Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липаза гриба MUCOR MIEHEI и ее свойства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Липаза гриба MUCOR MIEHEI и ее свойства"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи ГУЛЯМОВА Камола Анваровна

ЛИПАЗА ГРИБА МиСОК М1ЕНЕ1

И ЕЕ СВОЙСТВА

03.00.07— микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент—1992 г.

Работа Еыполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Давранов К. Д.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Рахимов М. М.

кандидат биологических наук Зубенко Т. Ф.

Ведущая организация: кафедра микробиологии и низших

растений биологического факультета ТашГУ.

Защита диссертации состоится «/В »992 г.

в -// _час. на заседании Специализированного совета Д 015.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, г. Ташкент, ул. А. Кадирий, 7 б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан «__»_1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ХОДЖИБАЕВА С. М.

ОЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ!!

Актуальность проблемы. Одним пэ промчпленно вакних видов ферментов продуцпруемпх микроорганизмами являются липазы (К.Ф. 3.1.1.3 - триашл-глицорол-гидролазы), которые интенсивно исследуются во всем мире. Они стала модельными объектами для изучения закономерностей гетерогенного (Тормомтатганого катализа п механизма доПствия (Терментоз на граница раздела <?аз: масло-пола.

Б настоящее время извести« различные виды липаз микроорганизмов, которые получили реальное практическое применение. Некоторые из них получены в лаборатории Лермонтов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз (липолактин, липомикроспорян и т.д.).

имеете с тем, в различных оТерах, где лппазы могут прймв-няться требуются ферменты этого вида с определенные свойствами, прежде всего, спегдаТичностыз действия (позиционная специфичность, специфичность к химическому строению субстрата, специфичность к физическому состоянии системы) и повыпенно? термостабильностью. В связи с этим поиск новых продуцентов липаз с требуемыми свойствами во всем мире продолжает оставаться актуальным.

Одним из перспективных объектов в этом смысле, как нами было обнаружено в предварительных экспериментах является микро--МЙП6Т Кцсог ойеЬе!.

Поль и задачи исследований. Цель настоящего исследования -отбор нового высокоактивного продуцента термостабялышх ляпаз, очистка и изученио Физико-химических я каталитических свойств выделениях липаз.

В связи о поставленной целью, задачами исследования являются:

- отбор продуцента терчсстабкльпо!» липазн, изучение его морТюлого-культурчлыппс, (Тлзполого-бяохшдачесяих особенностей л разработка условия культивирования;

- изучение регуляции я некоторых особенностей- образования липазн отобрпппо1? культурой й мнсгаеетленпостп фор! сяйтездру&-мнх лгптаз;

- разработка способа очистки вне.члеточннх липаз я иасяедо-

взние основных физико-химических и катабодических свойств;

- использование ферментных препаратов липазы для решения ■конкретных вопросов, имеющих практическое значение.

Нпучная новизна работы. Отобран новый продуцент липазы шгоромипет иисог та1еЬе1. Определены оптимальные условия культивирования продуцента, обеспечивавшие активное образование фермента. Исследованы основные закономерности биосинтеза липаз. Установлено, что синтез лгагазы не подвержен катаболятпой репрессии.

Гпервыа замечено, что в зависимости от состава питательной среди синтез и секреция липазы может осуществляться в экспоненциальной, стационарной фазах или же на стадии отмирания клеток.

Йпервые показано существование двух внутри- Л и Б, и двух внеклеточных форм - А^ и Е^ липаз. Установлено, что липазы А и ау является основными, тогда как липазы Е и - минорными (Гор— мани. Замечено, что в процессе роста продуцента уменьшается содержание ¡Горны А с одновременный накоплением формы Б. Разработали условия получения внеклеточных липаз в высокоочшпенном состоянии. Изучены их основные физико-химические и каталитические свойства.

Практическая ценность работ.;. Разработанная лабораторная ме годика культивирования гриба иисог ш1еЬе1 монет служить осново для получения препаратов липаз на действующих заводах микробиологической промышленности. Показана возможность использования комплексного препарата липазы из мцсог в1еЬе! - ляпомшсина для гидролиза растительных масел с целью получения жирных кио-лот и глицерина, а также для утилизации отходов масло-жировой промышленности (соапстоков). Устойчивость липомихина к солям желчных кислот позволяет рекомендовать его для проведения дальнейших исследований по изучении возможности его применения в медицине в качестве профилактического и терапевтического препарата.

Апробация тойоты. Материалы диссертации были представлена на Всесоюзной конференции "Регуляция микроб, метаболизма" (Пущине, 1989 г.). Республиканской конференции молодых ученых микробиологов Узбекистана "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов" (Ташкент, 1989 г.),,? Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991 г.), Всесоюзной конференции "Биотехнология и биофизика микробных популяций" (Алма-

Ата, IS9I г.).

Публикация. Но теш .диссертация опубликованы 4 работы и сданы в почать 3 статья..

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, выводов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 17 таблицами,

ЭКСПЕРИШГГАЛЪНАЯ ЧАСТЬ •

i. объекты и дасаы шжотания

Скрининг продуцентов липазы проводили в два этапа с.использованием качественного и количественного методов анализа. На первом этапе исследуемые микроорганизмы высевали в чашки Петри с агаризованной питательной среде';, содержаний говяжий жир, оливковое масло или трибутирин. Культур отобранные в результате' качественной проверки, вырапдавали глубиннш способом в колбах о 50 мл питательной среды на круговой качалке в теченйе 2-5 суток, с последующим определением ляпазной активности в фильтрате культу ральной жидкости и в гомогёнате мицелии методом титромег-рического анализа ( ota I. Jamada , 1966). Субстратом служила 40^-ная эмульсия оливкого масла в 20^-ном {«створе поливинилового спирта. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое отщепляет I мкМ олеинов oí! кислота от 40^-ной эмульсии оливкового масла в растворе поливинилового спирта (ПВС) за I час в подобранных условиях.

Липазную активность в зависимости от целей эксперимента определяли в фильтрате культу ральной .тшдкости, а также в бес-клеточянх гомогвнатах. Для получения последнего, 0,5 г сырой биомассы растирали кварцевым пескам, экстрагировали в 50 мл дистиллированной водн в течение 2 часов при 4°. НадосаДочную жидкость использовали для определения активности клеточносвязанноЗ липазы, .."ктиеность рассчитывали на I г абсолютно сухой биомассы.

Закономерности синтеза липазы изучали выращивая выбранный итагот на синтетических и комплексных питательных средах, состав которых варьировали в зависимости от далей эксперимента. В качестве посевного материала использовали водную суспензию спор микроорганизмов, поддерживаемых в активном состоянии на сусло-агаре. Скорость растворения кислорода ("сульфитное число") оп-

ределяли оульТигицы методом (Егоров и др., 1376). Осаидение ла-пази из фильтрата культуральной тл?дкости проводили при 4°. Про-теолитическув активность определяли модна,ицированвим штоком Аисона (Каверзнева, 1971).

Содержание белка определяли по методу Jloypa (• .Cowry, 1951) а такжо по оптической плотности при 280 ни с помощью спектрофотометра C¿>—2G. Количество биошссц - ппсуткигишом образцов при 105° до постоянного веса, jJI - потенциометрическя.

Позппяоннуп специфичность липази определяли по методу Ие-ерова (Мееров я др., ISÖ0 г.). Анализ водно!) cjfaau на глицерин и жиров of Í83U на глубину расщепления осуществляли стандарт шш методами, принятыми в масло-кяровой прошшленности (Ржехкк,

1963). Определение качественного состава продуктов гидролиза масел и яиров проводил!? методом тонкослойной хрог.ятогра<Тии на силуфолових пластинках (КеЙтс, 1975).

Очистку липаз проводили методом ионообменной хроматографа на ДЭАЭ-TSK 650 Toyopeuri , гель]ильтрации на i'SL-H'W 55 Чоуо-pearl (Hoyo soda Ш5 Со "Ш)" - ЯПОНИЯ), се<|аДвНСв G-ЮО C'Pbaraacla Fiwj chemicals" .Uppaula , Швеция).

Дискэле^трофорез проводили в 7$-ном поллакриламадном геле при pil 8,3. Гали окрашивали раствором кумасси К-250 (Davis,

1964), Высокоактивные фракции анализировали методом изоэлектри ческого фокусирования {Vesterberg et al. , I9S7). При ЭТО.'.! использовали ам*олити - носители с пределами pH от 3 до 10, испс льзуя аналитическую колонку, объемом 110 мл (íupua "üb" , Швеция) * Продолжительность изоэлоктрического фокусирования -48 часов при 4°, Для создания градиента плотности применяли са харозу. Анодным раствором служила I^-ная фосфорная кислота в 405?-ном растэоро сахарозы, катодным - 1%ит\ раствор йаон . Кс пентрация амфолянов - I??. Фракции собирали по 2 мл. По окончании изозлектрического фокусирования в получениях фракциях изме ряли pH с помощью рН-метра при комнатной температуре. После иг Электрического фокусирования фракции объединяли, освобождали с амфолйнав и сахарозы диализом против дистиллированной води в течанйа 24 ч п'ри 4°, концентрировали до 1,0 мл и использовали, Молекулярную "массу очищенной липази определяли гель-фильтрацш и методом дяскэлеитрофореза в ПААГ, используя в качестве метч! ков белки с известной молекулярной массой фирмы "Serva".

Полученные аксперимантальше данные обработали методом w

тематической статистики (Урбах, 1975).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССШСШЛИЧ! 11 ИХ ОБСЩЩШЕ

2Д. Отбор микроорганизма' - продуцента терлостабильноЯ лняаэн

С целью отбора активных продуцентов термостабильпых липаз были обследовали 7 штаммов тормоТильных микромицзтов, полученных из Вееооюзио-1 коллекция микроорганизмов, а также 40 культур мик-ромицетов различных видов, получёшпх из лаборатории коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз п гыделенши нами из различных природных субстратов.

Голое высоко'' лппазноП активностью яз отобранных культур обладал штамм Mue or miehel ВШГ-1365 - культура ранее ne извоот-кая как продуцент лапазн. Путем многократного рассепа моноспор этоЗ культур; на твердые питательные среды с г'овялшм жиром получен аташ l.iuoor miehei УзЛТ-3, активность которого в 2,5-3,0 раза превышает активность исходно" культуры.

2.2. Еляляпа-условия культивирования на биосинтез липазы Mue or ale'hei, УзЛТ-3

Образование ферментов микроорганизмами зависит не только от продуктивности итаг.поп, но п от условий их культивирования, которые влияют из рост п развитее продуцента, на его бйоемтети-тескуп способность. Необходимо скорректировать для каждого итам-■да такие параметры культи?пропаши кап аэрация, качество и количество пооррного материала и т.д.

Псслодовано влияние возраста и количества спорового и ми-зелпального посевного гатериала на рост гриба а синтез липазы. ■Тстаяовлоно, что пепользэванпе сег.щ суточной культур; наиболее 5лзгепркптпо ллч получения посевного гатераача, оптимальное ко-iîîttpctbo спор в котором достигает 2,8-5,5«Ю(' в пересчете га ГГ-0 гл питательно"' среды.

Оп'.тм по пзучетвга влияния аэрэпии на накопление ляпаэной ав-глгностп. т» фильтрате культу рашюЯ аидкоотп показали, что яйра-'ХРашто грчба п колбах ГрленппИерэ с 50 мл среда является рптк-глмп';, р. яэтробчоятп культуры п ниолороде уповлотязрчютса в

строкой диапазона от 0,6 до 1,3 г 02 лГ*час

Установлено, что штамм синтезирует фермент в широком диапазоне рН, однако наиболее благоприятным является исходное значение рН, 6,0-7,0, При рН кнже 4,0 происходит кислотная инактивация секратируемой липазы, а при значении р!1 выше 7,5 наблюдается значительное уменьшение уровня активноотя фермента (рис. I).

Оптимально!' температурой роста является 40°, а при более вцсоких температурах наблюдается быстрое старение культуры.

О Ф

20,

12

5,0

2,5

Ф

5,0

2,0 1,5 1,0 0,5

7-0

значение рн

Рис, I, .Влияние «сходного значения рН питательной среды на образование и экспорт липазы грибом Ыисог о1еЬв1 , УзЛТ-З

1 - внутриклеточная липазная активность, ед/г.ТО^;

2 - внеклеточная липазная активность, ед/мл.Ю^;

3 - количество биомассы, г/100 мл,

2.Э, Влияние компонентов питательной среда на биосинтез - липазы Миоог ю!еЬв! УзЛТ-З

Состав питательная среды играет весьма значительную роль как для роста я развития микроорганизмов, так и для синтеза не-

обходимого герментд.

Прз изучения зависимости образования липазы па средах о минеральными п органическими источниками азота было замечено, ч?о все испытанные минеральные'источники азота обеспечивают хо-рояий рост культуры* fio синтез и секреция- фермента наблюдается .только лишь на средах с'аммонийными fop.a?Ы азота.

Из органических азотсодержащих.компонентов лучшие результату были получены на.средах с дрожжевым автолязатом - .1%, гидро-л' мточ дродяёй - 1%, кукурузным экстрактом - а также 7%-тт окстрактом сояодсв'К ростков. Для составления комбинированных источников азота были выбраны те источники минеральных и органп-чjcitiix Форм, на которых была получена значительная ляпазная активность. Результаты этих исследований (табл. t) показали, что ¡йомбянярование-источников азота приводят к умэньиёншо продуктивности культуры. Исключением является среда содерзащая экстракт солодазых ростков я сернокислый ашопйй. Í3 этом случае ляпазная . активность увеличивается в 2,3" раза.

Для изучения физиологической потребности культуры'а источниках углеродного питания были испитйнЫ различные углеводы, жирные Кислоты п масла. Рее испытанные источники углерода обеспечивали хоротшй рост продуцента, однако на средах о растительными масла-мй и олеиновой кислотой накопление биомассы значительно внао чем на других углеродсОдержаиш: соедяканвях (табл..г). Наибольшее ; накопление липазней активности" было отмечено на средах о крахмалом, глицерином й растительными масламй.

Б результате проведенных экспериментов был подобран следующий состав питательной среды (в : экстракт солодовых ростков -7,0, (НН4)20О4 - 0*2, CaCÖg - 0,1, хлопковое мйсло - 0,7, который обеспечивал накопление липазы в фильтрате культуральной жадности.до уровня 45C0-5G00 ед/мл. На этой среде была Изучена динамика роста штамма и- образование ляйазы, Установлено, что интенсивный синтез липазы происходит в начала Стационарной фазы роста-с одновременной секрецией ее в культу рвльйую жидкость. Наибольший уровень накопления внеклеточной липазн (рис. 2, кривая 3) наблюдается при значениях jii 8,0-7,0 i кривая 4).

Д

í

ei к

S g

о «

11

s в

я

îY

хэ

á

ra

а s

m i

Й S? 8

О tq - " i-» a а о

en n . 00 «S<

^ ts Ю

Й t>

О О О О МО

г- C\í OD

г- •«■ со

œ ш о

о м

а %

M СО

со н

in to m со

8 3 8ft'

N N Ю 4f

2 8 8 8 * *. * «

W Ю 1Л H

N с- to <з> 8-----

a

ЧГ ю

»

со 8 CO CO M

CS in IS ¡S

g Г-CO s- •sc

M CNJ M OJ

Ol г-ai ю w

Ю о a го in in о о

s w о N in fi M M со in 8 CVÍ ■M1 M* irf Й о CVJ M in см CM

8 i-i

8 СО in О IS OJ

со ю

Г- О! СО СЛ

ю

О СО СЧ Ol

(С 1Л Ю Ш Г-Г-Г-Ю IS СО tO Ш

о о г- о

о г- m ts

р ts о P.,in is

о о г- о

О £- <о Г-

О О О МООСЭ CV о о о

ГО (О П 1С

Ц} to to H

Г- СО Ф С-

a о о с

in ю о

W H Ц)

8

çv to ь СЙ СО i {SMC CO ** С

о о о с о' П о" И

5 S £ S

Ю Ю ID Vf Ы CV о

1Л Ю Ю ч

8 ? ю CS О О

Образование липазы микромицетом цисог пйеЫА УайТ-З в зависимости от

источника углерода

Источник углерода 1рй куль-»туральной ¡жидкости ■ Биомасса, мг/ш ; Ляпазная активность {Внеклеточная, !внутриклеточная, { ед/мл } ад/г

Гдшоза 8,12 6,27 880 15875

Сахароза 8,08 2,86 984 10310

Храхкал 7,96 6,79 1074 28571

Глшерин 6,08 . 6,81 . 1064 34722 •

Масляная кислота 4,62 3,22 20 ХО

Каприновая кислота 5,32 3,15 - • -

Олеиновая кислота 6,08. I0.II 758 8620 '

Пальмитиновая кислота. 7,57 5,13. 696 12755

Оливковое масло 5,95 10,71 10В6 7812

Подсолнечное масио 5,95 10,21 хпе; 8330 '

Хлопковое масло • 5,9В 10,61 1180 6024

источника углерода (яойтрпль) 7,75 . 2,10 200 1000. '

ГГряивчаш» с. даягт 72 часового роста- культуры

Рис.2. Динамика роста и ¿шсрлзния вне- и внутриклеточных липаз гриба ¿íucor ELißhei , Уа5Т~3

I - биокасса, г/JCO мл; 2 - внутриклеточная акткваость, 3 - внеклеточная активность., 4-- значение рВ. .

2.4. Нскоторт вопросы рогуллщш биссгнтеза и секреция ляяаз грабом Ыисог niehel УзйТ-З

Р^осгитвз к свкгуцяа мнсглх ткро&шх ферментов можно регулировать a вестл напривдозко- иугеа подбора соответствующего состава питатель»ой c'pawú Изкз было показано, что на минимальной глшозо-ашояиЗиоЗ' среда, лштаза скатез^ррется 'в экспоненциальной пазе разаптяя граба, -горда как н' комплексных средах a 1%-tam пептоном кукурузные экстрактом то? же самый Вермонт

синтезируемся в стационарной фаза роста, а па срадах с TJÍ-nuM экстрактом оолодовкх роетксз лилазНая активность проявляется лкв: в конце стационарно!! й в начала фазы отмирания клеток. В.последнем случае образуется высокоактивная внеклеточная липаза. Эти данные свидетельствуют, что синтез и секрецию липазы гриба tóueor Diebel мокно' регулировать составом питательной среды,

Ti отличие от многих других продуцентов, синтез липазы у' r-риба Muoor. oiebet На подвержен катаболятноЯ репрессии. Прово-денные исследования позвмилй'установить, что на средах с глюкозой и пру гимн легкоусиояешми сахарямн иташ хороша растет и

К

сгг.тг-эирует липазу, что даэт огюззнва кргслаяогтаь о конотэту-■г"!зйг:л характера свпгоза лззарч. Эта пре.таолс^-оцля .пся?пялк сзся подтвердшиш- й оксдврш.гент.'гг о иочттт по 1шиа-,авдоташ. Меченпнэ аминогшолотн внсодлтсй 1.ая э рергралыюо (баз хггшксао-го мама), так д в опытные (о-хлопковым маолсм) среди. Ашгдта агатов показал, что хлсггнсаоа масло На способствуй? внличениэ мечЬмшх аминокислот в состав вновь сцнтеаадееш^ бзязсз,- По-аи-■димому, масло является лучжям источником углерода, а !ш явдуито-рем синтеза липаз. В работа приведены дашша по изменений у резня езитеза липаза при дробном внесении хлопковогомаала в ораду. Обращает на себя внимание то, что путем дробного занесения хлопкового масла в-среду можно увеличить уровень биосинтеза дойзы й 1;5-2,0 раза.

з. вщшление, очистка и некоторое- СЕОЙСШ ЗШДАВи.

ШСйЧ ЩЕ1Ш 7я1Т-3 3.1. Получение препаратов ляпазц

Комплексные препарат лилазц получаля аэ фильтрата кулъту-ральноЗ явдкости осаждением органическими растворятзлямя (ацетон, этанол, язопропанол) и сульфатом аммония. Енли изучена условия осаждения -фрр,чента, такие параметры как:' концентрация осадятоля, влияние рЯ культуралыюЯ нидкости на осаждение, влиянии Сг.012 :ш активность а выход препарата. Прозеденныо кссявдовайня показали, что пав<ЗольшяЯ выход как по актквноотз,- так-и по- «олячвпт-эу препарата наблюдается при осажквншГпзопропанблоч в концентра-пии 85,7^ я сульфатом атония п ксицентрациа 70/? -с выходом-йо ак?авностя 69,5 я 72$ соответственно, Пря этом необходимо установить рЯ культуральноЯ жидкости и пределах 6,0-6,5 й добавлять хлоряотыЯ кальций в концентрата 0,1-0,3;?, а случпо ооазде'ййя : •нзопропанолом.

Гяло изучено слияние концентрирования культуральноД жидкости па липазную активность. С этой целью нспользояаян метод пакуугл-нгааривашш. Установлено, что прп 5-кратном неянентраро-ваиия культуралъней клдк'ости сохраняется 100^-ная ак^иэйойть фзрмэнта ('табл. 3). '"

Таким образом, с целью получения высокоактивно!? липазы моха? бнть использован концпптрэт .фильтрата культуряльнсЭ глдкос-

Т.Ч» ■••:•,-•■.'.

Таблица 3

Влияние процесса концентрирования фильтрата культурвльной жидкости на липаэную активность

{?онот1|Гряро- 'Концентра-' Липазная активность | Остаточная ли------.---------I-------! пазная актив-

|>£я*яе1 кости. '■жид--»веществ, ! в раз | в % ( Е/мл Удельная ! кость, % I

' / I 1,9 4000 1300 100

3 4,3 8000 1305 100

3 5,2 12000 1414 ТОО

5 8,0 20000 1562 100

10 14,0 31500 1146 78,8

Примечание: Температура концентрирования 18-20 С; время - 2 часа,

3.2. Выделение и очистка внеклеточных липаз

Существование липаз в виде множественности молекулярных

(ШФ) характерно для многих микроорганизмов. В ходе выпол-йения настоящей работы нами было установлено, что птамм УзЛТ-3, гриба йиоог о1еЬе1 также синтезирует две формы липазы. Более того, было замечено изменение в соотношении между двумя формами в зависимости от фазы развития и условий культивирования продуцента (рис, 3).

Для предсказания возможных путей включения отдельных форм лйпав в метаболизм липидов, понимания механизмов их возникнове-. ния необходимы знания физико-химических и энзиматических свойств этих ферментов. В связи с этим, следующий этап исследования был связан с выделением и очисткой внеклеточных липаэ.

Первым этапом очистки фермента служило осаждение его из фильтрата культу рельной жидкости сульфатом аммония или язопропа-нолом. Последующая очистка липаз включала сочетание ионообменной хроматографии с гельфильтрацией. Этапы и результаты очистки внеклеточных липаэ представлены в таблице 4 и риоунке 4 и 5. Как видна из таблицу 4 на первом этапе очистки удельная активность липазы увеличивается п 2,5 раза. При ионообменной хроматографии комплексного препарата на ДЗЛЭ-650 М Тоуореаг! липазная активность оптируется одним пиком при концентрация НоС1

Рис.3, ГелыТильтрация внеклеточных белков гриба Мисог вйвЬв! УзЛТ-3 (Заштрихована липазная активность). А и Б - две (Тори; липазы, цифрами указан возраст культур

Таблица 4

Очистка внеклеточных липаз мисог ш1вЬв!УзЛГ-3

Этапы очистки !0<3ще9 ко_! Разная а»-! Рыход, % !0та-тшш 0ЧИ1^«И ¡личество ! тивность 1_ }пань

- !йелка' "ПУдель-!0бщая.'По бел-'По ак1^ст-

_!_!№ 1Б » ну 1ТНВН.Г ■ '

Фильтрат культу-ральн.яидкости 5000 800 400С000 .100 100

Осаждение сернокислым аммонием 1620 2050 3321000 32,4 83 2,5

ДЗАЗ- тзк-650 и 325 9600 3X20000 6,5 78 12

тзк-55 ни 1(А) 120 Г6000 1920000 2.4 48 20.

2(Б) 76,6 12С00 920000 1.5- 23 " ' 15 ,

0-100 К А) 35 48000 1680000 . 0,7 42 . 60

2(Б) - 30 24000 720000 0,6 18 30

2,0-1

МаИ.Й А^.Ю'

г-

60

Номера фракций

Рис.4 .Ионообменная хроматограф ея ляпазной фракции на ДЭАЭ-Фсуор 650 М, колонка 1,4x35 см, элюцяя 0,05 М фосфатным буфером рН Б,О с градиентом НаС1 от 0 До 0,6.И

го .50. ' номер» *мкцмй

Рис.5.Гель-хродатографад аятшшых фракций яа ?бк-№г-55 (Г) 'И сефзлексОС' -1С0 (2). (Колонка 1,2x60 см,, скорость элюш 40 г/л/час 0,005 К фосфатным буфером, рЯ 6,0)

1,3 Н в 0,05 1! фосфатном буфера рН 6,0» Прз атом удельная актив- • [ость фермента возрастает в 12 раз.

На следующем этапе бил применен метод гельфальтракяи на ísk геле 55 HW . Пря этом происходят раздаланаа белков с лапа-ihoíS активностью (рис. 5, I). Последним этапом очистки била поа-■орная гельфяльтрадия активных фракций на овфадекса а -100 (рас. ¡,-s2). В результате очпсткя достигнута 60 кратная очастка первой фракции - форма А и 30 кратная очистка второй фракции - форма Б.

Таким образом, описанная схема выделения я очистка внвйле-■ очных липаз позволяет получить одновременно две формы липаз в лектрофоретически гомогенном состоянии.

Основная характеристика высокоочотвняых форм липаз представ-:вна в таблице 5.

Таблица 5

Свойства двух форм внеклеточных липаз Mucor ntahel УзЛТ-3

Показатели j ■ Формы липаз__

__А | Б

олекулярная масса, кД 43 не сир.

зоэлектрическая точка 4,9 4,7

lt в ПААГ при 8,3 ОДб 0,52

макс в УФ 281 280

мин в УФ 252. 252

макс/Цмин 2,60 '2,63

д?'2 1(88

птимум рН 8,7 8,2

птимум тешературы 55° 45°

В работе приведены экспериментальные данные по изучена» ермостабильносги отдельных форм липаз и специфичности основной орм«,. Показано, что форма А является (¿-специфично!! липазой.

4. РЕЗУЛЬТАТ!!, ИМЕЮЩИЕ ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕЩЕ

Б процессе выполнения настоящей работы нам« был решен ряд опросов, которые могут прлучить практическое воплощение в бяж-

жайиеы будущем.

^ийомяуйн' - новы!! ферментный препарат липазы; получен яэ •фильтратй культуральной'кидкости микромицета мисог ш1есЬе1 , УзЛТ-3 путем осаждения яэопропанола (85,7?). Липомихин - мелкий порошок, све'тло-коричНевого цвета, хорошо растворим в воде, водный раствор не обладает запахом. Липазная активность препарата -400000 ед/г. Оптимальные условия действия: рН 8,5-8,7; ^ -55-57°С; выход препарата - 9,5 г/л.

Препарат использован для гидролиза растительных масел и сэ~ алсточных жиров.

выводи

1. Отобран новый продуцент термостабильиой липазы - микро-цицет Мисог и!еЬе1 . штамм УэЛТ-3. Изучена зависимость образования липазы от различных, компонентов питательной среды я показано, что лучшими источниками углерода являются раститольные масла я ненасыщенные жирные кислоты, а источниками азота - солодовне ростки в сочетании с. сернокислым аммонием. Установлено, что лгшаэа является экспортным, белком, а обнаружение' клоточносвязан-ног.о фермента, по-видимому, следует рассматривать как промежуточную ступень при секреции фермента.

Для глубинного культивирования продуцента подобрана среда следующего состава (в %): экстракт солодовых ростков - 7; (йН4)2ао4 - 0,2; СаСОз - 0,1; хлопковое масло - 0,7. Разработаны оптимальные условия глубинного культивирования птамма: рН -К,0-7,0; температура - 40°; аэрация - 0,6-1,3 г 02 л""1 .чао"*.

2. Установлена возможность.регуляции синтеза и секреции липазы составом питательной среды. Показано, что синтез липазы Мисог т!вЬе1 УзЛТ-3 возможен практически на среде с любым лег-коусрояемым источником углерода. На основании полученных в работе экспериментальных данных выдвинуто предположение о возяот-ном отсутствии у исследуемого штамма гена катаболитяой репрессии липазы,

3.. Рпврвне показано, что шташ УзЛТ-3, гриба мисог т!оЬе.1 в подобранных условиях роста синтезирует и секрвтирует две форга лппазы (А и Б), соотночелио »между которыми меняется в зависимости от розрастз культуры, л условий ее кулькшированяя. Разработана елиняя охот эднопрокеннсМ очистки обнаружении Форм липаз до

гомогенного состояния. Определена молекулярная' масса основной формы (А) - 43 кП. Установлено, что липазн ыисог ийеЬе! УзЛТ-3 стабильна к нагреванию до 60° и в широком диапазоне {И (4,010,0). Максимальная активность фор® А наблюдается при рН 8,7 • и температуре 55°, форма Б - при рЯ 8,2 и температура 45°.

4. Показана принципиальная возможность использования крмп-леКЬных препаратов внеклеточных липаз (липомяхина) для гидролиза масел и соапсточных аиров.

Список работ, опубликованию: по материалам диссертации

1. Лавранов К.Д., Табак МЛ.,* Гулямова К.А. Биосинтез и секреция молекулярн!1Х форм липаз термоТильным микромицетом ии-оиг вр. Тез.Всесоюзной конференции "Регуляция микроб.метаболизма". Пущино, 12-14 июня, 1989 г. С. 66.

2. Гулямова К.А., Иирзахмедова Н.М., Табак И,Я. Образование термостойкой Л1шазц грибом Ииоог вр. в зависимости от некоторых компонентов питательной среди. Тез. докл. Г/ Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов микробиологов. "Биология, культивирование .и биотехнология микроорганизмов", г.Ташкент, 24-26 мая, 1989 г. О, 9-10,

3. Лавранов К .Д., Гулямова.К.А. Липазы термофильного гриба Мисог т!еЬа1. Тез.докл. Всесоюзно!! конференция "Биотехнология и биофизика микробных популяций". г. Алма-Ата, 19-22 августа, 1991 г. С. 10.

4. Дав ран ов К.Л., Гулямова К. А. Характеристика липазы гриба Ыисог ш1еЬв1.Тез. УП Всесоюзного симпозиума "Штекерная энзимология", г.Москва, 8-12 апреля, 1991 г.

5. Гулямова К.А., Табак МЛ., Лавранов К.Д. Поиск микроорганизмов - продуцентов термостабильнцх липаз. Б кн.: "Биология микроорганизмов и использование в биотехнологии". Изд-во ФАН, Ташкент, Г991 г.

6. Гулямова К.А., Давранов К.Д. Влияние-условия культивирования на образование вне- и внутриклеточной липазы грибом Мисог ш1е11е1 Прикл.бнохим. и микробная., 1992 г. (в печати).

7. Гулямова К. А., Розмухамедзва БД., Дав ран ов К .5. Биосинтез липазы микромицетом Мисог в!еЬе1 , ДАН РУз, 1991. .