Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липазы микромицетов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липазы микромицетов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

На правах рукописи

УДК 577.153.2

ДИЁРОЕ ЖАМИЛ ХУРРАМОВИЧ

ЛИПАЗЫ МИКРОМИЦЕТОВ

(03.00.04 биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущине - 1994

<л

Работа выполнена в Институте биохимии, и физиологии микроорганизмов РАН и в Институте микробиологии АН РУз.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Б.М.Степанов

доктор биологически наук, профессор А.С.Тихомирова

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.Баха, РАН

4

Защита диссертации состоится ".^¿Гу>А-19Э4 г. в 14 час

30 мин на заседании-специализированного совета Д.00.2.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущина, Московской области, 142292.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

доктор биологических наук

А.Г.Козловский

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

В М.Вагабов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большой интерес, проявляемый к липо-литическим ферментам, играющим важную роль в процессах жизнедеятельности всех организмов, связан как с фундаментальными аспектами, так и с высокой потребностью многих областей промышленности и медицины в ферментных препаратах жпаз.

Поскольку липиды являются одним из важнейших компонентов лшопротеидных и лштополисахаридшх комплексов, входящих в состав биомембран, клеточных стенок и многих других ультраструктурных составляющих живых клеток, реакции с участием липаз часто играют ключевую роль во многих внутриклеточных процессах.

Быстрое развитие новых биотехйологий с использованием липаз связано с их широким применением в пищевой, кожевенной, парфюмерной, хлебо-пекарной, клее-желагиновой, текстильной промышленнос-тях, производстве моющих средств, очистке сточных вод и др.

Для изучения механизма катализа с участием липаз, а также при организации различных биотехнологических производств, чрезвычайно важно иметь высокоочищекные препараты липаз с определенной специфичностью. Для решения этих проблем актуальными являются исследования по выделению и конструировании высокоактивных продуцентов липаз, повышению выхода продуктов воздействием на механизмы естественной секреции, отработке методов и схем очистки ферментов до гомогенного состояния, разделению множественных форм фермента и изучению их биогенеза, путей секреции, локализации в клетках и специфичности действия. Успехи в получении высокоочищенных ферментных препаратов в значительной степени связаны с разработкой и внедрением в биотехнологическую практику высокоэффективных методов аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах. В отличие от обычных методов выделения и очистки ферментов, основанных на различиях в молекулярной массе, заряде и др., в аффинной хроматографии используется уникальная способность биокатализаторов специфически и обратимо взаимодействовать с некоторыми' соединениями: субстратами, ингибиторами, коферментами и т.д. Это позволяет устранить многостэдийность и трудоемкость, увеличить выход очищенного фермента.

Важность биохимических и физико-химических исследований липолитических ферментов связана также с особым типом катализируемых ими реакций. Липазы, являясь водорастворимыми белками, катализируют гидролиз или этерификацгао нерастворимых в воде субстратов, функционируя на границе раздела липид-вода.

Вследствие сложности физических условий протекания липолизэ наши знания особенностей регуляции этих реакций существенно отстают от тех. которые известны для гомогенного катализа. Именно эти особенности лиголитических Зерментов вызывают большой интерес в плане их иммобилизации на нерастворимых носителях.

В последние годы большое внимание уделяется изучению липаз мицелиальных грибов, что связано в первую очередь с их ценными и уникальными свойствами при проведении многих реакций. Так, например, из трех липолитических ферментов, у которых на сегодняшний день полностью изучена структура, включая кристаллографический анализ трехмерной структуры методом х-лучевой даффракции, два являются липазами, выделенными из мицелиальных грибов ОеоггусЬш саМШит к КМготисог ш1ес1ге1.

В настоящее время выделены и сконструированы высокопродуктивные грибгые штаммы. Интенсивно проводятся микробиологические, генетические, молекулярно - биологические, биохимические и физико-химические исследования липаз микроорганизмов. Следует, однако, отметить, что до сих. пор мало уделяется внимания вопросам механизмов биосинтеза и секреции липаз, а также их локализации в клетках мицелиальных грибов.

Все сказанное свидетельствует сб актуальности, научной и практической значимости исследования липаз мицелиальных грибов.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлось получение высокоактивных продуцентов липаз и изучение особенностей биосинтеза и секреции этих ферментов, а также разработка высокоэффективных способов их выделения и очистки, изучение физико-химических и каталитических -евейсзал1_щдаетеш1е в биотехнологии. В задачи эхсп5ршёнталшых--Я€^^

1) Получение высокоактивных продуцентов липаз1^рйбов; ---—

2) Изучение особенностей регуляции их биосинтеза;

3) Разработка новых высокоэффективных биоспецифических сорбентов для гидрофобной хроматографии и выделение с их помощью высокоочшцешшх препаратов липаз;

4) Всестороннее изучение физико-химических и каталитических свойств выделенных липаз;

5) Изучение природы множественных молекулярных форм липаз, их свойств и динамики их накопления у разных штаммов грибов;

6) Яолучение иммобилизованных препаратов липаз с помощью

разработанных новых биоспецифических сорбентов и изучение особенностей: их ферментативного катализа;

?) Локализация множественных молекулярных форм липаз в клетках . грибов;

8) Изучение закономерностей терминальной стадии секреции липаз у грибов;

9) Решение ряда вопросов, связанных с разработкой липазных препаратов, в том числе иммобилизовашшх, для биотехнологических целей.

Научная новизна.

- Выделены высокоактивные штаммы гриба ганиориз тЗ-Сгоэрогаз - продуценты липаз и оптимизированы условия биосинтеза ими этого фермента. Изучена динамика накопления вне- и внутриклеточных форм липаз в лроизссе роста культур.

- Из разных штаммов выделены и очицеш до гомогенного состояния препараты липаз с помощь» вновь разработанных биоспецифических гидрофобных сорбентов. Изучены физико-химические, каталитические и иммунологические свойства множественных молекулярных форм липаз из разных штаммов грибов.

- Разработаны новые биоспецифические сорбенты для эффективной иммобилизации липаз, повышающие их стабильность в отношении температуры, рН и вызывающие изменение позиционной специфичности, приводящее к появлению у них стереоспецифичности.

- Установлены особенности терминальной стадии секреции липаз у исследованных мицелиальных грибов и изучена локализация множественных молекулярных форм этого фермента в клетках. Показана векторная направленность секреции липаз микромицетами в апикальную область гиф.

- Впервые в клеточных оболочках микромицетов, относящихся к низшим эукариотам, обнаружены специализированные структуры ("каналы"), участвующие в экспорте липаз во внешнюю среду.

- Полученные результаты является физиолого-биохимической основой для эффективного использования растворимых и иммобилизованных препаратов липаз микромицетов для решения ряда практических задач (осветления и хранения соков, в кожевенном, меховом производстве при переэтерификации жиров и масложировой промышленности).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Путем искусственной селекции исходный штамм №. Шсгойрогиз УзЛТ-1 разделен на два новых, морфологически различающихся,

штамма - УзЛТ-5С и УзЛТ-4В, с повышенной липолитической активностью. В ходе длительного последующего анализа морфологических признаков и биохимической активности вновь выделенных штаммов получено подтверждение их генетической стабильности.

2. На основа микрокристаллической и аминоэтилцеллюлозы, путем химической модификаций, синтезированы Сиоспецифические сорбенты для гщцюфобяой хроматографии, с помощью которых проведено одноэтапное разделение липаз из пяти штаммов мицвлиальгах грибов.

3. При иммобилизации растворимых липаз на биоспецифических сорбентах: "липосорб-4'\ "липосорб-8" и "лшосорб-16", расширяется область оптимального значения рН и температуры, а также значительно повышается стабильность иммобилизованных липаз, не снижающих активности при многократном использовании.

Среда использованных сорбентов наиболее эффективным является "лшгасорб-16" {аюшоэтащеллюлозз с пальмитиновым остатком).

4. У иммобилизованных липаз Ей. тЮговротз изменяется позиционная специфичность. В отличие от растворимых липаз, у которых с одинаковой скоростью гидролизуются триглицерида в I и 3 положениях иммобилизованные липазы преимущественно катализируют отщепление жирных кислот в положении I. Образующиеся в результате реакции 2,3-диглицерида обладают свойствами стереоизомеров. В результате конфэрмационных изменений, после иммобилизации, у липаз этого гриба появляется свойство стереоспецифичности.

5. Множественные формы липэз кавдого штамма различаются по молекулярной массе, другим физико-химическим свойствам, особенностям катализа и по субстратной специфичности. Поскольку различные молекулярные формы липаз из трех исследуемых штаммов НМгориз

___т1сгоБрогиз, сходные по молекулярным массам близки и по другим cвoШтвffl^lpeж0лaEaaт£ЯJ^aжчиe у них генетического родства.

6. Содержание отдельных форГ~внёюшточшх—липаз___изменяется в динамике роста микромицетов. В середине экспонешдаальной~$азьгу трех исследуемых штаммов Ей. Щсгозрогиз в среду выделяется одна форма - 66 кДа (у штамма УзДГ-БС, а у штаммов УзЛТ-1 и УзЛТ-4В - 69 кДа), а к началу стационарной фазы и все другие секретируемые формы.

7. Методом иммуноцитохимического анализа вперьые выявлены в области клеточных стенок специализированные структуры -"каналы", участвующие в секреции липаз в окружающую среду. Установлено, что одной из молекулярных форм, экспортируемых через "каналы'

является форма А. 8. Секреция липаз у мицелиальных грибов имеет векторную направленность в сторону растущего кончика гиф. Большая часть фермента концентрируется в апикальной части (а, ß - зонах) периплазматического пространства. Среда множественных форм липазы, обнаруживаемых в периплазме, выявляются Б, В и Д-формы. Форш Б и В по-видимому содержатся е клеточных стенках и увлекаются в окружающую среду с потоком постоянно обновляющихся полимеров клеточной стенки в ß-зонах апикальной части гиф.

Практическая ценность работы-.

Разработаны регламенты получения технических и иммобилизованных препаратов липаз- "лшомикроспорина" и "лжхолактина". Б производственных условиях получены их опытные образцы. Разработан способ получения жирных кислот и глицерина из растительных масел. Препараты использованы для осветления и хранения соков, в кожевенном, меховом и шелко-могэльном производстве, при переэтерификации жиров, и на других предприятиях масложировой промышленности. Синтезирование нами гидрофобные сорбенты лшюсорб-4, лнпосорб-8 и липосорб-16 используются в различных лабораториях для очистки и иммобилизации липаз.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II, III и IV конференциях биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Бишкек, 1976; Душанбе, 1981; Амгабат, 1985); на II Всесоюзном совещании по ферментам микроорганизмов (Минск,1978), на II и III республиканских научно-теоретических конференциях молодых ученых- микробиологов (Ташкент, 1978, 1983), на IV Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), на I региональном совещании по химическим реактивам республик Средней Азии и Казахстана (Душанбе,1986), на IV Всесоюзной конференции по ферментам микроорганизмов (Ташкент, 1988), на Международном конгрессе бактериологов и микологов (Осака, Япония, 1990), на Российской конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, получено I авторское свидетельство.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 415 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалоз и методов,

а также изложение результатов и их обсуждения, заключения, поводов. списка цитируемой литературы и приложения. Диссертация включает 49 таблиц и 75 рисунков. Список литературы содержит 436 ис-■точника, в том числе 371 иностранных авторов.

Список использованных в тексте сокращений: ЖК-жирные кислоты; ДГ-даглицерид; МГ-моноглицерид; ТГ-триглицерид; ВКЛ-внутриклеточные липазы; НКЛ-внеклеточше липазы; ПП-переплаз-матическое пространство; КС-клеточная стенка; ЦПМ-цитоплазмати-ческая мембрана; МФЛ-множественше форма липаз; ИМЛ-иммобилизоиан-ше липазы; КО-клеточная оболочка; ЭДТА-этилендиаминтетрауксусная кислота, ТСХ-тонкослойная хроматография; ЛААГ-полиакриламидшй .■•ель; Ш-Иа-додецилсульфат натрия.

Благодарности. Автор выражает особую благодарность научному консультанту д.б.н., чл. корр. РАН, профессору И.С.Кулаеву за постоянное внимание к работе, а также д.О.н., профессору К.Д.Даврано-ву и к.б.н. А.Б.Циоменко за ценные советы и постоянную поддержку проводимых исследований.

Искреннюю благодарность автор выражает коллегам, принимавшим участи" ч выполнении различных этапов этой работы: к.б.н. И.Г.Султановой, к.б.н. М.З.Ззкирову, к.б.н. К.А.Лусте, д.х.н. А.Б.Паулю-конису, к.б.н. А.А.Дикчювене, М.И.Ризаевой, к.б.н.М.Я.Табак, к.б.н. А.Саттарову.

СОДЕРМНИЕ РАБОТЫ

Главы 1-3. Обзор литературы.

-—_^1_главе_I рассматриваются вопросы общей характеристики и механизма дёйстшя^шпояитичесшс^^&ерментов, их распространения и свойства липаз разных групп 1трооргангошв~Тч5актерй1^щ20№ грибов, биосинтеза этих ферментов и его регуляции, природа множественных молекулярных форм липаз и сравнительного изучения их свойств.

В главе 2 рассматривается состояние вопроса о секреции ферментов, локализации липаз в клетках низших эукариот и особенностях терминальной стадии секреции у этих организмов.

Глава 3 посвящена также применению биоспецифической гидрофобной хроматографии для выделения и очистки липаз.

Глава 4. Материалы и методы.

Приводятся методические подробности проведения экспериментов: условий культивирования липолитически активных штаммов, выделения и очистки липаз, их исследования методами белковой химии, биохимическими и иммунологическими методами. Описаны методические приемы локализации этих ферментов методами электронно -иммуноцитохимичес-кого анализа и субклеточного фракционирования. Более подробно описаны разработанные нами синтез биоспецифических сорбентов для гидрофобной хроматографии и иммобилизации липаз.

Глава 5. Селекция липолитически активных штаммов и биосинтез липзз грибов рода ЛМгориБ.

При селективном выделении новых активных штаммов микроорганизмов используется явление естественного или спонтанного мутационного процесса.

С помощью пересевов исходной культуры гриба КМгориз пйсгоэро-гиэ УзЛТ-1 четыре года хранившейся в высушенном состоянии были получены морфологически различные колонии : "серые", отличающиеся многочисленными спорами и серой окраской спорэнгионосцев и "белые" - имеющие небольшое количество спор и бежевую окраску указанных органов. Показано, что "белые" варианты образуют более активные липазы, однако, количество биомассы у "серых" вариантов больше.

Исследование генетической стабильности "белых" и "серых" штаммов по морфологическим признакам и биохимической активности показало, что эти признаки воспроизводятся в течение десяти генераций.

Таким образом, в результате этих исследований из исходного вида №. т^-сгогрогиз УзЯТ-1 путем селекции были выделены два новых морфологически различающихся устойчивых штамма : УзЛТ-4В ("белый") и УзЛТ-50 ("серый").

При изучении влияния дгоидных субстратов на биосинтез липаз у выделенных активных штаммов - продуцентов наиболее высокая ллполитическая активность проявляется на средах, содержащих оливковое и хлопковое масла в концентрации 0,5%, подсолнечное масло- 0,7$, а также бараний кир- 0,1$. При добавлении в среду других липидов : сливового, касторового, соевого масел, свиного и говяжьего жиров отмечали хороший рост, однако липолитическая активность была значительно ниже.

На основании полученных результатов очевидно, что для штаммов гриба кь. пасговрогиз УзЛТ-4В и УзЛТ-5С специфическими индукторами синтеза липазы являются олеиновая кислота, а также олив-

ковое, хлопковое и подсолнечное масла, содержащие значительные количества этой кислоты.

Добавление в питательную среду минеральных источников азота различно влияет на синтез липазы у изученных штаммов грибов. В значительной степени это зависит от их концентрации. Так, при внесении нитратов На и к в количестве 0,1й по азоту липолитическая -живность была на уровне контроля. Увеличение их концентрации уг-■ .стало рост и снижало синтез липаз. Наиболее интенсивный синтез .¡тих ферментов отмечен на средах с аммонийными солями фосфорной -iслоты.

Внесение различных источников органического азота обеспечивало лучшее развитие гриба по сравнению с контролем. Наибольшая лилолирическая активность отмечена при культивировании грибов в средах с дрожжевым автолизатом и кормовыми дрожжами. Стимулирующее влияние дрожжевого эатолизата и кормовых дрожжей, по-видимому, можно объяснить тем, что при их добавлении в среду создается наиболее благоприятный комплекс биологически активных веществ (аминокислот, зитаминов к других соединений), которые необходимы для синтеза липазы грибом.

Минеральные соли различно действуют на биосинтез липаз этими грибами. Гак, добавление Nací (0,01-0,1%) повышало липолитическук активность на 25-30%. !íaIl2F04 в концентрации 0,01-0,5% и КС] (0,1%) повышали синтез липаз на В больших же концентрацию они снижали эту активность. Добавление 0,01$ гаэз, 0,5% КН2Р(м г 0.1% Na2HP04 незначительно повышало активность. При увеличенш концентрации этих солей липолитическая активность снижалась.

В ходе изучения влияния ионов металлов на биосинтезлилаз быж установлено, что в основном все они, кроме zn2+ и Сиг+ при повыше-1Ш~их-1»нцщцщцшоказывали подавляющее воздействие. При внесении в среду Zn2+ в концШрзцйях--Зх1й^^Зх10®М липолитическая активность увеличивалась на 100-130%. Наиботашйё^Щце1Гфацщ)1_ионо; cu2\ Мо6+, ní£+, Рег+, Ре3+ стимулировали активность на 40-50 % Добавление Mn2+, Cd2<\ Сог+, ыг+незначи?ельно повышало актив ность, а Ва2+, Al3t, Cs2+ не оказывали существенного влияния. По вышение выхода биомассы отмечалось только при добавлении ионо Zn2+, Все другие ионы не влияли на рост.

Было проведено сравнительное исследование биосинтеза липаз процессе роста трех исследуемых штаммов гриба Sh.microsporus. По казано, что у каждого штамма имеются свои особенности динамик накопления вне- и внутриклеточных липаз, однако общие закономер ности этих процессов сходны у всех штаммов (рис.1). 8

Рис Л.Изменение лилазной активности в процессе роста культуры гриба Ш1.т1егоБрогиэ. а-штамм УзЛТ-4В, б-штамм УзЛТ-5С. 1-активность фильтрата хультуралыгой жидкости; 2-активность гомогената мицелия; 3-вес сухого мицелия.

Таким образом, установлено, что у выделенных путем естественной селекции двух новых штаммов Шк писгоэрогш УзЛТ-4В и УяЛГ-БС липазы являются индуцируемыми ферментами и их биосинтез осуществляется только в присутствии лигшдша субстратов. Наиболее эффективным индуктором для штамма УзЛТ-4В является оливковое масло, а для штамма УзЛТ-5С - хлопковое. Из источников азота наиболее активным стимулятором у обоих штаммов является дрожжевой автолизат, а из неорганических источников азота - Ш4)зР04. Из ионов металлов наиболее активным стимулятором липолитической активности является гпг+, имеющий по-видимому существенное значение для биосинтеза липаз у этих грибов. Установлены особенности накопления вне- и внутриклеточных липаз у исходного штамма и двух вновь выделенных : УзЛГ-4В и УзЛТ-5С.

Глава 6. Выделение и очистка липаз микромицетов.

Для изучения физико-химических и каталитических свойств вне- и внутриклеточных липаз, установления механизмов возникновения различных молекулярных форм и аутей их секреции необходимо, в первую очередь, выделить и получить высокоочщенные гомогенные препараты этих ферментов. Хотя принципы выделения и очистки для большинства ферментов являются сходными, тем не менее в случае липолитических ферментов существуют свои особенности.

Таблица I. Очистка внутриклеточной липазы (ВКЛ) ел. microsporus УзЛТ-1,

Стадии очистки Белок, мг Активность липазы^ общая, Тудельная ед. ! ед/мг Выход, % Степень очистки раз

Гомогенат мицелия 16647 75000 4,50 100 I

Осаждение ацетоном 2642,5 68775 26 91,7 5,78

Хроматография на ДЭАЭ-целлмозе ВКЛ-А ВКЛ-Б ВКЛ-В ВКЛ-Г ВКЛ-Д 140 1,5 220 2,3 25 29005 Z5600 425 800 207,1 206,6 116,3 184,7 32 38,6 0,41 34,1 0,56 1,06 46 45,9 25,8 41 7.1

Хроматогафия на ДЭАЭ-сефадексе А-50 33860 45,1

ВКЛ-А 36,5 18860 516,7 25,1 114,8

ВЮ1-В 40,0 15000 375 20,0 83,3

Хроматография на БЕ-сефадексе С-50 ВКЛ-А 15,0 13530 902 18,04 200,4

Гельфильтрация с-150 ВКЛ-А 5,2 8300 1692,3 11,73 376

Гельфильтрация й-юо 3,0 5453 1817,7 7,25 404

Хроматография на ЗЕ-сефадексе С-50 ВКЛ-В 23,0 II950 519,5 15,93 115,4

Гельфильтрация б-юо ВЙ-В 12,0 8360 696,7 11,14 154,8

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 3,2 4300 1343,7 5,78 29i' . ->

Гельфильтрация с-75 ВКЛ-В

2,0 3025 1512,5 Ч > vJ J

При очистке липаз нами были использованы известные метода, включая осаждение органическими растворителями, фракционирование сульфатом аммония, ионообменная хроматография и гельфильтращш. При этом для каждого из исследуемых нами микромицетов : Oospora laetis, Eh. microsporus УзЛТ-I, УзЛТ-4В и УзЛТ-5С была разработана своя схема выделения и очистки липаз. Пример одного из таких

исследований приведен в таблице I.

Традиционные схемы получения шсокоочищенннх препаратов липаз позволяют получить гомогенные формы фермента, но они многостадийны трудоемки, требуют много времени (15-20 суток) и выход фермента невысок (около 16й). Поэтому целью наших дальнейших исследований была разработка более эффективного способа очистки этих ферментов. Одним из наиболее перспективных методов, применяемых с этой целью является хроматография на сорбентах содержащих гидрофобные остатки.

6.1. Синтез сорбента для гидрофобной хроматографии и

Для очисгки липолитических ферментов нами были синтезирована биоспецифические сорбенты на основе микрокристаллической целлюлозы и АЭ-целлюлозы. Для связывания носителя и лиганда в качестве "вставки" был использован 2,4-толуолдиизоццаат. На первой стадии реакции 2,4-толуолдиизоцианат частично реагирует как бифункциональный реагент с сохранением свободной изоцианатной группы. Далее к этой группе присоединяются вещества, содержащие алифатическую цепочку различной длины : н-бутанол, н-октанол и пальмитиновую кислоту.

С целью получения носителя, содержащего отрицательно заряженные группы, способствующие удалению продуктов гидролиза липи-дов, в отдельных экспериментах использована эквимолярная смесь пальмитиновой и себациновой кислот. Максимальная сорбционная емкость такого носителя достигает 1060 Е на I г сорбента.

Схематическая структура сорбента может быть представлена на рисунке 2.

иммобилизации липаз

сн.

'3

+ Л

'8 16

Рис.2.Синтез гидрофобного сорбента.

Синтезированный сорбент достаточно устойчив в щелочной, нейтральной и слабокислой средах. Срок хранения полученного сорбента в 0,01 М фосфатном буфзре, pH 8,0 - 6 месяцев, а в сухом состоянии -.не ограничен.

6.2. Гидрофобная хроматография грибных липаз.

Синтезированный гидрофобный сорбент был использован для очистки вне- и внутриклеточных липаз грибов Eh. microsporus, штаммов УзЛТ-I, УзЛТ-4В, УзЛТ-5С и Oospora lactis. Для хроматографи-ческой очистки этих липаз колонку, заполненную 10 г сорбента, уравновешивали 0,01 М фосфатным буфером, pH 8,0 и наносили 50 мл раствора липазы при концентрации белка 30 мг/мл. Хроматографию осуществляли при +4°С, используя колонку размером 15 х 350 мм. Скорость элюции - 25 мл/час. Фракции собирали по 5 мл.

Балластные белки вымывали 0,01 М фосфатным буфером, а липаз-ную активность - линейным градиентом концентрации диоксана (0-20$) в этом же буфере. При этом липазная активность Rh.microsporus УзЛТ-5С элюируется пятью, а у штамма УзЛТ-4В четерьмя пиками. Выход по активности составляет 91 - 93%. Полученные результаты представлены в таблицах 2 и 3 и на рис.3.

Для дальнейшей очистки всех форм липаз из грибов Khizopus microsporus УзЛТ-4В и УзЛТ-5С использовали гельфильтрацкю на сефа-дексе G-100 и ионообменную хроматографию с использованием колонки Моно Q в системе FPLC (Pharmacia). Результаты представлены в таблице 3. Гомогенность полученных фракций липаз, выделенных из грибов №. microsporus УзЛТ-4В и УзЛГ~5С была показана с помощью электрофореза в DS-Na ШАГ (рис.Зд, Зе).

Полученные данные свидетельствуют о том, что синтезированный ттвгж-сербенЕ-ждат_бшъ_суспехом использован для очистки и разделения липаз из разл!гшых1шфоортшшв-;________

Следует отметить, что очистка липаз методом гидрофобной хроматографии значительно эффективнее, чем обычные методы. Метод одностадийный, высоко производителен и может быть использован в больших масштабах для получения высокоочщенных липаз из других биологических объектов и для разделения различных форм липаз.

акт.10 ед/мл 100

О 10 20 30 40 50 00 70 80 90 10< N ФРАКЦИИ

О 10 20 30 40 50 60 70

N ФРАКЦИИ

акт 10 ед/мл

№ г-1 /в

О 10 20 30 40 50 60 70 80 N ФРАНЦИИ

О

акт, 10 ед/мл 100

О 10 20 30 40 50 60 70

N ФРАКЦИИ

кБа

94.5 67

43

30

20.1 14.4

МЗа

94.5

67

1 2 3 4 5

43

30

20.1 14.4

Рис.3.Гидрофобная хроматография липаз ЮыШсгозрогиБ на колонке с модифицированной целлюлозой. а-ВКЯ, б-НКЛ штамма УзЛТ-5С; А,Б,В,Г,Д-формы липазы. в-ВКЛ, г-НИ штамма УЗЛТ-4В; А,Б,В, Г-формы липазы. 1-А280; 2-градиенг 0-20% диоксана. д-электрофорез очищенных препаратов липаз штамм УзЛТ-5С в 10% ПМГ ББ-На. 1-маркерные белки; 2-форма А; 3-форма Б; 4-Форма В; 5-форма Г; 6-форма-Л. е-электрофорез очищенных препаратов липаз штамм УзЛТ-4В в 10% ПААГ св-эта. 1-маркерные белки; 2-форма А; 3-форма Б; 4-форма В; 5-форма Г.

Таблица 2. Очистка липаз Rh.microsporus УзЛТ~4В с использованием гидрофобного сорбента.

IАктивность липазы!I Степень Белок, общая,"Тудёльная ¡Выход, j очистки, мг ! ед ! йл/мг ! 9í

Степень очистки

раз

Внеклеточная липаза

Фильтрат культу-

ральной жидкости 9500 528000 55,58 100 I

Гидрофобная хро-

матография НЮР-А НКЛ-Б 19,38 8,3 475695 281188,6 194506,4 14509,2 23434,5 90,0 53,2 36,8 261 421,6

Гельфильтирацкя

на сефадексе G-100

НКЛ-А НКЛ-Б 12,2 7,15 279750 182345,2 22930,3 25502,8 52,98 34,53 412,5 458,85

Внутриклеточная липаза

Гомогенат мицелия Гидрофобная хроматография 10275 212500 Т93800 20,68 100 91,2 I

БКЛ-А 8 15067 1883,4 7,09 91,07

ВКЛ-Б 23 66200 2878,3 31,15 139,2

ВКЛ-В 30,5 96396 3160,5 43,95 152,8

ВКЛ-Г 10 I6I37 1613,7 7,59 78

Гельфильтрация о-юо

ВКЛ-А 5 12200 2440 5,7 118

" БЮ№- -- — 59345 3575 28 172,8

вкя-в __42^5____ 206,3

вкл-г 6,5 14072 2165 бТб L\J*i у <

Ионообменная хрнфия на Моно ВКЛ-Б 5,2 Q 46305 8904,8 21,8 430,6

ВКЛ-В 12 71067 5922,2 33,4 286,4

Таблица 3. Очистка липаз т.пасгозрогиз УзЛТ-5С с использовашем гидрофобного сорбента.

Стадия очистки ¡Белок, Активность, Уделная Степень Выход,

мг ед актив, ед/мг очистки %

Внеклеточная липаза

Фильтрат культуральной жидкости Гидрофобная хр-я 12700 655400 414955,5 51,60 I 100 89,66

А пик Б пик 16 9 182400 53105 11400 5789 221 112,2 27,8 7,95

В пик 26 365235 14047,5 272,2 55,7

Гельфильтирация оо

А пик 10,2 150500 14754,9 286 23

Б пик 6 48235 8039,1 155,8 7,36

В пик 14 294508 2X036,2 407,6 45

Внутриклеточная липаза

Гомогенат мицелия 17025 462690 27,17 I 100

Гидрофобная хр-я 414955,5 89,68

А пик 12,2 23665,2 1939,8 71,4 5,11

Б пик 10,4 20120 1934,6 71,2 4,34

В пик 25 94533,4 3781,3 139,1 20,43

Г пик 50,2 169351 3373,5 124,1 54,9

Д пик 35 107286 3065,3 112,8 34,8

Гельфильтрация С-ЮО

А пик 7 20132,5 2876 105,8 4,35

Б пик 5,5 16375,1 2977,3 109,6 3,54

В пик 18,7 78448,3 4195 154,4 16,95

Г пик 40,3 160210 3975,4 146,3 34,6

Д пик 22,5 96650 4295,5 158,0 20,9

Ионообменная хр-я на Мопо О

А пик 2,3 1544,3 6713,1 247 3,34

Б пик 1,3 10231,5 7870 289,6 2,2

В пик 5,8 69634 12005 441,87 15,05

Г пик 14,2 136350 9602,1 353,4 29,47

Д пик 8,3 81397 9806,8 360,9 17,6

Глава 7. Свойства липаз микромицетов.

Сравнение физико-химических и каталитических свойств очищенных до гомогенного состояния липаз из грибов двух различных таксономических групп: Oospora lactis и Rh. microspores свидетельствует oö их существенных различиях. Показано, что эти отличия касаются аминокислотного состава, содержания углеводных компонентов, оптимумов температуры и pH, субстратной и позиционной специфичности. Наибольшее внимание было уделено сравнительному изучению свойств множественных молекулярных форм трех различных штаммов гриба Rh. microsporus.

Микрогетерогенность МФЛ у каждого из изучаемых штаммов этого гриба определяет необходимость отдельного изучения свойств каждой из множественных молекулярных форм этого фермента, существенно варьирующих не только у разных видов и штаммов , но и в пределах одного грибного штамма (Табл.4). Бее МФЛ всех трех штаммов грибов обладают идентичным качественным составом аминокислот, но различаются по количеству аминокислотных остатков. N-концевой аминокислотой всех форм липаз у всех штаммов является лейцин, а С-концевой - глицин. При изучении N-концевых аминокислотных последовательностей было установлено, что у разных молекулярных форм в пределах одного штамма они также идентичны. Исключение составляет вне- и внутриклеточная ф>рма А штамма УзЛТ-5С. У всех этих форм N- концевой последовательностью является : Leu-Val-Met-Iys-Gln-Arg..., а у формы А : leu-Val-Met-lle-Gin-Arg...МФЛ из разных штаммов, сводные по молекулярной массе, довольно близко совпадают друг с другом и по другим физико-химическим свойствам (табл.4). Определенные корреляции между ниш обнаруживаются также и по количественному содержанию аминокислот.

ТрПЩчении-квталитин!Ш5ИХ__свойств липаз отмечены следующие особенности. Оптимумы pH и тешературГТ1М~ИЗ—pasMi^-m^MMOg-j^ microspores, сходных по Mr близки по своим значениям, а некоторые полностью совпадают (табл.4). Среди них можно отметить : ВКЛ-Г, ЕКЛ-Б (УзЛГ-4В) и НКЛ-Б, ВКЛ-Б (УзЛГ-бС), а также НКЛ-А, ВКЛ-В (УзЛТ-4В) и ВКЛ-Д (УзЛТ-5С). МФЛ каждого штамма различались по термостабильности и pH - стабильности (рис.4). Так, например, у штамма УзЛТ-1 ВКЛ-I более чувствительна к воздействию тепла, чем ВКЛ-2. Еа термостабильность липээ влияет также pH среда. Гак, стабильность ВКЛ-2 падает по мере снижения pH, a BKJI-I напротив, более чувствительна к тепловому воздействию именно при низких

Таблица 4. Характеристики множественных форм липаз разных штаммов гриба Rh. microsporus.

штамм УзЛТ-1

нкл-3 вкл-5 ЕИ-2 нкл-2 ВКЛ-4 ЕКЛ-1 нкл-Х вкл-3

Молекулярная масса, кДа 28 38 43 " 65'"" 69

Количество аминокислотных остатков 194 285 290 492 494

Электрофоретическая подвижность, (иг) 0,77 0,57 0,52 0,47 0,45

Изозлектрическая точка, р1 содержание бежэ,^ 88 5,2 92 85 8,5 95 90

Содержание полисахаридов 12 8 15 5 10

Оптимум температуры, °С 36 35 37 40 39

рН-оптимум 7,5 8,0 7,9 6,0 7,8

ВКЛ-А ш т а м ВКЛ-Б м УзЛТ-нкл-А вкл-В -4В вкл-Г нкл-Б

Молекулярная масса, кДа 2В 40 45 69

Количество аминокислотных 230 31Г 331 503

остатков

Электрофоре тиче екая

подвижность, (М) 0,73 0,52 0,48 0,40

Изозлектрическая точка, р1 5,8 6,7 3,6 5,2

Содержание белка, % 90 95 96 92

Содержание полисахаридов 10 5 4 8

Оптимум температуры, °С 40 38 40 37

рН-оптимум 7,5 8,0 7,5 6,0

штамм УЗЛТ-5С

БЮ1-Г

нкл-А вкл-А

нкл-Е ВКЛ-Д вкл-Б

нкл-вкл-

Молекулярная масса, кДа 25 32 43 '65 98

Количество аминокислотных остатков 171 240 324 503 704

Электрофоретическая подвижность, (Ей) 0,77 0,58 0,50 0,43 0,35

Изозлектрическая точка, р1 Содержание белка, % 6,2 95 4,4 93 5,3 87 8,4 95 3,8 90

Содержание полисахаридов 5 7 13. 5 10

Оптимум температуры, °С 37 40 40 37 40

рН-оптимум 8,0 7,8 7,5 6,0 8,5

Время, мин

Рис.4.Стабильность липаз Ш.пйсгозрогиа УзЛТ-5С. а.-термостзбиль-ность при 50°С; б.-рН стабильность; А,Б,В,Г,Д-формы липазы.

рН. НЫ-1 более термостабкльна, чем НКЛ-2 и НКЯ-З. При 45°С в течение 2 часов НКЛ-1 теряет лишь 27% активности, тогда как НКЛ-2 и НКЛ-З теряют 50 и 58% соответственно. У штамма УЗЛТ-4В формы "внемШтнх—лшнз-лщмлщтель^ рН среды, но НКЛ-Б более стабильна в кислой, а ВКЛ-А в щелочной срёдзхг^Зиутршиетошша^{е__ формы устойчивы в широкой области значений рН от 4,0 до 9,5. Термостабильность различных МФЛ у штамма УзЛТ-5С существенно различалась. У форм Б и В активности быстро падали с повышением температуры, тогда как у А, Г и Д они снижались значительно медленнее. РН-стабильности всех МФЛ этого штамма находятся в широкой области значений от 4,0 до 9,0 и незначительно отличаются между разными формами.

IgfSjo lg [S]o

Рис.5.Зависимость активности липаз Rh.microsporus от концентрации субстрата (оливковое масло), а-шгамм УзЛТ-5С; А,Б, В, Г, Д-форш липазы. б-штамм УзЛТ-4В; А,Б,В,Г- формы липазы.

Иош металлов являются активаторами или ингибиторами для многих ферментов. Степень влияния существенно зависит от концентрации. Так, например, иош Cu2 + , cd2+, Мпг+и К* при низких концентрациях не влияли на активность всех форм липаз из всех штаммов гриба Rh. microsporus , а при высоких (Ю_3-10"2М) тормозили реакции гидролиза. Соли Щг*, &пг* , Zn2+ являются ингибиторами. Все МФЛ всех штаммов гриба активировались солями Ca^í Mg2t, сог+. Предполагает.ся, что инактивация лшолиза осуществляется на уровне, образования фзрмент-субстратного комплекса. Справедливость этого предположения отчасти подтверждается снятием тормозящего эффекта с помощью ЭДТА.

При изучении влияния солей желчных кислот : холата и дезоксихолата Na на активность липаз было установлено, что первый действует как ингибитор всех МФЛ, а второй - как активатор.

Изучение зависимости скорости лшолиза от концентрации субстрата показало, что все формы липаз всех изучаемых штаммов ингибируются избытком субстрата (рис.5).. В результате обработки экспериментальных данных графическими методами • согласно кинетической схеме ингибирования субстратом получены кинетические параметры для липаз. Однако, значение эгих параметров существенно зависит от величины эмульгированных частиц.

При изучении влияния детергентов на активность различных форм липаз изучаемых штаммов показано, что Twecn 20 и 40, Triton. Х-100, Span 60 И 80, BriJ 30 и 35 и Mir^-52 являются ингибиторами липазной активности, Span-20 и Tween-60 активируют некоторые МФЛ, a Tween-85 не влияет на липолиз в любых концентрациях (табл.5).

Таблица 5. Влияние детергентов на активности липаз гриба Rhizopus microsporias УЗЛТ-4В И УзЛТ-5С.

Липазнэя активность, %

Детергенты Формы штамма УзЛТ-5С ] Формы штамма УзЛТ-4В

A j Б j В { Г j Д j A j Б j В j Г

Span - 20 114 100 130 140 120 110 135 95 105

- 40 93 92 95 107 95 100 180 90 90

- 60 60 40 72 85 45 98 76 70 89

- 80 48 35 65 20 30 25 20 32 40

Tween- 20 54 30 25 28 35 40 35 30 40

- 40 35 40 45 55 60 58 66 48 69

- 60 195 110 103 108 105 115 120 101 100

- 85 112 100 100 100 100 100 103 100 100

Mirj - 52 85 65 70 62 67 50 65 60 75

Brij - ЭО 43 53 50 45 40 35 45 65 50

- 35 40 45 35 25 28 15 20 35 30

Triton X-100 35 40 28 34 38 42 50 30 33

X-305 42 48 35 40 49 38 52 25 45

7.1. СшЩфичност1г--липаз^_______

При изучении субстратной специфичносга~^ШЖ0очщеашх_1ад___ было установлено, что наибольшая активность всех форм липаз проявлялась на трипальмитине и тримиристине, а также на говяжьем и свином жире (габл.5). То есть эти липазы специфичны к эфирам глицерина с высшими насыщенными жирными кислотами. МФЛ различаются по специфичности к ацильным радикалам. Так, формы А и Д штамма УзЛТ-5С и форма Г штамма УзЛТ-4В специфичны к короткоцепочечным триглицеридам, тогда как другие МФЛ лучше гидролизуют эфиры длинноцепочечных ЖК. Формы А и Б штамма УзЛТ-4В проявляют специфичность к насыщенным ацильным радикалам (табл.6).

Таблица 6. Скорости гидролиза различных триглицеридов, жиров и масел молекулярными формами липаз Rü. microsporus УЗЛТ-5С и УЗЛТ-4В.

Субстраты

Липазная активность, %

Форш штата УзМ-5С

Формы штамма УзЛТ-4В

м Б! • r I * ! А Б ! в ! Г

Трибутирин 142 105 70 96 180 65 55 85 176

Трипропионин Триацетин 105 60 80 20 35 5 45 78 107 45 50 30 30 10 38 75 117 44

Трилаурин 90 75 30 20 40 25 60 27 30

Трикапроин 65 34 20 27 19 18 23 20 15

Трипальмитин 108 140 170 III ПО 126 125 107 ИЗ

Тримиристин 187 112 132 95 97 95 106 85 99

*Триолеин 100 100 100 100 100 100 ТОО 100 100

Говяжий жир 102 140 130 97 110 115 128 98 107

Свиной жир 40 58 50 105 50 53 60 115 52

Бараний жир 65 80 72 58 72 83 85 56 65

Хлопковое масло 90 1Г2 108 85 90 80 90 70 95

Подсолнечное масло 88 108 127 90 85 75 ПО 80 10

Касторовое масло ПО 95 80 92 112 98 90 105 Ю

*0ливковое масло 100 100 100 100 100 100 100 100 10

Соевое масло 108 90 86 90 100 102 95 по II

Субстраты, используемые в качестве контролей.

При сравнительном исследовании позиционной специфичности липаз грибов двух различных таксономических rpymr.Kh.microsporus и Oospora lactis, по глубине и скорости гидролиза триглицеридов и с помощью анализа образующихся в результате продуктов методами ICX и газовой хроматографии было установлено существенное различие исследуемых липаз. Результаты анализа показывают, что основными продуктами гидролиза с использованием липаз из Oospora lactis являются глицерин и И, в то время , как в реакциях с участием всех

форм липаз из Шигориз писгозрогиБ продуктами липолиза являются ЯК, 1,2 ДГ и 2,3 ЛГ. МГ образуются лишь при длительной инкубации, а 1,3 ДГ за время реакции не был обнаружен. На основе полученных экспериментальных данных ш предполагаем следующий механизм действия изучаемых ферментов:

Липазы O.Lactia

-1,2 ДГЧ s

N^ Миграция Y

<2 ИГ Липазы Rh. microsporus * 1 Ш \ " г

,3 ДГ ЯК

Ж

Таким образом, липазы Oospora laotis не обладают специфичностью действия и относятся к смешанному а, ß типу, в то время как липазы Rhizopus microsporus специфичны по отношению к I и 3 положениям ТГ и их можно отнести к а типу.

При изучении иммунологических свойств различных МФЛ из двух штаммов Eh. microsporus было установлено, что полученные поликлонэльные антитела против формы HKJI-A (45 кДа) штамма УзЛТ-4В и НКЛ-Б (65 кДа) штамма УзЛГ-5С дают перекрестную реакцию со всеми другими формами липаз этих же штаммов. Иммунологическая близость всех МФЛ каждого изученного штамма дает основания предполагать существование генетических связей между отдельными формами.

Отмеченное сходство физико-химических и каталитических свойств МФЛ из разных штаммов гриба Rh. microsporus, совпадающих по молёкулярюй иэстач—может—свидетельствовать об их родственных генетических взаимосвязях. Наблюдаемые же несущественные—различия—___ по-видимому можно отнести за счет разницы в содержании и составе их небелковых, гликозидных частей.

Глава 8. Иммобилизованные липазы.

При выборе носителя и метода иммобилизации липаз исключается применение макропористых неорганических носителей, т.к. размеры эмульсий превышают размеры пор,, а инкапсулирование и заключение в гель приводят к непреодолимым диффузионным затруднениям. Поэтому наиболее адекватными являются адсорбционная иммобилизация и

ковалентное связывание.

Из использованных в качестве носителей ионитов было найдено, что на ДЭАЭ-целлюлозе адсорбируется большее количество белка и удельная активность ИМЛ выше, чем у других препаратов.

На сорбционное равновесие оказывает влияние ионная сила раствора, значение рН, температура и время контакта носителя и белка. Недостаток адсорбционной иммобилизации - низкая прочность связи носителя и фермента.

Для ковалентной иммобилизации были использованы различные сшивагадие агенты, однако при этом наблюдалось значительное снижение активности липаз. Особенно это было заметно при использовании глутарового альдегида.

Сродство липаз к водно - лшидной поверхности указывает на возможность использования гидрофобных взаимодействий. Этот метод иммобилизации оказался наиболее эффективным. Носители, содержащие гидрофобные остатки, были получены модификацией микрокристаллической и АЭ - целлюлозы 2,4- толуолдиизошанатом с последующим присоединением соединений с подвижным атомом водорода. Схематическая структура полученных носителей представлена на рисунке 2. Установлено, что наиболее эффективным для связывания липаз является использование АЭ-целлюлозы с остатками пальмитиновой кислоты в качестве лжганда (табл.7). Активность липаз, адсорбированных на частично замещенной АЭ-целлюлозе, больше, чем при применении незамещенной или полностью ацилированной АЭ-целлюлозы.

Таблица.7. Активности иммобилизованных липаз ЕЬ.гахсгоэрогид при различных соотношениях АЭ-целлвлозы и пальмитиновой кислоты.

Носитель Соотношение (моль) АЭ-целлюлоза-пальми-тиновая кислота ¡активность, ¡ед/r штамм ! УЗЛТ-4В 1 активность, ¡ед/г штамм ! УЗЛТ-5С

АЭ-целлюлоза не модифицирована 18,0 11,5

1:0,5 870 690

I : I 750 570

I : 5 710 550

ДЭАЭ-целлюлоза не модифицирована 10,2 12,4

Примечание: Исходное весовое соотношение препарат Зермент - носитель I : 20.

Нами был синтезирован также новый неорганический сорбент на основе силохрома и порохромз, активированный З-аминопропил-3-этоксисиланом и 2,4-толуолдаизоцианатом о последующей обработкой остатками жирных кислот с различной длиной ацильного радикала.

Рис.6.Зависимость активности липаз от pH среды у разных грибов а- O.laotis, б- Rh.microsporus УзЛТ-I, B-Rh.microsporus УзЛТ-4В, r-Rh.microsporus УзЛТ-5С. I-растворимый препарат; 2-иммобилизованный препарат.

При изучении каталитических свойств ИМЯ установлено, что оптимумы pH этих препаратов из Oospora lactis и Rh. microsporus несущественно отличаются от растворимых липаз, но у ИМЛ наблюдается расширение области оптимальных значений pH (рис.6). При этом, -раетворшае_4ермента_^н£штельно более чувствительны к изменению pH, чем ИМЛ. ТешературнйГоот^

штаммов находится в области 37-40°С, а у иммобилизованных он повышается до 45-50°. Иммобилизованные липазы, в отличие от растворимых, отличаются значительно большей термостабильностью (рис.7). Показана также возможность многократного использования ИМЛ. При четырехкратном использовании остаточная активность составляет 64-68$.

Рис.7.Термостабильность липаз, а-лгаазы о.1асЬ1з, б-липазы рй.пйс-гоэрогив УзЛТ-1, в-липазы штамма УзЛТ-4В, г-липазы штамма УзЛТ-5С. I-растворимый препарат 40°С; 2-растворимый препарат 50°С; 3-иммобилизовзнный препарат 50°С; 4-иммобилизованный препарат 60°С.

При изучении зависимости скорости липолиза от объемной концентрации субстрата показано, что для ММ так не, как и для растворимых липаз имеет место ингибирование субстратом. Пик ферментной активности ИМЛ находится при больших концентрациях эмульсии, чем в случае растворимых. Растворимая липаза подавляется в присутствии 1% субстрата, тогда как ИМЛ ингибируется 1,5% концентрацией.

При изучении позиционной специфичности у иммобилизованных липаз различных штаммов Юи писговрогиэ было показано преимущественное накопление 2,3 диглицеркдов, которые гидролизовались только после 48-часовой инкубации. Полученные данные указывают на избирательность действия ИМЛ на эфирную связь ТГ в положении I.

Для проверки стереоспецифичности действия ИМЛ использовали искусственный субстрат, представляющий собой рацемическую смесь (3, 1 З-хлор-2-метил пропанол пропионата. Проведенный с помощью газовой хроматографии анализ продуктов реакции показывает преи-

мущественное накопление в среде 1-изомера (70-80%).

Таким образом получаемые в результате иммобилизации на гидрофобных сорбентах липазы обладают свойствами стереоспецифичносги.

Глава 9. Локализация и секреция липаз в клетках грибов.

При использовании техники иммуноблотинга была исследована динамика накопления в среде отдельных форм секретируемых липаз каждого исследуемого штамма. Показано, что у штамма УзЛТ-5С в середине экспоненциальной фазы роста секретируется одна форма фермента - Б (6G кДа), а затем, к началу стационарной фазы, другие две формы : А (32 кДа) и В (98 кДа), с высоким и низким молекулярным весом (рис.8б). У штамма УзЛГ-4В в середине экспоненциальной фазы секретируется липаза НКЛ-Б (69 кДа), а в стационарной фазе и другая форма НКЛ-А (45 кДа) (рис.8а).

В качестве модели для исследований локализации липаз и выяснения закономерностей секреции этих ферментов использовали грибы: Oospora lactis и два штамма гриба Eh. microsporis: УзЛТ -5С и УзЛТ-4В. При электронно-иммуноцитохимическом изучении ультратонких срезов этих грибов после иммушыечения анти-липазой было показано, что большая часть метки концентрировалась в клеточной оболочке. Как видно на поперечных ультратонких срезах гиф основное содержание иммунометки на липазы приходится на ПП и отмечается относительно равномерное ее распределение по всему периметру этого компартмента. В то же время в КС и ЦПМ удается обнаружить лишь отдельные гранулы коллоидного золота (рис.Эа).

2$.

а б

Рис.8.Иммуноблоттияг секретируемых липаз гриба Kh.microsporus. г-штамм УзЛТ-4В, б-штамм УзЛТ-5С.

Помимо КО у всех грех штаммов грибов метка была обнаружена в цитоплазматических везикулах, имеющих размеры в диаметре от 0,3 до I |ом и располагающихся вблизи плазмалеммы. На ряде срезов удавалось наблюдать контактирование и слияние содержащих метку везикул с ЦПМ и переход их содержимого в ПП-(рис.96).

Совершенно другая картина распределения иммунометки наблюдалась на продольных ультратонких срезах гиф. Представленные на рис. 9в. данные демонстрируют концентрирование иммунометки на липазу в КО, в области растущих кончиков гиф грибов. Векторная направленность секрзцш белков в апикальную зону является особенностью мицелиальннх грибов.

Дополнительная новая информация о локализации липаз в клетках исследуемых грибов была получена при использовании метода иммобилизации мицелия гр и Са Rhizopus microsporus

УзЛТ-5С в кальций-альгкнатном геле. На срезах иммобилизованного мицелия, инкубировавшегося в течение 16-20 часов, впервые были обнаружены ранее никогда не наблюдавшиеся структуры, состоящие из тяжей злектронноплотного вещества , расположенные в области клеточной оболочки и с одной стороны глубоко проникающие в цитоплазму, а с другой пересекающие КС и выходящие за ее пределы на внешнюю поверхность гиф (рис.Эг). В этих структурах сконцентрировано большое количество метки на липазу. Полученные результаты позволяют предположить, что выявленные структуры выполняют функцию "каналов", осуществляющих экспорт белков и, в частности, липаз в окружающую среду. Списанные структуры удается наблюдать в условиях иммобилизации мицелия в гелевом матриксе. Очевидно, процессы их формирования и экзоцитоз липаз в норме происходят с высокой скорость», что делает маловероятным их обнаружение . Иммобилизация мицелия должна затруднять диффузию липаз сквозь участки КО и соответственно задерживать их в "каналах".

Поскольку в современной литературе данные о локализации множественных форм липаз отсутствуют, представляло чрезвычайный интерес провести такого рода исследование. Выявленные у гриба Rh.microsporus УзЛТ-5С 5 МФЛ, обозначенные А, Б, В, Г и Д иммунологически близки, что не позволило определить их клеточную локализацию иммуноцигохимическим методом непосредственно на ультратонких срезах. В результате субклеточного фракционирования (см. табл.8 и рис.Ю) точно установленным является присутствие в культуральной жидкости трех форм: А, Б и В. Во фракциях ПП и КС содержатся Б, В и Д формы Фермента. Поскольку в условиях естест-

Рис.Э.Иммуноцитохшическая локализация липазы в клетках гриба №. т1сгозрогиа УзЛР-5С. а,б,в-сгрежи указывают на концентрирование иммунометки. Масштаб: а-1 рм; <з,в,г-0,2 рм.

28

венной секреции в среде обнаруживается отсутствующая в клеточной ободочке форма А, логично предположить, что эта форма липазы зкс-портируется с помощью выявленных нами "каналов".

Часть липаз (формы Б и В) вероятно - увлекаются за пределы клеток с потоком постоянно обновляющихся полимеров КС в растущей зоне - р гиф мицелия. 1

Таблица 8. Анализ содержания молекулярных форм липазы и липазной активности во фракциях гриба КЬ.ггасгоБрогиз УзЛТ-5С

центрй^ фугирование ,

осадок I гомогенаг

3000 клеток 100 А Б В г д

супернатант I культуральная 100 Б

среда А В - -

1500 осадок II протопласты 40 А Б В г д

супернатант II перевар КС + 60 Б в д

периплазма - -

4000 осадок III остатки КО +

ЦПМ 8 А Б в - д

супернатант III цитоплазмати-

ческое содер- 32 г д

жимое протоп- А Б в

ласта

10000 осадок IV митохондрии 2 - - в - д

супернатант IV лизосомы, мик- 30 д

росомы, везикулы А Б - г

100000 осадок v микросомы 5 - Б - - д

супернатант V лизосомы, везикулы 25 А г

Во фракции протопластов содержатся все пять форм липаз этого штамма гриба. С помощью дифференциального центрифугирования показано, что самая легкая фракция лизосом, а также везикулы и ци-тозоль содержат формы А и Г (табл.8). Последняя из них не была обнаружена ни в культурзлыюй среде, ни во фракциях КО, что позг.о.-'яе? предположить, что форма Г является специфически лизосомной.

Фракция

липазная активность % от исход-

молекулярные формы липазы (МФЛ)

Рис. 10.Схема секреции множественных фом липазы у гриба Юз1горив т1огозрогиз УзЛТ-5С.

АлГ - ашарат Гольджи, Вак'-'- вакуоль, КС -клеточная стенка, ПП - периплазматическое пространство, ЦПМ - цито-плазматическая мембрана, КО - клеточная оболочка, К -"канал", р - интенсивно растущая зона КС. А - форма А липазы (32 кДа), Б - £орма Б липазы (66 кДа), В - форма В липазы (98 кДа), Г - форма Г липазы (£4 кДа), Д - форма Д липазы (43 кДа).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивным исследованиям лилологических ферментов, проводимым в последние годы, способствует бурное развитие медицины и биотехнологии.

Для различных областей современной биотехнологии основным источником липаз являются микроорганизмы. Лшюлитические ферменты, микроорганизмов весьма разнообразны по своим свойствам и' практически для любого процесса превращения лшшдных субстратов в микробном мире можно отыскать свой тип лщюлитических ферментов. Некоторые из них обладают уникальными свойствами.

Выделение микроорганизмами значительного количества липаз в окружающую среду, связанное с осуществлением ими трофической функции, является весьма ценным свойством для изучения и практического использования этих ферментов.

В результате проведенного нами селективного отбора морфологически различающихся форм, из исходного штамма Rftizopus microsporus УзЛТ-I были выделены новые штаммы этого гриба : УзЛТ-4В и УзЛТ-5С, значительно превышающие исходный по активностям внутриклеточных и внеклеточных липаз. Получены доказательства генетической стабильности этих штаммов.

При изучении биосинтеза липаз изучаемыми микромицетамл установлены закономерности его регуляции, характер влияния липидаых субстратов, источников азота и ионов металлов.

Возможность дог гения с помощью гидрофобной хроматографии на биоспецифических сорбентах высокоочищенных препаратов липаз, практически в о дну стадию, с малыш затратами времени подтвердила перспективность этих методов.

Их применение позволило нам разделить вне- и внутриклеточные липазы различных штаммов гриба Rhizopus microsporus на множественные молекулярные формы, существенно различающиеся по многим свойствам в пределах каждого штамма.

Проведенные наш сравнительные исследования свойств липаз из обьектов принадлежащих разным таксономическим группам : Oospor-a lactis и Rhizopus microspores свидетельствуют об их существенных различиях. Наряду с глубокими физяко-хишчесними и каталитическими различиями, липазы этих двух микромицетов обладают различной позиционной специфичностью действия. Фермент о.lactis является неспецифичным (a.fi-тип) и с одинаковой скоростью гидролизует все три сложноэфирнне связи в молекулах триглицеридов, в то время как

липазы гриба йиписгозроги:; относятся к а-тину, гидролизуя преимущественно 1,3 связи.

При этом иммобилизованные липазы ГОк писговрогиз в отличие от растворимых обладают избирательностью действия на эфирную связь триглицеридов в положении I, что означает появление у этих препаратов свойств сгереоспецифичноспг.

Проведенные исследования свойств липаз трех различных штаммов гриба №. пасгозроюиз УзЛТ-1, УЗ.ТТ-4В и УзЛТ-5С показали, что все зти ферменты достаточно близки по аминокислотному составу. При этом все они имеют идентичные Л-концевые и С-концевые аминокислоты. И-концевой аминокислотой липаз всех изученных штаммов является лейцин, а С-концевой - глицин. Не смотря на сходство аминокислотного состава эти ферменты существенно различаются по молекулярным массам.

При сравнительном анализе особенностей множественных форм липаз из разных штаммов, сходных по молекулярной массе, отмечается их близкое совпадение по многим физико-химическим и каталитическим свойствам. Это позволяет предположить их близкое генетическое родство друг другу.

Изучение антигенных свойств множественных форм липаз из двух штаммов УзЛТ-4В и УзЛТ-5С показало их иммунологическую близость.

При использовании техники иммуноблоттинга была изучена динамика последовательного накопления отдельных форм липаз, секре-тируемых в культуральную среду, Иммуноцнтохимичесюши исследованиями установлена векторная направленность секреции липаз в область растущего апикального конца гиф.

Внутриклеточные липазы локализованы главным образом в периплазматическом пространстве и прилегающих к ним везикулах.

Использование техники иммобилизации мицелия гриба Ш1.т1сго8рог1дд УзЛТ-5С в гидрогеле позволило нам впервые обнаружить ранее никогда не наблюдавшиеся структуры в области клеточной оболочки, заполненные иммунометкой на липазу, и по-видимому выполняющие функции экспорта этого фермента в среду.

На модели этого же штамма с помощью субклеточного фракционирования была также впервые определена внутриклеточная локализация некоторых ГШ. Формы Б, В и Д сосредоточены в периплазме и клеточной стенке, форма А - является одной из МИ, экспортируемых с помощью выявленных наш "каналов", а форма Г является специфически лизосомной.

Феномен образования множественных форм липаз в клетках грибов остается малоизученным. Биологический смысл микрогзтерогенности липаз и детали механизма их секреции в настоящее время неизвестны. Целый ряд новых вопросов поднимает также выявленный нами факт существования "каналов", участвующих в экспорте липаз. Все это требует дальнейшего углубленного изучения.

ВЫВОДЫ

1. Путем селекции, из исходного штамма Юпгориэ ппсговрогиз УзЛГ-1, выделены новые высокоактивные штаммы грибов - продуцентов липаз КМгориэ тасгогрогиз УзЛТ-4В И УзЛТ-5С и подтверждена " их генетическая стабильность. Изучены особенности биосинтеза и секреции липаз всех трех штатов в процессе роста, определены факторы, регулирующие биосинтез этих ферментов.

2. На основе микрокристаллической и аииноэтилцеллюлозы путем химической модификации синтезированы биоспецифические сорбенты для гидрофобной хроматографии, с помощью которых проведено одноэтапное разделение липаз из пяти штаммов грибов на множественные молекулярные формы, очищенные затем до гомогенного состояния. У Юпгориэ пасгозрогиз УзЛТ-1 - пять форм; У31Т-4В - четыре формы; УЗЛТ-5С - пять форм; Шигориэ огугае - две формы И у Ооярога 1ас1;1з - три формы.

3. Множественные формы липаз каждого штамма различаются по молекулярной массе и другим физико-химическим свойствам: изоэлектри-ческим точкам, содержанию полисахаридов, соотношению аминокислот, а также по особенностям катализа и субстратной специфичности. Все формы липаз каждого отдельного штамма иммунологически близки.

4. При иммобилизации липаз на биоспецифических сорбентах рассиряется область оптимального значения рК и значительно повышается оптимум температуры и стабильность. Иммобилизование липазы № писгоБрогшз обладают свойством стереоспецифичности, гидролизуя триглицериды преимущественно в 1-м положении. Это свойство подтверждается также способностью иммобилизованных липаз этого гриба к избирательному гидролизу а-изомера из рацемической смеси оптических изомеров искусственных субстратов.

5. При изучении локализации липаз в клетках гриба Юип^сговрогиз УзЛГ-5С установлено, что секреция этих ферментов имеет векторную направленность в сторону растущее о кончика гиф. Методом иммуноцитохимического анализа впервые выявлены в

области клеточных стенок эукариот специализированные структуры -"каналы", участвующие в "екреции липаз в окружающую среду. Установлено, что одной из молекулярных форм, экспортируемых через "каналы", является форма А (32 кДа). Внеклеточными липазами являются молекулярные формы А (32), Б (66) и В (98 кДа), периплазменными формами являются Б (66), В (98) и Д (43 кДа), а форма Г (24 кДа) является специфически лизосомной.

6. Разработаны способы получения ряда технических препаратов грибных липаз, в производственных условиях выпущены их опытные образцы. Полученные препараты нашли практическое применение (осветление и хранение соков, в кожевенном, меховом и шелкомотальном производстве, а также при получении жирных кислот и глицерина из растительных масел).

Список основных работ, опубликованных по диссертации:

1. Давранов К., Ризаева М., Диеров Ж.Х., Закиров Ы.З. Получение адсорбированной липазы и ее свойства. - Хим. прир. соед.,

1977, N2, С. 267-271.

2. Давранов К., Закиров М.З., Ризаева М., Диеров Ж.Х., Алим-джанова М. Некоторые свойства внеклеточной липазы. - Тез. докл. 2 конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, 1976, Фрунзе, с.55.

3. Ризаева М., Закиров М.З., Алимджанова М., Диеров Ж.X., Давранов К. Расщепление жиров и жироподобных веществ липазой. -Узб. биол. ж., 1977, N1, с. 69-71.

4. Давранов К., Диеров Х.Х. Выделение внутриклеточной липазы термотолерантного гриба Rhizopus microsporus, УзЛТ-I и ее свойства. - Хим. прир. соед., 1977, Н4, с. 566-570.

5. Давранов К., Ризаева М., Диеров Ж.Х. Изучение внеклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-I. - Прикл. биохим. и микробиол., 1978, т. XIV, вып. 3, с. 389-397.

6. Диеров Ж.Х. Получение и некоторые свойства иммобилизованных липаз гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-I.- Тез.докл. II респ. науч-теор.конф. молодых ученых-микробиологов, 1978, Ташкент, с.37

7. Диеров Ж.Х., Дикчювене А.А., Паулюконис А.-А.Б. Иммобилизация внутриклеточной и внеклеточной липаз Rhizopus microsporus УзЛТ-I. - Тез. докл. II Всес. совет, по ферментам микроорганизмов

1978, Минск, с. 172.

8. Диеров Ж.Х, Дикчювене А.А., Паулюконис А.-А.Б. Получение иммобилизованных липаз гриба Ehizopus microsporus, УзЛТ-I и их свойства. - Хим. прир. соед., 1978, Н5, с. 624-629.

9. Диеров Ж.Х., Давранов К., Паулюконис А.-А.Б. Действие некоторых детергентов на активность внутриклеточной липазы. - Тез. докл. IV респ. конф. молодых ученых-микробиологов, 1981, Киев.

10. Диеров Ж.Х., Давранов К. Влияние детергентов на липазную активность Rhizopus microsporus. - Тез. докл. 3 конф. биохимиков Средней Азии и Казахстана, 1981, Душанбе.

11. Диеров Ж.Х. Физико-химические свойства двух форм внутриклеточной липазы Rhisopus microsporus УзЛГ-1. - Тез. докл. 3 конф биохимиков Средней Азии и Казахстана, 1981, Душанбе.

12. Диеров Ж.Х..Давранов К., Паулюконис А.-А.Б., Закиров М.З.

Способ очистки липазы. А.С. N 87793С (СССР).

13. Диеров Ж.Х. Стабильность внутриклеточных липаз гриба Ehizopus microsporus, УзЛТ-I. - Тез. докл. 3 респ. конф. молодых ученых-микробиологов, 1983, Ташкент, с. 93.

14. Давранов К., Диеров К.Х. Получение , свойства и применение иммобилизованных грибных липаз. - Тез. докл. Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, 1985, Кобулети, с. 318.

15. Давранов К., Закиров М.З., Диеров Ж.Х., Щелокова С.С., Султанова И.Г. Новые препараты грибных липаз.- Тез. докл. I per. сов. по хим. реактивам респуб. Средней Азии и Казахстана, 1985, Душанбе.

16. Рахимов А.Х., Диеров Jft.X., Давранов к. Стабильность иммобилизованной липазы и ее использование в периодическом и непрерывном режимах. - Тез. докл. 4 конф. биохимиков Средней Азии и Казахстана, 1986, Ашгабад.

17. Саттаров М., Диеров Ж.Х., Табак М.Я., Давранов К. Иммобилизация липазы Oospora lactis.- Хим. природ, соед. 1988, N 5, с. 729-732.

18. Диеров Ж.Х. Биоспецифическая хроматография липаз микроми-цетов. - Тез. докл. 4 Всес. конф. по ферментам микрорганизмов, 1988, Ташкент.

20. Давранов К., Султанова И.Г., Диеров К.Х. Изменение активности спектра множественных молекулярных форм липазы в динамике роста гриба Ehizopus microsporus. - Прикл. биохим. и микробиол. 1990, т.26, ВЫП. 2.С.184-189.

21.Davranov К, Tabak М, Diyorov J.Kh, Sattarov A, Guljamova К Oospora laotis Lipase Isolation and Properties. - Collection of Czechoslovak Chem. Communications, v. 55, 1990, p. 2110-2117.

22.Diyorov J.Kh, Bavranov K. Preparation of Immobilized micro-mycete Lipases : Their Properties and Utilization.- IUMS Congress: Bacteriology and Mycology- Osaka, September, Japan - 1990, p.37.

23. Bavranov K., Sattarov A., Biyorov J. Kh. Immobilized Oospora lactis Lipase preparations and Their Properties.-Collection oi Czechoslovak Chemical Communications, 1991, v.56, p.499-504.

24. Диеров Ж.Х., Луста К.А, Циоменко А.Б., Кулаев И.С. Элект-ронно-иммуноцитохимическая идентификация субклеточных структур, участвующих в экзоцитозе липаз гриба Khizopus microsporus. - Докл. Акад. наук, 1993, Г. 326, N 6, о. 740-743.

25. Диеров JLX., Циоменко А.Б., Давранов К., Кулаев И.С. Гидрофобная хроматография и характеристика секретируемых липаз гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-4В. -Биохимия,1993, Н7, т.58, с.976-986.

26. Диеров Ж.Х., Циоменко А.Б., Давранов К., Кулаев И.С. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Ehizopus microspo -rus. - Биотехнология, 1993, И 7, с. 26-30.

27. Диеров JK.X. Иммобилизация новых препаратов липаз гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-4В и УзЛТ-5С.- Тез. конф. Биосинтез ферментов микроорганизмами, 1993, Москва, с.64.

28.Диеров Ж.Х. Секреция и свойства множественных молекуляр -ных форм липаз у штаммов гриба Rhizopus microsporus УзЛТ-4В и УзЛТ-5С. - Тез, конф. биосинтез ферментов микроорганизмами, 1993, Москва, с.65.

29. Диеров К.Х., Луста К.А., Циоменко А.Б., Кулаев И.С. Локализация множественных форм липаз у гриба Rhizopus microsporus. -Тез. докл. конф. Биосинтез ферментов микроорганизмами, 1993, Москва, с.66.

30. Diyorov J. Kh., busta К.A. Tsiomenko А.В., Kulaev I.S. Molecular Forms of lipase and Their localization in the Fungus Rhizopus microsporus by Immunoelectron Microscopy.-World J. Microbiol Biotechnol, 1994, v.10, N 1, p.65-76.