American Oil Chemists' Society.-. 1986. -Vol. 63, №4.-P. 538-540.

111. Khyami-Horani H. Thermotolerant strain of Bacillus licheniformis producing lipase / H. Khyami-Horani // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1996. - Vol. 12. - P. 399-401.

112. Kilara A. Preparation and properties of immobilized papain and lipase / A. Kilara, K.M. Shahani // Biotechnology and Bioengineering. 1977. - Vol. 19, № 11.-P. 1703-1714.

113. Kinetic studies of lipase from Candida rugosa: a comparative study between free and immobilized enzyme onto porous chitosan beads / E. Pereira et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2001. - Vol. 91-93. - P. 739-752.

114. Kinetics of organic solvent-soluble and native lipase / Tsuzuki W. et al. // Journal of the American Oil Chemists' Society. 1995. - Vol. 72, № 11. -P. 1333-1337.

115. Knezevic Z. Lipase immobilization in a hollow fibre membrane reactor: Kinetics characterization and application for palm oil hydrolysis / Z. Knezevic, B. Obradovic // Chemical Papers. 2004. - Vol. 58№ 6. - 418-^123.

116. Kojima Y. Purification and characterization of an alkaline lipase from Pseudomonas fluorescens AK 102 / Y. Kojima,~M. Yokoe, T. Mase // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 1994. - Vol. 58. - P. 1564-1568.

117. Kulkani N. Production and properties af an alkaline thermophilic lipase from Pseudomonas fluorescens NS2W'/ N. Kulkani, R.V. Gadre // Journal Idustrial Food Microbiology. 2002. - Vol. 28. - P. 344-348.

118. Lanser A.C. Regioselectivity of new bacterial lipases determined by hydrolysis of triolein / A.C. Lanser, L.K. Manthey, C.T. Hou // Current Microbiology. 2002. - Vol. 44. - P. 336-340.

119. Lavayre J. Stereospecific hydrolysis by soluble and immobilized lipases // J. Lavayre, J. Verrier, J. Baratti // Biotechnology and Bioengineering. -1982. Vol. 24. P. 2175-2188.

120. Leon A. Utilization of enzyme mixtures to retard bread crumb firming / A. Leon, E. Duran, C. Benedito De Barber // Journal of Agricultural and Food Chemistry.-2002.-Vol. 58, №6.-P. 1416-1419.

121. Lesuisse E. Purification and preliminary characterization of the extracellular lipase of Bacillus subtilis 168 anextremely basic pH-tolerant enzyme / E. Lesuisse, KI. Schanck, C. Colson // European Journal of Biochemistry. 1993. -Vol. 216.-P. 155-160.

122. Lipase activity and gene cloning of Acinetobacter calcoaceticus LP009 / S. Dharmsthiti et al. // The Journal of General and Applied Microbiology. 1998. - Vol. 44. P. - 139-145.

123. Lipase activity from strain of Pasteurella multocida / J. Pratt et al. // Current Microbiology. 2000. - Vol. 40. - P. 306-309.

124. Lipase immobilization on silica gel using a cross-linking method / D. H. Lee // Journal of Industrial and Engineering Chemistry. -.2006. Vol. 12, №. 5. -P. 777-782.

125. Lipase production by Trichosporon fermentans WU-C12, a newly isolated yeast / J. Chang et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. -1992.-Vol. 73.-P. 412-414.

126. Litthauer D. Pseudomonas luteola lipase: a new member of the 320-residue Pseudomonas lipase family / D. Litthauer, A. Ginster, E.V.E. Skein // Enzyme and Microbial Technology. -2002. Vol. 104. - p. 129-140.

127. Lotti M. High lipase production by Candida rugosa is associated with Gl cells. A flow cytometry study / M. Lotti, S. Brocca, D. Porro // Biotechnology Letters. -2001. Vol. 23, №. 21. - P. 1803-1808.

128. Low-temperature lipase from psychrotrophic Pseudomonas sp. strain KB700A / N. Rashid et al. // Applied and Environmental Microbiology. 2001. - Vol. 67, № 9. - P. 4064-4069.

129. Lysophospholipase A activity of Pseudomonas aeruginosa type III secretoiy toxin ExoU / M. Tamura et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004. - Vol. 316, №2. - P. 323-331.

130. Microbial lipases: production and applications / P.K. Ghosh et al. // Science progress. 1996. - Vol. 79, №2. - P.-119-157.

131. Microwave-assisted rapid characterization of lipase selectivities / S. Bradoo et al. // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2002. - Vol. 51, №2.-P. 115-120.

132. Minovska V. Lipase immobilized by different techniques on various support materials applied in oil hydrolysis / V. Minovska, E. Winkelhausen, S. Kuzmanova // Journal of the Serbian Chemical Society. 2005. - Vol. 70, №4. -P. 609-624.

133. Miyairi S. An enzyme-polymer film prepared with the use of poly(vinyl alcohol) bearing photosensitive aromatic azido groups / S. Miyairi // Biochimica et Biophysica Acta. 1979. - Vol. 571, № 2. - P. 374-377.

134. Mohd Z.A.R. Butyl acetate synthesis using immobilized lipase in Calcium alginate beads // Z. A. R. Mohd, M. L. Pat, H. L. Kong // The Malaysian Journal of Analytical Sciences. 2008. - Vol. 12, № 3. - P. 575 - 585.

135. Muraoka T. Purification and properties of a novel lipase from Staphylococcus aureus 226 / T. Muraoka, T. Ando, H. Okuda // The Journal of Biochemistry. 1982. - Vol. 92. - P. 1933-1939.

136. Namboodiri V.M. Purification and biochemical characterization of a novel thermostable lipase from Aspergillus' niger / V.M. Namboodiri, R. Chattopadhyaya // Lipids. 2000. - Vol. 35, № 5. - P. 495-502.

137. Nawani N. Purification, characterization and termostability of lipase from a thermophilic Bacillus sp. / N. Nawani, J. Kaur // Molecular and Cellular Biochemistry. 2000. - Vol. 206. - P. 91-96.

138. Noel M. Rhizomucor miehei lipase: differential scanning calorimetry and pressure/temperature stability studies in presence of soluble additives / M. Noel, D. Combes // Enzyme and Microbial Technology. 2003. - Vol. 33, № 2-3. - 299-308.

139. Novel zinc-binding center and a temperature switch in the Bacillus stearothermophilus LI lipase / S.T. Jeong et al. // J Biol Chem. 2002. - Vol. 277, № 19. - P. 17041-17047.

140. Occurrence of thermostable lipase in thermophilic Bacillus sp. strain 398 / E.K. Kim et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1994. -Vol. 53.-P. 961-962.

141. Optimization of a thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus PI: overexpression, purification, and characterization / S. Sinchaikul et al. // Protein Expression and Purification. 2001. - Vol. 22, №3. - P. 388-398.

142. Paiva A.L. Kinetics and mechanisms of reactions catalyzed by immobilized lipases / A.L. Paiva, V.M. Balcao, F.X. Malcata // Enzyme and Microbial Technology. 2000. - Vol. 27, № 3-5. - P. 187-204.

143. Palomo J. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies the enzyme functionality / J. Palomo, M. Fulntes, G. Fernandez-Lorente // Biomacromolecules. 2003. - Vol. 82, №2. - P. 1-6.

144. Pereira E.B. Immobilization and catalytic properties of lipase on chitosan for hydrolysis and esterification reactions / E.B.Pereira, G.M.Zanin, H.F.Castro // Brazilian Journal of Chemical Engineering. 2003. - Vol. 20, №4. -P. 343-355. —

145. Physical immobilization of Rhizopus oryzae lipase onto cellulose substrate: Activity and stability studies / M. Karra-Chaabouni et al. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2008. - Vol. 66. - P. 168-177.

146. Pires-Cabral' P. Modelling the production of ethyl butyrate catalysed by Candida rugosa lipase immobilised in polyurethane foams / P. Pires-Cabral, M.M.R. da Fonseca, S. Ferreira-Dias // Biochemical Engineering Journal. 2007. -Vol. 33, №2.-P. 148-158.

147. Pokorny D. Aspergillus niger lipases: induction, isolation and characterization of two lipases from a MZKI A116 strain / D. Pokorny, A. Cimerman, W. Steiner // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1997. -Vol. 2, № 4-5. - P. 215-222.

148. Polymorphism in the lipase gene of Geotrichum candidum strains. / M.C. Bertolini et al. // European Journal of Biochemistry. 1994. - Vol. 219, № 1-2.-P. 119-125.

149. Posner I. The comparative kinetics 'of soluble and heparin-Sepharose-immobilized bovine lipoprotein lipase / I. Posner, C. Wang, W. McConathy // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1983. - Vol. 226, №1. - P. 306-316.

150. Pratuamgdejkul J. Purification and characterization of lipase from psychophilic Acinetobacter calcoaceticus LP009 / J. Pratuamgdejkul, S. Dharmsthiti // Microbiological research. 2000. - Vol. 155. - P. 95-100.

151. Production, partial purification and characterization of lipases from Pseudomonas fragi CRDA 037 / C. Schuepp et al. // Process Biochemistry. -1997.-Vol. 32.-225-232.

152. Production, purification, and "characterization of lipase from thermophilic and alkaliphilic Bacillus coagulans BTS-3 / S. Kumar et al. // Protein Expression and Purification. 2005. - Vol. 421, №1. - P. 38-44.

153. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry et al. //The Journal of Biological Chemistry. 1951. - Vol. 193, №1. - P. 265 - 275.

154. Purification and characterization of a regiospecific lipase from Aspergillus terrus / R.P. Yadav et al. // Biotechnology and Applied Biochemistry. 1998. - Vol. 29. - P. 243-249.

155. Purification and biochemical characterization of lipase from the dorsal part of Cirrhinus reba / M.A. Islaml et al. // Thai Journal of Agricultural Science. 2009. - Vol. 42, №2. - P. 71-80.

156. Purification and characterization of a lipase from Pseudomonas aeruginosa KKA-5 and its role in castor oil hydrolysis / C. Sharon et al. II Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1998. - Vol. 20. - P. 304-307.

157. Purification and characterization of a lipase from the glycolipid-producing yeast Kurtzmanomyces sp. 1-11 / K. Kakugawa et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 2002. - Vol. 66, №. 5. - P. 978-985.

158. Purification and characterization of a Pseudomonas sp. lipase and its properties in non-aqueous media / D. Huan et al. // Biotechnology and Applied Biochemistry. 1999. - Vol. 30. - P. 251-256.

159. Purification and characterization of phospholipase B from Kluyveromyces lactis and cloning of phospholipase B gene / H. Oishi et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1999. - Vol. 63, №. 1. - P. 83-90.

160. Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea / M. Luisa Rúa et al. 11 Biochimica et Biophysica Acta. 1993. -Vol. 1156, №2.-P. 181-189.

161. Purification and partial characterization of an alkaline lipase from Pseudomonas pseudoalcaligenes F- 111 / S.F. Lin et al. // Applied and Environmental Microbiology. 1996. - Vol. 62. - P. 1093-1095.

162. Purification and properties of an extacellular lipase from the fungus Botrytis cinerea / P. Commenil et al. // Lipids. 1995. - V. 30, № 4. - P. 351356.

163. Purification, characterization, and crystallization of two types of lipase from Rhizopus niveus / Kohno M. et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1994. - Vol. 58, № 6. - P. 1007-1012.

164. Purification, crystallization and properties of triacylglycerol lipase from Pseudomonas fluorescens / M. Sugiura et al. // Biochimica et Biophysica Acta. -1977. Vol. 488. - P. 353-358.

165. Purification, gene cloning, amino acid sequence analysis and expression of an extracellular lipase from an Aeromonas hydrophila human isolate / J. Angultra et al. // Applied and Environmental Microbiology. 1993. - Vol. 59.-P. 2411-2417.

166. Ranjitha P. Purification and characterization of the lipase from marine Vibrio fischeri / P. Ranjitha, E. S. Karthy, A. Mohankumar // International Journal of Biology.- 2009. Vol. 1, № 2. - P. 48-56.

167. Rathi P. A novel alkaline lipase from Burkholderia cepacia for detergent formulation / P. Rathi, R.K. Saxena, R. Gupta // Process Biochemistry. -Vol. 37.-P. 187-192.

168. Reetz M.T. Combinatorial and evolution-based methods in the creation of enantioselective catalysts / M.T. Reetz // Angewandte Chemie International Edition. 2001. - Vol. 40. - P. 284-310.

169. Roberts I. M. Rat lingual lipase:-effect of proteases, bile, and pH on enzyme stability / I. M. Roberts // American Journal of Gastrointestinal and Liver Physiology. 1985. - Vol. 249. - p. 496-500.

170. Role of the lid hydrophobicity pattern in pancreatic lipase activity / A. Thomas et al. // Journal of Biological Chemistry .- 2005. Vol. 48. - P. 4007440083.

171. Rollof J. Purification and characterization of a lipase from Staphylococcus aureus / J. Rollof, S.A. Hedstrom, P. Nilsson-Ehle // Biochimica et Biophysica Acta. 1987. - Vol. 921, № 2. - P. 364-369.

172. Romanovskaya I.I. Immobilization" of Penicillium solitum lipase on the carbon fiber material "Dnepr-MN" / 1.1. Romanovskaya, G. I. Bondarenko, T. I. Davidenko // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2008. - Vol. 42, № 6. - P. 360-362.

173. Saeed H.M. Production and characterization of two extracellular lipases from Pseudomonas aeruginosa / Saeed H.M' et al. //Polish Journal of Microbiology. 2005. - Vol. 54, № 3. - P. 233-240.

174. Secreted lipases of Candida albicans: cloning, characterization and expression analysis of a new gene family with at least ten members / B. Hube et al. // Archives of Microbiology. 2000. - Vol. 174, № 5. - P. 362-374.

175. Seitz E. Industrial application of microbial lipases: A review / E. Seitz // Journal of the American Oil Chemists Society. 1974. - Vol. 51, № 2. - P. 1216.

176. Self-assembly of Pseudomonas fluorescens lipase into biomolecular aggregates dramatically affects functional properties / G. Fernandez-Lorente et al. I I Biotechnology and Bioengineering. 2003. - Vol. 82, №2. - P. 232-237.

177. Semeriva M. Some properties of a lipase from Rhizopus arrhizus. Separation of a glycopeptide bond to the enzyme / M. Semeriva, G. Benzonana, D. Desnuelle // Biochimica et Biophysica Acta. 1989. - Vol. 191, №3. - P.195-200.

178. Sequence of the lid affects activity and specificity of Candida rugosa lipoase isoenzymes / S. Brocca et al. // Protein Science. 2003. - Vol. 12.,- P. 2312-2319.i

179. Shah S. Enhancement of lipase activity in non-aqueous media upon immobilization on multi-walled carbon nanotubes / S. Shah, K. Solanki, M. N. Gupta // Chemistry Central Journal. 2007. - Vol. 1, № 30. - P. 31-37.

180. Sharma R. Production, purification, characterization, and applications of lipases / R. Sharma , Y. Chisti , U.C. Banerjee // Biotechnology Advances. -2001. Vol. 19, № 8. - P. 627-662. -

181. Shaw J.F. Characterization of three distinct forms of lipolytic enzyme in a commercial Candida lipase preparation / J.F. Shaw, C.H. Chang // Biotechnology Letters. 1989. - Vol. 11, № 11. - P. 779-784.

182. Shu Z. Purification and characterization of a lipase from Aspergillus niger F044 / Z. Shu, J.-K. Yang, Y. Yan // Chinese Journal of Biotechnology. -2007.- Vol. 23, № 1. — P. 96-101.

183. Singh S. Fluorescence properties and conformation of human milk bile salt-activated lipase / S. Singh, D.M. Lee, C.S. Wang // International Journal of Biological Macromolecules. 1987. - Vol. 9, №> 5. - P. 294-296.

184. Snellman E.A. Purification and properties of the extracellular lipase, LipA, Acinetobacter sp. RAG-1 / E.A. Snellman, E.R. Sullivan, R.R. Colwell // European Journal of Biochemistry. 2002. - Vol. 269. - P. 5771-5779.

185. Standard review cold active microbial lipase: a versatile tool for industrial application / B. Joseph et al. // Biotechnology and molecular biology review. - Vol. 2, №2. -2004. - P. 39^8.

186. Staphylococcus haemolyticus lipase: biochemical properties, substrate specificity and gene cloning / B.-C. Oh et al. // FEMS Microbiology Letters. -1999.-Vol. 179, № 1.-P. 385-392.

187. Streptomyces rimosus GDS(L) lipase: production, heterologous overexpression and structure-stability relationship / D. Vujaklijal et al. // Food Technology and Biotechnology. 2003. - Vol. 41, №1. - P. 89-93.

188. Structural stability of lipase fromTwheat germ in alkaline pH / K.S. Rao et al. //Journal of Protein Chemistry. 1991. - Vol. 10, № 3. - P. 291-299.

189. Sugihara A. Purificationand characterization of a novel thermostable lipase from Bacillus sp. / A. Sugihara, T. Tani, Y. Taminaga // The Journal of Biochemistry. 1991. - Vol. 109. - P. 211-216.

190. Teo J.W.P. Cloning and characterization of a novel lipase from Vibrio harveyi strain AP6 / J.W.P. Teo, L. Zhang, C.L. Poh // Gene. 2003. - Vol. 312, № 17.-P. 181-188.

191. Termoalkalophilic lipase of Bacillus thermocatenulatus I: Molecular cloning, nucleotide sequence, production and some properties / C. Schmidt-Dannert et al. // Biochimica et Biophysica Acta. 1996. - Vol. 1301. - P. 105114.

192. The alpha/beta hydrolase fold / P. Ollis et al. // Protein Engineering. 1992. - Vol. 5, N3. - P. 197-211.

193. The crystal structure of lipase II from Rhizopus niveus at 2.2 Â resolution / M. Kohno et al. // The Journal of Biochemistry. 1996. - Vol. 120, №3. - P. 505-510.

194. The crystal structure of triacyclglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate / M. Noble et al. II FEBS 13020. 1993. - Vol. 331, №1-2. - P.123-128.

195. The cysteine residues of recombinant human gastric lipase / S. Canaan et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. - Vol. 257, №3.-P. 851-854.

196. The lipase /acyltransferasefrom Candida parapsilosis: Molecular cloning and characterization of purified recombinant enzymes / V. Neugnot et al. // European Journal of Biochemistry. 2002. - Vol. 269, № 6. - P. 1734-1745.

197. The primary structure of porcine colipase II. I. The amino acid sequence / M. Charles et al. // Biochimica et Biophysica Acta. 1974. - Vol. 359, №1. - P. 186-197.

198. The putative lipase AF 1763 from Archaeoglobus fulgidus is a carboxylesterase with a very high pH optimum / M. Rusnak et al. // Biotechnology Letters. 2005. - Vol. 27, № 11. - P. 743-748.

199. The structure function relationship of the lipases from Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis / O. Misset et al. // Protein engineering. 1994. -Vol. 7.-P. 523-529.

200. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus strain A 30-1 (ATCC 53841) / Y. Wang et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1995. - Vol. 79. - P. 433^38.

201. Tombs M.P. Stability and inhibition of Aspergillus and Rhizopus lipases / M.P. Tombs, G.G. Blake // Biochimica et Biophysica Acta. 1982. - Vol. 700.-P. 81-89.

202. Toshijuki N. Purification and some properties of lipase from Pseudomonas fragi / N. Toshijuki // Agricultural and Biological Chemistry. -1987. Vol. 51, № 1. -P. 181-186.

203. Tsujisaka Y. Purification, crystallization and some properties of lipase from Geotrichumcandidum link I Y. Tsujisaka; M. Iwai, Y. Tominasa // Agricultural and Biological Chemistry. 1973. - Vol. 37. - P. 1457-1464.

204. Two lipases from Candida antarctica: cloning and expression in Aspergillus oryzae /1. Hoegh et al. // Canadian Journal of Botany. 1995. - Vol. 73.-P. 869-875.

205. Vakhlu J. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning / J. Vakhlu, A. Kour // Electronic Journal of Biotechnology. -2006. Vol. 9, №1. - http://www.ejbiotechnology.info/content/vol9/issuel/full/9/.

206. Vasileva-Tonkova E. Hydrolytic enzymes and surfactants of bacterial isolates from lubricant-contaminated wastewater / E. Vasileva-Tonkova, D. Galabova // Zeitschrift fur Naturforschung. 2003. - Vol. 58, №1-2. - P. 87-92.

207. Veeragavan K. Detection and partial purification of two cases from Candida rugosa / K. Veeragavan, B. F. Gibbs // Biotechnology Letters. 1989. -Vol. 11.-P. 345-348.

208. Veeraragavan K. Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum / K. Veeraragavan, T. Colpitis, B.F. Gibbs / Biochimica et Biophysica Acta. 1990. - Vol. 1, №. 1. - P. 26-33.

209. Zhou, Q.Z. Immobilization of ß-galctosidase on graphite surface by glutaraldehyde / Zhou, Q. Z. K. Chen, X.D. // Journal of Food Engineering. -2001.-Vol. 48.-P. 69-74.

210. Zhu S. Immobilization of Candida rugosa lipase on a pH-sensitive support for enantioselective hydrolysis of ketoprofen ester / S. Zhu, Y. Wu, Z. Yu // Journal of Biotechnology. -2005. Vol. 116, № 4. - P. 397-401.

Информация о работе

Беленова, Алёна Сергеевна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы